JP2005531001A - 再循環流体ネットワークおよびその使用法 - Google Patents

Abstract

本発明は、微小流体装置、および、同装置の使用法を提供する。特に、本発明の微小流体装置は、各種アッセイおよび高処理スクリーニングを実行するのに有用である。本発明の微小流体装置は、複数のエラストマー成分、および、その表面にリガンド（単数または複数）を付着させる固相基板を含む。本発明のもう一つの局面は、本明細書に開示される微小流体装置を用いて結合アッセイを実行する方法を提供する。本発明のさらにもう一つの局面は、ビア層を含む微小流体装置の製造法である。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２００２年６月２４日出願の米国仮出願番号第６０／３９１，２９２号の利益を主張する。この出願は、全ての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用されている。

（発明の分野）
本発明は、微小流体装置、および、各種アッセイの実行等、同装置の使用法に関する。

（発明の背景）
生物学的アッセイを開発する際には、極少量のアッセイ成分やサンプルの利用、操作の単純性および高処理能力を含む、いくつかの目標がある。コストを最小化するために、アッセイは極少量のアッセイ成分しか要求しないのが好ましい。このことは、ある種のアッセイ成分は高価である、および／または、大量のアッセイを実行しなければならない場合には特に問題になる。理想的には、アッセイはほんの極小量のサンプルしか要求しないのが望ましい。なぜなら多くの場合ごく限られた量のサンプルしか利用できないからである。操作の単純性という目標は、多くの場合、アッセイが統合形式で実行されるのが好ましいことを意味する。すなわち、アッセイの全てまたは多くの局面が、単一の装置と極小の道具立てで実行可能であるということである。最近の研究および薬剤発見努力の傾向は、巨大な化合物ライブラリーをスクリーニングして所望の活性を持つものを特定することに向けられるが、その傾向に鑑みると、高処理能力という目標は益々重要性を増してきている。

高処理能力が特に重要なもう一つの領域はプロテオミクスである。プロテオミクスとは、細胞内の蛋白同士の間に起こる複雑な生物学的相互作用の研究である。細胞は、数千の蛋白を様々の濃度で発現する。これらの蛋白の行動および相互作用は、二三を挙げるなら、細胞種、細胞サイクルの段階、および、細胞外事象に依存する。蛋白はまた、細胞の機構によって化学的に修飾され、しかも、この修飾が、その蛋白の振る舞いや、他の蛋白との相互作用を分化させる。

上記諸問題のいくつか、特に、分析を実行するのに必要とされるサンプルやアッセイ薬剤の量を極小化するという問題に対処するために、アッセイ実行用微小流体装置の開発には並々ならない努力が傾注されてきた。これらの装置は、アッセイの実行に必要なサンプルおよび薬剤の導入・輸送のために微小チャンネルを用いるという特徴を持つ。残念ながら、現在の微小流体装置にはいくつかの欠点があり、それが装置の有用性を限定する。例えば、現在の微小流体装置は、多くの場合、シリコンチップから製造されており、多数シリコン層の中にチャンネルを既存の半導体技術を用いてエッチングする。しかしながら、このようなチップは固く脆く、また、材料が固いので、しばしば高い活性力が必要とされる。このような力やストレスは、多層チップにおける複数の層を分離させる原因となる。装置の固さはまた、微小チャンネルの中を流れる溶液流の制御に関する選択肢に重大な制約を課す。

さらに、溶液流は、電気泳動または電気浸透を介して分子および溶液を移動させる電場を形成するよう電極を用いることによって、少なくとも部分的に制御される。しかしながら、電極への依存はいくつかの問題を引き起こす。一つの問題は、電極にはよくガスが発生することである。これは、装置内の圧を増し、微細加工された複数の層の分離の原因となる可能性がある。圧増加とガス気泡はまた、チャンネルを通過する溶液流を妨げる可能性がある。さらに、溶液輸送に対して所望のレベルの制御を実現するためには、精密な電極ネットワークが必要とされることが多い。このようなネットワークの製造は複雑となり、装置の出費を増す可能性がある。このようなネットワークに対する要求はまた、多重的で、高処理アッセイ能力を高めるために多数のチャンネルを含む装置を調製しなければならない場合には、特に問題になる。さらに、溶液流制御のために電場を用いる場合、必ず、溶液は電解質（すなわち、イオン化化合物）を含むことを要求される。さらに、電場の使用は、細胞を含む用途にとって問題となる可能性がある。なぜなら、電場の印加は、細胞に対して否定的な影響を及ぼす可能性があり、しばしば細胞を殺す可能性があるからである。従って、改良型の微小流体装置、特に、広範な高処理アッセイ能力において改善可能とする微小流体装置に対しては根強い要求が依然として存在する。

（発明の要旨）
本発明は、各種微小流体装置、および、アッセイおよび合成を実行する方法を提供する。装置は、リガンドおよび／またはアンチリガンドを付着させることの可能な固相基板層、および、前記固相基板層に付着されるエラストマー層を含む装置であって、前記エラストマー層は、
（ａ）複数の第１フローチャンネル、
（ｂ）複数の第２フローチャンネルであって、前記第１フローチャンネルそれぞれと交差・横断し、前記第１フローチャンネルと前記第２フローチャンネルとの交差部に形成される複数の交差区域を供給し、前記複数の第１フローチャンネルと前記複数の第２フローチャンネルは、その中を溶液を流通させるように適応され、かつ、前記固相基板表面は、前記複数の第１フローチャンネルと前記複数の第２フローチャンネルの、少なくとも前記交差区域と流通し、前記複数の第１フローチャンネルおよび／または前記複数の第２フローチャンネルは、複数のループ状フローチャンネルを形成することが可能である、第２フローチャンネル、
（ｃ）複数のコントロールチャンネル、
（ｄ）複数の第１コントローブバルブであって、それぞれ、前記各第１フローチャンネルに対して、前記第１フローチャンネルを通過する溶液の流れを制御するように配されており、前記各第１コントロールバルブは、第１コントロールチャンネルとエラストマー分画を含み、前記エラストマー分画は、前記第１コントロールバルブが、前記第１コントロールチャンネルに印加された活性化力に応じて動作すると、前記第１フローチャンネルの方に変位して侵入し、または、引き出され、前記第１フローチャンネルの中に配置されると、エラストマー分画は第１フローチャンネルを通る液流を制限する、第１コントローブバルブ、
（ｅ）複数の第２コントロールバルブであって、それぞれ、前記各第２フローチャンネルに対して、前記第２フローチャンネルを通過する溶液の流れを制御するように配されており、前記第２コントロールバルブは、第２コントロールチャンネルとエラストマー分画を含み、前記エラストマー分画は、前記第２コントロールバルブが、前記第２コントロールチャンネルに印加された活性化力に応じて動作すると、前記第２フローチャンネルの方に変位して侵入し、または、引き出され、前記第２フローチャンネルの中に配置されると、エラストマー分画は第２フローチャンネルを通る液流を制限する、第２コントロールバルブ、
（ｆ）複数のループ形成コントロールバルブであって、前記各第１および／または前記第２フローチャンネルに対して、前記複数のループ状フローチャンネルを形成するように配され、前記各ループ形成コントロールバルブは、ループ形成コントロールチャンネルと、エラストマー分画を含み、前記エラストマー分画は、前記ループ形成コントロールバルブが、前記ループ形成コントロールチャンネルに印加された活性化力に応じて動作すると、前記第１および／または前記第２フローチャンネル内に配置されて、そこを通る液流を制限し、それによって前記ループ状フローチャンネルを形成する、ループ形成コントロールバルブ、および、
（ｇ）複数の再循環ポンプであって、各再循環ポンプは、前記ループ状フローチャンネルの内の一つについて動作的に配され、各ループ状フローチャンネルを通る溶液の循環が、前記再循環ポンプの内の一つによって制御可能となる、再循環ポンプ、
を含むことを特徴とする微小流体装置。

本発明のもう一つの局面は、本明細書に開示される微小流体装置を用いて結合アッセイを実行する方法を提供する。その結合アッセイ法は、一般に、
第２コントロールバルブに活性化力を印加して、各第２フローチャンネルを通過する溶液流を制限すること、
リガンドを固相基板表面に付着させるのに十分な条件下で、リガンドを含む試薬を、前記第１フローチャンネルの少なくとも１本の中に、導入すること、
第２フローチャンネルのコントロールチャンネルに対する活性化力を除去し、第１フローチャンネルを通る溶液流が制限されるように第１コントロールチャンネルに活性化力を印加すること、および、
サンプル液の中にあるかも知れないアンチリガンドを、固相基板表面に共有結合したリガンドに特異的に結合させるのに十分な条件下で、サンプル液を第２フローチャンネルに導入することによって結合アッセイを実行すること、
を含む。

本発明のさらにもう一つの局面は、ビア層を含む微小流体装置の製造法である。この方法は、一般に、
エラストマーポリマーからコントロール層、フロー層、および、ビア層を製造し（各コントロール層およびフロー層は、その表面に、それぞれ、コントロールチャンネルおよびフローチャンネルを形成するための溝を含む）、
コントロール層をフロー層に付着させることであって、コントロール層の溝がフロー層の上面に付着され、複数のコントロールチャンネルを形成し、フロー層の底面をビア層に付着させ、複数の第１フローチャンネルおよび複数の第２フローチャンネルを形成し、各第１フローチャンネルは各第２フローチャンネルと交差・横断して複数のチャンネル交差部を形成し、ビア層の各ビアが各チャンネル交差部に設置され、および、
前記工程（ｂ）で製造されたエラストマーポリマーを、要すれば随意に、固相基板に付着させる（固相基板は、その表面に結合したリガンド、または、リガンドを付着させることの可能な官能基を含む）、
ことを含む。

（詳細な説明）
（Ｉ．定義）
別様に定義しない限り、本明細書で使用される技術・科学用語は全て、本発明の属する技術分野に精通する当業者によって通常に理解される意味を持つ。下記の参考文献は、本明細書で使用される多くの用語について、その一般的な意味を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４）、ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）、ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ、第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、および、Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。本明細書で使用する場合、下記の用語は、別様に指定しない限り、それらの用語に付与された意味を持つ。

「エラストマー」および「エラストマー性」という用語は、従来技術で使用される一般的な意味を持つ。例えば、Ａｌｌｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版）は、エラストマーを、一般的に、ガラス遷移温度と液化温度の間の温度に存在するポリマーと記述する。エラストマー材料は弾性を示す。これは、ポリマー鎖が簡単に捻れ運動を起こし、外力に応じてそのバックボーン鎖の捻れは解除されるが、その外力が無くなると、バックボーン鎖は再び捻れて元の形を取るからである。一般に、エラストマーは、外力を与えると変形するが、その外力を取り去ると元の形に戻る。エラストマー材料の示す弾性は、ヤング率によって特徴付けることが可能である。本明細書に開示される微小流体装置において利用されるエラストマー材料は、典型的には、約１Ｐａ−１ＴＰａの間、その他の場合では約１０Ｐａ−１００ＧＰａの間、さらに別の場合では約２０Ｐａ−１ＧＰａの間、その上さらに別の場合では約５０Ｐａ−１０ＭＰａの間のヤング率を、また、ある場合では約１００Ｐａ−１ＭＰａの間のヤング率を持つ。上記の範囲外のヤング率を有するエラストマー材料であっても、特定の用途の要求に応じて利用が可能である。

本明細書に記述される微小流体装置のいくつかは、ＧＥ ＲＴＶ ６１５（処方）ビニールシラン架橋（型）シリコンエラストマー（族）のようなエラストマー性ポリマーから製造される。しかしながら、本発明の微小流体システムは、この一つの処方、型のポリマーにも、この族のポリマーにすらも限定されるものではなく、むしろ、ほとんど全てのエラストマー性ポリマーが好適である。ポリマー化学薬品、前駆物質、合成法、反応条件、および、可能性のある添加剤の膨大な多様性を考慮すれば、一体的エラストマー微小バルブおよびポンプを製造するのに使用可能なエラストマーシステムは多数ある。材料の選択は、典型的には、実行する用途から要求される、その特定の材料の性質による（例えば、溶媒抵抗性、固さ、ガス透過性、および／または、温度安定性）。本明細書に記述される微小流体装置成分の製造に使用が可能なエラストマー材料の種類については、さらに詳細が、２０００年６月２７日出願米国特許出願第０９／６０５，５２０号、２０００年１１月２８日出願米国特許出願第０９／７２４，７８４号、および、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／０１０２５に記述される。これらの文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。

「リガンド」とは、一般に、アンチリガンドと結合して、リガンド／アンチリガンドペアを形成する全ての分子を指す。従って、リガンドとは、そのリガンドのある部分または性質の認識に基づいて、そのリガンドに特異的にまたは非特異的に結合する別の分子（すなわちアンチリガンド）が存在する全ての分子である。

「アンチリガンド」とは、別の分子（すなわち、リガンド）と特異的にまたは非特異的に相互作用を持つ一つの分子である。

例示のリガンド／アンチリガンドとしては、抗体／抗原、酵素／基質、オリゴヌクレオチド／相補的オリゴヌクレオチド、核酸／プローブ、薬剤分子／細胞蛋白、薬剤分子／細胞膜、細胞蛋白／細胞蛋白、蛋白親和性タグ／蛋白、蛋白親和性タグ／金属イオン、プロテインＡまたはＧ／抗体の外に、その他のリガンド／アンチリガンドペアであって対応する複合体を形成するペアが挙げられる。ある任意のリガンド／アンチリガンドペアにおいてリガンドおよびアンチリガンドという用語は相互交換が可能であることを理解しなければならない。例えば、他方ペアをアンチリガンドと考える限り、抗体または抗原のどちらかをリガンドと考えることが可能である。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「蛋白」は、本明細書では交換的に使用され、ペプチド結合で連結されたアミノ酸の分子鎖を含む。これらの用語は産物の特異的長さを指さない。これらの用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、糖鎖付加、アセチル化、リン酸化等を含み、さらにアミノ酸類縁体およびペプチド修飾バックボーンを含むポリペプチドも含む。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、ポリクロナールおよびモノクロナール標本から得られる抗体のみならず、下記のものも含む。すなわち、（ｉ）ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３−２９９、および、米国特許第４，８１６，５６７号参照）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片、（ｉｉｉ）Ｆｖ分子（非共有的ヘテロダイマー、例えば、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２６５９−２６６２、および、Ｅｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ１９：４０９１−４０９６参照）、（ｉｖ）単一鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３参照）、（ｖ）二量体および三量体抗体断片構築体、（ｖｉ）ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６、および、１９９４年９月２１日発行英国特許公報第ＧＢ２，２７６，１６９号参照）、（ｖｉｉ）ミニ抗体またはミニ体（すなわち、そのＣ末端にオリゴマードメインを含み、ヒンジ領域によってｓＦｖから隔てられるｓＦｖポリペプチド鎖、例えば、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ３１：１５７９−１５８４、Ｃｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４９Ｂ：１２０−１２６）、および、（ｖｉｉ）上記の分子から得られる機能的断片であって、ペアレント抗体分子の特異的結合性を保有する全ての機能的断片である。

「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書では、全ての長さの、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む−ただしそれらに限定されない−ヌクレオチドのポリマー形を含むものとして用いられる。これらの用語の間には、長さにおいて意図的な区別はない。さらに、これらの用語は、分子の一次構造のみに関わる。従って、ある実施態様では、これらの用語は、３本鎖、２本鎖、および、１本鎖ＤＮＡの外に、３本鎖、２本鎖、および、１本鎖ＲＮＡを含むこともあり得る。これらの用語はまた、ポリヌクレオチドのメチル化による、および／または、キャッピングによる修飾も、また、未修飾形も含む。さらに限定的には、「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである、その他全てのタイプのポリヌクレオチド、および、その他の、非ヌクレオチド性バックボーンを含むポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルフォリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ、コルバリス、オレゴン州、からＮｅｕｇｅｎｅという名前で市販されている）ポリマー、および、その他の、合成ポリマー特異的核酸ポリマーで、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見られるように塩基対合および塩基スタッキングを可能とする形態を取る核塩基を含む核酸ポリマーを含む。

「プローブ」とは、相補的配列を持つ標的核酸に対して、１種類以上の化学結合を通じて、通常は相補的塩基対合を通じて、通常は水素結合形成を通じて結合し、２本鎖構造を形成することができる核酸である。プローブは、「プローブ結合部位」に対して結合する、すなわち、ハイブリダイズする。このプローブは、プローブの容易な検出を、特に一旦プローブがその相補的標的に対してハイブリダイズした場合に、可能とするように、検出可能な標識によって標識することが可能である。プローブに付着される標識としては、例えば、化学的または物理的手段によって検出が可能な、従来技術で既知の各種各様の標識の全てが含まれる。プローブに付着が可能な適当な標識としては、放射性同位元素、蛍光体、色素体、質量標識、電子線不透過粒子、磁気粒子、スピン標識、化学的発光を発射する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補酵素、および、酵素基質が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。プローブはそのサイズが相当に変わり得る。比較的短いプローブもある。一般に、プローブは、長さが少なくとも７から１５個のヌクレオチドである。別に、少なくとも２０、３０または４０ヌクレオチド長のプローブもある。また別にそれよりやや長く、少なくとも、５０、６０、７０、８０、９０ヌクレオチド長のプローブもある。別にさらにより長く、少なくとも１００、１５０、２００以上のヌクレオチド長のプローブもある。プローブはまた、前述の範囲に入るいずれの特定の長さを持ってもよい。

「相補的」という用語は、ある核酸は、別の核酸分子と同一である、または、選択的にハイブリダイズすることを意味する。ハイブリダイゼーションの選択性は、完全な特異性の欠如よりも選択的なハイブリダイゼーションが起こる場合に存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも１４−２５個のヌクレオチド長の鎖において少なくとも約５５％の同一性がある、好ましくは少なくとも６５％の、さらに好ましくは少なくとも７５％の、そしてもっとも好ましくは少なくとも９０％の同一性がある場合に見られる。好ましくは、一方の核酸は、他方の核酸に対して特異的にハイブリダイズする。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）参照。

「ストリンジェントな条件」という用語は、あるプローブまたはプライマーが、その標的配列にはハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、様々な状況下で異なる。長い配列ほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、ある定義されたイオン強度およびｐＨにおいて、特異的配列に対する融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選ばれる。その他の場合では、ストリンジェントな条件は、配列と、標的に対して厳密な、または、ほぼ厳密な相補性を持つプローブの融解温度よりも約２０℃または２５℃低くなるように選ばれる。本明細書で用いる場合、融解温度とは、２本鎖核酸分子から成る集団の半分が１本鎖となる温度である。核酸のＴｍを計算する方法は従来技術においてよく知られている（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１５２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．および Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。両方とも引用することにより本明細書に含める。標準的文献に示されるように、Ｔｍ値の簡単な推定は、核酸が１Ｍ ＮａＣｌの水溶液である場合、方程式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算が可能である（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，”ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）参照）。その他の文献には、Ｔｍの計算に、配列特性のみならず構造特性も考慮にいれた、もっと洗練された計算式が挙げられている。ハイブリッドの融解温度（従って、厳格なハイブリダイゼーションの温度も）は、様々な要因、例えば、プローブの長さと性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在するか、または、固定化されているか等）、および、塩および、その他の成分（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランまたはポリエチレングリコールの有無）の濃度によって影響される。これらの要因の作用はよく知られており、従来技術における標準的文献の中で論じられている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ上記、および、Ａｕｓｕｂｅｌ上記を参照されたい。典型的には、厳格条件は、ｐＨ７．０から８．３において、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａイオン未満、典型的には約０．０１から１．０ ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）であり、温度は、短いプローブまたはプライマーの場合（例えば、１０から５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃で、長いプローブまたはプライマーの場合（例えば、５０を越えるヌクレオチド）少なくとも約６０oである。厳格条件はまた、ホルムアミドのような脱厳格化条件剤の添加によっても実現が可能である。

「低分子」とは、１０００ドルトン未満、より典型的には５００ドルトン以下の分子量を持つ合成分子を意味する。このような分子としては、例えば、単糖類、多糖類、ポリペプチド、ステロール、アミノ酸、脂質、および、核酸が挙げられる。

「特異的に結合する」という語句は、一般に、サンプル中の他の成分に対するよりも高い親和性と特異性をもって行われる、リガンドとアンチリガンドの結合、または、その逆の結合を指す。従って、この用語は、他の生物学的化合物から成る不均一な集団の存在下においてリガンドの存在を決定づける結合反応を指す。従って、表示の条件下では、ある特定のリガンドは、ある特定のアンチリガンドに対しては好んで結合するが、そのサンプルに存在する他の分子に対しては目立つほどの量結合しない。典型的には、アンチリガンドに特異的に結合する分子またはリガンド（例えば、抗体）は、少なくとも１０^３Ｍ^−１または１０^４Ｍ^−１、場合によっては１０^５Ｍ^−１または１０^６Ｍ^−１、その他の場合では１０^６Ｍ^−１または１０^７Ｍ^−１、好ましくは１０^８Ｍ^−１から１０^９Ｍ^−１、より好ましくは約１０^１０Ｍ^−１から１０^１１Ｍ^−１以上の結合定数を持つ。

差は、典型的には、その差が実験誤差のレベルよりも大きければ「統計的に有意」と考えられる。さらに特定的に言うと、差は、観察された差が偶然に起こる確率がある指定のレベル未満の場合、統計的に有意である。本明細書で使用する場合、「統計的有意差」とは、＜０．０５、好ましくは＜０．０１、および、もっとも好ましくは＜０．００１のｐ−値を指す。

「標識」という用語は、物理的、化学的、電磁的、および、その他の関連分析技術によって検出可能な分子、または、分子の一局面を指す。利用可能な検出標識の実例としては、放射性同位元素、蛍光体、色素体、質量標識、電子線不透過粒子、磁気粒子、スピン標識、化学的発光を発射する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補酵素、および、酵素基質が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。「検出可能に標識された」という用語は、薬剤が標識と抱合されること、または、薬剤が、別の標識と抱合することを要せずに検出可能とする、何か内在性の特性（例えば、サイズ、形、または、色）を持つことを意味する。

（ＩＩ．導入）
本明細書に記述されるものは、多種多様なアッセイ、例えば、高処理能力スクリーニングアッセイ、細胞アッセイまたは細胞成分を含むアッセイ、および、組み合わせ合成のような合成を実行するための、微小流体装置および方法である。この微小流体装置は、一部は、フローチャンネル、コントロールチャンネル、バルブ、および／またはポンプを含むことによって特徴づけられ、これらの内の少なくともいくつかはエラストマー材料から製造される。

さらに、本発明の微小流体装置は固相基板層を含む。この固相基板層は、１種以上のリガンドが付着する表面を含む。別態様として、固相基板面は官能基を含むかまたは、リガンドがその表面に付着できるように修飾が可能である。好ましくは、リガンドは、この固相基板面に対して共有的に結合される。

固相基板面の上にリガンドが存在することによって、下記に詳述する様々なアッセイが可能になる。

本発明の微小流体装置は、複数の第１チャンネルと複数の第２チャンネルを含む。１本を越えるフローチャンネルの存在によって単一の微小流体装置において平行的アッセイが可能となるので処理能力が増す。各第１フローチャンネルは、各第２フローチャンネルと交差し交わるので、複数の交差区域をもたらす。第１フローチャンネルにリガンドを含む流体を導入し、かつ、第２フローチャンネルにアンチリガンドを含むかも知れない流体を導入することによって、結合アッセイが第１および第２フローチャンネルの交差区域において実現される。

適当なバルブを選択的に活性化することによって、複数の第１フローチャンネルまたは複数の第２フローチャンネルの内の少なくとも１個は、複数のループ状フローチャンネルを形成することが可能になる。バルブはコントロールチャンネルを含み、このコントロールチャンネルの活性化によって（例えば、コントロールチャンネルに圧または真空を与えることによって）、フローチャンネルに向けて変位される、または、遠ざけられるエラストマー分節または膜によって、フローチャンネルから分離される。エラストマー分節がフローチャンネルの中に入り込むと、それは、チャンネルを通過する溶液流を阻止する。各ループ状フローチャンネルはポンプを含み、これが、そのループ状フローチャンネルの中を溶液を循環させる、または、再循環させる手段となる。ポンプは１個以上のコントロールバルブ、好ましくは１個を越えるコントロールバルブを含むことが可能であり、さらに好ましくは、所望の順序で活性化が可能な３個のバルブを含む。

さらに、本発明の微小流体装置は、複数の第１コントロールバルブおよび複数の第２コントロールバルブを含む。各第１コントロールバルブは、各第１フローチャンネルを通過する溶液の流れを調節し、各第２コントロールバルブは、各第２フローチャンネルを通過する溶液の流れを調節する。このようにして、コントロールバルブの選択的活性化は、溶液の、望まないフローチャンネルへの流れを防止する。

本発明のいくつかの微小流体装置はまた、複数の保持バルブを含む。各保持バルブは、第１および第２フローチャンネルの、一つの交差区域を包囲する保持空間を形成する。このようにして、交差区域内の流体流を制限することを可能とし、溶液を交差区域に長期間接触させる手段となる。保持バルブは、一対は第１フローチャンネル内にあり、もう一対は第２フローチャンネル内にある、２対のバルブを含む。各バルブペアにおいて、バルブは互いに、交差区域の別の側に設置されるように配置される。従って、保持バルブのエラストマー分節がフローチャンネルの中に侵入すると、そのエラストマー分節は、そのフローチャンネル内に、侵入エラストマー分節によって区画される保持空間を形成し、それぞれ個別の交差区域を包囲し、隔離する。一つの実施態様では、保持バルブは、複数の第１コントロールバルブと複数の第２コントローブバルブ両方の組み合わせから形成される複数の保持バルブを含む。

本発明の微小流体装置はまた、流体を第１フローチャンネルに沿って輸送するポンプ、および、流体を第２フローチャンネルに沿って輸送するポンプのような各種ポンプを含む。いくつかのポンプは、活性化されるとフローチャンネルに変位侵入するエラストマー分節によってフローチャンネルから隔離される、複数の、好ましくは少なくとも３本のコントロールチャンネルを含むことによって特徴づけられる。コントロールチャンネルを交互様式で活性化することによって、蠕動効果を誘発することも可能である。

さらに、本発明の微小流体装置は、貯留槽または保存区域（すなわち、液体チャンバ）を要すれば随意に含んでもよい。この貯留槽またはチャンバは、典型的には、フローチャンネルの入口部分に、または、その近傍に設置される。これは、第１または第２フローチャンネルに流体を導入する前の流体の保存部位とするためである。各フローチャンネルが独自の貯留槽を持ってもよいし、または、２本以上のフローチャンネルが１個の共通の貯留槽を持ってもよい。同様に、本発明の微小流体装置は、フローチャンネルの出口または廃液フローチャンネルからの流体を収集するための廃液貯留槽を要すれば随意に含んでもよい。

さらに、本発明の微小流体装置は、廃液フローチャンネルおよび／または廃液収集チャンバを含んでもよい。典型的には、第１フローチャンネルの出口は全て第１廃液フローチャンネルと流体的に連通しており、そのために、第１フローチャンネルに対し複数の廃液フローチャンネルは必要とされない。同様に、第２フローチャンネルの出口は全て第２廃液フローチャンネルと流体的に連通しており、そのために、第２フローチャンネルに対し複数の廃液フローチャンネルは必要とされない。しかしながら、本発明は、第１および第２フローチャンネルのそれぞれに単一廃液チャンネルを有することに限定されないことを理解しなければならない。

フローチャンネルは、エラストマー層内において、そのフローチャンネルの少なくとも一部が固相基板によって囲まれて形成される。一つの実施態様では、固相基板はフローチャンネルの一つの壁を形成する、すなわち、フローチャンネルは、固相基板とエラストマー層の間のインターフェイス内に配置される。別の実施態様では、全フローチャンネルがエラストマー層内に形成され、ただ、第１および第２フローチャンネルの交差区域においてのみ固相基板がフローチャンネルの一方の壁を形成する。

本明細書で提供される微小流体装置は、いくつかの異なるアッセイ用途に、例えば、高処理能力リガンド／アンチリガンド結合アッセイに利用が可能である。各種溶液を様々のフローチャンネルに調節的に導入することによって、いくつかの異なる分析または合成を同時に実行することが可能である。従って、本微小流体装置は、いくつかの異なるタイプのアッセイを実行するのに使用することが可能である。

本明細書に開示される装置は、複数の個別の化合物および化合物のライブラリーをスクリーニングして、各種インビトロ・モデルシステムにおいて所望の作用を有する化合物を特定するのに利用することが可能である。例えば、本明細書に提供される微小流体装置は、化合物のライブラリーを、不快な結果をもたらす反応または過程を完全にまたは部分的に抑制することが可能な化合物を探し出すためにスクリーニングするのに利用することが可能である。例えば、ライブラリーを、病気（例えば、細菌およびウィルス感染、遺伝疾患および癌）の発症、または、病気に関連する特定の症状に関わる反応または過程を抑制する化合物を特定するためにスクリーニングすることが可能である。別に、興味の反応または過程を活性化または促進する特定の化合物を同定するために複数の個別化合物および化合物ライブラリーをスクリーニングすることが可能である。最初のスクリーニングで活性を示す化合物は次に他のスクリーニングにかける、また、修飾して、病気を治療する、または、研究中の病気に関連する症状を治療するに当たって薬剤として処方するのに好適な化合物を特定するために再度スクリーニングにかける。

本明細書に開示される装置はまた、各種蛋白、または、翻訳後修飾、例えば、糖鎖付加またはリン酸化を受けた蛋白の濃度を特定するのに利用することが可能である。例えば、本明細書に提供される微小流体装置を利用するアッセイは、蛋白濃度の変動の有無に関して、細胞集団または細胞タイプをスクリーニングするのに利用することができる。このような情報は、例えば、細菌およびウィルス感染、遺伝疾患および癌に関連する表現型を確定するのに有用である可能性がある。このような情報は、新規の薬剤標的を特定するのに、または、各種細胞蛋白の重要性を明らかにするのに有用である可能性がある。

一般に、このようなスクリーニング法は、フローチャンネル内の固相基板表面にリガンド（例えば、細胞、酵素、オリゴヌクレオチド、ペプチド、または、抗体等）を付着させ、アンチリガンド（例えば、それぞれ、低分子、基質、相補的オリゴヌクレオチド、結合ペプチド、または、抗原等）を導入し、結合活性を測定することを含む。アンチリガンドは、リガンド／アンチリガンド結合の検出をさらに助けるために標識してもよい。別に、標識リガンドを加えて、リガンド／アンチリガンド／標識リガンドの３体複合体を形成させてもよい。このようにして、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫）およびＦＬＩＳＡ（蛍光免疫）アッセイ、おおび、従来既知の、リガンド／アンチリガンド／標識リガンド３体複合体アッセイを実現することが可能である。

典型的には、リガンドは、第１フローチャンネルを通じて適当な試薬を微小流体装置に導入することによって固相基板表面に付着させる。リガンドが付着した後、未結合のリガンドと試薬は、例えば、第１フローチャンネルを洗浄液で洗うことによって除去する。別に、チャンネル交差区域だけが興味ある場合は、未結合のリガンドは、第１コントロールバルブを閉鎖し、洗浄液を第２フローチャンネルの中に導入することによって除去することが可能である。次に、アンチリガンドを含むサンプル液を第２フローチャンネルを通じて導入する。サンプル液は、第２フローチャンネルの中を循環させ、結合リガンドに長期に暴露させるようにすることも可能であるし、あるいは、サンプル液は、第２フローチャンネルの中を連続的に流すことも可能である。さらに別のやり方として、サンプル液は、保持スペースに保持して、結合リガンドと長期に接触させることも可能である。３体複合アッセイを実行する場合、未結合リガンドは、第２フローチャンネルから、例えば、第２フローチャンネルを洗浄溶媒で噴射することによって除去する。ここでも、チャンネルの交差区域のみを問題としたいのであれば、第２コントロールバルブを閉鎖し、第１フローチャンネル中に洗浄液を導入することによって未結合リガンドを除去することができる。次に、リガンド液−この液のリガンドは要すれば随意に標識されてもよいが−を第１または第２フローチャンネルに導入する。このようにすると、結合アッセイは、交差区域においてのみ行われる。

エラストマー層を固相基板層から外し、交差区域において適当な結合パラメータ（単数または複数）を測定することによって結合アッセイを定めることが可能である。別態様として、結合アッセイは、エラストマー層を固相基板に付着させたままで定めることも可能である。

同様にして、この微小流体装置のバルブおよびポンプを、様々の交差区域において異なる反応物質を調節的に反応させて組み合わせ合成を実行するために利用することも可能である。

（ＩＩＩ．微小流体要素）
本明細書に開示される微小流体装置において共通に利用されるいくつかの要素を下記に記述する。これらの要素は、様々のやり方で組み合わされて、事実上無限の数の形態を生み出すことが可能なモジュールと見なすことが可能であることを理解しなければならない。さらに、下記の要素またはモジュールを用いることによって、装置で実行される特定の用途（単数または複数）にとって有用な要素を含む微小流体装置を特注製作することが可能である。

（Ａ．概論）
本発明は、後述する方法における微小流体装置の製造に限定されないことを理解しなければならない。むしろ、本発明の方法の修正を含めた、本発明の微小流体装置を製造するための、その他の適当な方法もまた、本発明の範囲に含まれる。

本明細書に開示される微小流体装置は、単層・多ソフトリソグラフィー（ＭＬＳＬ）技術、および／または、犠牲層封入法（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ−ｌａｙｅｒ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）によって構築される。これらの方法は両方ともＵｎｇｅｒ等（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８８：１１３−１１６、２０００年６月２７日出願の米国特許出願第０９／６０５，５２０号、２０００年１１月２８日出願の米国特許出願第０９／７２４，７８４号、および、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／０１０２５号に詳細に記述される。上記文献の全ては、その全体が本明細書中に参考として援用される。本明細書に提供される微小流体装置は、下記に詳述される様々な成分を含むことが可能である。これらの成分は、特定の用途に応じて多種多様な形態に配置することが可能である。下記のセクションでは、装置で利用される一般的成分が記述される。このセクションの次には、各種のアッセイや高処理スクリーニングに利用が可能な例示の形態が記述される。

下記に詳述されるように、フローチャンネルのエラストマー層部分は、そのエラストマー層フローチャンネルの内面を修飾することによって特定の用途に合わせることが可能である。

（Ｂ．固相基板）
本発明の微小流体基板では、固相基板の上でアッセイを実行することが可能となる。従って、リガンドまたはリンカー分子の付着を可能とする誘導体を派生させる物質はいずれも固相基板としての使用が可能である。本発明の固相基板として好適な例示の物質としては、ガラス（孔制御ガラスを含む）、ポリスチレン、ポリスチレン・ジビニルベンゼン共重合体（例えば、ペプチド合成用）、シリコンゴム、石英、ラテックス、ポリウレタン、金およびその他の誘導体化遷移金属、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、ヒ化ガリウム等が挙げられるが、ただし、これらに限定されない。固相基板材料は好ましくは、それらが暴露される、多様な有害化学反応条件に対して抵抗性を有する。

複数の、平坦な個別固相基板は、それから複数の、個別のアレイまたはチップが製造可能となるように、様々の大きさを持ってもよい。「アレイ」または「チップ」という用語は、固相基板の表面に結合した、複数の、位置的に異なるリガンド／アンチリガンド複合体を有する、個別の配列のリガンド／アンチリガンド複合体の最終産物を指す。固相基板のサイズは、一般に、固相基板から形成されるアレイの数と性質によって定義される。例えば、より複雑なアレイは、一般に、より広い面積を利用するので、より大きな固相基板を用いるが、一方、より単純なアレイは、より狭い表面積、したがって、より小さな固相基板を用いる。

固相基板のサイズは一般に、所望のリガンド／アンチリガンド複合体アレイの数に依存する。しかしながら、典型的には、固相基板の大きさは、約１ｃｍ×１ｃｍから約３０ｃｍ×３０ｃｍまでのどの値であってもよい。本発明の一つの特定の実施態様では、固相基板は、標準の、１（インチ）×３（インチ）または２（インチ）×３（インチ）の顕微鏡用ガラススライド、または、１（インチ）×１（インチ）、１．５（インチ）×１．５（インチ）、または、２（インチ）×２（インチ）の石英ガラス窓である。

（表層剥離および濯ぎ）
リガンドを固相基板に付着させる際に最大効率を確保するためには、一般に、リガンド付着反応が起こる予定の固相基板については清潔なものを提供することが好ましい。従って、本発明のいくつかの実施態様では、固相基板の表層を剥離して、残留汚れ、油成分、その他、リガンドの付着を妨げる恐れのある物質を完全に取り除く。

固相基板の表層剥離工程は、典型的には、剥離液を固相基板に塗布する、固相基板を剥離液に浸漬する、または、その他のやり方で固相基板を剥離液に接触させることを含む。剥離液は、汚れ・油分除去用の、市販の、または、簡単に調製される、いくつかの化学溶液の中から選ばれる。このような溶液は従来技術でよく知られている。特に好ましい剥離液は、Ｈ_２Ｏ_２およびＮＨ_４ＯＨの濃縮混合液から構成される。気相洗浄法・調製法も、従来技術で既知の方法を用いて固相基板に適用してもよい。

（誘導体化）
必要なければ、固相基板表面を洗浄し表層剥離したら、その表面に誘導体を派生させて、固相基板の上に、リガンドを付着させるための別部位または官能基を供給してもよい。特に、誘導体化は、それに対してリガンドまたはリンカーの付着が可能な、反応性官能基、例えば、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ基等をもたらす。例えば、固相基板表面には、水かエタノールに溶解させたシランを用いて誘導体化を実行することが可能である。好ましいシランとしては、基板表面にヒドロキシル官能基を供給する、モノおよびジヒドロキシアルキルシランが挙げられる。別に、アミノアルキルトリアルコキシシラン類を用いて、反応性のアミン官能基を有する初期表面修飾を実現してもよい。特に好ましいのは、３−アミノプロピルトリエトキシシランおよび３−アミノプロピルトリエトキシシラン（“ＡＰＳ”）である。後者のアミノシランによる基板の誘導体化は、各種アッセイ条件およびその他の化学的反応条件の下でも安定な結合（オリゴヌクレオチド合成の場合、この結合は典型的には、ヒドロキシアルキルシランが用いられるホスホジエステル結合と対照的に、ホスホラミダイト結合である）。さらに、このアミノシラン誘導体化は、ヒドロキシアルキルシランによる誘導体化に優るいくつかの利点を提供する。例えば、アミノアルキルトリアルコキシシラン類は安価であり、各種供給源から高純度で購入が可能であり、それから得られる一次および二次アミン官能基は、ヒドロキシル基よりもより反応性の高い求核基であり、従って、リガンド付着させるための反応部位を提供する。さらに、アミノアルキルトリアルコキシシラン類は保存中に重合する傾向が比較的少なく、また、揮発性が十分に高く、気相運用が蒸着過程制御下に実行されることを可能とする。他にも好適なリンカーがあるが、それらは従来技術において通常の熟練を有する当業者にもよく知られている。

さらに、シラン類は、保護された、または、「マスクされた」ヒドロキシル基を持つように、また、著明な揮発性を持つように調製されてもよい。そのようなシラン類であれば、例えば、蒸留によって簡単に精製が可能であり、また、固相支持体表面をシラン化するのに気相蒸着法において簡単に使用することが可能である。固相基板の表面にこれらのシラン類をコートした後、上記ヒドロキシル基は、素早い化学処理、例えば、固相基板−シラン結合を損なわない希釈酸または塩基により脱保護し、固相基板を、リガンド付着またはポリマー合成のために使用可能とするようにしてもよい。このようなシラン類の実例としては、アセトキシアルキルシラン類、例えば、アセトキシエチルトリクロロシラン、アセトキシプロピルトリメトキシシランが挙げられる。これらは、塗布の後、例えば、気相のアンモニアおよびメチルアミン、または、液相のアンモニアおよびアルキルアミンの水溶液またはエタノール液を用いて脱保護してもよい。

固相基板シラン化のための物理的操作としては、一般に、固相基板をシラン溶液に浸漬する、または、その他のやり方で浸すことを含む。浸漬後、一般に固相基板は回転され側方に余分液を飛ばし、固相基板表面にシラン液が均一に分布されるようにする。このことによって、固相基板表面における反応性官能基のより一層均一な分布が確保される。シラン層の塗布後、このシラン化固相基板を焼成し、固相基板表面において重合させて、シラン試薬と固相基板の間の反応を強化してもよい。

別法として、前記シラン溶液は、調節気相法またはスプレー法を用いて、固相基板の表面に接触させてもよい。これらの方法は、シラン溶液を揮発または噴霧化して気相または噴霧とし、その後、通常、固相基板の表面を、気相または噴霧雰囲気に暴露して、気相または噴霧を固相基板の表面に沈着させることを含む。典型的には、蒸着は、固相基板を単に溶液に浸す場合よりも、誘導体化溶液のより一層の均一塗布を実現する。

誘導体化化工程の効果、例えば、固相基板における官能基の密度および均一性は、一般に、反応基に結合する蛍光体、例えば、蛍光性ホスホロアミダイト、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａから市販されるＦｌｕｏｒｅｐｒｉｍｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されるＦｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＡＢＩから市販されるＦＡＭを添加し、固相基板表面全体における蛍光の相対的強度を観察することによって評価される。

前述したように、リガンドは、エラストマー層を固相基板表面に付着させる前に、固相基板表面に付着させることが可能である。別法として、リガンドは、エラストマー層を固相基板に付着させた後に固相基板表面に付着させてもよい。このリガンド付着は、固相基板表面とリガンドの間の結合形成を可能とするのに十分な条件下で、適当な試薬液をフローチャンネルに導入することによって実現が可能である。

（Ｃ．チャンネル）
微小流体装置において、流体がそれを通じて輸送されるチャンネルは、典型的には、少なくともその一部はエラストマー層によって形成される。フローチャンネルから、一枚のエラストマー膜によって隔てられるのがコントロールチャンネルであり、これは、活性化されて、フローチャンネル中の流体（例えば、溶液）の流れを調節または制御することが可能である。バルブのセクションで下記にさらに精しく述べるように、コントロールチャンネルの活性化（例えば、フルーチャンネル内部における加圧または減圧）によって、フローチャンネルとコントロールチャンネルとを隔てるエラストマー区画は伸ばされてフローチャンネルに侵入し、フローチャンネル中の溶液流を阻止するバルブを形成する。典型的には、フローチャンネルとコントロールチャンネルとはある角度をもって相互に交差する。

このフローチャンネルとコントロールチャンネルとは二種類の一次加工技術によって製造が可能である。一つの方法は、一連のエラストマー層を微細加工金型で成形し、次に各層を融合させることである。二番目の一次加工法は、エラストマー層の上に所望の形態を持つフォトレジストパターンを形成することである。特に、フォトレジストはチャンネルが望まれる全ての場所に沈着される。所望の形のフローチャンネルおよびコントロールチャンネルを形成するためのこれら異なる２種類の方法、および、チャンネルサイズや形に関するその他の詳細については、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／０１０２５、２０００年６月２７日出願の米国出願第０９／６０５，５２０号、２０００年１１月２８日出願の米国出願第０９／７２４，７８４号、および、Ｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８８：１１３−１１６に相当精しく記述されている。これらの出願は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。

（Ｃ．サンプル入力）
溶液をフローチャンネルに導入するためにはいくつかの異なる選択肢がある。一つの選択肢は、例えば、針を用いて単に溶液をフローチャンネルに注入することである。また、溶液の容器を加圧して、容器から溶液をフローチャンネル中に強制的に送り込むことも可能である。関連する方法として、フローチャンネルの一端の圧を下げて、フローチャンネルの遠位の開口に溶液を引き込むことを含む方法がある。

個々のインプット／流入ラインは、単一チャンネルマイクロピペットを用いて手動で負荷が可能となるように形成することが可能である。この微小流体装置は、プレートリーダーおよびロボティクス用の産業規模仕様（例えば、外形が１２７．７６０．１２ｘ８５．４７０．１２ｍｍ）に基づくサイズとし、基準化されたウェル間間隔（ピッチ）を持つ、汎用マルチチャンネルロボット駆動ピペッター／サンプラーと組み合わせて動作するように設計されてもよい。３種類のプレート／装置に関するサイズ基準が、http://www.tomtec.com/Pages/platstan.hmtlおよびhttp://www.sbsonline.comに記述されている。この基準に合致しない特注マイクロピペットでも使用が可能である。いくつかのシステムでは、サンプルインプットチャンネルと流体的に連通する電気ピペットが利用されている。このタイプのマイクロピペットは、例えば、米国特許第６，１５０，１８０号に記述される。

本明細書に開示される微小流体装置への流入口は、エラストマー基質に対して打ち抜かれた、ドリル形成された、または、金型形成された穴または開口であってもよい。この開口部は、場合によって「ビア」とも呼ばれる。このビアはまた、フォトレジスト技術を用いて形成することも可能である。例えば、金属のエッチブロック層を、フォトレジストマスクのパタニングと組み合わせ、かつ、エッチブロック層を除去する溶媒を用いることによって、ビアを形成することが可能である。エラストマー連続層におけるチャンネル同士をつなぐ垂直ビアは、陰性マスク技術を利用することによって形成することが可能である。ビアはまた、応用レーザービームの印加によるエラストマー材料の研削によって形成することも可能である。これらの技術は全てさらに詳細に米国出願第０９／６０５，５２０号に記述される。

流入口は、溶液を注入するために使用されるピペットまたは注射針の先端の気密を実現するために、要すれば随意にカップリング（例えば、テフロン（登録商標）製）によって裏打ちされていてもよい。

後述するように、フローチャンネルを通じて溶液を輸送するのにエラストマー材料から形成されるポンプを用いることが可能である。大きさ・形が既知のチャンネルに対して、ポンプのストローク数に基づいて流入口から導入される体積を正確に調整することが可能である。

それから微小流体装置が製造されるエラストマー材料と化学的に適合可能なものであれば、どのようなサンプルまたは溶液も装置に導入が可能である。エラストマー材料が適当な形に成形または腐刻された場合、特定の用途と組み合わせた操作をやり易くするために、その材料から成るフローチャンネル部分を前処理する必要があるかも知れない。例えば、エラストマーが、溶媒に溶けたり、または、試薬やアッセイ溶液と反応することを低減または阻止するために、フローチャンネルの内壁をポリプロピレン、フッ化ポリビニリデン、ビトン（登録商標）、または、その他の好適な不活性物質でコートしてもよい。

（Ｄ．バルブ）
（１．構造）
本明細書に提供される微小流体装置のバルブはエラストマー材料で形成され、コントロールチャンネルとフローチャンネルを隔てるエラストマー区画（あるいは膜または分離部分）を含む。バルブは、２種類の全体設計を有する。すなわち、典型的には開放しているもの、および、通常は閉鎖しているものである。典型的には開放しているバルブは活性化されると、コントロールチャンネルに圧を加え、それによって膜を変位させてフローチャンネルの中に侵入させて流れを制限することによって、フローチャンネルを通過する流れを阻止する。通常は閉鎖されているバルブの場合は、膜または分離部分は、通常は伸びてフローチャンネルに侵入している。しかしながら、フローチャンネルに対するコントロールチャンネルの圧を低下させることによって、膜／分離部分はコントロールチャンネルの中に引き込まれ、フローチャンネルにおける閉鎖を解除する。

図１Ａおよび１Ｂは、典型的には開放しているバルブの一般要素を示す。図から見て取れるように、エラストマー構造２４は、金型の突起部分から形成される陥凹部２１の上に乗るコントロールチャンネル３２を含む。このエラストマー構造の陥凹部が、その底面において固相基板１４に気密に接着されると、陥凹部２１はフローチャンネル３０を形成する。図１Ｂおよび２Ａから見て取れるように、フローチャンネル３０とコントロールチャンネル３２は好ましくは、互いにある角度をもって配置され、エラストマーブロック２４から成る小さな膜２５が、フローチャンネル３０の頂上部を、コントロールチャンネル３２の基底部から隔てる。これらの図では、装置の全長を横断するコントロールチャンネルが示されているが、そうである必要はないことを理解しなければならない。コントロールチャンネルは、膜が、フローチャンネルに対し所望のレベルの封鎖を実現できるほどの十分な大きさを持つ陥凹であってもよい。図２Ｂは、通常は開放のエラストマーバルブ構造２００において、バルブが活性化されてフローチャンネルが阻止された状況を示す。特に、この構造は、フローチャンネル１２６をを含むエラストマー層１２８の上に乗るもう一つのエラストマー層１１０の中に形成されるコントロールチャンネル１２０を含む。エラストマー層１１０は基板１３０に付着する。コントロールチャンネルは加圧されているので、コントロールチャンネル１２０とフローチャンネル１２６を隔てる膜１２２は下方に変位されてフローチャンネル１２６の中に侵入し、それによってフローチャンネルの溶液流を効果的に阻止する。圧が解除されると、膜１２２の変位はフローチャンネル１２６から戻り、溶液流を可能とする。

前述したように、バルブはまた通常閉鎖される形態を取ることも可能である。図３Ａは、非活性化状態にある通常閉鎖バルブ４２００の一つの例を示す。フローチャンネル４２０２およびコントロールチャンネル４２０４はエラストマーブロック４２０６の中に形成される。フローチャンネル４２０２は、分離部４２０８によって隔てられる第１部分４２０２ａおよび第２部分４２０２ｂを含む。コントロールチャンネル４２０４は、分離部４２０８の上に乗る。図３Ａに示すように、弛緩した、不活性位置では、分離部４２０８は、フローチャンネル部分４２０２ａと４２０２ｂの間に設置されたままで、フローチャンネル４２０２を遮断する。図３Ｂは、分離部４２０８が活性化位置にある状態におけるバルブ４２００の断面図を示す。コントロールチャンネル４２０４内の圧が、フローチャンネルの圧を下回って低減されると（例えば、真空ポンプによって）、分離部４２０８は、それをコントロールチャンネル４２０４の中に引き込む活性力を経験する。この活性力により、膜４２０８はコントロールチャンネル４２０４の中に突出し、それによって、フローチャンネル４２０２を通る溶液流に対する障害が除かれ、通路４２０３が形成される。コントロールチャンネル４２０４内の圧が上昇すると、分離部４２０８は、元々の位置を取り、弛緩して元に戻り、フローチャンネル４２０２を遮断する。

フローチャンネルおよびコントロールチャンネルを含むエラストマー層は、同じタイプのエラストマー材料から製造される必要はない。例えば、コントロールチャンネルとフローチャンネルとを隔てる膜は、構造の他の部分とは異なるエラストマー材料から製造されてもよい。このタイプの設計は有用である。なぜなら膜の厚さや弾性は、バルブの動作において決定的に重要な役割を担うからである。

（２．バルブ活性化の選択肢）
バルブを開閉するためには様々の方法の利用が可能である。コントロールチャンネル内の圧を増すことによってバルブを活性化するのであれば、一般に、このことは、コントロールチャンネルを気体（例えば、空気）、または、液体（例えば、水または油圧用油）を通じて加圧することによって実現が可能である。しかしながら、特注による静電的および磁気的活性化システムを利用することも可能である。静電的活性化は、反対電荷を持つ電極（電圧差がそれらの電極に印加されると互いに引き合う性向を持つ）を、直接エラストマーの一体的構造の中に形成することによって実現が可能である。例えば、再び図２を参照すると、特注の第１電極７０（ファントムとして示される）を膜２５の上に（または中に）設置し、特注の第２電極７２（これも想像上のものとして示される）を平坦な基板１４の上に（または中に）設置することが可能である。電極７０および７２が反対極性によって荷電されている場合、二つの電極間の引力によって、膜は下向きに曲げられ「バルブ」を閉鎖する（すなわち、フローチャンネル３０を閉鎖する）。

別法として、フローチャンネルの磁気的活性化が、フローチャンネルを隔てる膜を、磁気的に極性化が可能な材料、例えば、鉄、または、恒久的磁化材料、例えば、極性化ＮｄＦｅＢを用いて製造することによって実現が可能である。膜を磁気的に極性化可能な材料で製造した場合、印加された磁場に応じた牽引によって膜を活性化させることが可能である。

特注による電解質および動電活性化システムを利用することも可能である。例えば、膜に対する活性化圧は、膜の上の陥凹における電解反応によって発生させることが可能である。この実施態様では、陥凹の中の電極を用いて、陥凹中の電解質を横切る電圧を印加する。この電位差によって電極に電気化学的反応が誘発され、気体分子種の発生がもたらされ、陥凹部に圧差を引き起こす。別法として、膜の上の活性化圧は、コントロールチャンネルにおける動電的流動によって発生させることも可能である。この実施態様では、コントロールチャンネルの対向末端にある電極を用いて、コントロールチャンネル中に存在する電解質を横切って電位差を印加する。電解質における荷電分子種のそれぞれの電極に向かう移動によって圧差を発生させることが可能である。

最後に、バルブは、コントロールチャンネル中に、熱膨張による、または、液体からの気体生産による、熱エネルギーの印加に基づいて、液流を発生させることによって活性化させることも可能である。同様に、気体産物を発生する化学反応が、膜活性化に十分なほどの圧増加を生み出すようにしてもよい。

（３．選択的バルブ活性化の選択肢）
製造をやり易くし、かつ、微小流体装置におけるコントロールチャンネルの数を減らすために、１本のコントロールチャンネルを、数本のフローチャンネルの上にまたがらせることがよくある。この場合、この１本のコントロールチャンネルの加圧は、それら全てのフローチャンネルの阻止を招く可能性がある。１本のコントロールチャンネルがまたがる全てのフローチャンネルをではなく、選択されたフローチャンネルのみを阻止したいことがよくある。選択的活性化は、いくつかの異なるやり方で実現が可能である。

図４に描かれる一つの選択肢は、コントロールチャンネル５００４、５００６の幅を、それらチャンネルがフローチャンネル５００２Ａおよび５００２Ｂを横断する地点で制御することである。コントロールチャンネルが広くなる場所５００４Ａ，５００６Ａでは、コントロールチャンネル５００４、５００６の加圧によって、フローチャンネルとコントロールチャンネルを隔てる膜が大きくフローチャンネル５００２Ａ、５００２Ｂの中に押し下げられるので、それらのチャンネルの流通を阻止する。逆に、コントロールラインが狭い場所５００４Ｂ，５００６Ｂでは、両チャンネルを隔てる膜も狭い。従って、同じ程度の加圧では、膜は、フローチャンネル５００２Ａ，５００２Ｂの中に押し下げられない。従って、その膜下部の流通は阻止されない。

同じ一般的効果は、コントロールチャンネルに対するフローチャンネルの幅を変えることによっても実現が可能である。フローチャンネルの中に変位させられる膜に向き合うフローチャンネル区画にエラストマー支持体を組み込んでも、液流の完全阻止を防ぐことは可能である。

いくつかの図で、バルブは、そのバルブがフローチャンネルの液流を阻止するのに利用が可能である場合、単一の鎖線で表される。フローチャンネルを横切るが、そのフローチャンネルを阻止するようには作動しない（直ぐ上で述べた理由で）コントロールチャンネルは、フローチャンネルの上に弓状線を描く実線の円弧で表される。

その他、バルブを活性化する様々な方法があるが、それらは、上で本明細書に含められた米国およびＰＣＴ出願に記述されている。

（Ｅ．ポンプ）
本明細書に記述される微小流体装置の内部において一体化されるポンプは、１本のフローチャンネルの上に乗る複数のコントロールチャンネルから形成することが可能である。蠕動性ポンプ駆動用システムの特異的例を図５Ａと５Ｂに示す。図から見て取れるように、１本のフローチャンネル３０は、その上を通過する、複数の、全体として平行なコントロールチャンネル３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃを持つ。コントロールライン３２Ａを加圧することによって、フローチャンネル３０の流れＦは、コントロールライン３２Ａとフローチャンネル３０の交点にある膜２５Ａの下部において遮断される。同様に（しかし、図示はせず）、コントロールライン３２Ｂを加圧することによって、フローチャンネル３０の流れＦは、コントローライン３２Ｂとフローチャンネル３０の交点にある膜２５Ｂの下部において遮断される。各コントロールライン３２Ａ，３２Ｂおよび３２Ｃに対しては別々に向き合うことが可能である。従って、蠕動運動は、３２Ａと３２Ｃ一緒、次に３２Ａ、次に３２Ａと３２Ｂ一緒、次に３２Ｂ、次に３２Ｂと３２Ｃ一緒を活性化させるというパターンによって活性化させることが可能である。このタイプのポンプは、いくつかの図では、一連の３本の平行鎖線による省略形で表す。

溶液をチャンネルを通じて輸送するのに外部のポンプをフローチャンネルに接続することも可能である。別法として、フローチャンネルに真空を印加して、液流を、減圧領域に向けることも可能である。

（ＩＶ．高処理スクリーニングシステム）
（Ａ．概論）
もっとも単純な形としては、本発明の方法・微小流体装置で用いられる生化学システムモデルは、一つの生化学システムの二つの成分間の相互作用、すなわち、リガンド−アンチリガンド相互作用、例えば、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用等に及ぼす試験化合物の作用についてスクリーニングするものである。この形態では、生化学システムモデルは、典型的には、それに対する作用剤が求められる、システムの、正規に相互作用を持つ２種類の成分、例えば、抗体とその蛋白基質、または、酵素とその基質を含む。

あるサンプルがこの相互作用に対して作用を持つかどうかを定めることは、リガンドをサンプルと接触させ、リガンド−アンチリガンド相互作用を定量することを含む。次に、この定量された機能を、対照（コントロール）、例えば、アンチリガンド不在下における、または、既知のアンチリガンドの存在下における同じ反応と比較することが可能である。

２成分生化学システムに基づいて説明されたけれども、本発明の方法・微小流体装置はまた、システムの結果が既知であり、いくつかのレベルで定量が可能な、より複雑な系、例えば、酵素経路、細胞シグナル伝達経路等のためにも使用することが可能である。別に、本明細書に記述される方法および微小流体装置は、ある生化学システムの単一成分と相互作用を持つ化合物、例えば、特定の化合物、例えば、受容体、酵素、核酸等に特異的に結合する化合物をスクリーニングするのに使用することも可能である。

リガンドはまた、全体細胞システムにおいて具現化することも可能である。例えば、細胞反応に対する作用の有無について試験化合物をスクリーニングしようとする場合、細胞を固相基板面の上に固定化することによって全体細胞を利用することが可能である。本明細書でその全容が明確にされるこの微小流体装置では、修飾された細胞系を用いることも可能である。例えば、あるサンプルの、ある特定の生化学システムに対する作用のインディケーターとして、キメラリポーターシステムを用いることも可能である。キメラリポーターシステムは、典型的には、受容体の基質に対する結合をシグナル伝達するシグナル伝達系に統合された異種リポーターシステムを含む。例えば、ある受容体を、異種蛋白、例えば、その活性を簡単に定量可能である酵素に融合することが可能である。次に、基質結合による前記受容体の活性化はその異種蛋白を活性化させ、これが次に検出を可能とする。上記から、代理リポーターシステムは、簡単に検出可能な事象またはシグナルを生成するので、受容体／基質結合に対する定量が実現される。このようなキメラリポーターシステムは、従来技術において既に記述されている。

さらに、バイオアベイラビリティーについて、例えば、輸送についてスクリーニングしている場合には、生物学的障壁を含めることも可能である。この「生物学的障壁」という用語は、一般に、生物系内部の、または、その合成モデル内部の細胞層または膜層を指す。このような生物学的障壁の例としては、上皮層および、内皮層、例えば、血管内皮等が挙げられる。

生物学的反応はしばしば、受容体がその基質に結合することによって起動されたり、および／または、制御される。例えば、成長因子、すなわち、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ等とその受容体との相互作用は、広範な生物学的反応、例えば、細胞増殖・分化、介在酵素の活性化、メッセンジャー代謝回転の刺激、イオンフラックスの変動、酵素の活性化、細胞形の変化、および、遺伝子発現レベルの変動を含む生物学的反応を刺激する。従って、受容体とその基質との相互作用の調節は、その相互作用によってもたらされる生物学的反応調節の実現を可能とする。

従って、一つの局面において、本発明は、受容体とその基質の間の相互作用に影響を及ぼす化合物のスクリーニングに有用である。従って、受容体／基質ペアは、通常膜関連性の、典型的な蛋白受容体、および、その天然の基質、例えば、もう一つの蛋白または低分子を含んでもよい。受容体／基質ペアはまた、抗体／抗原結合ペア、相補的核酸同士、核酸関連蛋白とその核酸リガンドを含んでもよい。特異的に会合する、多数の生化学化合物同士が従来技術でよく知られており、本発明を実行する際に利用が可能である。さらに、三次元の、または、それより高次の結合複合体も、後述するように、本発明の微小流体装置によって定量が可能である。

従来から、受容体／基質相互作用の作用因子をスクリーニングする方法は、サンプルの存在下で受容体／基質結合ペアをインキュベートすることを含んでいた。正常な結合に減少が見られる場合、そのサンプルは、その受容体／リガンド結合の拮抗剤または抑制剤であると判断される。その結合に増加が見られる場合、その基質は、相互作用の拮抗剤であると判断される。

同様の、おそらく重複する一組の生化学システムは、酵素とその基質の間の相互作用を含む。典型的には、その基質に向かう酵素活性の作用因子は、酵素を、スクリーンニングの対象である化合物の存在下において、また、不在下において酵素を基質に、しかも、酵素活性の変化を検出するのに最適の条件下で接触させることによってスクリーニングする。反応設定時間後、混合物を、反応産物の有無について、または、基質量の減少について定量する。次に、触媒反応を経過した基質の量を、コントロールと、すなわち、サンプルの不在下に、または、既知の作用因子（エフェクター）の存在下に基質と接触させた酵素と比較する。前述のように、基質に向けられる酵素の活性を低下させる化合物は「阻害剤」または「拮抗剤」と名づけられ、一方、その活性を加速する化合物は「作用剤（アゴニスト）」と名づけられる。

一般に、本発明によって包括される各種スクリーニング法は、複数のサンプルを１台の微小流体装置に同時に導入することを含む。典型的には、各サンプルは、前記複数の第１または第２フローチャンネルの一方のそれぞれに導入される。一旦装置に注入されたなら、各サンプルは同時に定量されるので、高処理スクリーニングを実現する。

本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、化合物（単数または複数）であって、その固定化されたリガンドに結合する能力、または、特定の固定化生化学系に結合する能力に関してスクリーニングされる化合物の集合体を指す。サンプルは、広範な種類の化合物、化学的化合物、化学的化合物の混合物、例えば、多糖類、小型の有機または無機分子、生物学的巨大分子、例えば、ペプチド類、蛋白類、核酸類、または、生物学的試料、例えば、細菌、植物、真菌、または動物細胞や組織、天然に見られる組成物または合成組成物からの抽出物を含む各種化合物を含むことが可能である。実施される特定の実施態様に応じて、サンプルは、例えば、注入されて、溶液の中で遊離して、担体に付着して、粒子、例えば、ビーズとして、供給されてもよい。サンプルを付着させるためにいくつかの好適な粒子の採用が可能である。好適な粒子の実例としては、アガロース、セルロース、デキストラン（すなわち、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとして市販されている）、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ろ紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ガラスのビーズ、ポリアミンメチルビニールエーテル・マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン・マレイン酸コポリマー、ナイロン、シルク等が挙げられる。さらに、本明細書に記述される方法および微小流体装置においては、サンプルは個別に、または、グループとしてスクリーニングすることが可能である。グループスクリーニングは、有効サンプルに対するヒット率が、任意のグループにおいて大きな陽性結果を期待できないほど低いと予想される場合には、特に有用である。

高処理能力が重要な、一つの例示の領域はプロテオミクスである。細胞は、数千の蛋白質を様々の濃度で発現する。これらの蛋白の行動および相互作用は、二三を挙げれば、細胞タイプ、細胞サイクルの段階、および、細胞外事象に依存する。蛋白はまた、細胞機構によって化学的に修飾されるが、この修飾が、その蛋白の行動や、他の蛋白との相互作用をさらに分化させる。蛋白研究で重要な要素としては、濃度と翻訳後修飾が挙げられる。これらの要素に関する細胞集団間の相違は、抗体検出によって検出することが可能である。本発明の一つの実施態様では、抗体（すなわち、リガンド）であって、興味の特定の蛋白または抗原（すなわち、アンチリガンド）を認識する抗体を表面に固定化する。次に、細胞蛋白サンプルを、その抗原に高度の親和度をもって認識・結合する、その固定化された抗体の上に流す。抗体であって、その抗原を認識する第２抗体または検出抗体（すなわち、標識リガンド）を溶液に添加し、これもその選択された抗原に結合させる。このようにして、サンドイッチ定量であって、化学発光または蛍光検出体が、検出抗体を認識する定量を実施することが可能である。結合検出体は、洗浄によって未結合の検出体と分離される。検出体の濃度は結合抗原の濃度に比例する。

（Ｂ．高処理アッセイにおける微小流体装置の用法）
上述したように、微小流体装置の前記要素またはモジュールは、多数の形態に組み合わせることが可能であるし、また、多様な用途に利用することが可能である。ある種のアッセイを実行するのに有用な例示の設計がこのセクションでは記述される。しかしながら、本発明の微小流体装置は、この特定の形態に限定されるものではないことを理解しなければならない。

本発明の微小流体装置は、複数の第１フローチャンネルと複数の第２フローチャンネルを含む。各第１フローチャンネルは、各第２フローチャンネルと交差し、かつ、流動的に連通する。装置は、典型的には、各第１フローチャンネルに導入し、一方、第２フローチャンネルの流れを阻止しながら、リガンド（単数または複数）を固相基板表面に付着させるように使用される。別法として、リガンド（単数または複数）は、固相基板をエラストマー層に付着させる前に、あらかじめ固相基板に付着させることも可能である。

一旦リガンド（単・複）が固相基板に付着されたなら、第１フローチャンネルの流動を阻止する。次に、サンプル（単・複）を各第２フローチャンネルに導入する、典型的には、異なるサンプルが、異なる第２フローチャンネルに導入されるように導入する。状況に応じて随意に、ループ形成バルブが、第２フローチャンネルの各ペアがループ状フローチャンネルを形成するように活性化される。次にサンプル（単・複）を、再循環ポンプを用いて、各ループ状フローチャンネルを通じて循環させる。別法として、第１コントロールバルブと第２コントロールバルブを同時に活性化して、それぞれが一つの交差区域を包囲する、複数の保持空間を形成する。図６は、フローチャンネル（フローチャンネル交差区域は図示されていない）の一つに沿って形成される保持空間を示す。これら２種類の方法により、サンプル（単・複）と固相基板結合リガンドの間の長期の接触が可能となる。次に、この交差区域におけるサンプル（単・複）は、第１および第２フローチャンネルの交差区域における固相基板結合リガンドと反応させられる。

特定の設計の如何によらず、多数のサンプルを短期間に速やかにスクリーニングすることが可能である。これは、別々の反応が、各フローチャンネル交差区域において同時に実行可能だからである。

典型的には、ポンプがフローチャンネル内の流体の輸送に利用される。

（Ｃ．例示の装置）
高処理アッセイ用途に使用が可能な微小流体装置の、一つの特異的実例を第７Ａ図に示す。装置は複数の第１フローチャンネル７０４Ａ−Ｈ（黄色）と第２フローチャンネル７０８Ａ−Ｃ（ピンク）を含む。これらのフローチャンネルは互いに交差し、複数のチャンネル交差点７１２Ａ−ＢＤを作る。第２フローチャンネル７０８Ａ−Ｃは枝分かれして、出口付近で再び一緒になるので、一対の枝分かれチャンネル７０８Ａ_１−２、７０８Ｂ_１−２、および、７０８Ｃ_１−２を形成することに注意されたい。これらのペアの枝分かれチャンネルは、コントロールバルブ７２４Ａおよび７２４Ｂが閉鎖されるとループ状フローチャンネルを形成する。チャンネル交差点７１２Ａ−ＢＤは、要すれば随意に、ビア層を使用する場合に存在するチャンバ（貯留槽またはウェルとも呼ばれる）を含んでもよい。下記の実施例１を参照。本装置は複数の、第１コントロールバルブ７１６Ａ−Ｇ、および、複数の、第２コントロールバルブ７２０Ａ_１１−Ｇ_１９を含む。これらは、それぞれ、第１フローチャンネルおよび第２フローチャンネルの流れを制御するためのものである。このようにして、溶液の流れは、一方のフローチャンネルの溶液が、他方のフローチャンネルの溶液を汚染したり、それと混じったりすることのないように調節が可能である。さらに図示されるのは、ループ形成コントロールバルブ７２４Ａ−Ｂおよび再循環ポンプ７２８である。図７Ａにおいて、ループ形成コントロールバルブ７２４Ｂの内の一つはポンプ７３２としても働くが、これについては後述する。このループ形成コントロールバルブ７２４Ａと７２４Ｂは、再循環ポンプ７２８の活動により、ループ状フローチャンネルを通って溶液が循環するのを可能とする。装置はまた特注ポンプ７３２および７３６を含む。これらは、それぞれ、第２、および、第１フローチャンネルを通じて溶液を輸送するために使用される。図７Ｃに示されるのは、第２フローチャンネルに導入される溶液のために用意された特注の７４０Ａ−Ｄである。

再び図７Ａを参照すると、操作時に、リガンド（単・複）を導入するには、バルブ７１６Ａ−Ｇが開放され、かつ、バルブ７２０Ａ_１１−７２０Ｇ_１９が閉鎖され、さらに、適当な試薬溶液（単・複）が対応する流入口から第１フローチャンネル７０４Ａ−Ｈに導入される。これは、リガンド（単・複）を固相基板表面に付着させるためである。前述したように、別法として、リガンド（単・複）は、エラストマー層を固相基板に付着させる前に、固相基板に付着させてもよく、その場合は、サンプルが第１フローチャンネルに導入される。第１フローチャンネル７０４Ａ−Ｈを通る溶液の流速の調節にはポンプ７３６が使用される。リガンドを固相基板に付着させた後（または、リガンド／アンチリガンド複合体（単・複）を形成して後）、第１フローチャンネルを要すれば随意に洗浄して、未結合のリガンド（単・複）（または、未結合のサンプル）を除去する。

スクリーニングされるサンプル（単・複）（または標識リガンド（単・複））を、第１コントロールバルブ７１６Ａ−Ｇを閉鎖して、第１フローチャンネル７０４Ａ−Ｈの溶液流を制限し、一方、第２コントロールバルブ７２０Ａ_１１−Ｇ_１９を開放することによって導入する。サンプル（単・複）（または、標識リガンド（単・複））は、第２フローチャンネル７０８Ａ−Ｃに導入される。サンプル（単・複）（または、標識リガンド（単・複））は、第２フローチャンネルを通じて連続的に流してもよいし、あるいは、ループ形成コントロールチャンネル７２４Ａおよび７２４Ｂを閉鎖して、第２フローチャンネル７０８の各ペアについて複数のループ状フローチャンネルを形成するようにしてもよい。次に、サンプルは、再循環ポンプ７２８を用いてこのループ状フローチャンネルを通じて循環させることが可能である。

別法として、第１コントロールバルブ７１６Ａ−Ｇも閉鎖して、複数のチャンネル交差点７１２Ａ−ＢＤを形成してもよい。このようにすれば、サンプル（または、標識リガンド（単・複））は、チャンネル交差点７１２Ａ−ＢＤ内に保持され、固相基板結合リガンド（またはリガンド／アンチリガンド複合体）との長期の接触が実現される。図７Ｂは、フローチャンネルの交差区域に対する第１および第２コントロールバルブの相対的位置を示す。第１および第２コントロールバルブの両方を活性化することによって、各フローチャンネル交差区域内に保持空間が形成される。

その後、第２フローチャンネル７０８Ａ−Ｃは要すれば随意に濯がれ、未結合のサンプル（単・複）（または標識リガンド（単・複））を除去する。リガンド（単・複）を固相基板表面に付着させるのに第１フローチャンネルを使用した場合、要すれば随意に標識リガンドを第１と第２フローチャンネルのいずれかに導入して、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡ等のサンドイッチアッセイを実行することが可能である。

アッセイ終了後、エラストマー層を固相基板から外す。次に、この固相基板を適当な分析器で分析し、結果を定量する。

（Ｄ．サンプル（すなわち、試験化合物））
本明細書に記述されるアッセイおよびスクリーニング法は、事実上、全ての化合物について実行が可能である。一般的に、試験薬剤または試験化合物は、定量される成分（例えば、細胞、酵素、受容体、抗体、細胞小器官）と相互作用を持つ可能性を潜在的に持つ。例えば、細胞アッセイでは、試験化合物が潜在的に相互作用を持つ細胞成分は、細胞表面に局在する、または、細胞内に局在する全ての分子、巨大分子、小器官、または、前記の組み合わせであり得る。例えば、ある細胞受容体と相互作用を持つことができる化合物をスクリーニングするのであれば、試験薬剤は、興味の受容体と相互作用を持つことが潜在的に可能であるものとして（例えば、受容体の結合部位に結合するものとして、または、例えば、作用剤または拮抗剤のように、受容体の結合部位に対する結合に影響を与えるものとして）選択される。いくつかの２種ハイブリッドアッセイでは（下記参照）、試験薬剤は、２種の融合における結合蛋白間の結合作用に影響を及ぼす可能性のあるものである（下記参照）。

従って、試験薬剤は、様々の一般的タイプ、例えば−ただし、これらに限定されない−ポリペプチド、オリゴ糖および多糖のような炭水化物、脂質またはリン脂質、脂肪酸、ステロイド、または、アミノ酸類縁体を含む種々のタイプであってよい。さらに、化合物は、例えば、成長因子、ホルモン、神経伝達物質、および、血管拡張因子であってもよい。同様に、化合物は、様々の化学的タイプ、例えば−ただし、これらに限定されない−複素環化合物、炭素環化合物、β−ラクタム類、ポリカーバメート、オリゴマー状Ｎ置換グリシン、ベンゾジアゼピン、チアゾリジノン、および、イミジゾリジノンを含む化学的タイプであってもよい。試験薬剤のあるものは、合成有機化合物を含む低分子である。

試験薬剤は、例えば、天然産物ライブラリーまたは併合ライブラリーのようなライブラリーから入手が可能である。いくつかの異なるタイプのライブラリー、および、このようなライブラリーを調製するための方法が、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／０６１２１、ＷＯ９５／１２６０８、ＷＯ９５／３５５０３、ＷＯ９４／０８０５１、および、ＷＯ９５／３０６４２に記述されている。それぞれを引用することにより本明細書に含める。

（Ｖ．組み合わせ合成）
（Ａ．方法）
高処理アッセイ用として説明した、特に、図６Ａおよび６Ｂで図示した通りの成分の全体配置を有する微小流体装置はまた、組み合わせ化学分析を実行するのに利用することも可能である。この方法は、全体として、上に高処理スクリーニングに関して述べたものとほぼ一致するが、ただし、フローチャンネルに導入されるのはリガンドおよびサンプルではなく、別々の反応剤が導入されるところが異なる。

従って、リガンド（単・複）を付着させる代わりに、モノマー（単・複）または適当なリンカー（単・複）が固相基板に付着され、かつ、適当に保護されたモノマー（単・複）が導入される。脱保護、カップリング反応を順次選択的に実行することによって、広範な組み合わせ化学合成を実現することが可能である。

組み合わせ法に関するさらに詳細な案内が、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／０６１２１、ＷＯ９５／１２６０８、ＷＯ９５／３５５０３、ＷＯ９４／０８０５１およびＷＯ９５／３０６４２に提供されている。これらの出願は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。

（Ｂ．化合物）
この方法によって生成される化合物は、一連の工程における結合を通じて互いに接合する成分同士であればどの成分から構成されてもよい。従って、この成分は、組み合わせ合成において有用なものであれば、どのクラスのモノマーであってもよい。従って、成分、モノマー、または、構成単位（前記用語は本明細書では相互交換的に使用される）としては、酵素または酵素モジュール、アミノ酸、炭水化物、脂質、リン脂質、カーバメート、スルフォン、スルフォキシド、エステル、ヌクレオシド、複素環分子、アミン、カルボン酸、アルデヒド、ケトン、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロゲン化アルキル、フェノール分子、ボロン酸、スズ酸塩、アルキルまたはアリルリチウム分子、グリニャール試薬、アルケン、アルキン、ジエンおよびウレア誘導体が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。各種工程で添加される成分のタイプは、各工程で同じである必要はない。ただし、ある場合では、成分のタイプは、２回以上の工程で同じである。例えば、合成は、各サイクルで異なるアミノ酸の添加を含んでもよいし、一方、他の反応では、１サイクルにおいてのみアミノ酸の添加を含み、その他のサイクルでは別のタイプの成分（例えば、アルデヒドまたはイソシヤネート）の添加を含んでもよい。

本発明の方法において利用可能な成分は多様であるので、形成可能な化合物も同様に多様である。多数サイクルで形成され、最終化合物または産物が、前成分から後成分へというやり方で形成される化合物であれば、事実上どのタイプの分子でも本発明の方法によって合成が可能である。合成が可能な化合物の例としては、ポリペプチド、ポリケチド、オリゴ糖、ポリヌクレオチド、リン脂質、脂質、ベンゾジアゼピン、チアゾリジノン、および、イミジゾリジノンが挙げられる。前述したように、最終化合物は、直鎖状、分枝鎖状、環状であっても、あるいは、他の立体配座を取ってもよい。化合物は、生物活性、または、非生物活性を持つ可能性のあるものとして設計されてもよい。

（ＶＩ．変種）
（Ａ．チャンネルコーティング）
ある方法では、アッセイのある局面を強化するために、フローチャンネルが各種薬剤によってコートされる、または、処理される。例えば、フローチャンネルの形成される材料の性質に応じて、フローチャンネルを、アッセイの成分（例えば、細胞、蛋白、ペプチド、基質、低分子）が、導入されるフローチャンネルの壁へ、あるいは、ウェルの側壁へ付着する場合、その付着から保護する、または、その付着を防止する薬剤でフローチャンネルをコートすることは有用である可能性がある。これらのコートの一つの機能は、導入されたサンプルの生物学的完全性の確保を助けることである。もう一つの機能は、細胞の反応や機能に好ましくないやり方で影響を及ぼす可能性のある、細胞とチャンネル壁の間の物理的相互作用を防止することである。適当なコート剤の例としては、ＴＥＦＬＯＮ、パリレン、アクリルアミド、ポリエチレングリコール、シラン、および、その他の、自己集合性単一層を形成する薬剤が挙げられる。

同様に、チャンネルは、実施すべき特定の用途に合致するフローチャンネルを調製しようという意図に合わせて、分離・仕分け機能のような、その他の目的を実現するよう各種薬剤によって修飾することが可能である。もっと具体的に言うと、フローチャンネルのバルクの基質（すなわち、フローチャンネルを構築する際に利用される特定のエラストマーの選択）、表面化学（すなわち、エラストマー内部に形成される微小チャンネルの性質の修飾）、および、エラストマー表面領域の特定修飾（例えば、蛋白、ペプチド、核酸（またはその類縁体）、脂質、炭水化物の共有的および／または非共有的付着）を適当に選択することによって、ある任意の用途、または、それらの用途の組み合わせに対して、装置を「同調させる」ことがより容易になる。エラストマー表面を修飾する方法としては、（１）エラストマー熟成時における官能基との共重合体形成（バルク修飾の一例）、（２）酸素プラズマ処理、（３）プラズマ処理表面に対する、エラストマー表面において自己集合性単一層を形成する、シラン化試薬（例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、ジメチルクロロシラン、または、ヘキサメチルジシラザン）による修飾（個々のフローチャンネルを処理するのに使用が可能）、（４）光化学的架橋剤を用いて、エラストマー表面に反応基のパターンを形成する（例えば、アリルアジド誘導体またはキノン系誘導体）、（５）吸着によるエラストマー表面の受動的修飾が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。

吸着によって、一次吸着に優る性質を示す、二次または三次の修飾層の形成が可能となる。特異的例としては、抗原に対して抗体を用いることによって、フローチャンネル壁に対し一次コートを形成することが可能である。次に抗原を、この結合された抗体に結合させた場合、特異的に結合された抗原から成る二次層を形成することが可能となる。このように結合された抗原は、受動的に吸着された一次層の場合よりも、さらに好適なやり方でフローチャンネルの内部に対して「提示」が可能である。蛋白、核酸、脂質、または、炭水化物、あるいは、それらの組み合わせから成る複数の層を形成するためのスキームは、熟練した実際家にとっては明白であろう。

チャンネルはまた、例えば、細胞によって生産される、または、酵素アッセイ時に生産される産物のような、アッセイ成分および／または反応産物に対して特異的に結合する物質でコートすることも可能である。このようなコートの一つの例は、チャンネルが金属、または、金属誘導体物質によってコートされる場合である。金属キレートタグを担う反応産物は、この金属コート壁または材料に結合させられる。もちろん、金属キレート剤と金属に代わる置換物として、その他の多様な結合ペアも同様に利用が可能である。このような金属誘導体物質を利用するアッセイは、下記の酵素アッセイのセクションにさらに詳細に論じられる（米国特許第６，１４６，８４２号も参照）。

（Ｂ．チャンネルの磁気物質によるドーピング）
フローチャンネルのエラストマー壁には、要すれば随意に、磁気物質を、または、あらかじめ形成されたマグネット、または、電磁石を、微小流体装置の中に埋め込むことによってドープ（微小注入）することが可能である。埋め込みが可能な磁気物質の例としては、鉄および、永久磁石となり得る物質のような磁気分極の可能な物質が挙げられる。フローチャンネルにこのような物質を含めると、磁気に基づく分離を実行することが可能になる。場合によっては、回転する外部磁石を、混合を促進するのに使用することが可能である。

（Ｃ．電極）
フローチャンネルはまた、薬剤・溶液輸送に対してさらに制御を加えるために、要すれば随意に電極を含んでもよい。電極を装置に組み込むことによって、電気泳動的分離または電気浸透的流動を、ポンプ駆動輸送と統合させることが可能となる。適当な電極は、フローチャンネルの表面上に金属（例えば金）の薄層をスパッタリングすることによって形成することが可能である。他の金属沈着法、例えば、化学的エピタキシ、蒸着、メッキ、および、無電気メッキのような方法も、必要な導電材料を形成するのに利用が可能である。金属層の、エラストマー表面に対する物理的移送も、例えば、金属を、接着性の悪い、平坦な基板の上に蒸着し、次に、そのエラストマーを金属の上に載せ、基板から金属を剥がすことによって実行が可能である。導電性電極はまた、カーボンブラック（例えば、Ｃａｂｏｔ Ｖｕｌｃａｎ ＸＣ７２Ｒ）をエラストマー表面に、例えば、乾燥粉末を撫で付けることによって、または、エラストマーを、エラストマーを膨潤させる溶媒（例えば、ＰＤＭＳの場合には塩素化溶媒）に溶解させたカーボンブラックの懸濁液に暴露することによって調製が可能である。

（ＶＩＩ．例示の用途）
本明細書に開示される微小流体装置は、多様なアッセイを実行するのに利用が可能である。アッセイの成分のどれかが微小流体装置のサイズに合わないというものでない限り、事実上全ての生物学的アッセイまたはライブラリースクリーニングが、本明細書に記述される微小流体装置によって実行が可能である。例えば、本発明の微小流体装置は、プロテオミクスにおいてある特定の蛋白の存在を特定するために、または、何かの組の「薬剤候補」標的（すなわち、小分子による修飾によって、細胞標的に対して所望の表現型変化をもたらすことが可能な標的）の活性に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングするために使用が可能である。可能な薬剤候補標的としては、Ｇ−蛋白結合受容体（ＧＰＣＲ）、サイトカインおよびサイトカイン受容体、核内受容体（リガンド依存性転写因子）、シグナル伝達過程（例えば、受容体−リガンド相互作用、カルシウム移動、キナーゼおよびフォスファターゼ、第２メッセンジャー、および、転写因子）、プロテアーゼ、イオンチャンネル、および、細胞毒性の決定因子（例えば、アポトーシス促進・アポトーシス阻害過程および細胞死）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。これらの標的は、様々のタイプのアッセイ、例えば、蛍光検出技術、例えば、蛍光強度定量、蛍光分極、蛍光共鳴エネルギー転移、時間分解技術、および、蛍光相関分光光度計測法を含むアッセイによって対処することが可能である。

下記は、本明細書に提供される微小流体装置によって実行が可能な、例示のアッセイの、網羅的ではないリスト含むものであるが、これは、討究が可能な標的の性質、および、利用が可能な検出スキームのタイプを例示するものである。

（Ａ．結合アッセイ）
（１．概観）
本明細書に開示される微小流体装置を利用して、多種多様のアッセイを実行することが可能である。事実上全てのリガンドおよびアンチリガンド間の相互作用の検出が可能である。討究が可能なリガンド／アンチリガンド相互作用の例としては、酵素／リガンド相互作用（例えば、基質、補助因子、抑制因子）、受容体／リガンド、抗原／抗体、蛋白／蛋白（ホモフィリック／ヘテロフィリック相互作用）、蛋白／核酸、ＤＮＡ／ＤＮＡ、および、ＤＮＡ／ＲＮＡが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。従って、このアッセイは、例えば、興味の受容体に対する作用剤および拮抗剤を特定する、受容体に結合して細胞内シグナルカスケードを起動するリガンドを特定する、および、相補的核酸同士を特定するために使用することが可能である。アッセイは、従来技術に通常の技能を持つ当業者によく知られるように、リガンドとアンチリガンド候補を互いに接触させる、直接結合形式で実行してもよいし、または、競合的結合形式で実行してもよい。

微小流体装置は、典型的には、複数の分析を同時に実行可能とするよう、また、多数のアッセイを短時間で実行可能とするよう、複数のフローチャンネルと交差区域を含む。活性を持つリガンドまたはアンチリガンドは、識別可能な標識に基づいて特定が可能である。例えば、アッセイは、物理的、化学的、視覚的、放射性、またはその他の手段によって識別可能な標識を用いて実行が可能である。さらに具体的に言うと、複数の標識は、例えば、異なる組成、サイズ、色、形、磁気的性質、化学的性質、電子的性質、蛍光発射に基づいて互いに識別することが可能である。異なる蛍光発射に基づいて識別が可能な標識の具体的例としては、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）およびＱｕａｎｔｕｍドット（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ社）がある。選別および／または定量は、標識のサイズ、発生信号（例えば、蛍光）の波長および／または量に基づく。

結合アッセイは、一般に、リガンドを含む溶液を、アンチリガンドを含む溶液に接触させ、これらの溶液を、結合パートナー同士が複合体を形成するのに十分な期間、接触状態を維持するようにさせることを含む。リガンドおよび／またはアンチリガンドは通常標識される。別法として、かつ、ある好ましい実施態様では、標識リガンドが導入されてリガンド／アンチリガンド／標識リガンド複合体を形成するサンドウィッチアッセイが選ばれる。多様な標識の内のどれでも前述したように利用が可能である。リガンドおよびアンチリガンドは、典型的には、フローチャンネルの交差区域の中で接触させられる。リガンドおよびアンチリガンドを含む溶液同士を、それらの溶液をループ状フローチャンネルの中を循環させることによって、または、前述した保持空間内に溶液を保持することによってインキュベートすることが可能である。複合体は、典型的には、溶液を除去し、エラストマー層を固相基板から剥がし、その固相基板の交差区域を適当な検出器によって分析することによって検出される。別法として、複合体は、エラストマー層を固相基板と接触させたままで、固相基板の交差区域を適当な検出器で分析することによって検出することが可能である。利用される検出器のタイプおよび検出方法は、リガンドまたはアンチリガンドを標識するのに使用される標識のタイプに依存する。

（２．例示の結合アッセイ法）
本発明の結合アッセイは、典型的には、複合体が未反応の薬剤から分離され、そのために、標識複合体が、複合体を形成しない標識反応物質と区別されるようになる工程を含む。多くの場合、このことは、リガンドかアンチリガンドのどちらかを支持体に付着させることによって実現される。リガンドとアンチリガンドが接触させられた後、複合体を形成しない反応物質は洗い流され、その後残った複合体が検出される。

本明細書に開示される微小流体装置によって実施されるアッセイは、一般に、固相基板結合リガンドを、アンチリガンドを含む溶液に、リガンド／アンチリガンド複合体の、形成を可能とする条件下で、かつ、形成を可能とする十分な期間において接触させることを含む。前述したように、リガンドもアンチリガンドも標識されていない場合には、標識リガンドを、サンドイッチ複合体（すなわち、リガンド／アンチリガンド／標識リガンド複合体）の、形成を可能とする条件下で、かつ、形成を可能とする十分な期間導入してもよい。リガンドまたはアンチリガンドが標識されているので、形成された複合体はどのようなものでも、その複合体の中の標識に基づいて検出が可能である。

アッセイは様々なやり方で実行が可能である。一つの方法は、興味のリガンドを固相基板表面に付着させ、この固相基板結合リガンドを、アンチリガンドを含む溶液に接触させることを含む。複合体を形成しないアンチリガンドは、形成された複合体だけが固相基板に固定化し続けるような条件下で洗い流される。固相基板に固定化された複合体の検出は、いくつかのやり方で実現が可能である。例え固定化されていないアンチリガンドが標識されていても、固相基板の上に固定化された標識リガンドが検出されたならば、それは、リガンド／アンチリガンド複合体が形成されたことを示す。一方、固定化されていないアンチリガンドが標識されていないとしても、複合体は間接手段によって検出が可能である。例えば、アンチリガンドに特異的に結合する標識リガンドを利用して、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡ等のように固相基板に根付いた複合体を検出することは可能である。

別法として、リガンドとアンチリガンドは溶液中で接触させることも可能である。次に、複合体を、複合体未形成のリガンドおよびアンチリガンドから分離し、複合体を検出する。このようなアッセイを実行するための一つの方法は、興味のアンチリガンドを、そのアンチリガンドに結合するリガンドを含む可能性のある試験液に接触させることである。次に、得られた混合液を、このアンチリガンドに特異的に結合する、固相基板結合抗体に接触させ、もしも形成される複合体があれば、それを固定化してしまう。次に、このアンチリガンドに対して特異的な標識抗体を、固定化複合抗体に−もしもそのような複合抗体があるのなら−接触させて、そのような複合体の存在を検出する。

フローチャンネルに付着されるリガンド（アンチリガンド）は、固相基板表面に直接付着されてもよいし、リンカーを介して接着されてもよい。一般に、固相基板表面、および、その表面に付着されるリガンド（アンチリガンド）は、適当な化学的官能性、これら二つの実体によって担持される官能基同士が互いに反応して、付着されるようになるような官能性を必要とする。多くの場合、付着は、結合ペア物質と表面の間に共有結合を形成することによって実現される。ただし、静電的相互作用、水素結合相互作用、および、疎水性相互作用も、結合ペア物質を表面に付着させるように作用することが可能である。

リガンド（アンチリガンド）を固相基板表面に付着させるには、各種リンカーの利用が可能である。固相基板に付着されるためには、リンカーは、典型的には、多官能性、好ましくは２官能性であって、一端に固相基板表面の官能基と反応することが可能な一つの官能基を、他端にはリガンド（アンチリガンド）によって担持される官能基と反応することが可能なもう一つの官能基を有している。このリンカーの各端の官能基は同じであっても、違っていてもよい。適当なリンカーの例としては、直鎖または分枝鎖炭素リンカー、複素環リンカー、および、ペプチドリンカーが挙げられる。使用が可能な例示のリンカーは、ロックフォード、イリノイ州のＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から入手が可能であり、また、欧州特許出願第１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８、４，６５９，８３９、４，４１４，１４８、４，６６９，７８４、４，６８０，３３８、４，５６９，７８９および４，５８９，０７１号、Ｅｇｇｅｎｗｅｉｌｅｒ，Ｈ．Ｍ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ１９９８，３，５５２に記述されている。これらの文献は全て、その全体が、本明細書中に参考として援用される。

その他のリンカーとしては、結合ペアのメンバーが挙げられる。この配置では、結合ペアの一方が固相基板表面に付着される。結合ペアの他のメンバーは、固相基板表面に付着させたいとするリガンド（アンチリガンド）に付着される。例示の結合ペアのメンバーとしては、ビオチン／アビジン（またはストレプトアビジン）および抗原／抗体が挙げられる。

固相基板の組成によっては、場合によって、結合ペアメンバーが付着可能となるように、固相基板表面において誘導体化することが必要となることがある。前述したように、固相基板表面において誘導体化するには各種薬剤の使用が可能である。その例としては、シラン化試薬（例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、ジメチルクロロシラン、または、ヘキサメチルジシラザン）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。

（３．結合相互作用を阻害する化合物のアッセイ）
この微小流体装置はまた、既知の結合パートナー間の相互作用を抑制する薬剤を特定するための競合形式においても使用が可能である。この方法は、一般的に、結合パートナー同士を含む反応混合物を、それら結合パートナー同士が相互作用して、複合体を形成するのに十分な条件下で、また、複合体を形成するのに十分な時間調製することを含む。ある化合物について抑制作用の有無を調べるには、この反応混合物を、その試験化合物の存在下に（試験反応混合物）、および、試験化合物の不在下に（コントロール反応混合物）に調製する。次に、結合パートナー同士による複合体形成を、典型的には、その結合パートナーの片方または両方によって担持される標識によって検出する。試験反応混合物におけるよりも、コントロール反応の方により多くの複合体が形成され、その差が統計的有意差を定めるレベルにある場合、それは、試験化合物はこの結合パートナー同士の相互作用を妨げることを示す。

試験される化合物に関して様々の結合情報を得るために、反応物質の添加の順序は変動させてもよい。例えば、結合ペアメンバー同士の相互作用に干渉する試験化合物は、その反応を試験化合物の存在下に実行することによって、すなわち、試験化合物を、結合ペアメンバーの前に、または、それらと同時に反応混合物に導入することによって、特定することが可能である。別に、完成した複合体を破壊することが可能な試験化合物は、複合体が形成された後の反応混合物にその試験化合物を添加することによって特定することが可能である。この後者のタイプの分析により、結合ペアメンバーの一方よりも高い結合定数を持つ化合物を特定することが可能となり、従ってまた、複合体から、その結合ペアメンバーを押し除けることが可能となる。

（４．免疫学的アッセイ）
免疫学的アッセイとは、本明細書に提供される微小流体装置によって実行が可能なアッセイの、一つの一般的カテゴリーである。あるアッセイは、ある特定の興味の抗原に特異的に結合することのできる抗体を求めて、一集団の抗体をスクリーニングするために実行される。このようなアッセイでは、１種の試験抗体、または、１集団の試験抗体が、固相基板表面に付着する抗原と接触させられる。また別のアッセイでは、サンプルを調べて、興味の分析対象について、その分析対象を特異的に認識する抗体と分析対象との結合を検出することによって、その有無を確定する。このようなアッセイでは、多くの場合、固相基板表面に付着されるのは抗体であって、抗原候補を含む溶液の方がその固定化抗体に接触させられる。しかしながら、いずれのタイプのアッセイでも、抗原と抗体のどちらかが固定化される可能性がある。

（サンドイッチアッセイ）
免疫学的アッセイは様々の方式で実行が可能である。例えば、そのアッセイは、抗原と抗体との直接結合、いわゆるサンドイッチアッセイ、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光標識免疫測定法（ＦＬＩＳＡ）、および、競合アッセイを含むことが可能である。ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡアッセイでは、例えば、興味の分析対象に特異的に結合する捕捉抗体が、固相基板に付着される。次に、興味の分析対象を含む可能性のある溶液が、第１または第２フローチャンネルに導入され、固定化捕捉抗体に接触させられて、２体複合体を形成する。分析対象において、捕捉抗体とは別部分を認識する第２抗体（検出抗体）を、他方のフローチャンネルを通じてこの２体複合体に接触させて、チャンネル交差区域において３体複合体を形成する。この検出抗体は、定量可能な酵素または蛍光標識を含む。

ＥＬＩＳＡでは、３体複合体の形成は、フローチャンネルに適当な酵素基質を導入し、３体複合体に接触させることによって検出が可能である。酵素触媒による産物形成に伴って生成されるシグナルが、検出器によって検出される。

ＦＬＩＳＡでは、３体複合体の形成は、チャンネル交差区域における蛍光を観察することによって検出が可能である。蛍光標識は、リガンドの内の一方に共有的に結合し、リガンドの標識機能基を形成することが可能である。あるいは、蛍光タグを３体複合体に付加し、タグ付き複合体を形成することが可能である。蛍光は、固相基板からエラストマー層を外してから、または、エラストマー層をそのままにした状態で検出することが可能である。

上述したように、捕捉抗体は、抗体によって担持される官能基（例えば、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシル）を介して、また、固相基板上の、または、誘導体化によって導入された相補基を介して、固相基板表面に付着させることが可能である。

（Ｂ．抗菌アッセイ）
各種微生物細胞を様々の試験化合物に接触させることによって抗菌アッセイを実行し、抗菌化合物候補を特定するのに、本明細書に提供される装置を使用することが可能である。本明細書で使用する場合「微生物」という用語は、全ての、顕微鏡的および／または単細胞の、真菌、細菌または原虫を指す。ある抗菌アッセイは、細胞を、固相基板表面に固定化して、それを、少なくとも１種の抗菌化合物候補に接触させることを含む。この化合物の作用は、その細胞の健康および／または代謝に現れた検出可能な変化として検出が可能である。このような変化の例としては、成長変化、細胞増殖、細胞分化、遺伝子発現、細胞分裂等が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。

下記の実施例は、本発明のいくつかの局面をさらに具体的に示すために与えられるものであって、本発明の範囲を限定するものと考えてはならない。

（実施例１）
本実施例は、プロテインＡ（黄色ブドー球菌のＦｃ結合蛋白）をその表面に有する４層微小流体装置の生産法を示す。この４層装置によって、任意の固相基板の厳密な位置においてアッセイの実行が可能になる。

流体フローチャンネル成形体を、Ｓｈｉｐｌｅｙ５７４０を３６００ｒｐｍで３０秒回転させ、１０５℃で６０秒軟焼成し（厚さ測定値＝７．８μｍ）、１４０℃で１５０秒硬焼成して調製した（成形体の最終厚さ＝１０μｍ）。コントロールチャンネル成形体を、Ｓｈｉｐｌｅｙ５７４０を８５０ｒｐｍで３０秒回転させ、次いで５分間安静期間の後、１０５℃で１８０秒軟焼成して調製した（成形体の最終厚さ＝２０μｍ）。ビア成形体を、ＡＺ ＰＬＰ １００−ＸＴを１２４０ｒｐｍで３０秒回転させ、次いで９５℃で８分軟焼成して調製した（成形体の最終厚さ＝３５μｍ）。

対応するコントロール層（８０８）、流体（すなわち、フローチャンネル）層（８０４）、および、ビア層（８１２）それぞれの、例示の成形体設計を、図８Ａ−Ｅに示す。図８Ｂ−Ｄには、軸揃えマスク８１６も示されている。軸揃えマスク８１６と各層はまた、軸揃えガイド８２０ａ−ｅも含む。これらは、各層を適切に軸揃えするのを補佐する。

（ＰＤＭＳ工程）
エラストマー層は下記のように調製した。

１）３０：１ＰＤＭＳ ＧＥ ６１５混合、Ａ部分３０ｇ、Ｂ部分１ｇ
−成分を真空下に１０００ｒｐｍで混合
２）三つの成形体全てをＴＭＣＳ（トリメチルクロロシラン）で３分処理
３）３０：１ＰＤＭＳを、流体チャンネル上で１０９０ｒｐｍで２００秒回転
−ＰＤＭＳ厚は３５μｍ
−ウェファーを８０℃で３０分オーブン焼成
４）４：１ＰＤＭＳ ＧＥ ６１５混合、Ａ部分８０ｇ、Ｂ部分２０ｇ
−成分を真空下に１０００ｒｐｍで混合
５）４：１ＰＤＭＳをコントロールチャンネル成形体の上に注ぐ
−ウェファーを８０℃で３０分オーブン焼成
６）３０：１ＰＤＭＳ ＧＥ ６１５混合、Ａ部分３０ｇ、Ｂ部分１ｇ
−成分を真空下に１０００ｒｐｍで混合
７）３０：１ＰＤＭＳを、ビア形成体上で１２６０ｒｐｍで２００秒回転
−ＰＤＭＳ厚は３０μｍ（形成体よりも５μｍ薄い）
−ウェファーを８０℃で１．５時間オーブン焼成
８）ＰＤＭＳをコントロールチャンネル形成体から剥がす
−チップ辺縁にそってＰＤＭＳスラブに角型マーク
−チップの加圧マークの所でＰＤＭＳチップを打ち抜く
９）角型ＰＤＭＳチップを、流体コントロール形成体に対して軸合わせする。

−８０℃で１時間オーブン焼成
１０）ＰＤＭＳをコントロールチャンネル形成体に対しチップ辺縁を揃える
１１）コントロールチャンネル形成体から２層チップを剥がす
１２）２層チップをビア形成体に対して軸合わせする。

−８０℃で３時間オーブン焼成
１３）ＰＤＭＳをビア形成体に対しチップ辺縁を揃える
１４）ビア形成体から３層チップを剥がす
（基板接着）
固相基板は下記のように調製した。

１）プロテインＡスライドを調製する
−４℃冷蔵庫から取り出して窒素乾燥させたプロテインＡスライド
２）ＰＤＭＳをプロテインＡスライドの中央位置に置く
３）８０℃で３０−４５分オーブン焼成
４）ＰＢＳＴ添加前に、チップを室温に冷却させる
５）全てのウェルに０．５％ＰＢＳＴ溶液をピペットで注入
本装置では、基板の上で化学反応を実行する場合を除いては、サンプルと試薬は基板から遮蔽される。この遮蔽は、固定化物質が所期のアッセイ部位から上流に移動するのを防止することによって、サンプル／試薬濃度を維持するのを助ける。さらに、本装置では、装置の取り付けを容易にし、装置と基板の間の接着面積を増している。この３番目の（すなわち、ビア）層は効果的にチップを封印し、かつ、基板接着を、装置の特質である流体ネットワーク密度と無関係にする。形成体は、装置の三層それぞれについて製造される。最初の、２個の形成体は、コントロール層と流体層のものであって、標準的な２層流体装置を含む。それに加わる第３の形成体は、様々な形の支柱がパタニングされるビア層のものである。この形成体の高さは、形成体の上で回転させるＰＤＭＳよりも約５μｍ高い。２層チップを組み合わせて、第３層に軸合わせする。一旦３層が固定化されたならば、チップを、残余のＰＤＭＳが回転工程時に形成体の上に存在する時点で、ビア層側からドライエッチングしてビアを開ける。図９を参照。ＰＤＭＳのエッチングは、Ｃ_２Ｆ_６およびＯ_２の２：１混合物を４００ワットで１０−２０分印加して行った。上記実施例は、ビア層を含む３層エラストマー材料を製造する場合を具体的に述べたものであるが、ビア層を除くことによって、前述の工程を用いて２層エラストマー材料を製造することも可能である。従って、流体層形成体８０４およびコントロール層形成体８０８のみを用いることによって、２層エラストマー材料（固化されると一体化構造を形成する）を持つ微小流体装置を調製することが可能である。次に、アッセイのために、この一体化されたエラストマー層を直接固相基板に付着させる。さらに別の、２層の、一体的エラストマー層設計、および、製造された、対応する微小流体装置が図１０Ａおよび１０Ｂに示される。

ビア層は必要とされないものの、これは、固相基板表面において、アッセイ条件に暴露される一つの明確な領域を与えていることに注意すべきである。これは、利用されるサンプル量が極端に僅少な場合特に有用である。

（実施例２）
この実施例は、本発明の微小流体装置をＦＬＩＳＡアッセイ実行のために使用する方法を具体的に示す。

図１１に示す形態の微小流体装置を用いて、各種アッセイが下記のように実行された。

（流体インプット）
流体インプットＡ，Ｂ、ＣおよびＤは、試薬流入口である。これら流入口を通じて、試薬の溶液、例えば、抗体を添加することが可能である。適切なバルブが活性化されると、これらのインプットからの流動は、チップの点状区域へ向けられる。流体インプットＥ，Ｆ、ＧおよびＨは、サンプル流入口である。これら流入口を通じて、試薬の溶液、例えば、分析対象または抗原を添加することが可能である。適切なバルブが活性化されると、これらのインプットからの流動は、チップの点状区域へ向けられる。流体インプットＩは共通の洗液流入口である。このインプットは、流体インプットＥ−Ｈに隣接する流体ラインに接続する。流体インプットＩは、全てのサンプルに共通のバッファーまたは溶液を含んでもよい。同インプットはまた、チャンネル壁または基板表面を阻止するためのバッファーまたは溶液を含んでいてもよい。流体インプットＪは共通の洗液流入口である。このインプットは、流体インプットＡ−Ｄに隣接する流体ラインに接続する。流体インプットＪは、全てのサンプルに共通のバッファーまたは溶液を含んでもよい。同インプットはまた、チャンネル壁または基板表面を阻止するためのバッファーまたは溶液を含んでいてもよい。流体インプットＫは共通の洗液流入口である。このインプットは、流体インプットＡ−Ｄに隣接する流体ラインに接続する。流体インプットＫは、全てのサンプルに共通のバッファーまたは溶液を含んでもよい。同インプットはまた、チャンネル壁または基板表面を阻止するためのバッファーまたは溶液を含んでいてもよい。流体インプットＬは共通の洗液流入口である。このインプットは、流動が方向付けられる共通ラインに接続する。

流入口はどれも全て、チャンネルおよび基板を潤すことによってチップの下準備を整えるのに使用が可能である。

（コントロールバルブ）
コントロールバルブは１２−１６ｐｓｉで活性化される。陽性変位流体ポンプは６０Ｈｚで活性化される（サイクルのステップ当たり１０Ｈｚ）。バルブ１，２および３は、再循環ポンプを調節する。活性化されると、これらのバルブは、反応区域の周囲を時計回りに流体をポンプ駆動する。バルブ４，５および６は、サンプル流通ポンプを調節する。活性化されると、これらのバルブは、流体インプットＥ，Ｆ，ＧおよびＨからの流体を、または、流体インプットＩからの流体を、反応区域へポンプ駆動する。バルブ７は、流体インプットＩの隔離を調節する。このバルブを活性化すると、流体インプットＩからの溶液は反応区域に入るのを阻止される。このバルブを開放すると、流体インプットＩからの溶液は反応区域に入ることが可能になる。バルブ８は、流体インプットＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ、Ｅ，Ｆ，ＧおよびＨにおける溶液の隔離を調節する。このバルブを活性化すると、サンプルおよび試薬は、流体インプットＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ、Ｅ，Ｆ，ＧおよびＨから反応区域に入るのを阻止される。このバルブを開放すると、サンプルおよび試薬は、流体インプットＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，ＧおよびＨから反応区域に入ることが可能になる。バルブ９は、反応区域におけるサンプルの隔離を調節する。このバルブを活性化すると、垂直方向の反応区域の流動が阻止される。再循環ポンプ（バルブ１，２および３）またはサンプル流通ポンプ（バルブ４，５および６）と組み合わせて用いると、反応区域の流れは水平にのみ起こる。バルブ１０は、サンプル区域における試薬の隔離を調節する。このバルブを活性すると、水平方向の反応区域の流動が阻止される。試薬流通ポンプ（バルブ１２、１３および１４）と組み合わせて用いると、反応区域の流れは垂直にのみ起こる。バルブ１１は、反応区域全体の隔離を調節する。このバルブを活性化すると、反応区域からの流出が阻止される。このバルブを活性化することはまた、流体インプットＬから反応区域への流入を阻止する。バルブ１２、１３および１４は、試薬流通ポンプを調節する。活性化されると、これらのバルブは、流体インプットＡ，Ｂ，ＣおよびＤ、または、流体インプットＪ、または、流体インプットＫからの流体を反応区域へポンプ駆動する。バルブ１５は、流体インプットＪの隔離を調節する。このバルブを活性化すると、流体インプットＪからの溶液は反応区域に入るのを阻止される。バルブ１６は流体インプットＫの隔離を調節する。このバルブを活性化すると、流体インプットＫからの溶液は反応区域に入るのを阻止される。

（蛋白マイクロプロセッサーチップのためのプロトコール）
このアッセイは、抗原の検出、例えば、ヒトのインターロイキン−６（ＩＬ−６）の検出が可能である。図１２に模式的に描かれているように、このアッセイはサンドイッチアッセイであり、固定化されたマウスの、抗ヒトＩＬ−６モノクロナール抗体（ｍＡｂ）、および、ビオチニル化ポリクロナール抗体プローブを使用する。プローブ抗体の固定化は、サンプル中のＩＬ−６の捕捉抗体への結合に依存する。染料と抱合したストレプトアビジンが、このビオチニル化抗体に結合され、結合した蛍光を定量する。

（ＦＬＩＳＡスキーム）
モノクロナール抗体が適当な方向でガラス表面に結合し、そのために、抗原結合部位が溶媒に対して提示されることを実現するために、ブドー球菌プロテインＡを誘導派生させたスライドを用いた。プロテインＡは、抗体分子のＦｃ（定常領域）部分に結合する、４２ＫＤの抗体結合蛋白である。１個のプロテインＡは、最大４個の捕捉抗体分子と結合することが可能である。抗体に結合するプロテインＡの化学は当業者にはよく知られている。

（チップの使用）
１）チップは、プロテインＡガラス基板の上で８０℃で３０−４５分焼成した。ガラス基板に載せたチップを室温に冷却した。次に、適当な水溶液を加えて下準備した。流体（すなわち、流動）層を、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で満たした。典型的使用では、下記の溶液を調製した。

さらに、下記の試薬を調製した。

Ｒ１．ＰＢＳＴに溶解した１ｍｇ／ｍＬウサギ血清
Ｒ２．ＰＢＳＴに溶解した２５０μｇ／ｍＬの抗ＩＬ−６モノクロナール抗体（マウス）、２．５μｇ／ｍＬの抗ジニトロフエニルキーホールリンペットヘモシアニン抗体（ウサギ）
Ｒ３．ＰＢＳＴに溶解した２５０μｇ／ｍＬの抗ＩＬ−６抗体（マウス）、２．５μｇ／ｍＬの抗ジニトロフェニルキーホールリンペットヘモシアニン抗体（ウサギ）
Ｒ４．ＰＢＳＴに溶解した２５０μｇ／ｍＬの抗ＩＬ−６モノクロナール抗体（マウス）、２．５μｇ／ｍＬの抗ジニトロフェニルキーホールリンペットヘモシアニン抗体（ウサギ）
（洗浄液）
Ｗ１．ＰＢＳＴに溶解した１ｍｇ／ｍＬのウサギ血清
Ｗ２．ＰＢＳＴに溶解した１ｍｇ／ｍＬのウサギ血清
Ｗ３．ＰＢＳＴに溶解した１０μｇ／ｍＬのＣｙ３抱合抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ）
２）余分なバッファーは、流入口Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，ＩおよびＪからピペットで抽出する。バルブ７，８，１５および１６を活性化して、流入口Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，ＪおよびＫを閉鎖する。試薬液Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３およびＲ４を、それぞれ、流入口Ａ，Ｂ，ＣおよびＤに加える。サンプル液Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３およびＳ４を、それぞれ、流入口Ｅ，Ｆ，ＧおよびＨに加える。洗液Ｗ１を流入口Ｉに加える。洗液Ｗ２を流入口Ｊに加える。洗液Ｗ３を流入口Ｋに加える。

３）次に試薬をポンプでチップに送り込む。バルブ１０および１１を活性化して、反応区域の垂直流のみを可能とする。バルブ８を開放して、流入口Ａ，Ｂ，ＣおよびＤの溶液の反応区域への流入を可能とする。試薬流通ポンプ（バルブ１２、１３および１４）を活性化して、流れを、反応区域の垂直方向へ向ける。このポンプを１０−２０分運転する。

４）反応区域を垂直流で洗浄する。バルブ８を活性化して、流入口Ａ，Ｂ，ＣおよびＤからの溶液がこれ以上反応区域に流入するのを阻止する。バルブ１６を開放して、流入口Ｊからの溶液が、反応区域を垂直方向に流れるのを可能とする。試薬流通ポンプ（バルブ１２，１３および１４）を活性化して、反応区域に対する流れを垂直方向に向ける。このポンプを５−１０分運転する（一般に、工程３の時間の半分）。

５）試薬流通ポンプ（バルブ１２，１３および１４）を停止し、かつ、バルブ１２，１３および１４を開放する。バルブ１６を活性化して、流入口Ｊの溶液が反応区域に流入するのを阻止する。バルブ８は活性化されたままとし、流入口Ｅ，Ｆ，ＧおよびＨの溶液が反応区域へ流入するのを阻止する。バルブ９を活性化し、反応区域を水平方向に流れさせる。バルブ１０を開放し、水平方向に流れさせる。バルブ１１を開放し、水平流が反応区域から流入口Ｌに向かって起こるようにする。バルブ７を開放し、流入口Ｉの溶液が反応区域を水平方向に流れることを可能とする。サンプル流通ポンプ（バルブ４，５および６）を活性化して、反応区域への流れを水平方向に仕向ける。ポンプは５−１０分運転する。

６）バルブ７を活性化して、流入口Ｉの溶液が、反応区域に流入するのを阻止する。バルブ８を開放して、流入口Ｅ，Ｆ，Ｇ，およびＨの溶液が、反応区域に水平方向に流入するのを可能とする。バルブ１１を開放して、反応区域から流入口Ｌに向かって流れが生ずるのを可能とする。サンプル流通ポンプ（バルブ４、５および６）を活性化して、反応区域の流れを水平方向に仕向ける。ポンプを５分運転する。

７）サンプル流通ポンプ（バルブ４，５および６）を停止し、バルブ４，５および６を開放する。バルブ１１を活性化して、反応区域から流入口Ｌへの流れを阻止する。再循環ポンプ（バルブ１，２および３）を活性化して、反応区域周囲の流れを時計方向に仕向ける。ポンプを３０分運転する。

８）ステップ６）および７）を繰り返して、流入口Ｅ，Ｆ，ＧおよびＨからの溶液を反応区域に流して繰り返しサンプリングを実行することが可能である。

９）再循環ポンプ（バルブ１，２および３）を停止し、バルブ１，２および３を開放する。バルブ８を活性化して、流入口Ｅ，Ｆ，ＧおよびＨの溶液が反応区域に水平方向に流れるのを阻止する。バルブ１１を開放して、反応区域から流入口Ｌへの流れを可能とする。サンプル流通ポンプ（バルブ４，５および６）を活性化して、反応区域への流れを水平方向に仕向ける。ポンプを５−１０分運転する。

１０）サンプル流通ポンプ（バルブ４，５および６）を停止し、バルブ４，５および６を開放する。バルブ１０および１１を活性化して、反応区域には垂直流のみを可能とする。バルブ９を開放して、反応区域への流れが垂直方向に起こることを可能とする。バルブ１５を開放して、流入口Ｋの溶液を反応区域に流入させる。試薬流通ポンプ（バルブ１２、１３および１４）を活性化して、反応区域の流れを垂直方向に仕向ける。ポンプを５−１０分運転する。

１１）工程の終わりに、バルブ１０、１１、１２、１３および１４を開放する。この時点で、チップを基板から外すことが可能である。

チップのコントロール層に対する気圧接続が外される。チップと基板をＰＢＳ溶液の中に沈める。チップは取り出し、基板は、新鮮なＰＢＳによる３回の５分洗浄で洗う。スライドを乾燥し、少なくとも３組のフィルターセットを備えた蛍光マイクロアレイスキャナーで画像化し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ３およびＣｙ５からの信号を定量する。

本明細書に記述された実施例および実施態様は、例示目的のためだけのものであること、それらに照らして見れば各種修飾または変更が当業者には示唆されるので、それらの修飾・変更は、本出願の意図および範囲内に、また、添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用された刊行物、特許、および、特許出願は全て、その全体を、全ての目的のために、あたかも各個別の刊行物、特許または特許出願が、詳細にかつ個別に参考として援用されるのと同程度において、本明細書に参考として援用される。

いくつかの図面では、ポンプは、１群の３本鎖線で示され、バルブは単一鎖線で示される。

図１Ａおよび１Ｂは、エラストマーブロックと、その中に配された１本のコントロールチャンネルとフローチャンネルを図示したものである。 図２Ａはエラストマーブロックの断面図であり、バルブにおけるフローチャンネルとコントロールチャンネル相互の配置、および、バルブを活性化するための要すれば随意に設けられる電極を示す。 図２Ｂは、エラストマーブロックの断面図であり、通常は開放のバルブが活性化された場合のフローチャンネルの閉塞状態を示す。 図３Ａおよび３Ｂは、通常は閉鎖されるバルブ構造の一例を示す。 図４は、あるフローチャンネルの選択的閉塞を可能とする、コントロールチャンネルとフローチャンネルの、一配置を図示する。 図５Ａおよび５Ｂは、蠕動ポンプの一例を図示する。図５Ａは、蠕動ポンプの平面模式図である。図５Ｂは、図５Ａの直線２４Ｂ−２４Ｂに沿って得られた側面断面図である。 図６は、フローチャンネルのバルブを活性化することによって、そのフローチャンネル内に保持空間を形成する様を示す断面図である。 図７Ａ−Ｅは、各種成分を組み込んだ例示の微小流体装置を描く。図７Ａおよび７Ｃは各成分の配置を示す。図７Ｂ，７Ｄおよび７Ｅは、第１および第２フローチャンネルの交差部付近のフローチャンネルとコントロールチャンネルの、隔離された、近接図を示す。図７Ｄおよび７Ｅは、別形態のコントロールチャンネルを示す。 図８Ａは、対応するコントロール層（８０８）、流体（すなわち、フローチャンネル）層（８０４）、および、ビア層（８１２）それぞれに対する、例示の金型設計を示す。 図８Ｂは、対応するコントロール層（８０８）、流体（すなわち、フローチャンネル）層（８０４）、および、ビア層（８１２）それぞれに対する、例示の金型設計を示す。軸合わせマスク８１６も示す。 図８Ｃは、対応するコントロール層（８０８）、流体（すなわち、フローチャンネル）層（８０４）、および、ビア層（８１２）それぞれに対する、例示の金型設計を示す。軸合わせマスク８１６も示す。 図８Ｄは、対応するコントロール層（８０８）、流体（すなわち、フローチャンネル）層（８０４）、および、ビア層（８１２）それぞれに対する、例示の金型設計を示す。軸合わせマスク８１６も示す。 図８Ｅは、対応するコントロール層（８０８）、流体（すなわち、フローチャンネル）層（８０４）、および、ビア層（８１２）それぞれに対する、例示の金型設計を示す。 図９は、ビア層の形成、および、製造工程時形成体にＰＤＭＳが残存する場合、ビアを開けるために実施されるエッチング工程を示す。 図１０Ａおよび１０Ｂは、流体層（８０４）およびコントロール層（８０８）のための例示の設計を示す。 図１０Ｂは、集密統合された流体層とコントロール層とを有する、一つの特定の微小流体装置設計を示す。 図１１は、実施例２で使用された微小流体装置の形態を示す。 図１２は、実施例２で記述される結合アッセイの模式図である。

Claims (33)

1. アッセイを実行するのに適応した微小流体装置であって、リガンドおよび／またはアンチリガンドを付着させることの可能な固相基板層、および、前記固相基板層に付着されるエラストマー層を含む装置であって、前記エラストマー層は、
   （ａ）複数の第１フローチャンネル、
   （ｂ）複数の第２フローチャンネルであって、前記第１フローチャンネルそれぞれと交差・横断し、前記第１フローチャンネルと前記第２フローチャンネルとの交差部に形成される複数の交差区域を供給し、前記複数の第１フローチャンネルと前記複数の第２フローチャンネルは、その中を溶液を流通させるように適応され、かつ、前記固相基板表面は、前記複数の第１フローチャンネルと前記複数の第２フローチャンネルの、少なくとも前記交差区域と流通し、前記複数の第１フローチャンネルおよび／または前記複数の第２フローチャンネルは、複数のループ状フローチャンネルを形成することが可能であり、
   （ｃ）複数のコントロールチャンネル、
   （ｄ）複数の第１コントローブバルブであって、それぞれ、前記各第１フローチャンネルに対して、前記第１フローチャンネルを通過する溶液の流れを制御するように配されており、前記各第１コントロールバルブは、第１コントロールチャンネルとエラストマー分画を含み、前記エラストマー分画は、前記第１コントロールバルブが、前記第１コントロールチャンネルに印加された活性化力に応じて動作すると、前記第１フローチャンネルの方に変位して侵入し、または、引き出され、前記第１フローチャンネルの中に配置されると、エラストマー分画は第１フローチャンネルを通る液流を制限し、
   （ｅ）複数の第２コントロールバルブであって、それぞれ、前記各第２フローチャンネルに対して、前記第２フローチャンネルを通過する溶液の流れを制御するように配されており、前記第２コントロールバルブは、第２コントロールチャンネルとエラストマー分画を含み、前記エラストマー分画は、前記第２コントロールバルブが、前記第２コントロールチャンネルに印加された活性化力に応じて動作すると、前記第２フローチャンネルの方に変位して侵入し、または、引き出され、前記第２フローチャンネルの中に配置されると、エラストマー分画は第２フローチャンネルを通る液流を制限し、
   （ｆ）複数のループ形成コントロールバルブであって、前記各第１および／または前記第２フローチャンネルに対して、前記複数のループ状フローチャンネルを形成するように配され、前記各ループ形成コントロールバルブは、ループ形成コントロールチャンネルと、エラストマー分画を含み、前記エラストマー分画は、前記ループ形成コントロールバルブが、前記ループ形成コントロールチャンネルに印加された活性化力に応じて動作すると、前記第１および／または前記第２フローチャンネル内に配置されて、そこを通る液流を制限し、それによって前記ループ状フローチャンネルを形成し、および、
   （ｇ）複数の再循環ポンプであって、各再循環ポンプは、前記ループ状フローチャンネルの内の一つについて動作的に配され、各ループ状フローチャンネルを通る溶液の循環が、前記再循環ポンプの内の一つによって制御可能となる、
   を含むことを特徴とする微小流体装置。
2. 前記複数の再循環ポンプそれぞれが、１本を越えるコントロールチャンネルを含み、前記コントロールチャンネルはそれぞれ、前記エラストマー層の中に形成され、かつ、前記ループ状フローチャンネルからエラストマー区画によって隔てられ、前記エラストマー区画は、活性化力に応じて変位して前記ループ状フローチャンネルに侵入することが可能であることを特徴とする、請求項１の微小流体装置。
3. 前記複数の第１コントロールバルブと前記複数の第２コントロールバルブの両方を活性化すると、複数の保持バルブが形成され、各保持バルブは、前記第１および第２フローチャンネルに対し、前記交差区域のそれぞれを包囲する保持空間が形成されるように配置されていることを特徴とする、請求項１の微小流体装置。
4. 第１溶液の導入のために、前記各第１フローチャンネルと流通する、第１フローチャンネル用溶液流入口をさらに含むことを特徴とする、請求項１の微小流体装置。
5. 第２溶液の導入のために、前記各第２フローチャンネルと流通する、第２フローチャンネル用溶液流入口をさらに含むことを特徴とする、請求項４の微小流体装置。
6. 前記複数の第１フローチャンネルと前記複数の第２フローチャンネルは、前記固相基板層と前記エラストマー層の間のインターフェイスに配置され、そのために前記第１および前記第２フローチャンネルの一側は前記固相基板によって形成されることを特徴とする、請求項１の微小流体装置。
7. 前記複数の第１フローチャンネルと前記複数の第２フローチャンネルは前記エラストマー層内に配置され、前記第１フローチャンネルと前記第２フローチャンネルの間の交差部に形成される前記複数の交差区域は、それぞれ、前記固相基板表面と流通するビアを含み、そのために流体を収集するのに適したウェルが形成されることを特徴とする、請求項１の微小流体装置。
8. 複数の第１フローチャンネルポンプをさらに含み、前記第１フローチャンネルポンプはそれぞれ、前記第１フローチャンネルの一つに対して、前記各第１フローチャンネルを通る溶液流が、ポンプの内の一つによって調節可能となるように動作的に配置されていることを特徴とする、請求項１の微小流体装置。
9. 複数の第２フローチャンネルポンプをさらに含み、前記第２フローチャンネルポンプはそれぞれ、前記第２フローチャンネルの一つに対して、前記各第２フローチャンネルを通る溶液流が、ポンプの内の一つによって調節可能となるように動作的に配置されていることを特徴とする、請求項８の微小流体装置。
10. 前記複数のフローチャンネルポンプそれぞれが、１本を越えるコントロールチャンネルを含み、前記コントロールチャンネルはそれぞれ、前記エラストマー層の中に形成され、かつ、前記フローチャンネルからエラストマー区画によって隔てられ、前記エラストマー区画は、活性化力に応じて変位して前記フローチャンネルに侵入することが可能であることを特徴とする、請求項９の微小流体装置。
11. 前記各第１フローチャンネルからの溶液が流出して第１溶液流出チャンネルに流入するように、前記各第１フローチャンネルと流通する第１溶液流出チャンネルをさらに含むことを特徴とする、請求項１の微小流体装置。
12. 前記各第２フローチャンネルからの溶液が流出して第２溶液流出チャンネルに流入するように、前記各第２フローチャンネルと流通する第２溶液流出チャンネルをさらに含むことを特徴とする、請求項１の微小流体装置。
13. 前記各交差区域における前記固相支持体表面は、溶液の中に存在するアンチリガンドに特異的に結合が可能なリガンドを含むことを特徴とする、請求項１の微小流体装置。
14. 結合アッセイの実行法であって、
    （ａ）リガンドおよび／またはアンチリガンドを付着させることの可能な固相基板層、および、前記固相基板層に付着されるエラストマー層を含む微小流体装置を設けることであって、前記エラストマー層は、
    （ｉ）複数の第１フローチャンネル、
    （ｉｉ）複数の第２フローチャンネルであって、前記第１フローチャンネルそれぞれと交差・横断し、前記第１フローチャンネルと前記第２フローチャンネルとの交差部に形成される複数の交差区域を供給し、前記複数の第１フローチャンネルと前記複数の第２フローチャンネルは、その中を溶液を流通させるように適応され、かつ、前記固相基板表面は、前記複数の第１フローチャンネルと前記複数の第２フローチャンネルの、少なくとも前記交差区域と流通し、前記複数の第１フローチャンネルおよび／または前記複数の第２フローチャンネルは、複数のループ状フローチャンネルを形成することが可能であり、
    （ｉｉｉ）複数のコントロールチャンネル、
    （ｉｖ）複数の第１コントローブバルブであって、それぞれ、前記各第１フローチャンネルに対して、前記第１フローチャンネルを通過する溶液の流れを制御するように配されており、前記各第１コントロールバルブは、第１コントロールチャンネルとエラストマー分画を含み、前記エラストマー分画は、前記第１コントロールバルブが、前記第１コントロールチャンネルに印加された活性化力に応じて動作すると、前記第１フローチャンネルの方に変位して侵入し、または、引き出され、前記第１フローチャンネルの中に配置されると、エラストマー分画は第１フローチャンネルを通る液流を制限し、
    （ｖ）複数の第２コントロールバルブであって、それぞれ、前記各第２フローチャンネルに対して、前記第２フローチャンネルを通過する溶液の流れを制御するように配されており、前記第２コントロールバルブは、第２コントロールチャンネルとエラストマー分画を含み、前記エラストマー分画は、前記第２コントロールバルブが、前記第２コントロールチャンネルに印加された活性化力に応じて動作すると、前記第２フローチャンネルの方に変位して侵入し、または、引き出され、前記第２フローチャンネルの中に配置されると、エラストマー分画は第２フローチャンネルを通る液流を制限し、
    （ｖｉ）複数のループ形成コントロールバルブであって、前記各第１および／または前記第２フローチャンネルに対して、前記複数のループ状フローチャンネルを形成するように配され、前記各ループ形成コントロールバルブは、ループ形成コントロールチャンネルと、エラストマー分画を含み、前記エラストマー分画は、前記ループ形成コントロールバルブが、前記ループ形成コントロールチャンネルに印加された活性化力に応じて動作すると、前記第１および／または前記第２フローチャンネル内に配置されて、そこを通る液流を制限し、それによって前記ループ状フローチャンネルを形成し、および、
    （ｖｉｉ）複数の再循環ポンプであって、各再循環ポンプは、前記ループ状フローチャンネルの内の一つについて動作的に配され、各ループ状フローチャンネルを通る溶液の循環が、前記再循環ポンプの内の一つによって制御可能となる、を含むことを特徴とする微小流体装置を供給すること、
    （ｂ）第２コントロールバルブに活性化力を印加して、各第２フローチャンネルを通過する溶液流を制限すること、
    （ｃ）リガンドを含む試薬を、前記第１フローチャンネルの少なくとも１本の中に、リガンドを、固相基板表面に付着させるのに十分な条件下で導入すること、
    （ｄ）第２フローチャンネルのコントロールチャンネルに対する活性化力を除去し、第１フローチャンネルを通る溶液流が制限されるように第１コントロールチャンネルに活性化力を印加すること、および、
    （ｅ）サンプル液の中にあるかも知れないアンチリガンドを、固相基板表面に共有的に接続されたリガンドに特異的に結合させるのに十分な条件下で、サンプル液を第２フローチャンネルに導入することによって結合アッセイを実行すること、
    を含む方法。
15. 前記サンプル液を第２フローチャンネルに導入する前に、第１フローチャンネルから、固相基板表面に付着されないリガンドを全て除去することをさらに含むことを特徴とする、請求項１４の方法。
16. 前記結合アッセイ実行工程（ｅ）は、複数のループ形成コントロールバルブに活性化力を印加して、複数のループ状サンプル・フローチャンネルを形成すること、および、再循環ポンプを用いて、サンプル液を各ループ状サンプル・フローチャンネルの中を循環させることを含むことを特徴とする、請求項１４の方法。
17. 前記結合アッセイ実行工程（ｅ）は、サンプル液を第２フローチャンネルに導入した後に、複数の第１コントロールバルブおよび複数の第２バルブの両方に対して活性化力を印加して、複数の保持空間が形成され、各保持空間が交差区域の一つを包囲し、そのためにサンプル液と、交差区域における固相基板表面に付着されたリガンドとの長期の接触が可能となることを特徴とする、請求項１４の方法。
18. 前記複数の第１フローチャンネルと前記複数の第２フローチャンネルはエラストマー層内に配置され、かつ、第１フローチャンネルと第２フローチャンネルの間の交差部に形成される交差区域はそれぞれ固相基板表面と流通するビアを含み、そのために、基板表面に流体を収集するのに適したウェルが形成されることを特徴とする、請求項１４の方法。
19. 前記第１フローチャンネルはポンプと流通し、試薬は、ポンプの作用の下に第１フローチャンネルを通って輸送されることを特徴とする、請求項１４の方法。
20. 前記ポンプは、１本を越えるコントロールチャンネルを含み、前記コントロールチャンネルはそれぞれ、前記エラストマー層の中に形成され、かつ、前記第１フローチャンネルからエラストマー区画によって隔てられ、前記エラストマー区画は、活性化力に応じて変位して前記第１フローチャンネルに侵入することが可能であり、それによって、試薬が第１フローチャンネルを通って輸送されるようになることを特徴とする、請求項１９の方法。
21. 前記第２フローチャンネルはポンプと流通し、サンプル液は、ポンプの作用の下に第２フローチャンネルを通って輸送されることを特徴とする、請求項１４の方法。
22. 前記ポンプは、１本を越えるコントロールチャンネルを含み、前記コントロールチャンネルはそれぞれ、前記エラストマー層の中に形成され、かつ、前記第２フローチャンネルからエラストマー区画によって隔てられ、前記エラストマー区画は、活性化力に応じて変位して前記第１フローチャンネルに侵入することが可能であり、それによって、サンプル液が第２フローチャンネルを通って輸送されるようになることを特徴とする、請求項２１の方法。
23. 前記結合アッセイ実行工程（ｅ）は、固相基板表面からエラストマー層を外して、各交差区域におけるリガンド／アンチリガンド結合を検出器によって定量することを含むことを特徴とする、請求項１４の方法。
24. 前記検出器は、交差区域内の光学的信号を検出することを特徴とする、請求項２３の方法。
25. 前記検出器は、蛍光発射、蛍光分極、または、蛍光共鳴エネルギー転位を検出することを特徴とする、請求項２４の方法。
26. 前記検出器は、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、または、レーザー走査共焦点顕微鏡であることを特徴とする、請求項２４の方法。
27. 前記検出器は、放射能センサーおよび電位差センサーから成る群から選ばれることを特徴とする、請求項２３の方法。
28. 前記アッセイは、基質と細胞受容体、基質と酵素、抗体と抗原、核酸と核酸結合蛋白、蛋白と蛋白、低分子と蛋白、低分子とオリゴヌクレオチド、および、蛋白親和性タグと金属イオンの間の結合を検出することを特徴とする、請求項１４の方法。
29. 前記アッセイは、細胞に対する毒性作用を検出するアッセイまたは細胞死アッセイ、または、細胞増殖アッセイであることを特徴とする、請求項１４の方法。
30. 前記アッセイは、オリゴヌクレオチド結合アッセイまたはペプチド結合アッセイであることを特徴とする、請求項１４の方法。
31. 前記アッセイは抗菌アッセイであることを特徴とする、請求項１４の方法。
32. 微小流体装置の製造法であって、
    （ａ）エラストマーポリマーからコントロール層、フロー層、および、ビア層を製造することであって、各コントロール層およびフロー層は、その表面に、それぞれ、コントロールチャンネルおよびフローチャンネルを形成するための溝を含み、
    （ｂ）コントロール層をフロー層に付着させることであって、コントロール層の溝がフロー層の上面に付着され、複数のコントロールチャンネルを形成し、フロー層の底面をビア層に付着させ、複数の第１フローチャンネルおよび複数の第２フローチャンネルを形成し、各第１フローチャンネルは各第２フローチャンネルと交差・横断して複数のチャンネル交差部を形成し、ビア層の各ビアが各チャンネル交差部に設置され、および、
    （ｃ）前記工程（ｂ）で製造されたエラストマーポリマーを、要すれば随意に、固相基板に付着させることであって、固相基板は、その表面に結合したリガンド、または、リガンドを付着させることの可能な官能基を含み、
    の諸工程を含む製造法。
33. 前記ビア層製造工程は、ビア層をエッチングして複数のビアを形成することをさらに含むことを特徴とする、請求項３２の方法。

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