FR3109585A1 - Plaquette de test et système de test biologique automatisé - Google Patents
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Abstract
Plaquette de test (1) à usage unique dans un système de test biologique destiné à déterminer la présence d’une ou plusieurs séquences d’acide nucléique, la plaquette de test comprenant un corps (10) dans lequel sont formés des canaux (13) et des logements, une entrée (12) pour recevoir un échantillon à tester, une entrée d’air (14), une membrane d’extraction (2), des zones de réaction (31,32) contenant un media poreux (35) avec des premier et deuxième mélanges réactionnels permettant l'amplification et la détection de la ou des espèces d'acide nucléique, une sortie d’air (16,17), un réservoir de récupération (18), la plaquette étant configurée pour amener l’échantillon biologique à tester (ET) dans la membrane d’extraction, puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, amener l’éluat résultant dans les zones de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture. Procédé et système associés.
Description
Le présent document est relatif généralement aux dispositifs de diagnostic par amplification d’acide nucléique, notamment, à partir d'un échantillon biologique tel que des gouttes de sang, d'urine, de salive et de sueur. Plus spécifiquement, la présente invention concerne des plaquettes de test, utilisées dans un système de test biologique automatisé destiné à identifier la présence d’un microorganisme infectieux (bactérie, virus, etc.).
S’agissant des tests de diagnostic basés sur la détection par amplification de l’ADN/ARN d’un microorganisme infectieux, on connait les tests PCR usuels (PCR pour Réaction de Polymérisation en Chaîne) nécessitant des cycles en température, qui sont longs et coûteux à mettre en œuvre (nécessitent l’utilisation de thermocycleurs onéreux).
Dans les tests de diagnostic plus rapide, il a été utilisé récemment un type de test dit LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) ou RT-LAMP (Reverse transcriptase Loop-mediated isothermal amplification), pour lequel il n’est plus nécessaire d’effectuer plusieurs cycles en température. Un plateau de mise en température suffit d’où le qualificatif d’ « isotherme ».
C’est dans ce contexte qu’est apparu un besoin de proposer un système de test biologique qui permet de traiter un grand nombre d’échantillons de façon fiable et rapide, qui convienne pour un test de type isotherme, sans exclure toutefois de l’appliquer à d’autres types de tests.
À cet effet, il est donc proposé une plaquette de test (1), pour usage unique, dans un système de test biologique (ST) destiné à détecter la présence d’une ou plusieurs espèces pathogènes (e.g. une séquence d’acide nucléique d’intérêt), la plaquette de test comprenant :
- un corps (10) dans lequel sont formés des canaux (13) et des logements (24,72,73), lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur,
- une entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable,
- une entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable,
- au moins une entrée d’air (14),
- une membrane d’extraction (2), agencée dans un premier logement (24),
- une première zone de réaction (31) contenant un media poreux (35) agencé dans un deuxième logement (72) et contenant un premier mélange réactionnel de test (33) sous forme lyophilisée, le premier mélange réactionnel permettant l'amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt,
- de préférence, une deuxième zone de réaction (32) contenant un media poreux (35) agencé dans un troisième logement (73) et contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle (34) sous forme lyophilisée,
- au moins une sortie d’air (16,17),
- un réservoir de récupération (18),
- une zone de lecture de résultat, comprenant au moins la première zone de réaction (31), et le cas échéant la deuxième zone de réaction (32),
la plaquette de test étant configurée pour amener l’échantillon biologique à tester (ET) dans la membrane d’extraction (2), puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, amener l’éluat résultant dans les zones de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture.
Grâce aux dispositions exposées ci-dessus, le processus du test peut être automatisé et sécurisé. La plaquette de test est insérée dans une station d’analyse qui déroule des actions correspondant au processus ci-dessus. Notamment le séchage de la membrane d’extraction est fait in situ par un flux d’air qui circule dans les canaux et le logement qui contient la membrane d’extraction, grâce aux entrées/sorties d’air. On évite toute manipulation pendant le test, la plaquette reste placée dans la station d’analyse, tout se déroule sous le contrôle de la station, cette dernière ayant de préférence un capot fermé pendant le déroulement du test. La membrane étant rapidement et correctement séchée, cela augmente la fiabilité et la rapidité du test.
Le terme «membrane d’extraction» désigne ici un organe poreux permettant d’absorber momentanément les acides nucléiques contenus dans l’échantillon à tester, de retenir ces acides nucléiques pendant une ou plusieurs opérations de rinçage destinées à éliminer des espèces chimiques telles protéines ou débris, suite à quoi un éluant à plus forte affinité ionique avec lesdits acides nucléiques permet de capter ces acides nucléiques et de les entraîner vers les zones de réaction/d’amplification.
Le terme «plaquette »doit être pris ici au sens très large, la plaquette est ici un support qui peut prendre toute forme géométrique.
On note que la deuxième zone de réaction dite zone de contrôle, permet de confirmer le bon déroulement de la réaction. Le deuxième mélange réactionnel de contrôle permet par exemple l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques non spécifique, se trouvant communément dans tous les échantillons. Ceci permet de vérifier notamment que l’extraction s’est bien déroulée, et que l’éluat est bien parvenu aux zones de réaction et que la réaction d'amplification s’est bien déroulée.
La plaquette de test et le système de test biologique peuvent être utilisés notamment par une méthode isotherme d’amplification d’acide nucléique dite «LAMP» ou «RT-LAMP», mais d’autres méthodes sont possiblement utilisables.
Une espèce pathogène peut être un microorganisme tel qu’un virus ou une bactérie, la séquence d’acides nucléiques d’intérêt étant ainsi spécifique à l’espèce pathogène à détecter.
Pour le «corps» de la plaquette, on peut aussi utiliser le terme de « substrat », ou « corps-substrat ».
S’agissant du réservoir de récupération, on note que ce dernier est prévu pour recueillir non seulement les restes de l’échantillon biologique sous forme d’éluat après traitement, mais aussi le ou les liquides de rinçage qui ont été utilisés pour rincer la membrane d’extraction avant son élution. Grâce au réservoir de récupération, aucun liquide ne ressort de la plaquette, seul de l’air peut ressortir de la plaquette. Ainsi on évite toute contamination de l’environnement et/ou du test suivant.
Dans divers modes de réalisation de l’invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l’une et/ou à l’autre des dispositions suivantes, prises isolément ou en combinaison.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre au moins un premier volume (61) de premier liquide de rinçage (R1), et un volume (63) d’éluant (23), contenus directement dans des logements du corps ou contenus dans des sachets agencés dans des logements du corps.
Les volumes de liquide de rinçage et d’éluant sont embarqués à bord de la plaquette. La station d’analyse est ainsi relativement simple, et seule une connexion pneumatique est nécessaire entre la plaquette et la station d’analyse. Les liquides (rinçage et éluant) étant embarqués à bord de la plaquette, ils peuvent être différents en fonction de la nature du test biologique et des espèces d’acide nucléique d’intérêt que l’on cherche à révéler, la station d’analyse restant la même. Eventuellement, les paramètres et le logiciel faisant fonctionner la station peuvent être mis à jour par téléchargement mais le matériel de la station reste inchangé.
Selon un aspect, l’éluant contenu dans le volume d’éluant est de l'eau distillée exempte d'RNase et le volume d’éluant présente un volume compris entre 30 microlitres et 50 microlitres. Cette eau, dite «DNase/RNase free water», vient éluer les espèces d’acide nucléique retenues dans la membrane d’extraction et les entrainer vers les zones de réaction.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un deuxième volume (62) d’un deuxième liquide de rinçage (R2), les premier et deuxième volumes de liquide de rinçage ayant un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres. Ce volume d’un deuxième liquide de rinçage permet de compléter le premier rinçage avant le séchage. On a ainsi 3 volumes de liquide embarqués à bord de la plaquette. Avantageusement, aucun liquide n’est présent dans la station d’analyse. Les liquides (rinçage et éluant) étant embarqués à bord de la plaquette, ils peuvent être différents en fonction de la nature du test biologique et des espèces cibles.
Selon un aspect, il peut être prévu un réservoir de récupération unique à bord de plaquette, ce réservoir de récupération étant configuré pour recueillir tous les liquides. Ainsi non seulement les restes de l’échantillon biologique sous forme d’éluat après traitement, mais aussi le ou les liquides de rinçage qui ont été utilisés pour rincer la membrane d’extraction avant son élution sont piégés dans le réservoir de récupération unique et ne peuvent pas ressortir de la plaquette (seul de l’air peut ressortir de la plaquette), évitant ainsi toute contamination de l’environnement et/ou du test suivant.
Selon un aspect, il peut être prévu que les fluides de rinçage et d’élution ne soient pas embarqués sur la plaquette, mais soient reçus sur la plaquette en provenance de la station d’analyse. La plaquette est alors très simple, elle ne contient aucun liquide avant utilisation. Après utilisation, le réservoir contient et piège les liquides utilisés pendant le test, à savoir les liquides de rinçage et d’élution ainsi que restes de l’échantillon biologique initial.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre au moins deux valves (51,52), de préférence de type membrane, pour diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction (2) sélectivement vers le réservoir de récupération (18) ou vers la ou les zones de réaction.
Ces valves permettent de diriger les flux de fluides à l’intérieur de la plaquette notamment lorsqu’on utilise un nombre réduit de connexions pneumatiques entre la station d’analyse et la plaquette. Les valves sont embarquées à bord de la plaquette mais leurs commandes sont faites depuis la station d’analyse.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un réservoir auxiliaire (38) agencé de manière adjacente à la première, et le cas échéant à la deuxième, zone(s) de réaction (31) de manière à pouvoir alimenter en éluat (23) les première et deuxième zones de réaction par pompage capillaire.
On fournit ainsi une alimentation par capillarité des zones de réaction depuis le réservoir auxiliaire, sans que le flux d’éluat ne traverse les media poreux des zones de réaction. Cela permet aussi de contrôler plus finement le volume d'éluat qui imbibe les medias poreux et hydrate les mélanges réactionnels, ce qui augmente la répétabilité du test. On peut aussi faire en sorte que les medias poreux occupent sensiblement tout l'espace du logement pour éviter les volumes morts qui viendraient trop diluer les mélanges réactionnels.
Selon un aspect, le media poreux de chacun desdits premier et deuxième mélanges réactionnels est formé comprend un substrat papier sous forme générale de disque. On utilise ainsi un matériau et une forme disponibles à coût compétitif.
Selon un aspect, le media poreux de chacun desdits premier et deuxième mélanges réactionnels est formé comme un disque en papier avec une projection radiale pour le pompage capillaire, les deuxième et troisième logements qui les renferment ont un seul port d’entrée/sortie dans lequel passe la projection radiale, autrement dit les deuxième et troisième logements sont en configuration de cul-de-sac. Seule la projection radiale qui dépasse du disque est baignée par le flux d’éluat. Les disques ne sont baignés par le flux d’éluat, ils sont alimentés en éluat par le pompage capillaire.
Selon un aspect, le corps de la plaquette est formé en matériau plastique translucide, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycarbonate (PC), le copolymère cyclo-oléfinique (COC) ou le Cyclo Oléfines Polymères (COP).
On a ainsi une lecture du résultat aisée par transparence, le corps de la plaquette ne faisant pas obstacle. On note que la lecture optique est réalisée sans déplacer la plaquette qui reste en place sur l’embase.
Selon un aspect, les canaux (13) et les logements peuvent être formés par usinage dans le corps (10) de la plaquette de test. Selon un autre aspect, les canaux (13) et les logements peuvent être obtenus de moulage.
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre une membrane ou un clapet de ventilation, agencé sur au moins une des sortie d’air (16,17), pour laisser passer de l’air vers l’atmosphère et ne pas laisser passer de liquide.
Une capsule de type Gore tex™ peut avantageusement empêcher tout déversement de liquide tout en laissant passer l’air.
Selon un aspect, il est prévu une sortie d’air intermédiaire (17) agencée à proximité de l'entrée du réservoir de récupération, pour faciliter le séchage de la membrane après le passage des liquides de rinçage.
On évite que le flux de séchage ne traverse le réservoir sur sa longueur.
De plus cela facilite l'avancée de l'éluat après élution en chassant l'air par cet orifice, dans la configuration de réservoir de récupération unique.
Selon un aspect, il est prévu des nervures (19) dans le réservoir de récupération. Ceci procure une maitrise de l’avance du front de liquide dans le réservoir de récupération.
Selon un aspect, la plaquette de test peut présenter une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales (10A,10B) et dans laquelle l’entrée d’air (14) et l’entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sont agencées sur une seule face principale (10A).
Ceci procure une simplicité de réalisation et de la conception de la station d’analyse.
Selon un aspect, il est prévu que toutes les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un même côté, et l’autre côté de la plaquette est muni d’une membrane de scellement (59) rectangle et d’épaisseur uniforme. Cette membrane de scellement peut être du type “film adhésif PCR”. On a ainsi une simplicité de réalisation et de la conception de la station d’analyse.
Selon un aspect, il peut être prévu que les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un premier côté, i.e. d’une première face principale (10A) et l’entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) est agencée sur le deuxième côté, i.e. sur la deuxième face principale (10B).
Selon un aspect, la plaquette de test peut comprendre en outre un élément d’identification (27) de la plaquette.
Grâce à cela, l’élément d’identification permet d’identifier précisément la plaquette et le test pratiqué, données qui peuvent être associées de manière fiable à un patient duquel provient l’échantillon biologique à tester. L’identification de la plaquette par la station permet également d’adapter la séquence de test à la plaquette (temps de séchage, température de chauffe, temps de chauffe, etc…).
Selon un aspect, la plaquette peut être configurée pour recevoir, par enfichage, un récipient de collecte (4) contenant un échantillon biologique à tester. On supprime ainsi un risque lié au déversement d’un échantillon biologique contenu dans un tube de collecte standard dans l’entrée de la plaquette pour recevoir un échantillon biologique.
Selon un aspect, il est proposé unéquipementde test comprenant une plaquette de test telle que décrite précédemment, et un récipient de collecte (4) comprenant une entrée operculée (41) et une sortie operculée (42), toutes deux agencées en partie basse du récipient de collecte, et un couvercle (43) à fermeture hermétique.
Selon un aspect, le récipient de collecte peut être enfiché sur la plaquette de test, et la plaquette de test peut comprendre deux aiguilles (45,46) agencées respectivement en vis-à-vis de l’entrée operculée et de la sortie operculée, les aiguilles traversant les opercules durant l’opération d’enfichage.
Selon un aspect, il est proposé unsystèmede test biologique, comprenant une station d’analyse (8), et une ou plusieurs plaquettes de test (1) telles que décrites précédemment, la station d’analyse comprenant au moins un connecteur pneumatique (66) configuré pour être accouplé à l’entrée d’air et/ou à la sortie d’air.
On a ainsi un raccordement simple lors du mouvement d’insertion de la plaquette dans la position de test. Un seul mouvement à savoir descendre la plaquette dans l’embase de test en translation, suffit pour réaliser l’accouplement entre station et plaquette.
Selon un aspect, la station d’analyse (8) comprend au moins l’une des caractéristiques suivantes :
- une unité de commande (100),
- une pompe à air (85),
- un ou plusieurs actionneurs (pour pousser sur les volumes et/ou activer les valves commandées) (91-95),
- un dispositif d’analyse optique (pour déterminer le résultat) (98,99),
- un dispositif de chauffage (96),
- des moyens de communication sans fil (116),
- un lecteur d’identifiant (105),
- un système de verrouillage de capot (112).
Selon un aspect, il est proposé unprocédéde test biologique mis en œuvre dans une plaquette de test selon la revendication 1, le procédé comprenant :
S1- faire passer échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide dans la membrane d’extraction (2), et le diriger en aval vers le réservoir de récupération,
S2- faire passer un premier liquide de rinçage (R1) dans la membrane d’extraction, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération (18),
S3- faire passer de l’air dans la membrane d’extraction, pour la sécher,
S4- faire passer un volume d’éluant dans la membrane d’extraction, et diriger l’éluat qui en sort en aval vers la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31,32).
De manière avantageuse, le séchage de la membrane d’extraction est fait in situ par un flux d’air qui circule dans les canaux et le logement qui contient la membrane d’extraction. On s’assure ainsi qu’il n’y a plus de liquide, i.e. que la membrane a été bien asséchée, pour que seulement de l’éluant prévu à cet effet ne soit ainsi après entrainé vers les zones de réaction, ce qui contribue à la fiabilisation du processus de test.
Selon un aspect, il peut être prévu avant l’étape de séchage (S3):
S25- faire passer un deuxième liquide de rinçage (R2) dans la membrane d’extraction, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération.
Selon un aspect, il peut être prévu en outre :
S5- chauffer au moins la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31,32) à une température prédéfinie,
S6- attendre au moins un temps prédéterminé en maintenant la température prédéfinie,
S7- éclairer la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31,32), et recevoir en retour un niveau de fluorescence,
S8- déterminer un résultat.
Selon un aspect particulier, on prévoit une étape de refroidissement des zones de réaction à température ambiante avant la lecture optique.
Avantageusement, les étapes S1 à S8 ci-dessus sont réalisées lorsque la plaquette est en position dans l’embase prévue à cet effet, sans déplacement ni manipulation de la plaquette.
Selon un aspect particulier, on prévoit une première lecture optique de référence avant chauffage, qui peut être réalisée afin de faire le « zéro » du système optique.
Selon un aspect, il peut être prévu en outre :
S9- affecter le résultat à un dossier patient.
L’identification de la plaquette étant liée de manière bi-univoque à l’échantillon biologique et à son donneur, le résultat est affecté à un dossier patient de manière bi-univoque à la plaquette, donc à l’échantillon biologique et donc à son donneur, i.e. le patient. On peut ainsi traiter de très nombreux échantillons sans risquer de se tromper dans l’affectation des résultats.
Selon un autre aspect, il est donc proposé une plaquette de test (1), pour usage unique, dans un système de test biologique (ST) destiné à détecter la présence d’une une ou plusieurs espèces pathogènes (e.g. une séquence d’acide nucléique d’intérêt), la plaquette de test comprenant :
- un corps (10) dans lequel sont formés des canaux (13) et des logements, lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur,
- une entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable,
- une entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable,
- au moins une entrée d’air (14), et au moins une sortie d’air (16,17),
- une membrane d’extraction (2), agencée dans un premier logement (24),
- une zone de réaction (31) contenant un media poreux (35) agencé dans un deuxième logement (72) et contenant un premier mélange réactionnel de test (33) sous forme lyophilisée, ledit mélange réactionnel permettant l'amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt,
- un réservoir de récupération (18),
- une zone de lecture de résultat, comprenant au moins la zone de réaction,
la plaquette de test étant configurée pour amener l’échantillon biologique à tester (ET) dans la membrane d’extraction (2), puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, amener l’éluat résultant dans la zone de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture.
Pour réaliser des tests en très grand nombre, lorsque le test est déjà bien connu, on peut simplifier la plaquette de test et se passer de la zone de contrôle. On peut utiliser un autre moyen plus simple pour vérifier que l’éluat est arrivé dans la zone de réaction. Par exemple, une caméra de la station peut surveiller par transparence les opérations qui se déroulent dans la plaquette. On a ainsi une solution particulièrement économique concernant la plaquette avec un seul disque de réaction, la plaquette étant un consommable du point de vue du système de test. L’ensemble des caractéristiques optionnelles décrites ci-dessus peuvent être appliquées à cette configuration mono zone de réaction.
D’autres aspects, buts et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description suivante de plusieurs modes de réalisation de l’invention, donnés à titre d’exemple non limitatif. L’invention sera également mieux comprise en regard des dessins joints sur lesquels :
- la figure 1 est une vue générale synoptique d’un système de test biologique selon la présente invention,
- la figure 2 est une vue schématique d’un premier exemple de réalisation d’une plaquette de test selon la présente invention,
- la figure 3 est une vue en perspective du premier exemple de réalisation d’une plaquette de test selon la présente invention,
- la figure 4 est une vue en perspective depuis le côté opposé de la plaquette de la figure 2, avec la membrane de fermeture séparée,
- la figure 5 est une vue en perspective et en transparence d’une station d’analyse compatible avec le premier exemple de réalisation,
- la figure 6 est une vue partielle en perspective vu de dessous de la station de la figure 5,
- la figure 7 est une vue schématique d’un deuxième exemple de réalisation d’une plaquette de test,
- les figures 8A et 8B sont des vues schématiques respectivement de face et de côté d’un troisième exemple de réalisation d’une plaquette de test,
- les figures 9A et 9B illustrent un récipient de collecte selon deux modes de réalisation particulier,
- la figure 10 illustre une vue schématique en élévation d’une plaquette de test selon l’un des exemples possibles, dans une variante adaptée à recevoir le récipient de collecte de la figure 9,
- la figure 11 est une vue schématique d’un quatrième exemple de réalisation d’une plaquette de test,
- la figure 12 illustre le procédé mis en œuvre dans divers exemples de réalisation de la plaquette et/ou de la station d’analyse,
- les figures 13A et 13B sont des vues de détail illustrant une valve de type membrane,
- la figure 14 est une vue de détail illustrant un sachet de liquide embarqué sur la plaquette et poussé par un piston de la station d’analyse,
- la figure 15 est une vue système centrée sur une illustration schématique fonctionnelle de la station d’analyse,
- la figure 16 est une vue de détail partielle illustrant le dispositif de lecture optique des zones de réaction.
Sur les différentes figures, les mêmes références désignent des éléments identiques ou similaires. Pour des raisons de clarté de l’exposé, certaines dimensions peuvent ne pas être représentées à l’échelle.
Système – généralités
Selon la vue synoptique présentés à lafigure 1, il est proposé un système de test biologiqueSTqui comprend une station d’analyse8, une plaquette de test1et un récipient de collecte40.
La plaquette de test1est prévue pour usage unique ; il y a donc autant de plaquettes de test que de tests unitaires à réaliser. Dans l’exemple représenté ici, le récipient de collecte40est de type standard, toutefois, nous verrons plus loin qu’un autre type de récipient de collecte, plus spécifique peut être utilisé.
Le récipient de collecte40est utilisé pour recueillir un échantillon biologique, par exemple de la salive, un prélèvement naso-pharyngé, ou de l’urine, voire de la sueur. Bien que le système proposé s’adresse en particulier au traitement d’échantillons humains, il n’est pas exclu d’utiliser le système proposé pour traiter des échantillons prélevés sur des animaux. Optionnellement, pour certains types de tests, on peut être amené à recueillir du sang ou de la lymphe comme un échantillon biologique à tester.
Le recueil de l’échantillon biologique dans le récipient de collecte40consiste à déposer un prélèvement de fluide corporel brut provenant de l’être humain ou animal dans un tampon de lyse (pour rompre les membranes des cellules biologiques), puis d’agiter le récipient de collecte pendant un temps suffisant de une à plusieurs minutes, suite à quoi on verse une quantité prédéfinie d’éthanol dans le récipient pour figer l’échantillon dans un état d’échantillon préparé. On note qu’il suffit de prélever une quantité faible de fluide corporel brut, typiquement un volume entre 0,1 millilitre et 1 millilitre suffit pour de multiples types de tests.
L’échantillon biologique dans récipient de collecte40ainsi préparé (notéET) est ensuite versé dans un orifice d’entrée de la plaquette repéré12. Suite à quoi on rebouche cet orifice d’entrée, i.e. on rend hermétique cette entrée par un bouchon voire un scellement de membrane de fermeture étanche.
La plaquette1contenant désormais l’échantillon biologique à traiter (on dit aussi ‘à tester’, d’où le nom de ‘plaquette de test’), est placé sur un poste de test dans la station d’analyse8qui a alors son capot80ouvert. Ensuite la porte (le capot) est refermée et un utilisateur déclenche un cycle de traitement, i.e. un cycle de test. A la fin dudit cycle, un résultat de test est donné par la station d’analyse, sous une forme qui sera décrite plus loin. La plaquette de test et la station d’analyse peuvent présenter diverses fonctions et caractéristiques ; plusieurs exemples de réalisation sont présentés ci-après.
Le résultat est obtenu dans un temps de quelques dizaines de minutes. Le plus souvent le résultat est obtenu dans un temps inférieur à 1 heure. Pour de nombreux types de test, le résultat est obtenu en moins de 50 minutes tout compris.
Un tel système peut être utilisé dans le contexte d’un laboratoire d’analyse, mais, au vu de sa simplicité et la rapidité de sa mise en œuvre, ce système de test biologique peut être utilisé au-delà, dans un contexte très large, à savoir dans une pharmacie, dans un cabinet médical, dans un établissement de soins généraux, dans un système de mise en quarantaine et libération de quarantaine. Ce système de test biologique peut aussi être utilisé dans un véhicule de vétérinaire pour tester des animaux.
Plaquette - premier exemple
Lesfigures 2 à 6illustrent un premier exemple de réalisation de plaquette de test1et de station d’analyse8compatible à son traitement.
La plaquette de test présente comprend un corps10, qu’on peut aussi appeler substrat. Des canaux et des logements vus plus loin sont formés dans le corps de plaquette.
D’une façon générale, le terme ‘plaquette’doit être pris ici au sens très large, la plaquette est ici un support qui peut prendre toute forme géométrique. Par abus de langage on peut aussi l’appeler ‘chip’ ou ‘puce’ terme qui vient de la logique ‘Lab-on-a-chip’. En lieu et place de plaquette de test, on pourrait aussi utiliser « cartouche » ou « cassette ».
Dans l’exemple illustré, la plaquette de test présente une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales, à savoir une première face principale10Adite face d’interaction et une deuxième principale10Bdite face arrière. De plus, une tranche périphérique10Cformant les quatre autres faces s’étend entre les deux faces principales. Dans l’exemple illustré, l’épaisseur de la plaquette notéeH1est comprise entre 3 mm et 20 mm. La longueurL1est comprise entre 20 mm et 80 mm et la largeurW1est comprise entre 10 mm et 60 mm. La configuration géométrique peut s’apparenter à un format carte de crédit avec toutefois une épaisseur un peu plus importante.
La plaquette est identifiée par un élément d’identification27de la plaquette, qui peut être agencé sur la plaquette (i.e. QR Code) ou dans la plaquette comme dans le cas d’une puce RFID, NFC ou équivalents. L’élément d’identification peut être même plus simple, comme un codage couleur ou un codage mécanique. L’élément d’identification27, lorsqu’il est numérique, permet d’identifier unitairement sans ambiguïté la plaquette de test, et accessoirement de stocker le résultat dans l’élément d’identification27à la fin du test avant l’ouverture de la porte/capot 80.
Par ailleurs, l’échantillon biologique étant associé à un individu duquel provient cet échantillon biologique, ce qui permet d’associer de façon bi-univoque l’échantillon biologique, la plaquette et le donner.
Dans l’exemple illustré, la plaquette est obtenue par enlèvement de manière à partir d’un bloc de matière homogène parallélépipédique. On pratique depuis la face arrière10Bdes fraisages et des perçages pour obtenir les canaux et logements susmentionnés.
Le corps de la plaquette est formé en matériau plastique translucide, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycarbonate (PC), le copolymère cyclo-oléfinique (COC) ou le Cyclo Oléfines Polymères (COP).
Au lieu de partir d’un bloc homogène parallélépipédique, on peut partir d’une forme moulée où les principaux logements sont déjà formés de moulage et seuls des perçages de petit diamètre restent à faire.
On peut aussi obtenir directement de moulage la plaquette avec tous ses canaux et logements, sans reprise d’usinage.
En outre, au lieu d’une méthode par enlèvement de matière, on peut utiliser un procédé de fabrication additive de type impression 3D.
On note que le substrat choisi forme une barrière efficace pour contenir les fluides considérés, il ne laisse pas passer ni n’absorbe l’air et les liquides de rinçage dont il va être question plus loin.
Canaux, réservoirs et logements
Sur face arrière10B, pour fermer les canaux et les logements, on vient coller une membrane de fermeture59, par exemple un film plastique adhésif bio-compatible. Alternativement, on peut prévoir de souder un capot arrière, par exemple par soudure ultrasons.
Ainsi les canaux et les logements sont généralement isolés de l’environnement extérieur. Les canaux sont repérés de manière générale par la référence13. Dans ces canaux circule du fluide qui peut être du liquide ou de l’air. Les canaux ont une section transversale petite au regard des dimensions des logements. Parmi les logements, on trouve un réservoir dit amont et noté11qui forme un réservoir pour le stockage temporaire de l’échantillon biologique à testerET; cet espace est un serpentin dans l’exemple illustré. Mais il pourrait avoir une autre forme. On trouve aussi un réservoir aval aussi appelé réservoir de récupération repéré18. Ce réservoir de récupération18est en aval des canaux transportant des fluides liquides et ce réservoir de récupération est dimensionné pour contenir : le volume de l’échantillon biologique à tester entrée + les volumes de liquide de rinçage + le volume d’éluat. Le volume de ce réservoir de récupération18est compris entre 0,1 millilitre et 2 millilitres. Le réservoir de récupération18s’étend d’une extrémité d’entrée18aà un fond18b.
Pour en revenir aux canaux et en référence notamment à lafigure 4, un canal13hrelie l’entrée d’air14à l’espace formant réservoir amont11.
Un autre canal13arelie l’espace formant réservoir amont11à un premier logement24contenant un élément appelé membrane d’extraction qui sera vu plus loin.
Un autre canal13brelie le logement24à une valve de dérivation52. A partir de là, un autre canal13frelie la sortie de valve à la zone contenant les réactants, notamment à un réservoir auxiliaire38.
Un autre canal13cprolongeant le canal13brelie l’entrée de valve de dérivation à une autre valve51qui autorise ou stoppe le passage de fluide vers l’aval en direction du réservoir de récupération18, en se terminant à une sortie d’air17. Un autre canal13eprolonge le canal13det débouche dans le réservoir de récupération18.
Des canaux13s,13u,13krelient respectivement les logements repérés74,75,76au canal13aen amont du logement24de la membrane d’extraction.
Un canal13frelie la sortie de la valve de dérivation52à un réservoir auxiliaire38interposé entre les logements72,73.
De plus un canal13grelie le réservoir auxiliaire38et débouche au voisinage de l’extrémité d’entrée18adu réservoir de récupération18.
Enfin un canal13jmet en communication la portion de fond18bdu réservoir de récupération18avec l’atmosphère via une sortie d’air16.
Concernant les canaux13, de petites flèches en traits pointillés illustrent à lafigure 4le sens de circulation du fluide (liquide et/ou air) dans ces canaux. Les termes ‘amont’ et ‘aval’ font référence aux sens de circulation indiqués. Généralement il n’y a pas de circulation à double sens dans les canaux 13.
Comme déjà évoqué, il est prévu une entrée12pour recevoir l’échantillon biologique à testerETsous forme liquide. Cette entrée est scellable ou refermable par bouchon. Ainsi après déversement de l’échantillon biologique et fermeture, la plaquette peut être retournée sans aucun risque de répandre une partie de l’échantillon biologique.
Une fois versé dans la plaquette, le liquide de l’échantillon biologique est contenu dans un réservoir d’entrée11, qui se présente dans l’exemple illustré comme un logement en forme d’un serpentin.
De plus, la plaquette comprend une entrée d’air repérée14. De l’air peut être ainsi envoyé dans la plaquette, notamment par la station d’analyse.
Membrane d’extraction, liquides de traitement et valves
De plus, la plaquette comprend une membrane d’extraction repérée2. La membrane d’extraction peut être une membrane de silice ou membrane de cellulose. La membrane d’extraction présente une structure poreuse, c’est-à-dire une structure alvéolaire. La fonction de la membrane d’extraction est l’isolation des molécules ADN/ARN et l’élimination des protéines et autres déchets à molécules courtes comme il va être décrit ci-après.
Dans un exemple, la matrice en silice de la membrane d’extraction est capable de fixer sélectivement les ADN/ARN en condition de force ionique élevée et en pH ≤ 7. Les impuretés sont éliminées par des rinçages et après séchage, les molécules d’ADN et séquences ARN sont élués dans une solution en force ionique faible et à pH ≥ 7. La matrice en silice peut être sous un format de poudre de verre, de particules de verre/silice ou de fibres en verre.
Pour plus de détails sur les membranes d’extraction utilisées ici, on pourra se référer au document EP1463744.
On note que la membrane d’extraction2occupe tout le logement24dans lequel elle est disposée dans la direction transversale à l’écoulement des fluides que l’on fait passer dans la membrane d’extraction2. Autrement dit, le flux d’écoulement des fluides (rinçage, séchage, élution) ne peut pas contourner la membrane d’extraction2.
On peut choisir pour la membrane d’extraction la membrane GF/F Whatman de source Sigma-Aldrich™. Par exemple, la longueur de la membrane peut être de l’ordre de 10 mm, sa largeur peut être comprise entre 3 mm et 5 mm et son épaisseur peut être comprise entre 0,3 mm et 0,6 mm.
De plus, la plaquette comprend des liquides de traitement qui sont prédisposés sur la plaquette, c’est-à-dire présents sur la plaquette elle-même. On peut dire qu’ils sont embarqués ou à bord de la plaquette.
Dans l’exemple illustré, il est prévu un premier volume61de liquide de rinçageR1agencé dans le logement74, un deuxième volume62d’un deuxième liquide de rinçageR2agencé dans le logement75, et un volume63d’éluant23agencé dans le logement76. Ces volumes/produits sont contenus directement dans des logements du corps10ou contenus dans des sachets37lesquels sont agencés dans des logements du corps. Dans la configuration sachet/blister, ces sachets sont préparés en avance et ont une contenance bien précise. Le liquide d’intérêt est contenu dans ce sachet, par exemple en film d’aluminium, et il n’y a pas de contact direct entre le corps de la plaquette et le liquide d’intérêt avant utilisation effective par percement/déchirement du sachet.
Le contenu de ces volumes de liquide peut être déversé et dirigé vers la membrane d’extraction2au travers des canaux susmentionnés13s,13u,13kcomme il sera vu plus tard, en réponse à une activation.
On remarque que la présence du deuxième liquide de rinçageR2est optionnelle. En effet, en fonction du type de test, le logement75peut rester inutilisé ou être absent, un seul liquide de rinçage est utilisé.
Dans l’exemple illustré, les premier et deuxième volumes de liquide de rinçageR1,R2ont un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres. Bien entendu, l’invention fonctionne aussi pour des volumes de rinçage plus petits et aussi pour des volumes plus grands.
Concernant le volume d’éluant, il peut être compris entre 30 microlitres et 50 microlitres. Là aussi, l’invention fonctionne aussi pour des volumes d’éluant plus petits et aussi pour des volumes d’éluant plus grands.
Concernant l’éluant, on choisira de préférence une eau particulière, à savoir une eau distillée exempte de RNase et de DNase, i.e. dépourvue de RNase et DNase, dite « DNase/RNase free water». Dans un autre exemple on utilise un tampon Tris/EDTA.
L’éluant présente une force ionique faible et présente un pH ≥ 7.
Pour plus de détails sur le type d’éluant utilisé ici, on pourra se référer au document EP1463744.
En outre, dans l’exemple illustré, la plaquette comprend deux valves de routage qui servent à diriger ou stopper un flux de fluide circulant dans les canaux13.
Plus précisément, les deux valves permettent de diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction2sélectivement vers le réservoir de récupération18ou vers les zones de réaction.
Une première valve51peut sélectivement fermer l’accès au réservoir de récupération18. En amont de la première valve51se trouve le canal13cet en aval se trouve le canal13d(Fig 4).
Une deuxième valve52peut sélectivement ouvrir l’accès vers les zones de réaction. En amont de la deuxième valve52se trouve le canal13bet en aval se trouve le canal13f(Fig 4).
Les valves51,52sont dans l’exemple illustré des valves de type membrane. En effet une membrane déformable vient sélectivement ouvrir ou fermer un passage entre deux orifices voisins, la membrane étant placée dans un logement fermé, les deux orifices étant les seules voies de passages disponibles pour le fluide.
Lesfigures 13A et 13Billustrent une membrane déformable51, qui ouvre ou ferme sélectivement un passage entre deux canaux131,132.
La membrane déformable délimite par le bas une chambre151. Le corps de la plaquette délimite sur les côtés et sur le haut la chambre 151, sauf aux endroits où débouchent les canaux, avec un premier port131a(première embouchure) et un deuxième port132a(deuxième embouchure). Enfigure 13Ala membrane déformable 51 est au repos (forme plate au repos) et le passage entre les deux embouchures 131a, 132a est ouvert (circulation en flèche pointillée). Enfigure 13Bsous l’effet d’une action mécanique de poussée par l’élément noté94, la membrane déformable51est fléchie et vient porter sur les ports (deux embouchures) 131a, 132a ; le passage est entre les deux embouchures 131a, 132a est alors fermé.
La valve membrane a été illustrée dans une configuration normalement ouverte, mais il est aussi possible d’utiliser une membrane de configuration normalement fermée.
La sortie d’air16est agencée au fond ou en communication avec le fond du réservoir de récupération, tandis que la sortie d’air intermédiaire17est agencée à proximité de l'entrée du réservoir de récupération. L’une et l’autre peuvent être équipées d’une capsule Goretex™ ou équivalente qui empêche tout déversement de liquide tout en laissant passer l’air.
Pour la sortie d’air16du fond de réservoir, en fonction de la configuration du réservoir et notamment s’il a un volume excédentaires par rapport au besoin de stockage, la capsule Goretex™ est optionnelle.
On note qu’il pourrait y avoir seulement la sortie d’air16du fond de réservoir mais pour faciliter le séchage de la membrane après le passage des liquides de rinçage, et l’avancement de l’éluat par le canal13gon dispose la sortie d’air intermédiaire17qui elle doit être équipée d’une capsule Goretex™ ou équivalente.
Zones de réaction et zone de lecture
De plus, la plaquette comprend une première zone de réaction31contenant un media poreux35contenant un premier mélange réactionnel de test33, et une deuxième zone de réaction32contenant un media poreux 35 contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle34.
Les première et deuxième zones de réaction sont agencées respectivement dans le deuxième logement72dans le troisième logement73.
Dans l’exemple illustré, il est prévu un réservoir auxiliaire38agencé de manière adjacente aux premier et deuxième logements72,73pour alimenter indirectement les media poreux. Ainsi les medias poreux des zones de réaction31,32, i.e. les disques des premier et deuxième mélanges réactionnels33,34sont alimentés en éluat par l’arrivée de cet éluat dans le réservoir auxiliaire38, sans que cet éluat ne traverse les disques.
Selon une disposition optionnelle avantageuse, dans chaque disque de mélange réactionnel33,34, il est prévu une projection radiale33a,33bpour la fonction de pompage capillaire. Seule la projection radiale33a,33best baignée directement par le flux d’éluat. Les disques ne sont baignés par le flux d’éluat, ils sont alimentés en éluat par le pompage capillaire. On note que les deuxième et troisième logements72,73qui renferment les disques ont un seul port d’entrée/sortie dans lequel passe la projection radiale, autrement dit lesdits logements sont en configuration de cul-de-sac. On note que les interfaces de contact entre les disques et le réservoir sont minimisées, tout comme les volumes morts autour des disques de manière à limiter la diffusion des réactifs contenus sur les disques.
On peut choisir pour les deux disques de test et de contrôle les références GF/DVA Whatman de source Cytiva™ (précédemment GE HEalthcare™ Life Sciences™). Par exemple, les disques ont un diamètre compris entre 5 mm et 6 mm et une épaisseur comprise entre 0.7 mm et 1 mm.
Chaque disque occupe tout le logement dans lequel il est placé ; il n’y a pas de jeu ou de d’espace disponible où de l’éluant pourrait se loger.
Les réactifs intégrés sont dans un exemple : H2O, dNTPs, 10x tampon isotherme, MgSO4, bétaine, agent intercalant, mélange d’amorces, enzyme Bst 2.0 W S, et enzyme AMV-RT. Dans un exemple, il peut s’agir du WarmStart LAMP Kit de New England Biolabs™.
Le mélange réactionnel de test contenu dans le media poreux comprend ainsi, dans un exemple, la transcriptase inverse qui permet de transcrire l’ARN en ADN, le jeu d’amorces spécifiques à l’ADN du pathogène, l’ADN polymérase, un tampon isotherme contenant des désoxynucléotides triphosphates (dNTP), nécessaires à l’amplification ADN, du MgSO4 agissant comme un cofacteur et catalyseur de la réaction, ainsi que de la bétaine, additif souvent utilisé pour améliorer l’amplification des séquences ADN. Enfin, un fluorophore ou une sonde colorimétrique est incluse afin de révéler la réaction d’amplification quand celle-ci a lieu.
Les premier et deuxième mélanges réactionnels33,34se présentent sous forme lyophilisée. Cette forme est stable et autorise un stockage long des plaquettes neuves avant leur utilisation.
Les premier et deuxième mélanges réactionnels33,34se présentent sous une forme générale de disque.
Selon une disposition optionnelle avantageuse, le media poreux35est formé en papier. Sa capacité d’absorption d’eau exempte d’ARNase et/ou d’ADNase (éluant) est connue, maitrisée et répétable, ce qui contribue à la fiabilité du test.
La lecture du résultat est faite par une mesure optique, notamment un premier dispositif optique98agencé dans la station d’analyse 8 en vis-à-vis de la première zone de réaction31et un deuxième dispositif optique99agencé dans la station d’analyse 8 en vis-à-vis de la deuxième zone de réaction32. Il est prévu dans la station d’analyse 8 un élément d’illumination98a, commun ou non et un appareil d’imagerie, un capteur optique ou des photodiodes pour recevoir des rayonnements réfléchis (ou transmis) par les media poreux des premier et deuxième mélanges réactionnels33,34.
Dans l’exemple illustré, on utilise les propriétés de fluorescence des media poreux où les acides nucléiques se sont multipliés.
Lesdits premier et deuxième mélanges réactionnels permettant l'amplification et la détection d’une ou plusieurs séquences d'acide nucléique.
On note qu’il est prévu une zone de lecture de résultat, comprenant au moins les première et deuxième zones de réaction31,32. Dans le cas où le corps est formé en matière translucide, on peut considérer que la zone de lecture est aussi large que la plaquette elle-même. Si le substrat utilisé pour le corps n’est pas transparent ou pas suffisamment translucide, on peut prévoir une fenêtre spécifique transparente pour la lecture du résultat.
On détermine la réponse en fluorescence des première et deuxième zones de réaction pour en déduire un résultat de test.
Plus précisément, on compare la réponse en fluorescence de chaque disque avant et après chauffage. Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est faible alors le test est déclaré nul.
Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est élevée et que la réponse en fluorescence du disque de test est faible, alors le test est déclaré négatif.
Si la réponse en fluorescence du disque de contrôle est élevée et que la réponse en fluorescence du disque de test est élevée aussi, alors le test est déclaré positif.
En effet, la première zone de test amplifie l’ADN spécifique au pathogène recherché. La deuxième zone (disque de contrôle) consiste à amplifier l’ARN non spécifique provenant de l’échantillon. En effet, les deux mélanges réactionnels sont identiques mis à part le jeu d’amorces mis en place. Dans le cas du contrôle, il s’agit d’amorces non spécifiques au virus recherché (agent pathogène recherché) mais coopérant à une séquence ARN toujours présente dans l’échantillon/l’éluat incident. Le but du contrôle étant de confirmer qu’à la fois l’étape d’extraction ainsi que l’étape d’amplification se sont bien déroulées, permettant ainsi d’éliminer l’option d’un faux négatif.
Il n’est pas exclu de délivrer un résultat plus riche qu’un résultat binaire. A condition que la réponse en fluorescence du disque de contrôle soit élevée, l’intensité de réponse en fluorescence du disque de test peut être traduite en un index allant de 0 à 1.
Il faut noter qu’en lieu et place d’une mesure de réponse en fluorescence, on pourrait aussi utiliser d’autres méthodes optiques, comme une méthode de colorimétrie, une méthode de photométrie, une méthode de coefficient de transparence.
Il faut aussi noter qu’on peut analyser optiquement les mélanges réactionnels après réactions, soit par mesure de réflectivité, soit par mesure de transmissivité (émetteur et récepteur de part et d’autre de la plaquette).
Il faut aussi noter qu’on réalise une lecture optique de référence avant chauffage, pour permettre de faire le « zéro » du système optique, aux conditions de rayonnements ambiantes et avec la plaquette telle qu’elle est en transparence. Après chauffage réaction et refroidissement, les nouvelles mesures optiques sont prises avec comme référence la mesure de référence avant chauffage (méthode différentielle).
Station d’analyse
La station d’analyse8comprend un châssis89comprenant des colonnes de structure88. La station d’analyse 8 se présente comme une boite parallélépipédique. Dans un exemple, cette boite est proche d’une forme cubique. Dans un exemple, le côté de cette de forme cubique présente une longueur comprise entre 25 cm et 40 cm. La station d’analyse pourrait toutefois présenter une forme quelconque.
Dans l’exemple illustré, la station d’analyse8comprend une platine de fond81, une platine intermédiaire82et une platine supérieure83.
La station d’analyse8comprend une embase86configurée pour recevoir une plaquette de test 1 et la soumettre à une série d’opérations. L’embase86est agencée dans la platine supérieure83 et comprend des guides pour positionner la plaquette précisément à l’endroit souhaité pour qu’une interface mécanique, pneumatique, thermique et optique entre la plaquette et la station se produise.
La station d’analyse8comprend un capot80monté sur le châssis grâce à une articulation, par exemple grâce à un mouvement pivotant d’axeY8.
Il est prévu un système de verrouillage de capot112. En effet, lorsque les opérations de test sont en cours sur une plaquette de test, le capot est fermé et verrouillé. Lorsque le test est fini et que le résultat est obtenu, le système de verrouillage déverrouille le capot. Un opérateur peut alors ouvrir le capot, enlever la plaquette de test et placer sur l’embase une nouvelle plaquette de test à traiter.
La station d’analyse8comprend une pompe à air85. Ce peut être une pompe génératrice de surpression ou génératrice de dépression, suivant les configurations plaquette/station.
La station d’analyse8comprend un dispositif de chauffage96. La station d’analyse8comprend un capteur de température97pour réguler la commande du dispositif de chauffage. Le dispositif de chauffage peut être une résistance chauffante, une cellule à effet Peltier, ou encore comprendre un ou plusieurs corps noir(s) disposé(s) à proximité des zones de réaction et un éclairage infrarouge pour chauffer le(s)dit(s) corps noir(s). La station commande le dispositif de chauffage pour avoir un palier à une certaine température et sur une certaine durée. Par exemple, la température de palier est comprise entre 50°C et 70°C. Dans un exemple, la température de palier est de 65°C. La durée du palier est comprise entre 20 minutes et 40 minutes. La station d’analyse peut fonctionner avec une durée de palier prédéterminée (paramètre). Dans un mode alternatif, la fin de palier peut dépendre de l’analyse optique des zones de réaction, par exemple le résultat peut être lu avant la durée prédéfinie, ou dans le cas opposé, l’analyse optique des zones de réaction peut permettre d’identifier une erreur.
La station d’analyse8comprend une unité de commande100, dont le synoptique est présenté à lafigure 15.
La station d’analyse8comprend un dispositif d’analyse optique98,99pour déterminer le résultat, comme déjà évoqué plus haut.
La station d’analyse8comprend des moyens de communication sans fil116. Ces moyens permettent de transmettre le résultat à une entité distante.
La station d’analyse8peut comprendre, sur la platine intermédiaire82, un ou plusieurs actionneurs91-95pour pousser sur les volumes et/ou activer les valves commandées, suivant les différents exemples de réalisation. Plus précisément, un premier actionneur91permet d’exercer une action mécanique sur le volume du premier volume de rinçage61. Un deuxième actionneur92permet d’exercer une action mécanique sur le volume du deuxième volume de rinçage62. Un troisième actionneur93permet d’exercer une action mécanique sur le volume d’éluant63. Un quatrième actionneur94permet d’exercer une action mécanique sur la première valve51. Un cinquième actionneur95permet d’exercer une action mécanique sur la deuxième valve52.
La station d’analyse8comprend au moins un connecteur pneumatique66configuré pour être accouplé à l’entrée d’air14de la plaquette. Il est prévu une tuyauterie pneumatique67pour relier la pompe à air85au connecteur pneumatique66.
Dans d’autres configurations, le ou les connecteur(s) pneumatique(s) peuvent être raccordés à différentes entrées ou sorties d’air.
La station d’analyse8comprend une interface utilisateur sous forme de bouton de commande108,109et/ou d’écran tactile.
La station d’analyse8peut comprendre un dispositif de lecture105de l’élément d’identification27de la plaquette / des plaquettes.
La station d’analyse8peut comprendre une caméra102. Cette caméra peut être utilisée pour vérifier le déplacement des liquides dans la plaquette.
En référence à lafigure 14, on a illustré le déversement d’un liquide de rinçage contenu dans un sachet37. L’extrémité supérieure de l’actionneur 94 vient pousser sur la poche/le sachet. Il est prévu des picots36dans le fond du logement74. Lorsqu’on presse le sachet37, lesdits picots36s’y enfoncent et viennent déchirer le sachet libérant ainsi le liquide y contenu qui s’écoule dans le canal 131.
En référence à lafigure 16, on a illustré plus en détails le dispositif d’analyse optique et sa disposition vis-à-vis des disques35.
Une Led98aillumine un disque 35 et le rayonnement reçu en retour est capté par une ou plusieurs photodiodes98. Sur l’autre disque, le même processus se déroule avec une ou plusieurs photodiodes99.
Procédé
Sur lafigure 12, on a illustré les étapes du procédé. Dans le premier exemple où on utilise un récipient de collecte40standard, on a recueilli un par exemple de la salive, puis on l’a lysé puis on l’a inhibé avec de l’éthanol. On a ainsi obtenu un échantillon biologique prêt à tester, que l’on a versé dans l’entrée12et qui se trouve dans le réservoir amont11.
La première étape d’intérêt consiste à :
S1- faire passer échantillon biologique à testerETsous forme liquide dans la membrane d’extraction2. En pratique on pousse, grâce à une surpression d’air, l’échantillon biologiqueET, depuis le réservoir amont11vers le réservoir de récupération18, au travers de la membrane d’extraction2. La première valve51est ouverte alors que la deuxième valve52est fermée.
Les acides nucléiques et d’autres espèces moléculaires sont retenus par la membrane d’extraction2.
On note que la sortie d’air16permet à l’air présent dans le réservoir de récupération de s’échapper au fur et à mesure que le réservoir de récupération se remplit de liquide.
Ensuite on va procéder au rinçage, dans une étape notéeS2.
S2- faire passer un premier liquide de rinçageR1dans la membrane d’extraction2, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération18.
Optionnellement, on peut utiliser une deuxième passe de rinçage, au moyen de l’étape :
S25- faire passer un deuxième liquide de rinçage R2 dans la membrane d’extraction2, et le diriger en aval vers le réservoir de récupération.
Ensuite on va procéder au séchage, dans une étape notéeS3.
S3- faire passer de l’air dans la membrane d’extraction 2, pour la sécher. La station envoie de l’air sous pression dans l’entrée d’air 14 qui parcours les canaux 13h, 11, 13a, 13b, 13c, 13e, 13j. L’air peut sortir au fond du réservoir par la sortie16mais aussi l’air peut sortir par la sortie d’air intermédiaire17.
On procède ensuite à l’élution de la membrane d’extraction, dans une étape notéeS4.
S4- faire passer un volume d’éluant dans la membrane d’extraction2, et diriger l’éluat qui en sort en aval vers les première et deuxième zones de réaction31,32. La première valve51est fermée alors que la deuxième valve52est ouverte.
D’autres étapes interviennent ensuite :
S45-optionnellement on fait une lecture optique de référence avant chauffage, pour permettre de faire le « zéro » du système optique, aux conditions de rayonnements ambiantes et avec la plaquette telle qu’elle est en transparence,
S5- chauffer au moins les première et deuxième zones de réaction31,32à une température prédéfinie,
S6- attendre au moins un temps prédéterminé en maintenant la température prédéfinie,
S65- laisser refroidir ou ventiler pour refroidir afin de revenir à la température ambiante,
S7- éclairer les première et deuxième zones de réaction31,32, et recevoir en retour un niveau de fluorescence,
S8- déterminer un résultat.
Pour finir, le procédé prévoit d’affecter le résultat (étapeS9) à un dossier patientPF.
Deuxième exemple de réalisation
La figure 7 illustre un deuxième exemple de réalisation. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.
Dans le deuxième exemple de réalisation, les volumes ne sont pas embarqués, i.e. les fluides de rinçageR1,R2et d’élution23ne sont pas embarqués sur la plaquette, mais sont reçus sur la plaquette en provenance de la station d’analyse8. La plaquette est alors très simple, elle ne contient aucun liquide avant utilisation. Après utilisation, le réservoir de récupération 18 contient et piège les liquides utilisés pendant le test, à savoir les liquides de rinçage et d’élution ainsi que restes de l’échantillon biologique initial.
La station d’analyse8comprend alors des micro-doseurs, respectivement56,57,58pour les trois fluidesR1,R2, éluant23, le résultat des 3 microdosages se retrouve alors dans trois buffers intermédiaires50. La station d’analyse8comprend alors des valves de sélection, respectivement53,54,55pour alimenter en air en surpression les canaux des trois fluides. Les trois canaux se rejoignent en aval dans un canal de sortie unique. Il y a une seule interface pneumatique66avec la plaquette, au niveau de l’entrée d’air 14.
Troisième exemple de réalisation
Lesfigures 8A et 8Billustrent un troisième exemple de réalisation. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.
Les canaux internes à la plaquette ont été simplifiés. Un tronc commun de canal13zest relié successivement de l’amont vers l’aval aux éléments suivants de l’amont vers l’aval :
- l’entrée d’air 14,
- le volume d’éluant 23,
- le volume du deuxième liquide de rinçage R2,
- le volume du premier liquide de rinçage R1,
- l’entrée 12 de l’échantillon biologique,
- la membrane d’extraction2dans son logement24.
En aval, on retrouve, deux branches qui divergent, chacune étant ouverte ou fermée par respectivement les première et deuxième valves51,52.
Pour les rinçages et le séchage on ouvre la première valve51et on ferme la deuxième valve52.
Pour l’amenée de l’éluat vers les première et deuxième zones de réaction, on ouvre la deuxième valve52et on ferme la première valve51.
Dans cet exemple, le flux d’éluant traverse les media des mélanges réactionnels33,34. Mais on pourrait aussi avoir un réservoir auxiliaire comme précédemment décrit.
Quatrième exemple de réalisation
Lesfigures 9 à 11illustrent un quatrième exemple de réalisation. Pour les éléments non commentés dans les paragraphes suivants, il faut considérer que ces éléments sont identiques ou similaires à ce qui a été décrit pour le premier exemple de réalisation.
Selon la présente invention, dans son quatrième exemple de réalisation illustré, le récipient de collecte n’est pas standard. Le récipient de collecte4comprenant une entrée41et une sortie42, toutes deux agencées en partie basse du récipient de collecte, et un couvercle43à fermeture hermétique.
Chacune de ces entrée et sortie 41,42 est operculée à l’état neuf, i.e. un opercule64scelle hermétiquement chacune de ces entrée et sortie.
Il est prévu une cheminée44formant un canal interne au récipient et amenant de l’air qui va arriver par l’entrée41en partie supérieure du récipient.
Le récipient4est prévu pour coopérer avec la plaquette de test1par enfichage.
Sur la plaquette de test1, il est prévu une première aiguille45agencée respectivement en vis-à-vis de l’entrée operculée41, et une deuxième aiguille46agencée respectivement en vis-à-vis de la sortie operculée42.
Lorsque l’on vient enficher le récipient 4 sur la plaquette, les aiguilles45,46percent les opercules64et mettent en communication d’un part :
- l’entrée d’air14avec l’entrée41et la cheminée44,
et d’autre part :
- la sortie42avec l’entrée12d’échantillon biologique.
Pour vider le contenu du récipient de collecte4, la station souffle de l’air dans l’entrée d’air14, l’air remonte dans la cheminée et pousse l’échantillon biologique vers la sortie42du récipient, le liquide d’échantillon biologique s’écoule alors depuis l’intérieur du récipient4dans l’entrée12de la plaquette. Grâce à ce procédé, il n’y a aucun risque de déverser à l’extérieur du liquide d’échantillon biologique. Au lieu d’utiliser une pression relative positive en amont, on obtient le même résultat en créant une dépression en aval.
Selon le présent exemple, on utilise une pluralité de récipients de collecte à usage unique, chaque récipient de collecte est configuré pour être enfiché sur une plaquette de test, formant ainsi un couple [plaquette de test + récipient de collecte] à usage unique, donc destiné à être jeté après usage.
Selon une variante du récipient de collecte illustré à lafigure 9B, le récipient de collecte4STcomprend deux espaces pré-emplis respectivement de lyse et d’éthanol et pouvant être mis sélectivement en communication. Plus précisément, le récipient est livré avec un volume de lyse dans un compartiment principal et un volume d’éthanol dans un compartiment annexe47. On vient ensuite déposer grâce à un écouvillon scellable49le prélèvement de fluide corporel brut dans le compartiment principal. Ensuite on referme le couvercle43hermétiquement et on secoue le récipient de collecte4ST. Le tampon de lyse rompt les membranes des cellules biologiques. Puis on vient percer le compartiment annexe47pour faire s’écouler l’éthanol afin qu’il se mélange avec le liquide lysé. A cet effet il est prévu un élément pointu ou tranchant48déplaçable par une action manuelle sur un bouton protégé dans un orifice.
On forme ainsi un kit de collecte très pratique.
Dans ce quatrième exemple, comme visible sur lafigure 10, les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un premier côté, i.e. d’une première face principale10Aet l’entrée12pour recevoir un échantillon biologique à testerETest agencée sur le deuxième côté, i.e. sur la deuxième face principale10B.
A l’inverse, on remarque que pour les trois premiers exemples, toutes les interfaces de la plaquette avec la station d’analyse se trouvent d’un même côté10A.
Comme illustré dans lafigure 11, d’autres caractéristiques sont visibles, qui peuvent être indépendantes de la configuration du récipient de collecte. Ici, la plaquette n’a pas de valve embarquée. Les valves de sélection ou routage sont localisées dans la station d’analyse 8. De plus la pompe à air travaille en dépression au lieu de en surpression. On ‘tire’ au lieu de ‘pousser’.
Plus précisément, la plaquette dispose de quatre entrées d’air, l’entrée 14 déjà commentée pour faire avancer l’échantillon biologique dans la plaquette. Une autre entrée142est reliée au canal sur lequel arrive le premier volume de rinçage61,R1. Une autre entrée143est reliée au canal sur lequel arrive le deuxième volume de rinçage62,R2. Une autre entrée144est reliée au canal sur lequel arrive le premier volume d’élution63,23. Il peut être prévu un canal spécial pour le séchage auquel cas on a une cinquième entrée d’air145. Une seule des électrovannes146amont est ouverte à la fois, les autres restent fermées.
En aval, nous avons deux sorties d’air, une première sortie d’air16au fond du réservoir de récupération18et une deuxième sortie d’air16breliée fluidiquement au réservoir auxiliaire38. Il peut y avoir une sortie d’air pour le séchage, notée16c, en communication fluide avec l’aval du logement24 de la membrane d’extraction2.Une seule des électrovannes147amont est ouverte à la fois, pour générer une dépression dans un des circuits de canaux.
Pour rincer la membrane avec le premier liquide de rinçage, on ouvre la deuxième vanne amont et en aval la vanne1472reliée à la sortie 16. Pour rincer la membrane avec le deuxième liquide de rinçage, on ouvre à la place la troisième vanne amont. Pour sécher la membrane, on ouvre la première vanne aval1471et la cinquième vanne amont.
Pour l’élution, on ouvre la quatrième vanne amont et la troisième en aval1473reliée à la sortie.
Divers autres aspects
On note qu’il est possible d’utiliser les récipients de collecte particuliers4,4STdécrits au quatrième exemple dans le contexte et l’implémentation des autres exemples.
On note qu’il n’y a pas de source électrique à bord de la plaquette, seulement des composés et réactifs chimiques pré-stockés sous forme lyophilisée et les cas échéant des liquides.
La surpression ou la dépression créée par la pompe à air85, relativement à la pression atmosphérique peut être comprise entre 100 mbar et 500 mbars. Cette surpression ou dépression peut être adaptée en fonction de la portion de cycle (rinçage, élution, séchage).
On note qu’il est peut être prévu des nervures19dans le réservoir de récupération, ce qui permet de maîtriser l’avance du front de liquide dans le réservoir de récupération. Les nervures19se trouvent en partie basse du réservoir de récupération lorsque la plaquette est en position de test sur la station 8, les rainures 19 forment des mini barrages qui opposent une résistance hydrodynamique à la progression des liquides dans réservoir de récupération18.
On note qu’il est peut être prévu que le réservoir de récupération18est un réservoir de récupération unique à bord de plaquette, ce réservoir de récupération18étant configuré pour recueillir tous les liquides et les piéger à l’intérieur de la plaquette. Rien ne ressort de la plaquette. Seul de l’air peut ressortir de la plaquette. Ainsi on évite toute contamination de l’environnement et/ou du test suivant.
Grâce à une liaison sans fil196, la station d’analyse s’interface avec un Smartphone ou une tablette28.
De plus La station d’analyse peut s’interfacer avec un serveur29.
Avantageusement, la station d’analyse est mise à jour par téléchargement. En particulier, les paramétrages et certaines parties du logiciel peuvent ainsi être mis à jour par téléchargement depuis un serveur.
Concernant les actionneurs91-95agencés dans la station, on utilise des actionneurs linéaires. On peut par exemple choisir parmi :
- un vérin système pneumatique qui vient directement actionner un piston destiné à pousser sur la membrane ou le volume de liquide à solliciter mécaniquement,
- un vérin électrique ou un moteur pas-à-pas avec un pignon crémaillère ou un mécanisme vis-écrou
- un solénoïde ou électro-aimant
- un empilage d’étage piezo-électrique, notamment pour les valves membranes.
Bien que la description ait cite principalement la méthode LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) ou RT-LAMP (Reverse transcriptase Loop-mediated isothermal amplification), le présent système de test biologique et ses plaquettes peuvent tout-à-fait être utilisés pour les méthodes suivantes :
RPA : Recombinase polymerase amplification, ou RT-RPA,
HDA : Helicase dependant amplification, ou RT-HDA ,
RCA : Rolling circle amplification, ou RT-RCA,
SDA : Strand displacement amplification, ou RT-SDA,
NASBA : Nucleic acid sequence-based amplification, ou RT-NASBA,
TMA : Transcription mediated amplification, ou RT-TMA.
Claims (20)
1. Plaquette de test (1), pour usage unique, dans un système de test biologique (ST) destiné à détecter la présence d’une une ou plusieurs espèces pathogènes, la plaquette de test comprenant :
- un corps (10) dans lequel sont formés des canaux (13) et des logements (24,72,73), lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur,
- une entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable,
- au moins une entrée d’air (14),
- une membrane d’extraction (2), agencée dans un premier logement (24),
- une première zone de réaction (31) contenant un media poreux (35) agencé dans un deuxième logement (71) et contenant un premier mélange réactionnel de test (33) sous forme lyophilisée, le premier mélange réactionnel permettant l'amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt,
- de préférence, une deuxième zone de réaction (32) contenant un media poreux (35) agencé dans un troisième logement (72) et contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle (34) sous forme lyophilisée,
- au moins une sortie d’air (16,17),
- un réservoir de récupération (18),
- une zone de lecture de résultat, comprenant au moins la première zone de réaction (31), et le cas échéant la deuxième zone de réaction (32),
la plaquette de test étant configurée pour amener l’échantillon biologique à tester (ET) dans la membrane d’extraction (2), puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, amener l’éluat résultant dans les zones de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture.
- un corps (10) dans lequel sont formés des canaux (13) et des logements (24,72,73), lesquels sont généralement isolés de l’environnement extérieur,
- une entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide, l’entrée étant de préférence scellable ou refermable,
- au moins une entrée d’air (14),
- une membrane d’extraction (2), agencée dans un premier logement (24),
- une première zone de réaction (31) contenant un media poreux (35) agencé dans un deuxième logement (71) et contenant un premier mélange réactionnel de test (33) sous forme lyophilisée, le premier mélange réactionnel permettant l'amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt,
- de préférence, une deuxième zone de réaction (32) contenant un media poreux (35) agencé dans un troisième logement (72) et contenant un deuxième mélange réactionnel de contrôle (34) sous forme lyophilisée,
- au moins une sortie d’air (16,17),
- un réservoir de récupération (18),
- une zone de lecture de résultat, comprenant au moins la première zone de réaction (31), et le cas échéant la deuxième zone de réaction (32),
la plaquette de test étant configurée pour amener l’échantillon biologique à tester (ET) dans la membrane d’extraction (2), puis après rinçage, séchage et élution de ladite membrane d’extraction, amener l’éluat résultant dans les zones de réaction, pour, après réaction, en déduire un résultat au travers de la zone de lecture.
2. Plaquette de test selon la revendication 1, comprenant en outre au moins un premier volume (61) de premier liquide de rinçage (R1), et un volume (63) d’éluant (23), contenus directement dans des logements (74,75) du corps (10) ou contenus dans des sachets agencés dans des logements du corps.
3. Plaquette de test selon la revendication 2, dans lequel l’éluant contenu dans le volume d’éluant est de l'eau distillée exempte d'ARNase et/ou d’ADNase et le volume d’éluant présente un volume compris entre 30 microlitres et 50 microlitres.
4. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 3, comprenant en outre un deuxième volume (62) d’un deuxième liquide de rinçage (R2), les premier et deuxième volumes de liquide de rinçage ayant un volume compris entre 100 microlitres et 300 microlitres.
5. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 4, comprenant en outre au moins deux valves (51,52), de préférence de type membrane, pour diriger un flux de fluide depuis la membrane d’extraction (2) sélectivement vers le réservoir de récupération (18) ou vers la ou les zone(s) de réaction (31,32).
6. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 5, comprenant en outre un réservoir auxiliaire (38) agencé de manière adjacente à la première, et le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31) de manière à pouvoir alimenter en éluat (23) les première et deuxième zones de réaction par pompage capillaire.
7. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 6, dans lequel le corps (10) est formé en matériau plastique translucide, tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycarbonate (PC), le copolymère cyclo-oléfinique (COC) ou le Cyclo Oléfines Polymères (COP).
8. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 7, comprenant en outre une membrane ou un clapet de ventilation, agencé sur au moins une des sortie d’air (16,17), pour laisser passer de l’air vers l’atmosphère et ne pas laisser passer de liquide.
9. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 7, dans laquelle il est prévu une sortie d’air intermédiaire (17) agencée à proximité de l'entrée du réservoir de récupération, pour faciliter le séchage de la membrane après le passage des liquides de rinçage.
10. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 9, présentant une forme générale parallélépipédique plate, avec deux faces principales (10A,10B) avec l’entrée d’air (14) et l’entrée (12) pour recevoir un échantillon biologique à tester (ET) sont agencées sur une seule face principale (10A).
11. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 10 comprenant en outre un élément d’identification (27) de la plaquette.
12. Plaquette de test selon l’une des revendications 1 à 11, caractérisé en qu’elle est configurée pour recevoir, par enfichage, un récipient de collecte (4) contenant un échantillon biologique à tester.
13.Equipementde test comprenant une plaquette de test selon la revendication 12, et un récipient de collecte (4) comprenant une entrée operculée (41) et une sortie operculée (42), toutes deux agencées en partie basse du récipient de collecte, et un couvercle (43) à fermeture hermétique.
14. Equipement de test selon la revendication 13, dans lequel le récipient de collecte est enfiché sur la plaquette de test, et dans lequel plaquette de test comprend deux aiguilles (45,46) agencées respectivement en vis-à-vis de l’entrée operculée et de la sortie operculée, les aiguilles traversant les opercules durant l’opération d’enfichage.
15.Systèmede test biologique, comprenant :
- une station d’analyse (8),
- une ou plusieurs plaquettes de test (1) selon l'une des revendications précédentes, la station d’analyse comprenant au moins un connecteur pneumatique (66) configuré pour être accouplé à l’entrée d’air et/ou à la sortie d’air.
- une station d’analyse (8),
- une ou plusieurs plaquettes de test (1) selon l'une des revendications précédentes, la station d’analyse comprenant au moins un connecteur pneumatique (66) configuré pour être accouplé à l’entrée d’air et/ou à la sortie d’air.
16. Système de test biologique selon la revendication 15, dans lequel la station d’analyse (8) comprend au moins l’une des caractéristiques suivantes :
- une unité de commande (100),
- une pompe à air (85),
- un ou plusieurs actionneurs, pour pousser sur les volumes et/ou activer les valves commandées (91-95),
- un dispositif d’analyse optique pour déterminer le résultat (98,99)
- un dispositif de chauffage (96),
- des moyens de communication sans fil (116),
- un lecteur d’identifiant (105),
- un système de verrouillage de capot (112).
- une unité de commande (100),
- une pompe à air (85),
- un ou plusieurs actionneurs, pour pousser sur les volumes et/ou activer les valves commandées (91-95),
- un dispositif d’analyse optique pour déterminer le résultat (98,99)
- un dispositif de chauffage (96),
- des moyens de communication sans fil (116),
- un lecteur d’identifiant (105),
- un système de verrouillage de capot (112).
17.Procédéde test biologique mis en œuvre dans une plaquette de test selon la revendication 1, le procédé comprenant :
S1- faire passer échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide dans la membrane d’extraction (2), et le diriger en aval vers le réservoir de récupération,
S2- faire passer un premier liquide de rinçage (R1) dans la membrane d’extraction (2), et le diriger en aval vers le réservoir de récupération (18),
S3- faire passer de l’air dans la membrane d’extraction (2), pour la sécher,
S4- faire passer un volume d’éluant dans la membrane d’extraction (2), et diriger l’éluat qui en sort en aval vers la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31,32).
S1- faire passer échantillon biologique à tester (ET) sous forme liquide dans la membrane d’extraction (2), et le diriger en aval vers le réservoir de récupération,
S2- faire passer un premier liquide de rinçage (R1) dans la membrane d’extraction (2), et le diriger en aval vers le réservoir de récupération (18),
S3- faire passer de l’air dans la membrane d’extraction (2), pour la sécher,
S4- faire passer un volume d’éluant dans la membrane d’extraction (2), et diriger l’éluat qui en sort en aval vers la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31,32).
18. Procédé selon la revendication 17, comprenant en outre, avant l’étape de séchage :
S25- faire passer un deuxième liquide de rinçage (R2) dans la membrane d’extraction (2), et le diriger en aval vers le réservoir de récupération (18).
S25- faire passer un deuxième liquide de rinçage (R2) dans la membrane d’extraction (2), et le diriger en aval vers le réservoir de récupération (18).
19. Procédé selon l’une des revendications 17 ou 18, comprenant en outre à la suite :
S5- chauffer au moins la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31,32) à une température prédéfinie,
S6- attendre au moins un temps prédéterminé en maintenant la température prédéfinie,
S7- éclairer la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31,32), et recevoir en retour un niveau de fluorescence,
S8- déterminer un résultat.
S5- chauffer au moins la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31,32) à une température prédéfinie,
S6- attendre au moins un temps prédéterminé en maintenant la température prédéfinie,
S7- éclairer la première, et, le cas échéant la deuxième, zone(s) de réaction (31,32), et recevoir en retour un niveau de fluorescence,
S8- déterminer un résultat.
20. Procédé selon la revendication 19, comprenant en outre à la suite :
S9- affecter le résultat à un dossier patient (PF).
S9- affecter le résultat à un dossier patient (PF).
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