DE102005042601A1

DE102005042601A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit

Info

Publication number: DE102005042601A1
Application number: DE102005042601A
Authority: DE
Inventors: Ilse Ballhorn; Gert Dr. Blankenstein; Ralf-Peter Dr. Peters; Birgit Dr. Müller-Chorus; Michael Dr. Schlüter
Original assignee: Boehringer Ingelheim Microparts GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Microparts GmbH
Priority date: 2005-04-09
Filing date: 2005-09-07
Publication date: 2006-10-12

Abstract

Es werden eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit vorgeschlagen, wobei insbesondere das ELISA-Verfahren sehr einfach, schnell und mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden kann. Hierzu werden eine Probenflüssigkeit und eine Verdünnungsflüssigkeit jeweils mehreren Dosierkammern unterschiedlicher Volumina zugeführt, so daß die Probenflüssigkeit in zugeordnete Reaktionskammern in einem Verdünnungsschritt in unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen verdünnbar ist. Den Reaktionskammern sind verschiedene Flüssigkeiten nacheinander mittels einer gemeinsamen Aufnahmekammer zuführbar. Zum Anhalten der Nachweisreaktion werden die Flüssigkeiten aus den Reaktionkammern in zugeordnete Untersuchungskammern überführt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit, insbesondere mittels des ELISA-Verfahrens.
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit mikrofluidischen Systemen bzw. Vorrichtungen, deren Strukturen eine Größe von etwa 1 bis 1000 μm und/oder deren Kavitäten jeweils ein Volumen von etwa 1 bis 1000 μl aufweisen. Die nachfolgenden Ausführungen beziehen sich insbesondere auf Vorrichtungen und Verfahren, bei denen Kapillar-, Druck- und/oder Zentrifugalkräfte wirken und insbesondere für die Funktion entscheidend sind.
Der Begriff "ELISA" kommt aus dem Englischen und bedeutet "enzymelinked immunosorbent assay". Dieser Begriff ist bei der vorliegenden Erfindung im Sinne eines Verfahrens zu verstehen, bei dem ein Enzym an einen Analyten, insbesondere an einen Komplex aus einem Analyten und einem Antikörper, gebunden wird. Mittels des Enzyms wird in einer Nachweisreaktion ein Substrat in ein Nachweissubstrat, insbesondere eine fluoreszierende Substanz oder dgl., modifiziert bzw. umgewandelt. Durch eine Erfassung des Nachweissubstrats ist eine quantitative Bestimmung des Analyten in der Probenflüssigkeit möglich. Um eine hohe Genauigkeit und einen entsprechenden Meßbereich zu ermöglichen, wird üblicherweise eine Verdünnungsreihe der Probenflüssigkeit auf diese Weise untersucht.
Bisher wird das ELISA-Verfahren üblicherweise manuell oder automatisiert – beispielsweise mittels Pipettierrobotern – auf einer offenen Pipettierplatte mit beispielsweise 96 offenen Aufnahmekammern durchgeführt. Eine zu untersuchende Probenflüssigkeit wird in den Aufnahmekammern nacheinander mehrfach verdünnt, um unterschiedliche Verdünnungsverhältnisse zu erreichen. Anschließend wird die Probenflüssigkeit mit den unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen in vorbereitete Aufnahmekammern pipettiert, in denen ein Analyt in der Probenflüssigkeit an immobilisierte Antikörper gebunden werden kann. Nach einer verhältnismäßig langen Reaktionszeit erfolgt ein mehrfaches Spülen mit einer Waschflüssigkeit. Dann wird ein an einen Nachwei- Antikörper gebundenes Enzym zugeben. Der Nachweisantikörper bindet an dem Komplex aus Analyt und immobilisiertem Antikörper. Anschließend sind wieder verschiedene Waschschritte erforderlich. Dann wird ein Substrat zugegeben, das von dem Enzym in ein Nachweissubstrat umgewandelt bzw. modifiziert wird. Diese Nachweisreaktion ist sehr zeitkritisch. Das Anhalten der Nachweisreaktion erfolgt beispielsweise durch Zugabe von Säure. Problematisch ist, daß dies nicht gleichzeitig in allen Aufnahmekammern erfolgen kann, in denen die Nachweisreaktion abläuft, und daß bei größeren Volumina durch Diffusions- und/oder Mischvorgänge unterschiedliche Verzögerungen auftreten können. Schließlich wird das Nachweissubstrat beispielsweise optisch, insbesondere durch Fluoreszenzmessung oder dgl., bestimmt. Aus den ermittelten Werten läßt sich die Konzentration des Analyten in der Probenflüssigkeit bestimmen. Das erläuterte Verfahren ist sehr aufwendig und fehleranfällig. Insbesondere addieren sich Ungenauigkeiten aufgrund der Vielzahl der einzelnen Schritte. Des weiteren ist auch die Vorbereitung der Aufnahmekammern zur Immobilierung des Antikörpers entsprechend aufwendig und ebenfalls mit dem Einsatz großer Flüssigkeitsmengen verbunden. Darüber hinaus laufen die Reaktionen aufgrund der großen Flüssigkeitsmengen und dementsprechend großen Diffusionswege oftmals sehr langsam ab, so daß das ELISA-Verfahren in der bisher üblichen Form sehr zeitaufwendig ist.

Der Artikel "Design of a Compact Disk-like Microfluidic Platform for Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" von Siyi Lai et al, Analytical Chemistry, Band 76, Nr. 7, 1. April 2004, Seiten 1832 bis 1837, beschreibt ein mikrofluidisches System in Form einer sogenannten Compact Disk (CD) für einzelne Schritte des ELISA-Verfahrens. Es werden eine Probenflüssigkeit, eine Waschflüssigkeit, eine Flüssigkeit mit einem Nachweisantikörper und eine Substratflüssigkeit in entsprechende Aufnahmekammern gefüllt, die nacheinander durch entsprechend unterschiedliche Rotation der CD in eine einzige zugeordnete Reaktionskammer zur entsprechenden Reaktion geleitet werden. So können einzelne Schritte in dem mikrofluidischen System durchgeführt werden. Jedoch verringert sich der Pipettieraufwand noch nicht wesentlich, da gegenüber dem herkömmlichen ELISA-Verfahren lediglich die jeweils mehrfachen Waschschritte vermieden werden konnten.

Generell sind bereits eine Vielzahl von mikrofluidischen Systemen in Form von CDs bekannt, bei denen eine Steuerung von Flüssigkeitsströmen durch Rotation der CD, also durch Zentrifugalkräfte, erfolgt.

Die WO 03/018198 A1, WO 03/072257 A1 und WO 2004/061414 A2 offenbaren mikrofluidische Vorrichtungen, bei denen eine Flüssigkeit, insbesondere eine Probenflüssigkeit, von einer Aufnahmekammer in angeschlossene Kammern geleitet und in definierte Einzelmengen aufgeteilt werden kann und/oder mit einer anderen Flüssigkeit gemischt werden und vorzugsweise reagieren kann. Ähnliche mikrofluidische Systeme sind auch aus den US 6,706,519 B1 , US 6,719,682 B2 , US 2004/0203136 A1, WO 00/78455 A1 und WO 01/87485 A2 bekannt.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit anzugeben, wobei eine kostengünstige, schnelle und/oder genaue quantitative Untersuchung, insbesondere mittels des ELISA-Verfahrens, ermöglicht wird.

Die obige Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder ein Verfahren gemäß Anspruch 15 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt darin, mehrere erste Dosierkammern zur Aufnahme von Probenflüssigkeit aus einer ersten, gemeinsamen Aufnahmekammer sowie mehrere zweite Dosierkammern zur Aufnahme einer Verdünnungsflüssigkeit aus einer zweiten, gemeinsamen Aufnahmekammer vorzusehen. Die ersten und/oder zweiten Dosierkammern variieren in ihren Volumina. Die ersten und zweiten Dosierkammern sind paarweise einander zugeordnet und jeweils mit einer zugeordneten Reaktionskammer verbunden, so daß durch Druck- und/oder Zentrifugalkräfte die in den ersten und zweiten Dosierkammern enthaltenen Volumina an Probenflüssigkeit und Verdünnungsflüssigkeit in die jeweils zugeordneten Reaktionskammern überführbar und mischbar sind, wodurch die Probenflüssigkeit mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen verdünnt wird. Dieses vorschlagsgemäße Verdünnen wird nachfolgend auch kurz als das "parallele Verdünnen" bezeichnet. So kann mit minimalem Pipettieraufwand – es müssen nur die erste und zweite gemeinsame Aufnahmekammer mit Flüssigkeiten von außen gefüllt werden – eine Verdünnungsreihe der Probenflüssigkeit mit sehr hoher Genauigkeit realisiert werden. Insbesondere werden die beim Stand der Technik durch das mehrfache bzw. sequentielle Verdünnen auftretenden großen Fehler durch das Aufsummieren von Fehlern vermieden.

Besonders bevorzugt variieren die Volumina der ersten und zweiten Dosierkammern entgegengesetzt. Wenn die Dosierkammern beispielsweise in zwei nebeneinander bzw. parallel verlaufenden Reihen angeordnet sind, nimmt das Volumen der ersten Dosierkammern in einer Richtung (insbesondere wahl-weise in oder entgegen der Füllrichtung) zu, während das Volumen der zweiten Dosierkammern in dieser Richtung abnimmt. So kann bei geringem Platzbedarf und bei geringen Flüssigkeitsvolumina eine Verdünnungsreihe über einen großen Verdünnungsbereich realisiert werden.

Vorzugsweise sind die einzelnen Summen der zusammengehörenden Paare von ersten und zweiten Dosierkammern gleich. Dies ist einer optimalen Platzausnutzung, insbesondere auf einer CD, zuträglich. Des weiteren ergeben sich so gleiche Volumina an verdünnter Probenflüssigkeit mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen, so daß dementsprechend die weiteren sich anschließenden Kavitäten, insbesondere Reaktionskammern und dgl., alle einheitlich auf die gleichen Volumina ausgelegt sein können, wodurch das Design vereinfacht und vereinheitlicht wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform genügt eine einzige parallele Verdünnung um einen ausreichend großen Verdünnungsbereich abzudecken. Jedoch kann bedarfsweise auch nach der ersten parallelen Verdünnung mindestens eine weitere, vorzugsweise ebenfalls parallele Verdünnung erfolgen. Diese Unterverdünnung kann beispielsweise nur für eine, beispielsweise die bereits mit dem größten Verdünnungsverhältnis verdünnte Probenflüssigkeitsmenge erfolgen. Jedoch können bedarfsweise auch mehrere oder alle durch die erste parallele Verdünnung erzeugten Flüssigkeitsvolumina unterschiedlich verdünnter Probenflüssigkeit jeweils einer separaten weiteren, insbesondere ebenfalls parallelen Verdünnung unterzogen werden.

Vorzugsweise wird zu der weiteren Verdünnung die bereits für die erste Verdünnung verwendete bzw. zugeführte Verdünnungsflüssigkeit eingesetzt. Dann ist eine nochmalige Zuführung von Verdünnungsflüssigkeit nicht erforderlich, wodurch die Handhabung vereinfacht, insbesondere das erforderliche Pipettieren von Flüssigkeiten minimiert wird.

Gemäß einem weiteren, auch unabhängig realisierbaren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine dritte gemeinsame Aufnahmekammer für mehrere Reaktionskammern vorgesehen. Insbesondere können in der Aufnahmekammer mehrere Flüssigkeiten nacheinander – also sequentiell – beispielsweise durch Pipettieren zugeführt werden. So wird eine gemeinsame Einfüllöffnung für die verschiedenen Flüssigkeiten geschaffen.

Vorzugsweise wird die dritte Aufnahmekammer jeweils – insbesondere selbsttätig durch Kapillarkräfte und/oder durch Zentrifugalkräfte – geleert, bevor die nächste Flüssigkeit eingefüllt wird. So kann ein ungewolltes Vermischen verschiedener Flüssigkeiten in der gemeinsamen Aufnahmekammer vermieden werden. Insbesondere wird es so möglich, mehrere oder alle Reaktionskammern mit minimalem Aufwand – insbesondere mit besonders wenigen Pipettiervorgängen – in geeigneter Weise vorzubereiten, also beispielsweise ein Reagenz, wie einen Antikörper oder dgl., in den Reaktionskammern zu immobilisieren. Alternativ oder zusätzlich gestattet die den Reaktionskammern zugeordnete, gemeinsame Aufnahmekammer ein Durchführen der Nachweisreaktion, beispielsweise durch Zuführen entsprechender Flüssigkeiten mit dem Enzym, dem Substrat oder dgl., mit minimalem Pipettieraufwand.

Noch ein weiterer, bedarfsweise unabhängig realisierbarer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß den Reaktionskammern jeweils eine Detektions- bzw. Untersuchungskammer zugeordnet ist und die in den Reaktionskammern vorzugsweise enzymatisch durch ein immobilisiertes Enzym ablaufenden Nachweisreaktionen dadurch angehalten werden können, daß die in den Reaktionskammern befindliche Flüssigkeit in die zugeordnete Untersuchungskammer – vorzugsweise durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte – überführt wird. Diese Überführung erfolgt insbesondere gleichzeitig für mehrere oder alle Reaktionskammern, so daß die Nachweisreaktionen auch gleichzeitig in diesen Reaktionskammern angehalten werden können.

Die Untersuchung, insbesondere die Erfassung von in der jeweiligen Flüssigkeit gebildetem Nachweissubstrat oder dgl., kann dann bedarfsweise nacheinander in den Untersuchungskammern erfolgen. So wird eine wesentlich größere Genauigkeit beim Anhalten der insbesondere enzymatisch verlaufenden und dementsprechend zeitkritischen Nachweisreaktionen ermöglicht.

Weitere Vorteile, Merkmale, Eigenschaften und Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen anhand der Zeichnung. Es zeigt:
1 eine nicht maßstabsgerechte Ansicht eines Teils einer vorschlagsgemäßen Vorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform;
2 eine schematische Ansicht eines Teils einer vorschlagsgemäßen Vorrichtung gemäß einer zweiten Ausführungsform; und
3 eine nicht maßstabsgerechte Ansicht eines Teils einer vorschlagsgemäßen Vorrichtung gemäß einer dritten Ausführungsform.
In den Figuren werden für gleiche oder ähnliche Teile dieselben Bezugszeichen verwendet, wobei entsprechende oder vergleichbare Eigenschaften und Vorteile erreicht werden, auch wenn eine wiederholte Beschreibung weggelassen ist.
1 zeigt in einer nicht maßstabsgerechten, sehr schematischen Ansicht einen Teil einer vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 gemäß einer ersten Ausführungsform. Bei der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 handelt es sich insbesondere um ein mikrofluidisches System, das vorzugsweise die Form einer runden Scheibe, beispielsweise einer Compact Disk (CD) oder dgl., aufweist und dementsprechend um eine in 1 angedeutete Drehachse 2 zur Erzeugung von Zentrifugalkräften rotierbar ist. Jedoch sind auch andere Konfigurationen und Gestaltungen möglich.
Die vorschlagsgemäße Vorrichtung 1 dient einer Untersuchung einer Probenflüssigkeit 3, insbesondere mittels des ELISA-Verfahrens. Die nachfolgende Beschreibung ist daher im wesentlichen auf die Anwendung bzw. Durchführung des ELISA-Verfahrens gerichtet, wobei bedarfsweise auch ergänzende oder alternative Maßnahmen bzw. Verfahrensschritte durchgeführt werden können. Jedoch kann die vorschlagsgemäße Vorrichtung 1 bzw. das vorschlagsgemäße Verfahren grundsätzlich auch für sonstige Untersuchungen bzw. Verfahren eingesetzt werden.
1 zeigt die Probenflüssigkeit 3 unmittelbar nach dem Einfüllen in eine erste, gemeinsame Aufnahmekammer 4. Mehrere erste Dosierkammern 5 – beim Darstellungsbeispiel vier erste Dosierkammern 5a bis 5d – sind an die erste Aufnahmekammer 4 durch entsprechende Kanäle oder dgl. – beim Darstellungsbeispiel durch Kanal 18 – angeschlossen und vorzugsweise in einer Reihe in Umfangsrichtung angeordnet.
Die Probenflüssigkeit 3 strömt von der ersten Aufnahmekammer 4 in die angeschlossenen, ersten Dosierkammern 5, wobei Luft und/oder überschüssige Probenflüssigkeit 3 in eine optionale erste Sammelkammer 6 weiterströmen kann. Der Kanal 18 verbindet also die erste Aufnahmekammer 4 mit der ersten Sammelkammer 6. 1 zeigt die Vorrichtung 1 in einem Zustand unmittelbar nach dem Einfüllen der Probenflüssigkeit 3 in die erste Aufnahmekammer 4, also bevor die Probenflüssigkeit 3 in die ersten Dosierkammern 5 strömt.
Die Vorrichtung 1 weist eine zweite gemeinsame Aufnahmekammer 7 zur Aufnahme einer Verdünnungsflüssigkeit 8 auf. An die zweite Aufnahmekammer 7 sind mehrere zweite Dosierkammern 9 – beim Darstellungsbeispiel vier zweite Dosierkammern 9a bis 9d – angeschlossen, die beim Darstellungsbeispiel ebenfalls in einer Reihe und zumindest im wesentlichen parallel zu den ersten Dosierkammern 5 angeordnet sind. Die Verdünnungsflüssigkeit 8 strömt über Kanal 19 in die zweiten Dosierkammern 9. Überschüssige Verdünnungsflüssigkeit 8 kann bedarfsweise in eine optional vorgesehene zweite Sammelkammer 10 strömen. Der Kanal 19 verbindet vorzugsweise die zweite Aufnahmekammer 7 mit der zweiten Sammelkammer 10. Die 1 zeigt die Vorrichtung 1 in dem Zustand unmittelbar nach dem Einfüllen der Verdün nungsflüssigkeit 8 in die zweite Aufnahmekammer 7, also bevor die Verdünnungsflüssigkeit 8 die zweiten Dosierkammern 9 und die damit verbundenen Kanäle bzw. den Kanal 19 und ggf. die Sammelkammer 10 füllt.
Die Dosierkammern 5 und 9 sind vorzugsweise so ausgebildet, beispielsweise durch nicht dargestellte Führungselemente für die Flüssigkeiten 3 bzw. 8, daß die Dosierkammern 5, 9 und ggf. die Kanäle vollständig ohne Gas- bzw. Lufteinschluß gefüllt werden. Verdrängte Luft kann über die vorzugsweise offen ausgebildeten Sammelkammern 6, 10 und/oder über nicht dargestellte Entlüftungsöffnungen, die insbesondere den Kanälen 18 und 19 und/oder den Dosierkammern 5, 9 zugeordnet sind, entweichen.
Den ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 sind Reaktionskammern 11 – entsprechend der Anzahl der ersten bzw. zweiten Dosierkammern 5a bis 5d bzw. 9a bis 9d beim Darstellungsbeispiel also vier Reaktionskammern 11a bis 11d – zugeordnet, die beim Darstellungsbeispiel vorzugsweise in einer Reihe parallel zu den ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 und/oder bezüglich der Drehachse 2 radial außerhalb der ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 angeordnet sind.
Die ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 sind vorzugsweise paarweise einander und jeweils einer Reaktionskammer 11 zugeordnet, wobei jedes Paar mit der zugeordneten Reaktionskammer 11 durch entsprechende, insbesondere radial verlaufende, vorzugsweise kanalartige Verbindungen 12 fluidisch verbunden ist, beispielsweise also die erste Dosierkammer 5b und die zweite Dosierkammer 9b mit der zugeordneten Reaktionskammer 11b. Die Buchstaben a bis d geben beim Darstellungsbeispiel also die Zuordnung der einzelnen Kammern 5, 9, 11 und 16 an. Dementsprechend erfolgt auch die Flüssigkeitsüberführung, insbesondere zur Verdünnung, Mischung und/oder Reaktion.
Beim Darstellungsbeispiel füllen sich die ersten Dosierkammern 5 und 9 mit der Probenflüssigkeit 3 bzw. der Verdünnungsflüssigkeit 8 vorzugsweise selbsttätig aufgrund von Druck- und/oder Kapillarkräften, insbesondere beim Einfüllen der Flüssigkeit 3 bzw. 8 in zugeordnete Aufnahmekammern 4 bzw. 7 mittels einer nicht dargestellten Pipette o. dgl. und aufgrund des dabei auf die Flüssigkeit 3 bzw. 8 ausgeübten Drucks. Jedoch können auch sonstige Kräfte, ggf. sogar Zentrifugalkräfte, je nach Anordnung und Ausbildung, alternativ oder zusätzlich hierzu eingesetzt werden.
Anschließend können durch entsprechende Zentrifugalkräfte (verursacht durch entsprechende Rotation der Vorrichtung 1 um die Drehachse 2) die in den ersten Dosierkammern 5 vorhandenen Volumina an Probenflüssigkeit 3 und die in den zweiten Dosierkammern 9 vorhandenen Volumina an Verdünnungsflüssigkeit 8 in die jeweils zugeordnete Reaktionskammer 11 – beim Darstellungsbeispiel also radial – überführt werden, wobei sich die Probenflüssigkeit 3 und Verdünnungsflüssigkeit 8 jeweils mischen. Jedoch können zur Überführung der genannten Volumina in die Reaktionskammern 11 zusätzlich oder alternativ auch sonstige Kräfte, beispielsweise Druckkräfte, Kapillarkräfte oder dgl. wirken.
Die ersten Dosierkammern 5 und/oder zweiten Dosierkammern 9 variieren in ihren Volumina. Und zwar sind die Volumina derart gewählt, daß in den Reaktionskammern 11 unterschiedliche Verdünnungsverhältnisse der Probenflüssigkeit 3 erzielt werden.
Insbesondere variieren sowohl die Volumina der ersten Dosierkammern 5 als auch die Volumina der zweiten Dosierkammern 9. Beispielsweise ist einer ersten Dosierkammer 5d mit kleinem Volumen eine zweite Dosierkammer 9d mit großem Volumen und umgekehrt zugeordnet. Beim Darstellungsbeispiel wird dies dadurch erreicht, daß die Volumen der ersten Dosierkammern 5 in einer Umfangsrichtung zu- oder abnehmen und die Volumina der zweiten Dosierkammern 9 in dieser Umfangsrichtung umgekehrt ab- oder zunehmen. Dies gestattet eine Verdünnungsreihe mit einem großen Verdünnungsbereich – also insbesondere von einem niedrigen Verdünnungsverhältnis bis zu einem großen Verdünnungsverhältnis, beispielsweise von 1:1 bis 1:1000 – und/oder eine sehr platzsparende, kompakte Anordnung der Dosierkammern 5, 9 mit entsprechend geringem Platz- bzw. Flächenbedarf.
Besonders bevorzugt sind die Summen der Volumina der paarweise einander zugeordneten ersten und zweiten Dosierkammern 5a und 9a, 5b und 9b, 5c und 9c sowie 5d und 9d zumindest im wesentlichen gleich. Auf diese Weise kann neben einem besonders kompakten Aufbau erreicht werden, daß die ein zelnen Volumina an unterschiedlich verdünnter Probenflüssigkeit 3 gleich groß sind und die Reaktionskammern 11 und eventuelle sonstige nachgeordnete Kammern oder dgl. einheitlich groß ausgebildet sein können.
In der bisherigen und in der nachfolgenden Beschreibung wird immer auf das jeweilige Volumen der Dosierkammern 5 bzw. 9 abgestellt. Um genaue, definierte Verdünnungsverhältnisse zu erhalten, sind genau definierte Volumina erforderlich. Damit bei der Überführung der Probenflüssigkeit 3 und der Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 in die zugeordneten Reaktionskammern 11 jeweils nur definierte Volumina der Flüssigkeiten 3, 8 vorliegen und überführt und gemischt werden, sind nicht dargestellte Ventileinrichtungen, Hindernisse oder Flüssigkeitsstops, beispielsweise zu den Verbindungen 12 hin, den Kanälen 18, 19 zugeordnete Belüftungsöffnungen und/oder dgl. vorgesehen.
Beim Darstellungsbeispiel sind erste Trennstellen T_1a bis T_1e für die Flüssigkeit 3 im ersten Kanal 18 gebildet, insbesondere zwischen der ersten Aufnahmekammer 4 und der ersten Dosierkammer 5a, zwischen den einzelnen Dosierkammern 5 und zwischen der letzten Dosierkammer 5d und der ersten Sammelkammer 6. Entsprechend sind zweite Trennstellen T_2a bis T_2e für die Flüssigkeit 8 im zweiten Kanal 19 gebildet, insbesondere zwischen der zweiten Aufnahmekammer 7 und der folgenden zweiten Dosierkammer 9a, zwischen den zweiten Dosierkammern 9 und zwischen der letzten Dosierkammer 9d und der zweiten Aufnahmekammer 10. Die ersten und zweiten Trennstellen T können jedoch alternativ oder zusätzlich auch am Übergang zu einzelnen Kammern und/oder an sonstigen geeigneten Stellen gebildet sein.
Weiter sind beim Darstellungsbeispiel vorzugsweise Kanalstops KS₁ und KS₂ im Kanal 18 bzw. 19 zwischen der letzten Trennstelle T_1e bzw. T_2e und der jeweiligen Sammelkammer 6 bzw. 10 oder am Übergang zu der jeweiligen Sammelkammer 6 bzw. 10 hin gebildet, um einen derartigen Strömungswiderstand für die jeweilige Flüssigkeit 3 bzw. 8 zu bilden, daß beim Einfüllen zunächst die ersten bzw. zweiten Dosierkammern 5 bzw. 9 vollständig mit der jeweiligen Flüssigkeit 3 bzw. 8 gefüllt werden, bevor diese in die zugeordnete Sammelkammer 6 bzw. 10 weiterströmen kann.
Beim Darstellungsbeispiel sind vorzugsweise erste Flüssigkeitsstops S_1a bis S_1d und zweite Flüssigkeitsstops S_2a bis S_2d in den vorzugsweise radial verlaufenden Verbindungen 12 zwischen den jeweiligen ersten Dosierkammern 5 und zweiten Dosierkammern 9 bzw. den zweiten Dosierkammern 9 und den Reaktionskammern 11 angeordnet. Diese Flüssigkeitsstops S können jedoch alternativ oder zusätzlich auch an den Übergängen zu den jeweiligen Kammern gebildet sein.
Die ersten Flüssigkeitsstops S₁ verhindern, daß beim Füllen der ersten Dosierkammern 5 die Probenflüssigkeit 3 in unerwünschter Weise die zweiten Dosierkammern 9 füllt. Umgekehrt verhindern die ersten Flüssigkeitsstops S₁ auch, daß die Verdünnungsflüssigkeit 8 beim Füllen der zweiten Dosierkammern 9 in unerwünschter Weise die ersten Dosierkammern 5 füllen bzw. die Probenflüssigkeit 3 aus den ersten Dosierkammern 5 verdrängen kann. Jedoch können hierzu auch zusätzliche, nicht dargestellte Flüssigkeitsstops, beispielsweise am Übergang der Verbindungen 12 in den jeweiligen zweiten Dosierkammern 9 vorgesehen sein.
Die zweiten Flüssigkeitsstops S₂ verhindern, daß beim Füllen der zweiten Dosierkammern 9 die Verdünnungsflüssigkeit 8 nicht in unerwünschter Weise bereits in die Reaktionskammern 11 strömt, wodurch eine definierte Dosierung nicht mehr möglich wäre.
Die Kanalstops KS und die Flüssigkeitsstops S sind derart ausgebildet, bzw. auf die Flüssigkeiten 3 und 8 bzw. auf die bei der Befüllung insbesondere mittels nicht dargestellter Pipetten o. dgl. auftretenden Drücke abgestimmt, daß die ersten und zweiten Flüssigkeitsstops S₁ und S₂ während des Füllens der ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 mit den Flüssigkeiten 3, 8 nicht überwunden werden können, sondern erst bei der späteren gewünschten Überführung der einzelnen Volumina an Flüssigkeit 3 und 8 aus den Dosierkammern 5, 9 in die Reaktionskammern 11, insbesondere erst bei entsprechender Rotation der Vorrichtung 1 bzw. erst bei entsprechenden Zentrifugalkräften. Die Flüssigkeitsstops S sind dabei derart ausgebildet, daß die zweiten Flüssigkeitsstops S₂ vor den ersten Flüssigkeitsstops S₁ öffnen bzw. überwunden werden können. Dies kann auch bei gleicher oder ähnlicher Ausgestaltung und Eigenschaft der ersten und zweiten Flüssigkeitsstops S dadurch erreicht wer den, daß bei den zweiten Flüssigkeitsstops S₂, die gegenüber dem ersten Flüssigkeitsstops S₁ radial weiter außen liegen, größere Zentrifugalkräfte als bei den ersten Flüssigkeitsstops S₁ auftreten bzw. wirken.
Die Trennstellen T und Flüssigkeitsstops S führen zu definierten Volumina an Flüssigkeit 3 und 8, die miteinander gemischt werden. Beim Überführen der Flüssigkeitsvolumina aus den ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 in die Reaktionskammer 11 reißt die Flüssigkeit 3 bzw. 8 jeweils an den Trennstellen T ab und strömt dann über die jeweilige, insbesondere radiale Verbindung 12 in die zugeordnete Reaktionskammer 11. Entsprechend wird das beispielsweise der zweiten Dosierkammer 9b zugeordnete Flüssigkeitsvolumen durch die beiden zweiten Trennstellen T_2b und T_2c sowie die beiden Flüssigkeitsstops S_1b und S_2b bestimmt bzw. festgelegt. Das zu überführende bzw. dosierte Volumen an Probenflüssigkeit 3 wird beispielsweise für die erste Dosierkammer 5b durch die beiden Trennstellen T_1b und T_1c und durch den Flüssigkeitsstop S_1b begrenzt. Dies gilt in entsprechender Weise für die anderen Flüssigkeitsvolumina der weiteren Dosierkammern 5, 9.
Vorzugsweise sind die Trennstellen T durch entsprechende, nicht dargestellte Belüftungen o. dgl. gebildet. Die Flüssigkeitsstops S und/oder die Kanalstops KS sind vorzugsweise durch eine entsprechende Verengung, sprunghafte Querschnittserweiterung und/oder Modifizierung des Benetzungsverhaltens gebildet, so daß die jeweilige Flüssigkeit 3, 8, 14 nicht oder nicht ohne weiteres den jeweiligen Stop S, KS überwinden kann. Vielmehr ist insbesondere eine vorbestimmte, für die einzelnen Stops S, KS bedarfsweise unterschiedliche Zentrifugalkraft, Druckkraft o. dgl. erforderlich, um den jeweiligen Stop S, KS überwinden zu können.
Hinsichtlich der erforderlichen und/oder möglichen konstruktiven Lösungen, um definierte Volumina sicherzustellen und/oder geeignete Strukturen und Anordnungen zum Aufteilen und/oder Mischen von Flüssigkeitsmengen bereitzustellen, wird auf den eingangs genannten Stand der Technik verwiesen, der hiermit diesbezüglich ergänzend oder alternativ als Offenbarung eingeführt wird.
Die voranstehend erläuterte "parallele Verdünnung" gestattet die Erzeugung einer Verdünnungsreihe in einem einzigen Schritt, so daß allenfalls nur geringe Verdünnungsfehler auftreten. Insbesondere kann so das bei der bisher üblichen, sequentiellen Verdünnung auftretende Problem der Summierung von Einzelfehlern vermieden werden.
In jeder Reaktionskammer 11 können dann eine gewünschte Reaktion und insbesondere mehrere gewünschte Reaktionen ablaufen bzw. durchgeführt werden, worauf später noch näher eingegangen wird. Zur Durchführung des ELISA-Verfahrens werden die Reaktionskammern 11 vorzugsweise vor Zuführung der verdünnten Probenflüssigkeit 3 zunächst vorbereitet. Diese Vorbereitung erfolgt insbesondere vor dem Einfüllen der Probenflüssigkeit 3 in die erste Aufnahmekammer 4 und der Verdünnungsflüssigkeit 8 in die zweite Aufnahmekammer 7 und wird nachfolgend näher erläutert.
Die Vorrichtung 1 weist vorzugsweise eine, insbesondere nur eine einzige, gemeinsame Aufnahmekammer 13 zur Aufnahme einer Flüssigkeit 14, insbesondere sequentiellen Aufnahme verschiedener Flüssigkeiten 14, wie einer Reaktionsflüssigkeit, einer Waschflüssigkeit, einer Blockier- bzw. Fixierflüssigkeit, einer Substratflüssigkeit oder dgl., auf. Die Reaktionskammern 11 sind an die dritte Aufnahmekammer 13 angeschlossen, so daß insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte eine in die Aufnahmekammer 13 eingefüllte Flüssigkeit 14 über entsprechende Kanäle oder dgl. – beim Darstellungsbeispiel über einen Kanal 20, der vorzugsweise in Umfangsrichtung und/oder parallel zu den Kanälen 18 bzw. 19 verläuft – in die Reaktionskammern 11 strömen kann. Überschießende und/oder verdrängte Flüssigkeit 14 wird vorzugsweise in einer optional vorgesehenen, dritten Sammelkammer 15 aufgefangen, wobei ein optimaler Kanalstop KS₃ dafür sorgen kann, daß die Flüssigkeit 14 erst die Reaktionskammern 11 vollständig füllt, bevor sie in die dritte Sammelkammer 15 strömt.
Insbesondere ist die Vorrichtung 1 derart ausgebildet, daß die dritte Aufnahmekammer 13 zunächst wieder vollständig geleert wird oder geleert werden kann, bevor eine weitere Flüssigkeit 14 der dritten Aufnahmekammer 13 – beispielsweise durch Pipettieren – zugeführt wird. Das Leeren der dritten Aufnahmekammer 13 kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß nach dem Füllen der dritten Aufnahmekammer 13 mit einer Flüssigkeit 14 diese durch Kapillarkräfte selbsttätig in die Reaktionskammern 11 und ggf. die dritte Sammelkammer 15 durchströmt, bis die dritte Aufnahmekammer 13 vollständig geleert ist. Zusätzlich oder alternativ kann dies durch Zentrifugalkräfte, insbesondere bei radialem Gefälle (Zunahme des radialen Abstands zum Drehpunkt 2) des Kanals 20 zur dritten Sammelkammer 15 hin, und entsprechende Rotationen der Vorrichtung 1, und/oder sonstige Kräfte erreicht werden.
Zusätzlich können auch die Reaktionskammern 11 bei Bedarf zunächst wieder geleert werden, bevor eine neue Flüssigkeit 14 in die dritte Aufnahmekammer 13 eingefüllt wird und diese neue Flüssigkeit 14 in die Reaktionskammern 11 strömt. Das vorherige Leeren der Reaktionskammer 11 erfolgt dann vorzugsweise durch Zentrifugalkräfte, nicht dargestellte Ventileinrichtungen oder dgl., um ein gesteuertes Leeren der Reaktionskammern 11 zu ermöglichen.
Zur Vorbereitung der Reaktionskammern 11 für das ELISA-Verfahren wird insbesondere zunächst eine Flüssigkeit 14 mit einem Reagenz, vorzugsweise einem Antikörper, in die dritte Aufnahmekammer 13 eingefüllt und in die Reaktionskammern 11 geleitet, um das Reagenz in den Reaktionskammern 11 zu immobilisieren, insbesondere den Antikörper in den entsprechend vorbereiteten Reaktionskammern 11 zu binden bzw. die Reaktionskammern 11 mit dem Antikörper zu beschichten.
Nach einer bestimmten Inkubations- bzw. Reaktionszeit werden die Reaktionskammern 11 mit einer Waschflüssigkeit, die als nächste Flüssigkeit 14 in die dritte Aufnahmekammer 13 gefüllt wird, gespült, um ungebundenes Reagenz zu entfernen.
Mit einer weiteren Flüssigkeit 14 folgt bedarfsweise eine Blockierung der noch freien, also insbesondere von Antikörpern nicht besetzten Bindungsstellen, um ein späteres undefiniertes Binden anderer Reagenzien zu blockieren, bzw. Fixierung des immobilisierten Reagenzes bzw. der immobilisierten Antikörper in den Reaktionskammern 11.
Nach einem ggf. nochmaligem Spülen mit einer Waschflüssigkeit und ggf. Leeren sind dann die Reaktionskammern 11 vorbereitet, um die verdünnte Probenflüssigkeit 3 – also die Probenflüssigkeit 3 und die Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den zugeordneten ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 – aufzunehmen.
Nach dem Überführen der Probenflüssigkeit 3 zusammen mit der Verdünnungsflüssigkeit 8 in die Reaktionskammern 11 kann die eigentliche Nachweisreaktion bzw. eine erste Reaktion zur Untersuchung der Probenflüssigkeit 3 erfolgen. Ein in der Probenflüssigkeit 3 enthaltener Analyt kann beim Darstellungsbeispiel insbesondere an das immobilisierte Reagenz, insbesondere den immobilisierten Antikörper, binden. Nach einer vorzugsweise bestimmten bzw. definierten Reaktionszeit wird nicht gebundener Analyt aus den Reaktionskammern 11 gespült bzw. gewaschen, insbesondere durch einmaliges Einfüllen einer Waschflüssigkeit 14 in die dritte Aufnahmekammer 13, um die vorhandenen Flüssigkeiten 3, 8 aus den Reaktionskammern 11 zu verdrängen, und/oder durch Zentrifugalkräfte oder sonstige Kräfte.
Anschließend wird eine weitere Flüssigkeit 14, die insbesondere ein an einen Nachweisantikörper gebundenes Enzym enthält, den Reaktionskammern 11 zugeführt, indem diese Flüssigkeit 14 wiederum der dritten Aufnahmekammer 13 zugeführt wird. Der Nachweisantikörper ist derart ausgebildet, daß er zusammen mit dem Enzym an den Komplexen bindet, die aus den immobilisierten Antikörpern und dem Analyten in den Reaktionskammern 11 gebildet sind.
Ungebundene Nachweisantikörper und Enzyme werden anschließend in einem Waschschritt durch vorzugsweise einmaliges Zuführen einer weiteren Waschflüssigkeit 14 aus den Reaktionskammern 11 gespült.
Schließlich wird eine Substratlösung als weitere Flüssigkeit 14 vorzugsweise wiederum über die dritte Aufnahmekammer 13 den Reaktionskammern 11 zugeführt. Das Substrat wird von den Enzymen in den Reaktionskammern 11 in einer enzymatischen Nachweisreaktion umgewandelt bzw. modifiziert, so daß ein später nachweisbares Nachweissubstrat, insbesondere ein fluoreszierender oder sonstiger Farbstoff oder dgl., gebildet wird. Auf das Anhalten der Nachweisreaktionen in den Reaktionskammern 11 und die weitere Untersuchung wird später noch näher eingegangen.
Die Zuführung der verschiedenen Flüssigkeiten 14, die vorzugsweise ausschließlich über die gemeinsame dritte Aufnahmekammer 13 durch sequentielle Zuführung der Flüssigkeiten 14 erfolgt, gestattet eine sehr schnelle und einfache Vorbereitung der Reaktionskammern 11 und/oder Führung der Reaktionen in den Reaktionskammern 11, wobei der Pipettieraufwand, die erforderlichen Waschschritte und/oder die erforderlichen Flüssigkeitsmengen gegenüber dem Stand der Technik – insbesondere gegenüber dem herkömmlichen ELISA-Verfahren in einer offenen Pipettierplatte – wesentlich verringert werden.
Bisher wurden die in den Reaktionskammern 11 ablaufenden, bereits genannten, insbesondere enzymatischen oder katalytischen Nachweisreaktionen durch Zugabe einer Säure, einer Base oder sonstigen Stopplösung oder dgl. angehalten, beispielsweise durch Inaktivierung der Enzyme bzw. katalytischen Reaktion. Dies ist grundsätzlich auch bei der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 möglich.
Besonders bevorzugt erfolgt das Anhalten der Nachweisreaktionen jedoch durch Trennen der Flüssigkeit mit dem Substrat und Nachweissubstrat von den (immobilisierten) Enzymen, Reaktionskatalysatoren oder sonstigen Reaktionspartnern und/oder mittels zusätzlich vorgesehener Untersuchungskammern 16, indem die in den Reaktionskammern 11 befindliche Flüssigkeit mit dem Substrat und Nachweissubstrat zum Anhalten der Nachweisreaktionen jeweils in eine zugeordnete Untersuchungskammer 16 überführt wird. Dieses Überführen erfolgt vorzugsweise für mehrere oder alle Reaktionskammern 11 gleichzeitig, so daß die Nachweisreaktionen zeitgleich angehalten werden. Insbesondere erfolgt das genannte Überführen bzw. Anhalten durch Zentrifugalkräfte, indem die Vorrichtung 1 entsprechend rotiert wird. Jedoch ist das Überführen zusätzlich oder alternativ auch durch sonstige Kräfte, beispielsweise Druck- oder Kapillarkräfte, mittels entsprechender Ventile oder dgl. möglich.
Das genannte Überführen der Flüssigkeiten aus den Reaktionskammern 11, in denen die Enzyme und/oder sonstige für die Nachweisreaktionen erforderliche Reagenzien immobilisiert sind, in die Untersuchungskammern 16 ermöglicht ein sehr einfaches und hochgradig simultanes Anhalten der Nachweisreaktionen, so daß gegenüber dem Stand der Technik ein wesentlich definierterer Verfahrensablauf und damit eine wesentlich genauere Bestimmung des Analyten ermöglicht werden.
Nach der Überführung der Flüssigkeiten mit dem Nachweissubstrat in die Untersuchungskammern 16 kann eine sequentielle Untersuchung bzw. Detektion des Nachweissubstrats in den Untersuchungskammern 16 – insbesondere optisch, beispielsweise durch Fluoreszenzmessung – erfolgen. Aus den gewonnen Werten und unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Verdünnungsverhältnisse kann dann eine äußerst genaue, insbesondere quantitative Bestimmung des Analyten in der Probenflüssigkeit 3 erfolgen.
Zusätzlich oder alternativ kann den Reaktionskammern 11 auch ein optional vorgesehener, in 1 gestrichelt angedeuteter Sammelkanal 17 zugeordnet sein, der beispielsweise über die Untersuchungskammern 16 und entsprechende, vorzugsweise radiale Verbindungen 12 an die Reaktionskammmern 11 angeschlossen ist, um zur Leerung der Reaktionskammern 11 Flüssigkeiten) aus den Reaktionskammern 11 aufzunehmen, insbesondere wenn die Reaktionskammern 11 durch Zentrifugalkräfte durch entsprechendes Rotieren der Vorrichtung 1 geleert werden. Diese Flüssigkeiten können dann durch die Untersuchungskammern 16 hindurch oder durch nicht dargestellte, direkte Verbindungen oder dgl. in den Sammelkanal 17 ausgetragen werden. Ein derartiges Leeren der Reaktionskammern 11 kann beispielsweise zum Entfernen von Flüssigkeiten 3, 8 und/oder 14 vor Zuführung einer neuen Flüssigkeit 14 in die Reaktionskammern 11 erfolgen.
Beim Darstellungsbeispiel sind vorzugsweise dritte Flüssigkeitsstops S_3a bis S_3d in den (radialen) Verbindungen 12 zwischen den Reaktionskammern 11 und Überprüfungskammern 16 gebildet. Die dritten Flüssigkeitsstops S₃ können insbesondere zusammen mit den zweiten Flüssigkeitsstops S₂ ein unerwünschtes Ausweichen der Flüssigkeit 14 in andere Bereiche verhindern, so daß die Flüssigkeiten 14 in erwünschter Weise beispielsweise nur in die dritte Sammelkammer 15 oder bedarfsweise bei Überwindung der dritten Flüssigkeitsstops S₃ über die Untersuchungskammern 16 und optionale vierte Flüssigkeitsstops S₄ in den Sammelkanal 17 entleert bzw. abgeleitet werden können.
Die dritten Flüssigkeitsstops S₃ sorgen insbesondere für ein definiertes Halten der in die Reaktionskammern 11 überführten bzw. zudosierten Flüssigkeitsvolumina an Flüssigkeiten 3 und 8, verhindern also ein unkontrolliertes und unerwünschtes Abfließen aus den Reaktionskammern 11.
Zusätzlich können bedarfsweise im Kanal 20 oder in sonstigen Verbindungen zwischen den Reaktionskammern 11 und/oder zu der dritten Aufnahmekammer 13 bzw. dritten Sammelkammer 15 hin nicht dargestellte Trennstellen oder Flüssigkeitsstops vorgesehen sein, um eine unerwünschte Überführung von verdünnter Probenflüssigkeit 3 aus einer Reaktionskammer 11 in eine benachbarte Reaktionskammer 11 – beispielsweise beim Mischen durch Beschleunigen und Abbremsen – verhindern zu können.
Zusätzlich oder alternativ können der Kanal 20 und insbesondere dessen sich zwischen den einzelnen Reaktionskammern 11 erstreckende Abschnitte auch abweichend von dem Verlauf mit zumindest im wesentlichen konstantem Abstand bzw. Radius zum Drehpunkt 2 einen anderen, in radialer Richtung abweichenden Verlauf aufweisen, um ein unerwünschtes Überführen von verdünnter Probenflüssigkeit 3 zwischen einzelnen Reaktionskammern 11 zu verhindern. Entsprechendes gilt auch für die anderen Kanäle 18 und 19 bzw. die jeweiligen Kanalabschnitte zwischen den Dosierkammern 5 bzw. 9.
Vorzugsweise sind vierte Flüssigkeitsstops S_4a bis S_4d in den radialen Verbindungen 12 zwischen den Untersuchungskammern 16 und dem optionalen Sammelkanal 17 angeordnet, um ein undefiniertes Abfließen oder Ableiten von Flüssigkeit aus den Untersuchungskammern 16 zu verhindern.
Die dritten und vierten Flüssigkeitsstops S₃ und S₄ können wiederum je nach Bedarf auch an den Übergängen von den Reaktionskammern 11 bzw. 16 zu den jeweiligen Verbindungen 12 gebildet sein.
Hinsichtlich der parallelen Verdünnung ist anzumerken, daß vorzugsweise in einem einzigen Verdünnungsschritt – also bei einer parallelen Verdünnung – 3 bis 20, insbesondere etwa 10 Verdünnungen bzw. unterschiedliche Verdünnungsverhältnisse erzeugt werden. Selbstverständlich können auch mehrere parallele Verdünnungen gleichzeitig auf der Vorrichtung 1 erfolgen. Entsprechend kann die Vorrichtung 1 bedarfsweise auch mehrere Anordnungen, wie in 1 gezeigt, aufweisen.
Nachfolgend wird eine zweite Ausführungsform der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 und des vorschlagsgemäßen Verfahrens anhand von 2 näher erläutert, wobei die nachfolgenden Ausführungen lediglich auf wesentliche Unterschiede gegenüber der ersten Ausführungsform beschränkt werden. Sonstige Vorteile, Aspekte und Eigenschaften ergeben sich also in entsprechender Weise wie bei der ersten Ausführungsform.
Bei der Darstellung gemäß 2 wurde die vorzugsweise vorgesehene Krümmung bei der vorzugsweise vorgesehenen Ringstruktur zur Anordnung auf einer runden Scheibe, wie einer CD oder dgl., weggelassen, um eine bessere Übersichtlichkeit zu ermöglichen. Weiter ist die Darstellung gemäß 2 ebenfalls nicht maßstabsgerecht. Insbesondere entsprechen die dargestellten Längen, Breiten, Größenverhältnisse und dgl. nicht den unbedingt erforderlichen bzw. bevorzugten Verhältnissen. Dies ist ebenso bei der Darstellung gemäß 1 der Fall.
In 2 sind aus Vereinfachungsgründen außerdem keine Flüssigkeiten 3, 8, 14 dargestellt. Jedoch gelten die diesbezüglichen Ausführungen bei der ersten Ausführungsform und auch hinsichtlich des sonstigen Verfahrensablaufs entsprechend für die in 2 dargestellte, zweite Ausführungsform. Weiter ist in 2 aus Vereinfachungsgründen der optionale Sammelkanal 17 weggelassen.
In 2 sind ferner aus Vereinfachungsgründen keine Trennstellen T, Flüssigkeitsstops S und Kanalstops KS dargestellt. Die diesbezüglichen Erläuterungen und Anordnungen bei der ersten Ausführungsform gelten jedoch für die zweite Ausführungsform entsprechend oder ergänzend.
Bei der zweiten Ausführungsform erfolgt im Gegensatz zu der ersten Ausführungsform nach der parallelen Verdünnung eine weitere Verdünnung, also eine Unterverdünnung. Diese weitere Verdünnung ist bei dem in 2 gezeigten Darstellungsbeispiel wiederum als parallele Verdünnung ausgeführt. Beim Darstellungsbeispiel erfolgt lediglich eine weitere Verdünnung nur einer bereits einmal verdünnten Probenflüssigkeit aus nur einer Reaktionskammer 11. Jedoch kann bedarfsweise auch eine Unterverdünnung bzw. weitere Verdünnung für mehrere oder alle Reaktionskammern 11 vorgesehen sein.
Die weiter parallele Verdünnung erfolgt im wesentlichen entsprechend wie die bereits oben erläuterte parallele Verdünnung mittels der ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 sowie der nachgeordneten Reaktionskammern 11. Für die weitere parallele Verdünnung sind daher zusätzliche erste Dosierkammern 5' und zusätzliche zweite Dosierkammern 9' sowie zusätzliche Reaktionskammern 11' vorgesehen. Die zusätzlichen Dosierkammern 5' und 9' weisen vorzugsweise entsprechende Volumenverhältnisse – bei insbesondere entsprechend verringertem Absolutvolumen – wie die ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 auf.
Die Zuführung von bereits einmal verdünnter Probenflüssigkeit in die zusätzlichen ersten Dosierkammern 5' erfolgt von der vorgeschalteten Reaktionskammer 11, die im Fall der Weiterverdünnung eigentlich nur eine Mischkammer darstellt. Den zusätzlichen zweiten Dosierkammern 9' wird wiederum Verdünnungsflüssigkeit 8, insbesondere die überschüssige Verdünnungsflüssigkeit 8 für die erste Verdünnung zugeführt, beispielsweise über die Sammelkammer 10.
Die Überführung der einzelnen Flüssigkeitsvolumina in die zugeordneten zusätzlichen Reaktionskammern 11' erfolgt wiederum vorzugsweise durch Zentrifugalkräfte. Jedoch können alternativ oder zusätzlich auch sonstige Kräfte, insbesondere Druck- und/oder Kapillarkräfte wirken, bzw. Ventile oder dgl. eingesetzt werden.
Jedoch kann für die weitere Verdünnung auch nochmals separat eine andere oder zusätzliche Verdünnungsflüssigkeit über eine nicht dargestellte zusätzli che Aufnahmekammer den zusätzlichen zweiten Dosierkammern 9' zugeführt werden.
Sofern nur eine teilweise weitere Verdünnung erfolgt, wie in 2 dargestellt, sind vorzugsweise aber nicht zwingend auch denjenigen Reaktionskammern 11, deren Inhalt nicht weiter verdünnt wird, jeweils zusätzliche Reaktionskammern 11' zugeordnet, die insbesondere auf einen entsprechenden Umfang wie die der weiteren Verdünnung dienenden zusätzlichen Reaktionskammern 11' angeordnet sind, um für alle Verdünnungsstufen eine gleichzeitige Untersuchung, insbesondere Bindung des Analyten an das immobilisierte Reagenz, sicherzustellen bzw. zu erleichtern.
Optional kann auch eine zusätzliche erste Sammelkammer 6' vorgesehen sein, die zur Aufnahme von überschüssiger Probenflüssigkeit 3 an die zusätzlichen erste Dosierkammern 5' angeschlossen ist. Optional kann auch eine zusätzliche zweite Sammelkammer 10' vorgeschlossen sein, die zur Aufnahme von überschüssiger Verdünnungsflüssigkeit 8 an die zusätzlichen zweiten Dosierkammern 9' angeordnet ist.
Nachfolgend wird eine dritte Ausführungsform der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 und des vorschlagsgemäßen Verfahrens anhand von 3 näher erläutert, wobei sich die nachfolgenden Ausführungen lediglich auf wesentliche Unterschiede gegenüber der ersten und zweiten Ausführungsform beschränken. Die bisherigen Erläuterungen gelten also ergänzend oder entsprechend.
Bei der dritten Ausführungsform sind die ersten Dosierkammern 5 parallel an einen ersten, insbesondere gemeinsamen Kanal 18 angeschlossen, der von der ersten Aufnahmekammer 4 zu der ersten Sammelkammer 6 führt. Dies hat den Vorteil, daß eine schnellere Befüllung der ersten Dosierkammern 5 mit Probenflüssigkeit 3 möglich ist, da diese parallel, also gleichzeitig befüllbar sind. Insbesondere erfolgt eine Befüllung durch Druck, beispielsweise durch Ansetzen einer nicht dargestellten Pipette oder dgl., an die erste, offene Aufnahmekammer 4, wobei eine dabei erfolgende (teilweise) Füllung der ersten Sammelkammer 6 bei entsprechender Dimensionierung unkritisch ist.
Der erste Kanal 18 wird nach dem Füllen der ersten Dosierkammer 5 – insbesondere durch Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte – vor dem Überführen der Probenflüssigkeit 3 aus den ersten Dosierkammern 5 in die zugeordneten Reaktionskammern 11 in die erste Sammelkammer 6 entleert. Dies führt zu einer besonders genauen Dosierung, da so ein definiertes "Abreißen" der Probenflüssigkeit 3 an den Übergängen (Trennstellen T₁) vom Kanal 18 zu den einzelnen ersten Dosierkammern 5 bzw. entsprechenden Verbindungen erreicht wird. Dies ermöglicht besonders genaue Dosierungen, die dann zu entsprechend genauen Verdünnungsreihen bei dem anschließenden Mischen mit Verdünnungsflüssigkeit 8 und insbesondere bei dem ELISA-Verfahren zu sehr genauen quantitativen Ergebnissen führen.
Die zweiten Dosierkammern 9 sind vorzugsweise in entsprechender Weise parallel an einen zweiten, insbesondere gemeinsamen Kanal 19 angeschlossen, der die zweite Aufnahmekammer 7 mit der zweiten Sammelkammer 10 verbindet. Entsprechend können die zweiten Dosierkammern 9 schneller mit der Verdünnungsflüssigkeit 8 befüllt werden. Vorzugsweise folgt die Befüllung mit der Verdünnungsflüssigkeit 8 ebenfalls durch Druck, insbesondere durch Ansetzen einer nicht dargestellten Pipette oder dgl.
Des weiteren wird auch der zweite Kanal 19 nach dem Füllen der zweiten Dosierkammern 9 vorzugsweise vollständig in die zweite Sammelkammer 10 entleert, insbesondere durch Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, bevor die Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den zweiten Dosierkammern 9 in die zugeordneten Reaktionskammern 11 überführt wird. Dies ergibt wiederum eine sehr genaue Dosierung, da die Verdünnungsflüssigkeit 8 definiert an den Übergängen (Trennstellen T₂) vom Kanal 19 zu den Dosierkammern 9 bzw. entsprechenden Anschlüssen abreißt, wie bereits oben für die Probenflüssigkeit 3 und die ersten Dosierkammern 5 erläutert. Entsprechend ermöglicht dies besonders genaue Verdünnungsreihen und insbesondere sehr genaue quantitative Untersuchungen gemäß dem ELISA-Verfahren oder in sonstiger Weise. Der erste und zweite Kanal 18, 19 werden vorzugsweise gleichzeitig entleert.
Die Trennstellen T sind insbesondere durch entsprechende Verengungen und/oder Abknickungen gebildet, um das gewünschte definierte Abreißen der Flüssigkeit zu gewährleisten.
Der bei der dritten Ausführungsform vorgesehene parallele Anschluß der ersten Dosierkammern 5 an den ersten Kanal 18 und/oder der zweiten Dosierkammern 9 an den zweiten Kanal 19 gestattet, wie bereits erläutert, ein besonders schnelles und paralleles Füllen der Kammern 5 bzw. 9 und ist bedarfsweise auch unabhängig von anderen Aspekten und Merkmalen der vorliegenden Ausführungsformen realisierbar.
Die Kanäle 18 und 19 weisen vorzugsweise wiederum Kanalstops KS₁ bzw. KS₂ zur jeweiligen Sammelkammer 6 bzw. 10 hin auf, um sicherzustellen, daß zunächst die jeweiligen Dosierkammern 5 bzw. 9 vollständig gefüllt werden, bevor die entsprechende Flüssigkeit 3 bzw. 8 in die zugehörige Sammelkammer 6 bzw. 10 weiterströmen kann. Insbesondere sind die Kanalstops KS derart ausgelegt, daß diese von der jeweiligen Flüssigkeit 3 bzw. 8 von dem Druck zur Zuführung – beispielsweise durch eine nicht dargestellte Pipette, mit der die jeweilige Flüssigkeit in die zugeordnete Aufnahmekammer 4 bzw. 7 zugeführt wird – (erst) nach vollständigem Füllen der zugeordneten Dosierkammern 5 bzw. 9 überwunden werden können. So kann ein vollständiges Füllen der Dosierkammern 5 und 9 mit der jeweiligen Flüssigkeit 3 bzw. 8 sichergestellt werden.
Um ein vollständiges Leeren zu ermöglichen oder unterstützen, verlaufen die Kanäle 18 und 19 vorzugsweise weitgehend geradlinig oder mit nur geringen Versetzungen oder Abknickungen und/oder vorzugsweise ohne V- oder U-förmige Bögen. Um ein vollständiges Leeren zu ermöglichen oder unterstützen, weisen die Kanäle 18 und 19 alternativ oder zusätzlich vorzugsweise ein radiales Gefälle – insbesondere zwischen dem jeweiligen Anfang und Ende bzw. der jeweiligen Aufnahmekammer 4 bzw. 7 und Sammelkammer 6 bzw. 10 – auf, so daß die mit zunehmenden Radius ansteigenden Zentrifugalkräfte bei entsprechender Rotation der Vorrichtung 1 zu dem gewünschten Leeren der Kanäle 18, 19 führen.
Bei der dritten Ausführungsform sind die einander zugeordneten ersten Dosierkammern 5 und zweiten Dosierkammern 9 nicht in Serie wie bei der ersten oder zweiten Ausführungsform (wobei die Reihenfolge frei wählbar ist) geschaltet bzw. in Serie an die zugeordneten Reaktionskammern 11 angeschlos sen, sondern vorzugsweise parallel oder quasi-parallel an die zugeordneten Reaktionskammern 11 angeschlossen. Besonders bevorzugt ist der "quasi-parallel" Anschluß, der nachfolgend näher anhand von 3 erläutert wird.
Die zweiten Dosierkammern 9 sind über Verbindungen 12, die vorzugsweise zumindest im wesentlichen radial verlaufen, an die zugeordneten Reaktionskammern 11 angeschlossen. Die zweiten Flüssigkeitsstops S₂ verhindern ein unkontrolliertes Abfließen der Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den zweiten Dosierkammern 9 über die Verbindungen 12 in die Reaktionskammern 11.
Die ersten Dosierkammern 5 sind nun ihrerseits – vorzugsweise über erste Flüssigkeitsstops S₁ – an die zugeordneten Verbindungen 12 angeschlossen, insbesondere jeweils nach den zweiten Flüssigkeitsstops S₂. Die ersten Flüssigkeitsstops S₁ sind jeweils beispielsweise durch eine entsprechende Verengung oder sprunghafte Querschnittserweiterung gebildet, so daß die Probenflüssigkeit 3 aus den ersten Dosierkammern 5 – vorzugsweise auch bei Erreichen einer Winkelgeschwindigkeit bzw. Zentrifugalkraft, die zu einer Übertragung der Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den zweiten Dosierkammern 9 in die zugeordneten Reaktionskammern 11 führt – nicht oder nicht ohne weiteres in die zugeordneten Reaktionskammern 11 über die Verbindungen 12 übertragen wird. Vielmehr ist vorzugsweise eine abströmseitige Benetzung – insbesondere der Flüssigkeitsstops S₁ – durch die Verdünnungsflüssigkeit 8 erforderlich. Erst dann kann die Probenflüssigkeit 3 die Flüssigkeitsstops S₁ oder sonstige Anschlüsse zu den Verbindungen 12 hin überwinden und zusammen mit der Verdünnungsflüssigkeit 8 dann in die zugeordneten Reaktionskammern 11 strömen. Die seitliche bzw. parallele Einleitung der Probenflüssigkeit 3 in die Verdünnungsflüssigkeitsströme führt bereits zu einer ersten Vermischung bzw. zu einem besseren Mischen, so daß insbesondere in den Reaktionskammern 11 dann eine sehr gute Durchmischung erreichbar ist.
Die bevorzugte spezielle Ausbildung (Verjüngung) der Flüssigkeitsstops S kann bedarfsweise auch entfallen. Alternativ können statt dessen auch nicht dargestellte Ventileinrichtungen eingesetzt werden.
Weiter ist es auch möglich, daß die Übertragung einerseits der Verdünnungsflüssigkeit 8 aus den zweiten Dosierkammern 9 und andererseits der Proben flüssigkeit 3 aus den ersten Dosierkammern 5 – insbesondere bei Erreichen und Überschreiten einer bestimmten Winkelgeschwindigkeit oder Zentrifugalkraft – quasi gleichzeitig erfolgt. In diesem Fall wird ebenfalls ein (erstes) Durchmischen der Flüssigkeiten 3, 8 durch die Zugabe der Probenflüssigkeit 3 in die Verdünnungsflüssigkeitsströme in den Verbindungen 12 erreicht.
Bedarfsweise kann die Zuführung auch umgekehrt erfolgen, also die Verdünnungsflüssigkeit 8 in Probenflüssigkeitsströme in den Verbindungen 12 eingeleitet werden. Die obigen Ausführungen gelten dann entsprechend.
Bei der dritten Ausführungsform ist es nicht entscheidend, ob die ersten Flüssigkeitsstops S₁ oder die zweiten Flüssigkeitsstops S₂ zuerst von der jeweiligen Flüssigkeit 3 bzw. 8 überwunden werden, da in beiden Fällen eine gute Durchmischung der beiden Flüssigkeiten 3 und 8 – zumindest in den Reaktionskammern 11 – erreichbar ist. Dementsprechend handelt es sich bei der dritten Ausführungsform um ein sehr robustes System.
Ein weiterer Aspekt der dritten Ausführungsform liegt darin, daß beispielsweise die Kanäle 18, 19, aber auch sonstige Kavitäten, Verbindungen 12 oder dgl., nicht immer auf einer Flachseite des Trägers – insbesondere nicht auf der Flachseite, in der die Kammern 4 bis 7, 9 bis 11, 13, 15 und 16 – gebildet sein müssen, in dem die Kavitäten, Kanäle oder dgl. gebildet sind. Vielmehr sind bei der Darstellung gemäß 3 die gestrichelt angedeuteten Abschnitte vorzugsweise auf der Unterseite gebildet, während die durchgezogenen Kavitäten, Kanäle und dgl. vorzugsweise auf der Oberseite bzw. von der Oberseite her gebildet sind. Die ober- und unterseitigen Kavitäten, Kanäle und dgl. sind dann durch entsprechende Durchbrechungen, Bohrungen oder dgl. miteinander verbunden. Dies ermöglicht wesentlich größere Freiheiten bei dem Design der Vorrichtung 1, insbesondere hinsichtlich der Anordnung, Konfiguration und Verbindung der Kammern. Die vorzugsweise von den Flachseiten (ober- und unterseitig) her gebildeten Kavitäten, Kanäle und dgl. sind dann auf jeder Flachseite vorzugsweise durch eine nicht dargestellte Abdeckung, beispielsweise eine Folie oder Scheibe, abgedeckt, so daß ein zumindest quasi geschlossenes System gebildet wird. Lediglich die erforderlichen Öffnungen, beispielsweise zur Befüllung der Kammern 4, 7, 13 und zur Entlüftung oder dgl. stellen dann, ggf. sogar verschließbare, Öffnungen zur Umgebung dar.
Bei der dritten Ausführungsform sind die Reaktionskammern 11 nicht maßstabsgerecht dargestellt. Weiter ist anzumerken, daß die Volumen der einzelnen Kammern auch je nach Tiefe der Kammern sehr stark variieren können. Des weiteren können sich an die Reaktionskammern 11 bei Bedarf selbstverständlich auch Untersuchungskammern 16 entsprechend der ersten oder zweiten Ausführungsform anschließen.
Besonders bevorzugt ist die Vorrichtung 1 gemäß einem auch unabhängig von der vorliegenden Ausführungsform realisierbaren Aspekt der vorliegenden Erfindung aus mehreren, vorzugsweise segmentartigen Modulen M aufgebaut, die beispielsweise mittels eines nicht dargestellten Adapters oder Halters in einer scheibenförmigen Konfiguration anordenbar sind. Dieser modulare Aufbau gestattet die Kombination verschiedener Untersuchungen je nach Bedarf. In 3 ist lediglich schematisch ein einziges Modul M dargestellt.
Die einzelnen Merkmale und Aspekte der ersten, zweiten und dritten Ausführungsform können auch beliebig miteinander kombiniert werden. Des weiteren können einzelne Aspekte auch unabhängig von den vorliegenden Ausführungsformen bei sonstigen Ausführungsformen oder Anwendungen eingesetzt werden.
Die Mischung der Probenflüssigkeit 3 mit der Verdünnungsflüssigkeit 8 – insbesondere in den Reaktionskammern 11 – kann durch Bremsen und Beschleunigen der Drehung der Vorrichtung 1 gefördert oder erreicht werden.
Der Durchmesser der Vorrichtung 1 bzw. der CD, beträgt vorzugsweise etwa 50 bis 250 mm, insbesondere etwa 125 mm. Die Dicke beträgt vorzugsweise 1 bis 6 mm, insbesondere etwa 3 mm. Die Vorrichtung 1 ist vorzugsweise aus einem geeigneten Kunststoff hergestellt.
Die Tiefe bzw. Breite der Mikrostrukturen, also insbesondere der beschriebenen Kammern, Kanäle, Verbindungen und dgl. beträgt beim Darstellungsbeispiel vorzugsweise 20 bis 1000 μm, insbesondere etwa 200 μm.
Alle Mikrostrukturen sind vorzugsweise durch eine geeignete, nicht dargestellte bzw. transparente Abdeckung überdeckt. Lediglich die Aufnahmekammern 4, 7 und 13, ggf. die Sammelkammern 6, 10, 15 bedarfsweise der Sammelkanal 17 und/oder sonstige nicht dargestellte Entlüftungsöffnungen oder dgl. sind nach außen hin offen ausgebildet. So können die Verdunstungsverluste minimiert und dementsprechend mit hoher Genauigkeit mit geringen Flüssigkeitsvolumina gearbeitet werden.
Die einzusetzenden Volumen an Flüssigkeiten betragen pro Flüssigkeit etwa 10 bis 2.000 μl, vorzugsweise nur etwa 50 bis 200 μl.
Die Summe der Volumina der paarweise zugeordneten ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 beträgt vorzugsweise 1 bis 100 μl, insbesondere etwa 10 μl. Entsprechendes gilt für die Volumina der Reaktionskammern 11 und der Untersuchungskammern 16. Insbesondere sind die genannte Summe und die jeweiligen Volumina der Reaktionskammern 11 und der Untersuchungskammern 16 gleich.
Zusätzlich oder alternativ zu der Verdünnung der Probenflüssigkeit 3 durch die Verdünnungsflüssigkeit 8 kann auch ein Mischen beliebiger Flüssigkeiten 3 und 8 – also beispielsweise zweier miteinander reagierender Flüssigkeiten 3 und 8 – erfolgen. Insbesondere kann es sich dann statt der Verdünnungsflüssigkeit 8 um eine Reaktionsflüssigkeit 8 oder dgl. handeln. Entsprechend sind die Begriffe "Probenflüssigkeit" und "Verdünnungsflüssigkeit" vorzugsweise auch sehr allgemein als unterschiedliche Flüssigkeiten zu verstehen.
Mit der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 und dem vorschlagsgemäßen Verfahren kann das ELISA-Verfahren oder ein sonstiges Verfahren sehr einfach und sehr schnell und insbesondere unter Einsatz von sehr geringen Flüssigkeitsmengen und damit auch kostengünstig durchgeführt werden. Des weiteren wird eine Minimierung der erforderlichen Pipettierschritte oder sonstiger Vorgänge zur Zuführung von Flüssigkeiten ermöglicht. Insbesondere wird eine sehr genaue Untersuchung in Form einer genauen quantitativen Bestimmung eines Analyten in der Probenflüssigkeit ermöglicht.

Claims

Vorrichtung (1) zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit (3), insbesondere mittels des ELISA-Verfahrens, mit einer ersten, gemeinsamen Aufnahmekammer (4) zur Aufnahme der Probenflüssigkeit (3), mit mehreren ersten Dosierkammern (5), die zur Aufnahme von Probenflüssigkeit (3), insbesondere durch Druck- und/oder Kapillarkräfte, an die erste Aufnahmekammer (4) angeschlossenen sind, mit einer zweiten, gemeinsamen Aufnahmekammer (7) zur Aufnahme einer Verdünnungsflüssigkeit (8), mit mehreren zweiten Dosierkammern (9), die zur Aufnahme von Verdünnungsflüssigkeit (8), insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, an die zweite Aufnahmekammer (7) angeschlossenen sind, mit mehreren Reaktionskammern (11), wobei die ersten und/oder zweiten Dosierkammern (5, 9) in ihren Volumina variieren, wobei die ersten und zweiten Dosierkammern (5, 9) paarweise einander zugeordnet sind und wobei jedes Paar mit einer zugeordneten Reaktionskammer (11) verbunden ist, so daß durch Druck- und/oder Zentrifugalkräfte die in den ersten und zweiten Dosierkammern (5, 9) enthaltenen Volumina an Probenflüssigkeit (3) und Verdünnungsflüssigkeit (8) paarweise in die zugeordneten Reaktionskammern (11) überführbar und mischbar sind, wodurch die Probenflüssigkeit (3) mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen verdünnbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Volumina der ersten Dosierkammern (5), insbesondere ausgehend von der ersten Aufnahmekammer (4), zu- oder abnehmen und die Volumina der zweiten Dosierkammern (9) entgegengesetzt zu den Volumina der zugeordneten ersten Dosierkammern (5) ab- oder zunehmen.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Summen der jeweils paarweise zugeordneten Volumina der ersten und zweiten Dosierkammern (5, 9) gleich sind.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die verdünnte Probenflüssigkeit (3) aus mindestens einer der Reaktionskammern (11) weiter verdünnbar ist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten Dosierkammern (5) parallel, insbesondere über einen ersten Kanal (18), an die erste, gemeinsame Aufnahmekammer (4) zur Aufnahme der Probenflüssigkeit (3) angeschlossen sind, insbesondere wobei der erste Kanal (18) vor Überführung der Probenflüssigkeit (3) aus den ersten Dosierkammern (5) in die zugeordneten Reaktionskammern (11) entleerbar ist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Dosierkammern (9) parallel, insbesondere über einen zweiten Kanal (19), an die zweite, gemeinsame Aufnahmekammer (7) zur Aufnahme der Verdünnungsflüssigkeit (8) angeschlossen sind, insbesondere wobei der zweite Kanal (19) vor Überführung der Verdünnungsflüssigkeit (8) aus den zweiten Dosierkammern (9) in die zugeordneten Reaktionskammern (11) entleerbar ist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß jede zweite Dosierkammer (9) über eine Verbindung (12) an eine zugeordnete Reaktionskammer (11) angeschlossen ist und jede zugeordnete erste Dosierkammer (5) parallel an die zugeordnete Reaktionskammer (11) oder – insbesondere über einen Flüssigkeitsstop (S₁) – an diese Verbindung (12) angeschlossen ist, vorzugsweise wobei die Verdünnungsflüssigkeit (8) bei der Überführung von der zweiten Dosierkammer (9) in die Reaktionskammer (11) den Anschluß oder Flüssigkeitsstop (S₁) der zugeordneten ersten Dosierkammer (5) abströmseitig benetzt, um die Überführung der Probenflüssigkeit (3) aus der ersten Dosierkammer (5) in die Reaktionskammer (11) zu unterstützen und insbesondere den Flüssigkeitsstop (S₁) zu überwinden und/oder um ein Mischen der Probenflüssigkeit (3) mit der Verdünnungsflüs sigkeit (8) zu bewirken, insbesondere in dem Abschnitt der Verbindung (12) vom Anschluß der ersten Dosierkammer (5) bis zur Reaktionskammer (11).
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß an mindestens eine der Reaktionskammern (11) oder parallel an mehrere Reaktionskammern (11) jeweils zusätzliche erste Dosierkammern (5') zur Aufnahme von verdünnter Probenflüssigkeit (3), insbesondere durch Druck-, Zentrifugal- und/oder Kapillarkräfte, angeschlossenen sind, und daß zusätzliche zweite Dosierkammern (9') zur Aufnahme von Verdünnungsflüssigkeit (8), insbesondere durch Druck-, Zentrifugal- und/oder Kapillarkräfte, an die zweite Aufnahmekammer (7), eine den zweiten Dosierkammern (9) zugeordnete Sammelkammer (10) für Verdünnungsflüssigkeit (8) oder eine zusätzliche Zuführung von Verdünnungsflüssigkeit (8) angeschlossenen sind, wobei die zusätzlichen ersten und/oder zweiten Dosierkammern (5', 9') in ihren Volumina variieren, wobei die zusätzlichen ersten und zweiten Dosierkammern (5', 9') paarweise einander zugeordnet sind und wobei jedes Paar mit einer zugeordneten zusätzlichen Reaktionskammer (11') verbunden ist, so daß durch Druck- und/oder Zentrifugalkräfte die in den zusätzlichen ersten und zweiten Dosierkammern (5', 9') enthaltenen Volumina an bereits einmal verdünnter Probenflüssigkeit (3) und Verdünnungsflüssigkeit (8) paarweise in die zugeordneten zusätzlichen Reaktionskammern (11') überführbar und mischbar sind, wodurch die bereits einmal verdünnte Probenflüssigkeit (3) mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen weiter verdünnbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Volumina der zusätzlichen ersten Dosierkammern (5') zu- oder abnehmen und die Volumina der zusätzlichen zweiten Dosierkammern (9') entgegengesetzt zu den Volumina der zugeordneten zusätzlichen ersten Dosierkammern (5') ab- oder zunehmen.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Summen der jeweils paarweise zugeordneten Volumina der zusätzlichen ersten und zweiten Dosierkammern (5', 9') gleich sind.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (1) eine dritte Aufnahmekammer (13) zur insbesondere sequentiellen Aufnahme einer oder mehrerer Flüssigkeiten (14), wie einer Flüssigkeit mit einem Reagenz, insbesondere einem Antikörper, einer Waschflüssigkeit, wie einer Blockierflüssigkeit, insbesondere zur Blockierung freier Bindungsstellen in den Reaktionskammern (11, 11'), wie einer Flüssigkeit mit einem Enzym, das insbesondere an einem Nachweisantikörper gebunden ist, und/oder wie einer Flüssigkeit mit einem Substrat, aufweist, wobei die Reaktionskammern (11, 11') zur Aufnahme der Flüssigkeiten) (14), insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, an die dritte Aufnahmekammer (13) angeschlossen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (1) mindestens eine den Reaktionskammern (11, 11') und/oder nachgeordneten Untersuchungskammern (16) zugeordnete Sammelkammer (15) und/oder einen Sammelkanal (17) zur Aufnahme der Flüssigkeiten (3, 8, 14) aufweist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (1) den Reaktionskammern (11) und/oder zusätzlichen Reaktionskammern (11') zugeordnete Untersuchungskammern (16) aufweist, so daß in den Reaktionskammern (11, 11') ablaufende Nachweisreaktionen insbesondere gleichzeitig angehalten werden können, indem in den Reaktionskammern (11, 11') befindliche Flüssigkeiten (14), insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, jeweils in die zugeordneten Untersuchungskammern (16), insbesondere gleichzeitig, überführbar sind, insbesondere wobei in den Reaktionskammern (11, 11') immobilisierte Reagenzien, wie Enzyme, angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (1) als mikrofluidisches System, insbesondere in Form einer runden Scheibe, wie einer CD, ausgebildet und/oder aus vorzugsweise segmentartigen Modulen (M) aufgebaut ist.
Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit (3), insbesondere mittels des ELISA-Verfahrens, wobei die Probenflüssigkeit (3) einer ersten, gemeinsamen Aufnahmekammer (4) zugeführt und von dieser in mehrere erste Dosierkammern (5) weitergeleitet wird, wobei eine Verdünnungsflüssigkeit (8) einer zweiten, gemeinsamen Aufnahmekammer (7) zugeführt und von dieser in mehrere zweite Dosierkammern (9) weitergeleitet wird, wobei die ersten und/oder zweiten Dosierkammern (5, 9) in ihren Volumina variieren, die ersten und zweiten Dosierkammern (5, 9) paarweise einander zugeordnet sind und durch Druck- und/oder Zentrifugalkräfte die in den ersten und zweiten Dosierkammern (5, 9) enthaltenen Volumina an Probenflüssigkeit (3) und Verdünnungsflüssigkeit (8) paarweise in zugeordnete Reaktionskammern (11) überführt und gemischt werden, wodurch die Probenflüssigkeit (3) mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen verdünnt und anschließend untersucht wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß ein erster Kanal (18), an den die ersten Dosierkammern (5) zur Zuführung der Probenflüssigkeit (3) von der ersten Aufnahmekammer (4) angeschlossen sind, zuerst entleert wird, bevor die Probenflüssigkeit (3) aus den ersten Dosierkammern (5) in die zugeordneten Reaktionskammern (11) überführt wird, und/oder daß ein zweiter Kanal (19), an den die zweiten Dosierkammern (9) zur Zuführung der Verdünnungsflüssigkeit (8) von der zweiten Aufnahmekammer (4) angeschlossen sind, zuerst entleert wird, bevor die Probenflüssigkeit (3) aus den zweiten Dosierkammern (9) in die zugeordneten Reaktionskammern (11) überführt wird.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß zur oder während der Überführung der Probenflüssigkeit (3) aus der ersten Dosierkammer (5) in die zugeordnete Reaktionskammer (11) über eine Verbindung (12) diese Verbindung von der Verdünnungsflüssigkeit (8) bei der Überführung von der zugeordneten zweiten Dosierkammer (9) in die Reaktionskammer (11) durchströmt wird, vorzugsweise wobei die Verdünnungsflüssigkeit (8) bei der Überführung von der zweiten Dosierkammer (9) in die Reakti onskammer (11) den Anschluß einer zugeordneten ersten Dosierkammer (5) abströmseitig benetzt, um die Überführung der Probenflüssigkeit (3) aus der ersten Dosierkammer (5) in die Reaktionskammer (11) zu unterstützen und insbesondere einen Kapillarstop (20) zu überwinden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß während der Überführung der Probenflüssigkeit (3) und der Verdünnungsflüssigkeit (8) aus den Dosierkammern (5, 9) in die zugeordnete Reaktionskammer (11) über jeweilige Verbindungen (12) die Probenflüssigkeit (3) seitlich in die durch die Verbindungen (12) strömende Verdünnungsflüssigkeit (8) oder umgekehrt eingeleitet wird, insbesondere um die Flüssigkeiten (3, 8) bereits in den Verbindungen (12) zu mischen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenflüssigkeit (3) und die Verdünnungsflüssigkeit (8) parallel oder gleichzeitig in die jeweilige Reaktionskammer (11) insbesondere zur besseren Mischung überführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die verdünnte Probenflüssigkeit (3) aus mindestens einer der Reaktionskammern (11) weiter verdünnt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß zur weiteren Verdünnung die bereits einmal verdünnte Probenflüssigkeit (3) aus einer Reaktionskammer (11) an zusätzliche erste Dosierkammern (5') geleitet wird und daß die Verdünnungsflüssigkeit (8) an zusätzliche zweite Dosierkammern (9') geleitet wird, wobei die zusätzlichen ersten und/oder zweiten Dosierkammern (5', 9') in ihren Volumina variieren und die zusätzlichen ersten und zweiten Dosierkammern (5', 9') paarweise einander zugeordnet sind, so daß durch Druck- und/oder Zentrifugalkräfte die in den zusätzlichen ersten und zweiten Dosierkammern (5', 9') enthaltenen Volumina an bereits einmal verdünnter Probenflüssigkeit (3) und Verdünnungsflüssigkeit (8) paarweise in zugeordnete zusätzliche Reaktionskammern (11') überführt und gemischt werden, wodurch die bereits einmal verdünnte Probenflüssigkeit (3) mit unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen weiter verdünnt und anschließend untersucht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß den Reaktionskammern (11, 11') nacheinander verschiedene Flüssigkeiten (14), wie eine Flüssigkeit mit einem Reagenz, insbesondere einem Antikörper, wie eine Waschflüssigkeit, wie eine Blockierflüssigkeit, insbesondere zur Blockierung freier Bindungsstellen in den Reaktionskammern (11, 11'), wie eine Flüssigkeit mit einem Enzym, das insbesondere an einen Nachweisantikörper gebunden ist, und/oder wie eine Flüssigkeit mit einem Substrat, vorzugsweise über eine gemeinsame dritte Aufnahmekammer (13), insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, zugeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Aufnahmekammer (13) jeweils vor Aufnahme einer neuen Flüssigkeit (14) geleert wird, insbesondere selbsttätig durch Kapillarkräfte und/oder durch Zentrifugalkräfte.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskammern (11, 11') vor Zuführung der Probenflüssigkeit (3) mit einem vorzugsweise immobilisierten Reagenz, insbesondere einem Antikörper, versehen, insbesondere beschichtet werden.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß nach Immobilisierung des Reagenzes noch freie Bindungsstellen in den Reaktionskammern (11, 11') mittels einer Blockierflüssigkeit blockiert werden.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils nach dem Beschichten und/oder Blockieren, insbesondere jeweils nur einmalig, eine Waschflüssigkeit zum Spülen durch die Reaktionskammern (11, 11') geleitet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß anschließend die Probenflüssigkeit (3) mit dem jeweiligen Verdünnungsverhältnis, insbesondere durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, in die jeweilige Reaktionskammer (11, 11') geleitet wird.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß nach einer bestimmten Reaktionszeit und/oder Bindung eines Analyten in der Probenflüs sigkeit (3) an das Reagenz die Reaktionskammern (11, 11') gespült werden, dann ein an die Verbindung aus Reagenz und Analyten bindendes Nachweisreagenz, insbesondere ein Nachweisantikörper mit einem Enzym, in die Reaktionskammern (11, 11') geleitet wird und schließlich das ungebundene Nachweisreagenz bzw. ungebundene Enzym wieder ausgewaschen wird.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Auswaschen des ungebundenen Nachweisreagenzes bzw. ungebundenen Enzyms ein Substrat in die Reaktionskammern (11, 11') geleitet wird, das von dem Nachweisreagenz bzw. Enzym, insbesondere enzymatisch, in einer Nachweisreaktion in eine Nachweissubstanz modifiziert oder umgewandelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß in den Reaktionskammern (11, 11') eine insbesondere enzymatische oder sonstige katalytische Nachweisreaktion zum Nachweis eines Analyten in der Probenflüssigkeit (3) abläuft und dabei ein Nachweissubstrat erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweisreaktion in mehreren oder allen Reaktionskammern (11, 11') gleichzeitig angehalten wird, indem die in den jeweiligen Reaktionskammern (11, 11') befindliche Flüssigkeit (14) mit dem Substrat und dem Nachweissubstrat aus den Reaktionskammern (11, 11') in zugeordnete Untersuchungskammern (16), vorzugsweise durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte, überführt wird und dadurch für die Nachweisreaktion erforderliche Reaktionspartner getrennt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem mikrofluidischen System, insbesondere in Form einer runden Scheibe, wie einer CD, und/oder in einem Aufbau aus vorzugsweise segmentartigen Modulen (M) durchgefürt wird, insbesondere wobei zur Erzeugung von Zentrifugalkräften zur Steuerung des Verfahrensablaufs das mikrofluidische System zu bestimmten Zeitpunkten, für bestimmte Zeitdauern und/oder mit bestimmten Rotationsgeschwindigkeiten rotiert wird.