CN117615848A - 用于自动化独立生物学分析的系统、方法和设备 - Google Patents

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Abstract

用于进行基于扩增的分析，包括PCR测试的系统、设备和方法。在一个说明性实施方案中，系统可以包括测试容器组件和测试单元。测试容器组件可以包括样品收集端口、样品制备室和反应室。样品收集端口可以包括由栓塞构件密封的底部开口。在使用中，测试容器组件可以放置在测试单元的底座中，并且样品在样品收集端口中，由盖封闭。柱塞可以移开栓塞构件，样品被吸入样品制备室。一旦样品制备完成，可以打开通道，制备的样品流入反应室，然后密封反应室。然后可以进行包括扩增反应的测试，接着进行检测，如通过检测反应室中的荧光发射。

Description

用于自动化独立生物学分析的系统、方法和设备
技术领域
本公开涉及用于进行生物学分析的系统、方法和设备，包括用于检测生物体的PCR测试。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)已经成为灵敏和特异地检测样品中病原体的选择方法。通过PCR检测来自病原体的核酸是目前诊断许多传染性疾病的权威方法。在COVID-19疫情期间出现的一个挑战是在广泛的社区范围内快速进行这种分析的能力，几乎实时的结果交流，以便可以进行病例检测、接触追踪和监测，从而有效地遏制和控制疾病。目前存在许多基于PCR的测试平台，它们提供封闭的从样本到答案的设计，并且需要最少的操作员干预，周转时间为一至两个小时。但是这些设计涉及复杂的机械和消耗品，使它们变得昂贵，因此限制了它们主要用于临床实验室、医疗保健提供商、政府机构和其他专业组织。其他PCR系统允许消费者收集自己的样品，但实际的测试和分析是在样品运送到的集中的实验室进行的，得出结果的时间通常超过24小时。
操作简单的用于执行生物学分析的系统或方法将是本领域中的改进。这种需要最少的样本处理来使用的系统将是本领域的进一步改进。
发明内容
本公开涉及用于进行基于扩增的分析(包括PCR测试)的系统、设备和方法。在本公开的第一方面的一个说明性实施方案中，系统可以包括测试容器组件和测试单元，该测试单元具有用于接收测试容器组件的底座。在一些实施方案中，测试容器组件可以形成为单次使用的一次性单元。
测试容器组件可以包括样品收集端口、样品制备室和反应室。样品收集端口可以形成为具有底部开口的漏斗形杯构件，该底部开口由栓塞构件密封。样品制备室可以保持在真空下并与底部开口流体连接。反应室可以类似地保持在真空下。样品制备室和反应室可以各自包含任何所需的反应组件。测试单元可以包括与测试容器组件的各种腔室对准并且使得分析能够进行的部件。
在本公开的另一方面，提供了分析样本的说明性方法，并且可以包括提供测试容器组件并将样品放置在其收集端口中，然后用盖组件封闭该收集端口，该盖组件可以包括可移开的柱塞。测试容器组件可以放置在测试单元的底座中。柱塞可以移开栓塞构件，从而允许样品通过真空被吸入样品制备室。在一些实施方案中，这可以通过将盖组件固定到收集端口来实现。在其他情况下，可以推进柱塞以移开栓塞。与样品制备室传导接触的温度控制装置可以被致动来执行或终止样品制备反应。然后可以打开与反应室连接的通道，以允许制备的样品流入反应室。然后可以密封反应室，并通过启动与反应室传导接触的温度控制装置来进行反应，例如PCR。在反应期间和/或之后，可以进行检测，例如通过检测来自反应室中荧光染料的荧光发射，当目的反应产物存在时，该荧光染料被启动。熔解曲线分析可以任选地在反应期间和/或之后进行，以确认特定分析物或分析物的特定变体的存在或不存在。在一些实施方案中，测试单元可以包括作为光源的激光器，并且可以使用多通道光谱仪用于检测。
在另一方面，测试单元可以包括控制其各种组件以执行测试程序的CPU，以及通信网关，如蓝牙或其他无线通信组件。在一些实施方案中，测试单元可以与远程系统通信，该远程系统指示特定的测定要求，并接收和分析由测试单元收集的数据以确定结果。在一些实施方案中，系统可以利用诸如使用者的智能手机之类的手持设备来路由通信，并且可以使用设备上向使用者报告结果的应用程序。
在本公开的另一方面，根据本公开的系统和容器的示例性实施方案可以与检测样品中核酸的方法一起使用。在这种方法中，可以提供具有多个流体连接的腔室的容器或接受容器，所述腔室包括样品制备区和扩增区，具有流体连接所述腔室的一个或多个可密封的端口。应当理解，可密封端口可以提供从接受容器外部到腔室的唯一入口。样品可以通过收集端口引入第一腔室，其中收集端口具有由栓塞构件密封的底部开口。当具有可移动柱塞组件的盖组件被固定至收集端口时，栓塞构件可以与柱塞接触以移开栓塞构件，从而允许样品进入与底部开口流体连接的样品制备室。
任选地，然后可以在样品制备室中处理样品，例如通过加热使样品中的酶失活，或者用样品制备室中包含的反应物进行处理。可以打开密封件以允许样品从样品制备室流至反应室。在一些实施方案中，这可以通过将柱塞推进到样品制备室中以挤压样品并破坏密封来实现。然后可以密封反应室。在反应室中，样品中的核酸可以与PCR组分混合，所述PCR组分包括被配置用于扩增一个或多个靶标的引物；并且靶标核酸可以被扩增。
可以检测来自扩增区中荧光染料的荧光发射信号，其中荧光由激光二极管激发，并且发射由多通道光谱仪检测。可以使用能够在大约350nm到1000nm的波长中并行处理至少4个光谱通道的多通道光谱仪。荧光数据可以通过移动电话或其他使用者控制的设备或操作系统传送到云或本地CPU。然后可以分析数据，并且可以通过移动电话或其他使用者控制的设备或操作系统从云或本地CPU接收分析结果。
附图说明
本领域普通技术人员将理解，各种附图仅用于说明目的。通过参考以下详细描述、所附权利要求以及多个附图，可以更清楚地理解本公开的本质以及根据本公开的其他实施方案。
图1A、1B、1C、1D和1E分别是根据本发明原理的用于测试容器组件的主体的第一说明性实施方案的透视图、仰视图、侧视图、俯视图和剖视图。
图2是用于图1A至1E的测试容器组件的示例性栓塞构件的侧视图。
图3A和3B是用于图1A至1E的测试容器组件的一个示例性盖构件的底部透视图和剖视侧视图。
图4A和4B是用于图1A至1E的测试容器组件和图3A和3B的盖构件的一个示例性柱塞构件的透视图和剖视侧视图。
图5A和5B是图1A至1E的测试容器组件的透视和剖视侧视图，其中使用了图3A和3B的盖构件和图4A和4B的柱塞构件。
图6A是位于根据本公开原理的测试单元的一个说明性实施方案的底座中的图1A至1E的测试容器组件的局部剖视侧视图。
图6B是描绘与图6中所描绘的类似的检测组件的说明性实施方案的横向剖视图，其使用球面透镜来聚焦照明和荧光信号的收集。
图6C是根据本公开原理的测试容器的第二示例性实施方案的透视图，该测试容器位于根据本公开原理的测试单元的第二示例性实施方案的底座中。
图6D是沿着图6C的线A-A截取的剖视侧视图。
图7示出了在测试容器组件中使用干燥的扩增试剂扩增人类遗传靶标期间，在测试单元中实时监测的三个波长的荧光。
图8A和8B是在测试容器组件的扩增区中进行的扩增子熔解的结果，其中在熔解期间实时监测三色荧光(图8A)，并且根据本公开的原理通过与测试单元通信的外部CPU从其计算和绘制导数熔解曲线(图8B)，其中F是荧光，T是温度，dF/dT是导数。
图9是在根据本公开的测试容器组件中使用两个双链DNA片段在测试单元中进行熔解期间，由在六个波长同时监测的荧光计算的导数熔解曲线。
具体实施方式
本公开涉及与进行生物学分析(包括PCR测试)相关的设备、系统和方法。本领域技术人员将会理解，这里描述的实施方案虽然是说明性的，但并不旨在限制本公开或所附权利要求的范围。本领域的技术人员还将理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可以对这里呈现的实施方案进行各种组合或修改。所有这些替代实施方案都在本公开的范围内。
本公开涉及用于进行生物学分析(包括PCR测试)的系统、设备和方法。应当理解，尽管PCR是本文实例中使用的扩增方法，但是应当理解，使用引物的任何扩增方法都是合适的，无论是扩增信号还是靶标。事实上，可以使用本领域技术人员已知的任何基于邻近性的扩增方法，包括用于信号扩增以检测抗原的测定。一些合适的步骤可以包括聚合酶链式反应(PCR)；链置换扩增(SDA)；基于核酸序列的扩增(NASBA)；级联滚环扩增(CRCA)、DNA环介导等温扩增(LAMP)；等温和嵌合引物引发的核酸扩增(ICAN)；基于靶标的解旋酶依赖性的扩增(HDA)；转录介导的扩增(TMA)、CRISPR-Cas9触发的链置换扩增、免疫PCR等。扩增方法可以进一步包括诸如熔解曲线分析的分析。因此，当使用术语PCR时，应该理解为包括其他替代的扩增方法和扩增产物的分析。应当理解，方案可能需要相应调整。
出于理解的目的，将结合对唾液样品或鼻拭子样品中的冠状病毒的说明性的基于PCR的分析，如人类的COVID-19测试，来讨论本文的系统和方法。应当理解，可以使用用于不同的条件的不同的测定，所述测定使用多种样品和不同的试剂和反应参数。也可以使用含有可能的生物材料的环境和农业样品。所有这些变化都在本公开的范围内。
在一个说明性实施方案中，根据本发明的系统可以包括测试容器和测试单元，该测试单元具有用于接收测试容器组件的底座。在一些实施方案中，测试容器组件可以形成为单次使用的一次性单元。
转到图1A、1B、1C、1D和1E，描绘了总体上以10表示的一个示例性测试容器组件。应当理解，术语“测试容器组件”在本文中是指包括一个或多个用于容纳用于根据本公开进行处理的样品和反应物接受容器或外壳的组件，并且可以与术语“容器组件”互换使用。在所示实施方案中，测试容器组件10可以包括由大致刚性材料形成的主体100，其限定了样品收集端口1000、样品制备室1100和反应室1200。应当理解，主体100可以由与特定实施方案进行的特定反应和测定相容的材料构成。例如，可以使用不与PCR反应物和基底反应的可注射成型的聚合材料。在所描绘的实施方案中，基座1001可以形成为具有上表面1003和相对的下表面1004的大致平坦的构件。
样品制备室1100可设置在基座1001中，并由侧壁1101限定，该侧壁1101从底座1001升起，并朝着上部开口1103汇集。在下端，样品制备室1100可以具有穿过下表面1004的开放端口1102。
在样品制备室1100的上端，可以设置样品收集端口1000。如所描绘的，样品收集端口1000可以形成为由周围侧壁1011限定的漏斗形杯，所述侧壁1011逐渐变细至底部开口1013。侧壁1011可以包括螺纹上部1017或允许盖固定至其上的其他结构。
如图所示，底部开口1013和上部开口1103可以对齐并限定由周围侧壁限定的孔1015的上端。
在使用时，孔1015可以包含密封样品收集端口1000的底部和样品制备室1100的顶部的栓塞构件。如图2所示，栓塞构件可以是滚珠轴承200，其尺寸对应于孔1015的直径1016。在一些实施方案中，滚珠轴承可以具有略大于孔的直径的直径，其中侧壁的材料压缩栓塞构件以将其保持在适当位置。应当理解，在一些其他实施方案中，栓塞构件可以具有不同的形状，或者可以形成为穿过孔1015的易碎栓塞。在另外的实施方案中，易碎的密封件可以是设置在孔1015中的可刺穿的栓塞或密封件。
反应室1200可以形成为在与样品制备室1100间隔开的位置穿过基座1001的孔。反应室1200的上端可以由对检测所执行的测定中使用的波长足够透明的材料密封，以用作检测窗1203。检测窗1203可以由柔性材料形成，当腔室被填充时，该柔性材料允许窗弯曲以形成圆顶形状。
基座1001的底面1004可以包括形成在下表面1004中的一系列通道。如图所示，反应通道1302可以从样品制备室1100通向反应室1200。其他通道可以从腔室或通道通向真空端口1300。
底面1004可以被柔性材料的底部密封片1400(图5B)覆盖。柔性材料可以是柔性塑料薄膜或其它柔性材料，如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯及其混合物，它们可以通过本领域已知的任何方法制成，包括挤出、等离子体沉积和层压。该片可通过热处理或合适的粘合剂粘附到底面的边缘和/或其他部分，但在其覆盖样品制备室1100、反应室1200和各种通道的区域保持柔性。应当理解，在一些实施方案中，检测窗1203和底部片1400可以由相似的材料形成。应当理解，底部密封片1400可以由与特定实施方案进行的特定反应和测定相容的材料构成。
样品制备室1100和反应室1200可以保持在真空下。在一些实施方案中，可以使用真空端口1300施加真空。在一些实施方案中，施加真空可以将底部密封片1400吸到底面1004，并且该接触可以在底部密封片1400和底面之间形成易碎的密封，该密封将样品制备室1100和反应室1200彼此密封。在其他实施方案中，底部密封片1400和底面1004之间的易碎密封可以通过施加热形成。应当理解，可以使用本领域技术人员已知的在底部密封片1400和底面之间形成易碎密封的任何方法。真空端口1300然后可以被密封或者可以包含允许抽真空的密封构件。真空端口1300可以设置在从基座101突出的延伸部上，或者可以直接放置在基座1001上。
如图1B中最佳描绘的，样品制备室1100可以包括应力梯级特征，该特征有助于易碎密封件的打开，如本文别处所述。在所示实施方案中，样品制备室1100包括被应力梯级1112分开的细长部分1110，其表现为底面的一部分，逐渐变细至将细长部分分成两个“袋”的点。当样品制备室1100被加压时，袋填充有样品，从而膨胀，并且锥形点用作底部密封片1400在易碎密封件打开时从底面1300剥离的起始点。
应当理解，样品收集端口1000、样品制备室1100和反应室1200可各自包含任何所需的反应组分，包括置于该室中并密封在其中的干燥形式的反应物。干燥形式的反应组分可以通过各种已知的冷冻干燥方法(例如，Babonneau等人,(2015)Development of a Dry-Reagent-Based qPCR to Facilitate the Diagnosis of Mycobacterium ulceransInfection in Endemic Countries.PLoS Negl Trop Dis 9(4):e0003606.https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003606和Panoka等人,美国专利号8,900,525，每个文献的内容在此整体引入作为参考)或空气干燥方法(例如，Metzler等人,美国专利号8,652,811和Rombach等人,(2014)Real-time stability testing of air-dried primers andfluorogenic hydrolysis probes stabilized by trehalose and xanthan,BioTechniques 57:151-155.doi 10.2144/000114207，每个文献的内容在此整体引入作为参考)来制备。例如，样品收集端口1000可以包含用于启动样品制备步骤的试剂，该试剂以颗粒或薄膜的形式设置在其下部的侧壁上。样品制备室1100可以类似地包含样品制备部件。
一种潜在的试剂可以是蛋白酶，如蛋白酶K，其可用于消化人类样品中可能降解DNA或RNA或抑制PCR的蛋白质。可选地或另外，TCEP(三(2-羧乙基)膦)或NAC(N-乙酰半胱氨酸)可用于裂解唾液或鼻腔酶中存在的二硫键，从而使其更容易变性。应该理解的是，特定的成分和/或试剂可以根据要进行的测定而变化。在一些实施方案中，矿物油、石蜡或矿物油和石蜡的组合可以存在于第一腔室中。在使用过程中，在装载和/或加热步骤中，这些可以浮在水层上方，从而减少气泡并确保样品最接近加热器。石蜡也可以起到堵塞顶部出口的作用，以密封第二室中的样品。
反应室1200可以包含测定成分和反应物，以及分析成分，如染料、着色剂等。在一些实施方案中，密封反应室1200的顶部薄膜可具有在其上冷冻干燥或空气干燥的酶(包括聚合酶或转录酶)、核苷酸和/或缓冲液。下部密封膜可具有在其上空气干燥或冷冻干燥的引物、寡核苷酸和/或染料。应当理解，在一些实施方案中，干燥可以在柔性膜本身上进行，以将材料沉积在适当的位置，而在其他实施方案中，预干燥的材料可以沉积在适当的位置。
如图6B和6C所示，外罩605A可用于加强和保护组件10或10A。外罩605A可包括由合适的材料形成的主体，该主体可固定到基座1001上，并围绕样品收集端口1000主体、样品制备室1100和基座1001的上表面的一部分，以便于使用期间的处理并提供加固。锁定机制603可以设置在外罩605A的上表面处，以固定盖300，如本文进一步讨论的。
转向图3A和3B，描绘了用于图1A至1E的测试容器组件的一个示例性盖构件300。在所示的实施方案中，盖300形成为附接至样品收集端口1000的螺纹上部1017的帽，如图5A和5B所示，使用设置在侧壁3004的内侧上的螺纹3006，使得帽的上部3002封闭样品收集端口1000的开口顶部。在一些实施方案中，一个或多个锁定结构，如锁定凸片3007，可以连接至样品收集端口1000上或外罩605A上的相应锁定结构1007。应当理解，这种特定的封闭方式仅仅是示例性的，并且可以使用本领域技术人员已知的任何合适的布置。
柱塞孔3010可以设置在盖构件300中。在所示实施方案中，柱塞孔3010可形成为细长管3011，其从盖的上部3002的下表面向下延伸至底部开口3014。帽的上部3002中的顶部开口3012类似地与孔3010对齐。孔3010具有以3016表示的直径，该直径可以从帽的上部3002向下大致一致，穿过帽的上部3002的部分变窄，从而为柱塞400提供止动件。
柱塞400在图4A和4B中得到最佳描述。如图所示，柱塞400可形成为轴构件400，具有大致柱状的形状，具有平坦的上端4002和大致平坦的下端4004。轴4000的主体可包括具有较小直径的下部，以形成凹部或阶梯4006。应当理解，在不同的实施方案中，柱塞和帽部分的具体尺寸和形状可以变化，以便提供本文进一步讨论的功能。
图5A和5B描绘了具有盖构件300和柱塞构件400(图5B)的图1A至1E的测试容器组件。如图所示，柱塞主体4000的较大直径可对应于孔1015的直径，使得当盖300的盖固定到样品收集端口1000时，其侧面密封孔1015，较小的远端进入反应室1200。应当理解，柱塞400可以注射器柱塞的方式起作用，以密封孔1015并对样品制备室1100提供体积控制。
图6A描绘了根据本发明原理的测试单元60的一个示例性实施方案中位于底座600中的测试容器组件10。底座600可以形成为用于接收容器组件的基座1001的表面，测试单元600的部件对齐以允许进行测定。表面602可以包括对齐特征，如允许基座正确对齐并保持在适当位置的突出部或凹陷部分。在使用过程中，当部件设置在容器组件10的部分的上方时，底座600可以放置在单元60的腔室中，当单元60打开或关闭时，这些部件是可移动的，以允许使用者容易地将容器组件10放置在底座600中。底座600可在至少稍微偏离水平面的角度或倾斜位置接收基座1001，以加速反应室1200中的溶液中的任何气泡远离检测窗1203的中心的运动。
底座600可以包括第一温度控制元件610，其与样品制备室1100导热接触以供使用。在所描绘的实施方案中，第一温度控制元件是珀耳帖元件，并且传导构件612被设置成与其接触，当容器组件10被放置在底座600中时，传导构件612与样品制备室1100的底部对齐。应当理解，所示的珀耳帖元件仅仅是说明性的，可以使用本领域技术人员已知的任何温度控制组件，包括用于冷却或加热流体循环的管道、电阻加热元件等。
类似地，底座600可以包括第二温度控制元件614，其与反应室1200导热接触以供使用。在所描绘的实施方案中，第二温度控制元件是珀耳帖元件，并且传导构件616被设置成与其接触，当容器组件10被放置在底座600中时，传导构件612与反应室1200的底部对齐。应当理解，所示的珀耳帖元件仅仅是说明性的，可以使用本领域技术人员已知的任何温度控制组件，包括用于冷却或加热流体循环的管道、电阻加热元件等。
当容器组件10被放置在底座600中时，诸如热封机618的可伸缩密封单元可以被定位在底座600中，以位于反应通道1302的下方。可伸缩的密封单元可以被启动以向上移动，并且根据需要通过通道1302加热以熔化密封片1400，从而密封和隔离反应室1200，如本文进一步讨论的。
在所描绘的实施方案中，检测组件620可以位于底座600附近。检测组件620可以包括通过检测窗1203进行检测所需的部件，包括能源和传感器。在使用荧光发射检测的情况下，可能存在用于激发的能量源。在所示实施方案中，该能量源是激光器630。激光器的使用允许在单个预定波长附近的能量输入，这可以消除对一些已知检测系统中所需的波导和/或滤波器的需要。一种合适的激光器组件可以是PL-450B型激光器，其可从OSRAM OptoSemiconductors Inc.商购获得，其是金属罐封装中的蓝色激光二极管，发射波长约为450nm的光。应当理解，可以使用任何合适的激光器。或者，结合使用玻璃或带通/干涉滤光器，LED也可用作经济高效的能源选择。传感器可以是光学检测器640，如多通道光谱仪。一种合适的传感器是AS7341-DLGT，其可从AMS商购获得，其是11通道光谱仪，其光谱响应被定义在大约350nm至1000nm的波长。应当理解，可以使用任何合适的传感器。多通道光谱仪的使用允许检测多个波长的发射荧光。
图6B描绘了根据本公开的用于测试单元的检测组件620A的另一个说明性实施方案的横截面，涉及位于测试单元底座中的容器组件的基座1001中的反应室1200。检测组件620A类似于检测组件620，并且可以包括通过检测窗1203进行检测所需的部件，包括能量源(如激光器630)和光学检测器(如多通道光谱仪640)。此外，第一球面透镜650A可以位于激光器630的前面，第二球面透镜650B可以位于检测器640的前面，以聚焦穿过反应室1200的检测窗1203的荧光信号(由虚线箭头652A和652B表示)的照射和收集。
球面透镜652A和652B可以是球透镜，其可以形成为透明的球形球。合适的材料可以包括石英玻璃或另一种具有合适折射率的高透明材料，以允许使用小直径球体，其可以聚焦激光和荧光信号，用于小型化或微光学应用。
应当理解，检测组件620可以是可移动的。这可允许检测组件600在单元60打开或关闭时伸缩，以允许使用者容易地将容器组件10放置在底座600中，然后将激光器630和检测器640放置在适当位置，以在需要使用时与容器组件10的收集窗1203相互作用。应当理解，光源和检测器的布置仅仅是说明性的，并且可以使用允许将用于激发的能量聚焦到反应室中并检测从反应室发射的信号的任何布置。例如，光源和检测器的位置可以交换，或者可以将它们设置在其他位置。
测试单元60还可以包括控制其多个组件以执行测试程序的CPU，以及通信网关，如蓝牙或其他无线通信组件。在一些实施方案中，测试单元可以执行自诊断或校准方案，或可以与远程系统通信，该远程系统指示特定的测定要求，并接收和分析由测试单元收集的数据以确定结果。在一些实施方案中，系统可以利用诸如使用者的智能手机之类的手持设备来路由通信，并且可以使用设备上的应用程序来向使用者报告结果。
图6B和6C描绘了根据本公开的原理的测试单元60A的另一个示例性实施方案中的测试容器组件10A，包括位于底座600A中的外罩605A。底座600A可以形成为用于接收容器组件的基座1001的表面并且可以包括对齐壁601A，测试单元60A的部件对齐以允许进行检测。底座600A可以包括本文结合图6A的底座600讨论的各种特征和部件。测试单元60A还可以包括用于减少或重新定位反应室1200中的气泡的系统，以便于数据收集。
气泡减少系统611可以包括摇臂6002，该摇臂从驱动组件延伸到远端撞击端6003。在所示实施方案中，驱动器组件包括用于启动摇臂6002的振动器6004和复位弹簧6005。振动器6004可以由电动机(未示出)或本领域已知的其它方式启动。应当理解，可以使用用于启动摇臂6002的任何合适的驱动器组件。
当测试容器组件处于底座600中的适当位置时，摇臂6002的撞击端6003可以设置成位于基座1001的一部分的下方。底座600A可以包括使用期间摇臂6002穿过其延伸的凹部和/或撞击端6003穿过其可以露出的开口。撞击端6003可以被定位成位于底座1001更靠近远端的部分的下方。撞击端可以定位成在使用时不与反应室1200接合。
为了使用，容器组件10或10A连同包含柱塞400的盖组件300可以作为测试试剂盒的一部分提供给使用者。组件可以以密封包装提供，如保持组件无菌以供使用的真空密封封套。在这样的试剂盒中可以提供其他材料，例如说明书或样品收集物品。在对人唾液中冠状病毒的存在进行基于PCR的测试的示例性实施方案中，可以提供冲洗溶液的密封容器和一套说明书。
然后可以收集样品。在测试人类唾液中冠状病毒存在的示例性实施方案中，使用者可以将提供的溶液含在口中，并吐出到收集端口1000中。或者，使用者可以用采集拭子采集前鼻孔(鼻)样本，并在溶液中旋转拭子，所述溶液已经分配在收集端口1000中或者分配在单独的容器中，然后使用该溶液将样本溶液倒入收集端口1000中。然后，收集端口1000可以用盖组件300关闭，并且当盖组件被固定时，柱塞的远端4004可以接触并移出栓塞构件200，并且样品通过真空被抽入凹部4006周围的样品制备室1100中。测试容器组件10可以在盖固定之前或之后放置在测试单元60的底座600上。当存在纵向凹槽时，纵向凹槽可以允许当栓塞构件200移位时压力变化的排出。
当放置在底座60中时，第一温度控制装置610与样品制备室1100传导接触，并且可以被启动以执行或终止期望的样品制备反应。例如，可以在足够的温度下将样品加热足够的时间，以使唾液中的蛋白酶、核酸酶和可能天然存在的其他酶失活。如果期望对特定测定进行所需的预处理，则反应物可以以由样品重构的干燥形式存在于样品制备室1100中，并且由温度控制装置610提供适当的条件。一旦预处理完成，温度控制装置610可用于使样品达到合适的温度，以便进一步处理。
一旦预处理完成，单元60可以使柔性片1400和底面1004之间的易碎密封件至少在反应通道1302的区域打开，从而允许预处理的样品沿着反应通道1302流到反应室1200。在所描述的实施方案中，这可以通过将活塞推进穿过盖300的顶部开口3012进入孔3010中来实现，在该处它接触活塞400的上端4002并将远端4004推进到样品制备室1100中，从而密封孔1015并移动流体样品以对柔性片1400加压并使其弯曲以打开反应通道1302。
一旦足够量的预处理样品已经到达反应室1200，可伸缩密封单元618可以延伸并将密封片1400密封至底面，从而隔离反应室1200。在所描绘的实施方案中，可以执行这种密封以封闭总体上以1114指示的区域中的通道(图1B)。然后可以进行诊断反应。用于特定反应的反应物可以以干燥形式存在于反应室1200中，该干燥形式由样品重构，并且由第二温度控制装置614提供适当条件。
在用于检测人唾液中冠状病毒存在的基于PCR测试一个示例性实施方案中，可能存在所需的反应物。在一个实施方案中，为了减少所需的预处理步骤，可以存在UNG酶以减少交叉污染和假阳性。可以提供用于PCR的合适的热循环来扩增冠状病毒基因组特异性区域。在一些实施方案中，可以使用与寡核苷酸探针连接的荧光染料，所述寡核苷酸探针在热循环过程中特异性结合扩增产物。
当存在启动气泡减少系统时，可以启动气泡减少系统以减少反应室中的任何空气或气泡。在所描绘的实施方案中，当振动器6004被启动时，驱动器可以被启动，导致摇臂6002振动，并且该臂被复位弹簧6005约束。撞击端6003可以重复接触基座1001，或者持续设定的次数，或者持续设定的时间，以提供能量来破裂或移动反应溶液中的任何气泡。在基座位于斜面上的情况下，任何剩余的气泡可朝向腔室的一侧移动并远离检测窗1203的中心。在基座1001可随着摇臂被启动而弯曲的实施方案中，传感器组件620可在气泡减少启动期间远离容器组件定位。
当反应充分完成时，可以进行检测，在示例性实施方案中，激光器630用于以第一波长向反应室提供能量，传感器640用于读取不同通道上不同波长的发射。在适当的情况下，传感器组件620可以移动到允许执行检测的位置。
在示例性实施方案中，测试单元60中的CPU可用于控制其各种组件来执行测试程序。通信网关允许CPU与远程系统通信，该远程系统指示特定的测定要求，并接收和分析由测试单元收集的数据以确定结果。在一个示例性实施方案中，单元60可以与使用者的手持移动设备结合使用，如操作软件应用或应用程序或app的智能手机。使用者通过这种设备将单元60置于通信中。在一个实例中，试剂盒中的说明书可以包含可扫描代码，或者可扫描代码可以存在于容器组件10上。该代码对特定的测试是特定的，并打开移动设备上的控制面板。远程系统向该单元提供控制指令以允许进行该程序，并且由传感器640收集的数据可以被传输到远程系统。然后远程系统可以分析数据，如通过使用多通道进行数据校正和标准化，并确定目的扩增序列产物的存在或不存在。然后，结果可以在应用程序中传回给使用者。
应当理解，数据传输可以加密、匿名或以符合适用的隐私法的方式进行。此外，在需要将阳性测试结果提供给相关机构(如当地卫生部门或CDC)的情况下，远程系统可以这样做。
还应当理解，本文公开的系统、方法和装置不限于单一条件。可以使用用于检测需要不同引物、酶和/或不同反应条件的不同分析物的反应。远程系统或测试单元本身可以改变特定条件以进行这种测试。通过使用由多通道光谱仪检测的多个发射波长，也可以在单个反应室中同时检测多种分析物。多通道光谱仪传感器和远程数据分析的便携性和经济性允许系统处理这种变化的测试，并且允许单元在住宅或办公室环境中操作，而不需要配备训练有素的人员的医学测试实验室。还应该理解的是，容器组件包括多个反应室并且测试单元包含用于那些反应室的相关部件的实施方案被设想为允许执行多重测试。
在另一个示例性实施方案中，根据本公开的系统和容器可以与检测样品中核酸的方法一起使用。在这种方法中，可以提供具有多个流体连接的腔室的容器或接受容器，所述腔室包括样品制备区和扩增区，具有流体连接所述腔室的一个或多个可密封的端口。应当理解，可密封端口可以提供从接受容器外部到腔室的唯一入口。样品可以通过收集端口引入第一腔室，其中收集端口具有由栓塞构件密封的底部开口并且当盖组件固定到收集端口时，关闭收集端口，并且盖组件包括可移动的柱塞组件；栓塞构件可以与柱塞接触，以移动栓塞构件，并允许样品进入与底部开口流体连接的样品制备室。
任选地，然后可以在样品制备室中处理样品，例如通过加热使样品中的酶失活，或者用样品制备室中包含的反应物进行处理。可以打开密封件以允许样品从样品制备室流至反应室。在一些实施方案中，这可以通过将柱塞推进到样品制备室中以挤压样品并破坏密封来实现。然后可以密封反应室。
在反应室中，样品中的核酸可以与PCR组分混合，所述PCR组分包括被配置用于扩增一个或多个靶标的引物；并且靶标核酸可以被扩增。
可以检测来自扩增区中荧光染料的荧光发射信号，其中荧光由激光二极管激发，并且发射由多通道光谱仪检测。可以使用能够在大约350nm到1000nm的波长中并行处理至少4个光谱通道的多通道光谱仪。荧光数据可以通过移动电话或其他使用者控制的设备或操作系统传送到云或本地CPU。然后可以分析数据，并且可以通过移动电话或其他使用者控制的设备或操作系统从云或本地CPU接收分析结果。
应当理解，在这种方法中，扩增区可以包含引物，所述引物被配置为扩增可能存在于样品中的一个或多个核酸靶标。这种核酸靶标可以来源于病原体，如病毒、细菌和真菌。一些示例性的致病病毒可以包括冠状病毒、腺病毒、PIV1、PIV2、PIV3、RSV、甲型流感、乙型流感、鼻病毒和非HRV肠道病毒。一些这样的冠状病毒靶标可以包括229E、NL63、OC43和HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2。该方法可以被优化以检测多种SARS-CoV-2变体。在其他实施方案中，核酸靶标可以是人类核酸序列。在进一步的实施方案中，靶标可以由病原体和人类分析物两者组成，扩增区可以配备有干燥的扩增和检测试剂。在一些实施方案中，扩增区可以配备有进行熔解曲线分析的工具。
图7中显示了根据本发明的扩增方法的检测到的结果的第一个非限制性实例。在含有干燥的、预先计量的PCR试剂的测试容器组件中扩增人类多态性区域的50bp片段(SNPRS1981928,chr2:47445309+47445358)。在该实例中，将溶于2mL水中的5ng/μL胎盘来源的人DNA(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)引入样品收集端口1000。一旦柱塞400被接合，DNA溶液被引入样品制备室1100，随后被引入反应室1200，反应室1200被填充至65μL的体积。将引物5’CGAGGTAGTGTATTATTAGTGGGAAG SEQ ID NO.1和5’AGGGAGATGATGTAGCACTCA SEQ IDNO.2(IDT,Coralville,IA)各自以一旦溶解于DNA溶液中使得最终浓度为0.5μM的量，和将Maverick Blue核酸染色剂(Idaho Molecular,Inc.,Salt Lake City,UT)以使最终浓度为20μM的量，以干燥形式沉积到反应室的底部内表面(底部密封片1400)。Go-Taq DNA聚合酶(0.13U/μL，Promega，Madison，WI)、0.2mM dNTP、4mM MgCl2、50mM Tris HCl pH 8.5和0.12mg/mL BSA(均为最终浓度)以干燥形式沉积在反应室的上部内表面上(检测窗1203)。扩增在90℃下进行0秒钟，在63℃下进行4秒，进行45个循环，并通过检测窗1203进行实时监控，使用三个波长通道(480nm、515nm和555nm)。这三个波长通道覆盖了用于检测扩增产物的Maverick Blue的荧光发射范围。测试单元在450nm激光二极管前面以及多通道分光计前面使用了球面透镜。
扩增后，以0.35℃/s的升温速率将样品从50℃加热到90℃，在此期间使用三个通道实时监测荧光(产生图8A所示的结果)，之后将数据转换成图8B所示的负导数熔解曲线。77℃的熔解温度证实扩增了正确的DNA片段。所有的数据处理都发生在通过蓝牙与测试单元通信的外部CPU中。
图9示出了另一个非限制性实例，其描述了在测试容器组件中使用480nm、515nm、555nm、590nm、630nm和680nm六种波长的检测进行的熔解曲线分析。测试单元具有与上面针对图7、8A和8B描述的相同的试剂和光学配置以及外部CPU。模拟高(75℃)和低(63℃)熔解温度的扩增产物的两个合成双链DNA片段在反应室1200中被熔解。高熔解温度DNA是由具有序列5’CGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAGGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACC SEQ ID NO.3的寡核苷酸与其反向互补序列杂交产生的双链片段。低熔解温度DNA是由寡核苷酸5’AGTGGAACCTCATCAGGAA SEQ ID NO.4和5’CTCCTGATGAGGTTCCACCTGGTTT SEQ ID NO.5杂交产生的双链片段(其中下划线的碱基在另一条链上没有互补碱基)。两个DNA片段都用双链DNA结合染料Maverick Blue染色，并在前三个颜色通道(480nm、515nm和555nm)中检测到。低熔解温度的DNA片段进一步用羧基罗丹明(ROX)染料标记(其可以附着在AGTGGAACCTCATCAGGAA SEQ ID NO.4的5’末端)，并在由来自Maverick Blue的荧光能量转移实现的另外三个通道(590、630和680nm)中检测。
虽然已经使用某些实施方案描述了本公开，但是可以在保持其实质和范围内的同时对其进行进一步修改。因此，本申请旨在覆盖使用本发明的一般原理的本公开的任何变化、使用或修改。本申请旨在覆盖任何和所有偏离本公开的内容，只要这些内容属于本领域已知的或常规的实践，并且落入所附权利要求的限制内。
序列表
<110> 联合诊断公司(Co-Diagnostics, Inc.)
<120> 用于自动化独立生物学分析的系统、方法和设备
<130> IMI-0001.NP
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 1
cgaggtagtg tattattagt gggaag 26
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 2
agggagatga tgtagcactc a 21
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 3
cggaatcttg cacgccctcg ctcaggcctt cgtcactggt cccgccacc 49
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 4
agtggaacct catcaggaa 19
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 5
ctcctgatga ggttccacct ggttt 25

Claims (35)

1.一种用于进行生物学测定的系统，所述系统包括：
测试容器组件，其包括
具有底部开口的样品收集端口，所述底部开口由栓塞构件密封，
与底部开口流体连接的样品制备室，以及
反应室；
盖组件，其被配置为关闭样品收集端口，所述盖组件包括能够移动的柱塞，其当盖组件被固定到样品收集端口时与栓塞构件接触；和
测试单元，其包括用于接收测试容器组件的底座，所述测试单元包括：
第一温度控制装置，其当所述测试容器组件被放置在所述底座中时与所述样品制备室传导接触，
第二温度控制装置，其当所述测试容器组件被放置在所述底座中时，与所述反应室传导接触，以及
检测器组件，其被设置成当测试容器组件被放置在底座中时监控反应室中的条件。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述样品收集端口形成为设置在所述样品制备室上方的杯状构件。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述测试容器组件还包括
具有上表面和相对的底表面的基座构件主体，
与部分底表面粘附的柔性底部密封片，其中样品制备室下端的至少一部分和反应室的至少一部分由底表面和底部密封片之间的空间限定。
4.根据权利要求3所述的系统，其中所述反应室包括形成在所述基座构件主体的上表面中的检测窗。
5.根据权利要求4所述的系统，其中所述检测窗由柔性材料形成。
6.根据权利要求3所述的系统，其中所述样品制备室保持在真空下，直到所述栓塞构件在所述盖组件被固定时被所述能够移动的柱塞从所述底部开口推出。
7.根据权利要求3所述的系统，其还包括在所述样品制备室和所述反应室之间延伸的反应通道，其中所述反应通道由所述底表面和所述底部密封片之间的空间限定。
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述底部片和所述基座构件的底表面之间的易碎密封件密封所述反应通道直至使用。
9.根据权利要求8所述的系统，其中所述底表面包括应力梯级，所述应力梯级限定了在使用期间用于打开所述易碎密封件的点。
10.根据权利要求8所述的系统，其中所述测试单元还包括柱塞机构，其接触并推进所述能够移动的柱塞，以置换所述样品制备室中的流体并打开所述易碎的密封件。
11.根据权利要求8所述的系统，其中所述测试单元还包括热封机，用于将所述底部片的一部分密封至底表面，以封闭所述反应室。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述检测器组件包括多通道光谱仪和光源，所述光源选自由激光二极管和发光二极管组成的组。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述检测器组件还包括至少一个第一球透镜，所述第一球透镜被设置成将来自所述光源的光照聚焦到所述反应室上。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述检测器组件还包括第二球透镜，所述第二球透镜被设置成将来自所述反应室的发射光聚焦到所述多通道光谱仪。
15.一种分析样品的方法，其包括
将样品放置在容器组件的样品收集端口中，其中所述样品收集端口具有由栓塞构件密封的底部开口；
将盖组件固定到所述样品收集端口，以关闭样品收集端口，其中所述盖组件包括能够移动的柱塞组件；
使栓塞构件与柱塞组件接触，以移出所述栓塞构件，并允许样品进入与底部开口流体连接的样品制备室；
打开密封件以允许样品从样品制备室流到反应室；
进行反应以扩增可能存在于样品中的目的生物标志物；和
检测反应室中扩增的目的生物标志物的存在。
16.根据权利要求15所述的方法，其中打开密封件以允许样品从样品制备室流向反应室包括推进能够移动的柱塞以置换样品制备室中的流体并打开易碎密封件。
17.根据权利要求15所述的方法，还包括加热所述样品制备室中的样品以使样品中的酶失活。
18.根据权利要求17所述的方法，还包括在进行反应以扩增可能存在于样品中的目的生物标记物之前密封所述反应室。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述目的生物标志物是至少一个核酸靶标，并且所述反应室包含引物，所述引物被配置为扩增可能存在于所述样品中的一个或多个核酸靶标。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述反应室中包含干燥的扩增和检测试剂。
21.根据权利要求20的方法，其中所述干燥的扩增和检测试剂通过空气干燥制备。
22.根据权利要求15所述的方法，其中检测所述反应室中目的扩增生物标志物的存在包括检测来自荧光染料的荧光发射信号。
23.根据权利要求15所述的方法，其中检测所述反应室中目的扩增生物标志物的存在包括进行熔解曲线分析。
24.一种检测样品中核酸的方法，包括：
提供具有多个流体连接的腔室的接受容器，所述腔室包括
样品制备区，
扩增区，
流体连接腔室的一个或多个能够密封的端口，所述能够密封的端口提供从接受容器外部到腔室的唯一入口，以及
通过收集端口将样品引入第一腔室，其中收集端口具有由栓塞构件密封的底部开口；
将盖组件固定到收集端口，以关闭收集端口，其中所述盖组件包括能够移动的柱塞组件；
使栓塞构件与柱塞接触，以移出所述栓塞构件，并允许样品进入与底部开口流体连接的样品制备室；
打开密封件以允许样品从样品制备室流到反应室；
密封所述反应室；
将样品中的核酸与PCR组分混合，所述PCR组分包括被配置用于扩增一个或多个靶标的引物；
扩增靶标核酸；
检测来自扩增区中荧光染料的荧光发射信号，其中
荧光由激光二极管激发，
发射由能够在大约350nm到1000nm的波长并行处理至少4个光谱通道的多通道光谱仪检测；
通过移动电话或其他使用者控制的设备或操作系统将荧光数据传送到云或本地CPU；
通过移动电话或其他使用者控制的设备或操作系统从云或本地CPU接收分析结果。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述扩增区包含引物，所述引物被配置为扩增可能存在于样品中的一个或多个核酸靶标。
26.根据权利要求25所述的方法，其中至少一个核酸靶标来源于选自由病毒、细菌和真菌组成的组的病原体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述病毒选自由冠状病毒、腺病毒、PIV1、PIV2、PIV3、RSV、甲型流感、乙型流感、鼻病毒和非HRV肠道病毒组成的组。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述冠状病毒选自由229E、NL63、OC43和HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2组成的组。
29.根据权利要求28所述的方法，其中检测多个SARS-CoV-2变体。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述核酸靶标是人的核酸序列。
31.根据权利要求25所述的方法，其中所述扩增区中配备有干燥的扩增和检测试剂。
32.根据权利要求31所述的方法，其中干燥的扩增和检测试剂通过空气干燥制备。
33.根据权利要求25所述的方法，其中所述扩增区还配备有进行熔解曲线分析的手段。
34.根据权利要求25所述的方法，其中所述激光二极管与球透镜一起使用。
35.根据权利要求25所述的方法，其中所述光谱仪与球透镜一起使用。
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