CA2228737A1 - Carte d'analyse a usage unique comprenant un conduit d'ecoulement de liquides - Google Patents
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Abstract
Dispositif d'analyse (1) comprenant un corps (2) dans lequel sont disposés ou ménagés: un orifice (3) d'introduction d'un échantillon liquide de départ; un circuit (5) de circulation de liquide, comprenant au moins une enceinte opératoire (6) pour un échantillon liquide traité, obtenu avec tout ou partie de l'échantillon de départ, communiquant avec ledit orifice d'introduction (3), ledit circuit de circulation décrivant, dans au moins deux dimensions de la carte, une ligne géométrique déterminée, en sorte que tout changement d'orientation de la carte dans un référentiel tridimensionnel, comportant une dimension verticale de référence, fait circuler le liquide par gravité uniquement, d'une section à une autre dudit circuit, par exemple d'un côté ou de l'autre avec l'enceinte opératoire (6); caractérisé en ce que, le circuit (5) de circulation est continu et bouclé sur lui-même entre ledit orifice d'introduction (3) et ladite enceinte opératoire (6).
Description
CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCT~FR97/01020 Carte d'analyqe a usage unigue comprenant un conduit ~'écoulement de liguides La présente invention concerne l'analyse d'un ou plusieurs echantillons liquides différents, dans lequel ou 0 5 lesquels on cherche a identifier, détecter et/ou quantifier un ou plusieurs analytes, selon tous processus simples ou complexes d'analyse, mettant en jeu un ou plusieurs réactifs différents, selon la nature chimique, biochimique, biologique, ou physique du ou des analytes 10 recherchés.
Les principes techniques, définis et decrits ci-apres, ne sont pas limités a un analyte particulier, ce terme generique designant aussi bien une composition, un composé, que toutes especes chimiques, biochimiques, ou 15 biologiques ou autres entit~s, la seule condition requise etant que l'analyte soit distribue dans l'echantillon liquide de depart, a analyser, en suspension ou solution.
En particulier, le processus d'analyse mis en oeuvre peut etre effectué, sous formes homogene ou heterogene, ou 20 mixte.
A titre d'exemple non limitatif, la présente invention sera néanmoins illustrée par référence a l'analyse biologique, d'un ou plusieurs ligands, nécessitant pour leur détection et/ou quantification 25 l'utilisation d'un ou plusieurs anti-ligands. Par "ligand", on entend toute espece biologique, par exemple un antigene, un anticorps, un acide nucléique, un fragment d'acide nucleique, ou un oligonucleotide, susceptible de se lier, avec un anti-ligand. Par conséquent, un exemple 30 d'application des techniques d'analyse décrites ci-apres concerne les immuno-essais, quel que soit leur format, par exemple par analyse directe ou par competition. Mais bien entendu, dans le domaine biologique, les techniques d'analyse decrites ci-apres sont appliquées de la même 35 maniere a la détection et/ou la quantification d'un matériel nucl~ique ou de nucléotides.
CA 02228737 1998-02-0~
W O97/46318 PCT~R97/01020 Dans le domaine de l'analyse biologique en particulier, et à titre de produits jetables ou à usage unique, des dispositifs ou cartes d'analyse sont actuellement fabriques et disponibles, lesquels comprennent de manière générale un corps sous forme de plaque, dans lequel sont disposes ou menages :
- un orifice d'introduction d'un echantillon liquide de depart;
- une pluralite ou multiplicité d'enceintes operatoires, contenant des réactifs respectivement différents, et agencees chacune pour recevoir une quote-part ou aliquote de l'echantillon li~uide de depart, traitee dans chaque dite enceinte opératoire;
- une pluralité ou multiplicité de conduits de transfert de liquide, disposes en parallèle les uns par rapport aux autres, et communiquant chacun d'un coté avec l'orifice dlintroduction et de l'autre côté avec une enceinte opératoire.
Avec une telle carte d'analyse, dont le volume interne constitué par les éléments précités a été
préalablement mis sous vide ou sous dépression, on introduit l'échantillon liquide de départ, à analyser, par l'orifice d'introduction, moyennant quoi le liquide de l'échantillon se trouve introduit et distribué, sans autre intervention, dans les différentes enceintes opératoires.
Puis la carte d'analyse est scellée au niveau de son orifice d'introduction, puis soumise à differents traitements, notamment d'incubation, pour développer les réactions propres au processus d'analyse retenu dans les differentes enceintes operatoires, respectivement. Et finalement, la détection et/ou quantification des produits de réaction, par exemple par voie optique, dans les différentes enceintes operatoires, fournit un ensemble d'informations qualitatives et/ou quantitatives, permettant d'exprimer un résultat d'analyse.
CA 02228737 1998-02-0~
WO 97/46318 PCT~R97/Ola20 Comme dit précédemment, les différentes étapes ou séquences requises par l'analyse, une fois la carte ~ d'analyse scellee, sont en général mises en oeuvre de manière automatique dans un équipement d'analyse approprié, contrôlé ou commandé, notamment programmé pour dérouler automatiquement les opérations requises.
Il r~sulte de la description précédente qu'une telle carte d'analyse constitue en quelque sorte un composant passif, au sens o~ il n'est plus possible de déplacer un meme échantillon liquide de départ, ou un echantillon liquide traité, d'une enceinte opératoire à
une autre, pour effectuer au sein de la même carte d'analyse tout processus de traitement requis pour la détermination de l'analyte.
Conformément au document EP-A-o 339 277, on a décrit une carte d'analyse constituant un composant actif, au sens où son agencement permet de déplacer tout échantillon liquide d'un endroit à un autre de la carte. A
cette fin, le dispositif d'analyse propose comprend un corps de forme aplatie, dans lequel sont disposés ou menagés:
- outre un orifice d'introduction d'un échantillon liquide de départ, - un circuit de circulation de liquide, susceptible d'être isole de l'extérieur, par o~turation définitive de l'orifice d'introduction, comprenant au moins une enceinte operatoire pour l'echantillon liquide traité, obtenu avec tout ou partie de l'échantillon de départ, et communiquant avec ledit orifice d'introduction;
ce circuit de circulation décrit, dans deux dimensions de la carte, une ligne géométrique composée d'une extrémité à
une autre de branches successives, dont certaines en "cul de sac", en sorte que, dans un plan ou referentiel vertical, tout changement d'orientation de la carte, fait circuler le liquide par gravité uniquement, d'une section ou branche à une autre section ou branche du même circuit, CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCT~FR97/01020 par exemple d'un côté ou de l'autre de l'enceinte opératoire.
Une telle carte, de dimensions relativement importantes, permet de faire circuler tout liquide par simple gravité, dans le circuit de circulation isolé par rapport a l'extérieur, en raison de la section relativement importante ou ouverte dudit circuit.
Tel n'est pas le cas avec une carte de dimensions relativement faibles, et/ou mettant en oeuvre un circuit de section relativement faible, du type conduit capillaire, pour lequel les forces de tension superficielle s'opposent à la circulation de tout liquide, lorsque ledit circuit est isolé de l'extérieur.
La présente invention a donc pour objet un dispositif d'analyse, notamment carte d'analyse a usage unique, permettant, une fois ledit dispositif scellé ou fermé par rapport à l'extérieur, une circulation réguliare de tout échantillon liquide, y compris dans le cas d'un circuit de circulation de type capillaire.
Comme précédemment, la gravité est retenue comme source de d~placement ou mouvement de tout liquide au sein de la carte. Et selon l'invention, le circuit de circulation est à la fois continu, et bouclé sur lui-meme, entre l'ori~ice d'introduction et l'enceinte opératoire.
En particulier, lorsque le dispositif comprend au moins un conduit de transfert de liquide, disposé ou ménagé dans le corps, communiquant d'un coté avec l'orifice d'introduction, et de l'autre coté avec l'enceinte opératoire, le circuit de circulation continu est bouclé sur le conduit de transfert.
Par "continu", on entend la caractéristique selon laquelle toute portion du circuit de circulation consid~ré
comporte de part et d'autre respectivement deux orifices d'entrée et/ou sortie. Cette qualification s'oppose en particulier à la notion de "cul de sac", qui implique que la portion du circuit considére ne comporte qu'un seul CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCTn~R97/01020 orifice d'entree et/ou sortie. Cette qualification n'est pas exclusive de la caracteristique selon laquelle un ou plusieurs circuits ou conduits, eux-mêmes "sans issue"
peuvent communiquer avec ou se brancher sur le circuit continu consideré.
Par "bouclé sur lui-même", on entend la caractéristique selon laquelle le circuit continu de circulation forme dans l'espace, c'est-à-dire dans le volume du corps de la carte d'analyse, une boucle complète, en sorte que tout volume de liquide présent dans le conduit se trouve sensiblement en équi-pression des deux côtés de la colonne de liquide ainsi formee. Une telle caracteristique permet de deplacer cette même colonne de liquide, sans aucune contrainte ou resistance, puisque le volume gazeux pousse d'un c8te se trouve recyclé ou renvoye de l'autre cote de la meme colonne.
Bien entendu, comme dit plus haut, ce conduit continu de circulation, boucle sur lui-même communique par ailleurs avec un ou plusieurs orifices d'introduction des échantillons liquides, et un ou plusieurs orifices d'évent, comme décrit ci-apres.
Par conséquent, selon l'invention, la circulation des liquides s'effectue dans la carte d'analyse, par simple gravité, s~ns résistance particuliere, resultant de la dépression créée par l'écoulement ou la capillarité, et ce uniquement en changeant l'orientation de la carte. Bien entendu, pour obtenir un tel deplacement, il faut disposer d'une hauteur de liquide suffisante, pour l'echantillon liquide traite ; mais l'homme de metier est a même de determiner cette hauteur minimum, en fonction notamment du liquide traite et de ses caracteristiques, et de celles du conduit continu de circulation, et ceci par des essais de routine.
Preferentiellement, lorsque le corps de la carte d'analyse a la forme d'une plaque, la ligne géometrique décrite par le circuit continu de circulation comprend au CA 02228737 1998-02-0~
W O97/46318 PCTrFR97/01020 moins un segment planaire, situe dans un plan, par exemple parallèle ou confondu avec l'une des faces de la plaque;
et ce segment planaire decrit lui-même une ligne regulière, par exemple selon au moins une portion sensiblement circulaire, en sorte que la plaque etant disposee verticalement, le changement d'orientation de la carte, par exemple autour d'un axe perpendiculaire à la plaque et passant sensiblement par le centre de ladite portion circulaire, fait circuler le liquide d'une section a une autre du circuit continu de circulation.
La portion consideree du segment planaire de circulation peut être egalement de forme sinusoïdale.
La carte d'analyse precedemment de~inie presente bien d'autres avantages.
La circulation du liquide sous simple gravite, c'est-à-dire sans mettre en oeuvre ou en jeu des energies importantes, permet d'eviter pratiquement toute formation de bulles, par dissolution ou relargage des gaz, au sein des liquides en circulation. Mieux encore, la circulation d'un echantillon liquide au sein de la carte, presentant lui-même au depart des bulles ou microbulles, permet pratiquement en totalite d'eliminer ou degazer ces dernières. Ceci constitue un avantage fondamental, compte tenu en particulier de la taille, par exemple capillaire, des veines liquides susceptibles de circuler dans de telles cartes, etant entendu que la presence de bulles, aussi petites soient telles, perturbe ou contrarie, non seulement le regime d'ecoulement des liquides, mais aussi la precision de leur deplacement et de leur observation, par exemple par voie optique, et par consequent influence la qualite de l'analyse.
Et le dispositif ou carte d'analyse selon l'invention peut etre aisement manipulé ou traite, ce qui veut dire que l'equipement correspondant est agencé avec des mecanismes ou automatismes, notamment une robotique, particulièrement simple.
CA 02228737 l998-02-0~
WO 97/46318 PCTn~R97/~1020 La presente invention est maintenant decrite par référence au dessin annexé, dans lequel :
- la Figure 1 représente en perspective, et avec arrachement partiel, une carte d'analyse selon un premier ~ 5 mode d'execution de l'invention - les Figures 2 et 3 representent des coupes partielles verticales respectivement selon les lignes II-II et III-III de la Figure 1 - les Figures 4, 5 et 6 representent des vues schematiques de la carte d'analyse representée a la Figure 1, pour trois phases de manipulation de la carte d'analyse respectivement differentes - les Figures 7 a 9 representent de maniere schématique trois modes respectivement diff~rents du moyen d'arrêt du liquide, represente schématiquement a la Figure 1 sous la réference 18 - la Figure 10 représente en vue de face une carte d'analyse selon un deuxième mode d'exécution de l'invention 20- la Figure 11 représente une vue en coupe verticale partielle de la carte d'analyse selon Figure 10 - les Figues 12 a 15 représentent trois modes d'execution différents du moyen d'obturation définitive d'un orifice d'évent, et/ou d'un orifice d'introduction, portant la référence numérique 9 sur toutes les figures.
- la Figure 16 représente de maniere schématique une carte d'analyse, vue de face, selon un troisieme mode d'exécution de l'invention - la Figure 17 représente, toujours we de face, une carte d'analyse selon l'invention, selon un quatrieme mode d'exécution - la Figure 18 représente une vue en coupe verticale, selon la ligne XVIII-XVIII de la Figure 17, de ~ la carte d'analyse montrée a la Figure 17 35- les Figures 19 et 20 representent, de maniere schematique, la carte d'analyse representee a la Figure CA 02228737 1998-02-0~
WO 97/46318 PCT~FR97/01020 17, dans deux positions respectivement differentes correspondant à deux phases de manipulation différentes de la carte d'analyse - la Figure 21 représente un mode d'execution d'un dispositif selon l'invention, tel qu'utilisé pour l'essai décrit à l'exemple ~.
Il doit ~tre prealablement entendu que les représentations des dessins ne sont pas à l'échelle réelle, et qu'en particulier la dimension du ou des conduits de circulation a éte volontairement exagérée, aux fins de l'explication de la présente invention.
D'un point de vue fluidique, la carte d'analyse l représentee a la Figure 1 comprend un circuit 5 continu de circulation de liquide, intégré ou dispose au moins pour partie dans le corps 2 ayant la forme d'une plaque, de la carte d'analyse l.
Comme le montre la Figure 1, et toujours sous l'angle fluidi~ue, le circuit 5 continu de circulation rassemble selon une boucle :
- une enceinte operatoire 6, qui peut être materialisee ou non, notamment par la présence interne de réactif;
- un conduit de transfert 7 communiquant par une voie en dérivation avec un orifice 3 d'introduction d'un échantillon liquide de départ;
- un conduit 61 de retour vers le conduit de transfert 7, communiquant par une derivation avec un orifice d'évent 8;
- une cuve d'observation 17.
Par "enceinte opératoire", on entend toute enceinte, quelle que soit sa forme materielle, permettant d'effectuer toute operation ou traitement de l'echantillon liquide traite, dans le laps de temps pendant lequel ledit échantillon séjourne dans ladite enceinte. L'opération considerée peut être de nature physique, mécanique, chimique, biochimique, ou biologique. A cette fin, CA 02228737 1998-02-0~
WO97/46318 PCTA~R97/~1020 l'enceinte considérée peut contenir, préalablement (par exemple sous forme seche et/ou liquide), ou au moment de l'opération ou traitement, tous réactifs ou moyens matériels aidant ladite opération.
~ 5 Par "cuve d'observation", on entend tout moyen ménagé ou disposé dans le corps, permettant d'obtenir une information qualitative et/ou quantitative a partir d'un ou plusieurs paramètres ou caractéristiques, observés directement ou indirectement dans tout liquide présent dans ladite cuve 17. A titre d'exemple, et pour une analyse biologique, la cuve d'observation, qui communique avec et est comprise dans le circuit 5, est agencée, notamment avec des parois transparentes, pour détecter ou mesurer un parametre, notamment optique, par exemple une fluorescence, pour obtenir un signal représentatif de la présence et/ou de la quantité d'un analyte biologique, par exemple un anticorps, un acide nucléique ou analogue.
Il résulte de la description précédente, que mis à
part les dérivations ou branchements vers l'orifice d'introduction 3 et l'orifice d'évent 8, le circuit 5 est bouclé sur lui-même, au sens où un échantillon liquide y circulant à partir d'un point donné peut être recyclé vers ce point.
Selon l'invention, le circuit continu 5 de circulation décrit dans deux dimensions de la carte 1, une ligne géométrique déterminée, en l'occurrence circulaire, en sorte que tout changement d'orientation de la carte, disposée verticalement, comme montré a la Figure 4, par rapport à un référentiel tridimensionnel comportant une dimension verticale de référence, fait circuler le liquide présent dans le circuit, uniquement par gravité d'une section à une autre, par exemple d'un côté ou de l'autre de l'enceinte opératoire 6, et ceci de manière contrôlée en fonction de l'amplitude du changement d'orientation par rapport au référentiel précité.
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W O97/46318 PCTA~R97/01020 En pratique, comme montré a la Figure 1, le corps
W O 97/46318 PCT~FR97/01020 Carte d'analyqe a usage unigue comprenant un conduit ~'écoulement de liguides La présente invention concerne l'analyse d'un ou plusieurs echantillons liquides différents, dans lequel ou 0 5 lesquels on cherche a identifier, détecter et/ou quantifier un ou plusieurs analytes, selon tous processus simples ou complexes d'analyse, mettant en jeu un ou plusieurs réactifs différents, selon la nature chimique, biochimique, biologique, ou physique du ou des analytes 10 recherchés.
Les principes techniques, définis et decrits ci-apres, ne sont pas limités a un analyte particulier, ce terme generique designant aussi bien une composition, un composé, que toutes especes chimiques, biochimiques, ou 15 biologiques ou autres entit~s, la seule condition requise etant que l'analyte soit distribue dans l'echantillon liquide de depart, a analyser, en suspension ou solution.
En particulier, le processus d'analyse mis en oeuvre peut etre effectué, sous formes homogene ou heterogene, ou 20 mixte.
A titre d'exemple non limitatif, la présente invention sera néanmoins illustrée par référence a l'analyse biologique, d'un ou plusieurs ligands, nécessitant pour leur détection et/ou quantification 25 l'utilisation d'un ou plusieurs anti-ligands. Par "ligand", on entend toute espece biologique, par exemple un antigene, un anticorps, un acide nucléique, un fragment d'acide nucleique, ou un oligonucleotide, susceptible de se lier, avec un anti-ligand. Par conséquent, un exemple 30 d'application des techniques d'analyse décrites ci-apres concerne les immuno-essais, quel que soit leur format, par exemple par analyse directe ou par competition. Mais bien entendu, dans le domaine biologique, les techniques d'analyse decrites ci-apres sont appliquées de la même 35 maniere a la détection et/ou la quantification d'un matériel nucl~ique ou de nucléotides.
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W O97/46318 PCT~R97/01020 Dans le domaine de l'analyse biologique en particulier, et à titre de produits jetables ou à usage unique, des dispositifs ou cartes d'analyse sont actuellement fabriques et disponibles, lesquels comprennent de manière générale un corps sous forme de plaque, dans lequel sont disposes ou menages :
- un orifice d'introduction d'un echantillon liquide de depart;
- une pluralite ou multiplicité d'enceintes operatoires, contenant des réactifs respectivement différents, et agencees chacune pour recevoir une quote-part ou aliquote de l'echantillon li~uide de depart, traitee dans chaque dite enceinte opératoire;
- une pluralité ou multiplicité de conduits de transfert de liquide, disposes en parallèle les uns par rapport aux autres, et communiquant chacun d'un coté avec l'orifice dlintroduction et de l'autre côté avec une enceinte opératoire.
Avec une telle carte d'analyse, dont le volume interne constitué par les éléments précités a été
préalablement mis sous vide ou sous dépression, on introduit l'échantillon liquide de départ, à analyser, par l'orifice d'introduction, moyennant quoi le liquide de l'échantillon se trouve introduit et distribué, sans autre intervention, dans les différentes enceintes opératoires.
Puis la carte d'analyse est scellée au niveau de son orifice d'introduction, puis soumise à differents traitements, notamment d'incubation, pour développer les réactions propres au processus d'analyse retenu dans les differentes enceintes operatoires, respectivement. Et finalement, la détection et/ou quantification des produits de réaction, par exemple par voie optique, dans les différentes enceintes operatoires, fournit un ensemble d'informations qualitatives et/ou quantitatives, permettant d'exprimer un résultat d'analyse.
CA 02228737 1998-02-0~
WO 97/46318 PCT~R97/Ola20 Comme dit précédemment, les différentes étapes ou séquences requises par l'analyse, une fois la carte ~ d'analyse scellee, sont en général mises en oeuvre de manière automatique dans un équipement d'analyse approprié, contrôlé ou commandé, notamment programmé pour dérouler automatiquement les opérations requises.
Il r~sulte de la description précédente qu'une telle carte d'analyse constitue en quelque sorte un composant passif, au sens o~ il n'est plus possible de déplacer un meme échantillon liquide de départ, ou un echantillon liquide traité, d'une enceinte opératoire à
une autre, pour effectuer au sein de la même carte d'analyse tout processus de traitement requis pour la détermination de l'analyte.
Conformément au document EP-A-o 339 277, on a décrit une carte d'analyse constituant un composant actif, au sens où son agencement permet de déplacer tout échantillon liquide d'un endroit à un autre de la carte. A
cette fin, le dispositif d'analyse propose comprend un corps de forme aplatie, dans lequel sont disposés ou menagés:
- outre un orifice d'introduction d'un échantillon liquide de départ, - un circuit de circulation de liquide, susceptible d'être isole de l'extérieur, par o~turation définitive de l'orifice d'introduction, comprenant au moins une enceinte operatoire pour l'echantillon liquide traité, obtenu avec tout ou partie de l'échantillon de départ, et communiquant avec ledit orifice d'introduction;
ce circuit de circulation décrit, dans deux dimensions de la carte, une ligne géométrique composée d'une extrémité à
une autre de branches successives, dont certaines en "cul de sac", en sorte que, dans un plan ou referentiel vertical, tout changement d'orientation de la carte, fait circuler le liquide par gravité uniquement, d'une section ou branche à une autre section ou branche du même circuit, CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCT~FR97/01020 par exemple d'un côté ou de l'autre de l'enceinte opératoire.
Une telle carte, de dimensions relativement importantes, permet de faire circuler tout liquide par simple gravité, dans le circuit de circulation isolé par rapport a l'extérieur, en raison de la section relativement importante ou ouverte dudit circuit.
Tel n'est pas le cas avec une carte de dimensions relativement faibles, et/ou mettant en oeuvre un circuit de section relativement faible, du type conduit capillaire, pour lequel les forces de tension superficielle s'opposent à la circulation de tout liquide, lorsque ledit circuit est isolé de l'extérieur.
La présente invention a donc pour objet un dispositif d'analyse, notamment carte d'analyse a usage unique, permettant, une fois ledit dispositif scellé ou fermé par rapport à l'extérieur, une circulation réguliare de tout échantillon liquide, y compris dans le cas d'un circuit de circulation de type capillaire.
Comme précédemment, la gravité est retenue comme source de d~placement ou mouvement de tout liquide au sein de la carte. Et selon l'invention, le circuit de circulation est à la fois continu, et bouclé sur lui-meme, entre l'ori~ice d'introduction et l'enceinte opératoire.
En particulier, lorsque le dispositif comprend au moins un conduit de transfert de liquide, disposé ou ménagé dans le corps, communiquant d'un coté avec l'orifice d'introduction, et de l'autre coté avec l'enceinte opératoire, le circuit de circulation continu est bouclé sur le conduit de transfert.
Par "continu", on entend la caractéristique selon laquelle toute portion du circuit de circulation consid~ré
comporte de part et d'autre respectivement deux orifices d'entrée et/ou sortie. Cette qualification s'oppose en particulier à la notion de "cul de sac", qui implique que la portion du circuit considére ne comporte qu'un seul CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCTn~R97/01020 orifice d'entree et/ou sortie. Cette qualification n'est pas exclusive de la caracteristique selon laquelle un ou plusieurs circuits ou conduits, eux-mêmes "sans issue"
peuvent communiquer avec ou se brancher sur le circuit continu consideré.
Par "bouclé sur lui-même", on entend la caractéristique selon laquelle le circuit continu de circulation forme dans l'espace, c'est-à-dire dans le volume du corps de la carte d'analyse, une boucle complète, en sorte que tout volume de liquide présent dans le conduit se trouve sensiblement en équi-pression des deux côtés de la colonne de liquide ainsi formee. Une telle caracteristique permet de deplacer cette même colonne de liquide, sans aucune contrainte ou resistance, puisque le volume gazeux pousse d'un c8te se trouve recyclé ou renvoye de l'autre cote de la meme colonne.
Bien entendu, comme dit plus haut, ce conduit continu de circulation, boucle sur lui-même communique par ailleurs avec un ou plusieurs orifices d'introduction des échantillons liquides, et un ou plusieurs orifices d'évent, comme décrit ci-apres.
Par conséquent, selon l'invention, la circulation des liquides s'effectue dans la carte d'analyse, par simple gravité, s~ns résistance particuliere, resultant de la dépression créée par l'écoulement ou la capillarité, et ce uniquement en changeant l'orientation de la carte. Bien entendu, pour obtenir un tel deplacement, il faut disposer d'une hauteur de liquide suffisante, pour l'echantillon liquide traite ; mais l'homme de metier est a même de determiner cette hauteur minimum, en fonction notamment du liquide traite et de ses caracteristiques, et de celles du conduit continu de circulation, et ceci par des essais de routine.
Preferentiellement, lorsque le corps de la carte d'analyse a la forme d'une plaque, la ligne géometrique décrite par le circuit continu de circulation comprend au CA 02228737 1998-02-0~
W O97/46318 PCTrFR97/01020 moins un segment planaire, situe dans un plan, par exemple parallèle ou confondu avec l'une des faces de la plaque;
et ce segment planaire decrit lui-même une ligne regulière, par exemple selon au moins une portion sensiblement circulaire, en sorte que la plaque etant disposee verticalement, le changement d'orientation de la carte, par exemple autour d'un axe perpendiculaire à la plaque et passant sensiblement par le centre de ladite portion circulaire, fait circuler le liquide d'une section a une autre du circuit continu de circulation.
La portion consideree du segment planaire de circulation peut être egalement de forme sinusoïdale.
La carte d'analyse precedemment de~inie presente bien d'autres avantages.
La circulation du liquide sous simple gravite, c'est-à-dire sans mettre en oeuvre ou en jeu des energies importantes, permet d'eviter pratiquement toute formation de bulles, par dissolution ou relargage des gaz, au sein des liquides en circulation. Mieux encore, la circulation d'un echantillon liquide au sein de la carte, presentant lui-même au depart des bulles ou microbulles, permet pratiquement en totalite d'eliminer ou degazer ces dernières. Ceci constitue un avantage fondamental, compte tenu en particulier de la taille, par exemple capillaire, des veines liquides susceptibles de circuler dans de telles cartes, etant entendu que la presence de bulles, aussi petites soient telles, perturbe ou contrarie, non seulement le regime d'ecoulement des liquides, mais aussi la precision de leur deplacement et de leur observation, par exemple par voie optique, et par consequent influence la qualite de l'analyse.
Et le dispositif ou carte d'analyse selon l'invention peut etre aisement manipulé ou traite, ce qui veut dire que l'equipement correspondant est agencé avec des mecanismes ou automatismes, notamment une robotique, particulièrement simple.
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WO 97/46318 PCTn~R97/~1020 La presente invention est maintenant decrite par référence au dessin annexé, dans lequel :
- la Figure 1 représente en perspective, et avec arrachement partiel, une carte d'analyse selon un premier ~ 5 mode d'execution de l'invention - les Figures 2 et 3 representent des coupes partielles verticales respectivement selon les lignes II-II et III-III de la Figure 1 - les Figures 4, 5 et 6 representent des vues schematiques de la carte d'analyse representée a la Figure 1, pour trois phases de manipulation de la carte d'analyse respectivement differentes - les Figures 7 a 9 representent de maniere schématique trois modes respectivement diff~rents du moyen d'arrêt du liquide, represente schématiquement a la Figure 1 sous la réference 18 - la Figure 10 représente en vue de face une carte d'analyse selon un deuxième mode d'exécution de l'invention 20- la Figure 11 représente une vue en coupe verticale partielle de la carte d'analyse selon Figure 10 - les Figues 12 a 15 représentent trois modes d'execution différents du moyen d'obturation définitive d'un orifice d'évent, et/ou d'un orifice d'introduction, portant la référence numérique 9 sur toutes les figures.
- la Figure 16 représente de maniere schématique une carte d'analyse, vue de face, selon un troisieme mode d'exécution de l'invention - la Figure 17 représente, toujours we de face, une carte d'analyse selon l'invention, selon un quatrieme mode d'exécution - la Figure 18 représente une vue en coupe verticale, selon la ligne XVIII-XVIII de la Figure 17, de ~ la carte d'analyse montrée a la Figure 17 35- les Figures 19 et 20 representent, de maniere schematique, la carte d'analyse representee a la Figure CA 02228737 1998-02-0~
WO 97/46318 PCT~FR97/01020 17, dans deux positions respectivement differentes correspondant à deux phases de manipulation différentes de la carte d'analyse - la Figure 21 représente un mode d'execution d'un dispositif selon l'invention, tel qu'utilisé pour l'essai décrit à l'exemple ~.
Il doit ~tre prealablement entendu que les représentations des dessins ne sont pas à l'échelle réelle, et qu'en particulier la dimension du ou des conduits de circulation a éte volontairement exagérée, aux fins de l'explication de la présente invention.
D'un point de vue fluidique, la carte d'analyse l représentee a la Figure 1 comprend un circuit 5 continu de circulation de liquide, intégré ou dispose au moins pour partie dans le corps 2 ayant la forme d'une plaque, de la carte d'analyse l.
Comme le montre la Figure 1, et toujours sous l'angle fluidi~ue, le circuit 5 continu de circulation rassemble selon une boucle :
- une enceinte operatoire 6, qui peut être materialisee ou non, notamment par la présence interne de réactif;
- un conduit de transfert 7 communiquant par une voie en dérivation avec un orifice 3 d'introduction d'un échantillon liquide de départ;
- un conduit 61 de retour vers le conduit de transfert 7, communiquant par une derivation avec un orifice d'évent 8;
- une cuve d'observation 17.
Par "enceinte opératoire", on entend toute enceinte, quelle que soit sa forme materielle, permettant d'effectuer toute operation ou traitement de l'echantillon liquide traite, dans le laps de temps pendant lequel ledit échantillon séjourne dans ladite enceinte. L'opération considerée peut être de nature physique, mécanique, chimique, biochimique, ou biologique. A cette fin, CA 02228737 1998-02-0~
WO97/46318 PCTA~R97/~1020 l'enceinte considérée peut contenir, préalablement (par exemple sous forme seche et/ou liquide), ou au moment de l'opération ou traitement, tous réactifs ou moyens matériels aidant ladite opération.
~ 5 Par "cuve d'observation", on entend tout moyen ménagé ou disposé dans le corps, permettant d'obtenir une information qualitative et/ou quantitative a partir d'un ou plusieurs paramètres ou caractéristiques, observés directement ou indirectement dans tout liquide présent dans ladite cuve 17. A titre d'exemple, et pour une analyse biologique, la cuve d'observation, qui communique avec et est comprise dans le circuit 5, est agencée, notamment avec des parois transparentes, pour détecter ou mesurer un parametre, notamment optique, par exemple une fluorescence, pour obtenir un signal représentatif de la présence et/ou de la quantité d'un analyte biologique, par exemple un anticorps, un acide nucléique ou analogue.
Il résulte de la description précédente, que mis à
part les dérivations ou branchements vers l'orifice d'introduction 3 et l'orifice d'évent 8, le circuit 5 est bouclé sur lui-même, au sens où un échantillon liquide y circulant à partir d'un point donné peut être recyclé vers ce point.
Selon l'invention, le circuit continu 5 de circulation décrit dans deux dimensions de la carte 1, une ligne géométrique déterminée, en l'occurrence circulaire, en sorte que tout changement d'orientation de la carte, disposée verticalement, comme montré a la Figure 4, par rapport à un référentiel tridimensionnel comportant une dimension verticale de référence, fait circuler le liquide présent dans le circuit, uniquement par gravité d'une section à une autre, par exemple d'un côté ou de l'autre de l'enceinte opératoire 6, et ceci de manière contrôlée en fonction de l'amplitude du changement d'orientation par rapport au référentiel précité.
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W O97/46318 PCTA~R97/01020 En pratique, comme montré a la Figure 1, le corps
2 ayant la forme d'une plaque, la ligne géométrique decrite par le circuit 5 comprend un segment planaire 51, confondu avec la face 2a de la plaque, et ce segment planaire 51 comprend ou est constitué par une portion sensiblement circulaire, formant ainsi une ligne réguliere. De cette maniere, la carte d'analyse 1 étant disposée verticalement, tout changement d'orientation de la carte dans le plan vertical autour d'un axe 77 perpendiculaire a la plaque 2, et passant de préférence sensiblement par le centre de la portion circulaire définie par le segment planaire 51, fait circuler le liquide d'une section a une autre du circuit 5, par exemple d'un côté ou de l'autre de l'enceinte opératoire 6.
Il doit être entendu que la ligne géométrique décrite par le segment planaire 51 peut être réguliere ou brisée, et que ce même segment peut comprendre aussi bien une portion sensiblement circulaire qu'une portion sensiblement sinuso~dale. Mais cette ligne géom~trique demeure continue, au sens de la définition énoncée précedemment.
Comme le montre la Figure 1, l'orifice d'évent 8 communi~ue avec le circuit 5 en un point de jonction différent du point de jonction de l'orifice d'introduction
Il doit être entendu que la ligne géométrique décrite par le segment planaire 51 peut être réguliere ou brisée, et que ce même segment peut comprendre aussi bien une portion sensiblement circulaire qu'une portion sensiblement sinuso~dale. Mais cette ligne géom~trique demeure continue, au sens de la définition énoncée précedemment.
Comme le montre la Figure 1, l'orifice d'évent 8 communi~ue avec le circuit 5 en un point de jonction différent du point de jonction de l'orifice d'introduction
3 avec le circuit 5.
De maniere non représentée, mais comme il sera décrit ci-apres par référence aux Figures 11 a 15, l'orifice d'évent 8 et l'orifice d'introduction 3 comportent ou sont associés a des moyens d'obturation dé~initive, par exemple scellement.
Une cuve de décantation 15 est disposée ou menag~e dans le corps 2, en aval de l'orifice d'introduction 3, dans le sens d'introduction de l'échantillon liquide, et le circuit 5 peut être bouclé soit sur la cuve 15 de décantation, soit en aval de cette dernière.
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L'enceinte operatoire 6 est delimit~e dans le circuit 5 continu de circulation, dans le sens d'introduction de l'échantillon liquide, par au moins un moyen d'arrêt 18 du liquide introduit, choisi ou agencé
~ 5 pour libérer le passage dudit liquide sous l'effet d'une charge hydrostatique minimum. A cette fin, différents moyens représentés aux Figures 7 a 9 peuvent être utilisés:
- le moyen d'arrêt 18 est un agencement local du circuit 5 continu de circulation, générant une perte de charge, par exemple par un etranglement 19 montré a la Figure 9, ou une chicane 20 montr~e a la Figure 8 ; cette chicane 20 est obtenue, en passant de la face superieure 2a a la face inférieure 2b du corps 2 par un premier conduit vertical traversant, en circulant sur la face inferieure 2b, puis en remontant vers la face superieure 2a, par un deuxième conduit traversant;
- de maniere non representée, le moyen d'arrêt 18 peut être constitue par un revêtement local et ponctuel, hydrophobe, du circuit 5, par conséquent a faible mouillage, contrariant, en l'absence d'une charge minimum, la circulation du liquide;
- de maniere plus particuliere, et comme représenté a la ~igure 7, le moyen d'arrêt 18 est constitué par deux encoches, disposées l'une en face de l'autre, de part et d'autre du conduit 5, et formant avec lui une zone locale de rétention du liquide.
En termes de réalisation, la carte d'analyse 2 est obtenue pour l'essentiel, par moulage de précision d'une matiere plastique technique, compatible avec les liquides traités. De cette maniere, directement obtenu par moulage, le circuit 5 est formé au moins pour partie par un canal 25, menagé au moins pour partie a la surface de l'une 2a et/ou l'autre face 2b, étant entendu que, comme le montre la combinaison des Figures 1 et 8, le circuit 5 s'étend sur l'une 2a et/ou l'autre face 2b du corps, parallales CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCT~FR97/01020 l'une a l'autre, en traversant éventuellement de part en part le corps 2, localement, a un ou plusieurs endroits du circuit continu de circulation 5.
De manière à assurer l'étanchéité du circuit 5 par rapport à d'autres circuits ou conduits présents sur le corps 2, mais aussi par rapport à l'extérieur, les deux faces 2a et 2b du corps 2 sont revetues de manière étanche, par deux feuilles ou films, par exemple en matière plastique transparente, 22.
Compte tenu du processus d'analyse à effectuer au sein de la carte 1, l'enceinte opératoire 6 comprend, de manière libre ou fixée par rapport au corps, un ou plusieurs réactifs. Cette fixation peut consister aussi bien dans une liaison chimique covalente du réactif sur la paroi du circuit 5, que dans une liaison faible, par exemple par adsorption ou absorption du réactif sur cette même paroi.
Le fonctionnement de la carte d'analyse 1 peut être expliqué par référence aux Figures 4 à 5, la carte d'analyse 1 étant disposée verticalement.
Par référence à la Figure 4, l'orifice d'introduction 3 et l'orifice d'évent 8 sont ouverts. on introduit l'échantillon liquide à analyser, associé ou non ~ un réactif, par l'orifice 3, moyennant quoi il forme une colonne liquide 62 au bas du circuit 5 en equilibre, et au contact du réactif contenu dans l'enceinte opératoire 6.
Puis les orifices 8 et 3 sont scellés hermétiquement, de telle sorte que la carte se trouve isolee par rapport a l'exterieur.
Par rotation angulaire de la carte 5, de plus ou moins 45~ (selon le sens trigonométrique), on fait circuler l'échantillon liquide, dans un sens puis dans l'autre, au contact du réactif, de telle sorte qu'une reaction se développe entre l'échantillon liquide et le reactif.
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Dans la position angulaire représentee a la Figure 5, la colonne de liquide s'est deplacee dans la cuve d'observation 17. Egalement par rotation de part et d'autre de la position angulaire representee a la Figure ~ 5 5, on peut faire circuler, dans un sens puis dans l'autre, le liquide au travers de la cuve 17. Ainsi, il est possible de détecter et/ou mesurer l'analyte présent dans la cuve 17.
Une fois la mesure effectuée, on revient a la position initiale, representee a la Figure 6, et la carte d'analyse utilisee peut être jetee.
La carte d'analyse selon le deuxieme mode d'execution (conferer Figure 10), differe du premier mode d'exécution, par les points suivants:
- une enceinte 21 est disposée et ménag~e a plat, sensiblement au centre du corps 2, et forme une fois scellée une chambre comprise dans le circuit 5 continu de circulation du liquide ; cette enceinte est scellée et obturée par une membrane qui, par enfoncement et relâchement successifs, permet d'aspirer l'échantillon liquide par l'orifice d'introduction 3;
- l'orifice d'introduction 3 de l'echantillon liquide débouche dans une cuve 15 de decantation, avant de communiquer avec le circuit 5 proprement dit ; la cuve 15 de decantation est pourvue d'au moins un event 81 et/ou 82 qui est ferme quand la cavité 21 est utilisée pour aspirer le liquide et le faire cheminer dans le conduit 5;
- a la sortie de l'enceinte 21, le circuit 5 est bouclé sur la cuve 15 de décantation, par un conduit traversant, passant de la face 2a à la face 2b du corps 2.
L'enceinte 21 a une autre utilite : elle permet en pratique d'absorber les variations de pression, au sein de la carte d'analyse.
Comme montre par les Figures 2 a 14, le moyen d'obturation définitive de l'orifice 3 ou 16 (cf Figure CA 02228737 1998-02-0~
17) et des events 81,82, peut etre choisi parmi les moyens suivants:
- conformément à la Figure 12, ce moyen est un opercule 10 d'obturation definitive;
- conformement aux Figures 13 et 14, ce moyen d'obturation associe le conduit d'introduction 11 de l'échantillon liquide, dont l'extremité active lla peut prendre deux positions par rapport au corps 2, fi savoir une position rétractée (Figure 13) communiquant de manière étanche avec une cavite d'introduction 12 du liquide, et une position avancee (Figure 14), penétrant de maniere étanche dans un orifice ~orgne 13 calibré, menage dans le corps 2; dans cette derniere position, le conduit d'introduction 11 est scelle;
- et une bande adhesive 14 qui est rapportee, de maniere etanche, et adhesive sur l'orifice 3, cf Figure 15.
La carte d'analyse selon le troisième mode d'execution (cf Figure 16), differe du premier mode d'execution par le fait que le segment planaire 51 du circuit 5 décrit une ligne constituée par au moins deux portions 511 et 512 sensiblement circulaires, concentriques, reliées entre elles en série, par un conduit traversant de part en part le corps 2.
Bien entendu, comme non decrit specifiquement par reférence a des figures, mais de maniere parfaitement compréhensible pour l'homme de métier, les variantes suivantes peuvent etre apportées :
- plusieurs enceintes opératoires 6 peuvent être ménagées et disposées dans le corps 2, en étant comprises en série dans le circuit 5 continu de circulation, de telle sorte ~ue le changement d'orientation contrôl~e de la carte 2, permet de ~aire circuler de maniere adaptée l'échantillon liquide dans l'une et/ou l'autre enceinte opératoire;
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- plusieurs circuits 5 continus de circulation de liquide peuvent ~tre disposés ou ménagés dans le corps 2, et être relies entre eux, en serie et/ou en parallèle.
A cet egard, les circuits 5 différents peuvent communiquer avec le même orifice d'introduction 3 ou 16, ou respectivement avec deux orifices distincts 3 et 16, pour deux echantillons liquides respectivement. A cet ~gard, les circuits 5 peuvent communiquer avec la m~me cuve d'observation 17, ou respectivement chacun avec une cuve 17 d'observation distincte pour chaque échantillon traité.
La carte d'analyse selon le quatrième mode d'exécution de l'invention ~conférer Figures 17 à 20), diff~re du premier mode d'exécution par les caracteristiques suivantes.
Comme pour la Figure 16, le circuit 5 comporte un segment planaire 51, constitue par deux portions sensiblement circulaires 511 et 512, et concentriques, reliees entre elles en serie, et ceci en passant au-dessous de la portion 511, comme montre a la Figure 18,sur sa partie droite.
Il existe deux orifices d'introduction de liquide ou reactif, s~par~s, à savoir 3 et 16.
Un circuit annexe 23 est dispose ou menag~ dans le corps 2 sur la face 2a de la plaque correspondante, et comprend:
- une cavité 24, ménagée sur la face 2a, reliee par un conduit d'évacuation 67 au circuit continu de circulation 5, et par un conduit 67 a l'event 8;
- un conduit de transfert 65, dispose ou menage sur la face inférieure 2b, reliant, d'un côte l'orifice d'introduction 16, et de l'autre côte la cavite 24, en son centre.
Il résulte de la description precedente que le circuit annexe 23 communique d'un côte avec le circuit 5, CA 02228737 l998-02-0~
W O 97/46318 PCT~FR97/01020 et ne comporte de l'autre côte aucune issue ou sortie, autre que l'évent 8.
Il résulte aussi de la géométrie du circuit annexe 23, et en particulier de la disposition de la cavite 24, 5 montrees à la Figure 17, que : -- tout changement d'orientation de la carte dans un sens de rotation négatif (par rapport au sens trigonometrique), selon une amplitude limitee, interdit l'introduction de tout liquide contenu dans la cavite annexe 24, dans le circuit 5;
- et inversement, tout changement d'orientation dans l'autre sens de rotation, c'est-à-dire dans le sens positif, permet dlintroduire tout liquide contenu dans la cavité 24 dans le circuit 5 principal.
La caractéristique précédente est évidemment utile, pour stocker provisoirement un réactif, et l'introduire de maniere contrôlée dans le circuit 5, a tout moment du processus d'analyse.
C'est ce que montre en particulier le changement d'orientation entre les Figures 19 et 20, permettant d'introduire le réactif dans la boucle principale.
Par ailleurs, par référence aux figures 17 a 20, le liquide (réactif par exemple) est injecté au niveau de l'orifice d'introduction 16, et gr~ce au conduit 65 remplit la cavité 24, par un orifice de sortie emergeant au sommet d'un teton, situe sensiblement au centre et aux deux tiers de la hauteur de la cavite 24. Une fois la cavité 24 remplie, lors de la rotation de la carte dans le sens de rotation négatif, le liquide reste confin~ dans cette cavité, puis par une nouvelle rotation, toujours dans le sens negatif, le liquide demeure dans cette meme cavité, a la condition que la quantité de liquide soit predeterminee pour ne pas ressortir par l'orifice de sortie, situe aux deux tiers de la hauteur de la cavite 24.
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~ :~LL
Un exemple de mise en oeuvre d'un dispositif dianalyse conforme a la Figure 16 est maintenant décrit.
L'utilisation de ce dispositif pour l'entra~nement automatisé et confiné d'étapes biologiques a été validee dans le cadre de la réalisation d'un test de détection de l'agent de la tuberculose : la bactérie Mycobacterium tuberculoses.
Pour ce faire, des composants de la trousse de diagnostic "MTD-2" disponible auprès de la société Gen-Probe (San Diego, Californie), ont été utilisés. Le principe de ce test repose sur l'amplification sélective in vitro d' acides nucleiques cibles (ARN ribosomique 16S) par la technique "Transcription-Mediated Amplification"
(TMA), suivie de la detection luminescente des produits d'amplification par la technique homogene "Hybridization Protection Assay " (HPA).
Le test d'amplification "MTD-2" a été réalisé
selon le protocole manuel du fournisseur avec quelques modifications. Brièvement, la réaction a été assemblée en combinant 25 ~l d'un contrôle positif (~o exp 6 copies d'une molécule d'ARNr 16S synthétisée in vitro, correspondant environ a 100 cellules bactériennes) ou 25 ~l d'un contrôle négatif (eau ultrapure, de résistivité
supérieure ou égale a 18 MegaOhms), a 12,5 ~l de réactif d'amplification reconstitué, dans un tube 12 x 75 mm de 5 ml tpolypropylene) et l'ensemble est recouvert de 200 ~l d'huile minérale. Le tube est chauffé pendant 5 minutes a 95OC, refroidi a 42~C pendant 5 minutes (bains secs thermostatés), puis 12,5 ~l de reactif enzymatique sont ajouties et mélangés par agitation douce. La réaction est incubée pendant une heure a 42~C (bain marie), puis disposée sur glace en attendant d'etre soumise à l'étape de détection par HPA.
La détection HPA a été réalisée dans un tube séparé sur 10 ~l de mélange réactionnel (1/5 de réaction) CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCT~R97/01020 complétés par 90 ~l d'eau, auxquels sont ajoutés 100 ~l de sonde ester d'acridinium. Le tube est incubé pendant 15 minutes à 60~C (bain marie) pour réaliser l'hybridation de la sonde, et une ~tape de sélection est réalisée par 300 ~l de réactif de sélection. Chaque tube est alors incubé 15 minutes a 600C. Les réactions sont ensuite refroidies a température ambiante (5 minutes)~ puis directement lues sur le luminomètre Gen-Probe pendant 3 secondes.
Les résultats de luminescence obtenus (en Unités de Luminescence Relative, RLU) sont de 4 319 456 RLU pour le contrôle positif et de 1 282 RLU pour le contrôle négatif, le seuil de positivité indiqué par le fabricant étant de 30 oOO RLU.
L'automatisation des etapes d'amplification a été
réalisee avec une carte ou dispositif 1 selon la Figure 21, obtenue dans un corps 2, usiné dans une plaque carrée de 10 cm de coté et 3 mm d'épaisseur. La carte est rendue fonctionnelle par apposition d'un film adhesif 22 transparent de type BOPP sur le corps, afin de réaliser la fermeture etanche du circuit de circulation 5. Au prealable, une bille solide de reactif enzymatique est déposée et contenue dans une mini-cuvette prévue à cet effet, en position "R2" du circuit de circulation. Cette bille de 2 mm de diametre est obtenue par lyophilisation de gouttelettes d'une solution de trehalose (20%~
contenant l'équivalent d'une dose unitaire d'enzyme necessaire a la réalisation d'une reaction d'amplification TMA. Une telle forme de réactif présente 1'avantage d'etre stable pendant des mois a temperature ambiante et de se dissoudre instantanément au contact d'une solution aqueuse. La carte ainsi constituée est considérée comme le dispositif d'analyse au sein duquel les étapes d'amplification a partir d'un échantillon sont réalisées de maniere automatique.
CA 02228737 1998-02-0~
WO 97~46318 PCT/F'R97~01020 L'essai au sein du dispositif debute par une phase d'introduction initiale unique de reactifs par le manipulateur ou un appareil de distribution de liquides.
150 ~l de tampon de lavage (PBS lX, Tween-20 0,5%) sont introduits dans le segment circulaire externe de la carte, par l'orifice 81 communiquant avec le circuit 5, au dessous de la position selon le segment circulaire interne "Rl". L'echantillon a tester est compose de 25 ~1 contrôle positif ou negatif comme précédemment décrit, additionnes de 12,5 ~l de tampon de dilution d'enzyme (Enzyme Dilution Buffer, Gen-Probe) et 12,5 ~l de réactif d'amplification reconstitué. L'ensemble est injecté par l'orifice 8 en position "Rl" de la carte.
Le dispositif est inséré verticalement dans un automate piloté par ordinateur, dont un programme permet le contrôle simultané des étapes de rotation de la carte autour de son axe central (vitesse, amplitude, acceleration, polarite, encha~nements) et de la température des liquides contenus dans les segments circulaires externe et interne de la carte, par le biais d'un patin chauffant. Ce patin chauffant est en contact direct avec le film adhesif du dispositif, la faible epaisseur de celui-ci assurant un parfait échange thermique pour le contrôle de la température a l'intérieur du segment liquide situé à son niveau. Le patin recouvre les segments circulaires sur une amplitude angulaire de 450 de part et d'autre de la position inferieure du dispositif (aplomb de la position "Rl"), position o~ se trouvent en permanence les liquides, quelle ~ue soit la rotation du dispositif, du fait de l'effet combiné de la gravité et du piston liquide, propre a la presente invention. Le patin chauffant est regulé par une sonde thermocouple; son chauffage est actif, tandis que son refroidissement est passif, sous l'action d'un flux d'air a temperature ambiante (20-25~C) vehicule par une pompe sous une pression de 0,5 bar.
CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCT~nR97/01020 Le programme de traitement du dispositif ou carte 6' effectue comme suit : la carte venant d'être remplie avec le tampon de lavage et l'echantillon, comme precédemment decrit, est inserée dans l'automate dont la consigne de temperature est de 65~C (pr~chauffage effectue). La position initiale de la carte est celle ou l'échantillon et le tampon de lavage sont centrés sur la position Rl. L'echantillon est homogénéisé par 30 oscillations continues d'amplitude + 30~, centrées sur la position "Rl" (60it une amplitude totale maximum de 60O
par oscillation), et incube simultanement pendant 5 minutes a 65~C. La temperature est ensuite stabilisee a 420C pendant 2 minutes, la carte ~tant alors immobile, en position initiale. La temperature du patin restant a 42~C, une rotation de 140~C (sens inverse des aiguilles d'une montre) est effectuee, ce qui permet a la fraction de liquide d'~tre centree sur la position "R2". 6 oscillations continues d'amplitude ~ 45~ centree sur la position "R2" (soit une amplitude totale maximum de 90~) assurent la parfaite dissolution de la bille de reactif enzymatique, puis une rotation de 140~ (sens des aiguilles d'une montre) est effectuee afin de repositionner le milieu reactionnel au niveau de "Rl". La carte est incubee ~ 42~C en position fixe pendant une heure.
Afin de determiner l'efficacite du procéde d'amplification TMA automatise au sein du dispositif a usage unique de la presente invention, le milieu reactionnel est preleve et dispose sur glace avant d'être dosé selon la methode ~PA de réference. Pour des raisons d'instrumentation propres à la methode de reference, le processus de d~tection n'est pas realise ici a l'int~rieur de la carte, mais l'incorporation durant le procede d'amplification TM~ de marqueurs (par exemple fluorescents) permet, par la presence de tampons de ~avage au sein de la carte, de realiser la detection des produits d'amplification par capture specifique sur des sondes CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 ~CT~FR97/01020 immobilisées dans la cuve d'observations. La détection HPA
a ici été r~alisée dans un tube séparé sur 10 ~l de melange réactionnel (1/5 de réaction) complétés par 90 ~l d'eau, auxquels sont ajoutés 100 ~1 de sonde ester d'acridinium. Le tube est incubé pendant 15 minutes à 60~C
(bain marie~ pour réaliser l'hybridation de la sonde, et une étape de sélection est r~alis~e par 300 ~1 de réactif de sélection. Chaque tube est lors incubé 15 minutes à
60~C. Les réactions sont ensuite refroidies à température ambiante (5 minutes), puis directement lues sur le luminomètre Gen-Probe pendant 3 secondes, comme dans le cadre des essais manuels, selon le protocole préconisé
pour l'utilisation de la trousse de diagnostic "MTD-2"
(Gen-Probe).
Les résultats de luminescence obtenus ~en Unités de Luminescence Relative, RLU) sont, dans le cas du processus precedemment decrit, de 3 822 510 RLU pour le contrôle positif et de 2 357 RLU pour le contrôle négatif, le seuil de positivité indiqué par le fabricant étant de 30 000 RLU. Ces résultats montrent donc que la détection du contrôle positif s'effectue correctement, tandis que le contrôle négatif ne génère aucun signal significatif.
L'analyse comparée des résultats du test "MTD-2", dont la partie amplification TMA a été réalisee manuellement, ou automatiquement selon l'invention, démontre donc que la transposition d'un essai manuel vers un dispositif selon l'invention est réalisable et que la carte à usage unique selon invention permet de réaliser l'ensemble des étapes biologiques d'un test réalisant, comme en mode manuel et de manière aussi sensible, la détection de l'equivalent de 100 bactéries.
L'intérêt d'un tel dispositif selon l'invention est important, en particulier dans le domaine de la biologie moléculaire, dont des techniques telles que la TMA permettent de réaliser de manière sensible et rapide la détection d'agents pathogenes. Néanmoins, ces CA 02228737 1998-02-0~
techniques, étant données leurs performances, sont très sensibles aux contaminations de l'environnement ou amenees lors des manipulations pour la réalisation des étapes intermédiaires d'addition ou de mélange de r~actifs, conduisant alors à des essais faussement positifs. La presente invention permet de réaliser les étapes d'amplification de manière confinée et isolée, et de les encha~ner éventuellement avec les étapes de detection, à
partir de l'introduction d'un echantillon au sein du dispositif a usage unique. Ce dernier peut donc contenir sous forme stabilisee des reactifs prêts a l'emploi, dont le conditionnement et la preparation sont realisables dans un environnement contrôle exempt de contaminations.
L'expérimentateur doit s'assurer simplement de l'absence de contamination lors des étapes de preparation de l'échantillon, préalablement a la réalisation du test et lors de son introduction au sein de la carte. De manière plus générale, lorsque les étapes de détection sont également intégrees au sein de la carte, l'élimination et destruction de la carte du laboratoire sans jamais ouvrir cette dernière, autorisent la realisation de toutes les etapes situees en amont d'un tel test d'amplification et detection ; pretraitement des echantillons cliniques, lyse des micro-organismes, extraction des acides nucléiques peuvent s'effectuer dans un même environnement de travail, sans risque de production de resultats erronés.
De maniere non représentée, mais comme il sera décrit ci-apres par référence aux Figures 11 a 15, l'orifice d'évent 8 et l'orifice d'introduction 3 comportent ou sont associés a des moyens d'obturation dé~initive, par exemple scellement.
Une cuve de décantation 15 est disposée ou menag~e dans le corps 2, en aval de l'orifice d'introduction 3, dans le sens d'introduction de l'échantillon liquide, et le circuit 5 peut être bouclé soit sur la cuve 15 de décantation, soit en aval de cette dernière.
WO 97/46318 PCTA~R97/0102~
L'enceinte operatoire 6 est delimit~e dans le circuit 5 continu de circulation, dans le sens d'introduction de l'échantillon liquide, par au moins un moyen d'arrêt 18 du liquide introduit, choisi ou agencé
~ 5 pour libérer le passage dudit liquide sous l'effet d'une charge hydrostatique minimum. A cette fin, différents moyens représentés aux Figures 7 a 9 peuvent être utilisés:
- le moyen d'arrêt 18 est un agencement local du circuit 5 continu de circulation, générant une perte de charge, par exemple par un etranglement 19 montré a la Figure 9, ou une chicane 20 montr~e a la Figure 8 ; cette chicane 20 est obtenue, en passant de la face superieure 2a a la face inférieure 2b du corps 2 par un premier conduit vertical traversant, en circulant sur la face inferieure 2b, puis en remontant vers la face superieure 2a, par un deuxième conduit traversant;
- de maniere non representée, le moyen d'arrêt 18 peut être constitue par un revêtement local et ponctuel, hydrophobe, du circuit 5, par conséquent a faible mouillage, contrariant, en l'absence d'une charge minimum, la circulation du liquide;
- de maniere plus particuliere, et comme représenté a la ~igure 7, le moyen d'arrêt 18 est constitué par deux encoches, disposées l'une en face de l'autre, de part et d'autre du conduit 5, et formant avec lui une zone locale de rétention du liquide.
En termes de réalisation, la carte d'analyse 2 est obtenue pour l'essentiel, par moulage de précision d'une matiere plastique technique, compatible avec les liquides traités. De cette maniere, directement obtenu par moulage, le circuit 5 est formé au moins pour partie par un canal 25, menagé au moins pour partie a la surface de l'une 2a et/ou l'autre face 2b, étant entendu que, comme le montre la combinaison des Figures 1 et 8, le circuit 5 s'étend sur l'une 2a et/ou l'autre face 2b du corps, parallales CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCT~FR97/01020 l'une a l'autre, en traversant éventuellement de part en part le corps 2, localement, a un ou plusieurs endroits du circuit continu de circulation 5.
De manière à assurer l'étanchéité du circuit 5 par rapport à d'autres circuits ou conduits présents sur le corps 2, mais aussi par rapport à l'extérieur, les deux faces 2a et 2b du corps 2 sont revetues de manière étanche, par deux feuilles ou films, par exemple en matière plastique transparente, 22.
Compte tenu du processus d'analyse à effectuer au sein de la carte 1, l'enceinte opératoire 6 comprend, de manière libre ou fixée par rapport au corps, un ou plusieurs réactifs. Cette fixation peut consister aussi bien dans une liaison chimique covalente du réactif sur la paroi du circuit 5, que dans une liaison faible, par exemple par adsorption ou absorption du réactif sur cette même paroi.
Le fonctionnement de la carte d'analyse 1 peut être expliqué par référence aux Figures 4 à 5, la carte d'analyse 1 étant disposée verticalement.
Par référence à la Figure 4, l'orifice d'introduction 3 et l'orifice d'évent 8 sont ouverts. on introduit l'échantillon liquide à analyser, associé ou non ~ un réactif, par l'orifice 3, moyennant quoi il forme une colonne liquide 62 au bas du circuit 5 en equilibre, et au contact du réactif contenu dans l'enceinte opératoire 6.
Puis les orifices 8 et 3 sont scellés hermétiquement, de telle sorte que la carte se trouve isolee par rapport a l'exterieur.
Par rotation angulaire de la carte 5, de plus ou moins 45~ (selon le sens trigonométrique), on fait circuler l'échantillon liquide, dans un sens puis dans l'autre, au contact du réactif, de telle sorte qu'une reaction se développe entre l'échantillon liquide et le reactif.
W O 97/46318 PCT~FR97~0I~2~
Dans la position angulaire représentee a la Figure 5, la colonne de liquide s'est deplacee dans la cuve d'observation 17. Egalement par rotation de part et d'autre de la position angulaire representee a la Figure ~ 5 5, on peut faire circuler, dans un sens puis dans l'autre, le liquide au travers de la cuve 17. Ainsi, il est possible de détecter et/ou mesurer l'analyte présent dans la cuve 17.
Une fois la mesure effectuée, on revient a la position initiale, representee a la Figure 6, et la carte d'analyse utilisee peut être jetee.
La carte d'analyse selon le deuxieme mode d'execution (conferer Figure 10), differe du premier mode d'exécution, par les points suivants:
- une enceinte 21 est disposée et ménag~e a plat, sensiblement au centre du corps 2, et forme une fois scellée une chambre comprise dans le circuit 5 continu de circulation du liquide ; cette enceinte est scellée et obturée par une membrane qui, par enfoncement et relâchement successifs, permet d'aspirer l'échantillon liquide par l'orifice d'introduction 3;
- l'orifice d'introduction 3 de l'echantillon liquide débouche dans une cuve 15 de decantation, avant de communiquer avec le circuit 5 proprement dit ; la cuve 15 de decantation est pourvue d'au moins un event 81 et/ou 82 qui est ferme quand la cavité 21 est utilisée pour aspirer le liquide et le faire cheminer dans le conduit 5;
- a la sortie de l'enceinte 21, le circuit 5 est bouclé sur la cuve 15 de décantation, par un conduit traversant, passant de la face 2a à la face 2b du corps 2.
L'enceinte 21 a une autre utilite : elle permet en pratique d'absorber les variations de pression, au sein de la carte d'analyse.
Comme montre par les Figures 2 a 14, le moyen d'obturation définitive de l'orifice 3 ou 16 (cf Figure CA 02228737 1998-02-0~
17) et des events 81,82, peut etre choisi parmi les moyens suivants:
- conformément à la Figure 12, ce moyen est un opercule 10 d'obturation definitive;
- conformement aux Figures 13 et 14, ce moyen d'obturation associe le conduit d'introduction 11 de l'échantillon liquide, dont l'extremité active lla peut prendre deux positions par rapport au corps 2, fi savoir une position rétractée (Figure 13) communiquant de manière étanche avec une cavite d'introduction 12 du liquide, et une position avancee (Figure 14), penétrant de maniere étanche dans un orifice ~orgne 13 calibré, menage dans le corps 2; dans cette derniere position, le conduit d'introduction 11 est scelle;
- et une bande adhesive 14 qui est rapportee, de maniere etanche, et adhesive sur l'orifice 3, cf Figure 15.
La carte d'analyse selon le troisième mode d'execution (cf Figure 16), differe du premier mode d'execution par le fait que le segment planaire 51 du circuit 5 décrit une ligne constituée par au moins deux portions 511 et 512 sensiblement circulaires, concentriques, reliées entre elles en série, par un conduit traversant de part en part le corps 2.
Bien entendu, comme non decrit specifiquement par reférence a des figures, mais de maniere parfaitement compréhensible pour l'homme de métier, les variantes suivantes peuvent etre apportées :
- plusieurs enceintes opératoires 6 peuvent être ménagées et disposées dans le corps 2, en étant comprises en série dans le circuit 5 continu de circulation, de telle sorte ~ue le changement d'orientation contrôl~e de la carte 2, permet de ~aire circuler de maniere adaptée l'échantillon liquide dans l'une et/ou l'autre enceinte opératoire;
-WO 97/46318 P~TA~97/ala2~
- plusieurs circuits 5 continus de circulation de liquide peuvent ~tre disposés ou ménagés dans le corps 2, et être relies entre eux, en serie et/ou en parallèle.
A cet egard, les circuits 5 différents peuvent communiquer avec le même orifice d'introduction 3 ou 16, ou respectivement avec deux orifices distincts 3 et 16, pour deux echantillons liquides respectivement. A cet ~gard, les circuits 5 peuvent communiquer avec la m~me cuve d'observation 17, ou respectivement chacun avec une cuve 17 d'observation distincte pour chaque échantillon traité.
La carte d'analyse selon le quatrième mode d'exécution de l'invention ~conférer Figures 17 à 20), diff~re du premier mode d'exécution par les caracteristiques suivantes.
Comme pour la Figure 16, le circuit 5 comporte un segment planaire 51, constitue par deux portions sensiblement circulaires 511 et 512, et concentriques, reliees entre elles en serie, et ceci en passant au-dessous de la portion 511, comme montre a la Figure 18,sur sa partie droite.
Il existe deux orifices d'introduction de liquide ou reactif, s~par~s, à savoir 3 et 16.
Un circuit annexe 23 est dispose ou menag~ dans le corps 2 sur la face 2a de la plaque correspondante, et comprend:
- une cavité 24, ménagée sur la face 2a, reliee par un conduit d'évacuation 67 au circuit continu de circulation 5, et par un conduit 67 a l'event 8;
- un conduit de transfert 65, dispose ou menage sur la face inférieure 2b, reliant, d'un côte l'orifice d'introduction 16, et de l'autre côte la cavite 24, en son centre.
Il résulte de la description precedente que le circuit annexe 23 communique d'un côte avec le circuit 5, CA 02228737 l998-02-0~
W O 97/46318 PCT~FR97/01020 et ne comporte de l'autre côte aucune issue ou sortie, autre que l'évent 8.
Il résulte aussi de la géométrie du circuit annexe 23, et en particulier de la disposition de la cavite 24, 5 montrees à la Figure 17, que : -- tout changement d'orientation de la carte dans un sens de rotation négatif (par rapport au sens trigonometrique), selon une amplitude limitee, interdit l'introduction de tout liquide contenu dans la cavite annexe 24, dans le circuit 5;
- et inversement, tout changement d'orientation dans l'autre sens de rotation, c'est-à-dire dans le sens positif, permet dlintroduire tout liquide contenu dans la cavité 24 dans le circuit 5 principal.
La caractéristique précédente est évidemment utile, pour stocker provisoirement un réactif, et l'introduire de maniere contrôlée dans le circuit 5, a tout moment du processus d'analyse.
C'est ce que montre en particulier le changement d'orientation entre les Figures 19 et 20, permettant d'introduire le réactif dans la boucle principale.
Par ailleurs, par référence aux figures 17 a 20, le liquide (réactif par exemple) est injecté au niveau de l'orifice d'introduction 16, et gr~ce au conduit 65 remplit la cavité 24, par un orifice de sortie emergeant au sommet d'un teton, situe sensiblement au centre et aux deux tiers de la hauteur de la cavite 24. Une fois la cavité 24 remplie, lors de la rotation de la carte dans le sens de rotation négatif, le liquide reste confin~ dans cette cavité, puis par une nouvelle rotation, toujours dans le sens negatif, le liquide demeure dans cette meme cavité, a la condition que la quantité de liquide soit predeterminee pour ne pas ressortir par l'orifice de sortie, situe aux deux tiers de la hauteur de la cavite 24.
CA 02228737 1998-02-0~
~ :~LL
Un exemple de mise en oeuvre d'un dispositif dianalyse conforme a la Figure 16 est maintenant décrit.
L'utilisation de ce dispositif pour l'entra~nement automatisé et confiné d'étapes biologiques a été validee dans le cadre de la réalisation d'un test de détection de l'agent de la tuberculose : la bactérie Mycobacterium tuberculoses.
Pour ce faire, des composants de la trousse de diagnostic "MTD-2" disponible auprès de la société Gen-Probe (San Diego, Californie), ont été utilisés. Le principe de ce test repose sur l'amplification sélective in vitro d' acides nucleiques cibles (ARN ribosomique 16S) par la technique "Transcription-Mediated Amplification"
(TMA), suivie de la detection luminescente des produits d'amplification par la technique homogene "Hybridization Protection Assay " (HPA).
Le test d'amplification "MTD-2" a été réalisé
selon le protocole manuel du fournisseur avec quelques modifications. Brièvement, la réaction a été assemblée en combinant 25 ~l d'un contrôle positif (~o exp 6 copies d'une molécule d'ARNr 16S synthétisée in vitro, correspondant environ a 100 cellules bactériennes) ou 25 ~l d'un contrôle négatif (eau ultrapure, de résistivité
supérieure ou égale a 18 MegaOhms), a 12,5 ~l de réactif d'amplification reconstitué, dans un tube 12 x 75 mm de 5 ml tpolypropylene) et l'ensemble est recouvert de 200 ~l d'huile minérale. Le tube est chauffé pendant 5 minutes a 95OC, refroidi a 42~C pendant 5 minutes (bains secs thermostatés), puis 12,5 ~l de reactif enzymatique sont ajouties et mélangés par agitation douce. La réaction est incubée pendant une heure a 42~C (bain marie), puis disposée sur glace en attendant d'etre soumise à l'étape de détection par HPA.
La détection HPA a été réalisée dans un tube séparé sur 10 ~l de mélange réactionnel (1/5 de réaction) CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCT~R97/01020 complétés par 90 ~l d'eau, auxquels sont ajoutés 100 ~l de sonde ester d'acridinium. Le tube est incubé pendant 15 minutes à 60~C (bain marie) pour réaliser l'hybridation de la sonde, et une ~tape de sélection est réalisée par 300 ~l de réactif de sélection. Chaque tube est alors incubé 15 minutes a 600C. Les réactions sont ensuite refroidies a température ambiante (5 minutes)~ puis directement lues sur le luminomètre Gen-Probe pendant 3 secondes.
Les résultats de luminescence obtenus (en Unités de Luminescence Relative, RLU) sont de 4 319 456 RLU pour le contrôle positif et de 1 282 RLU pour le contrôle négatif, le seuil de positivité indiqué par le fabricant étant de 30 oOO RLU.
L'automatisation des etapes d'amplification a été
réalisee avec une carte ou dispositif 1 selon la Figure 21, obtenue dans un corps 2, usiné dans une plaque carrée de 10 cm de coté et 3 mm d'épaisseur. La carte est rendue fonctionnelle par apposition d'un film adhesif 22 transparent de type BOPP sur le corps, afin de réaliser la fermeture etanche du circuit de circulation 5. Au prealable, une bille solide de reactif enzymatique est déposée et contenue dans une mini-cuvette prévue à cet effet, en position "R2" du circuit de circulation. Cette bille de 2 mm de diametre est obtenue par lyophilisation de gouttelettes d'une solution de trehalose (20%~
contenant l'équivalent d'une dose unitaire d'enzyme necessaire a la réalisation d'une reaction d'amplification TMA. Une telle forme de réactif présente 1'avantage d'etre stable pendant des mois a temperature ambiante et de se dissoudre instantanément au contact d'une solution aqueuse. La carte ainsi constituée est considérée comme le dispositif d'analyse au sein duquel les étapes d'amplification a partir d'un échantillon sont réalisées de maniere automatique.
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WO 97~46318 PCT/F'R97~01020 L'essai au sein du dispositif debute par une phase d'introduction initiale unique de reactifs par le manipulateur ou un appareil de distribution de liquides.
150 ~l de tampon de lavage (PBS lX, Tween-20 0,5%) sont introduits dans le segment circulaire externe de la carte, par l'orifice 81 communiquant avec le circuit 5, au dessous de la position selon le segment circulaire interne "Rl". L'echantillon a tester est compose de 25 ~1 contrôle positif ou negatif comme précédemment décrit, additionnes de 12,5 ~l de tampon de dilution d'enzyme (Enzyme Dilution Buffer, Gen-Probe) et 12,5 ~l de réactif d'amplification reconstitué. L'ensemble est injecté par l'orifice 8 en position "Rl" de la carte.
Le dispositif est inséré verticalement dans un automate piloté par ordinateur, dont un programme permet le contrôle simultané des étapes de rotation de la carte autour de son axe central (vitesse, amplitude, acceleration, polarite, encha~nements) et de la température des liquides contenus dans les segments circulaires externe et interne de la carte, par le biais d'un patin chauffant. Ce patin chauffant est en contact direct avec le film adhesif du dispositif, la faible epaisseur de celui-ci assurant un parfait échange thermique pour le contrôle de la température a l'intérieur du segment liquide situé à son niveau. Le patin recouvre les segments circulaires sur une amplitude angulaire de 450 de part et d'autre de la position inferieure du dispositif (aplomb de la position "Rl"), position o~ se trouvent en permanence les liquides, quelle ~ue soit la rotation du dispositif, du fait de l'effet combiné de la gravité et du piston liquide, propre a la presente invention. Le patin chauffant est regulé par une sonde thermocouple; son chauffage est actif, tandis que son refroidissement est passif, sous l'action d'un flux d'air a temperature ambiante (20-25~C) vehicule par une pompe sous une pression de 0,5 bar.
CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 PCT~nR97/01020 Le programme de traitement du dispositif ou carte 6' effectue comme suit : la carte venant d'être remplie avec le tampon de lavage et l'echantillon, comme precédemment decrit, est inserée dans l'automate dont la consigne de temperature est de 65~C (pr~chauffage effectue). La position initiale de la carte est celle ou l'échantillon et le tampon de lavage sont centrés sur la position Rl. L'echantillon est homogénéisé par 30 oscillations continues d'amplitude + 30~, centrées sur la position "Rl" (60it une amplitude totale maximum de 60O
par oscillation), et incube simultanement pendant 5 minutes a 65~C. La temperature est ensuite stabilisee a 420C pendant 2 minutes, la carte ~tant alors immobile, en position initiale. La temperature du patin restant a 42~C, une rotation de 140~C (sens inverse des aiguilles d'une montre) est effectuee, ce qui permet a la fraction de liquide d'~tre centree sur la position "R2". 6 oscillations continues d'amplitude ~ 45~ centree sur la position "R2" (soit une amplitude totale maximum de 90~) assurent la parfaite dissolution de la bille de reactif enzymatique, puis une rotation de 140~ (sens des aiguilles d'une montre) est effectuee afin de repositionner le milieu reactionnel au niveau de "Rl". La carte est incubee ~ 42~C en position fixe pendant une heure.
Afin de determiner l'efficacite du procéde d'amplification TMA automatise au sein du dispositif a usage unique de la presente invention, le milieu reactionnel est preleve et dispose sur glace avant d'être dosé selon la methode ~PA de réference. Pour des raisons d'instrumentation propres à la methode de reference, le processus de d~tection n'est pas realise ici a l'int~rieur de la carte, mais l'incorporation durant le procede d'amplification TM~ de marqueurs (par exemple fluorescents) permet, par la presence de tampons de ~avage au sein de la carte, de realiser la detection des produits d'amplification par capture specifique sur des sondes CA 02228737 1998-02-0~
W O 97/46318 ~CT~FR97/01020 immobilisées dans la cuve d'observations. La détection HPA
a ici été r~alisée dans un tube séparé sur 10 ~l de melange réactionnel (1/5 de réaction) complétés par 90 ~l d'eau, auxquels sont ajoutés 100 ~1 de sonde ester d'acridinium. Le tube est incubé pendant 15 minutes à 60~C
(bain marie~ pour réaliser l'hybridation de la sonde, et une étape de sélection est r~alis~e par 300 ~1 de réactif de sélection. Chaque tube est lors incubé 15 minutes à
60~C. Les réactions sont ensuite refroidies à température ambiante (5 minutes), puis directement lues sur le luminomètre Gen-Probe pendant 3 secondes, comme dans le cadre des essais manuels, selon le protocole préconisé
pour l'utilisation de la trousse de diagnostic "MTD-2"
(Gen-Probe).
Les résultats de luminescence obtenus ~en Unités de Luminescence Relative, RLU) sont, dans le cas du processus precedemment decrit, de 3 822 510 RLU pour le contrôle positif et de 2 357 RLU pour le contrôle négatif, le seuil de positivité indiqué par le fabricant étant de 30 000 RLU. Ces résultats montrent donc que la détection du contrôle positif s'effectue correctement, tandis que le contrôle négatif ne génère aucun signal significatif.
L'analyse comparée des résultats du test "MTD-2", dont la partie amplification TMA a été réalisee manuellement, ou automatiquement selon l'invention, démontre donc que la transposition d'un essai manuel vers un dispositif selon l'invention est réalisable et que la carte à usage unique selon invention permet de réaliser l'ensemble des étapes biologiques d'un test réalisant, comme en mode manuel et de manière aussi sensible, la détection de l'equivalent de 100 bactéries.
L'intérêt d'un tel dispositif selon l'invention est important, en particulier dans le domaine de la biologie moléculaire, dont des techniques telles que la TMA permettent de réaliser de manière sensible et rapide la détection d'agents pathogenes. Néanmoins, ces CA 02228737 1998-02-0~
techniques, étant données leurs performances, sont très sensibles aux contaminations de l'environnement ou amenees lors des manipulations pour la réalisation des étapes intermédiaires d'addition ou de mélange de r~actifs, conduisant alors à des essais faussement positifs. La presente invention permet de réaliser les étapes d'amplification de manière confinée et isolée, et de les encha~ner éventuellement avec les étapes de detection, à
partir de l'introduction d'un echantillon au sein du dispositif a usage unique. Ce dernier peut donc contenir sous forme stabilisee des reactifs prêts a l'emploi, dont le conditionnement et la preparation sont realisables dans un environnement contrôle exempt de contaminations.
L'expérimentateur doit s'assurer simplement de l'absence de contamination lors des étapes de preparation de l'échantillon, préalablement a la réalisation du test et lors de son introduction au sein de la carte. De manière plus générale, lorsque les étapes de détection sont également intégrees au sein de la carte, l'élimination et destruction de la carte du laboratoire sans jamais ouvrir cette dernière, autorisent la realisation de toutes les etapes situees en amont d'un tel test d'amplification et detection ; pretraitement des echantillons cliniques, lyse des micro-organismes, extraction des acides nucléiques peuvent s'effectuer dans un même environnement de travail, sans risque de production de resultats erronés.
Claims (25)
1/ Dispositif d'analyse (1) comprenant un corps (2) dans lequel sont disposés ou ménagés :
- un orifice (3) d'introduction d'un échantillon liquide de départ, - un circuit (5) de circulation de liquide, comprenant au moins une enceinte opératoire (6) pour un échantillon liquide traité, obtenu avec tout ou partie de l'échantillon de départ, communiquant avec ledit orifice d'introduction (3), ledit circuit de circulation décrivant, dans au moins deux dimensions de la carte, une ligne géométrique déterminée, en sorte que tout changement d'orientation de la carte dans un référentiel tridimensionnel, comportant une dimension verticale de référence, fait circuler le liquide par gravité
uniquement, d'une section a une autre dudit circuit, par exemple d'un côté ou de l'autre avec l'enceinte operatoire (6), caractérisé en ce que, le circuit (5) de circulation est continu, et boucle sur lui-même entre ledit orifice d'introduction (3) et ladite enceinte opératoire (6).
- un orifice (3) d'introduction d'un échantillon liquide de départ, - un circuit (5) de circulation de liquide, comprenant au moins une enceinte opératoire (6) pour un échantillon liquide traité, obtenu avec tout ou partie de l'échantillon de départ, communiquant avec ledit orifice d'introduction (3), ledit circuit de circulation décrivant, dans au moins deux dimensions de la carte, une ligne géométrique déterminée, en sorte que tout changement d'orientation de la carte dans un référentiel tridimensionnel, comportant une dimension verticale de référence, fait circuler le liquide par gravité
uniquement, d'une section a une autre dudit circuit, par exemple d'un côté ou de l'autre avec l'enceinte operatoire (6), caractérisé en ce que, le circuit (5) de circulation est continu, et boucle sur lui-même entre ledit orifice d'introduction (3) et ladite enceinte opératoire (6).
2/ Dispositif selon la revendication 1, comprenant au moins un conduit de transfert (7) de liquide, disposé
ou ménagé dans ledit corps (2), communiquant d'un côte avec l'orifice d'introduction (3), et de l'autre côte avec l'enceinte opératoire (6), caractérisé en ce que le circuit (5) de circulation est boucle sur le conduit de transfert (7).
ou ménagé dans ledit corps (2), communiquant d'un côte avec l'orifice d'introduction (3), et de l'autre côte avec l'enceinte opératoire (6), caractérisé en ce que le circuit (5) de circulation est boucle sur le conduit de transfert (7).
3/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ligne géométrique décrite par le circuit (5) continu de circulation comprend au moins un segment planaire (51) situe dans un plan, et ledit segment décrit lui-même une ligne régulière ou brisée, en sorte que la plaque (2) étant disposée verticalement, le changement d'orientation de la carte dans le plan vertical fait circuler le liquide d'une section à une autre du circuit (5) continu de circulation.
4/ Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que le segment planaire (51) comprend au moins une portion sensiblement sinusoïdale.
5/ Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que le segment planaire (51) comprend au moins une portion sensiblement circulaire, en sorte que le changement d'orientation de la carte, autour d'un axe (77) perpendiculaire à la plaque (2), et passant sensiblement par le centre de ladite portion circulaire, fait circuler le liquide d'une section à une autre du circuit (5) continu de circulation.
6/ Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que le segment planaire (51) décrit une ligne constituée par au moins deux portions (511,512) sensiblement circulaires, éventuellement concentriques, reliées entre elles en série.
7/ Dispositif selon la revendication 1, comprenant un orifice d'évent (8), caractérisé en ce que ce dernier communique avec le circuit (5) continu de circulation, en un point de jonction différent du point de jonction de l'orifice d'introduction (3) avec ledit circuit.
8/ Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'orifice d'introduction (3) et/ou l'orifice d'évent (8) comportent ou sont associés à des moyens (9) d'obturation définitive, par exemple scellement.
9/ Dispositif d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une cuve (15) de décantation est ménagée ou disposée dans le corps (2), en aval d'un orifice d'introduction (16), dans le sens d'introduction de l'échantillon liquide, et le circuit continu (5) de circulation est éventuellement bouclé sur ladite cuve.
10/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une cuve d'observation (17) est disposée ou ménagée dans le corps (2), et le circuit (5) continu de circulation du liquide comprend ladite cuve d'observation.
11/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que plusieurs circuits (5) continus de circulation de liquide sont disposés ou ménagés dans le corps (2), et sont reliés entre eux, en série et/ou en parallèle.
12/ Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que lesdits circuits (5) continus de circulation communiquent avec le même orifice d'introduction (3,16), ou respectivement avec deux orifices d'introduction (3,16) distincts, pour deux échantillons liquides respectivement.
13/ Dispositif selon les revendications 10 et 11, caractérisé en ce que lesdits circuits (5) continus de circulation communiquent avec la même cuve (17) d'observation, ou respectivement avec deux cuves (17) d'observation distinctes.
14/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enceinte opératoire (6) est délimitée dans le circuit (5) continu de circulation par au moins un moyen (18) d'arrêt du liquide, agence pour libérer le passage dudit liquide sous l'effet d'une charge minimum.
15/ Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que le moyen d'arrêt (18) est un agencement local du circuit (5) continu de circulation, générant une perte de charge, par exemple un étranglement (19) ou une chicane (20).
16/ Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que le moyen d'arrêt (18) est constitué
par un revêtement local hydrophobe du conduit (5) continu de circulation.
par un revêtement local hydrophobe du conduit (5) continu de circulation.
17/ Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que le moyen d'arrêt (18) est constitué
par deux encoches disposées en face l'une de l'autre, de part et d'autre du conduit (5) continu de circulation, et formant avec lui une zone locale de rétention du liquide.
par deux encoches disposées en face l'une de l'autre, de part et d'autre du conduit (5) continu de circulation, et formant avec lui une zone locale de rétention du liquide.
18/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une enceinte (21) est disposée ou ménagée dans le corps (2), et est comprise dans le circuit continu de circulation ( 5).
19/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'un autre orifice (16) d'introduction d'un échantillon liquide est ménagé dans le corps (2), et comporte ou est associé à des moyens (9) d'obturation définitive.
20/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que plusieurs enceintes opératoires (6) sont ménagées et disposées dans le corps (2), et sont comprises en série dans le circuit (5) continu de circulation.
21/ Dispositif selon la revendication 1, le corps (2) comprenant deux faces (2a,2b) planes en vis-à-vis, par exemple parallèles l'une à l'autre, caractérisé en ce que le circuit continu de circulation s'étend sur l'une (2a) et/ou l'autre face (2b) du corps, en traversant (Fig 11) éventuellement de part en part ledit corps.
22/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'une et/ou l'autre face (2a,2b) du corps sont revêtues chacune, de manière étanche, par une feuille (22), et le circuit (5) continu de circulation est formé au moins pour partie, par un canal (25) ménagé pour partie en surface, sur l'une et/ou l'autre face (2a,2b) du corps, et par la ou lesdites feuilles fermant ledit canal, de manière étanche par rapport à l'extérieur de la plaque.
23/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enceinte opératoire (6) comprend, de manière libre ou fixée par rapport au corps (2), un réactif.
24/ Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que la cuve d'observation (17) est agencée pour permettre une lecture optique.
25/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que, premièrement au moins un circuit annexe (23) est disposé ou ménagé dans le corps, et communique d'un côté avec le circuit (5) continu de circulation du liquide, et ne comporte aucune issue de l'autre côté, deuxièmement une cavité (24) ménagée et disposée dans le corps (2) est comprise dans le circuit annexe (23), et troisièmement la géométrie du circuit annexe (23) et de la cavité (24) annexe est déterminée en sorte que tout changement d'orientation de la carte dans un sens de référence, interdit l'introduction d'un liquide contenu par la cavité annexe dans le circuit continu (5) de circulation, et tout changement d'orientation dans l'autre sens permet ladite introduction.
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