EP4132703A1 - Dispositif de diagnostic portable en forme de boitier cylindrique et ses utilisations - Google Patents

Dispositif de diagnostic portable en forme de boitier cylindrique et ses utilisations

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EP4132703A1
EP4132703A1 EP21716762.6A EP21716762A EP4132703A1 EP 4132703 A1 EP4132703 A1 EP 4132703A1 EP 21716762 A EP21716762 A EP 21716762A EP 4132703 A1 EP4132703 A1 EP 4132703A1
Authority
EP
European Patent Office
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diagnostic device
aforesaid
biological sample
detection
amplification
Prior art date
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Pending
Application number
EP21716762.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Patrick Tabeling
Pierre GARNERET
Elian MARTIN
Etienne COZ
Elodie Brient-Litzler
Jean-Claude Manuguerra
Jessica VANHOMWEGEN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris
Paris Sciences et Lettres Quartier Latin
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris
Paris Sciences et Lettres Quartier Latin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris , Paris Sciences et Lettres Quartier Latin filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
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    • B01L3/5023—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures with a sample being transported to, and subsequently stored in an absorbent for analysis
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • TITLE PORTABLE DIAGNOSTIC DEVICE IN THE SHAPE OF A CYLINDRICAL BOX AND ITS USES
  • the present invention relates to a portable device for diagnosing pathogens (viruses, bacteria, microorganisms, etc.) by rapidly detecting their nucleic acids in a biological sample to be tested.
  • pathogens viruses, bacteria, microorganisms, etc.
  • the present invention also relates to the uses of the diagnostic device of the invention and the methods which it enables to be carried out.
  • NAAT Nuclear Acid Amplification Test
  • PCR-based NAATs Although extremely useful, the downside of PCR-based NAATs is the cost and use of complex equipment. Many commercial instruments are now commercially available (ThermoFisher ® , Roche ® , Genexpert ® , etc.). However, the cost of the equipment varies from € 30k to € 200k. In many cases, they need highly skilled people, and clean, temperature and humidity controlled spaces to perform the tests. Such equipment is located in a limited number of places, hospitals and laboratories, requiring, in most cases, the transport of samples for analysis, or the transport of patients to reach these places, with significant risks of contamination. Thus, the cost and complexity of the PCR-based NAAT hinders the ability to perform massive amounts of testing, or limits it to wealthy countries.
  • LAMP isothermal amplification which operates at 65 ° C, should be highlighted, due to its performance, in terms of amplification rate (twice as fast as PCR), sensitivity and specificity (similar to PCR), as well as large amounts of cDNA (Complementary Deoxyribonucleic Acid) produced during the reaction, facilitating reading.
  • NAATs based on RPA and LAMP have been made, most often inspired by the ideas developed in recent years in the field of “Paper microfluidics” (S.
  • Vella et al. “Measuring markers of liver function using a micropatterned paper device designed for blood from a fingerstick”, Analytical Chemistry, vol. 84, pp. 2883-2891, 2012; J. Linnes et al. al., “Paper based molecular diagnostic for Chlamydia trachomatis, RSC Advances, vol. 4, pp. 42245-42251, 2014; L. Magro et al.,“ Paper microfluidics for nucleic acid amplification testing (NAAT) ofinfectious diseases '', Lab on a Chip, 14, 2347-2371, 2017; L.
  • NAAT nucleic acid amplification testing
  • the inventors have developed a new portable and easily deployable diagnostic device on a large scale allowing the diagnosis of pathogens (viruses, bacteria, microorganisms, etc.) based on on nucleic acid detection.
  • This new device makes it possible to carry out rapid, reliable and safe tests, and also makes it possible to test one or more samples.
  • this new device which can be single-use and / or disposable, has the advantage of being inexpensive and locally usable.
  • the diagnostic device of the invention the diagnoses could be carried out in the doctor, in the emergency department of the hospital, in the workplace, in pharmacies or even at home.
  • One of the first objects of the invention is therefore a portable diagnostic device in the form of a cylindrical housing.
  • a second object of the invention relates to the various possible uses of the diagnostic device of the invention.
  • Another object of the invention relates to the methods easily performed by a user, which allow the rapid diagnosis of pathogens (viruses, bacteria, microorganisms, etc.) in a reliable and safe manner.
  • Another object of the invention also relates to the methods of manufacturing the diagnostic device of the invention.
  • Figure 1 shows a perspective view of the diagnostic device of the invention.
  • Figure 2 shows a schematic top view of the diagnostic device of the invention.
  • Figure 3 shows a schematic bottom view of the diagnostic device of the invention when it includes a recess.
  • Figure 4 shows an exploded perspective view of the diagnostic device of the invention illustrated in Figures 1, 2 and 3.
  • diagnostic device (3) upper disc; (5) lower disc; (7) receiving opening; (8) membrane; (9) window; (11) optical filter; (13a and 13b) pellets and (15) absorbent material.
  • Figure 5 shows a vertical broken sectional view of the diagnostic device of the invention along the line VV (A) of Figure 2 (ie without recess at the level of the lower disc (5)) and (B) of Figure 3 (ie with recess at the level of the lower disc (5)).
  • FIG. 6 represents a top perspective view of a first variant implementation of the diagnostic device of the invention making it possible to perform eight tests on the same device.
  • diagnostic unit black triangle
  • upper disc upper disc
  • detection unit white circular arc
  • Figure 7 shows a top perspective view of a second implementation variant of the diagnostic device of the invention making it possible to perform twelve tests on the same device.
  • Figure 8 shows a bottom view of the upper disc of the diagnostic device of the invention, which includes three-dimensional elements to aid the rotational movement.
  • Figure 9 shows a schematic view of the plans for printing the upper disc of the diagnostic device of the invention using a 3D printer. The numbers and numbers correspond to dimensions are in millimeters (mm).
  • Figure 10 shows a schematic view of the plans for printing the lower disc of the diagnostic device of the invention using a 3D printer. The numbers and numbers correspond to dimensions are in millimeters (mm).
  • Figure 11 shows the experimental data obtained in Example 2.
  • Photograph taken with a smartphone (d) Device for the detection of SARS-CoV-2, sample containing SARS-CoV-2 RNA (positive sample).
  • Figure 12 shows a schematic view of the dispenser in its closed configuration.
  • Figure 13 shows a schematic view of the dispenser in its open configuration.
  • Figure 14 shows an exploded schematic view of the diagnostic device of the invention.
  • diagnostic device (50) cavity; (51) circular slit; (52a and 52b) receiving openings; (53) radial slot; (55) central stud; width a; axis r1; axis r3; angles a and b.
  • Figure 16 shows a schematic top view of the upper disc (33) including an opening.
  • Figure 17 is a schematic view of the interior of the lower disc (35). (35) lower disc; (54) central hole; (56) radial slot; (57) gripping means; (58) radial window; (59) bowl; (60) nipple; width a ’; axis r'1; axis r’2; axis r'3 and angle a / 2.
  • Figure 18 shows a schematic view of the capsule in its open configuration.
  • Figure 19 shows a schematic view of the lower disc (35) into which the capsule (62), in its open configuration, is inserted.
  • Figure 20 shows the arrangement of the upper disc (33) relative to the lower disc (35) when the diagnostic device (31) is in position 1. (33) upper disc; (35) lower disc; (52a and 52b) receiving openings;
  • Figure 21 shows the arrangement of the upper disc (33) relative to the lower disc (35) when the diagnostic device (31) is in the intermediate position.
  • Figure 22 shows the arrangement of the upper disc (33) relative to the lower disc (35) when the diagnostic device (31) is in position 2.
  • Figure 23 shows schematically a type of arrangement implemented in a dispenser (20).
  • Figure 24 is a schematic top view of the detector (21) in its open configuration.
  • Figure 25 shows a schematic top view of the detector (21) in its closed configuration.
  • Figure 26 shows schematically a type of arrangement implemented in a detector (21). (94) food; (95) control electronics; (96) power stage; (97) heating resistors and (98) diodes.
  • Figure 27 shows a serial operating diagram with n capsules of the diagnostic device of the invention in combination with a detection system comprising the joint use of a dispenser and a detector.
  • Figure 28 shows the experimental data obtained in Example 3.
  • Detection of SARS-CoV 2 RNA in artificial samples of saliva and nasopharyngeal fluid panel provided by the X Prize foundation as part of the XPrize rapid covid testing competition.
  • the invention consists in coupling an extraction unit and an amplification / detection unit in a portable device, which comprises reagents lyophilized in situ. Examples of this device and its variants are illustrated in Figures 1 to 10 and 12 to 27.
  • a first aspect of the invention relates to a portable diagnostic device in the form of a cylindrical housing including means:
  • nucleic acids DNA and / or RNA
  • ⁇ isothermal amplification eg. (RT) -LAMP, (RT) -LAMP-QUASR [Quenching of Unincorporated Amplification Signal Reporters]
  • RT isothermal amplification
  • a first very general embodiment of the invention according to this first aspect relates to a portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical housing comprising two superimposed coaxial discs (3, 5) mounted to rotate with respect to the other and defining a closed volume, namely:
  • a biological sample to be tested which is provided with a membrane (8) which is biologically compatible and capable of allowing the extraction and retention of nucleic acids from this biological sample in the presence of reagents appropriate, and
  • At least one window (9) which is either equipped with an optical filter (11) integrated into the mass of the upper disc, or capable of receiving a filter optical (11) positionable on said window in a removable manner, this receiving opening (7) and this window (9) being angularly spaced apart by an angle at the center of at least 30 °,
  • reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two biologically compatible, adjacent, independent pellets (13a, 13b), and capable of allowing the amplification and detection of at least one sequence of acids nucleics of interest likely to be present in the aforesaid biological sample in the presence of appropriate reagents, the receiving opening (7), the window (9), the absorbent material (15) and the reaction zone (12) forming a unit detection (4) such that, by a rotation, the upper disc can successively
  • the passage from the aforesaid second position to the aforesaid first position can therefore be done either by a rotation opposite to that allowing the passage from the aforesaid first position to the aforesaid second position, or by a rotation in the same direction as this one.
  • this is done by a reverse rotation, which makes it possible to return to the initial position more directly, by a shorter path, preventing the viewing window (9) from approaching the absorbent material (15).
  • the invention then relates to the diagnostic device (1) as described above in which the passage from the aforesaid second position to the aforesaid first position is effected by a rotation opposite to that allowing the passage from the aforesaid first position to the aforesaid first position. aforesaid second position.
  • a very general advantageous embodiment of the invention relates to a portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical housing comprising two superimposed coaxial discs (3, 5) mounted to rotate with respect to each other. and defining a closed volume, namely:
  • a biological sample to be tested which is provided with a membrane (8) which is biologically compatible and capable of allowing the extraction and retention of nucleic acids from this biological sample in the presence of reagents appropriate, and
  • At least one window (9) which is either equipped with an optical filter (11) integrated in the mass of the upper disc, or capable of receiving an optical filter (11) which can be positioned on said window in a removable manner, this receiving opening ( 7) and this window (9) being angularly separated by an angle at the center of at least 30 °, in particular by an angle at the center of 30 ° to 320 °,
  • reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two biologically compatible, adjacent, independent pellets (13a, 13b), and capable of allowing the amplification and detection of at least one sequence of acids nucleics of interest likely to be present in the aforesaid biological sample in the presence of appropriate reagents, the receiving opening (7), the window (9), the absorbent material (15) and the reaction zone (12) forming a unit detection (4) such that, by a rotation, the upper disc can successively
  • the lower disc (5) further comprises at least one recess (6) which is either equipped with a waterproof material (10) integrated into the mass of the lower disc, is able to receive a waterproof material (10) positionable on said recess in a removable manner, and which is positioned to the right of said at least one reaction zone (12) and integral with the latter, and in particular allowing light to reach said at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b) of said at least one reaction zone (12).
  • the lower disc (5) further comprises at least one recess (6) which is either equipped with a waterproof material (10) integrated into the mass of the lower disc, is able to receive a waterproof material (10) positionable on said recess in a removable manner, and which is positioned to the right of said at least one reaction zone (12) and integral with the latter, and in particular allowing light to reach said at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b) of said at least one reaction zone (12).
  • this other general embodiment relates to the portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical casing as described above comprising two superimposed coaxial disks (3, 5) mounted to rotate with respect to one another. other and defining a closed volume, namely:
  • a biological sample to be tested which is provided with a membrane (8) which is biologically compatible and capable of allow the extraction and retention of nucleic acids from this biological sample in the presence of appropriate reagents, and
  • At least one window (9) which is either equipped with an optical filter (11) integrated in the mass of the upper disc, or capable of receiving an optical filter (11) which can be positioned on said window in a removable manner, this receiving opening ( 7) and this window (9) being angularly separated by an angle in the center of at least 30 °,
  • reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two biologically compatible, adjacent, independent pellets (13a, 13b), and capable of allowing the amplification and detection of at least one sequence of acids nucleics of interest likely to be present in the aforesaid biological sample in the presence of appropriate reagents, and
  • At least one recess (6) which is either equipped with a sealed material (10) integrated into the mass of the lower disc, or capable of receiving a sealed material (10) which can be positioned on said recess in a removable manner, and which is positioned right to said at least one reaction zone (12) and integral with it, and in particular allowing light to reach said at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b) of said at least a reaction zone (12); the receiving opening (7), the window (9), the absorbent material (15), the reaction zone (12) and the recess (6) forming a detection unit (4) such that, by rotation, the upper disc can successively
  • this other general embodiment relates to the portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical housing as described above comprising two superimposed coaxial disks (3, 5) mounted to rotate with respect to each other. and defining a closed volume, namely:
  • a biological sample to be tested which is provided with a membrane (8) which is biologically compatible and capable of allowing the extraction and retention of nucleic acids from this biological sample in the presence of reagents appropriate, and
  • At least one window (9) which is either equipped with an optical filter (11) integrated in the mass of the upper disc, or capable of receiving an optical filter (11) which can be positioned on said window in a removable manner, this receiving opening ( 7) and this window (9) being angularly separated by an angle at the center of at least 30 °, in particular by an angle at the center of 30 ° to 320 °,
  • - at least one reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two biologically compatible, adjacent, independent pellets (13a, 13b), and capable of allowing amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the aforesaid biological sample in the presence of appropriate reagents
  • - at least one recess (6) which is either equipped with a sealed material (10) integrated into the mass of the lower disc, is able to receive a sealed material (10) positionable on said recess in a removable manner, and which is positioned to the right of said at least one reaction zone (12) and integral thereto, and in particular allowing light to reach said at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b) of said at least one reaction zone (12); the receiving opening (7), the window (9), the absorbent material (15), the reaction zone (12) and the recess (6) forming a detection unit (4) such that, by rotation, the upper disc can successively
  • a portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical casing is meant a device substantially the size of a hand (eg. From 4.00 cm to 20.00 cm in diameter, ie 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 cm) easily gripping and ergonomic.
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above in which the upper (3) and lower (5) discs are made of a material chosen from: polylactic acid ( PLA) and polycarbonate (C0-0-pPh-C (CH3) 2 -pPh-0) n ).
  • PLA polylactic acid
  • C0-0-pPh-C (CH3) 2 -pPh-0) n polycarbonate
  • the materials used to make these discs can be opaque or transparent (ie allows light to pass).
  • the invention also relates to the diagnostic device (1) as described above, the diameter to height ratio of the device being between 5 and 30.
  • the diameter to height ratio of the device is comprised from 5 to 10, from 10 to 15, from 15 to 20, from 20 to 25, from 25 to 30, from 10 to 20 or from 15 to 25.
  • the diameter to height ratio of the device is 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 .
  • the diagnostic device (1) of the invention also comprises three-dimensional structures which help guide the rotations of the upper disc on the lower disc and vice versa, thus making it more ergonomic and even easier to use.
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above in which said rotations are guided by a system of groove (s) (16) and lug (s), also called cleat (s).
  • the diameter of the upper (3) and lower (5) discs can be different.
  • the system of groove (s) and lug (s) can then be replaced or completed by a system of skirt (s) (17) and slide (s) (18).
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above in which the upper disc (3) is larger than the lower disc (5) or wherein the lower disc (5) is larger than the upper disc (3).
  • the skirt (s) are arranged on the largest disc and the slide (s) (18) on the upper (3) and lower (5) discs to guide the rotations. of the device. Consequently, according to another embodiment, the invention relates to the diagnostic device (1) as described above in which said rotations are guided by a system of skirt (s) (17) and slide (s) ( 18).
  • the diagnostic device (1) of the invention also comprises three-dimensional structures which aid in the assembly of the upper (3) and lower (5) discs on top of each other.
  • the diagnostic device (1) of the invention comprises a stud in the center of the lower disc (5), or of the upper disc (3), which fits into a circular recess hollowed out (cut out) in the center of the disc upper (3), or the lower disc (5).
  • It can also be a ring (ie an additional part) on which the upper (3) and lower (5) discs fit (clip), said ring comprising means allowing the discs to rotate one on the other. other (eg slides, grooves, lugs or cleats, etc.).
  • the diagnostic device (1) of the invention also comprises parts, molded or not with (on) the discs, allowing the introduction of the biological sample to be tested and of the reagents (or buffers) without loss of liquid. .
  • biological sample to be tested any type of biological sample likely to contain nucleic acids. It can be non-exhaustive way of blood, urine, sweat, saliva, secretions from the ENT sphere (eg nose, ears, throat), cerebrospinal fluid, lymphatic fluid, fluid amniotic, etc. It can also be a nasopharyngeal smear, cervico-vaginal smear, etc.
  • the biological sample to be tested can also come from a mammal. In particular, it comes from a mammal chosen from: Man (ie child, adult, woman and man), monkeys, felines, canines, equines, deer, cattle, sheep and poultry. Preferably, it is a human sample.
  • nucleic acids is meant deoxyribonucleic acid (DNA) and / or acid ribonucleic acid (RNA).
  • the invention by virtue of its circular configuration, also advantageously makes it possible to carry out the elution of nucleic acids, and the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence (DNA and / or RNA) of interest likely to be present in a biological sample at the same location of the device thus avoiding too many manipulations.
  • the invention is configured so that the window (9) equipped with an optical filter (11) can never be in line with and in contact with the absorbent material (15), called the capillary pad, thus avoiding contamination of the reaction zone (12) by absorbents taken from the absorbent material (15).
  • nucleic acid sequence of interest means a nucleic acid sequence present in the genome of a pathogen (virus, bacteria, microorganism, etc.) and the detection of which in a biological sample allows the diagnosis of 'a pathology. It can therefore be, for example, a DNA sequence contained in the genomic plasmid of a bacterium (eg Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Escherichia, Streptococcus, Helicobacter, etc.) or an RNA sequence contained in the transcriptome of said bacterium.
  • a pathogen virus, bacteria, microorganism, etc.
  • RNA sequence contained in the transcriptome of said bacterium eg Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Escherichia, Streptococcus, Helicobacter, etc.
  • the invention can also be a DNA and / or RNA sequence contained in the genome of a virus (eg SARS-CoV-2, Dengue virus, human immunodeficiency virus [HIV], etc.).
  • a virus eg SARS-CoV-2, Dengue virus, human immunodeficiency virus [HIV], etc.
  • the invention being a diagnostic device, it makes it possible to test a biological sample to find out whether it presents, for example, an infection (viral, bacterial or to another microorganism, etc.), hence the expression "Likely to be present in the aforesaid biological sample".
  • the diagnostic device of the invention makes it possible to test a patient, or even the population, to find out whether he has (or not) an infection (ie viral infection SARS-CoV-2) and take the appropriate measures (medical treatment, confinement, etc.).
  • the term “nucleic acid sequence of interest” also means a nucleic acid sequence present in the genome (DNA) or the transcriptome (RNA) of a mammal (eg humans) whose presence is linked. with a predisposition to a pathology or to the diagnosis of a pathology.
  • the diagnostic device of the invention as described therefore offers the advantage of being versatile and of easily adapting to the desired diagnosis and / or to the health context.
  • the term “detection unit” is understood to mean the minimum set which makes it possible to carry out the diagnosis of a biological sample to be tested. As indicated, this is provided with:
  • a biologically compatible membrane which receives the biological sample to be tested, and which makes it possible to extract the nucleic acids (DNA and / or RNA) from the sample to be tested and to retain them by affinity in the presence appropriate reagents when in line with the absorbent material;
  • a reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b) capable of allowing, after elution of the nucleic acids (DNA and / or RNA) from the aforesaid membrane (8), the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in the biological sample in the presence of appropriate reagents;
  • ⁇ optionally a recess (6) equipped with a sealed material (10) on the lower disc (5) below the reaction zone (12) and in particular allowing light to reach the at least one of preferably at least two pellets (13a and 13b).
  • window is meant an opening cut in the material of the upper disc (3).
  • the window or windows are provided with an optical filter (11).
  • This optical filter can be positioned in a removable manner (eg adhesive film, valve, flap, etc.) or be integrated into the mass of the upper disc (3), or even placed on an external device.
  • optical filter is understood to mean a device which allows all or part of the light radiation to pass and which makes it possible to analyze the light beam at the exit of the test.
  • optical filter denotes materials having specific optical properties (eg band-pass, band-stop, high-pass, low-pass), colored filters (eg photographic gelatins, etc.), devices such as as optical cubes allowing the reading of a fluorescent signal.
  • optical filter may be a filter helping to read the test.
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above in which the optical filter is chosen from: a band pass filter, a notch filter, a high pass filter, a pass filter -bas, photographic gelatin and an optical cube.
  • the recess or recesses are provided with a waterproof material (10).
  • This waterproof material can be positioned in a removable manner (e.g. adhesive film, valve, flap, etc.) or be integrated into the mass of the lower disc (5), or even placed on an external device.
  • waterproof material is meant any type of plastic or other material, waterproof and compatible with the amplification reactions. It can be transparent and allow light to pass through a transmission fluorescence reading. This can also be opaque in the context of a colorimetric reading or a fluorescence reading by reflection. The invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above in which the waterproof material is chosen from: a band-pass filter, a notch filter, a high-pass filter, a low-pass filter , photographic gelatin and an optical cube.
  • absorbent material also called capillary pad or absorbent sponge
  • a material which, at the time of extraction of the nucleic acids contained in the sample to be tested at the level of the membrane (8) in the presence of the reagents [also called appropriate buffers], is capable of absorbing, containing and storing fluids which pass through the membrane (8).
  • the latter capable of containing a volume of at least 1 mL (1 cm 3 ), can also be placed on a receptacle provided to receive it.
  • This absorbent material may in particular be an absorbent pad made of cellulose, fiberglass or cotton wad, any other absorbent material, or even it may for example be an absorbent pad which can be used for a conventional immunochromatographic test.
  • the invention therefore relates to the device diagnostic (1) as described above in which the absorbent material (15) is arranged in a receptacle which is positioned either on the upper surface of the lower disc, or integrated into the mass of the latter.
  • the invention also relates to the diagnostic device (1) as described above in which the absorbent material (15) is able to contain a volume of at least 1 ml_ (1 cm 3 ).
  • “at least 1 mL” means a volume comprised from 1 mL to 2 mL or comprised from 1 mL to 1.50 mL.
  • At least 1 mL also means that the volume absorbable by the absorbent material (15) is 1 mL; 1.10 mL; 1.15 mL; 1.20 mL; 1.25 mL; 1.30 mL; 1.35 mL; 1. 40 mL; 1.45 mL; 1.50 mL; 1.55 mL; 1.60 mL; 1.65 mL; 1.70 mL; 1.75 mL; 1.80 mL; 1.85 mL; 1.90 mL; 1.95 mL or 2.00 mL.
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above in which the absorbent material (15) is arranged in a receptacle which is positioned either on the upper surface of the lower disc or integrated into the mass. thereof, and said absorbent material (15) is preferably capable of containing a volume of at least 1 mL.
  • the invention also relates to the diagnostic device (1) as described above in which the absorbent material (15) is chosen from: an absorbent pad made of cellulose, fiberglass or cotton wool and a absorbent pad usable for an immunochromatographic test.
  • membrane biologically compatible and capable of allowing the extraction and retention of nucleic acids ... in the presence of appropriate reagents is meant a membrane capable of receiving a biological sample to be tested, of supporting the addition of reagents (or buffers) allowing the extraction of nucleic acids (DNA and / or RNA) contained in said sample and to have physicochemical properties capable of retaining (eg by affinity) the nucleic acids extracted before their elution .
  • This membrane can in particular be made of cellulose, silica, fiberglass, or any other porous material allowing the physicochemical retention of nucleic acids.
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above in which the membrane (8) which is biologically compatible and capable of allowing the extraction and retention of nucleic acids is in a material chosen from: cellulose, silica and glass fiber.
  • biologically compatible pellets capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest ... in the presence of appropriate reagents
  • pellets made from a material capable of collecting the nucleic acids (DNA and / or RNA) extracted from the biological sample to be tested after their elution from the membrane (8). This material, permeable to light, also makes it possible, in the presence of the appropriate reagents (eg.
  • Primers fluorophores, enzymes, dNTPs [any deoxyribonucleoside triphosphate], etc.), to support and ensure amplification and then visual detection ( fluorescence, colorimetry, etc.) of at least one nucleic acid sequence likely to be present in the biological sample to be tested.
  • These pellets can in particular be made of glass fiber (whether or not containing an adjuvant binder), of cellulose, or of any other porous material that is biocompatible or made biocompatible by a prior treatment. It should also be noted that these pellets are adjacent, ie side by side, while being independent, ie that they do not touch each other thus avoiding contamination between adjacent pellets.
  • these pellets per detection unit are at least one in number, preferably at least two in number, that is to say that a detection unit can comprise, one, two, three, four, five or six lozenges.
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above in which the at least two biologically compatible amplification pellets (13a, 13b) are in a material chosen from: fiberglass (whether or not containing an adjuvant binder) and cellulose.
  • these appropriate reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence (DNA and / or RNA) can be lyophilized in situ at the surface (or in) the at least one, preferably at least two. biologically compatible pellets (13a and 13b) from the reaction zone (12). Lyophilization being one of the best means of maintaining the integrity of these reagents over the long term, it is possible, after having manufactured the diagnostic device (1) of the invention, to lyophilize these reagents therein. The diagnostic device (1) of the invention can then be prepared in advance on a large scale, stored for the long term and be deployed rapidly in the event of a health crisis. It can also be used immediately after the lyophilization step described above.
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) such as described above in which at least one reaction zone (12) comprises at least one, preferably at least two biologically compatible, adjacent and independent amplification pellets (13a, 13b), at least one containing lyophilized reagents capable of allow the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in the aforesaid biological sample.
  • at least one reaction zone (12) comprises at least one, preferably at least two biologically compatible, adjacent and independent amplification pellets (13a, 13b), at least one containing lyophilized reagents capable of allow the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in the aforesaid biological sample.
  • the invention also relates to the portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical housing as described above comprising two superimposed coaxial discs (3, 5) mounted to rotate with respect to each other and defining a closed volume, namely:
  • a biological sample to be tested which is provided with a membrane (8) which is biologically compatible and capable of allowing the extraction and retention of nucleic acids from this biological sample in the presence of reagents appropriate, and
  • At least one window (9) which is either equipped with an optical filter (11) integrated in the mass of the upper disc, or capable of receiving an optical filter (11) which can be positioned on said window in a removable manner, this receiving opening ( 7) and this window (9) being angularly separated by an angle in the center of at least 30 °,
  • reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two biologically compatible, adjacent and independent amplification pellets (13a, 13b), at least one containing lyophilized reagents capable of allowing amplification and the detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the aforesaid biological sample, and
  • At least one recess (6) which is either equipped with a sealed material (10) integrated into the mass of the lower disc, or capable of receiving a sealed material (10) which can be positioned on said recess in a removable manner, and which is positioned in line with said at least one reaction zone (12) and integral with it, and in particular allowing light to reach said at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b) of said at least one reaction zone (12); the receiving opening (7), the window (9), the absorbent material (15), the reaction zone and possibly the recess (6) forming a detection unit (4) such that, by rotation, the upper disc can successively
  • the invention also relates to the portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical housing as described above comprising two superimposed coaxial discs (3, 5) mounted to rotate with respect to one another and defining a closed volume, namely:
  • a biological sample to be tested which is provided with a membrane (8) which is biologically compatible and capable of allowing the extraction and retention of nucleic acids from this biological sample in the presence of appropriate reagents, and
  • At least one window (9) which is either equipped with an optical filter (11) integrated in the mass of the upper disc, or capable of receiving an optical filter (11) which can be positioned on said window in a removable manner, this receiving opening ( 7) and this window (9) being angularly separated by an angle at the center of at least 30 °, in particular by an angle at the center of 30 ° to 320 °,
  • reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two biologically compatible, adjacent and independent amplification pellets (13a, 13b), at least one containing lyophilized reagents capable of allowing amplification and the detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the aforesaid biological sample, and
  • At least one recess (6) which is either equipped with a sealed material (10) integrated into the mass of the lower disc, or capable of receiving a sealed material (10) which can be positioned on said recess in a removable manner, and which is positioned in line with said at least one reaction zone (12) and integral with it, and in particular allowing light to reach said at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b) of said at minus one reaction zone (12); the receiving opening (7), the window (9), the absorbent material (15), the reaction zone and possibly the recess (6) forming a detection unit (4) such that, by rotation, the upper disc can successively
  • this embodiment can include:
  • reaction zone (12) comprises three pellets, two serving as test pellet and the last serving as negative control pellet or positive control pellet.
  • test pellet is meant a biologically compatible pellet on which is lyophilized in situ all the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the test pellet.
  • biological sample to be tested biological sample to be tested.
  • the sample contains said at least one nucleic acid sequence of interest and the diagnosis is positive (subject to the results obtained on the control tablets).
  • the patient has a SARS-CoV-2 infection and the appropriate measures (medical treatment, confinement, etc.) can be taken.
  • each test tablet can:
  • ⁇ be prepared so as to allow the amplification and detection of different nucleic acid sequences of interest from the same target (eg. 2 test pellets targeting 2 different regions of the same pathogen);
  • targets eg 2 test pellets each targeting a specific region of two pathogens different from each other.
  • negative control pellet is meant a biologically compatible pellet on which none of the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to be tested. is not lyophilized. It is also meant a biologically compatible pellet on which one of the elements essential for the amplification or the detection of at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in the biological sample to be tested is not lyophilized. . In this way, this pellet at the end of the test cannot positively reveal the presence of at least one nucleic acid sequence of interest. If this happens, the test is invalidated and must be redone.
  • positive control pellet is meant a biologically compatible pellet on which is lyophilized in situ:
  • this pellet at the end of the test must positively reveal the presence of a nucleic acid sequence. If this does not happen, the test is invalidated and must be redone.
  • the nucleic acid sequence revealed by means of the positive control pellet and the lyophilized reagents in situ can be dissociated (different) from said at least one nucleic acid sequence of interest capable of being be present in the biological sample to be tested.
  • positive control pellet is also meant and alternatively a biologically compatible pellet on which is lyophilized in situ all the reagents allowing the amplification and detection of at least one other nucleic acid sequence of interest. which we know is necessarily present in the biological sample to be tested.
  • this pellet at the end of the test must positively reveal the presence of said other nucleic acid sequence of interest. If this does not happen, the test is invalidated and must be redone.
  • the biological sample to be tested corresponds to saliva of human origin
  • on the positive control pellet can be lyophilized in situ all the reagents allowing the amplification and detection of at least one fragment of the gene encoding the major human histocompatibility complex, ie a fragment of the HLA gene.
  • the biological sample to be tested is of human origin
  • at least one other nucleic acid sequence of interest which is known to be necessarily present in the biological sample to be tested is meant, for example, a fragment of a human ubiquitous household gene (ie transcribed and present in large quantities in all cells) and exhibiting little interindividual variability.
  • a human ubiquitous household gene ie transcribed and present in large quantities in all cells
  • Common examples of such household genes are: human ⁇ -actin, human Rnase-P, human ribosomal RNA (eg 18S).
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above in which the reaction zone (12) comprises:
  • test pellet 13a or 13b on which is lyophilized in situ all the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to test ;
  • a negative control pellet (13b or 13a) on which: o none of the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to be tested n 'is lyophilized; Where one of the elements essential to the amplification or detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to be tested is not lyophilized.
  • the invention also relates to the diagnostic device (1) as described above in which the reaction zone (12) comprises:
  • test pellet 13a or 13b on which is lyophilized in situ all the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to test ;
  • a positive control pellet (13b or 13a) on which is lyophilized in situ: o all the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to be tested or of another nucleic acid sequence; and o said at least one nucleic acid sequence of interest or said other nucleic acid sequence.
  • the invention also relates to the diagnostic device (1) as described above in which the reaction zone (12) comprises:
  • test pellet 13a or 13b on which is lyophilized in situ all the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to test ;
  • a positive control pellet (13b or 13a) on which is lyophilized in situ all the reagents allowing the amplification and detection of at least one other nucleic acid sequence of interest necessarily present in the biological sample to test.
  • the invention also relates to the diagnostic device (1) as described above in which the reaction zone (12) comprises: ⁇ a test pellet on which is lyophilized in situ all the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to be tested;
  • a negative control pellet (13a or 13b) on which: o none of the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to be tested n 'is lyophilized, or o one of the elements essential to the amplification or detection of at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in the biological sample to be tested is not lyophilized; and
  • a positive control pellet (13b or 13a) on which is lyophilized in situ: o all the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to be tested or of another nucleic acid sequence; and o said at least one nucleic acid sequence of interest or said other nucleic acid sequence.
  • the invention also relates to the diagnostic device (1) as described above in which the reaction zone (12) comprises:
  • test pellet on which is lyophilized in situ all the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to be tested;
  • ⁇ a negative control pellet (13a or 13b) on which: o none of the reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the biological sample to be tested n 'is lyophilized, or o one of the elements essential to the amplification or detection of at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in the biological sample to be tested is not lyophilized; and ⁇ a positive control pellet (13b or 13a) on which is lyophilized in situ all the reagents allowing the amplification and detection of at least one other nucleic acid sequence of interest necessarily present in the biological sample to test.
  • this embodiment comprising three pellets can be described as being the diagnostic device (1) as described above in which at least one, preferably at least two biologically compatible amplification pellets (13a, 13b) contain biologically compatible amplification pellets (13a, 13b).
  • lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the aforesaid biological sample, and at least one of which also contains a nucleic acid of interest lyophilized capable of being amplified by the aforesaid lyophilized reagents.
  • this embodiment comprising three pellets can also be described as being the diagnostic device (1) as described above in which said at least one reaction zone (12) comprises at least two pellets.
  • said at least one reaction zone (12) comprises at least two pellets.
  • (13a, 13b) biologically compatible, adjacent and independent amplification the first (13a or 13b) containing lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest capable of '' be present in the aforesaid biological sample and the second (13b or 13a) containing lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one other nucleic acid sequence of interest necessarily present in the biological sample to test.
  • the term “lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the aforesaid biological sample” is understood to mean molecular tools (primers optionally modified at the 5 'and / or 3' ends) capable of hybridizing to a nucleic acid sequence of interest (DNA and / or RNA), of amplifying the latter (enzymes, dNTPs) and of visually (fluorescence, colorimetry, etc.) reveal its presence.
  • molecular tools making it possible to implement technologies for the amplification of isothermal nucleic acids (DNA and / or RNA) (eg.
  • RNA RNA into DNA by means of specific enzymes (ie viral retro-transcriptases, etc. .), which step is also carried out at the level of the pellets (13a and 13b) and the molecular tools of which can also be lyophilized.
  • amplification therefore means the step of retro-transcription of a target RNA (ie carrier of said at least one nucleic acid sequence of interest) into DNA and step d amplification of this DNA by a polymerase.
  • RNA sequence eg viral genomic RNA the presence of which it is sought to detect
  • the device include the means allowing its retro-transcription and its amplification, then its detection (eg RT-LAMP, RT-LAMP-QUASR, etc.).
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above comprising at least one reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two pellets (13a, 13b) d 'biologically compatible, adjacent and independent amplification, at least one containing lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest liable to be present in the aforesaid biological sample , said lyophilized reagents being at least:
  • ⁇ a set of at least six primers comprising primer F3, B3 primer, the FIP primer, the BIP primer, and the primer LoopF primer LOOPB;
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above comprising at least one reaction zone (12) comprising at least one preferably at least two biologically compatible, adjacent and independent amplification pellets (13a, 13b), at least one containing lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one sequence of 'nucleic acids of interest likely to be present in the aforesaid biological sample, said lyophilized reagents being at least:
  • ⁇ a set of at least six primers comprising primer F3, B3 primer, the FIP primer, the BIP primer, and the primer LoopF primer LOOPB;
  • the invention also relates to the diagnostic device (1) as described above comprising at least one reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two pellets (13a, 13b) d 'biologically compatible, adjacent and independent amplification, at least one containing lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest liable to be present in the aforesaid biological sample , said lyophilized reagents being at least:
  • a set of at least six primers comprising the F3 primer, the B3 primer, the FIP primer, the BIP primer, the LoopF primer and the LoopB primer, at least one of which is at the except for primer F3 and primer B3, is modified in 5 'by the addition of a fluorophore;
  • oligonucleotide ⁇ at least one complementary to the FIP primer oligonucleotide, the BIP primer, the primer or primer LoopF LOOPB, said oligonucleotide being capable to be coupled reversibly to the primer which is complementary and said oligonucleotide being modified in 3 'by a quencher.
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above comprising at least one reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two pellets (13a, 13b) of biologically compatible, adjacent and independent amplification, at least one containing lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the aforesaid biological sample, said lyophilized reagents being at least:
  • a set of at least six primers comprising the F3 primer, the B3 primer, the FIP primer, the BIP primer, the LoopF primer and the LoopB primer, including the FIP, BIP, LoopF and LoopB primers are modified in 5 'by the addition of a fluorophore;
  • oligonucleotides complementary to the primers FIP, BIP, LoopF and LoopB, said oligonucleotides being capable of reversibly coupling to the primers of which they are the complementary and said oligonucleotides being modified in 3 ′ by a quencher.
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above comprising at least one reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two pellets (13a, 13b) of biologically compatible, adjacent and independent amplification, at least one containing lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the aforesaid biological sample, said lyophilized reagents being at least:
  • ⁇ a set of at least six primers comprising primer F3, B3 primer, FIP primer BIP primer, and the primer LoopF primer LOOPB, at least one of which, with the exception of primer F3 and primer B3, is modified in 5 'by the addition of a fluorophore;
  • oligonucleotide ⁇ at least one complementary to the FIP primer oligonucleotide, the BIP primer, the primer or primer LoopF LOOPB, said oligonucleotide being capable to be coupled reversibly to the primer which is complementary and said oligonucleotide being modified in 3 'by a quencher.
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above comprising at least one reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two pellets (13a, 13b) of biologically compatible, adjacent and independent amplification, at least one containing lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the aforesaid biological sample, said lyophilized reagents being at least:
  • a set of at least six primers comprising the F3 primer, the B3 primer, the FIP primer, the BIP primer, the LoopF primer and the LoopB primer, including the FIP, BIP, LoopF and LoopB primers are modified in 5 'by the addition of a fluorophore;
  • oligonucleotides complementary to the primers FIP, BIP, LoopF and LoopB, said oligonucleotides being capable of reversibly coupling to the primers of which they are the complementary and said oligonucleotides being modified in 3 ′ by a quencher.
  • MgSC lyophilized reagents
  • Betaine reagent for lyophilized reagent for lyophilized reagents
  • Trehalose can be added and lyophilized.
  • retro-transcriptase also called reverse transcriptase
  • reverse transcriptase an enzyme capable of converting RNA into DNA.
  • This can be the AMV retrotranscriptase or any other reverse transcriptase purified from a retrovirus or retrotransposon, or any other reverse transcriptase which has undergone type-directed evolution or other type of optimization to improve its performance.
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above in which said retrotranscriptase is AMV retrotranscriptase.
  • polymerase is meant an enzyme capable of replicating DNA into DNA.
  • This can be the Bst polymerase enzyme, the GspSSD polymerase enzyme or any other polymerase enzyme used in nucleic acid amplification (such as PCR or isothermal amplification).
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above in which said polymerase is chosen from: Bst polymerase enzyme and GspSSD polymerase enzyme.
  • dNTPs is meant the mixture of the four deoxyribonucleotides: dATP (deoxy adenine tri-phosphate), dCTP (deoxy cytosine tri-phosphate), dGTP (deoxy guanine tri-phosphate) and dTTP (deoxy thymine tri-phosphate).
  • a set of at least six primers nucleic acid sequences allowing the isothermal amplification of at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in the biological sample to be tested. .
  • at least one ... is modified in 5 'by the addition of a fluorophore
  • one, two, three or four primers are modified in 5' by the addition a fluorophore with the exception of the primers F3 and B3 which are never modified.
  • These primers modified in 5 'by the addition of a fluorophore can also be called probes since they allow detection of the signal.
  • the invention employs four, modified in 5 ′, namely: FIP primer, BIP primer, LoopF primer and LoopB primer.
  • these at least six primers can be:
  • oligonucleotide is meant a sequence of about ten nucleotides. For example an oligonucleotide of 5 to 20 nucleotides, that is to say of 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 nucleotides .
  • complementary oligonucleotide is meant an oligonucleotide which can bind specifically to a sequence of nucleic acids. In this case, they are oligonucleotides complementary to the primers FIP, BIP, LoopF and LoopB, of which at least one, or two, or three and preferably all four are modified to 3 ′ by a quencher.
  • the latter is a quencher capable of quenching the 5 'grafted fluorophore of one or more FIB, BIP, LoopF and / or LoopB primers.
  • this at least one and preferably four oligonucleotides are chosen from the sequences SEQ ID NOs: 13 to 17 including:
  • sequence SEQ ID NO: 13 is complementary to the primer sequence BIP SEQ ID NO: 4 used in the diagnosis of infection with Dengue virus serotype 2;
  • sequences SEQ ID NOs: 14 to 17 are respectively complementary to the sequences SEQ ID NOs: 9 to 12 used in the diagnosis of an infection with the SARS-CoV-2 virus.
  • intercalating agent is meant a molecule capable of reversibly intercalating into DNA and of becoming fluorescent when in the double helix.
  • This can be SYBRGreen, a SYTO-type fluorophore (SYT09, SYT082, etc.), EvaGreen, ethidium bromide or any other DNA intercalating agent used in monitoring the amplification of nucleic acid in real time.
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above in which said intercalating agent is chosen from: SYBRGreen, a fluorophore of SYTO type (SYT09, SYT082, etc.), EvaGreen and ethidium bromide.
  • fluorophore also called fluorochrome
  • fluorophore is meant a chemical or protein substance capable of emitting fluorescence light after excitation.
  • the invention relates to the diagnostic device (1) such as described above in which said fluorophore is chosen from: fluorophores of Alexa Fluor type (Alexa 350, Alexa 488, alexa 555, Alexa 647, etc.), fluorophores of Cyanine type (CY3, CY3.5, CY5, etc. .), FAM (fluorescein amidite) fluorophores, fluorescein nsothiocyanate (FITC), FIEX type fluorophores, Texas Red fluorophores and ATTO type fluorophores.
  • fluorophores of Alexa Fluor type (Alexa 350, Alexa 488, alexa 555, Alexa 647, etc.
  • fluorophores of Cyanine type CY3, CY3.5, CY5, etc. .
  • FAM fluorescein amidite fluorophores
  • quencher also called a quencher
  • a quencher is meant a chemical or protein substance capable of deactivating (quenching) the excited state of a fluorophores.
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above in which said quencher is chosen from: DabCyl, BHQ-1, BFIQ-2, BFIQ-3, Cy5Q, Cy7Q, Iowa Black FQ, Iowa Black RQ, IRDye QC-1, QSY35, QSY7, QXL520, QXL570, QXL610 and QXL680.
  • the lowa Black FQ and lowa Black RQ quenches are used.
  • the diagnostic device (1) of the invention comprises a single detection unit (4) and makes it possible to test only 'a single biological sample.
  • it can be configured to accommodate different detection units distributed over all of the upper (3) and lower (5) disks. This configuration thus offers the user a very practical multisample device due to its versatility since, depending on its configuration, it can be used:
  • ⁇ either from a sample, to perform various diagnostics (eg. Zika virus, SARS-CoV-2, HIV, Salmonella, etc.);
  • ⁇ either from several samples, to perform a single type of diagnosis (eg Zika virus or SARS-CoV-2 or HIV or Salmonella, etc.);
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above comprising at least two detection units which are distributed over the upper (3) and lower (5) disks so that their respective receiving openings are located on the same radius of the upper disc.
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above comprising at least two detection units which are distributed over the upper (3) and lower (5) disks so that their respective receiving openings are located on the same arc of the upper disc.
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above comprising:
  • ⁇ at least two sensor units which are distributed on the upper discs (3) and lower (5) so that their respective receiving apertures are located on a same arc of circle of the upper disc.
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above comprising:
  • the invention therefore relates to the diagnostic device (1) as described above in which:
  • the windows (9) arranged on the same shelf of the upper disc (3) are grouped together and form only one, and / or
  • any recesses (6) arranged on the same radius of the lower disc (5) are grouped together and form only one.
  • the invention can be defined as a portable diagnostic device (1) in the form of a closed, flat cylindrical box comprising:
  • each diagnostic block comprising y detection units (4) of samples to be tested, each detection unit comprising:
  • a receptacle comprising an absorbent material (15) disposed either on the upper surface of the lower disc (5), or integrated into the mass of said upper surface of the lower disc (5), and said absorbent material (15) being capable of containing a volume of at least 1 ml;
  • reaction zone (12) arranged in the lower disc, said reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two biologically compatible, adjacent and independent pellets (13a and 13b) on the same circle of the lower disc (5) or the same radius of the lower disc (5), and at least one of which optionally comprises, on its surface, lyophilized reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in a sample to be tested;
  • a recess (6) arranged in the lower disc (5), said recess (6) being provided with a waterproof material (10), said recess (6) provided with a waterproof material (10) being in line with the reaction zone (12) and integral with it, and in particular allowing light to reach said at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b), and said impervious material (10) being either positioned on the recess (6) in a removable manner, or integrated into the mass of the lower disc (5);
  • the various elements of the lower disc (5) and of the upper disc (3) detection units (4) are respectively adjacent and independent along a respective radius of the lower disk (5) and the upper disk (3), and each diagnostic block (2) being configured so that the upper disc (3) may, by rotation through an angle of at least 30 °, pass:
  • the receiving opening (7) equipped with a membrane (8) biologically compatible with a detection unit (4) is located in line with the absorbent material (15) of said detection unit (4) to allow extraction and retaining nucleic acids from said test sample;
  • the window (9) provided with an optical filter (11) of said detection unit (4) is located in line with the reaction zone (12) of said detection unit (4),
  • the receiving opening (7) equipped with a membrane (8) biologically compatible with said detection unit (4) is located in line with the reaction zone (12) of said detection unit (4) and partially covers it or in full to allow the elution of the nucleic acids from said sample to be tested in the presence of the appropriate reagents, said nucleic acids by gravity being found on said at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b) of said unit of detection (4); and
  • the window (9) provided with an optical filter (11) of said detection unit (4) is offset by an angle of at least 30 °
  • the passage from the aforesaid second position to the aforesaid first position can therefore be done either by a rotation opposite to that allowing the passage from the aforesaid first position to the aforesaid second position, or by a rotation in the same direction that this one.
  • the invention relates to the portable diagnostic device (1) in the form of a flat closed cylindrical box as described above comprising:
  • each diagnostic block comprising y detection units (4) of samples to be tested, each detection unit comprising:
  • a receptacle comprising an absorbent material (15) disposed either on the upper surface of the lower disc (5), or integrated into the mass of said upper surface of the lower disc (5), and said absorbent material (15) being capable of containing a volume of at least 1 ml;
  • reaction zone (12) arranged in the lower disc, said reaction zone (12) comprising at least one, preferably at least two biologically compatible, adjacent and independent pellets (13a and 13b) on the same circle of the lower disc (5) or the same radius of the lower disc (5), and at least one of which optionally comprises, on its surface, lyophilized reagents allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest capable of being present in a sample to be tested; - optionally a recess (6) arranged in the lower disc (5), said recess (6) being provided with a waterproof material (10), said recess (6) provided with a waterproof material (10) being in line with the reaction zone (12) and integral with it, and in particular allowing light to reach said at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b), and said impervious material (10) being either positioned on the recess (6) in a removable manner, or integrated into the mass of the lower disc (5);
  • the various elements of the lower disk (5) and of the upper disk (3) of the detection units (4) are respectively adjacent and independent along a respective radius of the lower disc (5) and the upper disc (3), and each diagnostic block (2) being configured so that the upper disc (3) can, by rotation through an angle of at least 30 °, pass:
  • the receiving opening (7) equipped with a membrane (8) biologically compatible with a detection unit (4) is located in line with the absorbent material (15) of said detection unit (4) to allow extraction and retaining nucleic acids from said test sample;
  • the window (9) provided with an optical filter (11) of said detection unit (4) is located in line with the reaction zone (12) of said detection unit (4),
  • the receiving opening (7) equipped with a membrane (8) biologically compatible with said detection unit (4) is located in line with the reaction zone (12) of said detection unit (4) and partially covers it or in full to allow the elution of the nucleic acids from said sample to be tested in the presence of the appropriate reagents, said nucleic acids by gravity being found on said at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b) of said unit of detection (4); and
  • the window (9) provided with an optical filter (11) of said detection unit (4) is offset by an angle of at least 30 °
  • each diagnostic block (2) also being configured so that the one or more windows (9a and 9b) fitted with an optical filter (11) of one or more detection units (4) of a diagnostic unit (2) cannot be in line with the receptacle (s) comprising an absorbent material ( 15) of said diagnostic unit (2) or of another diagnostic unit (2 ') whatever the position of the upper disc (3) with respect to the lower disc (5).
  • x being an integer greater than or equal to 1
  • x can be equal to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • x can be ranging from 1 to 10, from 1 to 5, from 2 to 10, from 4 to 8.
  • y being an integer greater than or equal to 1
  • y can be equal to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20.
  • y can be included from 1 to 20, from 1 to 6, from 1 to 12, from 1 to 5, from 1 to 10, from 5 to 15 or from 10 to 20.
  • an angle of at least 30 ° is meant that the rotation of the upper disc (3) on the lower disc (5) can be 30 °, 35 °, 40 °, 45 °, 50 °, 55 ° , 60 °, 65 °, 70 °, 75 °, 80 °, 85 °, 90 °, 95 °, 100 °, 105 °, 110 °, 115 °, 120 °, 125 °, 130 °, 135 °, 140 °, 145 °, 150 °, 155 °, 160 °, 165 °, 170 °, 175 °, 180 °, 185 °, 195 °, 200 °, 205 °, 210 °, 215 °, 220 °, 225 °, 230 °, 235 °, 240 °, 245 °, 250 °, 255 °, 260 °, 265 °, 270 °, 275 °, 280 °, 95
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above in which x and y are chosen from the pairs:
  • ⁇ x 1 and y is from 1 to 6;
  • each of the x diagnostic blocks (2) comprises y detection units (4) including all of the y windows (9 ) provided with an optical filter (11) arranged on the upper disc (3) in a single form.
  • each of the x diagnostic blocks (2) comprises y detection units (4) including all of the possible y recesses ( 6) provided with a waterproof material (10) arranged on the lower disc (5) in one form.
  • each of the x diagnostic blocks (2) comprises y detection units (4) including all of the y windows (9 ) provided with an optical filter (11) arranged on the upper disc (3) in a single form and of which all the possible y obviously (6) provided with a waterproof material (10) arranged on the disc lower (5) is only one.
  • the invention relates to the diagnostic device (1) as described above further comprising means, in particular:
  • ⁇ at least one gripper capable of grasping said device and applying pressure for locking and tightening the upper disc on the lower disc, said pressure ensuring the tightness and sealing the device and equipped with a heating system suitable for being positioned in line with the reaction zone (s) of the device avoiding the creation of a temperature gradient on the reaction zone (s) to be heated.
  • a second aspect of the invention relates to the use of the portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical box as described above for detecting in vitro at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present. in a biological sample to be tested.
  • This at least one nucleic acid sequence (DNA and / or RNA) of interest which can be: ⁇ a nucleic acid sequence present in the genome of a pathogen (virus, bacteria, microorganism, etc.), or
  • ⁇ a nucleic acid sequence present in the genome (DNA) or the transcriptome (RNA) of a mammal (eg. Humans), the presence of which is linked to a predisposition to a pathology, the use according to the The invention allows the diagnosis of infections due to one or more pathogens and also the diagnosis of genetic diseases.
  • This utility and this versatility of the diagnostic device (1) of the invention are of course conditioned by the reagents (molecular tools) optionally lyophilized at the surface of one or more so-called “test” pellets.
  • the set of primers allowing the detection of at least one nucleic acid sequence of the SARS-CoV-2 coronavirus
  • the use described makes it possible to diagnose an infection. to this virus.
  • the set of primers allowing the detection of at least one nucleic acid sequence of the Dengue virus of serotype 1
  • the use described makes it possible to diagnose a infection with this virus. Etc.
  • the multisample configuration makes it possible to diagnose for one or more biological samples to be tested for several types of infections.
  • a diagnostic block would be used to test in vitro a first biological sample and detect in vitro whether it is suffering from an influenza virus infection, COVID-19 (SARS-CoV-2) and / or the bacteria Staphylococcus aureus
  • the second diagnostic block would be used to test in vitro a second biological sample and detect in vitro if it suffers from infection with the virus of influenza, the COVID-19 virus (SARS-CoV-2) and / or the bacteria Staphylococcus aureus.
  • This example can be generalized to x diagnostic block for x biological samples, each of the x blocks comprising y detection units making it possible to test in vitro the presence (or not) of y viral, bacterial or infections linked to other microorganisms ( eg mushroom).
  • the diagnostic device (1) of the invention can be used to test genetic diseases in vitro.
  • the invention therefore relates to the use such as described above to detect in vitro a viral infection (eg. HIV, Dengue virus, Zika virus, Sigma 3 virus, SARS-CoV-2, etc.), bacterial infection (eg Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Escherichia , Streptococcus, Helicobacter, etc.), an infection linked to a microorganism (eg fungus) and / or a genetic disease (eg cystic fibrosis, type 1 neurofibromatosis, hemophilia, trisomy 21, myopathy, etc.).
  • a viral infection eg. HIV, Dengue virus, Zika virus, Sigma 3 virus, SARS-CoV-2, etc.
  • bacterial infection eg Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Escherichia , Streptococcus, Helicobacter, etc.
  • an infection linked to a microorganism eg fungus
  • the invention also relates to the use as described above for detecting in vitro a viral infection and in particular for detecting in vitro a viral infection with SARS-CoV-2.
  • the invention relates to the use as described above for detecting in vitro a viral infection with SARS-Cov-2.
  • this embodiment of the invention is conditioned by the use, for example, of primers of sequences SEQ ID NO: 7 to 12 on the test pellet present on the reaction zone (12).
  • Another aspect of the invention relates to the method for the in vitro detection of at least one nucleic acid sequence of interest capable of being present in a biological sample to be tested, said method being implemented using the portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical housing as described above.
  • the invention relates to the method for the in vitro detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in a biological sample to be tested, said method being implemented using the device.
  • portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical case as described above and said method comprising at least the following steps: a. extracting nucleic acids from the biological sample to be tested on a biologically compatible membrane (8) of a detection unit (4); b. turn the upper disc (3) to position said biologically compatible membrane (8) in line with the reaction zone (12) of this detection unit and cover it in part or in whole; vs.
  • the aforementioned step d. can be done either by a reverse rotation of that of step b., or by a rotation in the same direction as that of step b.
  • the invention relates to the method for the in vitro detection of at least one nucleic acid sequence of interest capable of being present in a biological sample to be tested, said method being implemented using the device for testing.
  • portable diagnostic (1) in the form of a cylindrical case as described above and said method comprising at least the following steps: a. extracting nucleic acids from the biological sample to be tested on a biologically compatible membrane (8) of a detection unit (4); b.
  • the invention relates to the method as described above, said method comprising at least the following steps: To. depositing the biological sample to be tested on a biologically compatible membrane (8) of a detection unit (4); b. extracting the nucleic acids from the biological sample to be tested at this biologically compatible membrane (8); vs. washing said biologically compatible membrane (8) from this detection unit (4); b. turn the upper disc (3) to position said biologically compatible membrane (8) in line with the reaction zone (12) of this detection unit and cover it in part or in whole; vs. drying said biologically compatible membrane (8) of this detection unit (4) d.
  • step b. eluting the nucleic acids to pass them from said biologically compatible membrane (8) to at least one, preferably at least two biologically compatible pellets (13a, 13b) of this detection unit (4); e. turn the upper disc (3) in the same direction as in step b. or in the reverse order of step b. to return to the initial position; f. heating at 65 ° C for 40 min the reaction zone (12) to amplify said at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in the biological sample; and g. detecting whether an amplification of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in a biological sample has taken place.
  • the observation of a positive signal eg. Emission of light by fluorescence, appearance of a coloration
  • the observation of this positive signal means that the patient is infected with the SARS-CoV-2 coronavirus and suffers from COVID- 19.
  • a positive control and / or a positive control which can be performed outside the diagnostic device (1) of the invention.
  • these controls are integrated into the diagnostic device (1) of the invention via the positive control pellet which must always reveal a positive signal and / or via the negative control pellet which must always reveal a negative signal (ie absence of fluorescence , no color).
  • Another aspect of the invention relates to the manufacturing process (e.g. industrial) of the portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical housing as described above.
  • the invention relates to the method of manufacturing the portable diagnostic device (1) in the form of a cylindrical housing as described above, said method comprising at least the following steps: a. manufacture (e.g. 3D printing or injection into a mold) the upper (3) and lower (5) discs; b. disposing at least one biologically compatible membrane (8), at least one preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b), at least one absorbent material (15) and at least one optical filter (11); and c. assemble the upper (3) and lower (5) discs.
  • the invention relates to the manufacturing method as described above, said method comprising at least the following steps: a. manufacture (eg 3D printing or injection into a mold) the upper (3) and lower (5) discs; b. have at least one biologically compatible membrane (8), at least one preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b), at least one absorbent material (15), at least one optical filter (11) and optionally at least one waterproof material (10); and c. assemble the upper (3) and lower (5) discs.
  • manufacture eg 3D printing or injection into a mold
  • b. have at least one biologically compatible membrane (8), at least one preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b), at least one absorbent material (15), at least one optical filter (11) and optionally at least one waterproof material (10); and c. assemble the upper (3) and lower (5) discs.
  • the invention relates to the manufacturing method as described above, said method comprising at least the following steps: a. manufacture (e.g. 3D printing) the upper (3) and lower (5) discs; b. wash the upper (3) and lower (5) discs with an RNA free solution; vs. have at least one biologically compatible membrane (8), at least one preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b), at least one absorbent material (15), at least one optical filter (11) and optionally at least one waterproof material (10); and D. assemble the upper (3) and lower (5) discs.
  • manufacture e.g. 3D printing
  • vs. have at least one biologically compatible membrane (8), at least one preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b), at least one absorbent material (15), at least one optical filter (11) and optionally at least one waterproof material (10); and D. assemble the upper (3) and lower (5) discs.
  • the invention relates to the manufacturing method as described above, said method comprising at least the following steps: a. make ⁇ e.g. 3D printing) the upper (3) and lower (5) discs; b. wash the upper (3) and lower (5) discs with an RNA free solution; vs. have at least one biologically compatible membrane (8), at least one preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b), at least one absorbent material (15), at least one optical filter (11) and optionally at least one waterproof material (10); d. assemble the upper (3) and lower (5) discs; summer. lyophilize on at least one pellet (13a or 13b) reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in the aforesaid biological sample.
  • the invention relates to the manufacturing process as described above, said process comprising at least the following steps: a. manufacture ⁇ eg 3D printing) the upper (3) and lower (5) discs; b. lyophilize on at least one pellet (13a or 13b) reagents suitable for allow the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest which may be present in the aforesaid biological sample. vs. wash the upper (3) and lower (5) discs with an RNA free solution; d. have at least one biologically compatible membrane (8), at least one preferably at least two biologically compatible pellets (13a and 13b), at least one absorbent material (15), at least one optical filter (11) and optionally at least one waterproof material (10); summer. assemble the upper (3) and lower (5) discs.
  • variants of the invention can be developed which repeat and / or integrate and / or can be combined with the aspects (definitions) described above.
  • diagnostic device One of them concerns the automatic implementation of the diagnostic device of the invention.
  • this can be implemented by using two devices, namely a first device, hereinafter referred to as “dispenser” (20), and a second device, hereinafter referred to as “detector” (21). .
  • these two devices can be used independently of one another, or in combination and will then be referred to hereafter as the "diagnostic system” (22).
  • the diagnostic device (1, 31), the dispenser (20) and the detector (21) can be used in combination or individually.
  • FIG. 12 and 13 Is shown in Figures 12 and 13 an example of a dispenser (20) according to the invention.
  • a dispenser (20) according to the invention.
  • it is in the form of a housing comprising a base (23) closed by a cover (24) articulated around a hinge.
  • the base (23) is hollowed out with a circular cavity (25) intended to receive a diagnostic device (31), the bottom of this cavity (25) being provided with means, not shown in the drawing, ensuring the immobilization in rotation of the base of the diagnostic device (31), as explained below.
  • the diagnostic device (31) which is shown in exploded view in FIG. 14, incorporates some of the essential elements of the diagnostic device (1) described above with some arrangements intended to ensure its operation within automated means. For the clarity of the description, the same references, increased by a value of 30, are retained for similar elements.
  • the diagnostic device (31) thus comprises two concentric superimposed discs, namely an upper disc (33) and a lower disc (35) which are mounted to rotate about an axis yy ’perpendicular at their center O.
  • the upper disc (33) has a sampling area formed of a cylindrical boss (50) whose base is substantially in the shape of an oval. This boss is hollowed out with a recess, the base of which is pierced with two receiving openings (52a and 52b) which are each provided with a capture membrane (38), respectively (38a and 38b), biologically compatible and capable of allowing the extraction and retention of nucleic acids from the collected biological sample in the presence of appropriate reagents. These two receiving openings (52a and 52b) are arranged slightly apart from each other on the same radius r1 of the disc (33), as shown in Figure 15.
  • a single opening (37) elongated along the radius n and closed by a biologically compatible membrane (38) could be produced, as shown in partial FIG. 16.
  • a removable funnel (49) equipped with two openings which are arranged opposite the two openings (52a and 52b).
  • This funnel can also be equipped with a single opening.
  • This funnel helps prevent contamination. Indeed, the funnel (49) serves to prevent contact of the lysis product with the sample deposition zone (the part covered by the funnel) and its use is preferred. If this is not the case in manual mode, then there is a risk that the lysis product will wet the sample deposition area. In doing so, when the rinsing product is then deposited (eg 70% ethanol), it can mix with the traces of lysis product possibly remaining on the surface of the sample deposit zone. The rinsing product then becomes polluted with lysis product.
  • the rinsing product eg 70% ethanol
  • the upper disc (33) is pierced with a radial slot (53) of axis r 3 and of width a, the function of which will be explained below, and which forms with the axis n an angle at the center a whose value is at least equal to 30 ° and preferably in the present example of the order of 60 °. It is also pierced near its periphery with a circular slot (51) extending at an angle at the center b slightly greater than the angle a and whose functionality will be explained below.
  • the lower disc (35) as shown in Figures 14 and 17, comprises a central hole (54) which is intended to receive a central stud (55) produced under the upper disc (33), which makes it possible to ensure the relative rotation of the two discs.
  • the lower disc (33) has on its upper face a stud (60) arranged such that it comes to be housed in the circular slot (51) of the upper disc (33) when the two discs are superimposed in the operating position. It is understood under these conditions that the value of the angle at the center b of the circular slot (51) makes it possible to control the minimum and maximum angle of rotation of the upper disc (33) relative to the lower disc (35).
  • the lower disc (35) is pierced with a radial slot (56) of axis r'3 and width a ⁇ slightly less than the width a of the radial slot (53) of the upper disc.
  • the sides of this slot are provided with gripping means, consisting for example of teeth (57), which are intended to ensure the maintenance of a capsule, as explained below.
  • the lower disc (35) is also crossed by a radial window (58) of axis r'2 and which forms with the axis r'3 of the slot (56) an angle at the center equal, in the present example, to a / 2.
  • the lower disc (35) is provided with a cup (59) of substantially trapezoidal shape which is intended to receive an absorbent material (45) of a certain volume, so as to allow extraction and retention of nucleic acids, and to collect the overflow of the biological sample to be tested and of the reagents for extraction of nucleic acids and washing.
  • This cup (59) is arranged such that a radial axis r'1 forming with the axis r'2 an angle at the center equal to a / 2 passes through said cup (59), as shown in FIG. 17.
  • the angle at the center b defining the dimensions of the circular slot (51) will be given a value such that, when the axis r1 of the upper disc is located to the right of the axis r'1 of the lower disc , the stud (60) is in abutment against a first end of the groove (51) thus preventing any rotation of the upper disc in the clockwise direction, as shown in FIG. 20, and that, when the axis r1 of the disc upper is to the right of the axis r'3 of the lower disc the stud (60) is in abutment against the second end of the groove (51), as shown in figure 22, thus preventing any rotation of the upper disc counterclockwise.
  • the upper disc (33) is able to occupy three remarkable positions relative to the lower disc (35), namely:
  • This capsule (62) which can be made of a material chosen from: polypropylene and in particular food grade polypropylene, and which is shown in Figures 14 and 18; has an overall elongated configuration that allows it to sit in and hold in the radial slot (56), as well as shown in Figure 19.
  • the internal part of the capsule has three hollow bosses, respectively (64a, 64b, and 64c).
  • the two outermost hollow bosses contain reactive pellets, respectively (43a and 43b), which are biologically compatible, independent, and capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest susceptible to be present in the biological sample in the presence of appropriate reagents.
  • the part (62a) of the capsule (62) capable of being inserted into the radial slot (56) is extended by a cover (62b) which is connected to it by a link (62c).
  • the internal face of this cover also comprises hollow bosses, respectively (66a, 66b and 66c), the internal diameter of which is slightly greater than the external diameter of the bosses (64a, 64b and 64c) so as to be able to fit into the latter in order to to seal them.
  • the capsule (62) could have any other shape and contain more than two reactive pellets.
  • the cover (62b) of the capsule (62) consists in particular of a transparent material, in particular a synthetic material which is tinted yellow.
  • the cavity (25) of the dispenser (20) is able to receive the diagnostic device (31) and to ensure a rotational locking of the lower disc (35).
  • the upper part of the cover (24) comprises a rotating disc (68) bearing indentations allowing it to be housed on the upper disc (33) and to come into engagement with the latter when the cover (24) is closed.
  • the rotary disk (68) is set in rotation by a motor, in particular a stepping motor, which is driven by a control logic under the control in particular of a microcontroller and which is able to put the upper disk (33) in the three remarkable positions previously mentioned, namely:
  • the base (23) comprises a power supply (70) which supplies energy to a control electronics (72), driven for example by a microcontroller, which ensures the control, via a power stage (74), of a first pump.
  • metering unit (76) in connection with an ethanol reservoir (78) so as to inject the latter by means of a nozzle (80) into the cavity (50) of the diagnostic device having received the sample.
  • the base (23) also comprises a second metering pump (82) in connection with an eluent reservoir (84) so as to inject the latter by means of two nozzles (86a and 86b) on the capture membranes (38). respectively contained in the openings (52a and 52b) of the diagnostic device (31).
  • the base (23) also comprises a motor (88), for example a stepping motor, able under the control of the control electronics, to position the upper disc in each of the three positions previously mentioned as explained previously. .
  • a motor for example a stepping motor, able under the control of the control electronics, to position the upper disc in each of the three positions previously mentioned as explained previously.
  • control electronics then manage the following phases:
  • the upper disc (33) of the diagnostic device (31) is in the aforementioned "first position” and the metering pump (76) then injects via its nozzle (80) into the cavity of the hollow boss (50) a quantity of the order of 400 ⁇ L of 70% ethanol so as to rinse this cavity; 2. the motor (88) then positions the upper disc (33) in the aforementioned "Intermediate position", so as to bring the capture membranes (38a and 38b) to the right of the radial window (58) so as to achieve a drying (axis r1 to the right of axis r'2);
  • control electronics (72) then apply a pause of the order of 3 to 15 minutes so as to ensure drying, which drying can be active / promoted by blowing means, eg, a pump blowing water. air through capture membranes (38a and 38b);
  • the motor (88) then positions the upper disc (33) in the aforesaid "second position", so as to bring the capture membranes (38a and 38b) in line with the reactive pellets (43a and 43b) (axis r1 at right of axis r'3) and the nozzles (86a and 86b) inject a volume ranging from 30 ⁇ l to 50 ⁇ l_ of a saline solution on each capture membrane (38a and 38b);
  • the present dispenser (20) is particularly interesting insofar as it allows such a treatment to be carried out automatically in a short time of the order of 3 to 15 minutes. It can therefore of course be used alone, but it can also be used in combination with a detector (21) making it possible to detect the nucleic acids contained in the biological sample collected, the combination of the dispenser ( 20) and the detector (21) making it possible to constitute two complementary devices forming a diagnostic system (22).
  • the detector (21) which, in this exemplary embodiment, is in the form of a housing comprises a body (91) and a cover (92) articulated thereon.
  • the interior of the body (91) comprises a plate (93) which comprises two rows of cells (distinct and independent) intended to receive the capsules (62).
  • the plate comprises twenty cells, but it is understood that it could include any number of them.
  • the cover (92) consists in particular of a transparent material, in particular a synthetic material which is tinted yellow.
  • the body (91) of the detector (21) comprises a power supply (94) which supplies energy to a control electronics (95), driven for example by a microcontroller, which ensures the control, via a power stage (96), on the one hand of heating resistors (97) and, on the other hand, of diodes (98) emitting blue radiation.
  • a control electronics 95
  • a microcontroller driven for example by a microcontroller, which ensures the control, via a power stage (96), on the one hand of heating resistors (97) and, on the other hand, of diodes (98) emitting blue radiation.
  • control electronics (95) detects the cell which has just received the capsule (62) and applies to the latter by means of a resistance (97) a localized heating at a temperature of the order of 65 ° C for a period of around 45 minutes;
  • the control electronics lower the temperature of this cell to a value of 25 ° C and control, under this cell, the lighting of one or more LEDs (98) (light-emitting diodes) blue in color at the same time as it indicates the end of the process by emitting a signal, in particular an audible signal;
  • An average detection cycle is therefore between approximately 45 and 70 minutes.
  • the use of the detection system (22) according to the invention that is to say the joint use of the dispenser (20) and of the detector (21) is particularly advantageous in that it allows them to be used in such a manner. sequential time-sharing.
  • the average treatment time in the dispenser (20) being of the order of 3 to 15 minutes and that in the detector of the order of 45 minutes, it is possible to processing multiple samples in the dispenser during a processing cycle in the detector (21).
  • a portable diagnostic device (31) in the form of a cylindrical housing comprising two superimposed coaxial discs (33, 35) mounted to rotate one another. with respect to each other around their centers (O) and defining a closed volume, namely:
  • an upper disc (33) comprising:
  • a biological sample to be tested which is provided with a biologically compatible capture membrane (38) and capable of allowing the extraction and retention of nucleic acids from this biological sample in the presence of appropriate reagents, and
  • At least one capsule (62) disposed, removably, in a housing (56) thereof and which comprises a reaction zone comprising at least one and preferably at least two biologically compatible, adjacent pellets (43a, 43b) , independent, and capable of allowing the amplification and detection of at least one sequence of nucleic acids of interest likely to be present in the aforesaid biological sample in the presence of appropriate reagents, the receiving opening (52a, 52b), the window (53), the absorbent material (45) and the reaction zone forming a detection unit such that, by rotation, the upper disc (33) can successively
  • ⁇ move from a first position in which, for this detection unit, its receiving opening (52a, 52b) is in line with its absorbent material (45), so as to allow the extraction and retention of the aforesaid nucleic acids , and its window (53) is located in line with its reaction zone,
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that the lower disc (35) comprises a drying window (58), in particular of radial shape, arranged between the housing (56) of the capsule (62) and the absorbent material (45), preferably at the same angular distance (a / 2) of these two elements, this drying window (58) being arranged such that, by a rotation, the upper disc (33) can pass from the aforesaid first position to this intermediate position in which, for the aforesaid detection unit, its receiving opening (52a, 52b) is located to the right of this drying window (58).
  • a drying window in particular of radial shape
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that the housing suitable for receiving the capsule (62) is in the form of an open radial slot (56). on the outside, in which said capsule is insertable by sliding.
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above characterized in that the capsule (62) comprises a first part (62a) adapted to be inserted into the radial slot (56) and a second part forming a sealing cover (62b) of the first part, these two parts possibly being connected by connecting means (62c).
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that said first part (62a) and said second part (62b) is of the transparent type, and in particular said first part (62a) or said second part (62b) is tinted yellow in color.
  • said detection of the signal obtained via the use of the diagnostic device of the invention based on the principles of fluorescence only one or the other of the parts (62a) and (62b) can be tinted in yellow, which part is determined by the location of the light source.
  • a light source an LED of a certain color (ie centered on a blue wavelength of 495 nm) illuminates a fluorophore (ie present on the pellets and active at the end of the reaction in the case of a positive result).
  • the fluorophore in question under the stimulation of the light source, then emits light of another color (ie with a green wavelength of the order of 517 nm) the intensity of which is much lower than intensity emitted by the light source. It is therefore recommended or even necessary to use a color filter (i.e. yellow) to block the light source but not the light emitted by the fluorophore. In this way, the signal can be observed / measured and the diagnosis made.
  • a color filter i.e. yellow
  • the color filter to be placed between the side of the observed biologically compatible pellets (43a, 43b) and the measuring device (eg eye or camera) to eliminate the light source and allow the fluorescence emitted by the fluorophore to pass, which can then be detected, it will be understood that this filter can be constituted by said first part (62a) or said second part (62b) of the transparent capsule, or by the cover (92) of the detector (21) if the latter is used.
  • the measuring device eg eye or camera
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that the capsule (62) is made of polypropylene, in particular of food grade.
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that the opening (52a, 52b) receiving the biological sample to be tested is disposed at the bottom of a hollow boss (50), and comprises a removable funnel (49) provided with at least one opening located in line with the receiving opening (52a, 52b), this funnel (49) being fitted on the hollow boss (50) .
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above characterized in that the absorbent material (45) is either disposed in a bowl (59) of the upper surface of the lower disc (35) or integrated into the mass of the latter, said absorbent material (45) having a retention volume of at least 1 ml.
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that the absorbent material (45) consists of a material chosen from: an absorbent cellulose pad, fiberglass or cotton wool and an absorbent pad suitable for immunoassay chromatographic.
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that one of the two faces facing one of the discs (33) comprises a groove (51 ) coaxial with the disc and partially circular, the ends of which determine an angle at the center (b) whose value, in cooperation with a stud (60) of the other disc (35), define end positions of the two discs in the two aforesaid first position and second position.
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that the capture membrane (38) biologically compatible and capable of allowing the extraction and retention of acids nucleic acid is made from a material chosen from: cellulose, silica and glass fiber.
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that the at least one and preferably at least two biologically compatible amplification pellets (43a, 43b) are made from a material chosen from: glass fiber (or not containing an adjuvant binder) and cellulose.
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that at least one reaction zone comprises at least one, preferably at least two pellets (43a, 43b) of biologically compatible, adjacent and independent amplification, at least one containing lyophilized reagents capable of allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest capable of being present in the aforesaid biological sample.
  • the invention relates to the diagnostic device (31) as described above, characterized in that said at least one reaction zone comprises at least two biologically compatible amplification pellets (43a, 43b), adjacent and independent, the first (43a or 43b) containing lyophilized reagents capable of allowing amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the aforesaid biological sample and the second (43b or 43a) containing lyophilized reagents capable of allowing amplification and detection at least one other nucleic acid sequence of interest necessarily present in the biological sample to be tested.
  • the first (43a or 43b) containing lyophilized reagents capable of allowing amplification and detection of at least one nucleic acid sequence of interest likely to be present in the aforesaid biological sample
  • the second (43b or 43a) containing lyophilized reagents capable of allowing amplification and detection at least one other nucleic acid sequence of interest necessarily present in the biological sample to be
  • the invention relates to the use of the portable diagnostic device (31) in the form of a cylindrical housing as described above for detecting in vitro at least one nucleic acid sequence of interest. likely to be present in a biological sample to be tested.
  • the invention relates to the above-mentioned use for detecting viral infection in vitro and in particular for detecting SARS-CoV-2 viral infection in vitro.
  • the latter relates to a method for the in vitro detection of at least one nucleic acid sequence of interest capable of being present in a biological sample to be tested, said method being implemented.
  • the portable diagnostic device (31) in the form of a cylindrical case as described above and said method comprising at least the following steps: a. extracting nucleic acids from the biological sample to be tested on a biologically compatible capture membrane (38) of a detection unit; b. turning the upper disc (33) to position said biologically compatible capture membrane (38) in line with the reaction zone of this detection unit and to cover it in part or in whole; vs.
  • the invention relates to the in vitro detection method as described above, in which a step of drying said biologically compatible capture membrane (38) is carried out between the above steps a) and b ), and said step comprises at least the following step: i. rotating the upper disc (33) to position said biologically compatible capture membrane (38) in line with the radial window (58) so as to effect drying.
  • a dispenser device (20) intended to automatically implement a diagnostic device (31) as described above, characterized in that it comprises a receiver box (23, 24) receiving:
  • ⁇ means for eluting (82, 84, 86a, 86b) of the at least one capture membrane (38).
  • the invention relates to the dispenser device (20) as described above, characterized in that the management means comprise a power supply (70) delivering energy to a power stage (74) under the control of a control electronics (72).
  • the invention relates to the dispenser device (20) as described above, characterized in that the control electronics (72) ensure the control of a motor (88), in particular a stepper motor. stepped, capable of sequentially positioning the upper disc (33) relative to the lower disc (35) successively in the aforesaid first position, in the aforesaid intermediate position, in the aforesaid second position and in the aforesaid first position.
  • the invention relates to the dispenser device (20) as described above, characterized in that it comprises means (58) for drying the capture membrane (38).
  • the invention relates to the dispenser device (20) as described above, characterized in that the drying means comprise a radial slot (58) passing through the lower disc (35) and which is positioned so as to in such a way that it is located in line with the at least one receiving opening (52a, 52b) when the upper (33) and lower (35) discs are in the aforesaid intermediate position and possibly blowing means at the through said radial slot (58).
  • the drying means comprise a radial slot (58) passing through the lower disc (35) and which is positioned so as to in such a way that it is located in line with the at least one receiving opening (52a, 52b) when the upper (33) and lower (35) discs are in the aforesaid intermediate position and possibly blowing means at the through said radial slot (58).
  • the invention relates to the dispenser device (20) as described above, characterized in that the rinsing means comprise at least one reservoir (78) of liquid product, in particular ethanol and in particular 70% ethanol, making it possible to inject, by means of at least one pump (76), in particular a metering pump, and at least one nozzle (80), a quantity of said product, in particular of the order of 400 ⁇ L, in the at least one receiving opening (52a, 52b).
  • the order of 400 m / _ is meant an amount of from 350 to 450 pl, in particular an amount of 375 to 425 mI, from 390 to 410 pL or even an amount of 400 pL.
  • the invention relates to the dispenser device (20) as described above, characterized in that the elution means comprise at least one reservoir (84) of eluting product, in particular a saline solution, allowing to inject, by means of at least one pump (82), in particular a metering pump, and at least one nozzle and preferably two nozzles (86a, 86b), a quantity of said product, in particular of the order in particular of 30 mI_ at 50 mI_, in the at least one receiving opening (52a, 52b).
  • the elution means comprise at least one reservoir (84) of eluting product, in particular a saline solution, allowing to inject, by means of at least one pump (82), in particular a metering pump, and at least one nozzle and preferably two nozzles (86a, 86b), a quantity of said product, in particular of the order in particular of 30 mI_ at 50 mI_, in the at least one receiving opening (52a, 52b).
  • the invention relates to the above method characterized in that the control electronics (72), when the upper disc (33) leaves the aforesaid first position for the aforesaid second position:
  • ⁇ controls a stop in this position, during a drying time of the biologically compatible capture membrane (38), in particular between a few seconds and fifteen minutes.
  • drying time can be from 1 to 60 seconds, from 1 to 30 seconds, from 1 to 15 seconds, from 1 to 5 seconds, from 1 to 15 minutes or 1 to 5 minutes.
  • drying means is meant in particular blowing means.
  • it relates to a test system characterized in that it comprises a diagnostic device (31) as described above and a dispenser device (20) as described above. .
  • the latter relates to a detector device (21) intended to ensure the detection of the nucleic acids contained in a biological sample, for example collected in a diagnostic device (31) as described above and implemented in a dispenser device (20) as described above, this detector device (21) comprising a housing (91) comprising:
  • ⁇ means of managing the treatment process (94, 95, 96).
  • the invention relates to the detector device (21) as described above, characterized in that the process management means comprise a power supply (94) ensuring the supply of energy to a power stage ( 96) under the control of control electronics (95).
  • the invention relates to the detector device (21) as described above, characterized in that the means for heating the capsules (62) consist of heating resistors (97) preferably placed under each of the capsules. (62) and capable of bringing the latter to a temperature in particular of the order of 65 ° C.
  • the means for heating the capsules (62) consist of heating resistors (97) preferably placed under each of the capsules. (62) and capable of bringing the latter to a temperature in particular of the order of 65 ° C.
  • the order of 65 ° C is meant a temperature of 60 to 70 ° C, 62 to 68 ° C, 64 to 66 ° C or a temperature of 65 ° C.
  • the invention relates to the detector device (21) as described above, characterized in that the fluorescence detection means comprise lighting means, in particular constituted by light-emitting diodes (LED) ( 98), which are arranged under the capsules (62) and by a yellow filter arranged above them.
  • the invention relates to the detector device (21) as described above, characterized in that the yellow filter is formed by the cover (92) of the housing (91).
  • the user has one or more capsules in the indentations (89) of the plate (93) of the detector device (21),
  • control electronics (95) activate the heating of the resistors (97) placed under the capsule or capsules (62) which have just been introduced into the detector device (21) to a value of approximately 65 ° C. ,
  • control electronics (95) maintains this temperature under said capsule (s) for a period of approximately 45 minutes
  • control electronics (95) then lower the temperature applied to said capsule (s) to a value of approximately 25 ° C,
  • control electronics then emits a signal, in particular an audible signal, signaling the end of the treatment for this or these capsule (s) and lights up a blue light under this or these latter (s),
  • the user then places on the aforesaid capsule or capsules a yellow filter and in particular the cover (92) transparent and tinted in yellow, in order to detect any fluorescence,
  • the invention relates to the above method in which the fluorescence (the signal) is monitored in real time.
  • the fluorescence the signal
  • the method of the invention makes it possible to follow the amplification kinetics and, from there, to carry out a semi-quantitative estimate, for example, of the viral load; that is, the user is able to estimate (in a relative way) among the samples being tested in which the viral load is highest or lowest.
  • a diagnostic system characterized in that it comprises a test system as described above and a detector device as described above.
  • the dimensions of the diagrams are in millimeters (mm).
  • (2) The 3D parts of the 2 discs were exported in STL format and implemented in the Makerboot software.
  • ⁇ was placed the biologically compatible membrane allowing the extraction and retention of nucleic acids, called capture membrane, at the receiving opening in the form of an oblong hole, said capture membrane having been previously encapsulated in a perforated PCR tape on each side; and
  • the two upper and lower discs have been assembled taking care that the stop lug (or lug) is in the guide groove and that the hole in the center of the upper disc is aligned with the central stud of the lower disc.
  • the device thus ready can be either stored and used later, or directly used.
  • a step of lyophilization of the molecular tools allowing the amplification and detection of at least one nucleic acid sequence likely to be present in the sample to be tested can be added.
  • dNTPs, enzymes, primers, etc. are mixed and then adsorbed on the pellets.
  • the reaction pellets are incubated at - 20 ° C for 20 minutes, then at - 80 ° C for 20 minutes, then lyophilized in a lyophilizer at a pressure of 3 mbar overnight (8 h).
  • the thus lyophilized pellets can then be placed in the housings provided for this purpose in the device of the invention.
  • each deoxyribonucleotide triphosphate dATP, dTTP, dGTP, dCTP
  • ⁇ a concentration of quencher one and a half times greater than the concentration of the probe primer (1.2 mM if the probe primer is FIP or BIP, 0.6 mM if the probe primer is LoopF or LoopB)
  • the primers of sequences SEQ ID NOs: 1 to 6 were used, which amplify a target sequence of the NS4B gene, and the BIP primer (SEQ ID NO: 4) served as a probe since it was modified in 5 'by the addition of a FAM fluorophore.
  • the oligonucleotide-quencher of sequence SEQ ID NO: 13 was used and modified to 3 'by the addition of Iowa Black FQ.
  • the primers of sequences SEQ ID NOs: 7 to 12 were used, which amplify a target sequence of the ORFIab gene (Lin Yu et al., Rapid colorimetry detection of COVID-19 coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic plat-form: iLACO; DOI: 10.1101 / 2020.02.20.20025874), and the LoopF primer (SEQ ID NO: 11) served as a probe since it was modified in 5 'by the addition of a Texas Red fluorophore.
  • the oligonucleotide-quencher of sequence SEQ ID NO: 16 was used and modified to 3 'by the addition of Iowa Black RQ.
  • primers were lyophilized (cf. supra) in a test pellet next to an internal positive control pellet in which the DNA / RNA template has also been lyophilized, allowing the reaction to be initiated.
  • the pellets were placed in the housings provided for this purpose.
  • rinsing buffers eg 200 mI_ of Buffer AW1 (Qiagen ® ), then 200 mI_ of buffer AW2 (Qiagen ® ), or 400 mI_ of a 70% ethanol solution, or any other rinsing buffer whose composition is close to the rinsing buffer published: Boom et al., JPME (1990). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology, 28 (3), 495-503
  • the samples used were a sample infected with the DENV2 virus and a sample not infected with the DENV2 virus.
  • An RNA extract of SARS-CoV-2 and a negative control without extract of this RNA were also used.
  • Photographs were also taken with a smartphone (Iphone ® ) or a commercial Nikon ® camera.
  • Figure 11 shows the results obtained, which confirmed that the device is able, safely and reliably, to detect DENV2 virus and SARS-CoV-2 coronavirus only in samples where their respective genetic material is present.
  • the device of the invention was used and was configured so as to allow detection of SARS-CoV-2 RNA (Orflab gene) [Lamb, LE, Bartolone, SN, Ward, E., & Chancellor, MB (2020). Rapid detection of novel coronavirus / Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by reverse transcription- loop-mediated isothermal amplification.
  • SARS-CoV-2 RNA Orflab gene
  • PLoS One, 15 (6), e0234682 as well as human 18S RNA [Lamb, LE, Bartolone, SN, Tree, MO, Conway, MJ, Rossignol, J., Smith, CP, & Chancellor, MB (2018) .
  • the other, square, contains a lyophilized RT-LAMP mix allowing the detection of 18S RNA (SEQ ID NOs: 25 to 31) [Garneret, P., Coz, E., Martin, E., Manuguerra, JC, Brient-Litzler, E., Enouf, V., ... & Tabeling, P. (2021). Performing point-of-care molecular testing for SARS-CoV-2 with RNA extraction and isothermal amplification. Plos one, 16 (1), e0243712. 7]
  • 18S_rRNA_FIP TGGCCTCAGTTCCGAAAACCAACCTGGA
  • 18S_rRNA_LoopF AGAACCGCGGTCCTATTCCATTATT 29
  • 18S_rRNA_LoopB ATTCCTTGGACCGGCGCAAG 30
  • the COVID-19_FIP primer is modified in 5 'by the addition of a FAM molecule, and a complementary oligo having a 3' deactivator is added (Covid-19_FIP- Deactivator).
  • the 18S_rRNA_BIP primer is modified in 5 ′ by the addition of a FAM molecule, and a complementary oligo having a 3 ′ deactivator (18S_rRNA_BIP-Deactivator).
  • the sample (100 ⁇ L) is lysed for 5 min at 65 ° C.
  • the two discs forming the device are arranged so that the capture membranes are placed above the absorbent pad. After adding 400 ⁇ L of 100% ethanol, this volume is deposited in the capture zone.
  • the funnel is removed and then 400 ⁇ L of a 70% ethanol solution are deposited in the capture zone to rinse the capture membranes.
  • the upper disc is rotated so that the capture membranes on the upper disc face the drying area of the lower disc.
  • the capture membranes then dry for 15 minutes at 65 ° C.
  • the upper disc is again rotated to bring the two capture membranes facing respectively the two amplification membranes.
  • 40 ⁇ L of an aqueous solution is deposited on each of the two capture membranes, thus eluting the RNAs captured by the amplification membranes.
  • This eluate rehydrates the RT-LAMP mixes lyophilized on the detection membranes.
  • the capsule is then closed and then brought to 65 ° C. for 45 minutes.
  • the amplification product is then observed at room temperature by fluorescence.
  • the Ct values are obtained by the reference rt-PCR IP4 [World Health Organization. Protocol: real-time RT-PCR assays for the detection of SARS-CoV-2, Institut Pasteur, Paris. World Health Organization, Geneva]
  • Figure 28 shows the results obtained, which confirmed that the device is able, safely and reliably, to detect the SARS-CoV-2 coronavirus in samples of nasopharyngeal and salivary samples.

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Abstract

La présente invention concerne un dispositif portable pour effectuer le diagnostic d'agents pathogènes (virus, bactéries, microorganismes, etc.) en détectant rapidement leurs acides nucléiques dans un échantillon biologique à tester. La présente invention concerne également les utilisations du dispositif de diagnostic de l'invention et les procédés qu'il permet de mettre en œuvre.

Description

DESCRIPTION
TITRE : DISPOSITIF DE DIAGNOSTIC PORTABLE EN FORME DE BOITIER CYLINDRIQUE ET SES UTILISATIONS
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne un dispositif portable pour effectuer le diagnostic d’agents pathogènes (virus, bactéries, microorganismes, etc.) en détectant rapidement leurs acides nucléiques dans un échantillon biologique à tester. La présente invention concerne également les utilisations du dispositif de diagnostic de l’invention et les procédés qu’il permet de mettre en œuvre.
CONTEXTE DE L’INVENTION
Les tests d’amplification des acides nucléiques (NAAT - Nuclear Acid Amplification Test) détectent, par amplification, les acides nucléiques dans l’échantillon infecté. Les NAAT ont la capacité de détecter les agents pathogènes dès les premiers jours de l’infection, c’est-à-dire bien avant le développement de la réponse immunitaire. La technique se caractérise par de grandes sensibilités (10 - 100 particules) et d’excellentes spécificités, dues à une étape d’hybridation d’amorce. En raison de ses performances, le NAAT basé sur la PCR ( Polymerase Chain Reaction) est considéré, sans conteste, comme la référence dans le domaine.
Bien qu’extrêmement utile, l’inconvénient des NAAT basés sur la PCR est le coût et l’utilisation d’équipements complexes. De nombreux instruments commerciaux sont désormais disponibles dans le commerce (ThermoFisher®, Roche®, Genexpert®, etc.). Cependant, le coût de l’équipement varie de 30 k € à 200 k €. Dans un grand nombre cas, ils ont besoin de personnes hautement qualifiées, et d’espaces propres et contrôlés en température et humidité pour exécuter les tests. Un tel équipement est situé dans un nombre limité d’endroits, d’hôpitaux et de laboratoires, nécessitant, dans la plupart des cas, le transport des échantillons pour être analysés, ou le transport des patients pour atteindre ces endroits, avec des risques de contamination importants. Ainsi, le coût et la complexité du NAAT basé sur la PCR entravent la possibilité d’effectuer des quantités massives de tests, ou le limitent à des pays riches. En France, au début de l’épidémie de COVID-19 liée au virus SARS-CoV-2, en France, quelques milliers de tests ont été effectués chaque jour, un chiffre à comparer aux dizaines de milliers de personnes infectées. Il a fallu beaucoup de temps et de ressources pour passer à 10 - 20000 tests par jour, courant avril 2020, le nombre étant encore insuffisant. Dans le cas de de cette maladie, certains pays comme la Corée du Sud ont mis en oeuvre une approche de test importante, qui, couplée à l’isolement des patients positifs, a entraîné une diminution significative de la propagation du pathogène. Cependant, le déploiement de tests massifs nécessite une logistique coûteuse et complexe, qui ne peut être facilement déployée dans les pays à revenus moyen ou modeste.
Au cours des dernières années, avec l’avènement des technologies d’amplification isotherme ( Rolling Circle Amplification [RCA], Loop Mediated Amplification [LAMP], Recombinase Polymerase Amplification [RPA], etc.), qui ne nécessitent pas de thermocyclage pour amplifier les acides nucléiques, un nouveau domaine de recherche s’est ouvert, suscitant l’espoir de réaliser des NAAT sur site, en utilisant des appareils beaucoup plus simples et moins chers que les plateformes PCR. Aujourd’hui, il existe une vingtaine de techniques d’amplification isotherme (A. Niemz, T.Ferguson, D. Boyle. “Point of care nucleic acid testing for infectious diseases", Trends in biotechnology, 29, 240, 2011.). Parmi eux, l’amplification isotherme LAMP, qui fonctionne à 65°C, doit être mise en valeur, en raison de ses performances, en termes de taux d’amplification (deux fois plus rapides que la PCR), de sensibilité et de spécificité (similaire à la PCR), ainsi que de grandes quantités d’ADNc (Acide DésoxyriboNucléique complémentaire) produites pendant la réaction, facilitant la lecture. Récemment, ont été réalisés des NAAT basés sur RPA et LAMP, le plus souvent inspirés par les idées développées, ces dernières années, dans le domaine de la « microfluidique papier » (S. Vella et al., “Measuring markers of liver function using a micropatterned paper device designed for blood from a fingerstick”, Analytical Chemistry, vol. 84, pp. 2883-2891, 2012 ; J. Linnes et al., “Paper based molecular diagnostic for Chlamydia trachomatis, RSC Advances, vol. 4, pp. 42245-42251, 2014 ; L. Magro et al., “Paper microfluidics for nucleic acid amplification testing (NAAT) ofinfectious diseases’’, Lab on a Chip, 14, 2347-2371, 2017 ; L. Magro étal., “Paper-based RNA détection and multiplexed analysis for Ebola virus diagnostics" , Scientific Reports 7, 1347, 2017). Sans dégradation de qualité, ces tests remplacent la technique de la PCR, en termes de simplicité, de compacité et de coûts, ce qui la rend portable, utilisable dans les cabinets médicaux. Cependant, en pratique, les types de tests existant ne permettent pas de développer ces utilisations en « Point of Care », ou « de terrain », pour différentes raisons (pas de lyophilisation des produits, pas d’extraction d’ARN, système compliqué à utiliser pour le personnel médical, instrumentalisation environnante trop complexe, etc.).
BREF APERÇU DE L’INVENTION
En réponse aux besoins sanitaires actuels (i.e. pandémie COVID-19) et futurs, les inventeurs ont développé un nouveau dispositif de diagnostic portable et facilement déployable à grande échelle permettant le diagnostic d’agents pathogènes (virus, bactéries, microorganismes, etc.) basé sur la détection des acides nucléiques. Ce nouveau dispositif permet de mettre en oeuvre des tests rapides, fiables et sûrs, et permet également de tester un ou plusieurs échantillons. Par ailleurs, ce nouveau dispositif, qui peut être à usage unique et/ou jetable, présente l’avantage d’être peu coûteux et utilisable localement. Ainsi et grâce au dispositif de diagnostic de l’invention, les diagnostics pourraient s’effectuer chez le médecin, au service d’urgence de l’hôpital, sur le lieu de travail, dans les pharmacies ou même à domicile.
Un des premiers objets de l’invention est donc un dispositif de diagnostic portable en forme de boîtier cylindrique. Un second objet de l’invention concerne les différentes utilisations possibles du dispositif de diagnostic l’invention. Un autre objet de l’invention concerne les procédés facilement réalisables par un utilisateur, lesquels permettent le diagnostic rapide d’agents pathogènes (virus, bactéries, microorganismes, etc.) de manière fiable et sûre. Un autre objet de l’invention concerne également les procédés de fabrication du dispositif de diagnostic de l’invention.
LISTE DES FIGURES
Les figures suivantes illustrent l’invention, sans pour autant en limiter sa portée.
La Figure 1 représente une vue en perspective du dispositif de diagnostic de l’invention.
(1) dispositif de diagnostic ; (3) disque supérieur ; (5) disque inférieur ; (8) membrane ; (12) zone réactionnelle et (13a et 13b) pastilles.
La Figure 2 représente une vue de dessus schématique du dispositif de diagnostic de l’invention.
(3) disque supérieur ; (8) membrane ; (9) fenêtre et (13a et 13b) pastilles.
La Figure 3 représente une vue de dessous schématique du dispositif de diagnostic de l’invention lorsque celui-ci comprend un évidement.
(5) disque inférieur ; (6) évidement et (13a et 13b) pastilles.
La Figure 4 représente une vue en perspective éclatée du dispositif de diagnostic de l’invention illustré Figures 1, 2 et 3.
(1) dispositif de diagnostic ; (3) disque supérieur ; (5) disque inférieur ; (7) ouverture réceptrice ; (8) membrane ; (9) fenêtre ; (11) filtre optique ; (13a et 13b) pastilles et (15) matériau absorbant.
La Figure 5 représente une vue en coupe brisée verticale du dispositif de diagnostic de l’invention suivant la ligne V-V (A) de la Figure 2 (i.e. sans évidement au niveau du disque inférieur (5)) et (B) de la Figure 3 (i.e. avec évidement au niveau du disque inférieur (5)).
(1) dispositif de diagnostic ; (3) disque supérieur ; (5) disque inférieur ; (6) évidement ; (7) ouverture réceptrice ; (8) membrane ; (9) fenêtre ; (10) matériau étanche ; (11 ) filtres optiques ; (13b) pastille et (15) matériau absorbant. La Figure 6 représente une vue de dessus en perspective d’une première variante de mise en œuvre du dispositif de diagnostic de l’invention permettant d’effectuer huit tests sur le même dispositif.
(2) bloc de diagnostic (triangle noir) ; (3) disque supérieur ; (4) unité de détection (arc de cercle blanc) ; (7) ouverture réceptrice et (9a et 9b) fenêtres.
La Figure 7 représente une vue de dessus en perspective d’une seconde variante de mise en œuvre du dispositif de diagnostic de l’invention permettant d’effectuer douze tests sur le même dispositif.
(3) disque supérieur ; (8) membranes ; (12a, 12b) zones réactionnelles et (13a et 13b) pastilles.
La Figure 8 représente une vue de dessous du disque supérieur du dispositif de diagnostic de l’invention, lequel comprend des éléments tridimensionnels d’aide au mouvement de rotation.
(3) disque supérieur ; (8) membranes ; (11) filtre optique ; (16) rainure ; (17) jupe et (18) glissière.
La Figure 9 représente une vue schématique des plans permettant d’imprimer le disque supérieur du dispositif de diagnostic de l’invention à l’aide d’une imprimante 3D. Les chiffres et nombres correspondent à des dimensions sont en millimètre (mm). La Figure 10 représente une vue schématique des plans permettant d’imprimer le disque inférieur du dispositif de diagnostic de l’invention à l’aide d’une imprimante 3D. Les chiffres et nombres correspondent à des dimensions sont en millimètre (mm).
La Figure 11 représente les données expérimentales obtenues dans l’Exemple 2. Dispositifs utilisés pour la détection d’ARN de DENV2 et de SARS-CoV-2 dans des échantillons biologiques (a) Dispositif pour la détection de DENV2, échantillon contenant de l’ARN DENV2 (échantillon positif). Barre noire : intensité de fluorescence du contrôle interne mesurée à t = 45 minutes après soustraction de la fluorescence initiale. Barre grise hachurée : intensité de fluorescence de la pastille RT-LAMP DENV2 mesurée à t = 45 min après soustraction de la fluorescence initiale (b) Dispositif pour la détection de DENV2, échantillon négatif. Barre noire : intensité de fluorescence du contrôle interne mesurée à t = 45 minutes après soustraction de la fluorescence initiale. Barre blanche : intensité de fluorescence de la pastille de réaction RT-LAMP DENV2 mesurée à t = 45 min après soustraction de la fluorescence initiale (c) image des pastilles DENV2, échantillon positif à gauche, négatif à droite. Photographie prise avec un smartphone (d) Dispositif pour la détection de SARS-CoV-2, échantillon contenant de l’ARN SARS-CoV-2 (échantillon positif). Barre noire : intensité de fluorescence du contrôle interne mesurée à t = 45 minutes après soustraction de la fluorescence initiale. Barre grise hachurée : intensité de fluorescence de la pastille RT-LAMP SARS-CoV-2 mesurée à t = 45 min après soustraction de la fluorescence initiale (e) Dispositif pour la détection de DENV2, échantillon négatif. Barre noire : intensité de fluorescence du contrôle interne mesurée à t = 45 minutes après soustraction de la fluorescence initiale. Barre blanche : intensité de fluorescence de la pastille RT-LAMP SARS-CoV-2 mesurée à t = 45 min après soustraction de la fluorescence initiale (f) images des pastilles SARS-CoV-2, échantillon positif à gauche, négatif à droite. Photographie prise avec un appareil photographique numérique.
La Figure 12 représente une vue schématique du dispenseur dans sa configuration fermée.
(20) dispenseur ; (23) socle ; (24) capot et (90) organe de commande.
La Figure 13 représente une vue schématique du dispenseur dans sa configuration ouverte.
(20) dispenseur ; (23) socle ; (24) capot ; (25) cavité circulaire ; (31) dispositif de diagnostic et (68) disque rotatif.
La Figure 14 représente une vue schématique éclatée du dispositif de diagnostic de l’invention.
(31) dispositif de diagnostic ; (33) disque supérieur ; (35) disque inférieur ; (43a et 43b) pastilles réactives ; (45) matériau absorbant ; (50) cavité ; (51) fente circulaire ; (52a) ouverture ; (53) fente radiale ; (54) trou central ; (62) capsule ; (62a) partie de la capsule apte à être insérée dans le dispositif de diagnostic ; (62b) couvercle ; axe r3 ; axe r’3 et axe yy’. La Figure 15 représente une vue schématique du dessus du disque supérieur (33) comprenant deux ouvertures.
(33) dispositif de diagnostic ; (50) cavité ; (51) fente circulaire ; (52a et 52b) ouvertures réceptrices ; (53) fente radiale ; (55) téton central ; largeur a ; axe r1 ; axe r3 ; angles a et b.
La Figure 16 représente une vue schématique du dessus du disque supérieur (33) comprenant une ouverture.
(33) dispositif de diagnostic ; (37) ouverture réceptrice ; (38) membrane de capture ; axe r1. La Figure 17 représente une vue schématique de l’intérieur du disque inférieur (35). (35) disque inférieur ; (54) trou central ; (56) fente radiale ; (57) moyens de préhension ; (58) fenêtre radiale ; (59) cuvette ; (60) téton ; largeur a’ ; axe r’1 ; axe r’2 ; axe r’3 et angle a/2.
La Figure 18 représente une vue schématique de la capsule dans sa configuration ouverte.
(43a et 43b) pastilles réactives ; (62) capsule ; (62a) partie de la capsule apte à être insérée dans le dispositif de diagnostic ; (62b) couvercle ; (62c) lien ; (64a, 64b et 64c) bossages creux et (66a, 66b et 66c) bossages creux.
La Figure 19 représente une vue schématique du disque inférieur (35) dans lequel la capsule (62), dans sa configuration ouverte, est insérée.
(35) disque inférieur ; (58) fenêtre radiale ; (59) cuvette ; (60) téton ; (62) capsule, axe r’2 et axe r’3.
La Figure 20 représente l’agencement du disque supérieur (33) par rapport au disque inférieur (35) lorsque le dispositif de diagnostic (31) est à la position 1. (33) disque supérieur ; (35) disque inférieur ; (52a et 52b) ouvertures réceptrices ;
(58) fenêtre radiale ; (59) cuvette ; axe r1 ; axe r2 ; axe r3 ; axe r’1 ; axe r’2 et axe r’3.
La Figure 21 représente l’agencement du disque supérieur (33) par rapport au disque inférieur (35) lorsque le dispositif de diagnostic (31) est à la position intermédiaire. (33) disque supérieur ; (35) disque inférieur ; (52a et 52b) ouvertures réceptrices ; (58) fenêtre radiale ; axe r1 ; axe r2 ; axe r3 ; axe r’1 ; axe r’2 et axe r’3.
La Figure 22 représente l’agencement du disque supérieur (33) par rapport au disque inférieur (35) lorsque le dispositif de diagnostic (31) est à la position 2.
(33) disque supérieur ; (35) disque inférieur ; (52a et 52b) ouvertures réceptrices ; (56) fente radiale ; axe r1 ; axe r2 ; axe r3 ; axe r’1 ; axe r’2 et axe r’3.
La Figure 23 représente schématiquement un type d’agencement mis en œuvre dans un dispenseur (20).
(20) dispenseur ; (23) socle ; (24) capot ; (31) dispositif de diagnostic ; (70) alimentation ; (72) électronique de commande ; (74) étage de puissance ; (76) première pompe doseuse ; (78) réservoir d’éthanol ; (80) buse ; (82) seconde pompe doseuse ; (84) réservoir d’éluant ; (86a et 86b) buses et (88) moteur.
La Figure 24 représente une vue schématique du dessus du détecteur (21) dans sa configuration ouverte.
(62) capsule ; (91) corps du détecteur ; (92) couvercle et (93) platine. La Figure 25 représente une vue schématique du dessus du détecteur (21) dans sa configuration fermée.
(62) capsule ; (89) alvéole ; (91) corps du détecteur et (93) platine.
La Figure 26 représente schématiquement un type d’agencement mis en œuvre dans un détecteur (21). (94) alimentation ; (95) électronique de commande ; (96) étage de puissance ; (97) résistances chauffantes et (98) diodes.
La Figure 27 représente un schéma de fonctionnement en série avec n capsules du dispositif de diagnostic de l’invention en combinaison avec un système de détection comprenant l’utilisation conjointe d’un dispenseur et d’un détecteur. La Figure 28 représente les données expérimentales obtenues dans l’Exemple 3.
Détection d’ARN de SARS-CoV 2 dans des échantillons artificiels de salive et de fluide naso-pharyngés (panel fourni par la fondation X Prize dans le cadre de la XPrize rapid covid testing compétition). A. Signal fluorescent sur les pastilles d’amplification détectant le SARS-CoV-2, pour des échantillons naso- pharyngés extraits par le dispositif de l’invention. La limite de détection se situe autour de 5 copies génomiques/pL d’échantillon. B. Signal fluorescent sur les pastilles d’amplification détectant le SARS-CoV-2, pour des échantillons salivaires extraits par le dispositif de l’invention. La limite de détection se situe autour de 5 copies génomiques/pL d’échantillon.
DESCRIPTION DETAILLEE
L’invention consiste à coupler une unité d’extraction et une unité d’amplification/détection dans un dispositif portable, lequel comprend des réactifs lyophilisés in situ. Des exemples de ce dispositif et ses variantes sont illustrés sur les Figures 1 à 10 et 12 à 27.
Un premier aspect de l’invention concerne un dispositif de diagnostic portable en forme de boîtier cylindrique incluant des moyens :
■ d’extraction d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) d’un échantillon à tester,
■ d’amplification isotherme ( e.g . (RT)-LAMP, (RT)-LAMP-QUASR [Quenching of Unincorporated Amplification Signal Reporters ]) d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon à tester, et
■ de détection des amplicons si ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt est présente dans l’échantillon à tester.
Un premier mode de réalisation très général de l’invention suivant ce premier aspect concerne un dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
■ un disque supérieur (3) comprenant :
- au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
- au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11 ) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11 ) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible, cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°,
■ un disque inférieur (5) comprenant :
- un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide, et
- au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15) et la zone réactionnelle (12) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
■ passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
■ à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, et
■ se positionner, par une rotation, sur la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique.
Tel que décrit, le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position peut donc se faire soit par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position, soit par une rotation dans le même sens que celle-ci. Avantageusement, celle-ci se fait par une rotation inverse, laquelle permet de revenir à la position initiale plus directement, par un chemin plus court, en évitant que la fenêtre (9) d’observation s’approche du matériau absorbant (15). L’invention concerne alors le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position se fait par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position. Autrement dit, un mode de réalisation avantageux très général de l’invention concerne un dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
■ un disque supérieur (3) comprenant :
- au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
- au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11 ) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11 ) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible, cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°, en particulier d’un angle au centre compris de 30° à 320°,
■ un disque inférieur (5) comprenant :
- un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide, et
- au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15) et la zone réactionnelle (12) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
■ passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
■ à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci, et
■ revenir, par une rotation inverse, à la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique, la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation inverse, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci.
Un autre mode de réalisation très général de l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le disque inférieur (5) comprend en outre au moins un évidement (6) lequel est soit équipé d’un matériau étanche (10) intégré dans la masse du disque inférieur, soit apte à recevoir un matériau étanche (10) positionnable sur ledit évidement de façon amovible, et lequel est positionné au droit de ladite au moins une zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite au moins une zone réactionnelle (12).
Autrement dit, cet autre mode de réalisation général concerne le dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
■ un disque supérieur (3) comprenant :
- au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
- au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11 ) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11 ) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible, cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°,
■ un disque inférieur (5) comprenant :
- un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide,
- au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
- au moins un évidement (6) lequel est soit équipé d’un matériau étanche (10) intégré dans la masse du disque inférieur, soit apte à recevoir un matériau étanche (10) positionnable sur ledit évidement de façon amovible, et lequel est positionné au droit de ladite au moins une zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite au moins une zone réactionnelle (12) ; l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15), la zone réactionnelle (12) et l’évidement (6) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
■ passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
■ à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, et
■ se positionner, par une rotation, sur la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique.
De la même façon, le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position peut donc se faire soit par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position, soit par une rotation dans le même sens que celle-ci. Avantageusement, cet autre mode de réalisation général concerne le dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
■ un disque supérieur (3) comprenant :
- au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
- au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11 ) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11 ) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible, cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°, en particulier d’un angle au centre compris de 30° à 320°,
■ un disque inférieur (5) comprenant :
- un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide,
- au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et - au moins un évidement (6) lequel est soit équipé d’un matériau étanche (10) intégré dans la masse du disque inférieur, soit apte à recevoir un matériau étanche (10) positionnable sur ledit évidement de façon amovible, et lequel est positionné au droit de ladite au moins une zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite au moins une zone réactionnelle (12) ; l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15), la zone réactionnelle (12) et l’évidement (6) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
■ passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
■ à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci, et
■ revenir, par une rotation inverse, à la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique, la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation inverse, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci. Par « un dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique », on entend un dispositif sensiblement de la taille d’une main ( e.g . de 4,00 cm à 20,00 cm de diamètre, i.e. de 4, de 5, de 6, de 7, de 8, de 9, de 10, de 11 , de 12, de 13, de 14, de 15, de 16, de 17, de 18, de 19 ou de 20 cm) facilement préhensible et ergonomique. De par les matériaux choisis, celui-ci est peu coûteux à produire. Il est également léger ce qui facilite son utilisation. De plus et de par sa taille, celui-ci est également facilement transportable d’une pièce à l’autre, e.g. d’un laboratoire ou d’un hôpital. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel les disques supérieur (3) et inférieur (5) sont dans un matériau choisi parmi : l’acide polylactique (PLA) et le polycarbonate (C0-0-pPh-C(CH3)2-pPh-0)n). En particulier, il convient de noter que les matériaux utilisées pour fabriquer ces disques peuvent être opaques ou transparents (i.e. laisse passer la lumière). Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus, le rapport diamètre sur hauteur du dispositif étant compris de 5 à 30. En particulier, le rapport diamètre sur hauteur du dispositif est compris de 5 à 10, de 10 à 15, de 15 à 20, de 20 à 25, de 25 à 30, de 10 à 20 ou de 15 à 25. En particulier, le rapport diamètre sur hauteur du dispositif est de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30.
Avantageusement, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention comprend également des structures tridimensionnelles qui aident au guidage des rotations du disque supérieur sur le disque inférieur et vice versa, le rendant ainsi davantage ergonomique et encore plus facile d’utilisation. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel lesdites rotations sont guidées par un système de rainure(s) (16) et d’ergot(s), également appelé(s) taquet(s).
Alternativement, le diamètre des disques supérieur (3) et inférieur (5) peuvent être différents. Le système de rainure(s) et d’ergot(s) peut alors être remplacé ou complété par un système de jupe(s) (17) et de glissière(s) (18). Selon ce mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci- dessus dans lequel le disque supérieur (3) est plus grand que le disque inférieur (5) ou dans lequel le disque inférieur (5) est plus grand que le disque supérieur (3). En particulier, il convient de noter que la ou les jupe(s) sont disposées sur le disque le plus grand et la ou les glissière(s) (18) sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) pour guider les rotations du dispositif. Par conséquent, selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel lesdites rotations sont guidées un système de jupe(s) (17) et de glissière(s) (18).
Avantageusement, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention comprend également des structures tridimensionnelles qui aident à l’assemblage des disques supérieur (3) et inférieur (5) l’un sur l’autre. Par exemple, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention comprend un plot au centre du disque inférieur (5), ou du disque supérieur (3), lequel s’emboîte dans un évidement circulaire creusé (découpé) au centre du disque supérieur (3), ou du disque inférieur (5). Cela peut également être une bague (i.e. une pièce supplémentaire) sur laquelle viennent s’emboîter (se clipser) les disques supérieur (3) et inférieur (5), ladite bague comprenant des moyens permettant aux disques de tourner l’un sur l’autre (e.g. glissières, rainures, ergots ou taquets, etc.).
Avantageusement, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention comprend également des pièces, moulées ou non avec (sur) les disques, permettant l’introduction de l’échantillon biologique à tester et des réactifs (ou tampons) sans perte de liquide.
Par « échantillon biologique à tester », on entend tout type d’échantillon biologique susceptible de contenir des acides nucléiques. Il peut s’agir de manière non- exhaustive de sang, d’urine, de sueur, de salive, de sécrétions de la sphère ORL (e.g. nez, oreilles, gorge), de liquide céphalo-rachidien, de liquide lymphatique, de liquide amniotique, etc. Il peut également s’agir de frottis naso-pharyngé, de frottis cervico-vaginal, etc. L’échantillon biologique à tester peut par ailleurs provenir d’un mammifère. En particulier, celui-ci provient d’un mammifère choisi parmi : l’Homme (i.e. enfant, adulte, femme et homme), les singes, les félins, les canins, les équidés, les cervidés, les bovins, les ovins et les volailles. De préférence, il s’agit d’un prélèvement humain.
Par « acides nucléiques », on entend l’acide désoxyribonucléique (ADN) et/ou l’acide ribonucléique (ARN). L’invention, de par sa configuration circulaire, permet également de façon avantageuse de réaliser l’élution des acides nucléiques, et l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique au même endroit du dispositif évitant ainsi de trop nombreuses manipulations. De même, l’invention est configurée de sorte que la fenêtre (9) équipée d’un filtre optique (11 ) ne puisse jamais être au droit et en contact du matériau absorbant (15), dit tampon capillaire, évitant ainsi la contamination de la zone réactionnelle (12) par les absorbants pris dans le matériau absorbant (15).
Par « séquence d’acides nucléiques d’intérêt », on entend une séquence d’acides nucléiques présente dans le génome d’un pathogène (virus, bactérie, microorganisme, etc.) et dont la détection dans un échantillon biologique permet le diagnostic d’une pathologie. Il peut donc s’agir par exemple d’une séquence d’ADN contenu dans le plasmide génomique d’une bactérie (e.g. Salmonelle, Pseudomonas, Staphylococcus, Escherichia, Streptococcus, Hélicobacter, etc.) ou d’une séquence d’ARN contenu dans le transcriptome de ladite bactérie. Il peut également s’agir d’une séquence d’ADN et/ou d’ARN contenu dans le génome d’un virus (e.g. SARS-CoV-2, virus de la Dengue, virus de l’immunodéficience humaine [VIH], etc.). L’invention étant un dispositif de diagnostic, celui-ci permet de tester un échantillon biologique pour savoir s’il présente, par exemple, une infection (virale, bactérienne ou à un autre microorganisme, etc.), d’où l’expression « susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique ». Autrement dit, dans le contexte sanitaire actuel (i.e. pandémie COVID-19), le dispositif de diagnostic de l’invention permet de tester un patient, voire la population, pour savoir s’il présente (ou non) une infection (i.e. infection virale à SARS-CoV-2) et prendre les mesures adéquates (traitement médical, confinement, etc.). Par « séquence d’acides nucléiques d’intérêt », on entend également une séquence d’acides nucléiques présente dans le génome (ADN) ou le transcriptome (ARN) d’un mammifère (e.g. l’Homme) dont la présence serait en lien avec une prédisposition à une pathologie ou au diagnostic d’une pathologie. Le dispositif de diagnostic de l’invention tel que décrit offre donc l’avantage d’être polyvalent et de s’adapter facilement au diagnostic recherché et/ou au contexte sanitaire. Par « unité de détection », on entend l’ensemble minimal qui permet de mettre en œuvre le diagnostic d’un échantillon biologique à tester. Comme indiqué, celle-ci est pourvue :
■ d’une membrane (8) biologiquement compatible, laquelle reçoit l’échantillon biologique à tester, et laquelle permet d’extraire les acides nucléiques (ADN et/ou ARN) de l’échantillon à tester et de les retenir par affinité en présence des réactifs appropriés lorsqu’elle est au droit du matériau absorbant ;
■ d’un matériau absorbant (15), lequel recueille et stock les liquides qui passent au travers de la susdite membrane (8) ;
■ d’une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles aptes à permettre, après élution des acides nucléiques (ADN et/ou ARN) de la susdite membrane (8), l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique en présence de réactifs appropriés ;
■ d’une fenêtre (9) équipé d’un filtre optique (11) sur le disque supérieur (3) et apte à venir se positionner au droit de la zone réactionnelle (12) ; et
■ éventuellement d’un évidement (6) équipé d’un matériau étanche (10) sur le disque inférieur (5) au-dessous de la zone réactionnelle (12) et en particulier permettant à la lumière d’atteindre les au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b).
Par « fenêtre », on entend une ouverture découpée dans la matière du disque supérieur (3). Toutefois et afin d’assurer l’herméticité et l’étanchéité du dispositif de diagnostic (1) de l’invention, la ou les fenêtres sont munies d’un filtre optique (11). Ce filtre optique peut être positionné de façon amovible (e.g. film adhésif, clapet, volet etc.) ou être intégré dans la masse du disque supérieur (3), ou même placé sur un dispositif extérieur. Par « filtre optique », on entend un dispositif qui laisse passer tout ou partie du rayonnement lumineux et qui permet d’analyser le rayon lumineux en sortie du test. Ainsi, par « filtre optique » on désigne des matériaux ayant des propriétés optiques spécifiques (e.g. passe-bande, coupe-bande, passe-haut, passe- bas), des filtres colorés (e.g. gélatines photographiques, etc.), des dispositifs tels que des cubes optiques permettant la lecture d’un signal fluorescent. Par ailleurs et dans le cadre d’un test colorimétrique ou d’un test turbidimétrique (ou tout autre méthode de visualisation d’amplification) il peut s’agir d’un filtre aidant à la lecture du test. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le filtre optique est choisi parmi : un filtre passe-bande, un filtre coupe- bande, un filtre passe-haut, un filtre passe-bas, de la gélatine photographique et un cube optique.
Par « évidement », on entend une ouverture découpée dans la matière du disque inférieur (5). Toutefois et afin d’assurer l’herméticité et l’étanchéité du dispositif de diagnostic (1) de l’invention, la ou les évidements sont munis d’un matériau étanche (10). Ce matériau étanche peut être positionné de façon amovible (e.g. film adhésif, clapet, volet etc.) ou être intégré dans la masse du disque inférieur (5), ou même placé sur un dispositif extérieur. Par « matériau étanche », on entend tout type de matériau plastique ou autre, imperméable et compatible avec les réactions d’amplification. Il peut être transparent et laisser passer la lumière dans le cadre d’une lecture de fluorescence par transmission. Celui-ci peut être également opaque dans le cadre d’une lecture colorimétrique ou d’une lecture de fluorescence par réflexion. L’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci- dessus dans lequel le matériau étanche est choisi parmi : un filtre passe-bande, un filtre coupe-bande, un filtre passe-haut, un filtre passe-bas, de la gélatine photographique et un cube optique.
Par « matériau absorbant », également appelé tampon capillaire ou éponge absorbante, on entend un matériau qui, au moment de l’extraction des acides nucléiques contenus dans l’échantillon à tester au niveau de la membrane (8) en présence des réactifs [également appelés tampons] appropriés, est capable d’absorber, de contenir et de stocker les liquides qui passent au travers de la membrane (8). Celui-ci, capable de contenir un volume d’au moins 1 mL (1 cm3), peut par ailleurs être placé sur un réceptacle prévu pour l’accueillir. Ce matériau absorbant peut notamment être un tampon absorbant en cellulose, de la fibre de verre ou bourre de coton, tout autre matériau absorbant voire il peut s’agir par exemple d’un tampon absorbant utilisable pour un test immuno-chromatographique classique. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le matériau absorbant (15) est disposé dans un réceptacle qui est positionné soit sur la surface supérieure du disque inférieur, soit intégré dans la masse de ce dernier. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le matériau absorbant (15) est en mesure de contenir un volume d’au moins 1 ml_ (1 cm3). Au sens de l’invention, « au moins 1 mL » s’entend d’un volume compris de 1 mL à 2 mL ou compris de 1 mL à 1,50 mL. « Au moins 1 mL » signifie également que le volume absorbable par le matériau absorbant (15) est de 1 mL; 1,10 mL ; 1 ,15 mL ; 1,20 mL ; 1,25 mL ; 1 ,30 mL ; 1 ,35 mL ; 1 ,40 mL ; 1 ,45 mL ; 1,50 mL ; 1,55 mL ; 1,60 mL ; 1,65 mL ; 1,70 mL ; 1,75 mL ; 1, 80 mL ; 1,85 mL ; 1,90 mL ; 1,95 mL ou de 2,00 mL. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le matériau absorbant (15) est disposé dans un réceptacle qui est positionné soit sur la surface supérieure du disque inférieur, soit intégré dans la masse de ce dernier, et ledit matériau absorbant (15) est de préférence en mesure de contenir un volume d’au moins 1 mL. En particulier, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel le matériau absorbant (15) est choisi parmi : un tampon absorbant en cellulose, de la fibre de verre ou bourre de coton et un tampon absorbant utilisable pour un test immuno-chromatographique.
Par « membrane biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques ... en présence de réactifs appropriés », également appelée membrane de capture, on entend une membrane capable de recevoir un échantillon biologique à tester, de supporter l’ajout de réactifs (ou tampons) permettant l’extraction des acides nucléiques (ADN et/ou ARN) contenus dans ledit échantillon et de disposer de propriétés physico-chimiques capables de retenir (e.g. par affinité) les acides nucléiques extraits avant leur élution. Cette membrane peut notamment être en cellulose, en silice, en fibre de verre, ou en tout autre matériau poreux permettant la rétention physico-chimique des acides nucléiques. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques est dans un matériau choisi parmi : la cellulose, la silice et la fibre de verre. Par « pastilles biologiquement compatibles ... aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt ... en présence de réactifs appropriés », on entend des pastilles faites dans un matériau capable de recueillir les acides nucléiques (ADN et/ou ARN) extraits de l’échantillon biologique à tester après leur élution de la membrane (8). Ce matériau, perméable à la lumière, permet également, en présence des réactifs appropriés ( e.g . amorces, fluorophores, enzymes, dNTPs [désoxyribonucléoside triphosphate quelconques], etc.), de supporter et d’assurer l’amplification puis la détection visuelle (fluorescence, colorimétrie, etc.) d’au moins une séquence d’acides nucléiques susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester. Ces pastilles peuvent notamment être en fibre de verre (contenant ou non un liant adjuvant), en cellulose, ou en tout autre matériau poreux biocompatible ou rendu biocompatible par un traitement préalable. A noter également que ces pastilles sont adjacentes, i.e. côte à côte, tout en étant indépendantes, i.e. qu’elles ne se touchent pas évitant ainsi des contaminations entre pastilles adjacentes. De plus, ces pastilles par unité de détection sont au moins au nombre de une, de préférence au moins au nombre de deux, c’est-à-dire qu’une unité de détection peut comprendre, une, deux, trois, quatre, cinq ou six pastilles. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel les au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles sont dans un matériau choisi parmi : la fibre de verre (contenant ou non un liant adjuvant) et la cellulose.
Avantageusement, ces réactifs appropriés permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) peuvent être lyophilisés in situ à la surface (ou dans) les au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatible de la zone réactionnelle (12). La lyophilisation étant l’un des meilleurs moyens de conserver sur le long terme l’intégrité de ces réactifs, il est possible, après avoir fabriqué le dispositif de diagnostic (1 ) de l’invention, d’y lyophiliser ces réactifs. Le dispositif de diagnostic (1 ) de l’invention peut alors être préparé à l’avance à grande échelle, stocké sur le long terme et être déployé rapidement en cas de crise sanitaire. Il peut également être immédiatement utilisé après l’étape de lyophilisation décrite ci-dessus. Avantageusement, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1 ) tel que décrit ci-dessus dans lequel au moins une zone réactionnelle (12) comprend au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique.
Autrement dit, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
■ un disque supérieur (3) comprenant :
- au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
- au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11 ) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11 ) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible, cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°,
■ un disque inférieur (5) comprenant :
- un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide,
- au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, et
- éventuellement au moins un évidement (6) lequel est soit équipé d’un matériau étanche (10) intégré dans la masse du disque inférieur, soit apte à recevoir un matériau étanche (10) positionnable sur ledit évidement de façon amovible, et lequel est positionné au droit de ladite au moins une zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite au moins une zone réactionnelle (12) ; l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15), la zone réactionnelle et éventuellement l’évidement (6) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
■ passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
■ à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, et
■ se positionner, par une rotation, sur la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique.
De la même façon, le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position peut donc se faire soit par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position, soit par une rotation dans le même sens que celle-ci. Avantageusement, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
■ un disque supérieur (3) comprenant :
- au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
- au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11 ) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11 ) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible, cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°, en particulier d’un angle au centre compris de 30° à 320°,
■ un disque inférieur (5) comprenant :
- un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide,
- au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, et
- éventuellement au moins un évidement (6) lequel est soit équipé d’un matériau étanche (10) intégré dans la masse du disque inférieur, soit apte à recevoir un matériau étanche (10) positionnable sur ledit évidement de façon amovible, et lequel est positionné au droit de ladite au moins une zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite au moins une zone réactionnelle (12) ; l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15), la zone réactionnelle et éventuellement l’évidement (6) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
■ passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
■ à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci, et
■ revenir, par une rotation inverse, à la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique, la disposition du matériau absorbant (15) étant telle que, lors de la rotation inverse, la fenêtre (9) ne puisse pas venir au droit et en contact avec celui-ci.
En particulier, ce mode de réalisation peut comprendre :
■ le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend deux pastilles, l’une (13a ou 13b) servant de pastille test et l’autre (13b ou 13a) servant de pastille contrôle négatif ; et/ou
■ le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend deux pastilles, l’une (13a ou 13b) servant de pastille test et l’autre (13b ou 13a) servant de pastille contrôle positif ; et/ou
■ le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend trois pastilles, l’une servant de pastille test et les deux autres servant de pastilles contrôle négatif et contrôle positif ; et/ou
■ le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend trois pastilles, deux servant de pastille test et la dernière servant de pastille contrôle négatif ou de pastille contrôle positif.
Par « pastille test », on entend une pastille biologiquement compatible sur laquelle est lyophilisé in situ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester. De cette manière, si un signal positif est obtenu à l’issue du test alors l’échantillon contient ladite d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt et le diagnostic est positif (sous réserve des résultats obtenus sur la ou les pastilles contrôles). Autrement dit, dans le contexte sanitaire actuel (i.e. pandémie COVID-19), si un signal positif est obtenu sur cette pastille test, le patient présente une infection au SARS-CoV-2 et les mesures adéquates (traitement médical, confinement, etc.) peuvent être prises. Par ailleurs et dans l’hypothèse d’un dispositif de diagnostic (1) selon l’invention comprenant 3 pastilles dont 2 de test, chaque pastille test peut :
■ soit être préparée de sorte à permettre l’amplification et la détection de différentes séquences d'acides nucléiques d’intérêt d’une même cible ( e.g . 2 pastilles tests ciblant 2 régions différentes d'un même pathogène) ;
■ soit être préparée de sorte à permettre l’amplification et la détection de différentes séquences d'acides nucléiques d’intérêt de différentes cibles (e.g. 2 pastilles tests ciblant chacune une région spécifique de deux pathogènes différents l'un de l'autre).
Par « pastille contrôle négatif », on entend une pastille biologiquement compatible sur laquelle aucun des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est lyophilisé. On entend également une pastille biologiquement compatible sur laquelle un des éléments essentiel à l’amplification ou la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est pas lyophilisé. De cette manière, cette pastille à l’issue du test ne peut pas révéler positivement la présence d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt. Si cela se produit, le test est invalidé et doit être refait.
Par « pastille contrôle positif », on entend une pastille biologiquement compatible sur laquelle est lyophilisé in situ :
■ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ou d’une autre séquence d’acides nucléiques ; et
■ ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt ou ladite autre séquences d’acides nucléiques.
De cette manière, cette pastille à l’issue du test doit révéler positivement la présence d’une séquence d’acides nucléiques. Si cela ne se produit pas, le test est invalidé et doit être refait. Avantageusement, il convient de noter que la séquence d’acides nucléiques révélée par le biais de la pastille contrôle positif et des réactifs lyophilisés in situ peut être dissociée (différente) de ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester. Par « pastille contrôle positif », on entend également et de façon alternative une pastille biologiquement compatible sur laquelle est lyophilisé in situ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une autre séquence d’acides nucléiques d’intérêt dont on sait qu’elle est nécessairement présente dans l’échantillon biologique à tester. De cette manière, cette pastille à l’issue du test doit révéler positivement la présence de ladite autre séquence d’acides nucléiques d’intérêt. Si cela ne se produit pas, le test est invalidé et doit être refait. A titre d’exemple et si l’échantillon biologique à tester correspond à de la salive d’origine humaine, sur la pastille contrôle positif peut être lyophilisé in situ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins un fragment du gène codant pour le complexe majeur d’histocompatibilité humain, i.e. un fragment du gène HLA. Aussi et si l’échantillon biologique à tester est d’origine humaine, par « au moins une autre séquence d’acides nucléiques d’intérêt dont on sait qu’elle est nécessairement présente dans l’échantillon biologique à tester », on entend, par exemple, un fragment d’un gène de ménage ubiquitaire humain (i.e. transcrits et présents en quantité importante dans toutes les cellules) et présentant peu de variabilité interindividuelle. Des exemples courant de tels gènes de ménages sont : b- actine humaine, Rnase-P humaine, ARN ribosomal humain (18S par exemple).
Parmi ces modes de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend :
■ une pastille test (13a ou 13b) sur laquelle est lyophilisé in situ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ; et
■ une pastille contrôle négatif (13b ou 13a) sur laquelle : o aucun des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est lyophilisé ; ou o un des éléments essentiel à l’amplification ou la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est pas lyophilisé.
Parmi ces modes de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend :
■ une pastille test (13a ou 13b) sur laquelle est lyophilisé in situ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ; et
■ une pastille contrôle positif (13b ou 13a) sur laquelle est lyophilisé in situ : o l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ou d’une autre séquence d’acides nucléiques ; et o ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt ou ladite autre séquences d’acides nucléiques.
Parmi ces modes de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend :
■ une pastille test (13a ou 13b) sur laquelle est lyophilisé in situ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ; et
■ une pastille contrôle positif (13b ou 13a) sur laquelle est lyophilisé in situ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une autre séquence d’acides nucléiques d’intérêt nécessairement présente dans l’échantillon biologique à tester.
Parmi ces modes de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend : ■ une pastille test sur laquelle est lyophilisé in situ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ;
■ une pastille contrôle négatif (13a ou 13b) sur laquelle : o aucun des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est lyophilisé, ou o un des éléments essentiel à l’amplification ou la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est pas lyophilisé ; et
■ une pastille contrôle positif (13b ou 13a) sur laquelle est lyophilisé in situ : o l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ou d’une autre séquence d’acides nucléiques ; et o ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt ou ladite autre séquences d’acides nucléiques.
Parmi ces modes de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel la zone réactionnelle (12) comprend :
■ une pastille test sur laquelle est lyophilisé in situ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester ;
■ une pastille contrôle négatif (13a ou 13b) sur laquelle : o aucun des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est lyophilisé, ou o un des éléments essentiel à l’amplification ou la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester n’est pas lyophilisé ; et ■ une pastille contrôle positif (13b ou 13a) sur laquelle est lyophilisé in situ l’ensemble des réactifs permettant l’amplification et la détection d’au moins une autre séquence d’acides nucléiques d’intérêt nécessairement présente dans l’échantillon biologique à tester.
De manière avantageuse, ces derniers modes de réalisation particuliers permettent une meilleure lecture des résultats grâce aux contrastes de couleurs qu’il est possible d’observer entre les trois pastilles. Ceci permet également de sécuriser davantage l’interprétation des résultats. Alternativement, ce mode de réalisation comprenant trois pastilles peut être décrit comme étant le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles contiennent des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, et dont l’une au moins contient également un acide nucléique d’intérêt lyophilisé apte à être amplifié par les susdits réactifs lyophilisés.
Par ailleurs et selon une autre alternative, ce mode de réalisation comprenant trois pastilles peut également être décrit comme étant le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ladite au moins une zone réactionnelle (12) comprend au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, la première (13a ou 13b) contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique et la seconde (13b ou 13a) contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une autre séquence d’acides nucléiques d’intérêt nécessairement présente dans l’échantillon biologique à tester.
Comme évoqué précédemment, on entend par « réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique » les outils moléculaires (amorces éventuellement modifiées aux extrémités 5’ et/ou 3’) capables de s’hybrider à une séquence d’acides nucléiques d’intérêt (ADN et/ou ARN), d’amplifier celle-ci (enzymes, dNTPs) et de visuellement (fluorescence, colorimétrie, etc.) révéler sa présence. Parmi ces moyens on y retrouve de manière non exhaustive les outils moléculaires permettant de mettre en œuvre des technologies d’amplification d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) isotherme ( e.g . RCA, LAMP, RPA, LAMP-QUASR, etc.) qui ne nécessitent pas de thermocyclage, A noter que l’amplification d’ARN nécessite en amont une étape de rétro-transcription (RT) de l’ARN en ADN par le biais d’enzyme particulières (i.e. retro-transcriptases virales, etc.), laquelle étape est également effectuée au niveau des pastilles (13a et 13b) et dont les outils moléculaires peuvent être également lyophilisés. Au sens de l’invention, on entend donc par « amplification » l’étape de retro-transcription d’un ARN cible (i.e. porteur de ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt) en ADN et l’étape d’amplification de cet ADN par une polymérase. Par conséquent, si ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon à tester provient d’une séquence d’ARN (e.g. ARN génomique viral dont on cherche à détecter la présence), il est essentiel que le dispositif comprennent les moyens permettant sa rétro-transcription et son amplification, puis sa détection (e.g. RT-LAMP, RT-LAMP-QUASR, etc.).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
■ une polymérase ;
■ des dNTPs ;
■ un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB ; et
■ un agent intercalant.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
■ une rétro-transcriptase ;
■ une polymérase ;
■ des dNTPs ;
■ un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB ; et
■ un agent intercalant.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
■ une polymérase ;
■ des dNTPs ;
■ un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB, dont l’une au moins, à l’exception de l’amorce F3 et de l’amorce B3, est modifiée en 5’ par l’ajout d’un fluorophore ; et
■ au moins un oligonucléotide complémentaire de l’amorce FIP, de l’amorce BIP, de l’amorce LoopF ou de l’amorce LoopB, ledit oligonucléotide étant apte à se coupler de manière réversible à l’amorce dont il est le complémentaire et ledit oligonucléotide étant modifié en 3’ par un quencher. Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
■ une polymérase ;
■ des dNTPs ;
■ un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB, dont les amorces FIP, BIP, LoopF et LoopB sont modifiés en 5’ par l’ajout d’un fluorophore ; et
■ quatre oligonucléotides complémentaires des amorces FIP, BIP, LoopF et LoopB, lesdits oligonucléotides étant aptes à se coupler de manière réversible aux amorces dont ils sont le complémentaire et lesdits oligonucléotides étant modifiés en 3’ par un quencher.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
■ une rétro-transcriptase ;
■ une polymérase ;
■ des dNTPs ;
■ un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB, dont l’une au moins, à l’exception de l’amorce F3 et de l’amorce B3, est modifiée en 5’ par l’ajout d’un fluorophore ; et
■ au moins un oligonucléotide complémentaire de l’amorce FIP, de l’amorce BIP, de l’amorce LoopF ou de l’amorce LoopB, ledit oligonucléotide étant apte à se coupler de manière réversible à l’amorce dont il est le complémentaire et ledit oligonucléotide étant modifié en 3’ par un quencher.
Selon un mode particulier de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique, lesdits réactifs lyophilisés étant au moins :
■ une rétro-transcriptase ;
■ une polymérase ;
■ des dNTPs ;
■ un jeu d’au moins six amorces comprenant l’amorce F3, l’amorce B3, l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB, dont les amorces FIP, BIP, LoopF et LoopB sont modifiés en 5’ par l’ajout d’un fluorophore ; et
■ quatre oligonucléotides complémentaires des amorces FIP, BIP, LoopF et LoopB, lesdits oligonucléotides étant aptes à se coupler de manière réversible aux amorces dont ils sont le complémentaire et lesdits oligonucléotides étant modifiés en 3’ par un quencher.
Parmi les réactifs lyophilisés, du MgSC , de la Bétaïne et du Tréhalose peuvent être ajoutés et lyophilisés.
Par « rétro-transcriptase », également appelé transcriptase inverse, on entend une enzyme capable de convertir de l’ARN en ADN. Celle-ci peut être l’AMV rétrotranscriptase ou tout autre transcriptase inverse purifiées à partir d’un rétrovirus ou rétrotransposon, ou tout autre transcriptase inverse ayant subie des optimisation à type d’évolution dirigée ou autre pour en améliorer les performances. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ladite rétro-transcriptase est l’AMV rétrotranscriptase.
Par « polymérase », on entend une enzyme capable de répliquer de l’ADN en ADN. Celle-ci peut être l’enzyme polymérase Bst, l’enzyme polymérase GspSSD ou tout autre enzyme polymérase employée dans une amplification d’acide nucléique (à type de PCR ou d’amplification isotherme). En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ladite polymérase est choisi parmi : l’enzyme polymérase Bst et l’enzyme polymérase GspSSD.
Par « dNTPs », on entend le mélange des quatre désoxyribonucléotides : dATP (désoxy adénine tri-phosphate), dCTP (désoxy cytosine tri-phosphate), dGTP (désoxy guanine tri-phosphate) et dTTP (désoxy thymine tri-phosphate).
Par « un jeu d’au moins six amorces », on entend des séquences d’acides nucléiques permettant l’amplification isotherme d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique à tester. Par ailleurs, par « dont l’une au moins ... est modifiée en 5’ par l’ajout d’un fluorophore », on entend qu’une, deux, trois ou quatre amorces sont modifiées en 5’ par l’ajout d’un fluorophore à l’exception des amorces F3 et B3 qui eux ne sont jamais modifiés. Ces amorces modifiées en 5’ par l’ajout d’un fluorophore peuvent être également appelées sondes puisqu’elles permettent la détection du signal. De préférence, l’invention en met en oeuvre quatre, modifiés en 5’, à savoir : l’amorce FIP, l’amorce BIP, l’amorce LoopF et l’amorce LoopB. En particulier ces au moins six amorces peuvent être :
■ les amorces de séquences SEQ ID NOs : 1 à 6 permettant de détecter une séquence d’acides nucléiques d’intérêt du virus de la Dengue de sérotype 2 (DENV2) ; ou
■ les amorces de séquences SEQ ID NOs : 7 à 12 permettant de détecter une séquence d’acides nucléiques d’intérêt du virus SARS-CoV-2 responsable du COVID-19 (Lin Yu et al., Rapid colorimétrie détection of COVID-19 coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic plat-form: iLACO ;
DOI : 10.1101/2020.02.20.20025874).
Par « oligonucléotide », on entend une séquence d’une dizaine de nucléotide. Par exemple un oligonucléotide de 5 à 20 nucléotides, c’est-à-dire de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucléotides. Par « oligonucléotide complémentaire », on entend un oligonucléotide qui peut se lier spécifiquement à une séquence d’acides nucléiques. En l’espèce, il s’agit d’oligonucléotides complémentaires des amorces FIP, BIP, LoopF et LoopB, dont l’un au moins, ou deux, ou trois et de préférence les quatre sont modifiés en 3’ par un quencher. Ce dernier est un quencher capable d’éteindre le fluorophore greffé en 5’ d’un ou des amorces FIB, BIP, LoopF et/ou LoopB. En particulier, cet au moins un et de préférence quatre oligonucléotides sont choisis parmi les séquences SEQ ID NOs : 13 à 17 dont :
■ la séquence SEQ ID NO : 13 est complémentaire de l’amorce BIP de séquence SEQ ID NO : 4 utilisé dans le diagnostic d’une infection au virus de la Dengue de sérotype 2 ; et
■ les séquences SEQ ID NOs : 14 à 17 sont respectivement les complémentaires des séquences SEQ ID NOs : 9 à 12 utilisés dans le diagnostic d’une infection au virus SARS-CoV-2.
Par « agent intercalant », on entend une molécule capable de s’intercaler de manière réversible dans l’ADN et de devenir fluorescente lorsqu’elle est dans la double hélice. Celui-ci peut être du SYBRGreen, un fluorophore de type SYTO (SYT09, SYT082, etc.), de l’EvaGreen, du bromure d’éthidium ou tout autre agent intercalant de l’ADN employé dans le suivi d’amplification d’acide nucléique en temps réel. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ledit agent intercalant est choisi parmi : le SYBRGreen, un fluorophore de type SYTO (SYT09, SYT082, etc.), l’EvaGreen et le bromure d’éthidium.
Par « fluorophore », également appelé fluorochrome, on entend une substance chimique ou protéique capable d’émettre de la lumière de fluorescence après excitation. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ledit fluorophore est choisi parmi : les fluorophores de type Alexa Fluor (Alexa 350, Alexa 488, alexa 555, Alexa 647, etc.), les fluorophores de types Cyanine (CY3, CY3.5, CY5, etc.), les fluorophores de type FAM ( fluorescein amidite), Nsothiocyanate de fluorescéine (FITC), les fluorophores de type FIEX, les fluorophores de Texas Red et les fluorophore de type ATTO. De préférence, les fluorophores de type FAM et les fluorophores de Texas Red sont utilisés.
Par « quencher », également appelé désactivateur, on entend une substance chimique ou protéique capable de désactiver (d’éteindre) l’état excité d’un fluorophores. En particulier, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel ledit quencher est choisi parmi : le DabCyl, le BHQ-1 , le BFIQ-2, le BFIQ-3, le Cy5Q, le Cy7Q, l’Iowa Black FQ, l’Iowa Black RQ, l’IRDye QC- 1, l’QSY35, le QSY7, le QXL520, le QXL570, le QXL610 et le QXL680. De préférence, les quenchers lowa Black FQ et lowa Black RQ sont utilisés.
Il convient toutefois de noter que l’invention lorsqu’elle utilise une technologie d’amplification isotherme et de détection via un système fluorophore/quencher (e.g. (RT)-LAMP-QUASR), il est essentiel de choisir le bon couple. Le tableau 1 ci-après (Peng, X. et al., 2009, A nonfluorescent, broad-range quencher dye for Forster résonance energy transfer assays. Analytical biochemistry, 388(2), 220-228) permet de réaliser ce choix. Par exemple, si le fluorophore utilisé est le Texas Red alors il est préférable d’utiliser l’Iowa Black RQ.
Tableau 1. Liste des fluorophores et des quenchers spectralement compatibles (case grisée = compatible) Tel que décrit ci-dessus, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention comprend une seule unité de détection (4) et permet de ne tester qu’un seul échantillon biologique. Avantageusement, celui-ci peut être configuré pour accueillir différentes unités de détection réparties sur l’ensemble des disques supérieur (3) et inférieur (5). Cette configuration offre ainsi à l’utilisateur un dispositif multi-échantillons très pratique de par sa polyvalence puisque selon sa configuration celui-ci peut servir :
■ soit à partir d’un échantillon, de réaliser différents diagnostics ( e.g . virus Zika, SARS-CoV-2, VIH, Salmonella, etc.) ;
■ soit à partir de plusieurs échantillons, de réaliser un seul type de diagnostic {e.g. virus Zika ou SARS-CoV-2 ou VIH ou Salmonella, etc.) ;
■ soit à partir de plusieurs échantillons, de réaliser différents diagnostics {e.g. virus Zika, SARS-CoV-2, VIH, Salmonella, etc.).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même rayon du disque supérieur.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même arc de cercle du disque supérieur.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant :
■ au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même rayon du disque supérieur, et
■ au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même arc de cercle du disque supérieur.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant :
■ au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même rayon du disque supérieur, ou
■ au moins deux unités de détection qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même arc de cercle du disque supérieur. Avantageusement et suivant cette configuration multi-échantillons, les fenêtres (9) disposées sur le disque supérieur (3) des unités de détection disposées sur un même rayon peuvent être regroupées et n’en former qu’une. Il en est de même pour les éventuels évidements (6) disposés sur un même rayon sur le disque inférieur (5) qui peuvent n’en former qu’un. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel :
■ les fenêtres (9) disposées sur un même rayon du disque supérieur (3) sont regroupées et n’en forme qu’une, et/ou
■ les éventuels évidements (6) disposés sur un même rayon du disque inférieur (5) sont regroupés et n’en forme qu’un.
Alternativement et au regard de cette configuration multi-échantillons, l’invention peut être définie comme étant un dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boite cylindrique fermée plate comprenant :
■ un disque inférieur (5) ; et
■ un disque supérieur (3), les deux disques étant :
■ montés l’un sur l’autre et mobiles l’un par rapport à l’autre de sorte que le disque supérieur (3) est apte à effectuer un mouvement de rotation sur le disque inférieur (5) dans les deux sens de rotation possibles ; et
■ segmentés en x blocs de diagnostic (2), x étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 et chaque bloc de diagnostic comprenant y unités de détection (4) d’échantillons à tester, chaque unité de détection comprenant :
- un réceptacle comprenant un matériau absorbant (15) disposé soit sur la surface supérieure du disque inférieur (5), soit intégré dans la masse de ladite surface supérieure du disque inférieur (5), et ledit matériau absorbant (15) étant capable de contenir un volume d’au moins 1 ml_ ;
- une zone réactionnelle (12) disposée dans le disque inférieur, ladite zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes sur un même cercle du disque inférieur (5) ou un même rayon du disque inférieur (5), et dont l’une au moins comprend éventuellement à sa surface des réactifs lyophilisés permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon à tester ;
- éventuellement un évidemment (6) disposé dans le disque inférieur (5), ledit évidement (6) étant muni d’un matériau étanche (10), ledit évidement (6) muni d’un matériau étanche (10) étant au droit de la zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, et ledit matériau étanche (10) étant soit positionné sur l’évidement (6) de façon amovible, soit intégré dans la masse du disque inférieur (5) ;
- une ouverture réceptrice (7) disposée dans le disque supérieur (3), ladite ouverture étant :
• positionnée sur un cercle du disque supérieur, lequel cercle est parallèle au cercle du disque inférieur (3) sur lequel est positionnée la susdite zone réactionnelle (12) ;
• équipée d’une membrane (8) biologiquement compatible permettant l’extraction et la rétention des acides nucléiques de l’échantillon à tester en présence des réactifs appropriés ; et
• apte à être positionnée au droit de la susdite zone réactionnelle et de la recouvrir en partie ou en totalité ; et
- une fenêtre (9) disposée dans le disque supérieur (3), ladite fenêtre (9) étant munie d’un filtre optique (11 ), ladite fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) étant apte à être positionnée au droit de la zone réactionnelle (12) de l’unité de détection (4), et ledit filtre optique (11) étant soit positionné sur la fenêtre (9) de façon amovible, soit intégré dans la masse du disque supérieur (3), y étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 et lorsque qu’y est supérieur ou égal à 2, les différents éléments du disque inférieur (5) et du disque supérieur (3) des unités de détection (4) sont respectivement adjacents et indépendants le long d’un rayon respectif du disque inférieur (5) et du disque supérieur (3), et chaque bloc de diagnostic (2) étant configuré de sorte que le disque supérieur (3) peut, par rotation d’un angle d’au moins 30°, passer :
■ d’une première position dans laquelle :
- l’ouverture réceptrice (7) équipée d’une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) se trouve au droit du matériau absorbant (15) de ladite unité de détection (4) pour permettre l’extraction et la rétention des acides nucléiques dudit échantillon à tester ; et
- la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4),
■ à une seconde position dans laquelle :
- l’ouverture réceptrice (7) équipée d’une membrane (8) biologiquement compatible de ladite unité de détection (4) se trouve au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4) et la recouvre en partie ou en totalité pour permettre l’élution des acides nucléiques dudit échantillon à tester en présence des réactifs appropriés, lesdits acides nucléiques par gravité se retrouvant sur lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite unité de détection (4) ; et
- la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve décalée d’un angle d’au moins 30°,
■ puis de se positionner sur ladite première position de sorte que la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve de nouveau au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4) pour former une chambre d’amplification et de détection sensiblement hermétique et sensiblement étanche, ladite chambre permettant l’amplification et le détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon à tester.
De la même façon, le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position peut donc se faire soit par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position, soit par une rotation dans le même sens que celle-ci. Avantageusement, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boite cylindrique fermée plate tel que décrit ci-dessus comprenant :
■ un disque inférieur (5) ; et
■ un disque supérieur (3), les deux disques étant :
■ montés l’un sur l’autre et mobiles l’un par rapport à l’autre de sorte que le disque supérieur (3) est apte à effectuer un mouvement de rotation sur le disque inférieur (5) dans les deux sens de rotation possibles ; et
■ segmentés en x blocs de diagnostic (2), x étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 et chaque bloc de diagnostic comprenant y unités de détection (4) d’échantillons à tester, chaque unité de détection comprenant :
- un réceptacle comprenant un matériau absorbant (15) disposé soit sur la surface supérieure du disque inférieur (5), soit intégré dans la masse de ladite surface supérieure du disque inférieur (5), et ledit matériau absorbant (15) étant capable de contenir un volume d’au moins 1 ml_ ;
- une zone réactionnelle (12) disposée dans le disque inférieur, ladite zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes sur un même cercle du disque inférieur (5) ou un même rayon du disque inférieur (5), et dont l’une au moins comprend éventuellement à sa surface des réactifs lyophilisés permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon à tester ; - éventuellement un évidemment (6) disposé dans le disque inférieur (5), ledit évidement (6) étant muni d’un matériau étanche (10), ledit évidement (6) muni d’un matériau étanche (10) étant au droit de la zone réactionnelle (12) et solidaire à celle-ci, et en particulier permettant à la lumière d’atteindre lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, et ledit matériau étanche (10) étant soit positionné sur l’évidement (6) de façon amovible, soit intégré dans la masse du disque inférieur (5) ;
- une ouverture réceptrice (7) disposée dans le disque supérieur (3), ladite ouverture étant :
• positionnée sur un cercle du disque supérieur, lequel cercle est parallèle au cercle du disque inférieur (3) sur lequel est positionnée la susdite zone réactionnelle (12) ;
• équipée d’une membrane (8) biologiquement compatible permettant l’extraction et la rétention des acides nucléiques de l’échantillon à tester en présence des réactifs appropriés ; et
• apte à être positionnée au droit de la susdite zone réactionnelle et de la recouvrir en partie ou en totalité ; et
- une fenêtre (9) disposée dans le disque supérieur (3), ladite fenêtre (9) étant munie d’un filtre optique (11 ), ladite fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) étant apte à être positionnée au droit de la zone réactionnelle (12) de l’unité de détection (4), et ledit filtre optique (11) étant soit positionné sur la fenêtre (9) de façon amovible, soit intégré dans la masse du disque supérieur (3), y étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 et lorsque qu’y est supérieur ou égal à 2, les différents éléments du disque inférieur (5) et du disque supérieur (3) des unités de détection (4) sont respectivement adjacents et indépendants le long d’un rayon respectif du disque inférieur (5) et du disque supérieur (3), et chaque bloc de diagnostic (2) étant configuré de sorte que le disque supérieur (3) peut, par rotation d’un angle d’au moins 30°, passer :
■ d’une première position dans laquelle :
- l’ouverture réceptrice (7) équipée d’une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) se trouve au droit du matériau absorbant (15) de ladite unité de détection (4) pour permettre l’extraction et la rétention des acides nucléiques dudit échantillon à tester ; et
- la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4),
■ à une seconde position dans laquelle :
- l’ouverture réceptrice (7) équipée d’une membrane (8) biologiquement compatible de ladite unité de détection (4) se trouve au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4) et la recouvre en partie ou en totalité pour permettre l’élution des acides nucléiques dudit échantillon à tester en présence des réactifs appropriés, lesdits acides nucléiques par gravité se retrouvant sur lesdites au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles de ladite unité de détection (4) ; et
- la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve décalée d’un angle d’au moins 30°,
■ puis de revenir par rotation inverse à ladite première position de sorte que la fenêtre (9) munie d’un filtre optique (11) de ladite unité de détection (4) se trouve de nouveau au droit de la zone réactionnelle (12) de ladite unité de détection (4) pour former une chambre d’amplification et de détection sensiblement hermétique et sensiblement étanche, ladite chambre permettant l’amplification et le détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon à tester, et chaque bloc de diagnostic (2) étant également configuré de sorte que la ou les fenêtres (9a et 9b) munies d’un filtre optique (11) d’une ou des unités de détection (4) d’un bloc de diagnostic (2) ne puissent pas être au droit du ou des réceptacles comprenant un matériau absorbant (15) dudit bloc de diagnostic (2) ou d’un autre bloc de diagnostic (2’) quelle que soit la position du disque supérieur (3) par rapport au disque inférieur (5).
L’ensemble des modes de réalisation étant compatibles les uns avec les autres et pouvant être combinés les uns avec les autres, ces derniers s’appliquent à cette définition alternative de l’invention. L’inverse est également vrai. De plus, l’ensemble des définitions fournies s’applique à tous les modes de réalisation décrits.
Par « x étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 », on entend que x peut être égale à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. On entend également qu’x peut être compris de 1 à 10, de 1 à 5, de 2 à 10, de 4 à 8. Par « y étant un nombre entier supérieur ou égal à 1 », on entend qu’y peut être égale à 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. On entend également qu’y peut être compris de 1 à 20, de 1 à 6, de 1 à 12, de 1 à 5, de 1 à 10, de 5 à 15 ou de 10 à 20.
Par « un angle d’au moins 30° », on entend que la rotation du disque supérieur (3) sur le disque inférieur (5) peut être de 30°, 35°, 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, 75°, 80°, 85°, 90°, 95°, 100°, 105°, 110°, 115°, 120°, 125°, 130°, 135°, 140°, 145°, 150°, 155°, 160°, 165°, 170°, 175°, 180°, 185°, 195°, 200°, 205°, 210°, 215°, 220°, 225°, 230°, 235°, 240°, 245°, 250°, 255°, 260°, 265°, 270°, 275°, 280°, 285°, 295°, 300°, 305°, 310°, 315 ou de 320° voire de 360° laissant le disque supérieur (3) tourner librement (i.e. faire un tour complet) sur le disque inférieur (5) et vice versa. On entend également un angle compris de 30° à 320°. Bien entendu, il convient de noter que l’angle de rotation possible est fonction du nombre de blocs de diagnostic (2) que l’on dispose sur le dispositif de diagnostic (1) de l’invention et ce, afin que l’ensemble des blocs de diagnostic fonctionnent, de préférence, simultanément.
En particulier, selon cette alternative l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel x et y sont choisis parmi les couples :
■ x = 1 et y = 1 (correspondant à la configuration un échantillon biologique) ;
■ x = 1 et y est compris de 1 à 6 ;
■ x = 2 et y est compris de 1 à 6 ; ■ x = 3 et y est compris de 1 à 6.
Selon cette alternative, l’invention concerne avantageusement le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel chacun des x blocs de diagnostic (2) comprend y unités de détection (4) dont l’ensemble des y fenêtres (9) munies d’un filtre optique (11 ) disposées sur le disque supérieur (3) n’en forme qu’une.
Selon cette alternative, l’invention concerne avantageusement le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel chacun des x blocs de diagnostic (2) comprend y unités de détection (4) dont l’ensemble des y éventuels évidements (6) munis d’un matériau étanche (10) disposés sur le disque inférieur (5) n’en forme qu’un.
Selon cette alternative, l’invention concerne également le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus dans lequel chacun des x blocs de diagnostic (2) comprend y unités de détection (4) dont l’ensemble des y fenêtres (9) munies d’un filtre optique (11 ) disposées sur le disque supérieur (3) n’en forme qu’une et dont l’ensemble des y éventuels évidemment (6) munis d’un matériau étanche (10) disposés sur le disque inférieur (5) n’en forme qu’un.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (1) tel que décrit ci-dessus comprenant en outre des moyens, notamment :
■ au moins une pince capable de saisir ledit dispositif et d’appliquer une pression permettant de bloquer et de serrer le disque supérieur sur le disque inférieur, ladite pression assurant l’herméticité et l’étanchéité du dispositif, et équipée d’un système chauffant apte à être positionné au droit de la ou des zones réactionnelles du dispositif évitant la création d’un gradient de température sur la ou les zones réactionnelles à chauffer.
Un second aspect de l’invention concerne l’utilisation du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus pour détecter in vitro au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester. Cette au moins une séquence d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) d’intérêt pouvant être : ■ une séquence d’acides nucléiques présente dans le génome d’un pathogène (virus, bactérie, microorganisme, etc.), ou
■ une séquence d’acides nucléiques présente dans le génome (ADN) ou le transcriptome (ARN) d’un mammifère ( e.g . l’Homme) dont la présence serait en lien avec une prédisposition à une pathologie, l’utilisation selon l’invention permet le diagnostic d’infections dues à un ou plusieurs pathogènes et également le diagnostic de maladies génétiques. Cette utilité et cette polyvalence du dispositif de diagnostic (1) de l’invention sont bien sûr conditionnées par les réactifs (outils moléculaires) éventuellement lyophilisés à la surface d’une ou des pastilles dites « test ». Par exemple, s’il y est lyophilisé (ou ajouté extemporanément), l’ensemble des amorces permettant la détection d’au moins une séquence d’acides nucléique du coronavirus SARS-CoV-2, l’utilisation décrite permet de diagnostiquer une infection à ce virus. De même, s’il y est lyophilisé (ou ajouté extemporanément), l’ensemble des amorces permettant la détection d’au moins une séquence d’acides nucléique du virus de la Dengue de sérotype 1, l’utilisation décrite permet de diagnostiquer une infection à ce virus. Etc.
Avantageusement, la configuration multi-échantillons permet de diagnostiquer pour un ou plusieurs échantillons biologiques à tester plusieurs types d’infections. Par exemple, dans la configuration ou x = 2 et y = 3, un bloc de diagnostic serait utilisé pour tester in vitro un premier échantillon biologique et détecter in vitro s’il souffre d’une infection au virus de la grippe, au virus du COVID-19 (SARS-CoV-2) et/ou à la bactérie Staphylococcus aureus, et le second bloc de diagnostic serait utilisé pour tester in vitro un second échantillon biologique et détecter in vitro s’il souffre d’une infection au virus de la grippe, au virus du COVID-19 (SARS-CoV-2) et/ou à la bactérie Staphylococcus aureus. Cette exemple peut être généralisé à x bloc de diagnostic pour x échantillons biologiques, chacun des x blocs comprenant y unités de détection permettant de tester in vitro la présence (ou non) d’y infections virales, bactériennes ou liées à d’autres microorganismes (e.g. champignon). De la même manière, le dispositif de diagnostic (1) de l’invention peut être utilisé pour tester in vitro y maladies génétiques.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne donc l’utilisation telle que décrite ci-dessus pour détecter in vitro une infection virale ( e.g . VIH, virus de la Dengue, virus Zika, virus Sigma 3, SARS-CoV-2, etc.), une infection bactérienne (e.g. Salmonelle, Pseudomonas, Staphylococcus, Escherichia, Streptococcus, Hélicobacter, etc.), une infection liée à un microorganisme (e.g. champignon) et/ou une maladie génétique (e.g. mucoviscidose, neurofibromatose de type 1, hémophilie, trisomie 21, myopathie, etc.). En particulier, l’invention concerne l’utilisation telle que décrite ci-dessus pour détecter in vitro une infection virale. L’invention concerne également l’utilisation telle que décrite ci-dessus pour détecter in vitro une infection virale et en particulier pour détecter in vitro une infection virale au SARS-CoV-2. De préférence, l’invention concerne l’utilisation telle que décrite ci-dessus pour détecter in vitro une infection virale au SARS-Cov-2. Comme évoqué précédemment, ce mode de réalisation de l’invention est conditionné par l’utilisation, par exemple, des amorces de séquences SEQ ID NO : 7 à 12 sur la pastille test présente sur la zone réactionnelle (12).
Un autre aspect de l’invention concerne le procédé de détection in vitro d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester, ledit procédé étant mis en œuvre à l’aide du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus.
En particulier, l’invention concerne le procédé de détection in vitro d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester, ledit procédé étant mis en œuvre à l’aide du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus et ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. extraire les acides nucléiques de l’échantillon biologique à tester sur une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) ; b. tourner le disque supérieur (3) pour positionner ladite membrane (8) biologiquement compatible au droit de la zone réactionnelle (12) de cette unité de détection et la recouvrir en partie ou en totalité ; c. éluer les acides nucléiques pour les faire passer de ladite membrane (8) biologiquement compatible aux au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) ; d. tourner le disque supérieur (3) pour revenir à la position initiale ; et e. amplifier puis détecter si une amplification d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique a eu lieu.
Selon la configuration du dispositif de diagnostic (1) de l’invention, la susdite étape d. peut se faire soit par une rotation inverse de celle de l’étape b., soit par une rotation dans le même sens que celle de l’étape b. Avantageusement, l’invention concerne le procédé de détection in vitro d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester, ledit procédé étant mis en oeuvre à l’aide du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus et ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. extraire les acides nucléiques de l’échantillon biologique à tester sur une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) ; b. tourner le disque supérieur (3) pour positionner ladite membrane (8) biologiquement compatible au droit de la zone réactionnelle (12) de cette unité de détection et la recouvrir en partie ou en totalité ; c. éluer les acides nucléiques pour les faire passer de ladite membrane (8) biologiquement compatible aux au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) ; d. tourner le disque supérieur (3) dans le sens inverse pour revenir à la position initiale ; et e. amplifier puis détecter si une amplification d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique a eu lieu.
Puisque le procédé ci-dessus implique l’utilisation du dispositif de diagnostic (1) de l’invention, tout ce qui s’applique aux utilisations (définitions, etc.) s’applique également aux procédés.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé tel que décrit ci- dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. déposer l’échantillon biologique à tester sur une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) ; b. extraire les acides nucléiques de l’échantillon biologique à tester au niveau de cette membrane (8) biologiquement compatible ; c. laver ladite membrane (8) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) ; b. tourner le disque supérieur (3) pour positionner ladite membrane (8) biologiquement compatible au droit de la zone réactionnelle (12) de cette unité de détection et la recouvrir en partie ou en totalité ; c. sécher ladite membrane (8) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) d. éluer les acides nucléiques pour les faire passer de ladite membrane (8) biologiquement compatible aux au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) ; e. tourner le disque supérieur (3) dans le même sens qu’à l’étape b. ou dans le sens inverse de l’étape b. pour revenir à la position initiale ; f. chauffer à 65°C pendant 40 min la zone réactionnelle (12) pour amplifier ladite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique ; et g. détecter si une amplification d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique a eu lieu.
Que l’invention concerne les utilisations telles que décrites ci-dessus ou les procédés tels que décrits ci-dessus, l’observation d’un signal positif ( e.g . émission de lumière par fluorescence, apparition d’une coloration) au niveau de la pastille test signifie que ladite au moins une séquence d’acides nucléiques (ADN et/ou ARN) a été amplifiée et est présente dans l’échantillon biologique. Par exemple, s’il était voulu de tester in vitro une infection au SARS-CoV-2 chez un patient, l’observation de ce signal positif signifie que le patient est infecté par le coronavirus SARS-CoV-2 et souffre du COVID-19. A l’inverse et par exemple, s’il était voulu de tester in vitro une infection au SARS-CoV-2 chez un patient, l’inobservation d’un signal positif signifie que le patient n’est pas infecté par le coronavirus SARS-CoV-2 et ne souffre pas du COVID-19. Toutefois, pour s’assurer de la véracité de ce test in vitro, il convient de considérer également les résultats d’un contrôle positif et/ou d’un contrôle positif, lesquels peuvent être réalisés en dehors du dispositif de diagnostic (1) de l’invention. De préférence, ces contrôles sont intégrés au dispositif de diagnostic (1) de l’invention via la pastille contrôle positif qui doit toujours révéler un signal positif et/ou via la pastille contrôle négatif qui doit toujours révéler un signal négatif (i.e. absence de fluorescence, absence de couleur). Si ce n’est pas le cas à l’issue du test, celui-ci est invalidé et dot être refait. La présence d’une seconde pastille sur la zone réactionnelle est donc préférée pour la fiabilité et la sûreté du test de diagnostic in vitro que permet de mettre en œuvre le dispositif de diagnostic (1) de l’invention. Par ailleurs, il convient de noter que l’observation des signaux sur chacune des pastilles obtenus par colorimétrie, fluorométrie, etc., peut être réalisé au moyen de l’œil humain, de caméra ou d’appareil photo classiquement utilisés en laboratoire ou en hôpital. Il peut même s’agir d’appareil photo de smartphone. De plus et selon la technologie de détection choisie, il est possible de réaliser un suivi cinétique du test (e.g. (RT)-LAMP) ou un suivi « point final » ( e.g . (RT)-LAMP-QUASR).
Un autre aspect de l’invention concerne le procédé de fabrication (e.g. industriel) du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci- dessus. En particulier, l’invention concerne le procédé de fabrication du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. fabriquer (e.g. impression 3D ou injection dans un moule) les disques supérieur (3) et inférieur (5) ; b. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15) et au moins un filtre optique (11) ; et c. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de fabrication tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. fabriquer (e.g. impression 3D ou injection dans un moule) les disques supérieur (3) et inférieur (5) ; b. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15), au moins un filtre optique (11 ) et éventuellement au moins un matériau étanche (10) ; et c. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de fabrication tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. fabriquer ( e.g . impression 3D) les disques supérieur (3) et inférieur (5) ; b. laver les disques supérieur (3) et inférieur (5) avec une solution RNA free ; c. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15), au moins un filtre optique (11 ) et éventuellement au moins un matériau étanche (10) ; et d. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de fabrication tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. fabriquer {e.g. impression 3D) les disques supérieur (3) et inférieur (5) ; b. laver les disques supérieur (3) et inférieur (5) avec une solution RNA free ; c. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15), au moins un filtre optique (11 ) et éventuellement au moins un matériau étanche (10) ; d. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5) ; et e. lyophiliser sur au moins une pastille (13a ou 13b) des réactifs aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique.
Alternativement, l’invention concerne le procédé de fabrication tel que décrit ci- dessus, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. fabriquer {e.g. impression 3D) les disques supérieur (3) et inférieur (5) ; b. lyophiliser sur au moins une pastille (13a ou 13b) des réactifs aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique. c. laver les disques supérieur (3) et inférieur (5) avec une solution RNA free ; d. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15), au moins un filtre optique (11 ) et éventuellement au moins un matériau étanche (10) ; et e. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5).
Selon les besoins de l’utilisateur, des variantes de l’invention peuvent être développées, lesquelles reprennent et/ou s’intégrent et/ou peuvent être combinées aux aspects (définitions) décrits ci-dessus.
L’une d’entre elles, concerne la mise en œuvre de façon automatique du dispositif de diagnostic de l’invention. En particulier, celle-ci peut être mise en œuvre en faisant appel à deux dispositifs, à savoir un premier dispositif, dit ci-après « dispenseur » (20), et un second dispositif, dit ci-après « détecteur » (21). Aux fins de l’invention, ces deux dispositifs peuvent être utilisés indépendamment l’un de l’autre, ou en combinaison et seront alors désignés ci-après par le « système de diagnostic » (22). On notera que bien entendu le dispositif de diagnostic (1 , 31 ), le dispenseur (20) et le détecteur (21) peuvent l’objet d’une utilisation combinée ou individuelle.
Est représenté sur les figures 12 et 13 un exemple d’un dispenseur (20) suivant l’invention. Dans cet exemple il se présente sous la forme d’un boîtier comprenant un socle (23) fermé par un capot (24) articulé autour d’une charnière. Le socle (23) est creusé d’une cavité circulaire (25) destinée à recevoir un dispositif de diagnostic (31), le fond de cette cavité (25) étant pourvu de moyens, non représentés sur le dessin, assurant l’immobilisation en rotation de la base du dispositif de diagnostic (31), ainsi qu’expliqué ci-après.
Le dispositif de diagnostic (31), qui est représenté en vue éclatée sur la figure 14, reprend certains des éléments essentiels du dispositif de diagnostic (1) décrit précédemment avec quelques aménagements destinés à assurer son fonctionnement au sein de moyens automatisés. Pour la clarté de la description sont conservées pour les éléments semblables les mêmes références augmentées d’une valeur de 30.
Le dispositif de diagnostic (31) comprend ainsi deux disques concentriques superposés, à savoir un disque supérieur (33) et un disque inférieur (35) qui sont montés à rotation autour d’un axe yy’ perpendiculaire en leur centre O.
Le disque supérieur (33) comporte une zone de prélèvement formée d’un bossage cylindrique (50) dont la base a sensiblement la forme d’un ovale. Ce bossage est creusé d’un évidement dont la base est percée de deux ouvertures réceptrices (52a et 52b) qui sont chacune pourvues d’une membrane de capture (38), respectivement (38a et 38b), biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de l’échantillon biologique prélevé en présence de réactifs appropriés. Ces deux ouvertures réceptrices (52a et 52b) sont disposées légèrement écartées l’une de l’autre sur un même rayon r1 du disque (33), ainsi que représenté sur la figure 15.
Bien entendu, ainsi que dans la réalisation précédente, une seule ouverture (37) allongée suivant le rayon n et fermée par une membrane biologiquement compatible (38) pourrait être réalisée, ainsi que représenté sur la figure partielle 16.
Sur le bossage cylindrique (50), peut être positionné un entonnoir (49) amovible équipé de deux ouvertures lesquelles sont disposées en regard des deux ouvertures (52a et 52b). Cet entonnoir peut également être équipé d’une seule ouverture. Cet entonnoir permet d’éviter la contamination. En effet, l’entonnoir (49) sert à empêcher le contact du produit de lyse avec la zone de dépôt de l'échantillon (la partie recouverte par l'entonnoir) et son utilisation est préférée. Si tel n’est pas le cas en mode manuel, il existe alors un risque que le produit de lyse mouille la zone de dépôt de l'échantillon. Se faisant, lorsqu'est ensuite déposé le produit de rinçage (e.g. éthanol 70%), celui-ci peut se mélanger aux traces de produit de lyse restant éventuellement à la surface de la zone de dépôt de l'échantillon. Le produit de rinçage devient alors pollué par du produit de lyse. Après rinçage, il resterait alors des traces de produit de lyse sur les membranes, lesquelles seraient éluées dans les membranes réactionnelles avec les ARN capturés lors de l'étape d'élution. Finalement et si cela arrive, une inhibition non souhaitée de la réaction d’amplification serait créée, laquelle peut être évitée par le biais de l’utilisation de l’entonnoir (49), d’où son intérêt.
Dans le cas de l'utilisation automatique, la dépose de l'échantillon n'est pour l'instant pas différente de celle faite dans le cas de l'utilisation manuelle. Les mêmes contraintes s'appliquent et l'utilisation de l’entonnoir (49) est recommandé pour les raisons évoquées ci-dessus.
Le disque supérieur (33) est percé d’une fente radiale (53) d’axe r3 et de largeur a dont la fonction sera exposée ci-après, et qui forme avec l’axe n un angle au centre a dont la valeur est au moins égale à 30° et préférentiellement dans le présent exemple de l’ordre de 60°. Il est également percé à proximité de sa périphérie d’une fente circulaire (51) s’étendant suivant un angle au centre b légèrement supérieur à l’angle a et dont la fonctionnalité sera précisée ci-après.
Le disque inférieur (35), ainsi que représenté sur les figures 14 et 17, comporte un trou central (54) qui est destiné à recevoir un téton central (55) réalisé sous le disque supérieur (33), ce qui permet d’assurer la rotation relative des deux disques. Le disque inférieur (33) comporte sur sa face supérieure un téton (60) disposé de façon telle qu’il vienne se loger dans la fente circulaire (51) du disque supérieur (33) lorsque les deux disques sont superposés en position de fonctionnement. On comprend dans ces conditions que la valeur de l’angle au centre b de la fente circulaire (51) permet de contrôler l’angle de rotation minimal et maximal du disque supérieur (33) par rapport au disque inférieur (35).
Ainsi que représenté sur les figures 14 et 17 le disque inférieur (35) est percé d’une fente radiale (56) d’axe r’3 et de largeur a^ légèrement inférieure à la largeur a de la fente radiale (53) du disque supérieur. Les côtés de cette fente sont pourvus de moyens de préhension, constitués par exemple de dents (57), qui sont destinés à assurer le maintien d’une capsule, ainsi qu’expliqué ci-après. Le disque inférieur (35) est également traversé par une fenêtre radiale (58) d’axe r’2 et qui forme avec l’axe r’3 de la fente (56) un angle au centre égal, dans le présent exemple, à a/2.
Le disque inférieur (35) est pourvu d’une cuvette (59) de forme sensiblement trapézoïdale qui est destinée à recevoir un matériau absorbant (45) d’un certain volume, de façon à permettre l’extraction et la rétention des acides nucléiques, et à recueillir le trop-plein de l’échantillon biologique à tester et des réactifs d’ extraction des acides nucléiques et de lavage. Cette cuvette (59) est disposée de façon telle qu’un axe radial r’1 formant avec l’axe r’2 un angle au centre égal à a/2 traverse ladite cuvette (59), ainsi que représenté sur la figure 17.
Suivant l’invention on donnera à l’angle au centre b définissant les dimensions de la fente circulaire (51) une valeur telle que, lorsque l’axe r1 du disque supérieur se trouve au droit de l’axe r’1 du disque inférieur, le téton (60) se trouve en butée contre une première extrémité de la rainure (51) empêchant ainsi toute rotation du disque supérieur dans le sens horaire, ainsi que représenté sur la figure 20, et que, lorsque l’axe r1 du disque supérieur se trouve au droit de l’axe r’3 du disque inférieur le téton (60) se trouve en butée contre la seconde extrémité de la rainure (51), ainsi que représenté sur la figure 22, empêchant ainsi toute rotation du disque supérieur dans le sens anti-horaire.
Tel que décrit, on comprend ainsi que le disque supérieur (33) est en mesure d’occuper trois positions remarquables par rapport au disque inférieur (35), à savoir :
- une première position, représentée sur la figure 20 dans laquelle les ouvertures réceptrices (52a et 52b) se trouvent situées au droit de la cuvette (59) destinée à contenir le matériau absorbant (45) (superposition des axes r1 et r’1) ;
- une deuxième position représentée sur la figure 22 dans laquelle les ouvertures réceptrices (52a et 52b) se trouvent au droit de la fente radiale (56) du disque inférieur (35) destinée à recevoir une capsule (62) (superposition des axes r1 et r’3) ; et
- une position intermédiaire, représentée sur la figure 21 dans laquelle les ouvertures réceptrices (52a et 52b) se trouvent au droit de la fenêtre radiale (58) (superposition des axes r1 et r’2).
Cette capsule (62), qui peut être réalisée dans un matériau choisi parmi : le polypropylène et notamment le polypropylène de grade alimentaire, et qui est représentée sur les figures 14 et 18 ; a une configuration globale allongée qui lui permet de prendre place dans la fente radiale (56) et de s’y maintenir, ainsi que représenté sur la figure 19. La partie interne de la capsule comporte trois bossages creux, respectivement (64a, 64b, et 64c). Les deux bossages creux les plus externes contiennent des pastilles réactives, respectivement (43a et 43b), qui sont biologiquement compatibles, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique en présence de réactifs appropriés.
La partie (62a) de la capsule (62) apte à être insérée dans la fente radiale (56) se prolonge par un couvercle (62b) qui lui est reliée par un lien (62c). La face interne de ce couvercle comporte également des bossages creux, respectivement (66a, 66b et 66c) dont le diamètre interne est légèrement supérieur au diamètre externe des bossages (64a, 64b et 64c) de façon à pouvoir s’encastrer sur ces derniers afin de les obturer.
Bien entendu la capsule (62) pourrait avoir toute autre forme et renfermer plus de deux pastilles réactives. Avantageusement, le couvercle (62b) de la capsule (62) est constitué notamment d’un matériau transparent, notamment un matériau de synthèse qui est teinté en jaune.
Comme indiqué précédemment et représenté sur la figure 13, la cavité (25) du dispenseur (20) est apte à recevoir le dispositif de diagnostic (31) et à assurer un blocage en rotation du disque inférieur (35). La partie supérieure du capot (24) comporte un disque rotatif (68) portant des empreintes lui permettant de se loger sur le disque supérieur (33) et de venir en prise avec ce dernier lorsque le capot (24) est refermé. Le disque rotatif (68) est mis en rotation par un moteur, notamment un moteur pas à pas, qui est piloté par une logique de commande sous le contrôle notamment d’un microcontrôleur et qui est en mesure de mettre le disque supérieur (33) dans les trois positions remarquables précédemment mentionnées, à savoir :
- la première position dans laquelle les ouvertures réceptrices (52a et 52b) se trouvent situées au-dessus du matériau absorbant (45) (superposition des axes r1 et r’1) ;
- la deuxième position dans laquelle les ouvertures réceptrices (52a et 52b) se trouvent situées au-dessus de la capsule (62) (superposition des axes r1 et r’3) ; et - la position intermédiaire dans laquelle les ouvertures réceptrices (52a et 52b) se trouvent situées au-dessus de la fenêtre radiale (58) (superposition des axes r1 et r’2).
Est représenté de façon schématique et à titre d’exemple sur la figure 23 un type d’agencement mis en oeuvre dans un dispenseur (20) suivant l’invention.
Ainsi le socle (23) comprend une alimentation (70) qui alimente en énergie une électronique de commande (72), pilotée par exemple par un microcontrôleur, qui assure la commande, via un étage de puissance (74), d’une première pompe doseuse (76) en relation avec un réservoir d’éthanol (78) de façon à injecter celui-ci au moyen d’une buse (80) dans la cavité (50) du dispositif de diagnostic ayant reçu l’échantillon.
Le socle (23) comprend également une seconde pompe doseuse (82) en relation avec un réservoir d’éluant (84) de façon à injecter celui-ci au moyen de deux buses (86a et 86b) sur les membranes de capture (38) respectivement contenues dans les ouvertures (52a et 52b) du dispositif de diagnostic (31 ).
Le socle (23) comprend également un moteur (88), par exemple un moteur pas à pas, en mesure sous la commande de l’électronique de commande, de positionner le disque supérieur dans chacune des trois positions précédemment mentionnées ainsi qu’expliqué précédemment.
Dans ces conditions le fonctionnement du dispenseur (20) s’établit ainsi que décrit ci-après.
Une fois que l’utilisateur a effectué le prélèvement dans le dispositif de diagnostic (31) il ouvre le capot (24) du dispenseur (20) et y introduit le dispositif de diagnostic (31), capsule (62) ouverte dans la cavité circulaire du socle (23), puis il referme le capot (24) et lance le processus par pression sur un organe de commande (90).
L’électronique de commande gère alors les phases suivantes :
1. le disque supérieur (33) du dispositif de diagnostic (31) se trouve dans la susdite « première position » et la pompe doseuse (76) injecte alors via sa buse (80) dans la cavité du bossage creux (50) une quantité de l’ordre de 400 pL d’éthanol à 70% de façon à effectuer un rinçage de cette cavité ; 2. le moteur (88) positionne ensuite le disque supérieur (33) dans la susdite « Position intermédiaire », de façon à amener les membranes de capture (38a et 38b) au droit de la fenêtre radiale (58) de façon à réaliser un séchage (axe r1 au droit de l’axe r’2) ;
3. l’électronique de commande (72) applique alors une pause de l’ordre de 3 à 15 minutes de façon à assurer le séchage, lequel séchage peut être actif/favorisé par des moyens de soufflage, e.g., une pompe soufflant de l’air au travers des membranes de capture (38a et 38b) ;
4. le moteur (88) positionne ensuite le disque supérieur (33) dans la susdite « deuxième position », de façon à amener les membranes de capture (38a et 38b) au droit des pastilles réactives (43a et 43b) (axe r1 au droit de l’axe r’3) et les buses (86a et 86b) injectent un volume compris de 30 pL à 50 pl_ d’une solution salée sur chaque membrane de capture (38a et 38b) ;
5. le moteur (88) ramène ensuite le disque supérieur (33) dans la susdite « première position » ou position de départ ; et
6. il reste à l’opérateur à ouvrir le capot (24), à récupérer la capsule (62) et à la refermer au moyen de son couvercle (62b).
Le présent dispenseur (20) est particulièrement intéressant dans la mesure où il permet de réaliser un tel traitement de façon automatique en un temps restreint de l’ordre de 3 à 15 minutes. Il peut donc bien entendu faire l’objet d’une utilisation seul, mais il peut également être utilisé en combinaison avec un détecteur (21) permettant de réaliser la détection des acides nucléiques contenus dans l’échantillon biologique recueilli, la combinaison du dispenseur (20) et du détecteur (21) permettant de constituer deux dispositifs complémentaires formant un système de diagnostic (22).
Ainsi que représenté sur la figure 24 le détecteur (21) qui, dans cet exemple de réalisation, est en forme de boîtier comporte un corps (91) et un couvercle (92) articulé sur celui-ci.
L’intérieur du corps (91) comporte une platine (93) qui comporte deux rangées d’alvéoles (distinctes et indépendantes) destinées à recevoir les capsules (62). Dans le présent exemple la platine comprend vingt alvéoles mais il est bien entendu qu’elle pourrait en comprendre un nombre quelconque. Le couvercle (92) est constitué notamment d’un matériau transparent, notamment un matériau de synthèse qui est teinté en jaune.
Ainsi que représenté sur la figure 26, le corps (91) du détecteur (21) comprend une alimentation (94) qui alimente en énergie une électronique de commande (95), pilotée par exemple par un microcontrôleur, qui assure la commande, via un étage de puissance (96), d’une part de résistances chauffantes (97) et, d’autre part de diodes (98) émissives d’un rayonnement de couleur bleue.
Dans ces conditions le fonctionnement du détecteur (21) s’établit ainsi que décrit ci-après :
1. l’utilisateur après avoir ouvert le couvercle (94) du détecteur (21) insère dans l’une des alvéoles (89) de celui-ci une capsule (62) ayant subi un traitement du type de celui effectué précédemment dans le dispenseur (20) ;
2. l’électronique de commande (95) détecte l’alvéole qui vient de recevoir la capsule (62) et applique à cette dernière au moyen d’une résistance (97) un chauffage localisé à une température de l’ordre de 65°C pendant une durée de l’ordre 45 minutes ;
3. à la fin de cette période l’électronique de commande fait redescendre la température de cette alvéole à une valeur de 25°C et commande, sous cette alvéole, l’allumage d’une ou plusieurs LED (98) (diodes électroluminescentes) de couleur bleue en même temps qu’il indique la fin du processus par l’émission d’un signal, notamment un signal sonore ;
4. au travers du couvercle transparent coloré en jaune l’utilisateur perçoit la capsule (62) qui est éclairée en bleu par-dessous, si bien que la fluorescence est bien visible ce qui lui permet une lecture facile du résultat ; et
5. l’utilisateur peut alors ouvrir le couvercle (94) et retirer la capsule (62).
Un cycle moyen de détection est donc compris entre environ 45 et 70 minutes.
L’utilisation du système de détection (22) suivant l’invention c’est-à-dire l’utilisation conjointe du dispenseur (20) et du détecteur (21) est particulièrement intéressante en ce qu’elle permet de les utiliser de façon séquentielle en temps partagé.
En effet le temps moyen de traitement dans le dispenseur (20) étant de l’ordre de 3 à 15 minutes et celui dans le détecteur de l’ordre de 45 minutes, il est possible de traiter plusieurs échantillons dans le dispenseur pendant un cycle de traitement dans le détecteur (21).
Ainsi et en considérant à titre d’exemple un temps de traitement de 3 minutes pour le dispenseur (20) et un temps de 45 minutes pour le détecteur (21), est obtenu le schéma de fonctionnement représenté sur la figure 27.
Il est ainsi constaté que la durée pour obtenir l’ensemble des résultats du traitement de n capsules (62), via l’utilisation conjointe d’un dispenseur et d’un détecteur capable d’accueillir n capsules (62), est :
T = 48 + [(n-1) x 3]
Ce qui représente pour 20 capsules contenues dans le détecteur : T = 105 minutes.
Finalement et au regard de ce qui précède, on comprend qu’un autre aspect de l’invention concerne un dispositif de diagnostic portable (31) en forme de boîtier cylindrique comprenant deux disques (33, 35) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre autour de leurs centres (O) et définissant un volume fermé, à savoir :
■ un disque supérieur (33) comprenant :
- au moins une ouverture (52a, 52b) réceptrice d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane de capture (38) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
- au moins une fenêtre (53), l’ouverture réceptrice (52a, 52b) et cette fenêtre (53) étant écartées angulairement d’un angle au centre (a) d’au moins 30°,
■ un disque inférieur (35) comprenant :
- un matériau absorbant (45) apte à contenir un volume de liquide, et
- au moins une capsule (62) disposée, de façon amovible, dans un logement (56) de celui-ci et qui comprend une zone réactionnelle comprenant au moins une et de préférence au moins deux pastilles (43a, 43b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, l’ouverture réceptrice (52a, 52b), la fenêtre (53), le matériau absorbant (45) et la zone réactionnelle formant une unité de détection telle que, par une rotation, le disque supérieur (33) puisse successivement
■ passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection, son ouverture réceptrice (52a, 52b) se trouve au droit de son matériau absorbant (45), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (53) se trouve au droit de sa zone réactionnelle,
■ à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection, son ouverture réceptrice (52a, 52b) se trouve au droit de sa zone réactionnelle et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, et
■ se positionner, par une rotation, sur la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection, sa fenêtre (53) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que le disque inférieur (35) comporte une fenêtre de séchage (58), notamment de forme radiale, disposée entre le logement (56) de la capsule (62) et le matériau absorbant (45), préférentiellement au même écart angulaire (a/2) de ces deux éléments, cette fenêtre de séchage (58) étant disposée de façon telle que, par une rotation, le disque supérieur (33) puisse passer de la susdite première position à cette position intermédiaire dans laquelle, pour la susdite unité de détection, son ouverture réceptrice (52a, 52b) se trouve au droit de cette fenêtre de séchage (58).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que le logement apte à recevoir la capsule (62) est en forme d’une fente radiale (56) ouverte sur l’extérieur, dans laquelle ladite capsule est insérable par coulissement.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que la capsule (62) comporte une première partie (62a) apte à être insérée dans la fente radiale (56) et une seconde partie formant un couvercle d’obturation (62b) de la première partie, ces deux parties étant éventuellement rattachées par des moyens de liaison (62c).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que ladite première partie (62a) et ladite seconde partie (62b) est de type transparent, et notamment ladite première partie (62a) ou ladite seconde partie (62b) est teintée de couleur jaune. A noter que la détection du signal obtenu via l’utilisation du dispositif de diagnostic de l’invention se basant sur les principes de la fluorescence, seule l’une ou l’autre des parties (62a) et (62b) peut être teintée en jaune, laquelle partie est déterminée par l’emplacement de la source lumineuse.
Par exemple, une source lumineuse (une LED) d'une certaine couleur (i.e. centrée sur une longueur d'onde bleue de 495 nm) illumine un fluorophore (i.e. présent sur les pastilles et actif en fin de réaction dans le cas d'un résultat positif). Le fluorophore en question, sous la stimulation de la source lumineuse, émet alors une lumière d'une autre couleur (i.e. d’une longueur d'onde verte de l’ordre de 517 nm) dont l’intensité est beaucoup plus faible que l'intensité émise par la source lumineuse. Il est donc recommandé voire nécessaire d’utiliser un filtre de couleur (i.e. de couleur jaune) pour bloquer la source lumineuse mais pas la lumière émise par le fluorophore. De cette façon, le signal peut être observé/mesuré et le diagnostic posé. Le filtre de couleur devant être placé entre le côté des pastilles (43a, 43b) biologiquement compatibles observé et l'appareil de mesure (e.g. œil ou caméra) pour éliminer la source lumineuse et laisser passer la fluorescence émise par le fluorophore, qui peut alors être détectée, on comprend que ce filtre peut être constitué par ladite première partie (62a) ou ladite seconde partie (62b) de la capsule transparente, ou par le couvercle (92) du détecteur (21) si ce dernier est utilisé. Autrement dit :
■ si le support (62a) de la capsule (62) est transparent et jaune, alors le couvercle (62b) est transparent (sans couleur) et la source lumineuse se trouve au-dessus de la capsule (62), faisant alors face au couvercle (62b) transparent ; et ■ si le couvercle (62b) de la capsule (62) est transparent et jaune, alors le support (62a) est transparent (sans couleur) et la source lumineuse se trouve au-dessous de la capsule (62), faisant alors face au support (62a) transparent. A noter que ce mode de réalisation particulier de la capsule (62) vient en complément du cas où le détecteur (21) n’est pas utilisé ou s’il est utilisé, le couvercle (92) n’étant pas teinté en jaune. A l’inverse, si le détecteur (21) tel que décrit ci-dessus est utilisé et comprend un couvercle (92) transparent et jaune, alors la totalité de la capsule (62) est transparente et la source lumineuse se trouve au- dessous de la capsule. Au-delà de cet exemple basé sur l’excitation dans le bleu et l’émission dans le vert, il est possible d’adapter la couleur des matériaux teintés pour adapter le dispositif de diagnostic de l’invention à l’emploi d’agents intercalants ou de fluorophores utilisant des couples ‘longueur d’onde d’excitation / longueur d’onde d’émission’ différents.
En particulier et selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que la capsule (62) est constituée de polypropylène, notamment de grade alimentaire.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que l’ouverture (52a, 52b) réceptrice de l’échantillon biologique à tester est disposée au fond d’un bossage creux (50), et comporte un entonnoir amovible (49) pourvu d’au moins une ouverture située au droit de l’ouverture réceptrice (52a, 52b), cet entonnoir (49) étant encastrable sur le bossage creux (50).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que le matériau absorbant (45) est soit disposé dans une cuvette (59) de la surface supérieure du disque inférieur (35), soit intégré dans la masse de ce dernier, ledit matériau absorbant (45) ayant un volume de rétention d’au moins 1 ml_.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que le matériau absorbant (45) est constitué d’un matériau choisi parmi : un tampon absorbant en cellulose, de la fibre de verre ou bourre de coton et un tampon absorbant utilisable pour un test immuno- chromatographique.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que l’une des deux faces en regard de l’un des disques (33) comporte une rainure (51) coaxiale au disque et partiellement circulaire dont les extrémités déterminent un angle au centre (b) dont la valeur, en coopération avec un téton (60) de l’autre disque (35), définissent des butées de position extrêmes des deux disques dans les deux susdites première position et deuxième position.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que la membrane de capture (38) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques est réalisée dans un matériau choisi parmi : la cellulose, la silice et la fibre de verre.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que les au moins une et de préférence au moins deux pastilles (43a, 43b) d’amplification biologiquement compatibles sont réalisées dans un matériau choisi parmi : la fibre de verre (contenant ou non un liant adjuvant) et la cellulose.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que au moins une zone réactionnelle comprend au moins une de préférence au moins deux pastilles (43a, 43b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que ladite au moins une zone réactionnelle comprend au moins deux pastilles (43a, 43b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, la première (43a ou 43b) contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique et la seconde (43b ou 43a) contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une autre séquence d’acides nucléiques d’intérêt nécessairement présente dans l’échantillon biologique à tester.
Selon un autre aspect de l’invention, celle-ci concerne l’utilisation du dispositif de diagnostic (31) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus pour détecter in vitro au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation susmentionnée pour détecter in vitro une infection virale et en particulier pour détecter in vitro une infection virale au SARS- CoV-2.
Selon un autre aspect de l’invention, celle-ci concerne un procédé de détection in vitro d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester, ledit procédé étant mis en œuvre à l’aide du dispositif de diagnostic (31) portable en forme de boîtier cylindrique tel que décrit ci-dessus et ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. extraire les acides nucléiques de l’échantillon biologique à tester sur une membrane de capture (38) biologiquement compatible d’une unité de détection ; b. tourner le disque supérieur (33) pour positionner ladite membrane de capture (38) biologiquement compatible au droit de la zone réactionnelle de cette unité de détection et la recouvrir en partie ou en totalité ; c. éluer les acides nucléiques pour les faire passer de ladite membrane de capture (38) biologiquement compatible aux au moins une de préférence au moins deux pastilles (43a, 43b) biologiquement compatible de cette unité de détection ; d. tourner le disque supérieur (33) pour revenir à la position initiale. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé de détection in vitro tel que décrit ci-dessus, dans lequel une étape de séchage de ladite membrane de capture (38) biologiquement compatible est réalisée entre les susdites étapes a) et b), et ladite étape comprend au moins l’étape suivante : i. tourner le disque supérieur (33) pour positionner ladite membrane de capture (38) biologiquement compatible au droit de la fenêtre radiale (58) de façon à réaliser un séchage.
Selon un autre aspect de l’invention, celle-ci concerne un dispositif dispenseur (20) destiné à mettre en oeuvre de façon automatisée un dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce qu’il comporte un boîtier récepteur (23, 24) recevant :
■ un dispositif de diagnostic (31),
■ des moyens d’entraînement en rotation (88) du disque supérieur (33) par rapport au disque inférieur (35) de ce dispositif de diagnostic (31 ),
■ des moyens de gestion (72) du positionnement relatif de ses deux disques (33, 35),
■ des moyens de rinçage (76, 78, 80) de la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b),
■ des moyens d’élution (82, 84, 86a, 86b) de la au moins une membrane de capture (38).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif dispenseur (20) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que les moyens de gestion comportent une alimentation (70) délivrant l’énergie à un étage de puissance (74) sous le contrôle d’une électronique de commande (72).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif dispenseur (20) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que l’électronique de commande (72) assure le pilotage d’un moteur (88), notamment un moteur pas à pas, apte à positionner de façon séquentielle le disque supérieur (33) par rapport au disque inférieur (35) successivement dans la susdite première position, dans la susdite position intermédiaire, dans la susdite deuxième position et dans la susdite première position.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif dispenseur (20) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce qu’il comporte des moyens de séchage (58) de la membrane de capture (38).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif dispenseur (20) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que les moyens de séchage comprennent une fente radiale (58) traversant le disque inférieur (35) et qui est positionnée de façon telle sur celui-ci qu’elle se trouve au droit de la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b) lorsque les disques supérieur (33) et inférieur (35) sont dans la susdite position intermédiaire et éventuellement des moyens de soufflage au travers de ladite fente radiale (58).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif dispenseur (20) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que les moyens de rinçage comportent au moins un réservoir (78) de produit liquide, notamment de l’éthanol et notamment de l’éthanol à 70%, permettant d’injecter, au moyen d’au moins une pompe (76), notamment une pompe doseuse, et au moins une buse (80), une quantité dudit produit, notamment de l’ordre de 400 pL, dans la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b). Par « de l’ordre de 400 m/_ », on entend une quantité comprise de 350 à 450 pl_, en particulier une quantité comprise de 375 à 425 mI_, de 390 à 410 pL voire une quantité de 400 pL.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif dispenseur (20) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que les moyens d’élution comportent au moins un réservoir (84) de produit éluant, notamment une solution salée, permettant d’injecter, au moyen d’au moins une pompe (82), notamment une pompe doseuse, et au moins une buse et préférentiellement deux buses (86a, 86b), une quantité dudit produit, notamment de l’ordre notamment de 30 mI_ à 50 mI_, dans la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b). Par « de l’ordre notamment de 30 m/_ à 50 m/_ », on entend une quantité comprise de 30 à 50 mI_, en particulier une quantité comprise de 30 à 40 mI_, de 40 à 50 mI_ ou de 35 à 45 pL ; voire une quantité de 36 mI_. Selon un autre aspect de l’invention, celle-ci concerne un procédé de mise en œuvre d’un dispositif dispenseur (20) tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu’il comporte les étapes dans lesquelles l’électronique de commande (72) assure successivement :
■ (les disques étant dans la susdite première position), l’activation de la au moins une pompe (76) afin d’injecter, par la au moins une buse (80), de l’éthanol contenu dans le au moins un réservoir d’éthanol (78) dans la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b) dans une quantité de l’ordre notamment de 400 pL,
■ le positionnement relatif des disques supérieur (33) et inférieur (35) dans la susdite deuxième position,
■ l’injection, dans cette deuxième position, par au moins une buse et préférentiellement deux buses (86a, 86b), du produit éluant contenu dans le au moins un réservoir (84) dans la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b) en une quantité de l’ordre notamment de 30 pl_ à 50 mI_,
■ le retour dans la susdite première position relative des disques supérieur (33) et inférieur (35).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé ci-dessus caractérisé en ce que l’électronique de commande (72), lorsque le disque supérieur (33) quitte la susdite première position pour la susdite deuxième position :
■ assure le positionnement relatif des disques supérieur (33) et inférieur (35) dans la susdite position intermédiaire,
■ commande un arrêt dans cette position, pendant un temps de séchage de la membrane de capture (38) biologiquement compatible, notamment compris entre quelques secondes et quinze minutes.
Par « compris entre quelques secondes et quinze minutes », on entend que le temps de séchage peut être compris de 1 à 60 secondes, de 1 à 30 secondes, de 1 à 15 secondes, de 1 à 5 secondes, de 1 à 15 minutes ou de 1 à 5 minutes. En particulier et si des moyens de séchages sont utilisés, quelques secondes (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 15 secondes) suffisent pour réaliser l’étape de séchage. Par « moyen de séchages » on entend notamment des moyens de soufflage. Selon un autre aspect de l’invention, celle-ci concerne un système de test caractérisé en ce qu’il comprend un dispositif de diagnostic (31) tel que décrit ci-dessus et un dispositif dispenseur (20) tel que décrit ci-dessus.
Selon un autre aspect de l’invention, celle-ci concerne un dispositif détecteur (21) destiné à assurer la détection des acides nucléiques contenus dans un échantillon biologique par exemple recueilli dans un dispositif de diagnostic (31 ) tel que décrit ci- dessus et mis en œuvre dans un dispositif dispenseur (20) tel que décrit ci-dessus, ce dispositif détecteur (21 ) comportant un boîtier (91 ) comportant :
■ une platine (93) creusée d’une série d’alvéoles (89) destinées à recevoir des capsules (62),
■ des moyens de chauffage de ces capsules (62),
■ des moyens de détection d’une fluorescence de ces capsules (62),
■ des moyens de gestion du processus de traitement (94, 95, 96).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif détecteur (21) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que les moyens de gestion du processus comprennent une alimentation (94) assurant la fourniture en énergie à un étage de puissance (96) sous le contrôle d’une électronique de commande (95).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif détecteur (21) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que les moyens de chauffage des capsules (62) sont constitués de résistances chauffantes (97) préférentiellement disposées sous chacune des capsules (62) et aptes à porter ces dernières à une température notamment de l’ordre de 65°C. Par « de l’ordre de 65°C », on entend une température comprise de 60 à 70°C, de 62 à 68°C, de 64 à 66°C ou une température de 65°C.
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif détecteur (21) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que les moyens de détection de fluorescence comprennent des moyens d’éclairage, notamment constitués par des diodes électroluminescentes (LED) (98), qui sont disposées sous les capsules (62) et par un filtre jaune disposé au-dessus de celles-ci. Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le dispositif détecteur (21) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce que le filtre jaune est constitué par le couvercle (92) du boîtier (91).
Selon un autre aspect de l’invention, celle-ci concerne un procédé de mise en œuvre d’un dispositif détecteur (21) tel que décrit ci-dessus caractérisé en ce qu’il comporte les étapes dans lesquelles :
■ l’utilisateur dispose une ou plusieurs capsules dans les empreintes (89) de la platine (93) du dispositif détecteur (21),
■ l’électronique de commande (95) active le chauffage des résistances (97) disposées sous la ou les capsules (62) que l’on vient d’introduire dans le dispositif détecteur (21) à une valeur d’environ 65°C,
■ l’électronique de commande (95) maintient cette température sous la ou lesdites capsules pendant une durée d’environ 45 minutes,
■ l’électronique de commande (95) baisse ensuite la température appliquée à la ou auxdites capsules à une valeur d’environ 25°C,
■ l’électronique de commande émet alors un signal, notamment un signal sonore, signalant la fin du traitement pour cette ou ces capsules et allume sous cette ou ces dernières une lumière de couleur bleue,
■ l’utilisateur dispose alors sur la ou les susdites capsules traitées un filtre de couleur jaune et notamment le couvercle (92) transparent et teinté en jaune, afin de détecter la fluorescence éventuelle,
■ l’utilisateur retire alors la ou les capsules traitées du dispositif détecteur (21 ).
Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne le procédé ci-dessus dans lequel la fluorescence (le signal) est suivie en temps réel. Pour se faire et parmi les réactifs lyophilisés sur les pastilles (43a, 43b) biologiquement compatibles, ce ne sont pas des sondes couplées à un fluorophore qui sont utilisées mais des sondes sans modification et un agent intercalant. A noter qu’avec ce suivi en temps réel, le procédé de l’invention permet de suivre la cinétique d’amplification et, à partir de là, d'effectuer une estimation semi-quantitative, par exemple, de la charge virale ; c’est- à-dire que l’utilisateur est capable d’estimer (de manière relative) parmi les échantillons en cours de test dans lesquels la charge virale est la plus élevée ou la plus faible.
Selon un autre aspect de l’invention, celle-ci concerne un système de diagnostic caractérisé en ce qu’il comprend un système de test tel que décrit ci-dessus et un dispositif détecteur tel que décrit ci-dessus.
A tout égard, il est rappelé que les différents aspects de l’invention, tout comme les différents modes de réalisation de celle-ci sont interdépendants. Ces derniers peuvent donc être combinés entre eux à foison pour obtenir des aspects et/ou des modes de réalisation préférés de l’invention non explicitement décrits. Ceci est également valable pour l’ensemble des définitions fourni dans la présente description, lequel s’applique à tous les aspects de l’invention et ses modes de réalisation.
EXEMPLES
Les exemples suivants illustrent l’invention, sans pour autant en limiter sa portée.
EXEMPLE 1 - FABRICATION DU DISPOSITIF DE DIAGNOSTIC PORTABLE EN FORME DE BOITIER CYLINDRIQUE DE L’INVENTION
Création des disques
(1) À l’aide du logiciel Fusion 360 licence Autodesk, ont été réalisés 2 pièces circulaires d’un diamètre de 65 mm et l’autre de 58 mm ci-après nommés respectivement disque supérieur et disque inférieur Sur le disque supérieur ont été reproduites les dimensions du schéma 1 présenté
Figure 9.
Sur le disque inférieur ont été reproduites les dimensions de schéma 2 présenté
Figure 10.
Les dimensions des schémas sont en millimètre (mm). (2) Les pièces 3D des 2 disques ont été exportées en format STL et implémentées dans le logiciel Makerboot.
(3) L’impression avec l’imprimante Replicator 2X a été configurée avec les paramètres d’impressions suivants : ■ Température buse : 210°C
■ Température plateau : 50°C
■ Épaisseur de couche : 100 pm
■ Vitesse d’écriture : 110 mm/s
■ Remplissage : 45 % ■ Technique de remplissage : Hexagonale
(4) Les trajectoires d’impression en format 3gs ont été exportées et implémentées dans l’imprimante et l’impression a été lancée. (5) Après 3h d’impression, les 2 disques ont été récupérés en les détachant du plateau d’impression.
Assemblage des différents éléments sur les disques
(1 ) Après avoir nettoyé le disque supérieur avec une solution RNA free :
■ a été disposé un scotch double face sur les contours des 2 ouvertures (3 mm de large), la face scotchée étant la face intérieur du disque supérieur où existe la rainure de guidage ;
■ a été disposée la membrane biologiquement compatible permettant l’extraction et la rétention des acides nucléiques, dite membrane de capture, au niveau de l’ouverture réceptrice en forme de trou oblong, ladite membrane de capture ayant été préalablement encapsulée dans un scotch PCR perforé sur chaque face ; et
■ le bon maintien de l’ensemble a été assuré en appuyant sur les contours du trou oblong pour assurer le meilleur contact possible entre le scotch et le disque supérieur.
(2) L’opération (1) a été répétée avec le filtre optique préalablement découpé et assemblé avec une feuille PCR thermo rétractable pour la face en contact avec le disque supérieur.
(3) Après avoir nettoyé le disque inférieur avec une solution RNA free :
■ a été disposé le matériau absorbant, dit tampon capillaire, dans le réceptacle (ou cavité) en demi-cercle ; et
■ ont été disposés les 2 pastilles d’amplification et de détection dans les logements circulaires évidés prévus à cet effet au niveau de la zone réactionnelle, lequel évidement permet en particulier à la lumière d’atteindre lesdites pastilles. Assemblage des disques
Les deux disques supérieur et inférieur ont été assemblés en faisant attention à ce que le taquet de buté (ou ergot) soit bien dans la rainure de guidage et que le trou au centre du disque supérieur soit aligné avec le plot central du disque inférieur.
Le dispositif ainsi prêt peut être soit stocké et utilisé ultérieurement, soit directement utilisé.
Lyophilisation in situ des réactifs
En sus de la fabrication du dispositif de diagnostic de l’invention, une étape de lyophilisation des outils moléculaires permettant l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques susceptible d’être présente dans l’échantillon à tester peut être ajoutée. Pour cela, dNTPs, enzymes, amorces, etc. sont mélangés puis adsorbés sur les pastilles. Ensuite, les pastilles de réactions sont incubées à - 20°C durant 20 minutes, puis à - 80°C durant 20 minutes, puis lyophilisées dans un lyophilisateur à une pression de 3 mbar durant une nuit (8h). Les pastilles ainsi lyophilisées peuvent alors être placées dans les logements prévus à cet effet dans le dispositif de l’invention.
EXEMPLE 2 - UTILISATIONS DU DISPOSITIF DE DIAGNOSTIC DE L’INVENTION POUR
DIAGNOSTIQUER UNE INFECTION AU VIRUS DE LA DENGUE ET UNE INFECTION AU CORONAVIRUS SARS-COV-2
Matériels & Méthodes
Lyophilisation des composés
Les composés suivants ont été lyophilisés dans chaque pastille (18 pL) :
■ 0,85 mM de chaque désoxyribonucléotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
■ 5 mM de MgSC
■ 0,5 mM de Bétaïne ■ 0,2 mM de chaque amorce F3 et B3
■ 0,8 mM de chaque amorce FIP et BIP
■ 0,4 mM de chaque amorce LoopF et LoopB
■ une concentration de quencher une fois et demie supérieure à la concentration de l’amorce sonde (1,2 mM si l’amorce sonde est FIP ou BIP, 0,6 mM si l’amorce sonde est LoopF ou LoopB)
■ 7,2 unités d’enzyme polymérase GspSSD2.0
■ 0,9 unités d’enzyme rétro-transcriptase AMV-RT
■ 5 % v/v de Tréhalose, permettant la stabilité du lyophilisât.
Pour la détection du virus DENV2, les amorces de séquences SEQ ID NOs : 1 à 6 ont été utilisées, lesquelles amplifient une séquence cible du gène NS4B, et l’amorce BIP (SEQ ID NO : 4) a servi de sonde puisque modifiée en 5’ par l’ajout d’un fluorophore FAM. L’oligonucléotide-quencher de séquence SEQ ID NO : 13 a été utilisé et modifié en 3’ par l’ajout d’Iowa Black FQ.
Pour la détection du coronavirus SARS-CoV-2, les amorces de séquences SEQ ID NOs : 7 à 12 ont été utilisées, lesquelles amplifient une séquence cible du gène ORFIab (Lin Yu et al., Rapid colorimétrie détection of COVID-19 coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic plat-form: iLACO ; DOI : 10.1101/2020.02.20.20025874), et l’amorce LoopF (SEQ ID NO : 11) a servi de sonde puisque modifiée en 5’ par l’ajout d’un fluorophore Texas Red. L’oligonucléotide-quencher de séquence SEQ ID NO : 16 a été utilisé et modifié en 3’ par l’ajout d’Iowa Black RQ.
Ces amorces {etc.) ont été lyophilisées {cf. supra) dans une pastille test au côté d’une pastille contrôle positif interne dans laquelle a également été lyophilisé l’ADN/ARN matrice permettant d’initier la réaction.
Une fois lyophilisées, les pastilles ont été disposées dans les logements prévues à cet effet.
Utilisation du dispositif
(1) Extraction des acides nucléiques de l’échantillon ■ Mélanger 100 mI_ d’échantillon au tampon de lyse « buffer AVL » (Qiagen®) ou de tout autre tampon de lyse dont la composition est proche du tampon de lyse publié : Boom et al., J. P. M. E. (1990). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal ofclinical microbiology, 28(3), 495-503
■ Vortexer durant 15 secondes
■ Incuber 5 minutes à 65°C
■ Ajouter 400 mI_ d’éthanol pur
■ Vortexer durant 15 secondes
■ Déposer le lysat dans la zone de capture éventuellement à l’aide d’un entonnoir
■ (Retirer l’entonnoir)
■ Rincer la membrane de capture avec un ou plusieurs tampons de rinçage : e.g. 200 mI_ de Tampon AW1 (Qiagen®), puis 200 mI_ de tampon AW2 (Qiagen®), ou 400 mI_ d’une solution d’éthanol à 70 %, ou de tout autre tampon de rinçage dont la composition est proche du tampon de rinçage publié : Boom et al., J. P. M. E. (1990). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology, 28(3), 495-503
■ Laisser sécher la membrane de capture 15 minutes à 65°C.
(2) Elution dans les pastilles réactionnelles et étape de chauffage
■ Tourner le disque supérieur pour mettre en vis-à-vis la membrane de capture et les pastilles, et réhydrater la membrane de capture avec 43 pL de tampon de réaction « Buffer » dilué au 1X (Qiagen®) permettant l’élution des acides nucléiques
■ Tourner le disque supérieur soit dans le même sens soit en sens inverse de façon à venir recouvrir les pastilles avec le filtre optique, ici, un adhésif type « PCR tape »
■ Incuber le dispositif à 65°C durant 30 à 45 minutes, e.g. dans un four ou sur des résistances chauffantes.
Aux fins de cet exemple, les échantillons utilisés ont été un échantillon infecté par le virus DENV2 et un échantillon non-infecté par le virus DENV2. Ont été également utilisé un extrait ARN du SARS-CoV-2 et un contrôle négatif sans extrait de cet ARN. Acquisition des données
L’acquisition de la fluorescence en point final via les sondes utilisées et les quenchers associés a été réalisée :
■ pour le virus DENV2 (fluorophore = FAM) avec une longueur d’excitation de 495 nm et une longueur d’onde d’émission de 520 nm ; et
■ pour le coronavirus SARS-CoV-2 (fluorophore = Texas Red) avec une longueur d’onde d’excitation de 586 nm et une longueur d’onde d’émission de 603 nm.
Des photographies ont été également prises avec un smartphone (Iphone®) ou un appareil photographique Nikon® commercial.
Résultats
La Figure 11 montre les résultats obtenus, lesquels ont confirmé que le dispositif est capable, de manière sûre et fiable, de détecter le virus DENV2 et le coronavirus SARS-CoV-2 uniquement dans les échantillons où leur matériel génétique respectif est présent.
EXEMPLE 3 - UTILISATIONS DU DISPOSITIF DE DIAGNOSTIC DE LMNVENTION POUR D’ARN DE SARS-COV-2 DANS DES ECHANTILLONS ARTIFICIELS DE SALIVE ET DE FLUIDE NASO- PHARYNGES
Matériels & Méthodes
Les échantillons ont été fournis par XPrize dans le cadre du XPrize rapid covid testing compétition et ont été testés à l’aveugle avant que les valeurs de concentrations ait été communiquées par XPrize.
Le dispositif de l’invention a été utilisé et a été configuré de manière à permettre la détection de l’ARN du SARS-CoV-2 (gène Orflab) [Lamb, L. E., Bartolone, S. N., Ward, E., & Chancellor, M. B. (2020). Rapid détection of novel coronavirus/Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by reverse transcription- loop-mediated isothermal amplification. PLoS One, 15(6), e0234682] ainsi que l’ARN humain 18S [Lamb, L. E., Bartolone, S. N., Tree, M. O., Conway, M. J., Rossignol, J., Smith, C. P., & Chancellor, M. B. (2018). Rapid détection of Zika virus in urine samples and infected mosquitos by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. Scientific reports, 8(1), 1-9] La détection de l’ARN 18S a permis le contrôle de l’échantillonnage, de l’extraction et de la conservation du dispositif de l’invention. Sur le disque supérieur, deux membranes circulaires de silice placées dans la zone de capture permettent la capture des acides nucléiques. Sur le disque inférieur, un tampon absorbant permet de diriger les flux par capillarité. Sur le disque inférieur se trouve aussi une capsule refermable contenant 2 membranes de détection en fibre de verre. L’une, ronde, contient un mix RT-LAMP lyophilisé pour la détection du SARS-CoV-2 (SEQ ID NOs : 18 à 24). L’autre, carrée, contient un mix RT-LAMP lyophilisé permettant la détection de l’ARN 18S (SEQ ID NOs : 25 à 31) [Garneret, P., Coz, E., Martin, E., Manuguerra, J. C., Brient-Litzler, E., Enouf, V., ... & Tabeling, P. (2021). Performing point-of-care molecular testing for SARS-CoV-2 with RNA extraction and isothermal amplification. Plos one, 16(1), e0243712. 7]
AMORCES SEQUENCE DE 5’ A 3’ SEQ ID NO :
Covid-19_F3 TCCAG AT G AGG AT GAAG AAG A 18
Covid-19_B3 AGT CT G AACAACT GGTGTAAG 19
Covid-19_FIP AGAGCAGCAGAAGTGGCACAGGTGATT
20 GT G AAGAAGAAGAG
Covid-19_BIP T CAACCT GAAG AAG AGCAAGAACT GATT
21 GTCCTCACTGCC
Covid-19_LoopF CT CAT ATT G AGTT G AT GGCTCA 22
Covid-19_LoopB ACAAACT GTT GGTCAAC AAGAC 23
Covid-19_FI P-Désactivateur GCTGCTCT 24
18S_rRNA_F3 GTTCAAAGCAGGCCCGAG 25
18S_rRNA_B3 CCTCCGACTTTCGTT CTT G A 26
18S_rRNA_FIP TGGCCTCAGTTCCGAAAACCAACCTGGA
27
TACCGCAGCTAGG
18S_rRNA_BIP GGCATTCGTATTGCGCCGCTGGCAAAT
28
GCTTTCGCTCTG
18S_rRNA_LoopF AGAACCGCGGTCCTATTCCATTATT 29 18S_rRNA_LoopB ATTCCTTGGACCGGCGCAAG 30 18S rRNA Fl P-Désactivateur CGAATGCC 31
Tableau 2. Séquences des amorces utilisées permettant la détection de SARS-CoV- 2 et de l’ARN ribosomique 18S humain (Contrôle positif d’extraction).
L’amorce COVID-19_FIP est modifiée en 5’ par l’ajout d’une molécule FAM, et un oligo complémentaire possédant un désactivateur en 3’ est ajouté (Covid-19_FIP- Désactivateur). De même, l’amorce 18S_rRNA_BIP est modifiée en 5’ par l’ajout d’une molécule FAM, et un oligo complémentaire possédant un désactivateur en 3’ (18S_rRNA_BIP-Désactivateur). L’échantillon (100 pL) est lysé 5 min à 65°C. Les deux disques formant le dispositif sont disposés de tel sorte que les membranes de capture soient placées au-dessus du tampon absorbant. Après ajout de 400 pL d’éthanol 100 %, ce volume est déposé dans la zone de capture. L’entonnoir est retiré puis 400 pL d’une solution d’éthanol à 70 % sont déposés dans la zone de capture pour rincer les membranes de capture. Le disque supérieur est tourné de manière à ce que les membranes de capture sur le disque supérieur soient en vis-à-vis de la zone de séchage du disque inférieur. Les membranes de captures sèchent alors 15 minutes à 65°C. Le disque supérieur est à nouveau tourné pour porter les deux membranes de capture en vis-à-vis respectivement des deux membranes d’amplifications. 40 pL d’une solution aqueuse est déposée sur chacune des deux membranes de capture, éluant ainsi les ARN capturés par les membranes d’amplification. Cet éluat réhydrate les mix RT-LAMP lyophilisés sur les membranes de détection. La capsule est ensuite fermée puis portée à 65°C pendant 45 minutes. Le produit d’amplification est ensuite observé à température ambiante par fluorescence.
Les valeurs de Ct sont obtenues par la rt-PCR de référence IP4 [World Health Organization. Protocol: real-time RT-PCR assays for the détection of SARS-CoV-2, Institut Pasteur, Paris. World Health Organization, Geneva]
Résultats
La Figure 28 montre les résultats obtenus, lesquels ont confirmé que le dispositif est capable, de manière sûre et fiable, de détecter le coronavirus SARS-CoV-2 dans des échantillons des échantillons naso-pharyngés et salivaires.
De plus, il a été démontré que le dispositif offre une excellente sensibilité clinique (i.e. 97 %) et une spécificité de 100 % comme l’illustre le tableau 3 ci-après. Categories Ct IP4 COVIDISC (%, 95% CI) Total
Total positifs 36 (97.3, 85.8-99.9) 37
Faibles (>30) 14 (93.3, 68.1-99.8) 15
Moyen (20-30) 16 (100, 79.4-100) 16
Elevés (<20) 6 (100, 54.1-100) 6
Négatifs 62 (100, 94.2-100) 62
Tableau 3. Essai clinique rétrospectif pour la caractérisation des sensibilités et spécificités cliniques du système rotatif COVIDSIC.
Concordance positive et négative avec la PCR de référence IP4 [World Health Organization. Protocol: real-time RT-PCR assays for the détection of SARS-CoV-2, Institut Pasteur, Paris. World Health Organization, Geneva] 99 échantillons naso- pharyngés sont testés, 37 positifs au SARS-CoV 2 et 62 négatifs. La sensibilité clinique du COVIDISC est de 97 % (36/37) et la spécificité de 100 % (62/62).

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique comprenant deux disques (3, 5) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre et définissant un volume fermé, à savoir :
■ un disque supérieur (3) comprenant :
- au moins une ouverture réceptrice (7) d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
- au moins une fenêtre (9) laquelle est soit équipée d’un filtre optique (11) intégré dans la masse du disque supérieur, soit apte à recevoir un filtre optique (11 ) positionnable sur ladite fenêtre de façon amovible, cette ouverture réceptrice (7) et cette fenêtre (9) étant écartées angulairement d’un angle au centre d’au moins 30°,
■ un disque inférieur (5) comprenant :
- un matériau absorbant (15) apte à contenir un volume de liquide, et
- au moins une zone réactionnelle (12) comprenant au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, l’ouverture réceptrice (7), la fenêtre (9), le matériau absorbant (15) et la zone réactionnelle (12) formant une unité de détection (4) telle que, par une rotation, le disque supérieur puisse successivement
■ passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de son matériau absorbant (15), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (9) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12),
■ à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection (4), son ouverture réceptrice (7) se trouve au droit de sa zone réactionnelle (12) et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, et
■ se positionner, par une rotation, sur la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection (4), sa fenêtre (9) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle (12), de façon à permettre l’amplification et la détection de la susdite au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans l’échantillon biologique.
2. Dispositif de diagnostic (1) selon la revendication 1 dans lequel le passage de la susdite deuxième position à la susdite première position se fait par une rotation inverse de celle permettant le passage de la susdite première position à la susdite deuxième position.
3. Dispositif de diagnostic (1) selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le matériau absorbant (15) est disposé dans un réceptacle qui est positionné soit sur la surface supérieure du disque inférieur, soit intégré dans la masse de ce dernier, et ledit matériau absorbant (15) est de préférence en mesure de contenir un volume d’au moins 1 ml_.
4. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une des revendications précédentes dans lequel le matériau absorbant (15) est dans un matériau choisi parmi : un tampon absorbant en cellulose, de la fibre de verre ou bourre de coton et un tampon absorbant utilisable pour un test immuno-chromatographique.
5. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une des revendications précédentes dans lequel la membrane (8) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques est dans un matériau choisi parmi : la cellulose, la silice et la fibre de verre.
6. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel les au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles sont dans un matériau choisi parmi : la fibre de verre (contenant ou non un liant adjuvant) et la cellulose.
7. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel au moins une zone réactionnelle (12) comprend au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique.
8. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel ladite au moins une zone réactionnelle (12) comprend au moins deux pastilles (13a, 13b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, la première (13a ou 13b) contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique et la seconde (13b ou 13a) contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une autre séquence d’acides nucléiques d’intérêt nécessairement présente dans l’échantillon biologique à tester.
9. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes, le rapport diamètre sur hauteur du dispositif étant compris de 5 à 30.
10. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes dans lequel lesdites rotations sont guidées par un système de rainure(s) et d’ergot(s).
11. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant :
■ au moins deux unités de détection (4) qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même rayon du disque supérieur, ou
■ au moins deux unités de détection (4) qui se distribuent sur les disques supérieur (3) et inférieur (5) de façon que leurs ouvertures réceptrices respectives se situent sur un même arc de cercle du disque supérieur.
12. Dispositif de diagnostic (1) selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre des moyens, notamment :
■ au moins une pince capable de saisir ledit dispositif et d’appliquer une pression permettant de bloquer et de serrer le disque supérieur sur le disque inférieur, ladite pression assurant l’herméticité et l’étanchéité du dispositif, et équipée d’un système chauffant apte à être positionné au droit de la ou des zones réactionnelles du dispositif évitant la création d’un gradient de température sur la ou les zones réactionnelles à chauffer.
13. Utilisation du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 pour détecter in vitro au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester.
14. Utilisation selon la revendication 13 pour détecter in vitro une infection virale et en particulier pour détecter in vitro une infection virale au SARS-CoV-2.
15. Procédé de détection in vitro d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester, ledit procédé étant mis en œuvre à l’aide du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 et ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. extraire les acides nucléiques de l’échantillon biologique à tester sur une membrane (8) biologiquement compatible d’une unité de détection (4) ; b. tourner le disque supérieur (3) pour positionner ladite membrane (8) biologiquement compatible au droit de la zone réactionnelle (12) de cette unité de détection et la recouvrir en partie ou en totalité ; c. éluer les acides nucléiques pour les faire passer de ladite membrane (8) biologiquement compatible aux au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a, 13b) biologiquement compatible de cette unité de détection (4) ; d. tourner le disque supérieur (3) pour revenir à la position initiale ; et e. amplifier puis détecter si une amplification d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique a eu lieu.
16. Procédé de fabrication du dispositif de diagnostic (1) portable en forme de boîtier cylindrique selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. fabriquer les disques supérieur (3) et inférieur (5) ; b. disposer au moins une membrane (8) biologiquement compatible, au moins une de préférence au moins deux pastilles (13a et 13b) biologiquement compatibles, au moins un matériau absorbant (15) et au moins un filtre optique (11 ) ; et c. assembler les disques supérieur (3) et inférieur (5).
17. Dispositif de diagnostic portable (31) en forme de boîtier cylindrique comprenant deux disques (33, 35) coaxiaux superposés montés à rotation l’un par rapport à l’autre autour de leurs centres (O) et définissant un volume fermé, à savoir :
■ un disque supérieur (33) comprenant :
- au moins une ouverture (52a, 52b) réceptrice d’un échantillon biologique à tester qui est pourvue d’une membrane de capture (38) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques de cet échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, et
- au moins une fenêtre (53), l’ouverture réceptrice (52a, 52b) et cette fenêtre (53) étant écartées angulairement d’un angle au centre ( a) d’au moins 30°,
■ un disque inférieur (35) comprenant :
- un matériau absorbant (45) apte à contenir un volume de liquide, et
- au moins une capsule (62) disposée, de façon amovible, dans un logement (56) de celui-ci et qui comprend une zone réactionnelle comprenant au moins une et de préférence au moins deux pastilles (43a, 43b) biologiquement compatibles, adjacentes, indépendantes, et aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique en présence de réactifs appropriés, l’ouverture réceptrice (52a, 52b), la fenêtre (53), le matériau absorbant (45) et la zone réactionnelle formant une unité de détection telle que, par une rotation, le disque supérieur (33) puisse successivement
■ passer d’une première position dans laquelle, pour cette unité de détection, son ouverture réceptrice (52a, 52b) se trouve au droit de son matériau absorbant (45), de façon à permettre l’extraction et la rétention des susdits acides nucléiques, et sa fenêtre (53) se trouve au droit de sa zone réactionnelle,
■ à une deuxième position dans laquelle, pour cette unité de détection, son ouverture réceptrice (52a, 52b) se trouve au droit de sa zone réactionnelle et la recouvre en partie ou en totalité de façon à permettre l’élution des susdits acides nucléiques, et
■ se positionner, par une rotation, sur la susdite première position, de façon que, pour cette unité de détection, sa fenêtre (53) se retrouve au droit de sa zone réactionnelle.
18. Dispositif de diagnostic (31) selon la revendication 17 caractérisé en ce que le disque inférieur (35) comporte une fenêtre de séchage (58), notamment de forme radiale, disposée entre le logement (56) de la capsule (62) et le matériau absorbant (45), préférentiellement au même écart angulaire (a/2) de ces deux éléments, cette fenêtre de séchage (58) étant disposée de façon telle que, par une rotation, le disque supérieur (33) puisse passer de la susdite première position à cette position intermédiaire dans laquelle, pour la susdite unité de détection, son ouverture réceptrice (52a, 52b) se trouve au droit de cette fenêtre de séchage (58).
19. Dispositif de diagnostic (31) selon l’une des revendications 17 ou 18 caractérisé en ce que le logement apte à recevoir la capsule (62) est en forme d’une fente radiale (56) ouverte sur l’extérieur, dans laquelle ladite capsule est insérable par coulissement.
20. Dispositif de diagnostic (31) selon la revendication 19 caractérisé en ce que la capsule (62) comporte une première partie (62a) apte à être insérée dans la fente radiale (56) et une seconde partie formant un couvercle d’obturation (62b) de la première partie, ces deux parties étant éventuellement rattachées par des moyens de liaison (62c).
21. Dispositif de diagnostic (31) selon la revendication 20 caractérisé en ce que ladite première partie (62a) et ladite seconde partie (62b) est de type transparent, et notamment ladite première partie (62a) ou ladite seconde partie (62b) est teintée de couleur jaune.
22. Dispositif de diagnostic (31) selon l’une quelconque des revendications 17 à 21 caractérisé en ce que la capsule (62) est constituée de polypropylène, notamment de grade alimentaire.
23. Dispositif de diagnostic (31) selon l’une quelconque des revendications 17 à 22 caractérisé en ce que l’ouverture (52a, 52b) réceptrice de l’échantillon biologique à tester est disposée au fond d’un bossage creux (50), et comporte un entonnoir amovible (49) pourvu d’au moins une ouverture située au droit de l’ouverture réceptrice (52a, 52b), cet entonnoir (49) étant encastrable sur le bossage creux (50).
24. Dispositif de diagnostic (31) selon l’une quelconque des revendications 17 à 23 caractérisé en ce que le matériau absorbant (45) est soit disposé dans une cuvette (59) de la surface supérieure du disque inférieur (35), soit intégré dans la masse de ce dernier, ledit matériau absorbant (45) ayant un volume de rétention d’au moins 1 ml_.
25. Dispositif de diagnostic (31) selon l’une quelconque des revendications 17 à 25 caractérisé en ce que le matériau absorbant (45) est constitué d’un matériau choisi parmi : un tampon absorbant en cellulose, de la fibre de verre ou bourre de coton et un tampon absorbant utilisable pour un test immuno-chromatographique.
26. Dispositif de diagnostic (31) selon l’une quelconque des revendications 17 à 25 caractérisé en ce que l’une des deux faces en regard de l’un des disques (33) comporte une rainure (51) coaxiale au disque et partiellement circulaire dont les extrémités déterminent un angle au centre (b) dont la valeur, en coopération avec un téton (60) de l’autre disque (35), définissent des butées de position extrêmes des deux disques dans les deux susdites première position et deuxième position.
27. Dispositif de diagnostic (31) selon l’une quelconque des revendications 17 à 26 caractérisé en ce que la membrane de capture (38) biologiquement compatible et apte à permettre l’extraction et la rétention d’acides nucléiques est réalisée dans un matériau choisi parmi : la cellulose, la silice et la fibre de verre.
28. Dispositif de diagnostic (31) selon l’une quelconque des revendications 17 à 27 caractérisé en ce que les au moins une et de préférence au moins deux pastilles (43a, 43b) d’amplification biologiquement compatibles sont réalisées dans un matériau choisi parmi : la fibre de verre (contenant ou non un liant adjuvant) et la cellulose.
29. Dispositif de diagnostic (31) selon l’une quelconque des revendications 17 à 28 caractérisé en ce que au moins une zone réactionnelle comprend au moins une de préférence au moins deux pastilles (43a, 43b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, l’une au moins contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique.
30. Dispositif de diagnostic (31) selon l’une quelconque des revendications 17 à 29 caractérisé en ce que ladite au moins une zone réactionnelle comprend au moins deux pastilles (43a, 43b) d’amplification biologiquement compatibles, adjacentes et indépendantes, la première (43a ou 43b) contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans le susdit échantillon biologique et la seconde (43b ou 43a) contenant des réactifs lyophilisés aptes à permettre l’amplification et la détection d’au moins une autre séquence d’acides nucléiques d’intérêt nécessairement présente dans l’échantillon biologique à tester.
31. Utilisation du dispositif de diagnostic (31) portable en forme de boîtier cylindrique selon l’une quelconque des revendications 17 à 30 pour détecter in vitro au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester.
32. Utilisation selon la revendication 31 pour détecter in vitro une infection virale et en particulier pour détecter in vitro une infection virale au SARS-CoV-2.
33. Procédé de détection in vitro d’au moins une séquence d’acides nucléiques d’intérêt susceptible d’être présente dans un échantillon biologique à tester, ledit procédé étant mis en oeuvre à l’aide du dispositif de diagnostic (31) portable en forme de boîtier cylindrique selon l’une quelconque des revendications 17 à 30 et ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a. extraire les acides nucléiques de l’échantillon biologique à tester sur une membrane de capture (38) biologiquement compatible d’une unité de détection ; b. tourner le disque supérieur (33) pour positionner ladite membrane de capture (38) biologiquement compatible au droit de la zone réactionnelle de cette unité de détection et la recouvrir en partie ou en totalité ; c. éluer les acides nucléiques pour les faire passer de ladite membrane de capture (38) biologiquement compatible aux au moins une de préférence au moins deux pastilles (43a, 43b) biologiquement compatible de cette unité de détection ; d. tourner le disque supérieur (33) pour revenir à la position initiale.
34. Dispositif dispenseur (20) destiné à mettre en oeuvre de façon automatisée un dispositif de diagnostic (31) suivant l’une des revendications 17 à 30 caractérisé en ce qu’il comporte un boîtier récepteur (23, 24) recevant :
■ un dispositif de diagnostic (31), ■ des moyens d’entraînement en rotation (88) du disque supérieur (33) par rapport au disque inférieur (35) de ce dispositif de diagnostic (31 ),
■ des moyens de gestion (72) du positionnement relatif de ses deux disques (33, 35),
■ des moyens de rinçage (76, 78, 80) de la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b),
■ des moyens d’élution (82, 84, 86a, 86b) de la au moins une membrane de capture (38).
35. Dispositif dispenseur (20) selon la revendication 34 caractérisé en ce que les moyens de gestion comportent une alimentation (70) délivrant l’énergie à un étage de puissance (74) sous le contrôle d’une électronique de commande (72).
36. Dispositif dispenseur (20) selon la revendication 35 caractérisé en ce que l’électronique de commande (72) assure le pilotage d’un moteur (88), notamment un moteur pas à pas, apte à positionner de façon séquentielle le disque supérieur (33) par rapport au disque inférieur (35) successivement dans la susdite première position, dans la susdite position intermédiaire, dans la susdite deuxième position et dans la susdite première position.
37. Dispositif dispenseur (20) selon l’une quelconque des revendications 34 à 36 caractérisé en ce qu’il comporte des moyens de séchage (58) de la membrane de capture (38).
38. Dispositif dispenseur (20) selon la revendication 37 caractérisé en ce que les moyens de séchage comprennent une fente radiale (58) traversant le disque inférieur (35) et qui est positionnée de façon telle sur celui-ci qu’elle se trouve au droit de la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b) lorsque les disques supérieur (33) et inférieur (35) sont dans la susdite position intermédiaire et éventuellement des moyens de soufflage au travers de ladite fente radiale (58).
39. Dispositif dispenseur (20) selon l’une quelconque des revendications 34 à 38 caractérisé en ce que les moyens de rinçage comportent au moins un réservoir (78) de produit liquide, notamment de l’éthanol et notamment de l’éthanol à 70%, permettant d’injecter, au moyen d’au moins une pompe (76), notamment une pompe doseuse, et au moins une buse (80), une quantité dudit produit, notamment de l’ordre de 400 mI_, dans la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b).
40. Dispositif dispenseur (20) selon l’une quelconque des revendications 34 à 39 caractérisé en ce que les moyens d’élution comportent au moins un réservoir (84) de produit éluant, notamment une solution salée, permettant d’injecter, au moyen d’au moins une pompe (82), notamment une pompe doseuse, et au moins une buse et préférentiellement deux buses (86a, 86b), une quantité dudit produit, notamment de l’ordre notamment de 30 pL à 50 pl_, dans la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b).
41. Procédé de mise en oeuvre d’un dispositif dispenseur (20) selon l’une des revendications 34 à 40, caractérisé en ce qu’il comporte les étapes dans lesquelles l’électronique de commande (72) assure successivement :
■ (les disques étant dans la susdite première position), l’activation de la au moins une pompe (76) afin d’injecter, par la au moins une buse (80), de l’éthanol contenu dans le au moins un réservoir d’éthanol (78) dans la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b) dans une quantité de l’ordre notamment de 400 mI_,
■ le positionnement relatif des disques supérieur (33) et inférieur (35) dans la susdite deuxième position,
■ l’injection, dans cette deuxième position, par au moins une buse et préférentiellement deux buses (86a, 86b), du produit éluant contenu dans le au moins un réservoir (84) dans la au moins une ouverture réceptrice (52a, 52b) en une quantité de l’ordre notamment de 30 pl_ à 50 mI_,
■ le retour dans la susdite première position relative des disques supérieur (33) et inférieur (35).
42. Procédé selon la revendication 41 caractérisé en ce que l’électronique de commande (72), lorsque le disque supérieur (33) quitte la susdite première position pour la susdite deuxième position :
■ assure le positionnement relatif des disques supérieur (33) et inférieur (35) dans la susdite position intermédiaire,
■ commande un arrêt dans cette position, pendant un temps de séchage de la membrane de capture (38) biologiquement compatible, notamment compris entre quelques secondes et quinze minutes.
43. Système de test caractérisé en ce qu’il comprend un dispositif de diagnostic (31) selon l’une quelconque des revendications 20 à 34 et un dispositif dispenseur (20) selon l’une quelconque des revendications 34 à 40.
44. Dispositif détecteur (21) destiné à assurer la détection des acides nucléiques contenus dans un échantillon biologique par exemple recueilli dans un dispositif de diagnostic (31) selon l’une des revendications 17 à 30 et mis en oeuvre dans un dispositif dispenseur (20) selon l’une des revendications 34 à 40, ce dispositif détecteur (21) comportant un boîtier (91) comportant :
■ une platine (93) creusée d’une série d’alvéoles (89) destinées à recevoir des capsules (62),
■ des moyens de chauffage de ces capsules (62),
■ des moyens de détection d’une fluorescence de ces capsules (62),
■ des moyens de gestion du processus de traitement (94, 95, 96).
45. Dispositif détecteur (21) selon la revendication 44 caractérisé en ce que les moyens de gestion du processus comprennent une alimentation (94) assurant la fourniture en énergie à un étage de puissance (96) sous le contrôle d’une électronique de commande (95).
46. Dispositif détecteur (21) selon l’une des revendications 44 ou 45 caractérisé en ce que les moyens de chauffage des capsules (62) sont constitués de résistances chauffantes (97) préférentiellement disposées sous chacune des capsules (62) et aptes à porter ces dernières à une température notamment de l’ordre de 65°C.
47. Dispositif détecteur (21 ) selon l’une des revendications 44 à 46 caractérisé en ce que les moyens de détection de fluorescence comprennent des moyens d’éclairage, notamment constitués par des diodes électroluminescentes (LED) (98), qui sont disposées sous les capsules (62) et par un filtre jaune disposé au-dessus de celles-ci.
48. Dispositif détecteur (21) selon la revendication 47 caractérisé en ce que le filtre jaune est constitué par le couvercle (92) du boîtier (91 ).
49. Procédé de mise en oeuvre d’un dispositif détecteur (21) selon l’une des revendications 44 à 48 caractérisé en ce qu’il comporte les étapes dans lesquelles :
■ l’utilisateur dispose une ou plusieurs capsules dans les empreintes (89) de la platine (93) du dispositif détecteur (21),
■ l’électronique de commande (95) active le chauffage des résistances (97) disposées sous la ou les capsules (62) que l’on vient d’introduire dans le dispositif détecteur (21 ) à une valeur d’environ 65°C,
■ l’électronique de commande (95) maintient cette température sous la ou lesdites capsules pendant une durée d’environ 45 minutes, ■ l’électronique de commande (95) baisse ensuite la température appliquée à la ou auxdites capsules à une valeur d’environ 25°C,
■ l’électronique de commande émet alors un signal, notamment un signal sonore, signalant la fin du traitement pour cette ou ces capsules et allume sous cette ou ces dernières une lumière de couleur bleue,
■ l’utilisateur dispose alors sur la ou les susdites capsules traitées un filtre de couleur jaune et notamment le couvercle (92) transparent et teinté en jaune, afin de détecter la fluorescence éventuelle,
■ l’utilisateur retire alors la ou les capsules traitées du dispositif détecteur (21 ).
50. Système de diagnostic caractérisé en ce qu’il comprend un système de test selon les revendications 17 à 30 et 34 à 40 et un dispositif détecteur selon les revendications 44 à 48.
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