JP2017520239A - 核酸の分析のための統合されたアッセイ対照を備えたマイクロ流体カートリッジおよび装置 - Google Patents
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Abstract
開示されるのは、マイクロ流体カートリッジと、液体試料における蛍光アッセイ用のコンパクトなマイクロプロセッサで制御された器具とを含む、マイクロアッセイ検査システムであって、このカートリッジは、統合されたプロセス対照と、陽性および陰性アッセイ対照とを有する。器具は、複数の光チャネルを組み込む走査検出器ヘッドを有する。好ましい構成では、アッセイは、標的被分析物と関連付けられる第1のフルオロフォアおよびプロセス対照と関連付けられる第2のフルオロフォアを監視するための二重チャネル光学部を使用して、認証される。統合された陽性および陰性アッセイ対照は、向上したアッセイ認証能力を提供し、検査結果の分析を促進する。用途として、一般に標的核酸のPCR増幅および蛍光アッセイに基づく、分子生物学的アッセイが挙げられる。
Description
(背景)
(技術分野)
本発明は、概して、診断アッセイにおいて使用するための光学、熱、機械、および空気流体圧システムと統合されたアッセイ対照およびコンパクトな蛍光検出器具を伴う、マイクロアッセイカートリッジに関する。
(技術分野)
本発明は、概して、診断アッセイにおいて使用するための光学、熱、機械、および空気流体圧システムと統合されたアッセイ対照およびコンパクトな蛍光検出器具を伴う、マイクロアッセイカートリッジに関する。
(関連技術の説明)
分子診断の役割は、今日の地球的な健康ケア環境において極めて重要である。発展途上国における死因の95%は、感染症、例えば、急性呼吸器感染症(ARI)、マラリア、HIV、および結核症(TB)の適切な診断およびそれらに関連するその後の処置の欠如に起因している(Yager,P et al,Annu Rev Biomed Eng 10:107〜144,2008)。2009年のH1N1A型インフルエンザパンデミックのような最近のパンデミックは、感染症を効果的に検出し、そして制御するツールの必要性を際立たせてきた。急速な病原体の変異率、非ヒト病原体のヒト病原体への形質転換、および非ヒト病原体のヒト病原体への組み換えを含む要因が、新規感染症を管理する上での新たな課題を追加した(Kiechle,FL et al.,Clin Lab Med 29(3):555〜560,2009)。世界規模の移動性の高まりは、2009年H1N1パンデミックの際に見られたように、発症地域から世界の他の地域への感染症の急速な広がりに拍車をかけている。感染性病原体を検出するために必要な現在の実験培養方法は、結果を提供するために、1日またはそれを上回る日数を要する。これらの問題は、感染の地球規模の広がりを防ぐために、入国港における高速でポータブルな診断現場(POC)デバイスの必要性を明らかにする。
分子診断の役割は、今日の地球的な健康ケア環境において極めて重要である。発展途上国における死因の95%は、感染症、例えば、急性呼吸器感染症(ARI)、マラリア、HIV、および結核症(TB)の適切な診断およびそれらに関連するその後の処置の欠如に起因している(Yager,P et al,Annu Rev Biomed Eng 10:107〜144,2008)。2009年のH1N1A型インフルエンザパンデミックのような最近のパンデミックは、感染症を効果的に検出し、そして制御するツールの必要性を際立たせてきた。急速な病原体の変異率、非ヒト病原体のヒト病原体への形質転換、および非ヒト病原体のヒト病原体への組み換えを含む要因が、新規感染症を管理する上での新たな課題を追加した(Kiechle,FL et al.,Clin Lab Med 29(3):555〜560,2009)。世界規模の移動性の高まりは、2009年H1N1パンデミックの際に見られたように、発症地域から世界の他の地域への感染症の急速な広がりに拍車をかけている。感染性病原体を検出するために必要な現在の実験培養方法は、結果を提供するために、1日またはそれを上回る日数を要する。これらの問題は、感染の地球規模の広がりを防ぐために、入国港における高速でポータブルな診断現場(POC)デバイスの必要性を明らかにする。
先進国世界および発展途上世界の両方で、特定のタイプの感染症のための診断検査が、治療に対する応答を測定し、病状を監視するために、定期的に繰り返される必要がある。そのような1つのケースは、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)およびC型肝炎等の感染についてウイルス負荷(血液ミリリットルあたりのウイルス粒子の数)を監視することにある。サハラ以南のアフリカは、AIDSパンデミックの影響が大きい地域である。本地域の標準的検査施設や訓練された検査技師の不足は深刻な問題である。同様の問題は、米国の医療過疎地域にも存在する。地域社会全体に広められ、アクセスが容易で、場合によっては家庭でも使い得る、速くて安価な診断ツールが、病気および感染のより速い診断および監視を可能にすることでかなりの便益をもたらすであろう。
その誕生以降、マイクロ流体は、インビトロ診断(IVD)のための重要なツールとなる非常に大きな可能性を示している。マイクロ流体ベースのIVDの「至高の目標」は、最小限の未加工試料を使用して、複数の被分析物のための迅速、特異的、高感度、かつ定量的検査を行うことが可能であるハンドヘルド式または傾向式であって、独立型の自己較正式で自動化された安価なデバイスをもたらすことである。しかしながら、今日まで、非常に制限されたマイクロ流体デバイスのみが、そのような用途のための開発および商業化に成功を収めているにすぎない。独立型マイクロ流体デバイスの開発が直面する有意な技術的課題の1つは、空気圧、流体、機械的、電子、および光学ユニットの組み合わせを限定された空間の中に要求するシステム統合である。分析のために検査試料を効率的に調製し、標的被分析物を正確に検出することができるこれらの機能ユニットを、単一の頑丈なマイクロ流体デバイスの中でインターフェースをとり、かつ統合することは継続的課題のままである。
他の課題は、アッセイ認証および品質制御に関する。規制当局によって義務付けられている現在の標準では、診断ベースの健康ケアの決断において使用される全アッセイ手順の正確度および信頼性が、対照の使用を通して監視および認証されることが要求される。これらの対照は、抽出、増幅、および診断プロセスの機能性を検証する、プロセス対照ならびに陽性および陰性対照を含む。プロセス対照は、検査アッセイと同一試料に対して、そして同一検査ウェル内で行われるが、異なるセットのプライマーおよび/またはプローブを使用して、アッセイされた試料内に常時存在する対照標的を検出する。対照的に、陽性および陰性対照は、検査試料と同一プライマーおよび/またはプローブならびにウェル内に埋め込まれた既知の量のアッセイ標的(陰性対照の場合、ゼロ)を使用して、別個のアッセイウェル内で行われる。BD Diagnostics BC MAX(商標)システムおよびCepheid GeneXpert(登録商標)システム等のいくつかの市販のマイクロ流体診断システムでは、オンカードプロセス対照に対して行われるが、いずれのシステムも、統合された陽性および陰性対照を伴う検査カードを提供しない。外部対照は、製品パッケージ挿入物内に規定されるような第三者供給業者によって、または実際の試料を供給する顧客によって供給される付属対照キットとして、検査製造業者によっても提供され得る。
外部陽性および陰性アッセイ対照を用いる必要がある際、いくつかの有意な不利点が存在する。陽性および陰性アッセイ対照が、統合された検査カートリッジの一部ではないとき、固有のロット間試薬変動および/または劣化は、アッセイ結果の認証を損なわせ得る。エンドユーザにとっては、付加的な対照試薬およびデバイスを取得し、別個の対照アッセイを行うために、追加のコストおよび時間が要求される。さらに、多くの場合、対照検査の適切な頻度を判定することは、エンドユーザに任されており、ユーザに付加的負担をかける。これらの不利益は、複数のアッセイが行われるとき、ますます有意となり、リソースが不足した設定では、特に懸念される。
付加的課題は、携帯性である。生体外診断分析法用のプローブとしてのフルオロフォアの使用の有益性が周知であるが、そのような分析法用の最も一般的に入手可能な形式の機器は、大型で、使用が複雑で、比較的遅く、高価な共焦点光学部に依存する。これらの属性により、機器は、遠隔場所、および診療時の現場での完全一体型「サンプルツーアンサー」検査にとって不適切になり、そのような機器は、頑健、高速、コンパクト、安価、および使用容易であるよう要求される。
これらの相互に連動する問題の同時解決は、ほとんどの場合、この極めて予測不可能な技術分野で試行錯誤によって誘導される、広範な実験および開発によってのみ達成される。従って、多数の改良に対する技術上の必要があり、この改良の要素が本明細書における開示の目的である。
これらの相互に連動する問題の同時解決は、ほとんどの場合、この極めて予測不可能な技術分野で試行錯誤によって誘導される、広範な実験および開発によってのみ達成される。従って、多数の改良に対する技術上の必要があり、この改良の要素が本明細書における開示の目的である。
Yager,P et al,Annu Rev Biomed Eng 10:107〜144,2008
Kiechle,FL et al.,Clin Lab Med 29(3):555〜560,2009
(簡単な要旨)
本発明の実施形態は、いくつかの向上されたカートリッジ特徴を提供し、プロセス対照ならびに陽性および陰性アッセイ対照の両方をカートリッジ設計の中に統合することによって、マイクロ流体カートリッジ内の蛍光信号の確実かつ有効な検出の問題に対処する。本発明のマイクロ流体カートリッジは、分子検査のために外部アッセイ対照を用いる必要性を排除することによって、いくつかの著しい利点をエンドユーザに提供する。本発明の統合された陽性および陰性アッセイ対照はまた、診断検査結果を関心の被分析物または複数の被分析物のために陽性または陰性としてスコアするより正確な方法を提供する。
本発明の実施形態は、いくつかの向上されたカートリッジ特徴を提供し、プロセス対照ならびに陽性および陰性アッセイ対照の両方をカートリッジ設計の中に統合することによって、マイクロ流体カートリッジ内の蛍光信号の確実かつ有効な検出の問題に対処する。本発明のマイクロ流体カートリッジは、分子検査のために外部アッセイ対照を用いる必要性を排除することによって、いくつかの著しい利点をエンドユーザに提供する。本発明の統合された陽性および陰性アッセイ対照はまた、診断検査結果を関心の被分析物または複数の被分析物のために陽性または陰性としてスコアするより正確な方法を提供する。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、概して、空気圧回路を封入する第1の成形筐体と、流体圧回路を封入する第2の成形筐体と、流体圧回路に接続される試料入口と、複数の空気流体圧膜を含む、第1および第2の成形筐体間のラミネート層と、流体圧回路に接続されるアッセイウェルアセンブリと、第1の成形筐体内の空気圧回路に接続され、空気流体圧膜の動作を制御する、空気圧パルスを受容するための空気圧ポートのアレイとから組み立てられる、マイクロアッセイカートリッジに関する。有利なこととして、空気圧回路を第1の成形筐体の中に、流体圧回路を第2の成形筐体の中に分離することは、機能故障に寄与することが発見された、空気圧ラインおよび流体圧ラインの交差を防止することによって、カートリッジの頑丈性を増加することが発見された。
本発明の一側面では、カートリッジの流体圧回路は、試料入口に接続される検査アッセイ回路と、試料入口に接続されない対照アッセイ回路とを含む。対照試料回路は、いくつかの側面では、陽性対照アッセイ回路および陰性対照アッセイ回路に分割されてもよい。いくつかの側面では、陽性対照アッセイ回路は、陰性対照アッセイ回路に接続される一方、他の側面では、接続されない。各アッセイおよび制御回路はさらに、複数のアッセイウェルに接続されてもよく、いくつかの側面では、各回路は、1〜3つのアッセイウェルに接続される。好ましい側面では、各回路は、3つのアッセイウェルに接続される。別の側面では、アッセイウェルはそれぞれ、付加的プロセス対照を用いるように構成される。別の側面では、陽性対照アッセイウェルは、陽性対照核酸テンプレートが埋め込まれる。
本発明の別の側面によると、マイクロアッセイカートリッジは、中空筐体と、筐体の内部に支持される核酸捕捉膜とから組み立てられる、核酸捕捉アセンブリを含む。いくつかの側面では、核酸捕捉膜は、シリカファイバから製作される。他の側面では、核酸捕捉アセンブリはまた、捕捉膜の上側および下側表面を支持する、2つの支持媒体を含む。支持媒体は、「フリット」と称され、POREX(登録商標)から製作されてもよい。代替として、支持媒体は、ポリプロピレンワッシャ型構造であってもよい。
他の側面では、マイクロアッセイカードはまた、標的配列の増幅および蛍光検出の両方を実施するための複数のアッセイウェルを伴うPCRウェル層を組み込む、アッセイウェルアセンブリを含む。いくつかの側面では、PCR増幅は、例えば、定量的PCRを行うための、終点PCRであって、他の側面では、リアルタイムPCRである。
さらに他の側面では、マイクロアッセイカードの第1の成形筐体は、アッセイウェルアセンブリのアッセイウェルを覆う、光学検出ウィンドウを含む。光学検出ウィンドウは、筐体の上側表面内の切り込みが、上部から底部に内向きに傾斜する、角度付けられた側面を作成するように、筐体の下側表面内の切り込みより大きい、筐体内の菱形形状の切り込みから形成される。そのような角度付けられた側面を伴うウェルから放出される蛍光光の検出は、有意に向上されることが見出された。さらに、ウェルの菱形形状の幾何学形状は、気泡の取り込みを伴わずに、ウェルの湿潤を有利に促進することが見出されて。マイクロ流体デバイス内の気泡形成は、当技術分野において長期かつ著しい技術的問題となっている。別の側面では、光学的に透明なカバー層が、アッセイウェルと第1の筐体内の光学ウィンドウとの間に配置される。カバー層は、有利には、光学検出に干渉せずに、材料がアッセイウェルから漏出しないように防止する。
本発明の別の側面によると、複数の試薬パックが、上側の成形筐体の中に装填される。これらの試薬パックは、細胞溶解および核酸抽出、洗浄、ならびに捕捉膜からの溶出のために要求されるもの等、試料調製のために必要な全液体試薬を含む。本発明のマイクロアッセイカードは、1〜6つの試薬パックを保持するように構成される。いくつかの側面では、試薬パックは、箔から形成され、第1の成形筐体の中に糊着され、気密シールを形成してもよい。他の側面では、鋭利物が、空気圧起動によって要求されるとき、パックを穿刺し、試薬を放出するために、各試薬パックの下方に配置される。鋭利物は、金属(例えば、鋼鉄または同等物)から形成され、筐体の底部に対して約75度の角度で突出する、返しを有してもよい。本構成は、箔材料の優れた剪断を達成し、穿刺された縁がそれ自体に再密閉し、液体内容物の放出を妨害しないように防止することが見出された。さらに他の側面では、バネが、鋭利物と箔パックとの間に配置され、パックを時期尚早または不適切な破裂から保護してもよい。バネは、ホスト器具に由来する空気圧の力によってのみ克服される、内部バネ力を有する。いったん本力が克服されると、バネは、下方に急「スナップ」され、箔パックの破裂を良好に加速させる。
本発明のさらに他の側面では、マイクロアッセイカードの空気圧ポートは、液体膨張性材料から形成され得る、エアロゾルフィルタプラグで嵌合される。これらのプラグは、核酸等の液体ならびにエアロゾル化材料を捉え、したがって、器具−カートリッジ交互汚染の可能性を大幅に減少させる。
別の側面では、空気流体圧膜および流体圧回路機能を制御するために使用される、陽圧および陰圧状態は、+150〜−50kPAに及び、例えば、いくつかの実施形態では、陽圧および陰圧状態は、+150、+100、+70、0(大気)、−35、および−50kPaから成る群から選択される。
別の側面では、マイクロアッセイカードは、カードに固定された単回使用密閉ガスケットを用いて、ホスト器具に密閉される。
本発明の他の実施形態は、概して、ホスト器具にドッキングし、検査アッセイ回路を含む流体圧回路と、陽性対照アッセイ回路および陰性対照アッセイ回路に分割された対照アッセイ回路とを有し、流体圧回路は、それぞれ、ホスト器具からの空気圧状態を伝達する、空気圧ポートとインターフェースをとる空気圧回路によって制御される、使い捨てマイクロアッセイカートリッジと、カートリッジの空気圧回路および空気圧流体源に接続し、いくつかの空気圧状態をカートリッジに伝達する、空気圧マニホールドを伴う、ホスト器具と、検査試料中の光学信号を検出するための1〜5つの検出チャネルを伴う、検出器ヘッドとを含む、試料アッセイを行うためのマイクロアッセイシステムに関する。
他の側面では、ホスト器具はまた、熱循環能力をアッセイウェルアセンブリのウェルに提供し得る、少なくとも1つのペルチェ熱ポンプを含む。他の側面では、ホスト器具はまた、流体圧回路の領域を加熱し得る、少なくとも1つの熱ブロックを含む。細胞溶解および核酸抽出手順の間に熱を提供することは、効率を有意に増加させることが見出された。
他の側面では、ホスト器具の検出器ヘッドは、空間座標がホスト器具較正の間に事前定義される、基準点によって画定される離散経路上のカートリッジを走査する。そのような短離散経路に沿って走査することは、カートリッジ検出ウィンドウの全長を横断する連続経路とは対照的に、カートリッジ走査を行うために要求される時間を有意に短縮することが見出された。そのような増加した効率は、走査されるべきアッセイウェルの数がシステム内で増加するにつれて、ますます重要となる。
さらに他の側面では、本システムは、カートリッジの空気圧インターフェースポートをホスト器具の空気圧マニホールドに接合するための単回使用ガスケットと、ポートの中に設定され、汚染を防止するためのエアロゾルフィルタプラグとを含んでもよい。
本発明の他の実施形態は、概して、病態と関連付けられる標的蛍光信号のための制御されたアッセイを行う方法であって、前述のシステムを用いて検査アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、標的蛍光信号は、存在する場合、検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出され、内因性成分と関連付けられるプロセス対照蛍光信号は、存在する場合、該検出器ヘッドの第2の光チャネル内で検出される、ステップと、本システムを用いて陽性対照蛍光信号のための陽性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、陽性対照蛍光信号は、存在する場合、該検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出される、ステップと、本システムを用いて陰性対照蛍光信号のための陰性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、陰性対照蛍光信号は、存在する場合、該検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出される、ステップと、第2の蛍光プロセス対照信号が検出され、陽性対照の第1の蛍光信号が検出され、陰性対照の第1の蛍光信号が検出されない場合であって、かつその場合に限り、第1の標的制御信号を有効アッセイ結果として報告するステップとを含む、方法に関する。
本発明の一側面では、検査アッセイ回路、陽性対照アッセイ回路、および陰性対照アッセイ回路はそれぞれ、最大3つのアッセイウェルを含み、これらそれぞれは、特有の標的の分析のためのものである。
本発明の別の側面によると、本方法は、標的蛍光信号と陽性対照蛍光信号および陰性対照蛍光信号を比較するステップであって、試料を病態に対して陽性または陰性としてスコアするステップを含む。本発明のさらに他の側面では、この比較するステップは、標的蛍光信号と陽性対照蛍光信号の比率である、第1の比率を計算することと、標的蛍光信号と陰性対照蛍光信号の比率である、第2の比率を計算することと、第1および第2の比率と認証比率を比較することとを含む。本発明のさらに他の側面では、試料は、第1の比率が、認証比率よりも大きい場合、陽性としてスコアされ、試料は、第2の比率が認証比率未満である場合、陰性としてスコアされる。
本発明の別の側面によると、本方法は、標的蛍光信号と陽性対照蛍光信号を比較し、試料標的の相対的存在量を定量化するステップを含む。
(詳細な説明)
定義
検査試料:検査試料は、臨床標本であり得る生物学的試料または「バイオ試料」を含む。代表的なバイオ試料は、例えば、血液、血清、血漿、バフィーコート、唾液、傷からの滲出液、膿、肺および他の呼吸器吸引液、鼻吸引液および洗浄液、瘻孔ドレナージ、気管支肺胞洗浄液、痰、中耳および内耳吸引液、嚢胞吸引液、脳脊髄液、便、下痢液、尿、涙、乳分泌液、卵巣内容物、腹水、粘液、胃液、胃腸管内容物、尿道分泌物、滑液、腹膜液、胎便、腟液または分泌液、羊膜液、精液、陰茎分泌物、または同等物の被検物を含み、検査され得る。スワブからのアッセイ、または粘膜分泌および上皮を代表する洗浄液が受け入れ可能で、例えば、喉、扁桃腺、歯肉、鼻腔、膣、尿道、直腸、下部結腸、および眼の粘膜スワブや、あらゆる種類の組織標本のホモジネート、溶菌液、消化液もまたそうである。哺乳動物細胞は、受け入れ可能な試料である。生理学的または生物学的な液体の他に、水、工業廃棄物、食品、ミルク、空気濾過物等の試料もまた検査標本である。いくつかの実施形態では、検査試料は、デバイス内に直接載置され、他の実施形態では、分析前処理が考慮される。
定義
検査試料:検査試料は、臨床標本であり得る生物学的試料または「バイオ試料」を含む。代表的なバイオ試料は、例えば、血液、血清、血漿、バフィーコート、唾液、傷からの滲出液、膿、肺および他の呼吸器吸引液、鼻吸引液および洗浄液、瘻孔ドレナージ、気管支肺胞洗浄液、痰、中耳および内耳吸引液、嚢胞吸引液、脳脊髄液、便、下痢液、尿、涙、乳分泌液、卵巣内容物、腹水、粘液、胃液、胃腸管内容物、尿道分泌物、滑液、腹膜液、胎便、腟液または分泌液、羊膜液、精液、陰茎分泌物、または同等物の被検物を含み、検査され得る。スワブからのアッセイ、または粘膜分泌および上皮を代表する洗浄液が受け入れ可能で、例えば、喉、扁桃腺、歯肉、鼻腔、膣、尿道、直腸、下部結腸、および眼の粘膜スワブや、あらゆる種類の組織標本のホモジネート、溶菌液、消化液もまたそうである。哺乳動物細胞は、受け入れ可能な試料である。生理学的または生物学的な液体の他に、水、工業廃棄物、食品、ミルク、空気濾過物等の試料もまた検査標本である。いくつかの実施形態では、検査試料は、デバイス内に直接載置され、他の実施形態では、分析前処理が考慮される。
バイオアッセイ標的分子:すなわち、「対象となる核酸」または「標的分子」または「検査被分析物」は、単一もしくは複数の核酸を含む。標的核酸は、遺伝子、遺伝子の一部、遺伝子の調節配列、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA、cDNAを含み、単鎖、2本鎖、または3本鎖であり得る。いくつかの核酸標的は、多形性、欠失、および代替的スプライス配列を有する。
病原体:感染または感染症に関連付けられる有機体。
病態:健康の欠如、すなわち、病気、虚弱、病的状態、または潜在的な罹患率と関連する遺伝形質によって特徴付けられる哺乳動物宿主の状態。
様々な実施形態は、1つまたはそれを上回る標的感染因子を含む検査試料を分析可能なマイクロ流体デバイスを含む。例示的な標的感染因子は、DNAベースのゲノムまたはRNAベースのゲノムのいずれかを有する微生物および/またはウイルスを含む。いくつかの実施形態では、好適なウイルスは、限定されないが、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)IおよびII型、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)AおよびB型、ヒトメタニューモウイルス(MPV)、ならびに/もしくは単純ヘルペスウイルス(HSV)Iおよび/またはII型を含む。
他の実施形態では、試料中に存在するウイルス感染因子は、限定されないが、インフルエンザA型、インフルエンザB型、RSV(呼吸器合胞体ウイルス)AおよびB型、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトTリンパ球向性ウイルス、肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎ウイルスおよびC型肝炎ウイルス)、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、アリーナウイルス、風疹ウイルス、レオウイルス、ノロウイルス、ヒトメタニューモウイルス(MPV)、単純ヘルペスウイルス1型および2型(HSV−1およびHSV−2)、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、狂犬病ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、マールブルグウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、エプスタイン―バーウイルス(EBV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、エボラウイルス、コロラドダニ熱ウイルス(CTFV)、および/またはライノウイルスを含む。
異なる実施形態では、検査試料中の細菌感染因子は、限定されないが、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、カンピロバクター、クレブシエラ、シュードモナス、リステリア菌、結核菌、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、エルシニア、フランシセラ、パスツレラ、ブルセラ、クロストリジウム菌、百日咳菌、バクテロイデス、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、B−溶血性連鎖球菌、コリネバクテリア、レジオネラ、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、クラミジア、クロストリジウム・ディフィシル、ガードネレラ、膣トリコモナス、淋菌、髄膜炎菌、ヘモフィルスインフルエンザ、エンテロコッカスフェカリス、プロテウス・ブルガリス、プロテウスミラビリス、ヘリコバクター・ピロリ、トレポネーマ・パラジウム、ライム病菌、回帰熱ボレリア、リケッチア病原体、ノカルジア、放線菌および/またはアシネトバクターを含む。
さらに別の実施形態では、検査試料中の真菌感染因子は、限定されないが、クリプトコッカスネオフォルマンス、ブラストミセスデルマティティディス、ヒストプラスマカプスラーツム、コクシジオイデスイミチス、パラコクシジオイデスブラジリエンシス、カンジダアルビカンス、アスペルギルスフミガーツス、藻菌類(クモノスカビ)、スポロトリックスシェンキイ、クロモミコーシス、および/またはマズラ菌を含む。
さらに別の実施形態では、検査試料中に存在する寄生因子は、限定されないが、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、オンコベルバ・ボルブルス、リーシュマニア、トリパノソーマ属、住血吸虫属、赤痢アメーバ、クリプトスポリジウム、ジアルジア属、トリコモナス属、大腸バランチジウム、バンクロフト糸状虫、トキソプラズマ属、蟯虫、回虫、鞭虫、メジナ虫、吸虫、広節裂頭条虫、テニア属、ニューモシスティス・カリニ、および/またはアメリカ鉤虫を含む。
アッセイ対照:すなわち、「実行」対照または「増幅」対照は、陽性対照および陰性対照を含む。対照材料は、商業的に得られるか、内部で調製されるか、または他の源から得られてもよい。陽性対照材料は、精製された標的核酸、標的核酸を含む患者標本、または好ましくは不活性化された関心の微生物を、標的を含んでいないことが既知の標本の中に加えることによって産生される対照であってもよい。陽性対照は、アッセイの検出下限近傍の濃度にあるように構築されてもよい。濃度は、一貫した陽性結果を提供するために十分に高いが、検出システムを検出限界近傍に曝すために十分に低くあるべきである。複数のシステムに関して、被分析物毎の陽性対照が、含まれる。陽性対照PCR反応は、アッセイされるべき標的を含み得る、検査試料と同一プライマー、プローブ、および酵素を使用する。陽性対照は、アッセイされている試料と別個の反応ウェル内で生じる必要がある。
水または緩衝液等の空の非テンプレート対照が、陰性対照の形態として使用されてもよい。陰性対照はまた、試薬によって生成される背景信号を補償するために使用されてもよい。陰性対照は、抽出プロセスを通して採取され、反応試薬の全てを含んでいてもよい。陰性対照はまた、既知の非標的生物または核酸を含む非感染個人または標本からの患者標本等、既知の非標的核酸を含む標本であってもよい。陰性対照PCR反応は、アッセイ標的と同一プライマー、プローブ、および酵素を使用し、アッセイされている試料と別個の反応ウェル内で生じる必要がある。
プロセス対照:すなわち、「内部対照」または「手順対照」は、アッセイされた試料内に常時存在するか、または核酸抽出に先立ってアッセイ試料に添加される、対照標的を指す。本対照は、抽出、増幅、および検出プロセスの機能性を検証する。プロセス対照は、アッセイ標的と異なるプライマーセットを使用しなければならない。システムに応じて、プロセス対照は、アッセイ標的と異なるプローブを使用する必要があってもよい。
核酸:用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、限定されないが、本明細書では、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む任意の長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を含むものとして用いられる。比較的短い核酸ポリマーは、多くの場合、「プライマー」または「プローブ」として用いられる。その定義は、メチル化またはキャップ付きであり得る天然源からの核酸と、代替または誘導体化核酸塩基を含み、ペプチド骨格に基づき得る合成形態とを含む。核酸は、概して、アデノシン、グアニン、チミン、およびシトシンと、それらの「デオキシ」型のポリマーであるが、ウラシルおよびキサンチン等の他のピリミジン、またはデオキシイノシン等のスペーサーおよび汎用塩基をも含み得る。デオキシ核酸は、相補的配列の有無、pH条件、塩濃度、温度、およびホルムアミド、N、N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、およびN−メチルピロリジノン等のある種の有機溶剤の有無に応じて、単鎖または2本鎖でもよい。
「標的核酸配列」または「テンプレート」:本明細書で使用されるように、用語「標的」は、ポリメラーゼによってアッセイ中で増幅され、検出されようとするバイオ試料中の核酸配列を意味する。「標的」分子は、試料中の「スパイク」または未同定被験物として存在し、合成または有機体原産のいずれかのDNA、cDNA、gDNA、RNA、mRNA、rRNA、またはmiRNAから成り得る。「有機体」は、哺乳類に限定されるものではない。標的核酸配列は、増幅の際の相補的配列の合成用のテンプレートである。ゲノムの標的配列は、慣例的に5’末端から3’末端まで掲載される塩基の配列リストによって示される。
リポーター、「標識」、または「タグ」:物理的、化学的、電磁的および他の関連する分析技法によって検出され得るバイオ分子またはバイオ分子の修飾を意味する。検出可能なリポーターの例は、限定されないが、放射性同位体、蛍光体、発色体、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、染色された粒子、量子ドット(QDot)、スピン標識、化学発光を放出する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補因子、核酸プローブに連結された酵素、および酵素基質を含む。リポーターは、試薬としてバイオアッセイに用いられ、多くの場合、別の分子に共有結合によって取り付き、固相上に吸着され、または特定の親和性結合によって結合される。
プローブ:「プローブ」は、室温で安定な2重らせんを形成するのに十分な相補性を持った相補的塩基対合により、標的核酸に結合できる核酸である。プローブは、リポーター群によって標識され得る。プローブに取り付けられ得る好適な標識は、限定されないが、放射性同位体、蛍光体、発色体、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を放出する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、余因子、および酵素基質を含む。プローブの配列、長さ、およびハイブリダイゼーション条件の選定用ツールは、概して、当業者に周知である。
増幅:本明細書で用いられるように、用語「増幅」は、核酸配列濃度の初期濃度に対して核酸配列濃度における増大をもたらす「テンプレート依存プロセス」を意味する。「テンプレート依存プロセス」は、「プライマー」分子の「テンプレート依存伸長」を含むプロセスである。「プライマー」分子は、標的配列の既知部分と相補的な核酸の配列をいう。「テンプレート依存伸長」は、新たに合成される核酸ストランドの配列が、標的核酸およびプライマーの相補的塩基対合則で規定されるRNAまたはDNAの核酸合成を意味する。
アンプリコンは、先行技術増幅手段の2本鎖DNA産物を意味し、DNAおよびRNAテンプレートから形成される2本鎖DNA産物を含む。
両側(two−tailed)アンプリコンは、タグ付きプライマー対が共有結合的に組み込まれ、第1のプライマーがペプチドハプテンまたはエピトープと結合し、第2のプライマーが、親和性リポーター、タグまたは「リガンド」と結合する、増幅手段の2本鎖DNA産物を意味する。本明細書で使用されるように、両側アンプリコンはヘテロ二官能性」テザーとして機能し、固体基質上に分子検出複合体を形成する。
プライマー:本明細書で使用されるように、好適なポリメラーゼおよび補因子の存在下でテンプレート指向DNA合成の開始点として作用し得る単鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド複合体である。プライマーは、概して、少なくとも7ヌクレオチドの長さを有し、より典型的には、長さが10〜30ヌクレオチドまたはそれより長い。用語「プライマー対」は、増幅されるべきDNAテンプレートの5’末端の相補体とハイブリダイズする5’「順」または「上流」プライマーを含む1組のプライマーと、増幅されるべき配列の3’末端とハイブリダイズする3’「逆」または「下流」プライマーとを意味する。両方のプライマーとも5’および3’末端を有し、しかも、プライマー伸長は、常に5’から3’に向かって起こることに留意されたい。したがって、5’末端またはその近傍での化学的結合は、好適なポリメラーゼによるプライマー伸長を阻害しない。プライマーは、「順」および「逆」プライマーの主体が互換性のプライマー対を指して「第1のプライマー」および「第2のプライマー」と称され得る。追加的プライマーが、ネステッド増幅に用いられ得る。
ポリメラーゼは、プライマー分子の3’ヒドロキシル末端を延長するために、ヌクレオシド3リン酸またはデオキシヌクレオシド3リン酸を組み込む機能で定義される酵素である。ポリメラーゼに関する一般論については、Watson,J.D.et al,(1987)Molecular Biology of the Gene,4th Ed.,W.A.Benjamin,Inc.,Menlo Park,Calif.を参照されたい。ポリメラーゼの例は、限定されないが、大腸菌DNAポリメラーゼI型、「クレノウ」断片、Taqポリメラーゼ、T7ポリメラーゼ、T4ポリメラーゼ、T5ポリメラーゼ、および逆転写酵素を含む。逆転写酵素の例は、ヒト免疫不全ウイルス1型由来のHIV−1逆転写酵素、テロメラーゼ、モロニーマウス白血病ウイルス由来のM−MuLV逆転写酵素、およびニワトリ骨髄芽球症ウイルス由来のAMV逆転写酵素を含む。
なお、逆転写酵素は、RNA標的に対しポリメラーゼ連鎖反応法を適用するための研究に一般に用いられることに留意されたい。古典的なPCR法は、DNAに直接的にのみ適用することができるが、RNAからcDNAを合成する際に逆転写酵素を用いることによりRNA標的からのPCR分析が可能となる。この技法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(Reverse Transcription−Polymerase ChainReaction、RT−PCR)と総称される。
(核酸に関して)相補的とは、2重らせんを形成するようにハイブリダイズすることができる2つの単鎖核酸配列を意味する。2つの相補ストランドの2重らせんにおける塩基対のマッチングは、必ずしも絶対的なものとは限らない。ハイブリダイゼーションの選択性は、アニーリング温度、塩濃度、および溶媒の関数であり、少なくとも14〜25ヌクレオチドのストレッチにわたって、わずか55%程度の同一性があるとき、概して低いストリンジェンシーの下で生じ得る。ストリンジェンシーは、当業者に周知の方法で増大させることができる。M.Kanehisa,Nucleic Acids Res.12:203(1984)を参照されたい。プライマーのハイブリダイゼーションについて述べると、「完全に相補的」なプライマーは、プライマーの全長にわたって完全に相補的な配列を有し、ミスマッチを有さない。「ミスマッチ」とは、プライマー中の塩基と、それがアラインされる標的核酸中の塩基とが相補的ではないことを意味する。
事前装填は、試薬が、デバイスの製造中、例えば、その最終使用の前にデバイスに添加されることを意味する用語である。従って、固体試薬は、例えば、試薬中の溶媒が蒸発するように試薬の溶液を乾燥させることによってデバイス上に搭載され得る。代わりに、試薬は、全内容が参照により本明細書に組み込まれるBattrellらの米国特許出願公開第2012/0156750号に開示されるような脱水形態で事前装填されてもよい。
試薬は、酵素を含む、反応に使用される任意の化学的または生化学的物質を広く意味する。試薬は、それ自体が監視され得る単一薬剤(例えば、加熱される際に監視される物質)、または2つもしくはそれを上回る薬剤の混合物を含むことができる。試薬は、生物(例えば細胞)または非生物であってもよい。核酸増幅反応用の例示的試薬は、限定されないが、緩衝液、(マグネシウム塩等の)金属イオン、キレート剤、ポリメラーゼ、プライマー、テンプレート、ヌクレオチド3リン酸、標識、染料、ヌクレアーゼ阻害物質、および同等物を含む。酵素反応用の試薬は、例えば、基質、色原体、補因子、結合酵素、緩衝液、金属イオン、阻害剤、および活性化剤を含む。全ての試薬が反応物質とは限らない。
特異性:標的バイオマーカーの真の陽性シグナルを任意の背景誤信号または干渉信号から確実に区別するアッセイの能力を意味する。
感度:負が、もはや正から確実に区別できなくなるアッセイの検出下限値を意味する。
安定性:保管中、例えば、活性、濃度、分解、粘度、pH値、または粒子組成等のパラメータで測定される任意の組成的変化を意味し、10%以上の経時変化は、不安定性を示す。10%に等しいか、またはそれを下回る変化は、安定性を示唆する。安定性が測定される期間は、組成物の意図された有用性に応じて相対的なものである。より高い温度での加速安定性は、時として、実際に測定されるよりも、長期間にわたる安定性を推定するより迅速な方法である。
エンドポイント:「エンドポイント」または「データポイント」は、定性的または定量的アッセイのいずれかからの「結果」の省略形として本明細書で使用され、一定の平坦域または反応物のレベルが達成される安定したエンドポイントと、速度反応、すなわち、反応物または産物の出現または消失速度が時間の関数(すなわち、傾き)であるデータポイントとの両方を意味し得る。
マイクロ流体カートリッジ:流体構造と、マイクロ流体的な寸法を有する内部チャネルとを有する、「デバイス」、「カード」、または「チップ」。これらの流体構造は、例えば、チャンバ、弁、ベント、ビア、ポンプ、注入口、ニップル、および検出手段を含み得る。概して、マイクロ流体チャネルは、約500μmよりも小さい、典型的には約0.1μm〜約500μmの、少なくとも1つの内部断面寸法を有する流体通路である。マイクロ流体チャネルは、600μmより小さい少なくとも1つの内部断面寸法を有する流体通路である。マイクロ流体流動様式は、ポアズイユ流または「層状」流によって特徴付けられる。粒子体積率、および、粒子径に対するチャネル径の比(D/d)は、流れ特性に対し測定可能な影響を有する(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれるStaben M Eら(2005)「Particle transport in Poiseuille flow in narrow channels.」Intl J Multiphase Flow 31:529〜47、およびその引用文献参照)。
マイクロ流体カートリッジは、レーザステンシル、エンボス加工、スタンピング、射出成形、マスキング、エッチング、および三次元ソフトリソグラフィー等の技法を用いて、様々な材料から作られ得る。積層マイクロ流体カートリッジはさらに、接着剤中間層、および配向ポリプロピレンの圧力処理による等、熱的接合法により作られる。積層成形マイクロ流体カートリッジのマイクロアーキテクチャは、異なり得る。
マイクロ流体チャンネル(「マイクロチャンネル」とも称される):可変長であるが、500μmよりも小さい1つの断面寸法を有する流体チャネルである。マイクロ流体チャネル内のマイクロ流体的な流体の流れ挙動は、高度に非理想的で層状であり、端から端までの圧力低下または断面積よりも、壁の濡れ性、粗さ、液体の粘度、接着性、粘着性により多く依存し得る。マイクロ流体の流動様式は、多くの場合、チャネル内の「仮想液体壁」の存在と関連する。しかしながら、より大きなチャネルでは、10psiまたはそれを上回るヘッド圧が、アッセイのすすぎ工程で重要であり得るような乱流に接する遷移流様式を生成することができる。
押出成形によって形成された層で構成されるマイクロチャネルは、より丸みを帯びたチャネルプロファイルと、各「ビア」の半径とを有していてもよい。射出成形部品の内部チャネル表面は、幾分より滑らかである。チャネルの流れ特性は、マイクロ流動様式における大きな表面効果のため奥深い。表面張力と粘度とが合わさって、表面粗さ効果となる。チャンネルの最も狭い寸法が、流れに最も大きな影響を有する。したがって、長方形または円形の断面プロファイルに基づくチャネル内の流れは、対角幅または直径によって制御されることとなり、設計は、典型的には、この挙動を利用するように変更される。流れ方向への先細りの減少は、200ミクロンより小さな直径に対しウィッキング効果をもたらす。逆に、流れは、圧力が印加されない限り、バルブを形成するようにチャネルを利用することによって停止され得る。チャネル内のビアは、固体状逆止弁の一種として、方向流れを促進するように設計することができる。
本明細書で使用されるように、用語「下流」は、使用時に、試料がデバイスの異なる部分を通して逐次的に通過することを意味する。用語「下流」は、その範囲内に、直接流体連通しているデバイスの2つの部分を含むが、2つの部分が、例えば、弁またはデバイスの別の部分によって分離されている場合もその範囲内に含む。用語「統合」は、例えば、デバイスの同じ部分が試料をフィルタリングするのに役立ち、また溶解ユニットとして機能するように、デバイスの2つの異なる部分が単一のユニットに合わされたことを意味する。用語「統合」が、核酸増幅ユニットと組み合わせて本発明の第1および第2の側面のデバイスに適用されるとき、それは、システムの2つの部分が、使用時に互いに流体連通するように、互いに接続されていることを意味する。別の側面において、「統合」という用語は、デバイスの異なる部分が、好ましくは、共通の基板上に形成されていることを意味する。用語「接続される」は、デバイスの2つの部分に適用されるとき、2つの部分が(例えば、直接接合される、またはチャネルを介して接合されるかのいずれかによって)互いに直接流体連通し得るか、または、例えば、弁またはデバイスの別の部分によって互いに分離され得ることを意味する。好ましくは、用語「に接続された」は、デバイスの2つの部分が互いに直接接合されていることを意味する。
マイクロ流体ポンプ:流体の動きを強制することを目的とした、例えば、バルブ、ベローズ、ダイヤフラム、またはバブルを含み、ポンプのサブ構造は、1ミリメートルより小さい厚さまたは他の寸法を有する。そのようなポンプは、ともに本出願人に譲渡され、その全体が本明細書に参考として組み込まれるWeiglの米国特許第6,743,399号およびSaltsmanの米国特許出願第2005/0106066号に記載の機械的に作動する再循環ポンプを含む。このようなポンプは、ロボット操作または手動で操作され得る。電気浸透ポンプもまた、提供される。このようなポンプは、外部ドライブの代わりに、可溶化した試薬や、マイクロ流体デバイスに基づくアッセイ中の試料の流れを推進するように使用され得る。
ベローズ(「フィンガ」)ポンプ:空洞として形成されたデバイスであり、多くの場合、形が円筒状で、流体接続されていない第1および第2の半チャンバ(half−chamber)を形成するよう、エラストマーダイヤフラムにより冠状セクションに2分されている。ダイヤフラムは、第1の半チャンバに接続された空気圧パルス発生器によって制御される。ダイヤフラムより上の正圧がそれを膨張させて第2の半チャンバの内容物を移動させ、負ゲージ圧(吸引圧)がダイヤフラムを後退させて第2の半チャンバを拡大し、流体を引き込む。半チャンバについて、ダイヤフラムの有効面積は、正の圧力下における体積変位と吸引圧力下における体積変位との小さい方であり、したがって、第1および第2の半チャンバがおおよそ対称、またはダイヤフラムの上下の体積が等しいときに最適となるものと理解されるべきである。第2の半チャンバは、流体の注入口と排出口とに接続されている。流体の注入口と排出口は、別個のポートでも単一のポートでもよいが、いずれの場合も、弁の制御下にある。上述したように、空気パルス発生器は、概して、これもまた弁付きのマイクロチャネルによって、第1の半チャンバに空気圧接続される。完全な装置では、空気圧作動は、プログラム可能である。このように、パルス発生器によって使用されるプログラム可能な空気圧論理は、信号でダイヤフラムを作動させ、信号で弁を開閉させる2つの機能を有する。パルス発生器がカートリッジから外されるときには、ニップルまたは注入口と、空気マニホールドと、電磁弁とが設けられる。
使用時において、流体は、陰圧がダイヤフラムに印加されたとき(または、流体が第2のベローズポンプで押し込まれたときには受動的に)、入口弁を通りベローズポンプの第2の半チャンバに入る。次いで、正圧がダイヤフラムに印加されたときに、チャンバの流体内容物は、流出口弁を通って外に移動する。同様に、正および負の圧力信号は、弁の開閉を制御する。ダイヤフラムに正および負の圧力パルス列を供給することにより、流体がベローズポンプチャンバの内および外に動かされ得る。この流体の動きは、同期した弁論理の適用と、それによるポンプ作用によって指向的となる。
マイクロ流体弁:少なくとも1つの寸法が500μmより小さい流体圧、機械、空気圧、磁気、および静電アクチュエータ流れコントローラの属を含む。フラップ弁の代表的な属は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第6,431,212号に記載されている。逆止弁もまた、含まれる。弁の1つのクラスは、フローチャネルおよび制御チャネルが交差し、制御チャネル内の作動力に応答して流路内に偏向または流路外に退避させることができるエラストマー膜によって分離された構成を意味する。マイクロ流体弁のの種を記載する特許は、そのいくつかがともに本出願人に譲渡され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5,971,355号、第6,418,968号、第6,518,99号、第6,620,273号、第6,748,975号、第6,767,194号、第6,901,949号、ならびに米国特許出願第2002/0195152号および第2005/02005816号等である。
逆止弁:一方向弁である。ボールスプリング弁、フラップ弁、およびフリップフロップ弁のマイクロスケール版は、逆止弁である。
受動的シャットオフ弁:浸漬したとき、いずれの方向にもさらなる流れを遮断するためマイクロチャネルを閉じるように膨潤するマイクロ流体チャネル内の水和性インサートまたはコーティングである。同様に、マイクロチャネルの壁上の疎水性材料のリングから成る「表面張力弁」は、試薬の流れを遅延または停止させることが開示されている。流れの停止はまた、マイクロ流体チャネル径のテーパを広げることによって達成され得る。
自己プライミング:チャネルが湿潤性となり、チャネルに呼び水を差すことを概して必要とせずに毛細管流れが始まるような材料から製作されるか、またはそのような処理を施されたマイクロ流体チャネルを意味する。
ビア:1つの基質層から、上または下の別の基質層に流体経路を提供するマイクロ流体チャネルのステップ、層から構築された積層デバイスの特徴。
試薬パックまたはリザーバ:ダイヤフラムを加圧することにより試薬を送達するために使用されるオンボード試薬パックであって、ダイヤフラムにかかる圧力が「ピロー」を破裂させるような金属シェブロン等の「鋭利物」を並置してもよい(ピロー参照)。これらは、指向性の流体流れ、および試薬送達を生成するため、逆止弁または閉鎖可能なベントと併用され得る。変形可能なフィルムの好適な材料は、パラフィルム、ラテックス、フォイル、およびポリエチレンテレフタレートを含む。変形可能なフィルムを選択する際の主な要因は、降伏点および変形緩和係数(弾性率)を含む。
廃棄物チャンバまたは「パック」:排出される試料、すすぎ液、および廃棄物試薬を隔離するための入れ物として機能する空洞またはチャンバである。通常は、ウィッキング材または吸収性詰め物も含む(ウィック参照)。廃棄物パックはまた、マイクロ流体デバイスの本体に封着された弾性分離膜下で密封され得る。この内膜は、吸水性材料が膨張するにつれて膨張し、それにより廃棄物を封入する。分離膜の外側の空洞は、廃棄物が封じ込められ、隔離されるように大気に解放される。廃棄物パックは、随意に、乾燥状または液体状の滅菌剤を含んでいてもよい。
ウィック:マイクロ流体ポンプの代わりに、またはこれと協調して、毛細管湿潤により流体流れを推進させるために使用される吸水性の材料である。吸水性コアは、典型的には、天然または合成繊維の繊維ウェブもしくは吸収性詰め物を含み、また、通常、「ヒドロゲル」、「超吸収体」、または「ヒドロコロイド」材料と呼ばれる特定の吸収性ゲル化材料を多くの場合含む。材料は、紙、スポンジ、おむつ材料、コンテックワイプ(Contec−Wipe)、およびその他を含む。硫酸カルシウム、硫酸カルシウム、シリカゲル等の乾燥剤が、単独で、または吸水性材料と組み合わせて、用いられ得る。
トラップ:ベントから廃棄物リザーバをさらに分離するダムの付いた流体トラップ。
ベント:内部空洞と大気との間を相互連通する細孔。「衛生的」または「分離ベント」はまた、ガスに対して透過性のフィルタ要素を含むが、疎水性であり、そして湿潤化に抵抗する。随意に、これらのフィルタ要素は、0.45ミクロンまたはそれより小さい細孔径を有する。これらのフィルタは、順方向分離および逆方向分離の両方に機能する。このタイプおよび構造のフィルタ要素は、内部に配置され得、例えば、弁やベローズポンプを、それを制御する空気圧マニホールドから隔離する。
「従来」は、本発明が関連し、先行技術で知られているものを示す用語である。
「約」および「概して」は、ばらつきが取るに足りず、明白で、均等なユーティリティや機能を有し、さらに標準、規則、または制限に対し明らかにわずかな例外の存在をさらに示す場合において、非厳密な表現を拡大し、「多少」、「およそ」、または「ほぼ」の条件を「だいたい」の意味で記述する。例えば、様々な実施形態では、上記用語は、用語に続く値の20%、10%、5%、1%、または0.1%以内の量を指す。
本明細書で、「機能のための手段(means for a function)」と記載される場合、本発明の範囲は、図面に図示された単数または複数のモードのみに限定されず、本明細書に記載される機能を実行するための全ての手段と、出願時に当技術分野において一般に周知の他の全ての手段とを包含すると理解されるべきである。「先行技術手段」は、いくつかの実施例を参照することにより本明細書に引用される技術の累積知識を含め、出願時に当技術分野において当業者に知られている機能を実行するための全ての手段を包含する。
重合手段は、例えば、逆転写酵素およびTAQポリメラーゼ等、ポリメラーゼおよびその補因子および基質として記載される分子機械の様々な種を意味し、いくつかの例を参照することにより本明細書に引用される酵素学の累積知識を含む。
増幅するための手段として、熱循環および等温手段が挙げられる。第一の熱循環技法は、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号、Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989)、およびInnis et al.,(“PCR Protocols”,Academic Press,Inc.,San Diego Calif.,1990)(これらの開示はその全体が参考として本明細書に援用される)で詳細に説明されている、ポリメラーゼ連鎖反応(PCRと呼ばれる)であった。ポリメラーゼ連鎖反応の方法論は、当技術分野で周知である。簡潔に言えば、PCRにおいて、標的配列の逆相補鎖上の領域に相補的である2個のプライマー配列が調製される。過剰なデオキシヌクレオシド三リン酸が、DNAポリメラーゼ、例えば、Taqポリメラーゼと共に反応混合物に添加される。標的配列が試料中に存在する場合、プライマーは標的に結合し、ポリメラーゼは、ヌクレオチドを添加することによって、マーカー配列に沿ってプライマーを伸張させる。反応混合物の温度を上昇および低下させることによって、伸張プライマーは、テンプレートから解離し反応生成物を形成し、過剰なプライマーは、テンプレートおよび反応生成物に結合し、過程が繰り返される。蛍光挿入剤を添加することによって、PCR生成物をリアルタイムでまたは熱循環プロセスの最後に検出することができる。
1つの等温技法は、LAMP法(loop−mediated isothermal amplification of DNA)で、Notomi,T.ら、Nucl Acid Res 2000 28に記載されている。
SDA法(StrandDisplacement Amplification)は、核酸の等温増幅を行う別の方法で、複数回のストランド置換および合成、すなわち、ニックトランスレーションを伴う(Walkerら、Nucleic Acids Research, 1992:1691−1696(本明細書中に参照して組み込まれる))。同様の方法は、RCR法(Repair Chain Reaction)と呼ばれ、増幅の標的とされる領域全体でいくつかのプローブのアニーリングと、それに続く、4つの塩基のうち2つのみが存在する修復反応とを伴う。他の2種の塩基は、検出を容易にするため、ビオチン化誘導体として追加することができる。同様のアプローチは、SDAにも使用される。標的特異的な配列は、循環プローブ反応(cyclic probe reaction/CPR)を使用しても検出され得る。CPRでは、非特異的なDNAの3’配列および5’配列ならびに特異的なRNAの中央配列を有するプローブを、試料中に存在するDNAにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの際、反応をRNase Hにより処理し、プローブの産物が、消化後に放出される特徴的な産物として同定される。当初のテンプレートが、別の循環プローブにアニールされ、反応が繰り返される。
他の核酸増幅技術は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)である。まず、逆転写酵素を使用して相補的DNA(cDNA)をRNAテンプレートから作り、その後、PCRが、得られたcDNA上で実行される。
増幅のための別の方法は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる欧州特許第320308号に開示されたリガーゼ連鎖反応(「LCR」)である。LCRでは、2つの相補的なプローブ対が調製され、標的配列の存在下では、各対が、それらが当接するよう、標的の逆相補ストランドに結合し得る。リガーゼの存在下で、2つのプローブ対が結合して、単一のユニットを形成する。PCRの場合と同様の熱循環により、結合しライゲートされたユニットが標的から解離し、次いで、過剰のプローブ対のライゲーションのための「標的配列」として機能する。その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第4,883,750号は、プローブ対を標的配列と結合させるためのLCRと同様の方法を記載する。
Qβレプリカーゼも、本発明において、さらに別の増幅方法として使用され得る。本方法では、標的の領域に相補的な領域を有するRNAの複製配列が、RNAポリメラーゼの存在下で、試料に添加される。ポリメラーゼが複製配列をコピーし、次いで、それが検出され得得る。
その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる英国特許出願第2 202 328号、およびPCT出願第PCT/US89/01025号に記載されたさらなる増幅法も、本発明に従って使用され得る。前者の出願では、「修飾された」プライマーが、PCR様のテンプレート依存性かつ酵素依存性の合成に使用される。プライマーは、捕捉モエティ(例えば、ビオチン)および/または検出モエティ(例えば、酵素)で標識することにより修飾され得る。後者の出願では、標識されたプローブの過剰分が試料に添加される。標的配列の存在下で、プローブは結合し、触媒によって開裂される。開裂後、標的配列が、インタクトのまま放出され、過剰のプローブに結合される。標識されたプローブの開裂は、標的配列の存在を示すシグナルを与える。
その他の核酸増幅手順は、核酸配列ベース増幅(NASBA)および3SR(その開示が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Kwoh et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86:1173;GingerasらのPCT出願第WO88/10315号)を含む、転写ベース増幅システム(TAS)を含む。。NASBAでは、核酸が、標準的なフェノール/クロロホルム抽出、臨床試料の熱変性、溶解緩衝液による処理、ならびにDNAおよびRNAの単離のためのミニスピンカラム、またはRNAの塩化グアニジニウム抽出により、増幅用に調製され得る。これらの増幅技法は、標的特異的な配列を有するプライマーのアニーリングを含む。重合の後、DNA/RNAハイブリッドをRNase Hにより消化し、2本鎖DNA分子を再び熱変性させる。いずれの場合も、第2の標的特異的なプライマーの添加により、単鎖DNAを完全に2本鎖にし、続いて重合を行う。次いで、2本鎖DNA分子は、T7またはSP6等のRNAポリメラーゼにより多重転写される。等温循環反応では、RNAが単鎖DNAへ逆転写され、次いで、それが2本鎖DNAに変換され、次いで、T7またはSP6等のRNAポリメラーゼにより再度転写される。得られた産物は、短縮されていても、または完全であっても、標的特異的な配列を示す。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるDaveyらの欧州特許第329 822号は、本発明に従って使用され得る単鎖RNA(「ssRNA」)、ssDNA、および2本鎖DNA(dsDNA)を循環的に合成することを含む核酸増幅プロセスを開示する。ssRNAは、逆転写酵素(RNA依存DNAポリメラーゼ)により伸長される第1のプライマーオリゴヌクレオチドのためのテンプレートである。次いで、RNAは、リボヌクレアーゼH(RNase H、DNAまたはRNAのいずれかとの2重鎖であるRNAに特異的なRNase)の作用により、得られたDNA:RNA二重鎖から除去される。その結果得られるssDNAは、テンプレートと相同性のRNAポリメラーゼプロモータ(例えば、T7RNAポリメラーゼ)5’の配列も含む、第2のプライマーのためのテンプレートである。このプライマーは、次いで、DNAポリメラーゼ(例えば、大腸菌DNAポリメラーゼIの大きな「クレノウ」断片)により伸長され、プライマー間に最初のRNAのものと同一の配列を有し、1つの末端にプロモータ配列をさらに有する2本鎖DNA(「dsDNA」)分子をもたらす。このプロモータ配列は、適切なRNAポリメラーゼにより、DNAの多くのRNAコピーを作るために使用され得る。これらのコピーは、次いで、再びサイクルに入り、極めて高速の増幅をもたらし得る。酵素の適切な選択により、この増幅は、各サイクルで酵素を添加することなく等温で実施され得る。このプロセスの循環的な性質のため、出発配列は、DNAまたはRNAのいずれかの形態であるように選択され得る。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMillerらのPCT出願第WO89/06700号は、標的単鎖DNA(「ssDNA」)へのプロモータ/プライマー配列のハイブリダイゼーション、それに続く、配列の多くのRNAコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームは、循環的ではない、すなわち、得られたRNA転写物から新たなテンプレートは生成されない。他の増幅法は、「RACE」および「one−sided PCR」(Frohman,M.A.,「PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,」Academic Press,N.Y.,1990;Ohara et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86:5673−567(それぞれ、その開示が参照によりその全体が本明細書に組みこまれる))を含む。
得られる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で、2つ(またはそれを上回る)オリゴヌクレオチドのライゲーションに基づき、それにより、ジオリゴヌクレオチドを増幅する方法も、本発明の増幅ステップにおいて使用され得る(Wuら、(1989,Genomics 4:560(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる))。
「検出のための手段」:本明細書で使用されるように、終点、すなわち、分析法の結果を表示するための装置を指し、器具フォトダイオード、比濁計、光子計数器、電圧計、電流計、pH計、容量センサ、無線トランスミッタ、磁気抵抗計、またはホール効果デバイスを含んでもよい。分析法結果の検出および解釈を向上させるために、カバープレート内の拡大レンズ、光学フィルタ、着色流体、および標識プローブが使用されてもよい。「標識」または「タグ」は、発色団およびフルオロフォア等の染料、ならびに従来技術で公知であるような化学発光を含むが、それらに限定されない。磁気ビーズ上で装飾される、ZnSで被覆されたCdSe等のQDots、またはQDotsおよび常磁性Fe3O4微粒子の合併は、本発明の分析法の感度を向上させる便利な方法である。蛍光消光検出終点もまた予想される。酵素結合免疫測定法と関連した種々の基質および生成物発色団もまた、当該技術分野で周知であり、分析法の感度、例えば、「上方変換」フルオロフォアを向上させるように検出信号を増幅するための手段を提供する。蛍光および光学検出器は、フォトダイオード、光起電デバイス、フォトトランジスタ、アバランシェフォトダイオード、フォトレジスタ、CMOS、CCD、CID(電荷注入デバイス)、光電子倍増管、および逆バイアスLEDを含んでもよい。検出システムは、随意で、定性的、定量的、または半定量的である。
「融解分析」または「溶融曲線分析」または「高分解能融解曲線分析(HRM)」または「FRET融解分析」は、加熱の間の二本鎖DNAの解離特性の査定である。温度が上昇されるにつれて、二本鎖は、解離し始める。DNAの50%が変性される温度は、融点として知られる。2つのDNAストランド間の温度依存解離は、SYBRグリーン、EvaGreen、またはフルオロフォア標識DNAプローブ等のDNAインターカレートフルオロフォアを使用して測定されることができる。SYBRグリーン(DNAの2本のストランドの小溝内にインターカレートされる間、1000倍強く蛍光を発する)の場合、加熱の間のDNAの解離は、生じる蛍光における著しい減少によって測定可能である。代替として、並置されたプローブ(一方は、フルオロフォアを特徴とし、他方は、好適な消光剤である)が、標的配列へのプローブの相補性を判定するために使用されることができる。プローブベースの技法は、単一ヌクレオチド多形(SNP)、新規変異、およびメチル化パターンを検出するためにPCR後に使用されてもよく、また、生成される解離パターンによって、ホモ接合野生型、ヘテロ接合型、およびホモ接合変異型対立遺伝子の間を区別することができる。
「分子ビーコン」は、溶液中の特定の核酸の存在を報告するように設計されている、一本鎖ヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブである。分子ビーコンは、幹部、ヘアピンループ、末端標識フルオロフォア、および反対側末端標識消光剤といった、4つの構成要素から成る。ヘアピン状ビーコンが標的に結合されない時は、フルオロフォアおよび消光剤がともに密接して位置し、蛍光が抑制される。相補標的ヌクレオチド配列の存在下では、ビーコンの幹部が開いて標的にハイブリッド形成する。これは、フルオロフォアおよび消光剤を分離し、フルオロフォアが蛍光を発することを可能にする。代替として、分子ビーコンはまた、末端標識ドナーに近接して発光するフルオロフォアも含む。「波長偏移分子ビーコン」は、フルオロフォアがより強力に発光することを可能にする、付加的な収穫フルオロフォアを組み込む。分子ビーコンの現在の論評は、Wang K et al,2009, Molecular engineering of DNA:molecular beacons. Angew Chem Int Ed Engl,48(5):856−870;Cissell KA et al,2009,Resonance energy transfer methods of RNA detection,Anal Bioanal Chem 393(1):125−35 and Li Y,et al,2008,Molecular Beacons:an optimal multifunctional biological probe,Biochem Biophys Res Comm 373(4):457−61を含む。近年の進歩は、Cady NC,2009,Quantum dot molecular beacons for DNA detection.Methods Mol Biol 554:367−79を含む。
蛍光核酸分析法は、タグ付きプライマーを用いた増幅と、プローブベースの検出化学反応とを含む。蛍光生成物は、分析法の終了時に、またはリアルタイムで増幅生成物の量を測定することによって、分析することができる。
限定的ではないが、とりわけ、3’消光剤構築物を有する5’レポーター染料の変位およびポリメラーゼ媒介加水分解に依存するTaqManプローブ(Applied Biosystems)、FRETハイブリダイゼーションプローブ、二重オリゴFRETベースのプローブ(Roche)、副溝結合剤共役ハイブリダイゼーションプローブ(MGBプローブ、Applied Biosystems)、Eclipseプローブ、Locked NAプローブ(Exiqon/Roche)、アンプリフルア(Amplifluor)プライマー化学反応、スコーピオン(Scorpions)プライマー化学反応、LUXプライマー、Qzymeプライマー、RT−PCRが、全て本発明で好適である。インターカレーション染料も使用されてもよい。逆転写は、RNA標的を分析するために使用され、cDNAを形成するために別個のステップを必要とする。近年の進歩は、Krasnoperov LN et al.2010.Luminescent probes for ultrasensitive detection of nucleic acids.Bioconjug Chem 2010 Jan 19 epubを含む。化学染料に加えて、プローブは、緑色蛍光タンパク質、量子ドット、およびナノドットを含み、その全ては蛍光性である。核酸および抗体等の分子、分析法標的に対する親和性を有する他の分子は、本発明の蛍光分析で有用なプローブを形成するようにフルオロフォアでタグ付けされてもよい。
いくつかの実施形態では、「プローブ」は、オリゴヌクレオチド小溝結合分子(MGB)コンジュゲート(例えば、米国特許第5,801,155号(その内容は、全体として本明細書に開示される)に開示されるような「MGB−Eclipse」プローブ)を指す。MGB部分は、二本鎖DNA分子の小溝に結合する、合成分子である。プローブは、MGBおよび消光剤部分が、フルオロフォアが3’末端にあり、その一方、オリゴヌクレオチドの5’末端にあるように構築される。MGBの5’位置付けは、MGB−EclipseプローブがPCRの間、裂開されないように保護し、プローブをPCR後溶融曲線分析のために利用可能にする。蛍光増加は、標的DNAへのハイブリダイゼーションに応じた無作為コイル状状態から直鎖状態へのプローブの遷移によって生成される。リアルタイムPCR用途では、MGBは、二本鎖DNA複合体の安定性、具体的には、プローブと増幅されたDNA標的との間のハイブリダイゼーションを増加させる。増加したDNA−DNAハイブリッド安定性は、より高い特異性を伴う、より短い検出プローブの設計を可能にする。プローブの特異性は、類似無MGBのより長い対応物プローブと比較される、完全に一致した配列とミスマッチの標的との間を判別する能力を増加させる。
「FRET」(蛍光共鳴エネルギー転移)は、分子間相互作用の調査を可能にする蛍光技法である。それは、ハイブリッド形成される時等の2つの分子がごく接近している時に、1つのフルオロフォアからもう1つのフルオロフォア(すなわち、ドナーおよび消光剤)へのエネルギーの転移に依存する。近年の進歩は、Carmona AK et al[2009,The use of fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptides for measurement of clinically important proteolytic enzymes,An Acad Bras Cienc 81(3):381−92]を含む。
加熱および冷却のための手段:液体で充満したチャンバを熱循環するための数多くの手段が、先行技術に記載されている。これらの先行技術手段は、概して、循環の冷却部分の間に熱を放散するためのヒートシンクと組み合わせて、電気抵抗器、熱風、レーザ、赤外線、ジュール加熱、TECまたはペルチェ素子、ヒートポンプ、吸熱反応物、および同等物の対流および伝導加熱要素を含む。加熱手段はまた、高周波磁場によって駆動される磁気ビーズの動きによる加熱も含み得る。
熱循環のための加熱、冷却装置は、2つのカテゴリ、すなわち、傾斜温度および固定温度に分類される。固定温度デバイスは、反応では比較的一定の温度を維持し、熱循環のためには少なくとも2つの反応チャンバが必要とされる。傾斜加熱装置は、少なくとも2つの設定点の間で温度を変化させ、そのため、熱循環のためには、1つの反応チャンバのみが必要とされる。加熱要素の組み合わせも、可能である。ペルチェ素子は、固定温度および傾斜用途の両方で使用され得る。水浴は、熱循環の傾斜温度制御に十分適合しない。
概して、加熱および冷却手段は、流体部材とインターフェースして液体内容物との熱交換を行う。PCRのために、熱交換が行われるマイクロ流体チャネルまたはチャンバを形成する関連要素は、「PCR流体工学および熱インターフェース」アセンブリの一部と呼ばれる。
「高熱伝導ポリマー」(米国特許第7,476,702号(その内容は、全体として本明細書に開示される)に開示される)は、高熱伝導性および誘電強度を有する、ポリマー組成物である。このポリマー組成物は、ベースポリマーマトリクスと、熱伝導性の電気絶縁材料とを含む。ガラス等の補強材料が、組成物に添加されることができる。ポリマー組成物は、重量比20%〜80%のポリマーマトリクスと、重量比20%〜80%の熱的伝導性の電気絶縁セラミック材料とを含む。ポリマー組成物はさらに、重量比3%〜50%の補強材料を含んでもよい。ポリマーマトリクスは、熱可塑性または熱硬化性ポリマーであることができる。熱的伝導性の電気絶縁セラミック材料は、アルミナ、酸化カルシウム、酸化チタン、酸化ケイ素、酸化亜鉛、窒化ケイ素、窒化アルミニウム、窒化ホウ素、またはそれらの混合物であることができる。補強材料は、ガラス、無機鉱物、または他の好適な材料であることができる。
文脈上他の意味に解するべき場合を除き、本明細書および後に続く特許請求の全体を通して、「備える(comprise)」という用語、ならびに「備える(comprises)」および「〜を備える(comprising)」等のその変化形は、広く包括的な意味で、すなわち、「〜を含むがそれに限定されない」と解釈されるものとする。
本明細書における「一実施形態」または「ある実施形態」という言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、もしくは特性が本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通した様々な箇所での「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、全てが同じ実施形態を指すとは必ずしも限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、1つまたは複数の実施形態で、任意の適切な方法によって組み合わされ得る。
ここで図を参照すると、図1は、ドッキングベイ5030の中への光学ウィンドウ1106を伴うマイクロ流体カートリッジ1100の前方突出部1105の挿入を動画的に示す、ホスト器具5000の斜視図である。カートリッジ試料ポート1104およびカバープレート1103は、動作中、ホスト器具の外部に残る。示されるのは、タッチスクリーン表示面5080およびコンパクトなシャーシまたは筐体5060である。全ての試薬およびアッセイ対照がマイクロ流体カートリッジの中に提供されるため、器具は、完全独立型操作性を有する。ドッキングベイは、以下でより詳細に論議されるように、懸架載置され、器具基部に対してある角度を成して傾転され得る。
図2は、ホスト器具アッセイ装置の機能ユニットの概観を提供する、ブロック図である。機械、空気流体圧、温度制御、光学、および入力/出力(I/O)システムは、2つのデジタルプロセッサによって協調され、第1のものは、「ホストコントローラ」と称され、ユーザコマンドを受信し、アッセイ結果を出力し、また、アッセイの機械、熱、および空気流体圧プロセスステップを取扱い、第2のものは、「埋め込みマイクロプロセッサ」と称され、検出器ヘッド内の信号取得および処理を含む、光学システムの局所制御に対して統制力を発揮し、デジタルデータをホストコントローラに通信する。埋め込みプロセッサによって制御される光学システムは、検出器ヘッド内において、装置筐体内の雑音の多いアナログ回路から遮蔽され、比較的雑音が少ない環境において高利得増幅を可能にする。各プロセッサは、別個のクロック、揮発性、および不揮発性メモリが提供され、他から自律的に機能する。
概観として、器具内の浮動台(1000、点線)は、マイクロ流体カートリッジを受容し、可逆的に締め付けるためのドッキングベイ(ここでは1001)を支持し、走査検出器ヘッド311が提供される。検出器ヘッドは、ホストコントローラの制御下でマイクロ流体カートリッジの光学ウィンドウにわたって走査される。検出器ヘッドは、励起光を提供するためのサブアセンブリと、蛍光発光信号を検出、増幅、および処理するためのセンサとを含む。浮動台は、定常ベースプレートおよび器具スタンドに載置されるバネサスペンションに乗設される。
ホストコントローラ1003の制御下にある別々に制御可能な加熱ブロックおよびペルチェ熱ポンプを有するヒータモジュール、空気圧分配マニホールドとしての機能も果たす、ベースプレート330上に載置された空気圧サーボに接続される空気圧インターフェース、ステッピングモータおよびホストコントローラを接続するワイヤハーネス、およびクランプモータ用の配線ハーネス、ならびに、クランプおよびマイクロ流体カートリッジの位置を測定するための圧力スイッチ、バーコード読取機、および温度モニタを含む関連センサが、定常ベースプレートに固定され、浮動台と相互作用するように位置付けられる。電力が、器具スタンド内に載置されるバッテリから、または自動車等のACコンバータもしくはDC源への直接接続によって、全システムに分配される。
ホストコントローラ1003は、器具の操作用のタッチパッドパネル、およびLCD表示パネルも含む、マザーボード上に載置される。器具は、無線ネットワーキングカードまたは他の遠隔通信デバイスを含む、種々のデジタルシリアルI/Oリンクを介して、外部ネットワークまたはデバイスにデータを伝送してもよい。固体ROMに符号化されたソフトウェアである、RAMレジスタおよびプログラミングへのサービスアクセスのための特殊デジタル接合点が提供される。
液体試料から特定の疾患または病状を診断する能力を有する、特定のマイクロアッセイカードを操作するために必要とされる、空気圧パルスおよび弁論理のシーケンス等の、器具の操作のための一般的命令が、アッセイを実行するための揮発性および不揮発性メモリが供給される、ホストコントローラと関連付けられるプログラム可能なソフトウェアによって提供される。例えば、バーコード読取機が特定のマイクロアッセイカートリッジを検出した場合、デバイスは、そのバーコードから認識される特定のアッセイを行い、結果を解釈して指定形式で表示するようにプログラムされる。
しかしながら、光源強度の変調、信号増幅、およびフィルタリングを含む、信号取得光学部の動作は、検出器ヘッド311内のセンサPCB上の埋め込みマイクロプロセッサ1841内に常駐のダイモンの制御下にある。したがって、雑音に高感度である電気信号は、検出器ヘッドの中でホスト器具のより雑音の多い環境から遮蔽され、検出器ヘッドからホストA/D変換器へのアナログ信号の伝送は、完全に回避される。この非従来型の機能の分離は、幸いにも、完全携帯性および現場作業のために必要とされるように、器具の雑音感受性を低減するのに極めて有利であって、予想外にも、雑音の多い電子環境であることが予期されるものの中において高利得トライステート増幅器の使用を可能にすることが証明された。
図3Aおよび3Bは、本発明の装置と併用するための使い捨ての、単回使用であって、サンプリングから分析まで行う、マイクロ流体カートリッジの斜視図であって、カートリッジは、アッセイのための全ての試薬を含み、検査試料の導入のみを要求する。カートリッジはまた、プロセス対照ならびに陽性および陰性アッセイ対照を行うために必要な全ての試薬を含む。ここに示されるカートリッジは、内部の仕組みとともに、第1の成形筐体1101および第2の成形筐体1102と、カバープレート1103とから成る。ポート1104は、検査試料を受容するためのものであって、前方突出部1105は、ホスト器具のドッキングベイに挿入するためのものである。下に示されるのは、アッセイウェルアセンブリ1201を伴う、第2の成形筐体である。第1の成形筐体内のウィンドウ1106は、アッセイウェルアセンブリ1201内の試料ウェルを覆って形成される光学ウィンドウである。ガスケット1206は、ホスト器具の空気圧インターフェースマルチポートと密閉してインターフェースをとるためのものである。核酸捕捉アセンブリ1208は、検査試料からの核酸抽出のためのものである。
図4は、マイクロアッセイカートリッジ1100の内部構成要素を示す分解図である。本特定のカートリッジは、FRETまたは分子ビーコン検出を用いたPCRのために設計されている。好ましくは、診断用途および満たされるべき具体的要件に従って採用されるべきカートリッジ設計および分析反応の詳細を判定することは、当業者に任され、以下の詳細な説明は、例証のためだけに供給される。
検査試料は、入口ポート1104を通して添加される。第1の成形筐体1101の前方突出部上の光学ウィンドウ1106は、ホスト器具の中に挿入され、アッセイウェルアセンブリ1201のウェルが、光学ウィンドウを長さ方向に横断する直線経路を辿る、器具検出器ヘッドによって走査されるように整列される。検査試料調製に関連して追加される処理は、ベローミキサ1107Aおよび1107Bと、核酸捕捉アセンブリ1208によって供給される。試料調製のために要求される全ての液体試薬は、密閉された破裂可能箔パウチ1205内に封入され、空気圧制御下で必要なときに分注される。本実施形態では、第1の成形筐体は、6つの箔パウチを提供するように構成されるが、特定の関心のアッセイの要件に応じて要求されるパウチの数を判定することは、当業者に任される。鋭利物1209は、ステンレス鋼から製作され、箔パウチに対して垂直を下回る角度で突出する穿刺縁1211を伴う。箔パウチの時期尚早破裂、すなわち、貫通は、箔パウチと鋭利物との間でインターフェースをとり、パウチを鋭利物の穿刺縁から保護する、バネ1207によって防止される。バネは、ポリ塩化ビニル(PVC)から製作され、鋭利物上で「テント」を形成するように成形される、変形可能構造である。空気圧起動に応じて、変形可能バネの固有の力は、克服され、バネは、鋭利物上で下方に「スナップ」する。バネは、箔パウチを破裂させる鋭利物の穿刺縁を通した通過を可能にする、上部内の孔とともに形成される。有利には、鋼鉄穿刺縁の角度は、剪断材料界面を再密閉から防止しながら、箔材料の剪断を促進する。我々は、本機構が液体試薬のより確実かつ効率的送達を提供することを見出した。例えば、核酸増幅および検出のための他の試薬も、乾燥形態でカード上に提供される。流体廃棄物は、陥凹面積1210の中に糊着され、プラスチックカバープレート1103の下の定位置で密閉される、吸収性詰め物内に隔離される。任意の特定の分子アッセイの詳細は、本範囲を超える。本実施形態では、内部マイクロアッセイチャネルおよびウェルを伴うアッセイウェルアセンブリ1201は、任意の得られた単位複製配列(アンプリコン)の熱循環および蛍光検出による核酸標的配列の増幅を提供する。
図5は、マイクロ流体カートリッジ1100の層アセンブリを描写する、分解図である。第1の成形筐体1101と第2の成形筐体1102との間でインターフェースをとるのは、以下にさらに説明されるように、例えば、弁動作および混合機能性を提供し、第1および第2の成形筐体内に形成される空気圧および液体回路を統合する、ラミネート層1301、1302、および1303のラミネートされたスタックである。ホスト器具によって提供される空気圧供給は、第2の成形筐体内の空気圧ポート1115を通して方向付けられる。空気圧供給は、「空気圧層」と称され得る、第1の成形筐体1101内の回路に流体接続される。本明細書で使用されるように、用語「流体接続される」とは、2つの特徴が、任意のタイプの物質、例えば、気体、液体、溶液、固体の水性懸濁液、および同等物の通過および/または移送のための導管を形成することを意味する。液体チャネルは、「液体層」およびラミネート層1301とも称され得る、第2の成形筐体1102内の回路によって形成され、試薬パック1205、核酸捕捉アセンブリ1130、およびPCRアセンブリ1201と流体連通する。それぞれ、空気圧および液体回路の上側および下側成形筐体の中への平面隔絶は、空気および流体ラインの交差を防止し、有利に頑丈なカートリッジアーキテクチャを提供する。複数の空気流体圧膜またはダイヤフラムが、以下にさらに説明されるように、ラミネート層1302の中に溶接され、マイクロ流体カートリッジのミキサ、弁、および中間準備チャンバを形成する。ラミネート層1301、1302、および1303はさらに、孔およびチャネルが切り込まれ、第1および第2の成形筐体内に形成される空気圧および液体回路を接続する。ラミネート層1303および1301は、当技術分野において公知の接着剤材料を用いて製作され、第1および第2の成形筐体を組み立てられたマイクロ流体カートリッジの中に固定して接合する。エアロゾルフィルタプラグ1125は、下側成形筐体内の空気圧ポート1115の中に嵌合され、マイクロ流体カートリッジとホスト器具との間に物理的障壁を作成する。エアロゾルフィルタプラグ1125は、POREX(登録商標)等の液体膨張性または超膨張性材料から製作され、流体の移送を防止し、かつ核酸等のエアロゾル化材料を吸収するように両方に機能してもよい。試行錯誤を通して、発明者らは、カートリッジの空気圧ポートの中へのエアロゾルフィルタプラグの嵌合が、ホスト器具をカートリッジ内の液体および固体物質から効果的に隔離することを見出した。これは、有利には、後続診断検査結果を損なわせ、著しい規制上の問題を提起し得る、ホスト器具の汚染を防止する。核酸捕捉アセンブリ1130は、以下にさらに詳細に説明されるように、第2の成形本体内の陥凹チャンバの中に嵌合され、液体チャネルと流体連通し、ホスト器具と熱接触する。
図6A−Cは、マイクロ流体カートリッジ1100の空気圧および液体回路と、第1の空気圧層1101、ラミネート弁層1302、および第2の液体層1102の溶接された空気流体圧膜とのさらなる詳細を示す。図6Aは、第1の成形筐体(すなわち、「空気圧層」)1101の底部表面の平面図である。第1の成形筐体は、テレフタル酸ポリエチレングリコール(PETG)等のポリマー材料の射出成形によって製作される。空気圧層の1つの機能は、カートリッジアセンブリ内の弁層1302の空気圧側を密閉することである。第1の成形筐体内の空気圧ラインのネットワークは、弁(ここではライン1150Aによって例示される)、ミキサ(ここではライン1150Bによって例示される)、および試薬パック分注(ここではライン1150Cによって例示される)の動作を制御する。我々は、所定の空気圧ラインの制御下、「特徴セット」(例えば、弁、ミキサ、試薬パック)の数を最小限にする必要があることを見出した。単一空気圧ラインへの特徴セットの多重化は、より高いレベルのカートリッジ故障に寄与することが見出された。試行錯誤を通して、我々は、ポンプ、弁、およびベントのための別個の圧力と個々に関連付けられた20のポート1160に接続される、20の空気圧ラインが、大部分のアッセイに好適であることを見出した。しかしながら、本発明は、本構成に限定されることを意図せず、他の好適な空気圧構成も、企図される。
図6Bは、マイクロ流体カートリッジの弁動作、混合、および流体停止機能を行う、空気流体圧ダイヤフラム膜またはフィルムの構成の例証的実施例を描写する、ラミネート層(すなわち、「弁層」)1302の平面図である。マイクロ流体カートリッジにおいて使用するためのマイクロ弁、マイクロポンプ、および他の空気圧流体要素のためのダイヤフラム技術ならびにそれらの製造および溶接方法は、本出願人の同時係属中の特許出願第WO2014100743号および第WO2011/094577号に説明されており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。全膜フィルムは、単一基板材料、例えば、MELINEX(登録商標)PETフィルムの中に溶接され、層1302を形成してもよい。本例示的構成では、弁膜1310は、DURA−LAR(登録商標)PETフィルムから製作され、混合膜1320は、SARANEXMフィルムから製作され、中間準備チャンバ1330および流体停止1340膜は、PORELLE(登録商標)フィルム等のマイクロ多孔性フィルムから製作される。本図は、膜が溶接され、図6Aに示される上側成形筐体の表面に接触する、ラミネート層の側面を示す。当業者は、任意の数の代替弁および混合構成ならびに材料がラミネート層1302内に採用されてもよいことを理解し得る。
図6Cは、第2の成形筐体1102、すなわち、「液体層」の上側表面の平面図である。第2の成形筐体の機能の1つは、カートリッジアセンブリ内の弁層の液体側を密閉することである。第2の成形筐体内の流体ライン1107は、カートリッジ内の機能特徴間で流体を移送し、インビトロ診断検査、例えば、分子アッセイを行う。機能特徴は、第1の成形筐体および/またはラミネート層ならびに核酸捕捉アセンブリ1130、中間準備チャンバ1180、アッセイウェル1185、および流体停止1195内に封入または形成される、試薬パック、弁、および混合チャンバを含んでもよい。ビア1190Aおよび1190Bは、第2の成形筐体とアッセイウェルアセンブリを流体により結合する。ウィンドウ1185は、アッセイ信号の検出のために、下側成形筐体内に切り込まれ、アッセイウェルアセンブリのウェルと噛合する。空気ポート1115は、前述のように、第1の成形筐体内の器具空気圧マニホールドおよび空気圧ラインと空気圧接続する。第2の成形筐体は、ポリカーボネート(PC)またはテレフタル酸ポリエチレングリコール(PETG)等のポリマー材料の射出成形によって製作される。
図7は、マイクロ流体カートリッジの種々の機能ユニットが、どのように例示的弁動作および流体論理によって制御され得るかを図示する、本発明の一実施形態の概略図である。示されるのは、試料入口1104、例示的試薬が充填された箔パック1205、ミキサ(すなわち、ベローポンプ)1107Aおよび1107B、核酸捕捉膜1208、PCRウェル1260、および流体停止部1255である。逆転写ウェルも、特定の関心のアッセイに応じて、随意である。
図8Aおよび8Bは、それぞれ、核酸捕捉アセンブリ1130の詳細を示す、分解等角および断面図である。核酸捕捉アセンブリは、筐体1131と、捕捉マトリクス1132と、マトリクス支持媒体、1133と、接着ガスケット1134とを含む。筐体1131は、アセンブリの他の構成要素を中空内部に保持する、略中空の非対称形状の円筒形である。筐体は、PCまたはPETG等のポリマー材料から、下側成形本体内に相補的に成形される陥凹の中に楔着する、非対称形状に成形される。第2の成形筐体内の捕捉アセンブリの適切な配向は、液体チャネルの適切な流体連通を確実にする。捕捉マトリクスまたは膜1132は、DNAおよび/またはRNAであり得る、標的核酸を結合および放出するように機能する。好適なマトリクスまたは膜材料は、当技術分野において周知であって、シリカまたはガラスファイバ膜を含んでもよい。核酸捕捉膜はさらに、2つの捕捉膜支持媒体ディスクまたはフリット1133Aおよび1133Bによって支持される。断面図7Bに示されるように、2つの媒体支持フリットは、捕捉膜の上部および底部表面上に平行構成に設定される。本平行構成は、捕捉膜内のマトリクスファイバの均一分布を維持するのに役立ち、これは、発明者らによって、膜を通した液体の均一流動を維持するために重要であることを見出された。これは、構造支持の欠如に起因して、液体接触下で圧潰し、したがって、標的核酸を効率的に結合できないことが知られている、先行技術フィルタまたは膜に優る明白な改良点である。捕捉膜支持媒体1133Aおよび1133Bは、POREX(登録商標)等の任意の好適な材料から製作されてもよい。代替支持媒体実施形態もまた、本発明によって企図される。一実施形態では、ポリプロピレンワッシャが、捕捉膜のための支持を提供してもよい。ワッシャはさらに、筐体チャネルの縁を密閉し、液体試料が捕捉膜の縁の周囲に流れないように防止するように構成されてもよい。別の実施形態では、ポリマー筐体構造自体が、側方膜支持特徴を提供するように成形される。捕捉膜接着ガスケット1134は、捕捉アセンブリを下側成形筐体に接着するように機能し、任意の好適に接着剤材料から製作されてもよい。
図9は、限定ではないが、逆転写、終点PCR、リアルタイムPCR、および定量的PCR、および融解曲線分析を含む、いくつかの分子反応に好適である、アッセイウェルアセンブリ1201の斜視図を示す。本実施形態では、図示されるアセンブリは、同一アッセイウェル内における熱循環およびFRET検出による終点PCRのために構成される。PCRウェル層1250は、溶出された核酸標的分子を増幅するように機能し、PCRのための最適熱伝達および短縮されたサイクル時間のために、ポリプロピレン等の高熱伝導ポリマーから製作される。好適なポリマーの熱伝導率は、好ましくは、1.0W/mK〜10W/mKの範囲である。一実施形態では、高熱伝導ポリマーは、COOLPOLY(登録商標)D1201である。液体試料は、第2の成形本体内の液体チャネルと流体連通する、ビア1280を通してウェル層に進入する。層1250の各試料チャネルは、2つのウェル、すなわち、略球状ウェル1255および菱形形状のウェル1260と流体連通する。菱形形状のウェル1260は、増幅および検出ウェルであって、任意の得られた単位複製配列(アンプリコン)の核酸増幅および検出の両方のために必要な全ての試薬を含む。我々は、菱形形状のウェル1260の幾何学形状が、有利には、気泡の形成を伴わずに、乾燥試薬の湿潤および再水和を促進することを見出した。菱形形状のウェルの角度付けられた側面は、放出される蛍光光の収集および検出を向上させる、標準的垂直または丸みを帯びた縁に優る改良である。より小さい半球状ウェル1255は、流体停止部として機能し、ラミネート層1302の中に溶接された空気浸透性の液体不浸透性膜1346と流体連通する。本実施形態では、PCRウェルアセンブリは、最大3つの標的被分析物の検出のために、9つのアッセイウェルを含む。標的被分析物毎に、前述のように、対応する陽性および陰性の統合された対照のための2つの対照ウェルが存在する。標的被分析物の増幅および検出のためのウェルは、核酸捕捉膜と流体連通し、溶出された核酸を含む液体試料を受容する。対照的に、統合された対照ウェルは、核酸捕捉膜と流体連通せず、代わりに、空の溶出緩衝液を検査試料として受容する。空のウェル1299は、第2の成形本体と流体連通せず、光学検出の間、蛍光標準として機能してもよいが、他の使用も、本発明によって企図される。PCRウェル層1250を覆うのは、PCRウェルアセンブリを第2の成形筐体に固定して接着するための接着層1275である。アッセイウェルアセンブリはまた、ウェル層1250と接着層1275との間にキャッピング層を含む。キャッピング層は、PCRウェルからの液体試薬の漏出を防止しながら、標的信号の検出を可能にする、光学的に透明なカバーである。
ホスト器具システム
本発明のホスト器具の機械、加熱、締め付け、光学、ソフトウェアおよびファームウェア、ホストコントローラ、および結合解除される光学機能の特定の側面は、本出願人の同時係属中の特許出願第WO2014/100725号(参照により全体として本明細書に組み込まれる)全体を通して開示される。以下に説明される特徴は、技術水準に対する特定の代替実施形態および改良を表す。
本発明のホスト器具の機械、加熱、締め付け、光学、ソフトウェアおよびファームウェア、ホストコントローラ、および結合解除される光学機能の特定の側面は、本出願人の同時係属中の特許出願第WO2014/100725号(参照により全体として本明細書に組み込まれる)全体を通して開示される。以下に説明される特徴は、技術水準に対する特定の代替実施形態および改良を表す。
オンボード光学部ベンチおよびドッキングベイを伴う、浮動台は、器具の独特の特徴である。この特徴は、器具の主要光熱機械サブシステムの概念表現である、図10に概念的に導入される。浮動台は、4点バネ載置されるサスペンションによって傾斜された平面上に懸架され、マイクロ流体カートリッジを受容するためのドッキングベイ103を支持する、トレイ状シャーシ301(破線ボックス)から成る。また、浮動台300上に支持されるのは、対のガイドレール上に載置される検出器ヘッド311である。カートリッジは、器具100の一部ではなく、浮動式ドッキングベイ103の中に挿入後、器具とインターフェースする。
動作中に、浮動台は、載置板(330)に押し付けられ、区域加熱ブロックおよびペルチェ熱ポンプならびに関連抵抗発熱体および回路の接触面に係合する。ファンが、動作中に器具の過剰熱を消散させるために提供される。傾斜載置板にはまた、マイクロ流体カートリッジの基部に密閉してドッキングするための空気圧インターフェースポート350も提供される。空気圧は、傾斜載置板330に埋め込まれた一体型空気圧分配「マニホールド」またはシステムから、空気圧インターフェースポートを通してカートリッジに送達される。空気圧マニホールドは、傾斜載置板上に載置された発生源から陰圧および陽圧を供給する。マザーボードに載置されたプログラム可能なホストコントローラは、ベースプレート330および空気圧インターフェースポート350の中の内部マニホールドを介して、カートリッジ上のポンプおよび弁に圧力、減圧、ならびに制御パルスを駆動する、空気圧を方向付ける。
検出器ヘッド311は動力式であり、カートリッジの走査は、ホストコントローラの制御下で行われる。ペアを成すガイドレールに沿って検出器ヘッドを走査するために、ホストコントローラは、ステッピングモータによって駆動されるウォームギアに係合する。検出器ヘッドは、マイクロ流体カートリッジの前方突出部の中の光学ウィンドウを走査し、未加工光信号を収集する、対物レンズを伴う外部ウィンドウが装着される。検出器ヘッド311は、光学信号取得のために、ホストコントローラから独立して機能する、独自の埋め込みマイクロプロセッサを有する。ホストコントローラはまた、加熱ブロックおよびペルチェ熱ポンプ内の温度を調整し、一式のソレノイド弁ならびに空気圧インターフェースにリンクされた陽圧および減圧ポンプリザーバを制御する。器具には、ユーザ相互作用のための表示パネルおよびタッチパネルが供給される。電力入力は融通が利き、随意で、ACアダプタ、自動車のアダプタによって、または器具の下に載置された再充電可能バッテリから供給される。また、随意的な無線IOおよびデジタルIOポートも含まれる。
図10は、浮動台301、ドッキングベイ103、検出器ヘッド311、およびマイクロ流体カートリッジが、接地面に対して画定された角度において器具シャーシ内に載置され得ることを概念的に示す。接地面からある角度でカートリッジを傾転させることは、流体装填の間、通気を改善し、湿潤および混合動作の間、空気取り込みを最小限にする。アッセイ結果の熱伝達および光学的問い合せに干渉する、気泡蓄積は、本明細書に開示されるこのおよび他の革新によって回避される。傾斜載置板330は、浮動台301、カートリッジ、ならびに締め付けおよび光学走査サブアセンブリの機械的構成要素の角度を確立する。我々は、気泡蓄積が核酸増幅に干渉するが、台の角度載置によって制限されることを見出した。本角度「シータ」は、接地面から10〜45度、より好ましくは、10〜20度の範囲、最も好ましくは、約15度が有利であることが見出された。
図10に示されるように、検出器ヘッド311は、噛合する半分のシェル(312、313)を伴う、クラムシェル形筐体を含む。検出器ヘッドは、側方ガイドレール308および309上で摺動し、ウォーム駆動を伴う、ステッピングモータのホスト制御下にある。浮動台シャーシ301は、4点サスペンション内にバネ載置され、締め付けられるまで傾斜載置板330と直接接続しない。2つの走査ガイドレール308のうちの1つが、この図で容易に目に見え、浮動台シャーシまたはトレイ301によっていずれか一方の端で支持されている。ドッキングベイは、波線ボックス(103)によって示され、示されるように(二重矢印)左右に走査することが可能になる、検出器ヘッド311の下のマイクロ流体カートリッジの突出部の挿入のための開口部を画する。空気圧インターフェースポート350は、ここではドッキングベイの下の高くなったプラットフォームとして示される。電力調節、ACアダプタ、およびバッテリ貯蔵機能が、平坦な表面上に静置するように設計されている器具スタンド329の裏面より上で傾斜載置板330の下に載置される。
図11は、ペルチェ熱ポンプ341および加熱ブロック342を伴う加熱器アセンブリを含む詳細の内部を図示する、器具の底部のCAD図である。加熱器アセンブリの上面は、1つまたはそれを上回る加熱ブロックと、ペルチェ熱ポンプとから成り、それぞれは、アッセイの間、カートリッジの封入されたチャネルおよびチャンバ内で生じる分子生物学的手順および/または反応の適切な動作のために、マイクロ流体カートリッジの裏面の画定された区域と熱インターフェースを形成する。これらの手順および/または反応は、細胞溶解および核酸抽出と同程度に単純であるか、または逆転写および核酸増幅と同程度に複雑であり得、概して、最適反応性および特異性のために比較的厳密な温度制御を要求する。ペルチェ熱ポンプおよび加熱ブロックは、バネで載置されてもよく、締め付け機構の下向き圧力と反対に上向きに押勢され、熱伝達のための高熱拡散性接触区域を確立する。また、示されるのは、空気圧インターフェースポート350であって、それぞれ、独立して、ホスト器具の空気圧分散マニホールドから陽圧または陰圧源に繋がれ、独立して、プログラム可能なホストコントローラの制御下にある。本実施形態は、20の空気圧ポートを描写するが、他の好適な構成も、本発明によって企図される。これらの出口は、マイクロ流体カードの裏面の噛合された入口とインターフェースをとり、それを密閉し、タイミングが図られたパターンの相互連通する空気圧、減圧、および圧力パルスは、空気圧インターフェースを通して経路指定され、カートリッジ内のアッセイを駆動および制御する。
図12は、ホスト器具の締め付け機構500と係合される、マイクロ流体カートリッジ200を描写する、CAD図である。また、示されるのは、ギア400、バネ301、および検出器ヘッド支持体311である。前述のように、カートリッジの第2の成形筐体の裏面のシリコンゴムガスケットは、ホスト器具の空気圧マニホールドへのバネ力と噛合し、カートリッジが器具内に装填され、バネ圧力が印加されると、圧縮下、空気圧相互接続部を密閉する。ガスケット1206は、単回使用密閉ガスケットとしての役割を果たし、有利には、従来の知恵に従って器具の一部としではなく、使い捨てカートリッジが供給される。使い捨てカートリッジを伴うガスケットを含むことによって、空気圧インターフェースにおいて、より優れた、かつより清潔なシールが得られ、ガスケットを周期的に交換する必要性も排除される。本構成では、カートリッジは、空気圧制御インターフェースマルチポート上に流体によって係合し、熱ブロック342およびペルチェ熱ポンプ341と熱的に接触される。器具空気圧制御マニホールドは、調整された空気圧を空気圧インターフェースマルチポート350を通してカートリッジに供給する。完成器具では、載置板330に、カード空気圧を制御するための圧力調整器、蓄圧器、およびソレノイドが集合する。
圧力状態は、概して、限定ではないが、+150kPa、+100kPa、+70kPa、0kPa、−35kPa、および−50kPaを含む、陽圧および陰圧の範囲から選択され、より高い圧力は、例えば、試薬パックを破裂させるために使用され、陰圧は、弁の開放等のために使用される。これらの圧力は、緩衝された圧力リザーバから供給されてもよい。ダイヤルアップ可変圧力供給もまた、使用されてもよい。空気圧状態は、マイクロプロセッサ制御下、マニホールドサブ回路を通してカートリッジに供給される。各アッセイは、流体圧回路を通して流体を移動させるために必要とされる、空気圧弁およびポンプ論理に従って実行されるべき一連のステップから成る。通気口もまた、回路の必要部分であって、加圧、反転圧、および通気は全て、各個々のアッセイタイプの要件に従って、器具および関連付けられたマイクロアッセイ回路の能力内にある。
光学システム
図13は、それぞれ、励起用および発光検出用の2つの光チャネルおよび電子的に隔離された回路基板(1301、1302)を有する二重チャネル検出器ヘッド1300の斜視図である。内部構成要素を視認するために、筐体の一方の半分が除去されている。この図では、検出器ヘッドの内部構成要素を示すために、筐体1303の上半分が除去されている。二重チャネルは、対物レンズ(1310、1330)ならびに光路AおよびB(AおよびBと印をつけた白い矢印)によって印付けられる。SMD LED励起光源(1311、1331)は、エッジ型抵抗ピンコネクタ(1304)を介して直角でセンサPCB(1302)に接続される、光源LEDプリント回路基板(1301)の上に載置される。光検出構成要素は、センサPCB(1302)の上に載置される。ファラデー箱要素(1306)は、フォトダイオード(1317)および(1337)ならびに周辺高利得増幅回路を遮蔽するために使用される。
図13は、それぞれ、励起用および発光検出用の2つの光チャネルおよび電子的に隔離された回路基板(1301、1302)を有する二重チャネル検出器ヘッド1300の斜視図である。内部構成要素を視認するために、筐体の一方の半分が除去されている。この図では、検出器ヘッドの内部構成要素を示すために、筐体1303の上半分が除去されている。二重チャネルは、対物レンズ(1310、1330)ならびに光路AおよびB(AおよびBと印をつけた白い矢印)によって印付けられる。SMD LED励起光源(1311、1331)は、エッジ型抵抗ピンコネクタ(1304)を介して直角でセンサPCB(1302)に接続される、光源LEDプリント回路基板(1301)の上に載置される。光検出構成要素は、センサPCB(1302)の上に載置される。ファラデー箱要素(1306)は、フォトダイオード(1317)および(1337)ならびに周辺高利得増幅回路を遮蔽するために使用される。
蛍光励起は、標的フルオロフォアの励起スペクトルに合致するように選択される、表面載置LED(1331)によって標的チャネル(矢印A)の中に提供される。光源LED(1331)は、発散光線を発光し、次いで、放射された光線は光源励起レンズ(1332)によって平行にされる。光源レンズ(1332)は、LEDに対面する平面を有する、平凸レンズである。次いで、平行光線は、励起帯域通過フィルタ(1333)を通過させられてもよい。検出器ヘッドは、システムの熱が増加または減少するにつれて、または複数の励起強度がアッセイの間に要求されるとき、アッセイの間、LED強度を修正し、例えば、一定LED強度を経時的に維持する能力を有する。これは、約5%のコリメートされ、フィルタ処理された励起光が、光サンプラ鏡から、中性濃度フィルタを通して、LED強度検出器に反射される、閉ループ直接LED強度変調回路によって遂行される。次いで、平行のフィルタにかけられた励起光線の残りは、入射ビームに対して45度で設置される、二色性鏡要素またはビームスプリッタ(1334)から反射され、平凸対物レンズ(1330)および検出器筐体の外部ウィンドウを通過させられる(矢印A)。レンズ1330を通過した後、励起光は、標的フルオロフォアを有する試料液体を含む、マイクロアッセイカートリッジに埋め込まれた検出チャンバ(図示せず、図14−17参照)を通して集束させられる。試料液体を通る励起光の経路長は、マイクロアッセイカートリッジの後のバックミラーの使用によって2倍にされる。標的フルオロフォアは、入射光によって励起される。フルオロフォアの発光は、概して、励起波長よりも長い波長であり、標的フルオロフォアのストークス偏移に等しい量だけ偏移される。
検出チャンバの中の標的フルオロフォアからの帰還発光の一部分は、平凸サンプリングレンズ1330によって収集され、二色性鏡1334に衝打する前に平行にされる。随意で、検出チャンバの後の加熱ブロック上に載置されたバックミラーによってさらに強化される、発光した光の収集を最適化するよう、レンズと試料との間の作業距離をさらに縮小するために、フレネルレンズが使用されてもよい。二色性ビームスプリッタ1334は、励起および発光波長の間の波長カットオフを有するため、二色性鏡1334は、発光した蛍光光線用の通過帯域ビームスプリッタ、および励起光用の阻止帯域フィルタとしての役割を果たす。それは、反射励起光および対物レンズウィンドウを通して光路に進入する周囲光を反射しながら、発光した蛍光を伝達する。次いで、二色性ビームスプリッタ1334を通過する発光した光は、発光フィルタ1335を通過し、その目的は、図20と関連する説明でさらに説明される。次いで、発光フィルタ1335から退出する光は、平凸センサレンズ1336を通過し、そこで、PCB1302に表面載置され、ファラデー箱1306によって電気的雑音から保護される、光センサ1337の表面の上に集束させられる。
上記の光路は、複数(例えば、5つ)のチャネルの中で反復され得、いずれの蛍光放出バンドも検出する潜在力がある。第2の(対照)チャネルは、対照励起LED1311、平凸励起レンズ1312、励起フィルタ1313、二色性ビームスプリッタ1314、対物レンズ1310、対照発光フィルタ1315、平凸センサレンズ1316、および対照フォトダイオード1317を有する。両方のフォトダイオードからの出力は、フォトダイオードの隣で基板に内蔵され、増幅器からの慎重に遮蔽されたピンを介して、センサPCB上の埋め込みマイクロプロセッサに接地される、3段トランスインピーダンス増幅器によって増幅される。
一実施形態では、フルオロフォアとしてのフルオレセインおよびテキサスレッドの使用によって例示されるように、励起LED1331は、標的チャネルに使用される485±12nmの本質的に単色の光を送達するための帯域通過励起フィルタ1333を有する470nmLEDであり、帯域通過フィルタ1313を有する590nmLED1311が、対照チャネルに使用された。励起LEDは、50または60Hzにおいて、および蛍光頭上照明と関連する調和周波数において、AC電力関連雑音をフィルタにかけるよう、130Hzのストローブ速度を使用して、オンおよびオフに変調または「ストローブ」され、また、30または60Hzで存在してもよい、散在する周囲光および電気的雑音に関するファントム信号もフィルタにかける。上記のように、局所フィードバックセンサが、光源LED出力強度を監視し、安定させるために使用される。フルオロフォア発光の検出監視は、ホストコントローラによって制御されるステッピングモータの動力下で検出器ヘッドのレール上の移動と協調される。検出器ヘッドの中の埋め込みマイクロプロセッサおよび関連回路には、RAMメモリ、ROMメモリ、A−D変換器、3段トランスインピーダンス増幅器、およびこれらの機能に対処するための信号処理およびコマンドシーケンスファームウェアが提供される。
光センサ1317および1337のそれぞれは、共通PCB1302の上に載置される。これらの光センサのそれぞれからの出力信号脚部は、それぞれの3段トランスインピーダンス増幅器(図示せず)の前置増幅器または第1の台に直接接続される。PCB1302は、入力信号へのRFまたは電磁干渉の不要な効果を最小化するように、ハードウェア雑音低減構成要素、具体的には、埋め込み接地面およびファラデー箱1306を大いに利用する。増幅器は、ファラデーケージ、バイパスコンデンサ、信号調節前置増幅器、別個の接地板、金属化検出器ヘッド筐体、またはそれらの組み合わせによって電子雑音から遮蔽され、増幅器は、センサに電気的に近接近している。光学信号取得、事前調節、増幅、およびデジタル化は、遮蔽環境内で動作する自律ダイモンによって制御される。検出ヘッド内の局所制御下のこれらのハードウェア雑音低減要素と、光学データ取得、デジタル化、および処理方法の組み合わせは、不要な雑音の効果から本質的に免れる検出器設計につながる。トライステージ増幅器が、最大1014の利得のために構成されてもよく、所望に応じて、102、103、106、1010、または1012の利得のために選択的に構成される。
我々は、驚くべきことに、信号経路長を最小限にし、センサダイオード導線の周囲および励起回路基板とセンサ回路基板との間の接合部等において必要な、ファラデー遮蔽の効果的使用を可能にすることによって、走査ヘッド内の信号処理のパッケージ化が、向上された信号対雑音比および感度とともに、隔離された低雑音環境を達成することを見出した。随意に、検出器筐体は、アルミニウムから製作されるか、または伝導性ポリマーでコーティングおよび接地され、さらに、内部電子機器を望ましくない干渉から遮蔽してもよい。有利には、より高い信号増幅が、本環境において実現される。
図14は、マイクロアッセイカートリッジ内の光ウィンドウとの外部光学インターフェースを示す、蛍光検出器ヘッド1300の内部光学構成要素の概略図である。非従来的に、複数の独立光路または「チャネル」が単一の検出ヘッドに形成され、電子PCBおよび下流信号処理回路を共有するが、雑音干渉を低減するように、励起光学部は一方の回路基板の上に載置され、検出光学部はもう一方の回路基板の上に載置される。2つの基板は、角載置ピン接合点によって電気的に連結され、別個の接地板上に載置されたバイパスコンデンサを使用して電子的に隔離される。
図14には、マイクロアッセイカートリッジ1402内に埋め込まれた検出または試料ウェル(1403)の中のフルオロフォアの励起のための光学遷移が示されている。ヘッドは、走査ヘッドであり、マイクロアッセイカートリッジ1402(二重矢印)を横断する。PCB1301上の励起LED1331からの光は、レンズ1332によって平行にされ、帯域通過フィルタ1333によって本質的に単色にされる。前述のように、LED強度制御ループは、コリメートされた光を、光サンプラ鏡1338から、中性濃度フィルタ1339を通して、LED強度検出器1340に反射させることによって形成される。検出ウェル1403の中の任意の1つまたは複数のフルオロフォア(対照フルオロフォアであろうと標的フルオロフォアであろうと)は、対物レンズ1330によって試料上に集束された入射光1420によって励起される。図Xでは、ルオロフォアの発光は、対物レンズ1330によって収集され、二色性ビームスプリッタ1334、発光フィルタ1335、およびセンサレンズ1336を通過した後にセンサ1337に伝達される。センサ1337は、出力信号を増幅し、ファラデー箱の中で遮蔽される、高利得トランジスタの基部と直接電気的に接触している。発光した蛍光は、概して、フルオロフォアのストークス偏移に従って、より長い波長であり、発光した光が、損失を伴わずに二色性帯域通過鏡1334および発光帯域通過フィルタ1335を通過することを可能にする。したがって、試料チャンバ1403aから対物レンズ1330へ戻される光は、発光および反射蛍光1421および反射励起光1420の混合物である。散在する反射を捕捉するように、光トラップ(図示せず)が提供される。反射光1420は、二色性鏡1334を通過せず、光源に戻され、センサ1337における発光強度の測定に干渉しない。励起源、光源平行レンズ、励起フィルタ、二色性鏡、対物レンズ、励起フィルタ、センサレンズ、および増幅器を有する検出器を含む、単一チャネルの光学要素は、本質的に単色の光源波長と、標的(または対照)フルオロフォアの特性を示す特定の波長において蛍光を検出するための高度特異的センサとを有する、光学部モジュールを構成する。一方の光学部モジュールまたはチャネルが分析法標的に、他方のモジュールが対照チャネルに使用されてもよい。複数のフルオロフォアについてのデータを収集するために、タンデム載置光学部チャネルが使用されてもよく、その場合、電気的処理は、ホスト器具への伝送前に、常駐ダイモンの制御下、埋め込みマイクロプロセッサを通して多重化される。示されるように、2つのチャネルはそれぞれ、2つの回路基板のそれぞれ上で回路を共有するが、別個の光学部を有する。随意に、付加的なチャネルが、示される光学要素の複製のプロセスによって、検出器ヘッドに組み込まれてもよい。
マイクロアッセイカートリッジ1402は、検出器ヘッド1300に対して移動可能(二重矢印)であり、検出器ヘッドまたはカートリッジトレイあるいは載置シャーシの動力化は、走査を可能にし、カートリッジ1402を横断するトランセクトは、例えば、測定が試料チャンバ1403上で行われることを可能にする。検出器ヘッドの中で並んで載置される複数の検出光学部を使用することによって、試料チャンバを複数のフルオロフォアについて連続して走査することができる。
一実施形態によれば、励起電子機器がプリント回路基板(1301)の上に載置され、検出電子機器が第2のPCB(1302)の上に載置される。エッジコネクタ1304が、基板を電気的に接合する。ファラデー箱1306が、散在する電磁雑音からセンサおよび関連高利得増幅器を保護する。ペルチェ熱ポンプの温度は、光学データが、自律プロセスにおいて、検出ヘッド内の埋め込みプロセッサによって得取される間、ホストコントローラの制御下、温度およびモータ機能を用いて、例えば、FRET融解判定におけるように、走査の間、勾配をつけることができる。
アッセイ認証および品質制御
驚くべきことに、本発明のホスト器具の自律検出器ヘッド機能は、各チャネルが、励起光を放射するためのLEDと、励起フィルタを有する少なくとも1つの光経路と、放出フィルタと、定義された通過帯域内のフルオロフォアからの放出の検出を可能にするように調整される二色性鏡と、該励起光を濃縮し、該放出を収集するための対物レンズと、任意の通過帯域放出を受信するためのセンサと、センサからの出力を増幅させるための高利得増幅器とを備えるように、個々のフルオロフォアの検出のための別個の光チャネルを含む二重ヘッドおよびマルチヘッド検出器内で多重化されることができ、各LEDは、チャネルの照射周波数が重複しないような周波数範囲内で光を放射するように構成され、そして各光チャネルは、チャネルの放出通過帯域が重複しないように構成される。さらに、各光チャネルは、前述のように、LED強度を動作中に修正するために、LED強度制御回路とともに構成される。
驚くべきことに、本発明のホスト器具の自律検出器ヘッド機能は、各チャネルが、励起光を放射するためのLEDと、励起フィルタを有する少なくとも1つの光経路と、放出フィルタと、定義された通過帯域内のフルオロフォアからの放出の検出を可能にするように調整される二色性鏡と、該励起光を濃縮し、該放出を収集するための対物レンズと、任意の通過帯域放出を受信するためのセンサと、センサからの出力を増幅させるための高利得増幅器とを備えるように、個々のフルオロフォアの検出のための別個の光チャネルを含む二重ヘッドおよびマルチヘッド検出器内で多重化されることができ、各LEDは、チャネルの照射周波数が重複しないような周波数範囲内で光を放射するように構成され、そして各光チャネルは、チャネルの放出通過帯域が重複しないように構成される。さらに、各光チャネルは、前述のように、LED強度を動作中に修正するために、LED強度制御回路とともに構成される。
アッセイ認証のために、2つの(またはそれを上回る)センサチャネルが、2つまたはそれを上回るフルオロフォアを監視するために提供され、これら2つのセンサチャネルは、各フルオロフォアからの放出通過帯域が重複しないように構成される。好ましい実施形態では、第1の検出チャネルは、標的信号を検出する目的のためのものであって、第2の検出チャネルは、内部プロセス対照信号を検出する目的のためのものであって、アッセイ結果は、有効内部プロセス対照信号が報告される場合であって、かつその場合に限り、報告される。
本システムは、「バイプレックス」またはマルチプレックス標的およびプロセス対照信号のペアを成す収集を要求するアッセイプロトコルの認証で有用であることが証明された。FDA CLIAウェーバー要件に関して、標的およびプロセス対照テンプレートの両方が並行して増幅される場合、陽性プロセス対照信号が、検査試料のアッセイ結果を報告または請求することができる前に、存在するはずである。検出可能プロセス対照信号が存在しない場合には、検出された任意の標的信号は、有効な結果ではない。本条件が満たされる場合、1988年の臨床検査改善修正法案(CLIA)の下、単純かつ低リスク検査を統制する規制は、免除され、検査は、医院および種々の他の場所において監視を伴わずに行われることができる。これらのCLIAウェーバー要件を満たすために、蛍光検出器は、例えば、PCRによって増幅される標的感染性生物の存在だけではなく、標的または内因性ヒト遺伝子とともに共存し、同じPCR反応または器具中で並行して行われるPCR反応によって増幅される、内因性ヒト対照生物の存在も検出できることが必要である。例えば、プロセス対照は、ヒトミトコンドリア遺伝子であってもよく、本発明の好ましい実施形態では、プロセス対照は、ミトコンドリアチトクロームcオキシダーゼサブユニット2をコードする、MTOC2遺伝子である。
検出システムは、UV、可視領域、および近赤外スペクトル内の波長のために構成することができる。近単色出力、フィルタ、発色団、およびフルオロフォアを有する、利用可能な光源は、300〜900nmの範囲内の同調励起および放出通過帯域を可能にする。本発明の好ましい動作モードのうちの1つである、蛍光検出モードでの用途について、装置は、UVおよび可視スペクトル内の励起スペクトルを伴う特定の蛍光染料のために、ならびにUV、可視、および近赤外スペクトル内の発光のために構成することができる。赤色シフトがより典型的であるが、上方変換フルオロフォアも使用されてもよい。
埋め込みマイクロプロセッサへの入力は、いくつかの標的被分析物および内部プロセス対照が同時にアッセイされ得るように多重化される。検出器ヘッドは、少なくとも2つまたはそれを上回る光チャネルが提供され、それぞれは、離散波長で動作する、独立励起光学部および放出光学部を有する。白色励起光は、標的フルオロフォアおよび内部対照フルオロフォアが共通液体試料中で混合されるとき等、多重化されたアッセイ内の異なるフルオロフォア間の可能性として考えられるクロストークを排除するために使用されない。
良好な実験実践標準はまた、典型的には、外部対照として行われる、陽性および陰性アッセイ対照を用いた診断検査結果の認証を要求する。技術水準に優る大きな進歩として、本発明のマイクロアッセイカートリッジは、統合された陽性および陰性対照が提供される。図15および16は、一般化されたマイクロ流体アッセイ回路に統合された、本発明の陽性および陰性対照回路の特定の実施形態の詳細を図示する。図15は、本発明の一実施形態を図示する、デバイス100の概略図である。マイクロ流体デバイス100は、2つの独立アッセイ回路:検査アッセイ回路200および対照アッセイ回路300を有する。検査アッセイ回路200は、マイクロ流体チャネル215および試料抽出チャンバ220と流体連通する、試料入口ポート210を含む。試料抽出チャンバ220は、下流チャネル235および1つまたはそれを上回る検査アッセイウェルと流体連通する。本実施形態では、マイクロ流体チャネル235は、3つの検査アッセイウェル250a、250b、および250cと流体連通するが、当業者は、検査アッセイ回路200が任意の数のアッセイウェルを含んでもよいことを理解し得る。アッセイウェル250a、250b、および250cは、分子アッセイ(例えば、PCR)を行い、アッセイ信号(例えば、蛍光信号)の有無を検出するために必要な全ての試薬を含む。各アッセイウェルは、酵素混合物270a、270b、または270cを含み、その組成は、同じである。酵素混合物は、酵素(単数または複数)と、標的テンプレートおよびプロセス対照テンプレートの増幅のために必要な他の試薬とを含む。各アッセイウェルはさらに、プロセス対照プライマー/プローブ混合物275a、275b、または275cを含み、その組成もまた、同じである。プロセス対照プライマー/プローブ混合物は、プロセス対照テンプレートの増幅および検出のために好適なプライマーおよびプローブを含む。各アッセイウェルはさらに、図15において異なる色で区別される、特有の標的テンプレートの増幅および検出のために好適な特有の標的プライマー/プローブ混合物を含む。本実施形態では、アッセイウェル250aは、標的配列1プライマー/プローブ混合物280を含み、アッセイウェル250bは、標的配列2プライマー/プローブ混合物285を含み、アッセイウェル250cは、標的配列3プライマー/プローブ混合物290を含む。本発明の実施形態は、3つの検査標的配列を検出するように構成されるが、任意の数の標的配列が、本発明のアッセイウェルおよび標的配列プライマー/プローブ混合物の数を増減することによってアッセイされてもよいことが、当業者に容易に理解され得る。
マイクロ流体デバイス100の対照アッセイ回路300は、下流マイクロ流体チャネル325と流体連通する、対照緩衝液チャンバ320を含む。一実施形態では、対照緩衝液チャンバ320は、任意の生物学的材料、例えば、核酸を欠いた空の緩衝液溶液を含む。マイクロ流体チャネル325は、2つの対照チャネル、すなわち、陰性対照チャネル335および陽性対照チャネル345に分割される。陰性対照チャネル335は、陰性対照アッセイウェル350a、350b、および350cと流体連通する。本実施形態では、陰性対照チャネルは、3つのアッセイウェルと流体連通するが、当業者は、陰性対照回路が任意の数のアッセイウェルを備えてもよいことを理解し得る。各陰性対照アッセイウェルは、特有の検査アッセイウェルのうちの1つに対応する。陰性対照アッセイウェル350a、350b、および350cは、分子アッセイを行い、プロセス対照テンプレートおよび標的テンプレートの有無を検出するために、検査アッセイウェルと同一試薬を含む。陰性対照アッセイウェル350a、b、およびcは、それぞれ、酵素混合物370a、370b、および370cを含む。これらの酵素混合物のそれぞれの組成は、各アッセイウェル内で同じである。酵素混合物は、酵素(単数または複数)と、標的配列およびプロセス対照配列の増幅のために必要な他の試薬とを含む。アッセイウェル350a、b、およびcはさらに、プロセス対照プライマー/プローブ混合物375a、375b、および375cを含む。これらの内部制御プライマー/プローブ混合物のそれぞれの組成もまた、各アッセイウェル内で同じである。プロセス対照プライマープローブ混合物は、プロセス対照配列の増幅および検出のために好適なプライマーおよびプローブを含む。各アッセイウェルはさらに、特有の標的配列プライマー/プローブ混合物を含む。本実施形態では、アッセイウェル350aは、標的配列1プライマー/プローブ混合物380aを含み、アッセイウェル350bは、標的配列2プライマー/プローブ混合物385aを含み、アッセイウェル350cは、標的配列3プライマー/プローブ混合物390aを含む。標的配列プライマー/プローブ混合物380a、385a、および390aはそれぞれ、特有の関心の標的配列を増幅および検出するために必要なプライマーおよびプローブを含む。混合物380aのプライマー/プローブは、混合物280のものと同じである一方、混合物385aおよび390aのものは、それぞれ、混合物285および290のものと同じである。
陽性対照チャネル345は、順に、陽性対照アッセイウェル360a、360b、および360cと流体連通する。本実施形態では、陽性対照チャネルは、3つのアッセイウェルと流体連通するが、当業者は、陽性対照回路が任意の数のアッセイウェルを備えてもよいことを理解し得る。各陽性対照アッセイウェルは、特有の検査アッセイウェルおよび特有の陰性対照アッセイウェルに対応する。それらの対応する検査アッセイウェルと同様に、陽性対照アッセイウェル360a、360b、および360は、分子アッセイを行い、標的およびプロセス対照配列の有無を検出するために必要な全ての試薬を含む。重要なこととして、陽性対照ウェルには、標的核酸テンプレートの外因性試料が埋め込まれる。各陽性対照アッセイウェルは、酵素混合物370d、370e、または370fを含み、その組成は、各アッセイウェル内で同じである。酵素混合物は、標的およびプロセス対照配列の増幅のために必要な酵素および試薬を含む。各アッセイウェル360a、b、およびcはさらに、プロセス対照プライマー/プローブ混合物375d、375e、および375fを含み、その組成もまた、各アッセイウェル内で同じである。プロセス対照プライマー/プローブ混合物は、プロセス対照標的の増幅および検出のために好適なプライマーおよびプローブを含む。各アッセイウェルはさらに、特有の標的配列プライマー/プローブ混合物を含む。本実施形態では、アッセイウェル360aは、標的配列1プライマー/プローブ混合物380bを備え、アッセイウェル360bは、標的配列2プライマー/プローブ混合物385bを備え、アッセイウェル360cは、標的配列3プライマー/プローブ混合物390bを備える。各標的配列プライマー/プローブ混合物380b、385b、および390bは、特有の関心の標的配列を増幅および検出するために必要なプライマーおよびプローブを含む。混合物380bのプライマーおよびプローブは、混合物280のものと同じである一方、混合物385bおよび390bのものは、それぞれ、混合物285および290のものと同じである。各陽性対照アッセイウェルはまた、本明細書では、395a、395b、および395cとして指定される、埋め込みプロセス対照テンプレート試料を含む。埋め込みプロセス対照テンプレート試料は、既知の量のプロセス対照テンプレート核酸を含み、各陽性対照アッセイウェル内で同じである。各陽性対照アッセイウェルはさらに、本明細書では、397a、397b、または397cとして指定される、埋め込み標的配列テンプレート試料を含む。本実施形態では、標的配列テンプレート試料397aは、既知の量の標的配列1核酸テンプレートを含む一方、標的配列テンプレート試料397bおよび397cは、それぞれ、既知の量の標的配列2および標的配列3核酸テンプレートを含む。本発明の本実施形態では、各標的配列は、単一の対応する陽性対照アッセイウェルによって表されるが、複数の陽性対照アッセイウェルは、所定の標的配列のために企図されてもよく、例えば、ウェルは、異なる濃度の所定の標的テンプレートを含むことが、当業者によって理解され得る。そのような陽性対照は、例えば、定量的PCR分析のための標準的曲線を生成する際に有用である。
図16は、本発明の対照アッセイ回路の代替構成を描写する。本実施形態では、検査回路200の構成は、図15に説明されるものと同じであるが、陰性対照回路300および陽性対照回路400の構成は、それらが流体連通せず、代わりに、独立流体回路によって表されるという点において異なる。検査および陰性対照アッセイウェル内に含まれる全ての試薬は、図15に関して説明されるものと同じである。陽性対照試料回路400は、マイクロ流体チャネル415および下流試料抽出チャンバ420と流体連通する、陽性対照試料ポート410を含む。陽性対照アッセイウェル460a、460b、および460cは、図15に説明されるものと同一酵素混合物試料(470d、e、およびf)、プロセス対照プライマー/プローブ混合物(475d、475e、および475f)、および標的プライマー/プローブ混合物(480b、485b、および490b)を含む。しかしながら、陽性対照アッセイウェルは、埋め込み核酸テンプレート試料を含まない。本発明のこの実施形態の実践では、ユーザは、陽性対照テンプレートを外部試料源から供給し、これは、陽性対照チャネル400の中に試料ポート410を通して導入される。陽性対照試料は、抽出チャンバ420内で処理され、抽出された核酸は、本明細書に説明される方法のいずれかによって、アッセイウェル460a、460b、および460c内で分析される。本発明の別の実施形態では、非生存陽性対照テンプレート試料は、マイクロ流体カートリッジの製造の際、試料ポート410の中に事前装填される。非生存陽性対照試料は、死滅した細菌、プラスミドDNA、または同等物を含んでもよい。事前装填された陽性対照試料は、前述の検査試料に関して説明されるものと同じ抽出および増幅を受ける。
実践では、ユーザは、関心の標的配列のためにアッセイされるべき検査試料をマイクロ流体デバイスの試料ポートに適用する。試料は、下流抽出チャンバに進入し、そこで、核酸は、当技術分野において公知の任意の手段によってPCRのために抽出される。抽出された核酸試料は、前述の試薬およびプライマー/プローブ混合物との増幅および検出のために、検査アッセイウェルに進入する。本発明の実施形態のデバイスは、並行して3つの特有の検査配列の有無に関してアッセイするように構成され、各特有の増幅反応は、標的およびプロセス対照テンプレートの同時増幅のために二重化される。デバイス上で行われる特有の標的アッセイ毎に、対応する陽性および陰性対照が、統合された制御回路内で並行して行われ、付加的外部品質制御を行う必要性を排除する。
陽性および陰性対照アッセイからの結果は、検査アッセイ結果の認証のさらなる基準として使用されてもよい。例えば、陽性検査アッセイ結果を認証するために、陰性対照アッセイウェル内で産生された蛍光信号が閾値を下回り、陽性検査信号が外因性テンプレートとのシステム汚染に起因するものではないことを示すことを要求する、基準が設定されてもよい。同様に、陰性検査アッセイ結果を認証するために、陽性対照アッセイウェル内で産生される蛍光信号が閾値を超え、検査試薬、プライマー、およびプローブの完全性を確認することを要求する、基準が設定されてもよい。したがって、本発明の方法は、以下の3つの基準、すなわち、1)プロセス対照信号が陽性であって、2)陰性対照信号が陰性であって、かつ3)陽性対照信号が陽性であることが満たされる場合であって、かつその場合に限り、検査アッセイを有効として報告するステップを含む、検査アッセイ結果を認証するための方法を含む。
本発明の他の実施形態は、検査結果を認証し、標的およびアッセイウェル内で生成された蛍光信号を直接比較することによって、結果を標的配列に対して陽性または陰性としてスコア化する方法を含む。これらの方法のさらなる詳述は、図15を参照して行われる。一実施形態では、プロセス対照配列は、デバイス100によって、第1の蛍光信号を使用して検出される一方、検査標的配列は、第2の蛍光信号を使用して検出される。第1および第2の蛍光信号間の直接比較は、それぞれ、エンドユーザによって設定される恣意的認証比率に基づく、診断アッセイのための以下の5つの認証またはスコア化ステップにおいて行われてもよい。1)プロセス対照アッセイの完全性を認証するために、陽性対照ウェル360a、360b、および360cからの第1の蛍光信号(プロセス対照信号を報告する)が、陰性対照ウェル350a、350b、および350cのものと比較される。一実施形態では、有効結果は、陽性対照信号が陰性対照信号のものよりも約2.5倍大きい場合のみ報告される。2)標的アッセイの完全性を認証するために、陽性対照ウェル360a、360b、および360cからの第2の蛍光信号(標的信号を報告する)が、陰性対照ウェル350a、350b、および350cのものと比較される。一実施形態では、有効結果は、陽性対照信号が陰性対照ウェルのものよりも約5倍大きい場合のみ報告される。3)抽出プロセスの完全性を認証するために、検査アッセイウェル250a、250b、および250cからの第1の蛍光信号(プロセス対照信号を報告する)が、陰性対照ウェル350a、350b、および350cのものと比較される。有効結果は、検査アッセイ信号が陰性対照ウェルのものよりも少なくとも約2倍大きい場合のみ報告される。4)陽性検査アッセイ結果の完全性を認証する(すなわち、汚染に起因する偽陽性を排除する)ために、陰性対照ウェル350a、350b、および350cの第1の蛍光信号および/または第2の蛍光信号が、増幅前の同一ウェルからの信号レベル(すなわち、背景)と比較され、有効結果は、増幅後アッセイ信号が実質的に背景を上回って増加していない場合のみ報告される。5)検査アッセイ信号を検査被分析物に対して陽性または陰性としてスコア化するために、検査アッセイウェル250a、250b、および250c内の第2の蛍光信号が、陰性対照ウェル350a、350b、および350cのものと比較される。検査アッセイは、検査信号が陰性対照ウェルよりも少なくとも約3倍大きい場合、陽性として、検査信号が陰性対照ウェルよりも約3倍未満において大きい場合、陰性として報告される。前述の認証比率は、恣意的であって、多くの代替値が、特定のアッセイに特有の多くの要因に応じて、任意の所定の診断アッセイに適切であり得ることが当業者によって理解され得る。
本発明のさらに別の実施形態では、走査データは、アッセイウェルが検査試料で正常に充填されたかどうかを判定するために使用されてもよい。アッセイウェルは、乾燥している間は、「充填前」として、増幅前は、「充填後」として走査される。「充填前」と「充填後」の蛍光信号の比較は、ウェルが検査試料で適正に充填されたかどうかを判定するために使用されてもよい。例えば、充填後のより低い蛍光信号を示すウェルは、適正に充填されておらず、任意のアッセイ結果が無効である可能性が高いことを示し得る。
有利なこととして、我々は、カートリッジを走査するために要求される時間が、カートリッジ内の各ウェルの位置を事前検出する、工場較正プロセスによって大幅に短縮され得ることを発見した。工場較正の際、カートリッジの連続走査が行われ、「定位置」からの各ウェル位置を特定するために要求されるステッピングモータパルスの数が、検出器ヘッドファームウェア内の不揮発性メモリ内に較正データとして記憶される。動作時、検出器ヘッドは、これらの較正された位置のそれぞれにステッピングし、これらの位置においてのみ光学データを採取することによって、「離散走査」を行う。検出器ヘッドが、走査の間、各個々のウェルを特定する必要性を排除することによって、全9つのウェルの走査を行うための時間は、約1秒未満まで短縮され、これは、技術水準における明白な改良点である。
例示の実施形態は、以下を含む。
実施形態1.試料アッセイを行うためのマイクロアッセイカートリッジであって、
a)その中に封入された空気圧回路を有する、第1の成形筐体と、
b)その中に封入された流体圧回路を有する、第2の成形筐体と、
c)検査試料を受容するための試料入口であって、上記流体圧回路と流体連通する、試料入口と、
d)上記第1の成形筐体と上記第2の成形筐体との間に介在されるラミネート層であって、上記空気圧回路および上記流体圧回路と流体連通する複数の空気流体圧膜を備える、ラミネート層と、
e)上記流体圧回路と流体連通する、アッセイウェルアセンブリと、
f)空気圧インターフェースを画定する空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、そこに印加される空気圧パルスを受容し、上記ポートは、上記空気圧回路と流体連通し、上記空気圧パルスは、陽圧パルスまたは陰圧パルスである、空気圧ポートのアレイと、
を備え、
実施形態1.試料アッセイを行うためのマイクロアッセイカートリッジであって、
a)その中に封入された空気圧回路を有する、第1の成形筐体と、
b)その中に封入された流体圧回路を有する、第2の成形筐体と、
c)検査試料を受容するための試料入口であって、上記流体圧回路と流体連通する、試料入口と、
d)上記第1の成形筐体と上記第2の成形筐体との間に介在されるラミネート層であって、上記空気圧回路および上記流体圧回路と流体連通する複数の空気流体圧膜を備える、ラミネート層と、
e)上記流体圧回路と流体連通する、アッセイウェルアセンブリと、
f)空気圧インターフェースを画定する空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、そこに印加される空気圧パルスを受容し、上記ポートは、上記空気圧回路と流体連通し、上記空気圧パルスは、陽圧パルスまたは陰圧パルスである、空気圧ポートのアレイと、
を備え、
上記カートリッジは、上記空気流体圧膜が上記空気圧パルスによって動作可能に制御されるようにされる。
実施形態2.上記流体圧回路は、検査アッセイ回路と、対照アッセイ回路とを備える、実施形態1に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態3.上記検査アッセイ対照回路は、上記試料入口と流体連通し、上記対照アッセイ回路は、上記試料入口と流体連通しない、実施形態2に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態4.上記対照アッセイ回路は、陽性対照アッセイ回路と、陰性対照アッセイ回路とを備える、実施形態3に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態5.上記陽性対照アッセイ回路および上記陰性対照アッセイ回路は、流体連通している、実施形態4に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態6.上記陽性対照アッセイ回路および上記陰性対照アッセイ回路は、流体連通していない、実施形態4に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態7.上記検査アッセイ回路、上記陽性対照アッセイ回路、および上記陰性対照アッセイ回路はそれぞれ、複数のアッセイウェルのそれぞれと流体連通する、実施形態3に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態8.上記複数のアッセイウェルは、最大3つである、実施形態7に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態9.上記複数のアッセイウェルは、3つである、実施形態7に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態10.上記複数のウェルはそれぞれ、プロセス対照を行うように構成される、実施形態7〜9のいずれか1つに記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態11.上記陽性対照アッセイウェルは、陽性対照核酸テンプレートを備える、実施形態7〜9のいずれか1つに記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態12.上記流体圧回路と流体連通する核酸捕捉アセンブリをさらに備える、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のマイクロアッセイカード。
実施形態13.上記核酸捕捉アセンブリは、中空筐体部材と、その中に配置される核酸捕捉膜とを備える、実施形態12に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態14.上記核酸捕捉膜は、シリカファイバを含む、実施形態13に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態15.上記筐体部材の内部に配置される、上側支持媒体および下側支持媒体をさらに備え、上記核酸捕捉膜は、上記上側支持媒体と上記下側支持媒体との間に介在される、実施形態13に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態16.上記上側および下側支持媒体は、POREX(登録商標)フリットである、実施形態15に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態17.上記上側および下側支持媒体は、ポリプロピレンワッシャである、実施形態15に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
実施形態18.上記アッセイウェルアセンブリは、複数のウェルとともに構成されるPCRウェル層を備え、上記ウェルはそれぞれ、任意の得られた単位複製配列のPCR増幅および蛍光検出のために必要な全ての試薬を含む、実施形態1〜17のいずれか1つに記載のマイクロアッセイカード。
実施形態19.上記PCRウェル層は、高熱伝導ポリマーから形成される、実施形態18に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態20.上記PCRウェル層は、終点PCR、リアルタイムPCR、または融解曲線分析のために構成される、実施形態18に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態21.上記第1の成形筐体は、上記アッセイウェルアセンブリを覆う光学検出ウィンドウを備え、上記光学検出ウィンドウは、上記第1の成形筐体の上側表面上の菱形形状の開口部と、上記第1の成形筐体の下側表面上のより小さい菱形形状の開口部とから形成され、上記光学ウィンドウの側面は、第1の成形筐体の上側表面から下側表面に内向きに角度付けられる、実施形態1〜20のいずれか1つに記載のマイクロアッセイカード。
実施形態22.上記光学ウィンドウと上記アッセイウェルアセンブリとの間に介在される光学的に透明なカバー層をさらに備える、実施形態21に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態23.上記第1の成形筐体は、上記空気圧回路および上記流体圧回路と流体連通する複数の試薬リザーバを備える、実施形態1〜22のいずかに記載のマイクロアッセイカード。
実施形態24.上記試薬リザーバは、二重層箔パックである、実施形態23に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態25.上記箔パックは、気密接着剤シールによって上記第1の成形筐体に固定して接着される、実施形態24に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態26.最大6つの試薬リザーバを備える、実施形態23に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態27.上記箔パックの下方に配置される鋭利物をさらに備え、上記鋭利物は、上記箔パックが、上記空気圧回路への圧力パルスの印加によって、上記鋭利物と接触するように押勢されると、上記箔パックを破裂させるためである、実施形態24に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態28.上記鋭利物は、金属から形成される、実施形態27に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態29.上記鋭利物は、上記成形筐体に対して垂直を下回る角度で突出する、返しを備える、実施形態28に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態30.上記角度は、約75度である、実施形態29に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態31.上記試薬パックと上記鋭利物との間に介在されるバネをさらに備え、上記バネは、固有のバネ力を有し、上記バネ力は、圧力パルスの不在下、上記試薬パックと上記鋭利物との間の接触を防止する、実施形態20に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態32.上記空気圧ポート内に配置されるエアロゾルフィルタプラグをさらに備える、実施形態1〜31のいずれか1つに記載のマイクロアッセイカード。
実施形態33.上記エアロゾルフィルタプラグは、液体膨張性材料から形成される、実施形態25に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態34.上記陽圧および陰圧の状態は、+150、+100、+70、0、−35、および−50kPaから選択される、実施形態1〜33のいずれか1つに記載のマイクロアッセイカード。
実施形態35.上記空気圧インターフェースをホスト器具に接合するように構成される単回使用密閉ガスケットをさらに備える、実施形態1〜34に記載のマイクロアッセイカード。
実施形態36.試料アッセイを行うためのマイクロアッセイシステムであって、
a)ホスト器具とドッキングするために構成される使い捨てマイクロアッセイカートリッジであって、上記カートリッジは、その中に配置される流体圧回路を有し、上記流体圧回路は、それとインターフェースされた空気圧回路の制御下で動作するように構成され、上記流体圧回路は、検査アッセイ回路、陽性対照アッセイ回路、および陰性対照アッセイ回路を備える、カートリッジと、
b)空気圧インターフェースを画定する1つまたはそれを上回る空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、空気圧状態を上記ホスト器具から上記空気圧回路に伝達するようにされる、空気圧ポートのアレイと、
c)記ホスト器具内に配置される空気圧マニホールドであって、上記マニホールドは、そこに流体結合される複数の空気圧源を有し、複数の圧力状態で動作されるように構成され、上記空気圧インターフェースのポートを通して上記空気圧回路に流体接続される、マニホールドと、
d)試料中の少なくとも1つの光学信号を検出するための検出器ヘッドであって、1〜5の検出チャネルを備える、検出器ヘッドと、
を備える、システム。
a)ホスト器具とドッキングするために構成される使い捨てマイクロアッセイカートリッジであって、上記カートリッジは、その中に配置される流体圧回路を有し、上記流体圧回路は、それとインターフェースされた空気圧回路の制御下で動作するように構成され、上記流体圧回路は、検査アッセイ回路、陽性対照アッセイ回路、および陰性対照アッセイ回路を備える、カートリッジと、
b)空気圧インターフェースを画定する1つまたはそれを上回る空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、空気圧状態を上記ホスト器具から上記空気圧回路に伝達するようにされる、空気圧ポートのアレイと、
c)記ホスト器具内に配置される空気圧マニホールドであって、上記マニホールドは、そこに流体結合される複数の空気圧源を有し、複数の圧力状態で動作されるように構成され、上記空気圧インターフェースのポートを通して上記空気圧回路に流体接続される、マニホールドと、
d)試料中の少なくとも1つの光学信号を検出するための検出器ヘッドであって、1〜5の検出チャネルを備える、検出器ヘッドと、
を備える、システム。
実施形態37.上記ホスト器具は、少なくとも1つのペルチェ熱ポンプを備える、実施形態36に記載のマイクロアッセイシステム。
実施形態38.上記マイクロアッセイカートリッジは、上記流体圧回路と流体連通し、上記ペルチェ熱ポンプと熱接触する、アッセイウェルアセンブリを備える、実施形態37に記載のマイクロアッセイシステム。
実施形態39.上記ホスト器具は、上記流体圧回路と熱接触する少なくとも1つの熱ブロックを備える、実施形態38に記載のマイクロアッセイシステム。
実施形態40.上記カートリッジは、上記流体圧回路と流体連通し、上記熱ブロックと熱接触する、核酸捕捉アセンブリを備える、実施形態38に記載のマイクロアッセイシステム。
実施形態41.上記検出器ヘッドは、上記検査試料回路および上記対照試料回路を横断する複数の離散経路上の上記マイクロアッセイカートリッジを走査するように構成され、上記離散経路はそれぞれ、少なくとも1つの基準点によって画定され、上記基準点は、ホスト器具較正の間に事前定義される空間座標である、実施形態36〜40のいずれか1つに記載のマイクロアッセイシステム。
実施形態42.上記空気圧インターフェースポートアレイを上記空気圧マニホールドに接合するように構成される単回使用密閉ガスケットをさらに備える、実施形態36〜41のいずれか1つに記載のマイクロアッセイシステム。
実施形態43.上記空気圧ポート内に配置されるエアロゾルフィルタプラグをさらに備える、実施形態36〜42のいずれか1つに記載のマイクロアッセイシステム。
実施形態44.約20の空気圧ポートを備える、実施形態36〜43のいずれか1つに記載のマイクロアッセイシステム。
実施形態45.上記検出器ヘッドの検出チャネルはそれぞれ、励起光サンプラ鏡、中性密度フィルタ、およびLED強度検出器を備える、LED強度変調回路を備える、実施形態36〜44のいずれか1つに記載のマイクロアッセイシステム。
実施形態46.上記カートリッジは、接地プレートに対して約15度の角度で保持される、実施形態36〜45のいずれか1つに記載のマイクロアッセイシステム。
実施形態47.病態と関連付けられる標的蛍光信号のための制御されたアッセイを行う方法であって、
a)実施形態36に記載のシステムを用いて検査アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、上記標的蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出され、内因性成分と関連付けられるプロセス対照蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第2の光チャネル内で検出される、ステップと、
b)実施形態36に記載のシステムを用いて陽性対照蛍光信号のための陽性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、上記陽性対照蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出される、ステップと、
c)実施形態36に記載のシステムを用いて陰性対照蛍光信号のための陰性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、上記陰性対照蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出される、ステップと、
d)上記第2の蛍光プロセス対照信号が検出され、上記陽性対照の第1の蛍光信号が検出され、上記陰性対照の第1の蛍光信号が検出されない場合であって、かつその場合に限り、上記第1の標的制御信号を上記アッセイの有効結果として報告するステップと、
を含む、方法。
a)実施形態36に記載のシステムを用いて検査アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、上記標的蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出され、内因性成分と関連付けられるプロセス対照蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第2の光チャネル内で検出される、ステップと、
b)実施形態36に記載のシステムを用いて陽性対照蛍光信号のための陽性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、上記陽性対照蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出される、ステップと、
c)実施形態36に記載のシステムを用いて陰性対照蛍光信号のための陰性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、上記陰性対照蛍光信号は、存在する場合、上記検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出される、ステップと、
d)上記第2の蛍光プロセス対照信号が検出され、上記陽性対照の第1の蛍光信号が検出され、上記陰性対照の第1の蛍光信号が検出されない場合であって、かつその場合に限り、上記第1の標的制御信号を上記アッセイの有効結果として報告するステップと、
を含む、方法。
実施形態48.上記検査アッセイ回路、上記陽性対照アッセイ回路、および上記陰性対照アッセイ回路はそれぞれ、最大3つのアッセイウェルをそれぞれ備える、実施形態47に記載の方法。
実施形態49.上記最大3つのアッセイウェルはそれぞれ、特有の標的蛍光信号をアッセイするように構成される、実施形態48に記載の方法。
実施形態50.上記標的蛍光信号と上記陽性対照蛍光信号および上記陰性対照蛍光信号とを比較し、上記試料を上記病態に対して陽性または陰性としてスコアするステップをさらに含む、実施形態47〜49のいずれか1つに記載の方法。
実施形態51.上記比較するステップは、第1の比率を計算することであって、上記第1の比率は、上記標的蛍光信号と上記陽性対照蛍光信号の比率である、ことと、第2の比率を計算することであって、上記第2の比率は、上記標的蛍光信号と上記陰性対照蛍光信号の比率である、ことと、上記第1および第2の比率と認証比率とを比較することとを含む、実施形態50に記載の方法。
実施形態52.上記試料は、上記第1の比率が上記認証比率よりも大きい場合、陽性としてスコアされ、上記試料は、上記第2の比率が上記認証比率未満である場合、陰性としてスコアされる、実施形態51に記載の方法。
上記は、本発明の特定の実施形態の説明であるが、種々の代替案、修正、および等価物を使用することが可能である。したがって、本発明の範囲は、上記の説明を参照して決定されるべきではないが、代わりに、均等物のそれらの全範囲とともに、添付の請求項を参照して決定されるべきである。添付の請求項は、そのような制限が「〜のための手段」という語句を使用して所定の請求項で明示的に記載されない限り、手段と機能の制限を含むものとして解釈されるものではない。本明細書で参照される、および/または添付の出願データシートで引用される、2014年6月11日に出願された米国仮出願番号第62/010,915号を含むが、それに限定されない、米国特許、米国特許出願第公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許出版物の全ては、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。なおさらなる実施形態を提供するために、種々の特許、出願、および出版物の概念を採用する必要がある場合、実施形態の側面を修正することができる。
Claims (52)
- 試料アッセイを行うためのマイクロアッセイカートリッジであって、
a)その中に封入された空気圧回路を有する、第1の成形筐体と、
b)その中に封入された流体圧回路を有する、第2の成形筐体と、
c)検査試料を受容するための試料入口であって、前記流体圧回路と流体連通する、試料入口と、
d)前記第1の成形筐体と前記第2の成形筐体との間に介在されるラミネート層であって、前記空気圧回路および前記流体圧回路と流体連通する複数の空気流体圧膜を備える、ラミネート層と、
e)前記流体圧回路と流体連通する、アッセイウェルアセンブリと、
f)空気圧インターフェースを画定する空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、そこに印加される空気圧パルスを受容し、前記ポートは、前記空気圧回路と流体連通し、前記空気圧パルスは、陽圧パルスまたは陰圧パルスである、空気圧ポートのアレイと、
を備え、前記カートリッジは、前記空気流体圧膜が前記空気圧パルスによって動作可能に制御されるようにされる、カートリッジ。 - 前記流体圧回路は、検査アッセイ回路と、対照アッセイ回路とを備える、請求項1に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記検査アッセイ対照回路は、前記試料入口と流体連通し、前記対照アッセイ回路は、前記試料入口と流体連通しない、請求項2に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記対照アッセイ回路は、陽性対照アッセイ回路と、陰性対照アッセイ回路とを備える、請求項3に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記陽性対照アッセイ回路および前記陰性対照アッセイ回路は、流体連通している、請求項4に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記陽性対照アッセイ回路および前記陰性対照アッセイ回路は、流体連通していない、請求項4に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記検査アッセイ回路、前記陽性対照アッセイ回路、および前記陰性対照アッセイ回路はそれぞれ、複数のアッセイウェルのそれぞれと流体連通する、請求項3に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記複数のアッセイウェルは、最大3つである、請求項7に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記複数のアッセイウェルは、3つである、請求項7に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記複数のウェルはそれぞれ、プロセス対照を行うように構成される、請求項7〜9のいずれかに記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記陽性対照アッセイウェルは、陽性対照核酸テンプレートを備える、請求項7〜9のいずれかに記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記流体圧回路と流体連通する核酸捕捉アセンブリをさらに備える、請求項1に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記核酸捕捉アセンブリは、中空筐体部材と、その中に配置される核酸捕捉膜とを備える、請求項12に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記核酸捕捉膜は、シリカファイバを含む、請求項13に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記筐体部材の内部に配置される、上側支持媒体および下側支持媒体をさらに備え、前記核酸捕捉膜は、前記上側支持媒体と前記下側支持媒体との間に介在される、請求項13に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記上側および下側支持媒体は、POREX(登録商標)フリットである、請求項15に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記上側および下側支持媒体は、ポリプロピレンワッシャである、請求項15に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
- 前記アッセイウェルアセンブリは、複数のウェルとともに構成されるPCRウェル層を備え、前記ウェルはそれぞれ、任意の得られた単位複製配列のPCR増幅および蛍光検出のために必要な全ての試薬を含む、請求項1に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記PCRウェル層は、高熱伝導ポリマーから形成される、請求項18に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記PCRウェル層は、終点PCR、リアルタイムPCR、または融解曲線分析のために構成される、請求項18に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記第1の成形筐体は、前記アッセイウェルアセンブリを覆う光学検出ウィンドウを備え、前記光学検出ウィンドウは、前記第1の成形筐体の上側表面上の菱形形状の開口部と、前記第1の成形筐体の下側表面上のより小さい菱形形状の開口部とから形成され、前記光学ウィンドウの側面は、第1の成形筐体の上側表面から下側表面に内向きに角度付けられる、請求項1に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記光学ウィンドウと前記アッセイウェルアセンブリとの間に介在される光学的に透明なカバー層をさらに備える、請求項21に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記第1の成形筐体は、前記空気圧回路および前記流体圧回路と流体連通する複数の試薬リザーバを備える、請求項1に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記試薬リザーバは、二重層箔パックである、請求項23に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記箔パックは、気密接着剤シールによって前記第1の成形筐体に固定して接着される、請求項24に記載のマイクロアッセイカード。
- 最大6つの試薬リザーバを備える、請求項23に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記箔パックの下方に配置される鋭利物をさらに備え、前記鋭利物は、前記箔パックが、前記空気圧回路への圧力パルスの印加によって、前記鋭利物と接触するように押勢されると、前記箔パックを破裂させるためである、請求項24に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記鋭利物は、金属から形成される、請求項27に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記鋭利物は、前記成形筐体に対して垂直を下回る角度で突出する、返しを備える、請求項28に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記角度は、約75度である、請求項29に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記試薬パックと前記鋭利物との間に介在されるバネをさらに備え、前記バネは、固有のバネ力を有し、前記バネ力は、圧力パルスの不在下、前記試薬パックと前記鋭利物との間の接触を防止する、請求項20に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記空気圧ポート内に配置されるエアロゾルフィルタプラグをさらに備える、請求項1に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記エアロゾルフィルタプラグは、液体膨張性材料から形成される、請求項25に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記陽圧および陰圧の状態は、+150、+100、+70、0、−35、および−50kPaから選択される、請求項1に記載のマイクロアッセイカード。
- 前記空気圧インターフェースをホスト器具に接合するように構成される単回使用密閉ガスケットをさらに備える、請求項1に記載のマイクロアッセイカード。
- 試料アッセイを行うためのマイクロアッセイシステムであって、
a)ホスト器具とドッキングするために構成される使い捨てマイクロアッセイカートリッジであって、前記カートリッジは、その中に配置される流体圧回路を有し、前記流体圧回路は、それとインターフェースされた空気圧回路の制御下で動作するように構成され、前記流体圧回路は、検査アッセイ回路、陽性対照アッセイ回路、および陰性対照アッセイ回路を備える、カートリッジと、
b)空気圧インターフェースを画定する1つまたはそれを上回る空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、空気圧状態を前記ホスト器具から前記空気圧回路に伝達するようにされる、空気圧ポートのアレイと、
c)記ホスト器具内に配置される空気圧マニホールドであって、前記マニホールドは、そこに流体結合される複数の空気圧源を有し、複数の圧力状態で動作されるように構成され、前記空気圧インターフェースのポートを通して前記空気圧回路に流体接続される、マニホールドと、
d)試料中の少なくとも1つの光学信号を検出するための検出器ヘッドであって、1〜5の検出チャネルを備える、検出器ヘッドと、
を備える、システム。 - 前記ホスト器具は、少なくとも1つのペルチェ熱ポンプを備える、請求項36に記載のマイクロアッセイシステム。
- 前記マイクロアッセイカートリッジは、前記流体圧回路と流体連通し、前記ペルチェ熱ポンプと熱接触する、アッセイウェルアセンブリを備える、請求項37に記載のマイクロアッセイシステム。
- 前記ホスト器具は、前記流体圧回路と熱接触する少なくとも1つの熱ブロックを備える、請求項38に記載のマイクロアッセイシステム。
- 前記カートリッジは、前記流体圧回路と流体連通し、前記熱ブロックと熱接触する、核酸捕捉アセンブリを備える、請求項38に記載のマイクロアッセイシステム。
- 前記検出器ヘッドは、前記検査試料回路および前記対照試料回路を横断する複数の離散経路上の前記マイクロアッセイカートリッジを走査するように構成され、前記離散経路はそれぞれ、少なくとも1つの基準点によって画定され、前記基準点は、ホスト器具較正の間に事前定義される空間座標である、請求項36に記載のマイクロアッセイシステム。
- 前記空気圧インターフェースポートアレイを前記空気圧マニホールドに接合するように構成される単回使用密閉ガスケットをさらに備える、請求項36に記載のマイクロアッセイシステム。
- 前記空気圧ポート内に配置されるエアロゾルフィルタプラグをさらに備える、請求項36に記載のマイクロアッセイシステム。
- 約20の空気圧ポートを備える、請求項36に記載のマイクロアッセイシステム。
- 前記検出器ヘッドの検出チャネルはそれぞれ、励起光サンプラ鏡、中性密度フィルタ、およびLED強度検出器を備える、LED強度変調回路を備える、請求項36に記載のマイクロアッセイシステム。
- 前記カートリッジは、接地プレートに対して約15度の角度で保持される、請求項36に記載のマイクロアッセイシステム。
- 病態と関連付けられる標的蛍光信号のための制御されたアッセイを行う方法であって、
a)請求項36に記載のシステムを用いて検査アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、前記標的蛍光信号は、存在する場合、前記検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出され、内因性成分と関連付けられるプロセス対照蛍光信号は、存在する場合、前記検出器ヘッドの第2の光チャネル内で検出される、ステップと、
b)請求項36に記載のシステムを用いて陽性対照蛍光信号のための陽性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、前記陽性対照蛍光信号は、存在する場合、前記検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出される、ステップと、
c)請求項36に記載のシステムを用いて陰性対照蛍光信号のための陰性対照アッセイ回路内の試料ウェルを走査するステップであって、前記陰性対照蛍光信号は、存在する場合、前記検出器ヘッドの第1の光チャネル内で検出される、ステップと、
d)前記第2の蛍光プロセス対照信号が検出され、前記陽性対照の第1の蛍光信号が検出され、前記陰性対照の第1の蛍光信号が検出されない場合であって、かつその場合に限り、前記第1の標的制御信号を前記アッセイの有効結果として報告するステップと、
を含む、方法。 - 前記検査アッセイ回路、前記陽性対照アッセイ回路、および前記陰性対照アッセイ回路はそれぞれ、最大3つのアッセイウェルをそれぞれ備える、請求項47に記載の方法。
- 前記最大3つのアッセイウェルはそれぞれ、特有の標的蛍光信号をアッセイするように構成される、請求項48に記載の方法。
- 前記標的蛍光信号と前記陽性対照蛍光信号および前記陰性対照蛍光信号とを比較し、前記試料を前記病態に対して陽性または陰性としてスコアするステップをさらに含む、請求項47に記載の方法。
- 前記比較するステップは、第1の比率を計算することであって、前記第1の比率は、前記標的蛍光信号と前記陽性対照蛍光信号の比率である、ことと、第2の比率を計算することであって、前記第2の比率は、前記標的蛍光信号と前記陰性対照蛍光信号の比率である、ことと、前記第1および第2の比率と認証比率とを比較することとを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記試料は、前記第1の比率が前記認証比率よりも大きい場合、陽性としてスコアされ、前記試料は、前記第2の比率が前記認証比率未満である場合、陰性としてスコアされる、請求項51に記載の方法。
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