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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren
zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit,
insbesondere mittels des ELISA-Verfahrens.
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Die
vorliegende Erfindung befaßt
sich mit mikrofluidischen Systemen bzw. Vorrichtungen, deren Strukturen
eine Größe von etwa
1 bis 1000 μm und/oder
deren Kavitäten
jeweils ein Volumen von etwa 1 bis 1000 μl aufweisen. Die nachfolgenden Ausführungen
beziehen sich insbesondere auf Vorrichtungen und Verfahren, bei
denen Kapillar-, Druck- und/oder Zentrifugalkräfte wirken und insbesondere für die Funktion
entscheidend sind.
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Der
Begriff "ELISA" kommt aus dem Englischen
und bedeutet "enzymelinked
immunosorbent assay".
Dieser Begriff ist bei der vorliegenden Erfindung im Sinne eines
Verfahrens zu verstehen, bei dem ein Enzym an einen Analyten, insbesondere
an einen Komplex aus einem Analyten und einem Antikörper, gebunden
wird. Mittels des Enzyms wird in einer Nachweisreaktion ein Substrat
in ein Nachweissubstrat, insbesondere eine fluoreszierende Substanz
oder dgl., modifiziert bzw. umgewandelt. Durch eine Erfassung des
Nachweissubstrats ist eine quantitative Bestimmung des Analyten
in der Probenflüssigkeit
möglich.
Um eine hohe Genauigkeit und einen entsprechenden Meßbereich
zu ermöglichen,
wird üblicherweise
eine Verdünnungsreihe
der Probenflüssigkeit
auf diese Weise untersucht.
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Bisher
wird das ELISA-Verfahren üblicherweise
manuell oder automatisiert – beispielsweise mittels
Pipettierrobotern – auf
einer offenen Pipettierplatte mit beispielsweise 96 offenen Aufnahmekammern
durchgeführt.
Eine zu untersuchende Probenflüssigkeit
wird in den Aufnahmekammern nacheinander mehrfach verdünnt, um
unterschiedliche Verdünnungsverhältnisse
zu erreichen. Anschließend wird
die Probenflüssigkeit
mit den unterschiedlichen Verdünnungsverhältnissen
in vorbereitete Aufnahmekammern pipettiert, in denen ein Analyt
in der Probenflüssigkeit
an immobilierten Antikörpern
gebunden werden kann. Nach einer verhältnismäßig langen Reaktionszeit erfolgt
ein mehrfaches Spülen
mit einer Waschflüssigkeit.
Dann wird ein an einen Nachwei santikörper gebundenes Enzym zugeben.
Der Nachweisantikörper
bindet an dem Komplex aus Analyt und immobilierten Antikörper. Anschließend sind
wieder verschiedene Waschschritte erforderlich. Dann wird ein Substrat
zugegeben, das von dem Enzym in ein Nachweissubstrat umgewandelt
bzw. modifiziert wird. Diese Nachweisreaktion ist sehr zeitkritisch.
Das Anhalten der Nachweisreaktion erfolgt beispielsweise durch Zugabe
von Säure.
Problematisch ist, daß dies
nicht gleichzeitig in allen Aufnahmekammern erfolgen kann, in denen
die Nachweisreaktion abläuft,
und daß bei
größeren Volumina
durch Diffusions- und/oder Mischvorgänge unterschiedliche Verzögerungen
auftreten können.
Schließlich
wird das Nachweissubstrat beispielsweise optisch, insbesondere durch
Fluoreszenzmessung oder dgl., bestimmt. Aus den ermittelten Werten
läßt sich
die Konzentration des Analyten in der Probenflüssigkeit bestimmen. Das erläuterte Verfahren
ist sehr aufwendig und fehleranfällig.
Insbesondere addieren sich Ungenauigkeiten aufgrund der Vielzahl
der einzelnen Schritte. Des weiteren ist auch die Vorbereitung der Aufnahmekammern
zur Immobilierung des Antikörpers
entsprechend aufwendig und ebenfalls mit dem Einsatz größer Flüssigkeitsmengen
verbunden. Darüber
hinaus laufen die Reaktionen aufgrund der großen Flüssigkeitsmengen und dementsprechend
großen
Diffusionswege oftmals sehr langsam ab, so daß das ELISA-Verfahren in der
bisher üblichen
Form sehr zeitaufwendig ist.
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Der
Artikel "Design
of a Compact Disk-like Microfluidic Platform for Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay" von Siyi
Lai et al, Analytical Chemistry, Band 76, Nr. 7, 1. April 2004,
Seiten 1832 bis 1837, beschreibt ein mikrofluidisches System in
Form einer sogenannten Compact Disk (CD) für einzelne Schritte des ELISA-Verfahrens.
Es werden eine Probenflüssigkeit,
eine Waschflüssigkeit,
eine Flüssigkeit
mit einem Nachweisantikörper
und eine Substratflüssigkeit
in entsprechende Aufnahmekammern gefüllt, die nacheinander durch
entsprechend unterschiedliche Rotation der CD in eine einzige zugeordnete
Reaktionskammer zur entsprechenden Reaktion geleitet werden. So
können
einzelne Schritte in dem mikrofluidischen System durchgeführt werden.
Jedoch verringert sich der Pipettieraufwand noch nicht wesentlich,
da gegenüber
dem herkömmlichen
ELISA-Verfahren lediglich die jeweils mehrfachen Waschschritte vermieden
werden konnten.
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Generell
sind bereits eine Vielzahl von mikrofluidischen Systemen in Form
von CDs bekannt, bei denen eine Steuerung von Flüssigkeitsströmen durch
Rotation der CD, also durch Zentrifugalkräfte, erfolgt.
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Die
WO 03/018198 A1, WO 03/072257 A1 und WO 2004/061414 A2 offenbaren
mikrofluidische Vorrichtungen, bei denen eine Flüssigkeit, insbesondere eine
Probenflüssigkeit,
von einer Aufnahmekammer in angeschlossene Kammern geleitet und
in definierte Einzelmengen aufgeteilt werden kann und/oder mit einer
anderen Flüssigkeit
gemischt werden und vorzugsweise reagieren kann. Ähnliche
mikrofluidische Systeme sind auch aus den
US 6,706,519 B1 ,
US 6,719,682 B2 ,
US 2004/0203136 A1, WO 00/78455 A1 und WO 01/87485 A2 bekannt.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung
und ein Verfahren zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit
anzugeben, wobei eine kostengünstige,
schnelle und/oder genaue quantitative Untersuchung, insbesondere
mittels des ELISA-Verfahrens, ermöglicht wird.
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Die
obige Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder ein Verfahren
gemäß Anspruch
7 gelöst.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß den Reaktionskammern
jeweils eine Detektions- bzw. Untersuchungskammer zugeordnet ist und
die in den Reaktionskammern vorzugsweise enzymatisch durch ein immobilisiertes
Enzym ablaufenden Nachweisreaktionen dadurch angehalten werden können, daß die in
den Reaktionskammern befindliche Flüssigkeit in die zugeordnete
Untersuchungskammer – vorzugsweise
durch Druck-, Kapillar- und/oder
Zentrifugalkräfte – überführt wird.
Diese Überführung erfolgt
insbesondere gleichzeitig für mehrere
oder alle Reaktionskammern, so daß die Nachweisreaktionen auch
gleichzeitig in diesen Reaktionskammern angehalten werden können. Die Untersuchung,
insbesondere die Erfassung von in der jeweiligen Flüssigkeit
gebildetem Nachweissubstrat oder dgl., kann dann bedarfsweise nacheinander in
den Untersuchungskammern erfolgen. So wird eine wesentlich größere Genauigkeit
beim Anhalten der insbesondere enzyma tisch verlaufenden und dementsprechend
zeitkritischen Nachweisreaktionen ermöglicht.
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Gemäß einem
weiteren, auch unabhängig realisierbaren
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine dritte gemeinsame Aufnahmekammer
für mehrere
Reaktionskammern vorgesehen. Insbesondere können in der Aufnahmekammer
mehrere Flüssigkeiten
nacheinander – also
sequentiell – beispielsweise durch
Pipettieren zugeführt
werden. So wird eine gemeinsame Einfüllöffnung für die verschiedenen Flüssigkeiten
geschaffen.
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Vorzugsweise
wird die dritte Aufnahmekammer jeweils – insbesondere selbsttätig durch
Kapillarkräfte
und/oder durch Zentrifugalkräfte – geleert,
bevor die nächste
Flüssigkeit
eingefüllt
wird. So kann ein ungewolltes Vermischen verschiedener Flüssigkeiten
in der gemeinsamen Aufnahmekammer vermieden werden. Insbesondere
wird es so möglich, mehrere
oder alle Reaktionskammern mit minimalem Aufwand – insbesondere
mit besonders wenigen Pipettiervorgängen – in geeigneter Weise vorzubereiten,
also beispielsweise ein Reagenz, wie einen Antikörper oder dgl., in den Reaktionskammern
zu immobilisieren. Alternativ oder zusätzlich gestattet die den Reaktionskammern
zugeordnete, gemeinsame Aufnahmekammer ein Durchführen der
Nachweisreaktion, beispielsweise durch Zuführen entsprechender Flüssigkeiten
mit dem Enzym, dem Substrat oder dgl., mit minimalem Pipettieraufwand.
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Weitere
Vorteile, Merkmale, Eigenschaften und Aspekte der vorliegenden Erfindung
ergeben sich aus den Ansprüchen
und der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen anhand der Zeichnung.
Es zeigt:
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1 eine
nicht maßstabsgerechte
Ansicht eines Teils einer vorschlagsgemäßen Vorrichtung gemäß einer
ersten Ausführungsform;
und
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2 eine
schematische Ansicht eines Teils einer vorschlagsgemäßen Vorrichtung
gemäß einer zweiten
Ausführungsform.
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In
den Figuren werden für
gleiche oder ähnliche
Teile dieselben Bezugszeichen verwendet, wobei entsprechende oder
vergleichbare Eigenschaften und Vorteile erreicht werden, auch wenn
eine wiederholte Beschreibung weggelassen ist.
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1 zeigt
in einer nicht maßstabsgerechten,
sehr schematischen Ansicht einen Teil einer vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 gemäß einer
ersten Ausführungsform.
Bei der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 handelt
es sich insbesondere um ein mikrofluidisches System, das vorzugsweise
die Form einer runden Scheibe, beispielsweise einer Compact Disk
(CD) oder dgl., aufweist und dementsprechend um eine in 1 angedeutete
Drehachse 2 zur Erzeugung von Zentrifugalkräften rotierbar
ist. Jedoch sind auch andere Konfigurationen und Gestaltungen möglich.
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Die
vorschlagsgemäße Vorrichtung 1 dient einer
Untersuchung einer Probenflüssigkeit 3,
insbesondere mittels des ELISA-Verfahrens. Die nachfolgende Beschreibung
ist daher im wesentlichen auf die Anwendung bzw. Durchführung des
ELISA-Verfahrens gerichtet, wobei bedarfsweise auch ergänzende oder
alternative Maßnahmen
bzw. Verfahrensschritte durchgeführt
werden können.
Jedoch kann die vorschlagsgemäße Vorrichtung 1 bzw.
das vorschlagsgemäße Verfahren
grundsätzlich
auch für sonstige
Untersuchungen bzw. Verfahren eingesetzt werden.
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1 zeigt
die Probenflüssigkeit 3 unmittelbar
nach dem Einfüllen
in eine erste, gemeinsame Aufnahmekammer 4. Mehrere erste
Dosierkammern 5 sind an die erste Aufnahmekammer 4 durch
entsprechende Kanäle
oder dgl. angeschlossen und vorzugsweise in einer Reihe in Umfangsrichtung
angeordnet.
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Die
Probenflüssigkeit 3 strömt von der
ersten Aufnahmekammer 4 in die angeschlossenen, ersten Dosierkammern 5,
wobei Luft und/oder überschüssige Probenflüssigkeit 3 in
eine optionale erste Sammelkammer 6 weiterströmen kann. 1 zeigt
die Vorrichtung 1 in einem Zustand unmittelbar nach dem Einfüllen der
Probenflüssigkeit 3 in
die erste Aufnahmekammer 4, also bevor die Probenflüssigkeit 3 in die
ersten Dosierkammern 5 strömt.
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Die
Vorrichtung 1 weist eine zweite gemeinsame Aufnahmekammer 7 zur
Aufnahme einer Verdünnungsflüssigkeit 8 auf.
An die zweite Aufnahmekammer 7 sind mehrere zweite Dosierkammern 9 angeschlossen,
die beim Darstellungsbeispiel ebenfalls in einer Reihe und zumindest
im wesentlichen parallel zu den ersten Dosierkammern 5 angeordnet
sind. Die Verdünnungsflüssigkeit 8 strömt in die
zweiten Dosierkammern 9. Überschüssige Verdünnungsflüssigkeit 8 kann bedarfsweise
in eine optional vorgesehene zweite Sammelkammer 10 strömen. Die 1 zeigt
die Vorrichtung 1 in dem Zustand unmittelbar nach dem Einfüllen der
Verdünnungsflüssigkeit 8 in die
zweite Aufnahmekammer 7, also bevor die Verdünnungsflüssigkeit 8 die
zweiten Dosierkammern 9 und die damit verbundene Kanäle und ggf.
die Sammelkammer 10 füllt.
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Die
Dosierkammern 5 und 9 sind vorzugsweise so ausgebildet,
beispielsweise durch nicht dargestellte Führungselemente für die Flüssigkeiten 3 bzw. 8,
daß die
Dosierkammern 5, 9 und ggf. die Kanäle vollständig ohne
Gas- bzw. Lufteinschluß gefüllt werden.
Verdrängte
Luft kann über
die vorzugsweise offen ausgebildeten Sammelkammern 6, 10 und/oder über nicht
dargestellte Entlüftungsöffnungen,
die insbesondere den Kanälen
und/oder Dosierkammern 5, 9 zugeordnet sind, entweichen.
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Den
ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 sind
Reaktionskammern 11 zugeordnet, die beim Darstellungsbeispiel
vorzugsweise in einer Reihe parallel und/oder bezüglich der
Drehachse 2 radial außerhalb
der ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 angeordnet
sind.
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Die
ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 sind vorzugsweise
paarweise einander und jeweils einer Reaktionskammer 11 zugeordnet,
wobei jedes Paar mit der zugeordneten Reaktionskammer 11 durch
entsprechende, insbesondere radial verlaufende, vorzugsweise kanalartige
Verbindungen 12 fluidisch verbunden ist.
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Beim
Darstellungsbeispiel füllen
sich die ersten Dosierkammern 5 und 9 mit der
Probenflüssigkeit 3 bzw.
der Verdünnungsflüssigkeit 8 vorzugsweise selbsttätig aufgrund
von Druck- und/oder Kapillarkräften.
Jedoch können
auch sonstige Kräfte,
ggf. sogar Zentrifugalkräfte,
je nach Anordnung und Ausbildung, alternativ oder zusätzlich hierzu
eingesetzt werden.
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Anschließend können durch
entsprechende Zentrifugalkräfte
(verursacht durch entsprechende Rotation der Vorrichtung 1 um
die Drehachse 2) die in den ersten Dosierkammern 5 vorhandenen
Volumina an Probenflüssigkeit 3 und
die in den zweiten Dosierkammern 9 vorhandenen Volumina
an Verdünnungsflüssigkeit 8 in
die jeweils zugeordnete Reaktionskammer 11 überführt werden,
wobei sich die Probenflüssigkeit 3 und
Verdünnungsflüssigkeit 8 jeweils mischen.
Jedoch können
zur Überführung der
genannten Volumina in die Reaktionskammern 11 zusätzlich oder
alternativ auch sonstige Kräfte,
beispielsweise Druckkräfte,
Kapillarkräfte
oder dgl. wirken.
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Die
ersten Dosierkammern 5 und/oder zweiten Dosierkammern 9 variieren
in ihren Volumina. Und zwar sind die Volumina derart gewählt, daß in den
Reaktionskammern 11 unterschiedliche Verdünnungsverhältnisse
der Probenflüssigkeit 3 erzielt werden.
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Insbesondere
variieren sowohl die Volumina der ersten Dosierkammern 5 als
auch die Volumina der zweiten Dosierkammern 9. Vorzugsweise
ist einer ersten Dosierkammer 5 eine zweite Dosierkammer 9 mit
großem
Volumen und umgekehrt zugeordnet. Beim Darstellungsbeispiel wird
dies dadurch erreicht, daß die
Volumen der ersten Dosierkammern 5 in einer Umfangsrichtung
zu- oder abnehmen
und die Volumina der zweiten Dosierkammern 5 in dieser Umfangsrichtung
umgekehrt ab- oder zunehmen. Dies gestattet eine Verdünnungsreihe
mit einem großen
Verdünnungsbereich – also insbesondere
von einem niedrigen Verdünnungsverhältnis bis
zu einem großen
Verdünnungsverhältnis, beispielsweise
von 1:1 bis 1:1000 – und/oder
eine sehr platzsparende, kompakte Anordnung der Dosierkammern 5, 9 mit entsprechend
geringem Platz- bzw. Flächenbedarf.
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Besonders
bevorzugt sind die Summen der Volumina der paarweise einander zugeordneten
ersten und zweiten Dosierkammern 5, 9 zumindest
im wesentlichen gleich. Auf diese Weise kann neben einem besonders
kompakten Aufbau erreicht werden, daß die einzelnen Volumina an
unterschiedlich verdünnter
Probenflüssigkeit 3 gleich
groß sind
und die Reaktionskammern 11 und eventuelle sonstige nachgeordnete
Kammern oder dgl. einheitlich groß ausgebildet sein können.
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In
der bisherigen und in der nachfolgenden Beschreibung wird immer
auf das jeweilige Volumen der Dosierkammern 5 bzw. 9 abgestellt.
Um genaue, definierte Verdünnungsverhältnisse
zu erhalten, sind genau definierte Volumina erforderlich. Damit
bei der Überführung der
Probenflüssigkeit 3 und
der Verdünnungsflüssigkeit 8 aus
den ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 in
die zugeordneten Reaktionskammern 11 jeweils nur definierte
Volumina der Flüssigkeiten 3, 8 vorliegen
und überführt und
gemischt werden, sind nicht dargestellte Ventileinrichtungen, Hindernisse
oder Flüssigkeitsstops,
beispielsweise zu den Verbindungen 12 hin, den Kanälen zugeordnete
Belüftungsöffnungen
und/oder dgl. vorgesehen. Hinsichtlich der erforderlichen und/oder
möglichen konstruktiven
Lösungen,
um definierte Volumina sicherzustellen und/oder geeignete Strukturen
und Anordnungen zum Aufteilen und/oder Mischen von Flüssigkeitsmengen
bereitzustellen, wird auf den eingangs genannten Stand der Technik
verwiesen, der hiermit diesbezüglich
ergänzend
als Offenbarung eingeführt
wird.
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Die
voranstehend erläuterte "parallele Verdünnung" gestattet die Erzeugung
einer Verdünnungsreihe
in einem einzigen Schritt, so daß allenfalls nur geringe Verdünnungsfehler
auftreten. Insbesondere kann so das bei der bisher üblichen,
sequentiellen Verdünnung
auftretende Problem der Summierung von Einzelfehlern vermieden werden.
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In
jeder Reaktionskammer 11 können dann eine gewünschte Reaktion
und insbesondere mehrere gewünschte
Reaktionen ablaufen bzw. durchgeführt werden, worauf später noch
näher eingegangen wird.
Zur Durchführung
des ELISA-Verfahrens werden die Reaktionskammern 11 vorzugsweise
vor Zuführung
der verdünnten
Probenflüssigkeit 3 zunächst vorbereitet.
Diese Vorbereitung erfolgt insbesondere vor dem Einfüllen der
Probenflüssigkeit 3 in
die erste Aufnahmekammer 4 und der Verdünnungsflüssigkeit 8 in die
zweite Aufnahmekammer 7 und wird nachfolgend näher erläutert.
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Die
Vorrichtung 1 weist vorzugsweise eine, insbesondere nur
eine einzige, gemeinsame Aufnahmekammer 13 zur Aufnahme
einer Flüssigkeit 14, insbesondere
sequentiellen Aufnahme verschiedener Flüssigkeiten 14, wie
einer Reaktionsflüssigkeit, einer
Waschflüssigkeit,
einer Fixierflüssigkeit,
einer Substratflüssigkeit
oder dgl., auf. Die Reaktionskammern 11 sind an die dritte Aufnahmekammer 13 angeschlossen,
so daß insbesondere
durch Druck-, Kapillar- und/oder Zentrifugalkräfte eine in die Aufnahmekammer 13 eingefüllte Flüssigkeit 14 über entsprechende
Kanäle
oder dgl. in die Reaktionskammern 11 strömen kann. Überschießende und/oder verdrängte Flüssigkeit 14 wird
vorzugsweise in einer optional vorgesehenen Sammelkammer 15 aufgefangen.
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Insbesondere
ist die Vorrichtung 1 derart ausgebildet, daß die dritte
Aufnahmekammer 13 zunächst
wieder vollständig
geleert wird oder geleert werden kann, bevor eine weitere Flüssigkeit 14 der dritten
Aufnahmekammer 13 – beispielsweise
durch Pipettieren – zugeführt wird.
Das Leeren der dritten Aufnahmekammer 13 kann beispielsweise
dadurch erreicht werden, daß nach
dem Füllen
der dritten Aufnahmekammer 13 mit einer Flüssigkeit 14 diese durch
Kapillarkräfte
selbsttätig
in die Reaktionskammern 11 und ggf. die Sammelkammer 15 durchströmt, bis
die dritte Aufnahmekammer 13 vollständig geleert ist. Zusätzlich oder
alternativ kann dies durch Zentrifugalkräfte, insbesondere entsprechende
Rotationen der Vorrichtung 1, oder sonstige Kräfte erreicht werden.
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Zusätzlich können auch
die Reaktionskammern 11 bei Bedarf zunächst wieder geleert werden, bevor
eine neue Flüssigkeit 14 in
die dritte Aufnahmekammer 13 eingefüllt wird und diese neue Flüssigkeit 14 in
die Reaktionskammern 11 strömt. Das vorherige Leeren der
Reaktionskammer 11 erfolgt dann vorzugsweise durch Zentrifugalkräfte, nicht
dargestellte Ventileinrichtungen oder dgl., um ein gesteuertes Leeren
der Reaktionskammern 11 zu ermöglichen.
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Zur
Vorbereitung der Reaktionskammer 11 für das ELISA-Verfahren wird
insbesondere zunächst eine
Flüssigkeit 14 mit
einem Reagenz, vorzugsweise einem Antikörper, in die dritte Aufnahmekammer 13 eingefüllt und
in die Reaktionskammern 11 geleitet, um das Reagenz in
den Reaktionskammern 11 zu immobilisieren, insbesondere
die Reaktionskammern 11 mit dem Antikörper zu beschichten.
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Nach
einer bestimmten Inkubations- bzw. Reaktionszeit werden die Reaktionskammern 11 mit einer
Waschflüssigkeit,
die als nächste
Flüssigkeit 14 in
die dritte Aufnahmekammer 13 gefüllt wird, gespült um ungebundenes
Reagenz zu entfernen.
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Mit
einer weiteren Flüssigkeit 14 folgt
bedarfsweise eine Blockierung bzw. Fixierung des immobilisierten
Reagenzes bzw. der immobilisierten Antikörper in den Reaktionskammern 11.
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Nach
einem ggf. nochmaligem Spülen
mit einer Waschflüssigkeit
und ggf. Leeren sind dann die Reaktionskammern 11 vorbereitet,
um die verdünnte Probenflüssigkeit 3 – also die
Probenflüssigkeit 3 und die
Verdünnungsflüssigkeit 8 aus
den zugeordneten ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 – aufzunehmen.
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Nach
dem Überführen der
Probenflüssigkeit 3 zusammen
mit der Verdünnungsflüssigkeit 8 in
die Reaktionskammern 11 kann die eigentliche Nachweisreaktion
bzw. eine erste Reaktion zur Untersuchung der Probenflüssigkeit 3 erfolgen.
Ein in der Probenflüssigkeit 3 enthaltener
Analyt kann an das immobilisierte Reagenz, insbesondere den immobilisierten
Antikörper,
binden. Nach einer vorzugsweise bestimmten Reaktionszeit wird nicht
gebundener Analyt aus den Reaktionskammern 11 gespült bzw. gewaschen,
insbesondere durch einmaliges Einfüllen einer Waschflüssigkeit 14 in
die dritte Aufnahmekammer 13, um die vorhandenen Flüssigkeiten 3, 8 aus
den Reaktionskammern 11 zu verdrängen, und/oder durch Zentrifugalkräfte oder
sonstige Kräfte.
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Anschließend wird
eine weitere Flüssigkeit 14,
die insbesondere ein an einen Nachweisantikörper gebundenes Enzym enthält, den
Reaktionskammern 11 zugeführt, indem diese Flüssigkeit 14 wiederum
der dritten Aufnahmekammer 13 zugeführt wird. Der Nachweisantikörper ist
derart ausgebildet, daß er
zusammen mit dem Enzym an den Komplexen bindet, die aus den immobilisierten
Antikörpern und
dem Analyten in den Reaktionskammern 11 gebildet sind.
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Ungebundene
Enzyme werden anschließend
in einem Waschschritt durch vorzugsweise einmaliges Zuführen einer
weiteren Waschflüssigkeit 14 aus
den Reaktionskammern 11 gespült.
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Schließlich wird
eine Substratlösung
als weitere Flüssigkeit 14 vorzugsweise
wiederum über
die dritte Aufnahmekammer 13 den Reaktionskammern 11 zugeführt. Das
Substrat wird von den Enzymen in den Reaktionskammern 11 in
einer enzymatischen Nachweisreaktion umgewandelt bzw. modifiziert,
so daß ein
später
nachweisbares Nachweissubstrat, insbesondere ein fluoreszierender
oder sonstiger Farbstoff oder dgl., gebildet wird. Auf das Anhalten der
Nachweisreaktionen in den Reaktionskammern 11 und die weitere
Untersuchung wird später
noch näher
eingegangen.
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Die
Zuführung
der verschiedenen Flüssigkeiten 14,
die vorzugsweise ausschließlich über die
gemeinsame dritte Aufnahmekammer 13 durch sequentielle
Zuführung
der Flüssigkeiten 14 erfolgt,
gestattet eine sehr schnelle und einfache Vorbereitung der Reaktionskammern 11 und/oder
Führung
der Reaktionen in den Reaktionskammern 11, wobei der Pipettieraufwand,
die erforderlichen Waschschritte und/oder die erforderlichen Flüssigkeitsmengen
gegenüber
dem Stand der Technik – insbesondere
gegenüber
dem herkömmlichen
ELISA-Verfahren in einer offenen Pipettierplatte – wesentlich
verringert werden.
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Bisher
wurden die in den Reaktionskammern 11 ablaufenden, bereits
genannten, insbesondere enzymatischen Nachweisreaktionen durch Zugabe von
Säure oder
dgl. angehalten. Dies ist grundsätzlich
auch bei der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 möglich.
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Vorzugsweise
erfolgt das Anhalten der Nachweisreaktionen jedoch mittels zusätzlich vorgesehener
Untersuchungskammern 16, indem die in den Reaktionskammern 11 befindliche
Flüssigkeit
mit dem Nachweissubstrat zum Anhalten der Nachweisreaktionen jeweils
in eine zugeordnete Untersuchungskammer 16 überführt wird.
Dieses Überführen erfolgt
vorzugsweise für
mehrere oder alle Reaktionskammern 11 gleichzeitig, so
daß die
Nachweisreaktionen zeitgleich angehalten werden. Insbesondere erfolgt
das genannte Überführen bzw.
Anhalten durch Zentrifugalleräfte,
indem die Vorrichtung 1 entsprechend rotiert wird. Jedoch
ist das Überführen zusätzlich oder
alternativ auch durch sonstige Kräfte, beispielsweise Druck-
oder Kapillarkräfte,
mittels entsprechender Ventile oder dgl. möglich.
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Das
genannten Überführen der
Flüssigkeiten aus
den Reaktionskammern 11, in denen die Enzyme und/oder sonstige
für die
Nachweisreaktionen erforderliche Reagenzien immobilisiert sind,
in die Untersuchungskammern 16 ermöglicht ein sehr einfaches und
hochgradig simultanes Anhalten der Nachweisreaktionen, so daß gegenüber dem
Stand der Technik ein wesentlich definierterer Verfahrensablauf
und damit eine wesentlich genauere Bestimmung des Analyten ermöglicht werden.
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Nach
der Überführung der
Flüssigkeiten
mit dem Nachweissubstrat in die Untersuchungskammern 16 kann
eine sequentielle Untersuchung bzw. Detektion des Nachweissubstrats
in den Untersuchungskammern 16 – insbesondere optisch, beispielsweise
durch Fluoreszenzmessung – erfolgen. Aus
den gewonnen Werten und unter Berücksichtigung der unterschiedlichen
Verdünnungsverhältnisse
kann dann eine äußerst genaue,
insbesondere quantitative Bestimmung des Analyten in der Probenflüssigkeit 3 erfolgen.
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Zusätzlich oder
alternativ kann den Reaktionskammern 11 auch ein optional
vorgesehener, in 1 gestrichelt angedeuteter Sammelkanal 17 zugeordnet
sein, der beispielsweise über
die Untersuchungskammern 16 und entsprechende, vorzugsweise
radiale Verbindungen 12 an die Reaktionskammern 11 angeschlossen
ist, um zur Leerung der Reaktionskammern 11 Flüssigkeiten)
aus den Reaktionskammern 11 aufzunehmen, insbesondere wenn die
Reaktionskammern 11 durch Zentrifugalkräfte durch entsprechendes Rotieren
der Vorrichtung 1 geleert werden. Diese Flüssigkeiten
können
dann durch die Untersuchungskammern 16 hindurch oder durch nicht
dargestellte, direkte Verbindungen oder dgl. in den Sammelkanal 17 ausgetragen
werden. Ein derartiges Leeren der Reaktionskammern 11 kann
beispielsweise zum Entfernen von Flüssigkeiten 3, 8 und/oder 14 vor
Zuführung
einer neuen Flüssigkeit 14 in
die Reaktionskammern 11 erfolgen.
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Hinsichtlich
der parallelen Verdünnung
ist anzumerken, daß vorzugsweise
in einem einzigen Verdünnungsschritt – also bei
einer parallelen Verdünnung – 3 bis 20,
insbesondere etwa 10 Verdünnungen bzw. unterschiedliche
Verdünnungsverhältnisse
erzeugt werden. Selbstverständlich
können auch
mehrere parallele Verdünnungen
gleichzeitig auf der Vorrichtung 1 erfolgen. Entspre chend
kann die Vorrichtung 1 bedarfsweise auch mehrere Anordnungen,
wie in 1 gezeigt, aufweisen.
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Nachfolgend
wird eine zweite Ausführungsform
der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 und
des vorschlagsgemäßen Verfahrens
anhand von 2 näher erläutert, wobei die nachfolgenden
Ausführungen
lediglich auf wesentliche Unterschiede gegenüber der ersten Ausführungsform
beschränkt
werden. Sonstige Vorteile, Aspekte und Eigenschaften ergeben sich
also in entsprechender Weise wie bei der ersten Ausführungsform.
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Bei
der Darstellung gemäß 2 wurde
auf die vorzugsweise vorgesehene Krümmung bei der vorzugsweise
vorgesehenen Ringstruktur zur Anordnung auf einer runden Scheibe,
wie einer CD oder dgl., weggelassen, um eine bessere Übersichtlichkeit zu
ermöglichen.
Weiter ist die Darstellung gemäß 2 ebenfalls
nicht maßstabsgerecht.
Insbesondere entsprechen die dargestellten Längen, Breiten, Größenverhältnisse
und dgl. nicht den unbedingt erforderlichen bzw. bevorzugten Verhältnissen.
Dies ist ebenso bei der Darstellung gemäß 1 der Fall.
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In 2 sind
aus Vereinfachungsgründen außerdem keine
Flüssigkeiten 3, 8, 14 dargestellt. Jedoch
gelten die diesbezüglichen
Ausführungen
bei der ersten Ausführungsform
und auch hinsichtlich des sonstigen Verfahrensablaufs entsprechend
für die
in 2 dargestellte, zweite Ausführungsform.
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Weiter
ist in 2 aus Vereinfachungsgründen der optionale Sammelkanal 17 weggelassen.
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Bei
der zweiten Ausführungsform
erfolgt im Gegensatz zu der ersten Ausführungsform nach der parallelen
Verdünnung
eine weitere Verdünnung, also
eine Unterverdünnung.
Diese weitere Verdünnung
ist bei dem in 2 gezeigten Darstellungsbeispiel
wiederum als parallele Verdünnung
ausgeführt. Beim
Darstellungsbeispiel erfolgt lediglich eine weitere Verdünnung nur
einer bereits einmal verdünnten Probenflüssigkeit
aus nur einer Reaktionskammer 11. Jedoch kann bedarfsweise
auch eine Unterverdünnung
bzw. weitere Verdünnung
für mehrere
oder alle Reaktionskammern 11 vorgesehen sein.
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Die
weiter parallele Verdünnung
erfolgt im wesentlichen entsprechend wie die bereits oben erläuterte parallele
Verdünnung
mittels der ersten und zweiten Dosierkammern 5 und 9 sowie
der nachgeordneten Reaktionskammern 11. Für die weitere
parallele Verdünnung
sind daher zusätzliche
erste Dosierkammern 5' und
zusätzliche
zweite Dosierkammern 9' sowie
zusätzliche
Reaktionskammern 11' vorgesehen.
Die zusätzlichen
Dosierkammern 5' und 9' weisen vorzugsweise
entsprechende Volumenverhältnisse – bei insbesondere
entsprechend verringertem Absolutvolumen – wie die ersten und zweiten
Dosierkammern 5 und 9 auf.
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Die
Zuführung
von bereits einmal verdünnter Probenflüssigkeit
in die zusätzlichen
ersten Dosierkammern 5' erfolgt
von der vorgeschalteten Reaktionskammer 11, die im Fall
der Weiterverdünnung
eigentlich nur eine Mischkammer darstellt. Den zusätzlichen
zweiten Dosierkammern 9' wird
wiederum Verdünnungsflüssigkeit 8,
insbesondere die überschüssige Verdünnungsflüssigkeit 8 für die erste
Verdünnung
zugeführt,
beispielsweise über
die Sammelkammer 10.
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Die Überführung der
einzelnen Flüssigkeitsvolumina
in die zugeordneten zusätzlichen
Reaktionskammern 11' erfolgt
wiederum vorzugsweise durch Zentrifugalkräfte. Jedoch können alternativ oder
zusätzlich
auch sonstige Kräfte,
insbesondere Druck- und/oder Kapillarkräfte wirken, bzw. Ventile oder
dgl. eingesetzt werden.
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Jedoch
kann für
die weitere Verdünnung auch
nochmals separat eine andere oder zusätzliche Verdünnungsflüssigkeit über eine
nicht dargestellte zusätzliche
Aufnahmekammer den zusätzlichen zweiten
Dosierkammern 9' zugeführt werden.
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Sofern
nur eine teilweise weitere Verdünnung
erfolgt, wie in 2 dargestellt, sind vorzugsweise
aber nicht zwingend auch denjenigen Reaktionskammern 11,
deren Inhalt nicht weiter verdünnt wird,
jeweils zusätzliche
Reaktionskammern 11' zugeordnet,
die insbesondere auf einen entsprechenden Umfang wie die der weiteren
Verdünnung
dienenden zusätzlichen
Reaktionskammern 11' angeordnet
sind, um für
alle Verdünnungsstufen
eine gleichzei tige Untersuchung, insbesondere Bindung des Analyten
an das immobilisierte Reagenz, sicherzustellen bzw. zu erleichtern.
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Optional
kann auch eine zusätzliche
erste Sammelkammer 6' vorgesehen
sein, die zur Aufnahme von überschüssiger Probenflüssigkeit 3 an
die zusätzlichen
erste Dosierkammern 5' angeschlossen ist.
Optional kann auch eine zusätzliche
zweite Sammelkammer 10' vorgeschlossen
sein, die zur Aufnahme von überschüssiger Verdünnungsflüssigkeit 8 an die
zusätzlichen
zweiten Dosierkammern 9' angeordnet
ist.
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Der
Durchmesser der Vorrichtung 1 bzw. der CD, beträgt vorzugsweise
etwa 50 bis 250 mm, insbesondere etwa 125 mm. Die Dicke beträgt vorzugsweise
1 bis 6 mm, insbesondere etwa 3 mm. Die Vorrichtung 1 ist
vorzugsweise aus einem geeigneten Kunststoff hergestellt.
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Die
Tiefe bzw. Breite der Mikrostrukturen, also insbesondere der beschriebenen
Kammern, Kanäle,
Verbindungen und dgl. beträgt
beim Darstellungsbeispiel vorzugsweise 20 bis 1000 μm, insbesondere
etwa 200 μm.
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Alle
Mikrostrukturen sind vorzugsweise durch eine geeignete, nicht dargestellte
bzw. transparente Abdeckung überdeckt.
Lediglich die Aufnahmekammern 3, 7 und 13,
ggf. die Sammelkammern 6, 10, 15 bedarfsweise
der Sammelkanal 17 und/oder sonstige nicht dargestellte
Entlüftungsöffnungen oder
dgl. sind nach außen
hin offen ausgebildet. So können
die Verdunstungsverluste minimiert und dementsprechend mit hoher
Genauigkeit mit geringen Flüssigkeitsvolumina
gearbeitet werden.
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Die
einzusetzenden Volumen an Flüssigkeiten
betragen pro Flüssigkeit
etwa 10 bis 2.000 μl,
vorzugsweise nur etwa 50 bis 200 μl.
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Die
Summe der Volumina der paarweise zugeordneten ersten und zweiten
Dosierkammern 5, 9 beträgt vorzugsweise 1 bis 100 μl, insbesondere etwa
10 μl. Entsprechendes
gilt für
die Volumina der Reaktionskammern 11 und der Untersuchungskammern 16.
Insbesondere sind die genannte Summe und die jeweiligen Volumina
der Reaktionskammern 11 und der Untersuchungskammern 16 gleich.
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Mit
der vorschlagsgemäßen Vorrichtung 1 und
dem vorschlagsgemäßen Verfahren
kann das ELISA-Verfahren oder ein sonstiges Verfahren sehr einfach
und sehr schnell und insbesondere unter Einsatz von sehr geringen
Flüssigkeitsmengen
und damit auch kostengünstig
durchgeführt
werden. Des weiteren wird eine Minimierung der erforderlichen Pipettierschritte
oder sonstiger Vorgänge
zur Zuführung
von Flüssigkeiten
ermöglicht.
Insbesondere wird eine sehr genaue Untersuchung in Form einer genauen
quantitativen Bestimmung eines Analyten in der Probenflüssigkeit
ermöglicht.