WO2014009066A1 - Verfahren und analysevorrichtung zur mikroskopischen untersuchung eines gewebeschnittes oder eines zellausstrichs - Google Patents

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Winfried STÖCKER
Norbert Rottmann
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Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag
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Definitions

  • the invention relates to a device and a method for the immunological and / or histochemical examination of patient samples, which are in the form of tissue sections and / or cells.
  • patient samples which are in the form of tissue sections and / or cells.
  • the respective patient samples after their fixation on a substrate support and subsequent staining with the aid of a suitable reactant, are subjected to a microscopic examination.
  • tissue sections or cells are first stained and then the stained structures are examined in the context of a report.
  • tissue sections are produced and assessed on the microscope.
  • Specimens used in histological work include, in particular, surgical specimens, specimen excisions and biopsied tissue, the primary aim of which is to examine such stained tissue sections for the reliable detection and typing of tumors.
  • EP 0 238 190 B1 discloses a method for producing a multiplicity of tissue preparations, in which a group of cylindrical tissue rods of relatively large length, up to 10 mm, and small cross-sectional area, approximately 1 mm 2, are initially made of a piece of tissue , is cut out or punched out. These tissue rods are arranged parallel to each other and tightly packed in a sheath.
  • the sheath which is preferably obtained from parts of the rabbit's small intestine, is wrapped tightly around the tissue rods and tied by means of a wire. The ends of the resulting cylindrical bundle of tissue rods are cut so that the ends of all tissue rods are exposed at the ends of the sheath.
  • tissue sections are produced in a short time with the known method, it is only possible with relatively great effort to arrange tissue sections from different regions of a tissue piece on a slide or to examine them simultaneously.
  • the problem with the described technical solution is that it is possible only with relatively great effort to arrange tissue sections from different areas of a piece of tissue on a slide exactly as it would be desirable for a quick and effective investigation.
  • EP 0 350 189 B1 discloses a multiple sample carrier for use in immunohistological examination methods.
  • the described sample carrier is characterized in that a plurality of samples are applied to one another object-spaced from one another in order to enable an improved automated image analysis.
  • a plurality of tissue sample fragments are arranged almost equidistantly in a rectangular pattern, with associated sample fragments being combined in a section of the substrate carrier as a function of specific sample properties.
  • a flexible arrangement of sample fragments which allows a needs-based placement of substrate carriers, so that the assembly is changed, for example, depending on a planned step in the laboratory, however, is not feasible with the described technical solution.
  • the invention has the object, a device and a method for examining patient samples, in particular of tissue sections to further develop such that on the one hand a reliable and on the other hand in terms of cost and the time required optimized examination of a patient sample is possible.
  • the aim is to be able to increase the degree of flexibility and automation in a laboratory, while at the same time enabling reliable provision, staining, examination and archiving of different patient samples. It is of particular importance to be able to offer a solution that ensures a flexible and always adapted to the requirements of a laboratory arrangement of the samples to be examined.
  • a device for immunological and / or histochemical examination of patient samples which are in the form of tissue sections and / or cells, with at least one substrate support for applying at least one of the patient samples and with at least one holder, which can be equipped with at least one substrate carrier, so have been further developed that means are provided by the placement of the holder with at least one substrate carrier after performing at least one laboratory working step is variable.
  • the invention is thus based on the essential idea that the arrangement of patient samples in the period between the provision of the samples to archiving is not rigid, but always the requirements in the laboratory, in particular the workflows, is customizable. The arrangement or the composition of the individual patient samples can thus be changed between the steps in the laboratory.
  • a holder is provided in or on which at least one substrate carrier can be fastened as required, wherein one or more samples with different properties can be arranged on a substrate carrier.
  • a holder is provided for receiving at least one substrate carrier or holders of different embodiments are provided, which are designed, for example, specifically for the requirements during the incubation, the microscopic examination or the archiving of the samples.
  • the individual samples are arranged in a different form, for example as a comparatively large tissue section or else in the form of different, miniaturized biochips on a substrate carrier.
  • a carrier preferably made of optically transparent material, understood, on the one hand is large enough, a group of Samples, in particular of biochips, so substrates of glass or plastic with samples arranged thereon, but on the other hand, is much smaller than a standard slide. Also, a substrate carrier according to the invention is thinner than conventional slides. This miniaturization of the substrate supports, preferably together with the biochip fragmentation technique, allows flexible formation of groups in the assembly of the samples. In principle, it is conceivable to use plastic, in particular a plastic film, instead of glass as the carrier substrate of a biochip, ie substrate on which the tissue or cells to be examined are located.
  • the samples can be grouped very flexibly according to the sample size and the requirements of the analytical process in meaningful combination groups of samples on the substrate carrier.
  • the substrate carriers can be put together into meaningful groups which are then used together for processing the samples, in particular for incubation or dyeing, but also for generating images of the samples, for visual examination with subsequent examination of the samples and / or for archiving the samples be releasably attached to a holder.
  • releasable attachment is understood in this context that the holder and at least one substrate carrier can be separated from each other and non-destructively connected to each other again.
  • samples of different patients which are the same or at least similar to be colored, can be processed simultaneously, for subsequent evaluation, the substrate carriers are then in a modified arrangement in a holder of a second type, in particular Preferably, the samples are now arranged in such a way in the holder, that all differently colored samples of a patient are in a common frame and comparatively easy to report a Untersuchsein it, in particular a microscope, can be supplied.
  • the holder has at least one surface on which a substrate carrier can be placed at least in regions. It is also conceivable that the holder and / or the substrate carrier has at least one fastening element, via which a detachable connection between holder and substrate carrier can be produced. Such a fastening element is preferably designed as a latching, clamping or snap element. In any case, repeated loosening and joining of Substrate carrier and holder easily, and without causing damage to these components, be possible.
  • the at least one holder is designed as an incubation holder.
  • the incubation holder in this case absorbs at least one substrate carrier during an incubation.
  • the incubation holder has at least one fluid intake into which at least one of the patient samples is immersed during incubation such that the patient sample is at least temporarily brought into contact with a fluid in the fluid intake.
  • the shape of the liquid intake depends on how many substrate carriers are to be immersed in a receptacle and / or on the size and shape of a substrate carrier They may be separate and mutually delimited receptacles for the liquid required in each case, or different or different types of liquids may be introduced in different channels or troughs of an incubation holder.
  • a gutter or tub is designed such that leakage of liquid from the gutter or tub is reliably prevented.
  • the liquid receptacles are designed such that the volume of the recordings is greater than that of the respectively filled liquid.
  • a further advantageous design of the liquid receptacles provides a profile in the recordings, which serves to guide the liquid, in particular in the longitudinal direction of the liquid receptacles.
  • at least one suitable deflecting element may be present, which causes an additional movement, a deflection and / or a mixing of the liquid during a movement of a liquid in a liquid receptacle.
  • the incubation holders used are preferably made of a material containing macroion or aluminum.
  • Such a relative movement can optionally be realized by a movement of the substrate carrier and / or an incubation holder or by providing a movement means, in particular a pump or a suction, which at least temporarily puts the liquid into a flow movement.
  • a movement means in particular a pump or a suction
  • the substrate carrier and the incubation holder receiving it are set into a pivoting movement during the incubation, so that a relative movement takes place between the liquid due to this movement.
  • the movement takes place while the holder or the incubation holder and the at least one substrate carrier are in a relative to each other fixed position.
  • the holder is designed as a diagnostic frame.
  • the diagnostic frame here has means for attaching at least one substrate carrier during the diagnosis. It is essential that the substrate carrier with the samples arranged thereon is reliably held within the holder and safely together with this an examination unit, in particular a microscope, can be fed.
  • a cover is provided which is arranged between an optic of the examination unit and the sample.
  • the at least one sample arranged on a substrate carrier is covered with a cover glass, wherein a mounting medium is located between the sample and the cover glass.
  • the substrate carrier has suitable stop surfaces on which the cover rests securely.
  • the cover is placed after completed incubation of the sample and remains both during the visual examination and the subsequent archiving on the substrate support or on the sample.
  • the sample is arranged on the substrate carrier within a depression.
  • the depression can in this case be designed such that the cover rests circumferentially on an edge surrounding the depression.
  • a further embodiment of the device according to the invention provides that at least one of the substrate carriers has a sample-specific identifier with an identification code which is stored in a control unit.
  • an identifier is preferably a one-dimensional or multidimensional bar code or an RFID tag, so that a link to information about the samples present on the substrate carrier can be reliably produced in a control unit or a laboratory data management system.
  • samples of the same origin in particular of a patient, or samples of different origin, that is to say of different patients, are applied to a substrate carrier.
  • the samples are assembled on a substrate carrier as a function of an optimization criterion.
  • the combination or functional groups are here, for example, taking into account the origin of the tissue samples from organs and / or patients, composed of the staining protocols to be performed and / or the antigens or biomarkers to be detected. If, for example, one or more markers for breast cancer are to be detected for several patients, then it makes sense to arrange biochips from areas of the total incision of a patient on a substrate carrier in which the same marker is to be detected. It is also conceivable to arrange tissue samples from different organs of a patient on a microscope slide, which should undergo the same staining protocols.
  • substrate carriers are assembled in a targeted manner into a functional group, fastened in a holder and assigned to an incubation holder conditioned specifically for the selected functional group. If similar staining protocols are provided for the markers to be detected, then the substrate carriers can pass through the staining protocols in the various grooves of an incubation holder. Further incubation holders need only be resorted to as soon as the staining protocols differ.
  • the substrate carriers are also compiled for finding, evaluating and archiving in special functional groups in a special holder, in particular a diagnostic frame.
  • a special holder in particular a diagnostic frame.
  • the samples of a patient who have been separated for incubation can be arranged next to one another again and fastened together on or in a holder, supplied to a microscope and examined visually.
  • An annoying change of slides during microscopy to evaluate the staining of multiple markers for example, only one patient, is not necessary, because these samples are all side by side and / or one above the other in a holder.
  • the invention also relates to a method for immunological and / or histochemical examination of patient samples, in which both at least one patient sample in the form of a tissue section and / or provided in the form of cells and applied to a substrate carrier and at least one substrate carrier indirectly or is directly connected to a holder, and which is characterized in that an assembly of the holder with at least one
  • Substrate carrier is changed after performing at least one laboratory working step. It is essential to the method according to the invention that an effective examination of samples is made possible by the use of substrate carriers, which can be flexibly assembled and arranged in a holder. Advantageously, it is possible that a first assignment for the incubation or staining of the samples and a second assignment for the visual examination of the samples is generated, so that there is always an effective processing of the samples.
  • the samples or the substrate carriers are preferably arranged such that the assignment with respect to the incubation takes place with consideration of the antibodies, antigens or the selected biomarkers to be detected, while the assignment for the visual examination and archiving of the samples takes into account the origin of the samples ,
  • "origin” is to be understood as meaning, in particular, the affiliation of a sample to a patient or a type of tissue.
  • the incubation takes place, in which the sample arranged on a substrate carrier is immersed in a liquid in which a special reactant is provided.
  • a relative movement between the liquid and the sample is particularly preferably generated.
  • This relative movement can be brought about, for example, by the holder being displaced together with an incubation holder having a plurality of channel-shaped liquid receptacles in which the samples are immersed upside down in a pivoting movement about a longitudinal axis of the holder together with the at least one substrate carrier attached thereto ,
  • the liquid located in the channels flows back and forth with the at least one reagent, so that intimate contact between the incubated samples and the liquid on the one hand and strong mixing of the liquid on the other hand occur.
  • the substrate carriers are in this case preferably arranged in the holder transversely to its longitudinal axis.
  • FIG. 1 substrate carrier with samples of biological material arranged thereon;
  • FIG. 1 substrate carrier with samples of biological material arranged thereon;
  • Fig. 2 Various arrangements of samples of biological material
  • Fig. 3 holder in the form of a diagnostic frame with populated substrate carriers in different views;
  • Fig. 4 Representation of different types of equipment of a holder form of a
  • Fig. 5 Top view of a tray with a plurality of holders
  • Fig. 6 Different views of a holder type incubation holder with trough-shaped
  • Fig. 7 Schematic representation of the incubation of substrate carriers with samples of biological material used in trough-shaped liquid receptacles of a
  • Incubation holder are arranged;
  • FIG. 8 shows various views of a holder in the form of an incubation holder with a trough-shaped liquid intake
  • Fig. 10 Detail view of a fastener between the holder and the substrate carrier.
  • substrate carriers 1 which are significantly smaller than conventional microscope slides.
  • substrate carriers 1 which are also referred to below as magnum chips, are preferably provided with more than one sample 2 and / or with more than one biochip, ie a biological material-coated fragment 3, which in the case described is made of glass. But it can also be made of a suitable plastic. In principle, however, the substrate carriers 1 described can have different sizes, the size always being adapted to the requirements.
  • FIG. 1 a shows a plan view and an oblique view of the substrate carrier 1, while FIG. 1 b shows an enlarged detail view of the detail "A"
  • Magnum chip has a size of 6 ⁇ 19 ⁇ 0.6 mm
  • On the substrate carrier 1 according to Figure 1 a four samples of biological material 2 are arranged, which are paraffinized tissue sections, which are applied to glass fragments 3. Die Glasfragmente 3 with the paraffinized tissue sections represent so-called biochips 2, which allow a preferred provision, handling and examination of biological material have a surface area of 3.3 x 3.3 mm 2 .
  • the glass fragments 3 of the biochips 2 have a thickness of 0.15 mm, while the tissue sections have a thickness of about 0.004 mm.
  • Each biochip 2 located on the substrate carrier represents an independent sample, which can be omitted or replaced by another sample and / or another biochip, depending on the examination requirements.
  • an identifier 4 in the form of a 2D barcode is provided at one end of the substrate carrier 1, wherein the tissue sections are arranged on the respective glass fragment 3.
  • This identifier 4 contains all the information about the sample 2 required for the examination, in particular the type of tissue and the origin of the tissue, in order to identify the samples 2.
  • a corresponding identification code is stored in a central control unit for each sample 2. Both in the assembly of the substrate carrier 1 and in the incubation, examination, diagnosis and archiving of the samples 2, this identification code is taken into account.
  • the control unit is designed in this context such that at least the incubation and the delivery of the samples to a microscopic examination unit are automatically controlled.
  • FIG. 1 b shows in a greatly enlarged detail view the detail "A" -shown here is a biochip 2 arranged on the substrate carrier 1.
  • Biological material in the form of a tissue section is arranged on the actual chip 3, which is embodied as a glass fragment b illustrates the size ratio of the thickness of the glass fragment 3 on the one hand to the thickness of the tissue section 5 on the other.
  • the theoretically usable surface of a standard slide corresponds approximately to seventeen times the surface of the substrate carrier 1 or magnum chip used.
  • the capacity of four samples 2 on a comparatively small, barcode-carrying substrate carrier 1 is particularly well suited for the typical requirements of a histopathological diagnostic laboratory, for example in tumor diagnostics.
  • a large number of samples 2 of different patients can be dyed rationally, effectively and flexibly;
  • the individual biochips 2 of 3.33 ⁇ 3.33 mm 2 are still large enough to be evaluated by one or two in most questions small number of biochips to ensure optimal diagnosis.
  • FIG. 2a shows a substrate carrier 1 with the dimensions according to FIG. 1, on which not a plurality of samples 2 but rather a sample is arranged.
  • FIG. 2b shows, by way of example, special combinations of differently equipped substrate carriers 1 in a holder 6, wherein the type of a sample, the dimensions of the biochips and / or the size and number of samples per substrate carrier 1 can always be adjusted as required, in principle To make optimum use of the advantages of the invention.
  • the method described here and all devices can be adapted comparatively easily.
  • FIG. 2 a shows a substrate carrier 1 on which a 2D barcode is attached as identification 4 and on which a tissue section is located.
  • the Substrate carrier 1 the dimensions 48 x 19 x 0.6 mm 3 on.
  • the use of large-area tissue sections in addition to smaller tissue samples is quite useful for certain applications in the field of medical diagnostics, in particular in the field of histology or histopathology.
  • the substrate carrier 1 in turn has suitable fastening means 16 so that it can be fastened in a holder 6.
  • FIG. 2 b shows an arrangement of various substrate carriers 1, which can be assembled in a preferred manner and fastened in a holder 6.
  • the substrate carriers 1 have either tissue sections of different number and size or an arrangement of biochips 2.
  • the combination of the required substrate carrier 1 with the samples 2 biological material thereon is made as needed and can always meet the requirements of the investigation and / or the work progress, in particular Dependence of the next required work step to be adapted in the laboratory.
  • FIG. 3 a shows a plan view of a holder 6, which is designed in the form of a diagnostic frame, and to which ten substrate carriers 1 are fastened.
  • Such a holder is preferably used to supply already processed, in particular stained patient samples to a visual examination and / or archiving.
  • the holder 6 is designed in the form of a frame to which the substrate carriers 1 are releasably secured by means of suitable fastening elements 16.
  • the substrate carriers 1 are arranged transversely to the longitudinal direction of the holder 6 and have an identifier 4, which is designed as a 2D code, and in each case via four samples 2 of biological material, which are arranged on corresponding adhesion surfaces of the substrate carrier 1.
  • an identifier 7 is provided in the form of a 2D code, so that the holder 6 with the substrate carriers 1 and samples therein can be identified at any time unambiguously and is thus reliably supplied to the required operation and / or archiving ,
  • FIGS. 3b to 3d show the holder 6 according to FIG. 3a with the substrate carriers 1 fastened thereto in sectional or detailed views.
  • 3b shows a view along the section "A - A", which runs centrally in the longitudinal direction of a substrate carrier 1 and transversely to the longitudinal axis of the holder 6.
  • Four samples 2 are arranged on the substrate carrier 1 in the longitudinal direction of the substrate carrier 1.
  • FIG an identifier 4 is applied at one end, which permits unambiguous identification of the substrate carrier 1 and of the samples 2 located thereon.
  • the samples of biological material in the exemplary embodiment shown are tissue sections which are examined for the presence of specific tumor cells and / or tumor markers should.
  • FIG. 3c shows detail "A" in an enlarged detail view, clearly showing the substrate carrier 1 with the biochip 2 thereon, on which the tissue section intended for an examination is located, the substrate carrier 1 including the one arranged thereon
  • the tissue section-bearing biochip 2 is covered by a cover 8 in the form of a cover glass matched in its size to the surface of the holder 6 fitted with substrate carriers 1. Between the cover 8, which rests on its outer periphery in the edge region of the holder 6, and the samples 2 There is a mounting medium required for the visual inspection of Samples 2.
  • FIG. 3 shows the detail "B" also in an enlarged detail view: While the biochip 2 rests on the substrate carrier 1 with its supporting glass substrate 3, a sample 2 of biological material in the form of a tissue section is located on the surface Tissue section is covered by a cover 8, wherein between cover 8 and biochip 2 a Eindeckmedium is provided.
  • the inventively provided holder 6 offers the advantage that the substrate carrier 1 can be put together again in other functional groups after staining with the samples 2 or biochips thereon.
  • the substrate carriers 1 can be assembled with the samples of a patient, even though these samples previously passed through different staining protocols, and thus were assigned to other functional groups during the staining process.
  • the substrate carriers 1 are fixed at least temporarily and detachably, e.g. through the use of clips.
  • the holder 6 is an aluminum frame, on which a cover 8 is applied in the form of a cover glass. On this cover glass, the substrate carrier 1 from the bottom, ie virtually overhead, glued.
  • the size of the holder 6 shown corresponds to the size of a conventional normalized slide, so that this holder 6 together with commercially available microscopes, the are aligned on conventional slides, can be used.
  • the size of the holder 6 predetermines the size of the substrate carrier 1, in particular how many magnum chips 1 equipped with biochips 2 and / or macrochips with large-area tissue sections can be arranged together.
  • the dimensions are preferably selected such that ten substrate carriers 1 or magnum chips equipped with biochips 2 are arranged in a holder 6.
  • This holder 6 allows containers for storage of conventional slides also for storage of the holder 6, optionally together with or separately from conventional slides, can be used.
  • Figures 4a to 4c show in an illustrative form in each case a holder 6 in the form of a diagnostic frame with substrate carriers 1 fastened therein, wherein the substrate carriers 1 are adapted to the respective examination requirements with respect to their size and placement.
  • a holder 6 is preferably used to supply already processed patient samples for visual examination and / or archiving.
  • the arrangement of the samples 2 on the substrate carriers and the substrate carrier 1 within the holder 6 were in this case made such that a visual evaluation of the samples 2 can be made particularly effective. In particular, the required travel paths between the individual samples 2 and the focal plane of a microscope used for the examination are minimized.
  • At least one assignment is generated in a controller on the basis of the required examinations and of an analysis plan, according to which the placement of the substrate carriers 1 and the holder 6 takes place.
  • an assignment is created specifically for each working step during the processing and examination of the samples and taken into account in the execution of the individual examination steps.
  • FIG. 4a While in the holder 6 shown in FIG. 4a ten substrate carriers 1 are fixed with samples 2 arranged in the form of biochips, larger holders 1 are provided in the holders 6 according to FIGS. 4b and 4c in addition to substrate carriers 1 with biochips 2 large-area tissue sections have been applied.
  • the substrate carriers 1 in the holder 6 according to FIG. 4a each have a control 9 and two or three biochips 2 with tissue sections.
  • the arrangement of the tissue sections on the substrate carriers 1 and within the holder 6 was carried out as a function of their affiliation to the samples P1 to P4.
  • the assignment of the individual Tissue sections to discrete single examination sites on the substrate carriers 1 and within the holder 6 was generated using laboratory software.
  • FIG. 5 shows a tray 10, in which in turn a plurality of holders 6 are combined with the substrate carriers 1 fastened therein.
  • a tray 10 may be preferably fed to the microscope stage of a microscope for the visual inspection of the individual samples 2.
  • it is suitable for an advantageous, especially space-saving archiving of the samples 2. Due to the identifiers 4, 7, 1 1, which are provided on the substrate carriers 1, the holders 6 and the tray 10, at any time a unique identification of the individual Samples 2 possible.
  • FIG. 6 shows a holder 6 in the form of a special incubation holder 12 with which the samples 2, in this case tissue sections, fixed on the substrate carriers 1 or magnum chips are brought into contact with the required reactants and / or rinsing liquids in an effective and readily reproducible manner.
  • FIG. 6a shows an incubation holder 12 in an oblique view
  • FIG. 6b shows the same incubation holder 12 in a top view and a longitudinal "A-A" and a cross-section "B-B" of the incubation holder 12.
  • the incubation holder 12 has a plurality of, in the example shown, five liquid receptacles 13 in the form of grooves.
  • the gutters are hereby arranged in parallel in the body of the incubation holder 12 and provided in each case for receiving a sample carrier 2 equipped with substrate carrier 1 and a magnum chip.
  • the incubation holder 12 with five grooves 13 is an advantageous embodiment, so that in this case a group of five substrate carriers 1 with the samples 2 thereon undergoes a multiplicity of working steps in the laboratory.
  • five substrate carriers 1 each having four biochips 2 are provided so that the incubation holder 12 comprises a total of 20 independent samples 2.
  • These samples 2 undergo time-synchronous the entire processing steps, in particular an incubation with a descending alcohol series medium, an immunohistochemical staining and an incubation with an ascending alcohol series medium.
  • FIG. 6 the incubation of the samples 2 is shown in FIG.
  • the incubation holder 12 and the substrate carrier 1 shown correspond to those which have been explained in connection with FIG.
  • the incubation is preferably carried out (see FIGS. 7a to 7c) by placing the incubation holder 12 after the substrate carriers 1 have been inserted into the channels 13 and the one required Liquid 14 has been filled into the grooves 13, is placed in a pivoting movement about its longitudinal axis.
  • the liquid 14 in this case runs back and forth in the individual channels 13, whereby a thorough mixing of the liquid 14 is ensured and intimate contact between the samples 2 and the liquid 14 takes place.
  • the gutters also protrude on both sides beyond the end of the substrate carrier 1, so that in this area an additional reservoir 15 is located, in which excess liquid collects before it flows back to the other side.
  • the channel bottom is inclined in the longitudinal and in the transverse direction, so that a slight trough shape is created.
  • the inclination in the groove longitudinal direction is clearly to be taken from the view of the section "B - B" in Figure 6b.
  • a metered addition and / or removal of a liquid 14 into or out of the grooves 13 is usually carried out in the area of the additional reservoirs 15.
  • the incubation of the samples 2 is shown in detail in FIG.
  • the illustrated incubation holder 12 as well as the substrate carriers 1 correspond to those which have been explained in connection with FIG.
  • the incubation of the samples 2 takes place by moving the incubation holder 12 with the substrate carriers 12 contained in the channels 13 or trays in such a way that the liquid flows alternately into the two longitudinal directions of the channels 13 or trays emotional.
  • the reactions in the tissue sections incubated in this way are remarkably uniform because the reactants in the liquid are constantly mixed.
  • FIG. 8 shows an alternative embodiment of an incubation holder 12.
  • the latter does not have individual grooves as liquid receptacles 14, but has a comparatively large trough.
  • Substrate carriers 1 are preferably incubated with an incubation holder 12 of this type, on which large-area tissue sections are located in comparison to the biochips 2. Incidentally, the incubation is carried out by pivoting the incubation holder 12 here as well.
  • each of the patient samples for each of the requested antibodies would have to have at least one section grown on each slide:
  • substrate carriers each with a biochip of 4 lung cancer samples 10 substrate carrier
  • substrate carrier 1 For equipping the substrate carrier 1, if the biopsy of the potential tumor is sufficiently large (larger than 7 ⁇ 7 mm) and the biopsate in the HE overview stain is sufficiently homogeneous, it may be sufficient to use only one incision to obtain a biochip therefrom 2 to produce
  • Figure 9 shows a holder 6 which is attached to a receptacle or placed on a tray and with the aid of the receptacle or the tray about its longitudinal axis 17 is pivotable.
  • the longitudinal axis 17, by which the holder 6 is pivoted at least temporarily in the direction of the arrow during an incubation, is shown in phantom in FIG.
  • Fastening elements 16 are again provided on the frame-shaped holder 6, via which a plurality of substrate carriers 1 with the samples 2 arranged thereon, in this case tissue sections, can be detachably attached to the holder 6 in a non-destructive manner. It is possible to arrange only one or more, in the illustrated embodiment, up to eight, substrate carrier 1 side by side and to attach to the holder 6.
  • the substrate carriers 1 are arranged transversely to the pivot axis 17, so that after Contacting the samples 2 with a liquid 14, the liquid 14 due to the pivotal movement parallel to the longitudinal axis of the substrate carrier 1, the sample 2 overflows, thus it comes to a forced relative movement between the liquid 14 and the respective sample 2.
  • the incubation takes place, as shown for example in FIG. 7, by submerging the samples 2 arranged on the substrate carriers 1 quasi head-on in the liquid 14.
  • the liquid 14 intended for incubation or washing is located within a liquid receptacle 13 of an incubation holder 12 designed as a trough or trough, which is finally set into a pivoting movement together with the holder 6 and the substrate carriers 1 fastened thereto.
  • a suitably suitable incubation holder 12 with grooves is shown in FIG. 6 and with a trough in FIG.
  • the holder 6 is placed accordingly on the incubation holder 12 or releasably secured thereto.
  • the liquid 14 flows back and forth due to the pivoting movement within the tub or the channels of the incubation holder 12, so that on the one hand the liquid 14 is always well mixed and on the other hand to an intimate contact between the samples 2 adhering to the substrate carrier 1 and the liquid 14th , in particular a reactant or a washing liquid comes.
  • the substrate carriers 1 can be equipped very flexibly with regard to the number and the design of the samples 2. In the illustrated embodiment, there are either up to five tissue sections drawn on glass fragments 3, which occupy a square base area, or larger tissue sections on a substrate carrier 1. It is clear that the illustrated arrangement of flexibly stockable substrate carriers 1 in a holder 6 allows a plurality of different mounting variants of the holder 6. Depending on the need for the planned examination, the individual samples 2 are arranged in such a way that in particular the demand for the reactants required for the incubation is minimized. In this connection, the swiveling movement carried out during the incubation ensures that, on the one hand, there is always an intimate contact between the reactants and the samples 2 and, on the other hand, that the reactants used are well mixed.
  • the use of a device for flexible attachment of substrate carriers 1, which is embodied in the manner of the holder 6 shown in FIG. 9, furthermore offers the advantage that a combination of substrate carriers 1 which can be selected as required can be relatively easily moved, provided, incubated with respect to one another in their entirety Investigation unit can be positioned and / or archived. Nevertheless, the system is characterized by a particular flexibility, since the composition of substrate carriers 1 in a holder 6 can be changed easily and at any time and adapted to changing needs.
  • both the individual substrate carriers 1, the so-called magnum chips, and the holder 6 have an identification 4, 7 in FIG Shape of a barcode, preferably a data matrix code.
  • an identification 4, 7 in FIG Shape of a barcode preferably a data matrix code.
  • the samples 2 can be clearly identified, located and fed to the desired method step at any time with the aid of laboratory software and the information stored in a laboratory control.
  • 9 shows in detail the detail "A" marked in FIG. 9. It can be clearly seen that at least one fastening element 16 is provided by means of which a substrate carrier 1 can be simply and reliably connected to the holder 6.
  • the fastening element 16 has a coupling point to which, for example by means of a detent or clip element, a secure and yet detachable connection between the holder 6 and a substrate carrier 1 equipped with samples 2 can be produced
  • the fastening element 16 is designed in such a way that unintentional release of the connection, in particular during the pivoting operation and also after a relatively long time, is reliably precluded. that a different Number of substrate carriers 1 in a simple manner, quickly, safely and still be arranged with very high flexibility as a whole in a holder 6.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur mikroskopischen Untersuchung von Patientenproben, die aus Gewebe oder Zellen bestehen. Typischerweise werden, insbesondere auf dem Gebiet der Tumordiagnostik, die gesamten Proben oder ausgewählte Teilbereiche, deren Untersuchung von besonderem Interesse ist, zunächst einzeln oder in Gruppen auf Substratträgern arrangiert. Diese Substratträger werden dann einzeln oder zusammen mit weiteren Substratträgern jeweils in Haltern angeordnet, in denen sie eine definierte Folge von Prozessschritten durchlaufen. Wesentlich hierbei ist, dass die Substratträger mit den Patientenproben zum einen sicher in den Haltern fixiert sind und zum anderen für nachfolgende Laborarbeitsschritte umsortiert werden können. Dabei bilden die Patientenproben für jeden Laborarbeitsschritt Kombinationsgruppen, die parallel behandelt oder gemeinsam bewegt werden.

Description

Verfahren und Analysevorrichtung zur mikroskopischen Untersuchung eines Gewebeschnittes oder eines Zellausstrichs
Technisches Gebiet:
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur immunologischen und/oder histochemischen Untersuchung von Patientenproben, die in Form von Gewebeschnitten und/oder Zellen vorliegen. Die jeweiligen Patientenproben werden nach ihrer Fixierung auf einem Substratträger und anschließender Anfärbung mit Hilfe eines geeigneten Reaktanten einer mikroskopischen Untersuchung zur Befundung zugeführt.
Stand der Technik:
Auf dem Gebiet der Labordiagnostik sind verschiedene Analyseverfahren bekannt, bei denen jeweils Patientenproben in Form von Gewebeschnitten oder Zellen zunächst angefärbt und dann die angefärbten Strukturen im Rahmen einer Befunderstellung untersucht werden. Insbesondere im Bereich der Histologie bzw. Histopathologie werden mikrometerdünne, gefärbte Gewebsschnitte hergestellt und am Mikroskop beurteilt. Zum Probengut beim histologischen Arbeiten gehören vor allem Operationspräparate, Probeexzisionen sowie mittels Biopsien entnommenes Gewebe, wobei das vorrangige Ziel bei der Untersuchung derart angefärbter Gewebeschnitte in der sicheren Erkennung und Typisierung von Tumoren liegt.
Für die Handhabung der Schnitte für Färbung, Mikroskopie und Archivierung werden üblicherweise Standard-Objektträger aus Glas mit Abmessungen von 26 x 76 x 1 mm verwendet. Auf einen derartigen Objektträger werden auf einer Seite ein einzelner Schnitt oder manchmal eine kleine Gruppe von Schnitten aufgezogen. Darüber hinaus sind schachbrettartige Anordnungen von sehr kleinen Schnitten bekannt, die bei speziellen Analysen eingesetzt werden.
In diesem Zusammenhang ist aus der EP 0 238 190 B1 ein Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Gewebepräparaten bekannt, bei dem aus einem Gewebestück zunächst eine Gruppe von zylindrischen Gewebestäben mit verhältnismäßig großer Länge, bis zu 10 mm, und kleiner Querschnittsfläche, etwa 1 mm2, herausgeschnitten bzw. herausgestanzt wird. Diese Gewebestäbe werden parallel zueinander und eng gepackt in einer Umhüllung angeordnet. Die Umhüllung, die bevorzugt aus Teilen des Kaninchendünndarms gewonnen wird, wird eng um die Gewebestäbe gewickelt und mittels eines Drahtes verschnürt. Die Enden des sich ergebenden zylindrischen Bündels von Gewebestäben werden zugeschnitten, so dass die Enden aller Gewebestäbe an den Enden der Umhüllung freiliegen. Der Draht wird entfernt und die gebündelten Gewebestäbe auf herkömmliche Weise in Paraffin eingebettet. Abschließend wird der Paraffinblock senkrecht zur Längsrichtung der Gewebestäbe geschnitten, so dass aus jedem Paraffinblock eine Vielzahl von Gewebeschnitten hergestellt werden kann. Mit dem bekannten Verfahren kann somit zwar in kurzer Zeit eine vergleichsweise große Menge von Gewebeschnitten hergestellt werden, es ist aber nur mit verhältnismäßig großem Aufwand möglich, Gewebeschnitte aus unterschiedlichen Bereichen eines Gewebestücks auf einem Objektträger anzuordnen bzw. gleichzeitig zu untersuchen. Problematisch an der beschriebenen technischen Lösung ist allerdings, dass es nur mit verhältnismäßig großem Aufwand möglich ist, Gewebeschnitte aus unterschiedlichen Bereichen eines Gewebestücks auf einem Objektträger genau so anzuordnen, wie es für eine schnelle und effektive Untersuchung wünschenswert wäre.
Ferner ist aus der EP 0 350 189 B1 ein Mehrfachprobenträger zur Verwendung in immuno- histologischen Untersuchungsverfahren bekannt. Der beschriebene Probenträger zeichnet sich dadurch aus, dass auf einen Objektträger eine Mehrzahl von Proben beabstandet zueinander aufgebracht sind, um so eine verbesserte automatisierte Bildanalyse zu ermöglichen. Es werden bevorzugt mehrere Gewebeprobenfragmente nahezu äquidistant in einem Rechtseckmuster angeordnet, wobei in Abhängigkeit bestimmter Probeneigenschaften zusammengehörige Probenfragmente in einem Abschnitt des Substratträgers zusammengefasst werden. Eine flexible Anordnung von Probenfragmenten, die eine bedarfsgerechte Bestückung von Substratträgern ermöglicht, so dass die Bestückung beispielsweise in Abhängigkeit eines geplanten Arbeitsschrittes im Labor verändert wird, ist mit der beschriebenen technischen Lösung allerdings nicht umsetzbar.
Ausgehend von den aus dem Stand der Technik bekannten technischen Lösungen liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Untersuchung von Patientenproben, insbesondere von Gewebeschnitten, derart weiter zu bilden, dass einerseits eine zuverlässige und andererseits eine im Hinblick auf Kosten und den benötigten Zeitaufwand optimierte Untersuchung einer Patientenprobe möglich ist. Mit Hilfe der anzugebenden technischen Lösung, soll der Grad an Flexibilität und Automatisierung in einem Labor erhöht werden können und gleichzeitig eine sichere Bereitstellung, Färbung, Untersuchung und Archivierung unterschiedlicher Patientenproben möglich sein. Hierbei ist es von besonderer Bedeutung, eine Lösung anbieten zu können, die eine flexible und stets den Anforderungen eines Labors angepasste Anordnung der zu untersuchenden Proben gewährleistet. Gleichzeitig sollen eine erhöhte Auslastung der im Labor verwendeten Geräte sowie Einsparungen bei den verwendeten Hilfsstoffen, insbesondere in Bezug auf die verwendeten Reaktanden und Eindeckmedien, erzielbar sein. Auf diese Weise soll der Probendurchsatz in Laboren bei gleichbleibendem oder sogar verringertem Platzbedarf gesteigert werden. Ebenso soll bei Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie des entsprechenden Verfahrens gewährleistet werden, dass vergleichsweise kurze Reaktionszeiten und eine hohe Qualität der Färbungen, insbesondere durch eine kontinuierliche Konvektion der flüssigen Phase, sicher gestellt werden können. Zeitintensive und fehlerträchtige manuelle Schritte während der Färbung sollen weitgehend vermieden werden, so dass insgesamt eine effektive Arbeitsweise während der Untersuchung von Patientenproben sichergestellt wird.
Die zuvor geschilderte Aufgabe wird mit einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 sowie einem Verfahren nach Anspruch 19 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.
Darstellung der Erfindung:
Erfindungsgemäß ist eine Vorrichtung zur immunologischen und/oder histochemischen Untersuchung von Patientenproben, die in Form von Gewebeschnitten und/oder Zellen vorliegen, mit wenigstens einem Substratträger zur Aufbringung wenigstens einer der Patientenproben und mit zumindest einem Halter, der mit wenigstens einem Substratträger bestückbar ist, derart weitergebildet worden, dass Mittel vorgesehen sind, durch die eine Bestückung des Halters mit wenigstens einem Substratträger nach Durchführung wenigstens eines Laborarbeitsschrittes veränderbar ist. Die Erfindung beruht somit auf dem wesentlichen Gedanken, dass die Anordnung der Patientenproben im Zeitraum zwischen der Bereitstellung der Proben bis zur Archivierung nicht starr ist, sondern stets den Anforderungen im Labor, insbesondere den Arbeitsabläufen, anpassbar ist. Die Anordnung bzw. die Zusammenstellung der einzelnen Patientenproben kann somit zwischen den Arbeitsschritten im Labor verändert werden. Wesentlich hierfür ist, dass ein Halter vorgesehen ist, in oder an dem bedarfsgerecht wenigstens ein Substratträger befestigbar ist, wobei auf einem Substratträger eine oder mehrere Proben mit unterschiedlichen Eigenschaften angeordnet sein können. Hierbei ist es wiederum denkbar, dass entweder ein Halter zur Aufnahme wenigstens eines Substratträgers vorgesehen ist oder aber Halter unterschiedlicher Ausführungsform bereitgestellt werden, die beispielsweise speziell für die Anforderungen bei der Inkubation, der mikroskopischen Untersuchung oder der Archivierung der Proben ausgeführt sind. Ebenso ist es grundsätzlich denkbar, dass die einzelnen Proben in unterschiedlicher Form, beispielsweise als ein vergleichsweise großer Gewebeschnitt oder aber in Form unterschiedlicher, miniaturisierter Biochips auf einem Substratträger angeordnet werden.
Unter einem Substratträger im Sinne der Erfindung wird ein Träger, vorzugsweise aus optisch durchlässigem Material, verstanden, der einerseits groß genug ist, eine Gruppe von Proben, insbesondere von Biochips, also von Substraten aus Glas oder Kunststoff mit darauf angeordneten Proben, zu tragen, der aber andererseits wesentlich kleiner als ein Standardobjektträger ist. Auch ist ein Substratträger im Sinne der Erfindung dünner als herkömmliche Objektträger. Diese Miniaturisierung der Substratträger ermöglicht, vorzugsweise zusammen mit der Biochip-Fragmentiertechnik, eine flexible Bildung von Gruppen bei der Zusammenstellung der Proben. Grundsätzlich ist es denkbar, als Trägersubstrat eines Biochips, also Substrat, auf dem sich das zu untersuchende Gewebe oder die Zellen befinden, anstelle von Glas auch Kunststoff, insbesondere eine Kunststofffolie, zu verwenden. Die Proben können hierbei sehr flexibel entsprechend dem Probenaufkommen und den Anforderungen an den analytischen Prozess in sinnvollen Kombinationsgruppen von Proben auf dem Substratträger gruppiert werden. Ebenso können die Substratträger zu sinnvollen Gruppen zusammengestellt werden, die dann gemeinsam zur Prozessierung der Proben, insbesondere zur Inkubation bzw. Färbung, aber auch zur Erzeugung von Abbildern der Proben, zur visuellen Untersuchung mit anschließender Befundung der Proben und/oder zur Archivierung der Proben in einem Halter lösbar befestigt werden. Unter lösbarer Befestigung wird in diesem Zusammenhang verstanden, dass der Halter und wenigstens ein Substratträger zerstörungsfrei von einander getrennt und wieder mit einander verbunden werden können. Ein spezielles Einsatzgebiet für die Erfindung stellt die Tumordiagnostik dar. Hier müssen oft eine Mehrzahl von Schnitten, aus dem „verdächtigen" Bereich des Gewebes auf unterschiedliche Weise angefärbt und später die hierdurch entstehenden Färbemuster verglichen werden. Zur Anfärbung bzw. Inkubation werden hierfür speziell ausgeführte Halter eines ersten Typs mit Substratträgern bestückt. Auf besonders effektive Weise können so Proben verschiedener Patienten, die gleich oder zumindest ähnlich zu färben sind, gleichzeitig prozessiert werden. Für die spätere Auswertung werden die Substratträger dann in einer veränderten Anordnung in einem Halter eines zweiten Typs, insbesondere in einem so genannten Befundungsrahmen, angeordnet. Vorzugsweise werden die Proben nunmehr derart in den Halter angeordnet, dass sich alle unterschiedlich gefärbten Proben eines Patienten in einem gemeinsamen Gestell befinden und vergleichsweise einfach zur Befundung einer Untersuchungseinheit, insbesondere einem Mikroskop, zugeführt werden können.
Gemäß einer speziellen Weiterbildung der Erfindung weist der Halter wenigstens eine Fläche auf, auf der ein Substratträger zumindest bereichsweise auflegbar ist. Ebenso ist es denkbar, dass der Halter und/oder der Substratträger wenigstens ein Befestigungselement aufweist, über das eine lösbare Verbindung zwischen Halter und Substratträger herstellbar ist. Ein derartiges Befestigungselement ist bevorzugt als Rast-, Klemm- oder Schnappelement ausgeführt. In jedem Fall sollte ein wiederholtes Lösen und Verbinden von Substratträger und Halter einfach, und ohne dass es zu einer Beschädigung dieser Komponenten kommt, möglich sein.
In einer weiteren speziellen Ausführungsform der Erfindung ist der zumindest eine Halter als Inkubationshalter ausgeführt. Der Inkubationshalter nimmt hierbei wenigstens einen Substratträger während einer Inkubation auf. Vorzugsweise verfügt der Inkubationshalter über wenigstens eine Flüssigkeitsaufnahme, in die zumindest eine der Patientenproben während einer Inkubation derart eingetaucht wird, dass die Patientenprobe zumindest zeitweise in Kontakt mit einer in der Flüssigkeitsaufnahme befindlichen Flüssigkeit gebracht wird. Der Kontakt zwischen Patientenprobe und der Flüssigkeit, insbesondere einem Reaktanten oder einer Waschflüssigkeit, findet statt, indem die Probe der Flüssigkeitsoberfläche zugewandt, also quasi„kopfüber", in die Flüssigkeit eingetaucht wird. In diesem Zusammenhang ist es denkbar, dass die Flüssigkeitsaufnahme in Form einer Rinne oder einer Wanne ausgeführt ist. Die Form der Flüssigkeitsaufnahme richtet sich danach, wie viele Substratträger in eine Aufnahme eingetaucht werden sollen und/oder nach der Größe und der Form eines Substratträgers. In jedem Fall sind die Rinnen oder Wannen des Inkubationshalters derart ausgeführt, dass sie separate und gegeneinander abgegrenzte Aufnahmen für die jeweils benötigte Flüssigkeit darstellen. In unterschiedlichen Rinnen oder Wannen eines Inkubationshalters können wahlweise gleiche oder verschiedenartige Flüssigkeiten eingefüllt werden.
Auf bevorzugte Weise ist eine Rinne oder Wanne derart ausgeführt, dass ein Austreten einer Flüssigkeit aus der Rinne oder der Wanne zuverlässig verhindert wird. Hierdurch wird insbesondere eine Vermischung von in unterschiedliche Rinnen oder Wannen befindlichen Flüssigkeiten zuverlässig vermieden. Vorzugsweise sind die Flüssigkeitsaufnahmen derart ausgeführt, dass das Volumen der Aufnahmen größer ist als das der jeweils eingefüllten Flüssigkeit. In Ergänzung zu einer geeigneten Gestaltung der Flüssigkeitsaufnahmen ist es ferner denkbar, eine Abdichtung der Rinnen oder Wannen des Inkubationshalters, beispielweise in Form von speziellen Kantenformen und/oder zusätzlichen Begrenzungselementen, vorzusehen.
Eine weitere vorteilhafte Gestaltung der Flüssigkeitsaufnahmen sieht ein Profil in den Aufnahmen vor, das der Führung der Flüssigkeit, insbesondere in Längsrichtung der Flüssigkeitsaufnahmen, dient. Ebenso kann wenigstens ein geeignetes Umlenkelement vorhanden sein, das bei einer Bewegung einer Flüssigkeit in einer Flüssigkeitsaufnahme eine zusätzliche Bewegung, eine Umlenkung und/oder eine Durchmischung der Flüssigkeit bewirkt. Die verwendeten Inkubationshalter werden bevorzugt aus einem Werkstoff, der Makroion oder Aluminium enthält, gefertigt. Eine ganz besondere Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass zumindest ein Bewegungsmittel vorhanden ist, durch das die Flüssigkeit in der Flüssigkeitsaufnahme wenigstens zeitweise relativ zur Patientenprobe bewegbar ist. Eine derartige Relativbewegung kann wahlweise durch eine Bewegung des Substratträgers und/oder eines Inkubationshalters oder aber durch Vorsehen eines Bewegungsmittels, insbesondere eine Pumpe oder eine Ansaugung, das die Flüssigkeit zumindest zeitweise in eine Strömungsbewegung versetzt, verwirklicht werden. Besonders bevorzugt werden der Substratträger und der diesen aufnehmende Inkubationshalter in eine Schwenkbewegung während der Inkubation versetzt, so dass eine Relativbewegung zwischen der Flüssigkeit aufgrund dieser Bewegung erfolgt. Vorzugsweise erfolgt die Bewegung während sich der Halter bzw. der Inkubationshalter und der wenigstens eine Substratträger in einer relativ zu einander fixierten Lage befinden.
In einer weiteren besonderen Gestaltung der Erfindung ist der Halter als Befundungsrahmen ausgeführt. Der Befundungsrahmen weist hierbei Mittel zur Befestigung wenigstens eines Substratträgers während der Befundung auf. Wesentlich ist, dass der Substratträger mit den darauf angeordneten Proben zuverlässig innerhalb des Halters gehalten wird und sicher gemeinsam mit diesem einer Untersuchungseinheit, insbesondere einem Mikroskop, zuführbar ist.
Eine weitere besondere Ausführung der Erfindung sieht vor, dass zumindest zeitweise eine Abdeckung vorgesehen ist, die zwischen einer Optik der Untersuchungseinheit und der Probe angeordnet ist. Auf bevorzugte Weise wird die wenigstens eine auf einem Substratträger angeordnete Probe mit einem Deckglas überdeckt, wobei sich zwischen der Probe und dem Deckglas ein Eindeckmedium befindet. Vorzugsweise verfügt der Substratträger über geeignete Anschlagflächen, auf denen die Abdeckung sicher aufliegt. In diesem Zusammenhang ist es denkbar, dass ein die Probe zumindest abschnittsweise umgebender Begrenzungssteg zumindest teilweise als Anschlagfläche für die aufgelegte Abdeckung dient. Vorteilhafterweise wird die Abdeckung nach abgeschlossener Inkubation der Probe aufgelegt und verbleibt sowohl während der visuellen Untersuchung als auch der anschließenden Archivierung auf dem Substratträger bzw. über der Probe.
In einer speziellen Weiterbildung ist alternativ oder in Ergänzung zu dem zuvor beschriebenen Begrenzungssteg vorgesehen, dass die Probe auf dem Substratträger innerhalb einer Vertiefung angeordnet ist. Die Vertiefung kann hierbei derart ausgeführt sein, dass die Abdeckung umfangsseitig auf einem die Vertiefung umgebenden Rand aufliegt. Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sieht vor, dass wenigstens einer der Substratträger eine probenspezifische Kennung mit einem Identifikationscode, der in einer Steuereinheit hinterlegt ist, aufweist. Vorzugsweise handelt es sich bei einer derartigen Kennung um einen ein- oder mehrdimensionalen Barcode oder eine RFID-Markierung, so dass in einer Steuereinheit oder einer Labordatenverwaltung zuverlässig eine Verknüpfung zu Informationen über die auf dem Substratträger befindlichen Proben herstellbar ist. Hierbei ist es denkbar, dass auf einem Substratträger entweder Proben gleichen Ursprungs, insbesondere eines Patienten, oder Proben unterschiedlichen Ursprungs, also von unterschiedlichen Patienten, aufgebracht sind. Vorteilhafterweise werden die Proben auf einem Substratträger in Abhängigkeit eines Optimierungskriteriums zusammengestellt.
Die Kombinations- oder Funktionsgruppen werden hierbei zum Beispiel unter Berücksichtigung der Herkunft der Gewebeproben aus Organen und/ oder Patienten, der durchzuführenden Färbeprotokolle und/oder der nachzuweisenden Antigene bzw. Biomarker zusammengestellt. Soll etwa für mehrere Patienten ein oder mehrere Marker für Brustkrebs nachgewiesen werden, so ist es sinnvoll, jeweils Biochips aus Arealen des Gesamtschnittes eines Patienten auf einem Substratträger anzuordnen, bei denen der gleiche Marker nachzuweisen ist. Auch ist es denkbar, Gewebeproben aus verschiedenen Organen eines Patienten auf einem Objektträger anzuordnen, die die gleichen Färbeprotokolle durchlaufen sollen.
Gemäß eines speziellen Aspekts der Erfindung werden Substratträger gezielt zu einer Funktionsgruppe zusammengestellt, in einem Halter befestigt und einem spezifisch für die ausgewählte Funktionsgruppe konditionierten Inkubationshalter zugeordnet. Sind für die nachzuweisenden Marker ähnliche Färbeprotokolle vorgesehen, so können die Substratträger die Färbeprotokolle in den verschiedenen Rinnen eines Inkubationshalters durchlaufen. Auf weitere Inkubationshalter muss nur zurückgegriffen werden, sobald sich die Färbeprotokolle unterscheiden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die Substratträger auch zur Befundung, Auswertung und Archivierung in speziellen Funktionsgruppen in einem speziellen Halter, insbesondere einem Befundungsrahmen, zusammengestellt. So können z.B. die Proben eines Patienten, die zur Inkubation getrennt worden sind, wieder nebeneinander angeordnet werden und zusammen an oder in einem Halter befestigt, einem Mikroskop zugeführt und visuell untersucht werden. Ein lästiges Wechseln von Objektträgern während des Mikroskopierens zum Auswerten der Anfärbung mehrerer Marker für z.B. nur einen Patienten, entfällt, denn diese Proben befinden sich alle neben- und/ oder übereinander in einem Halter. Neben einer speziellen Analysevorrichtung betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur immunologischen und/oder histochemischen Untersuchung von Patientenproben, bei dem sowohl wenigstens eine Patientenprobe in Form eines Gewebeschnittes und/oder in Form von Zellen bereitgestellt und auf einen Substratträger aufgebracht wird als auch wenigstens ein Substratträger mittelbar oder unmittelbar mit einem Halter verbunden wird, und das sich dadurch auszeichnet, dass eine Bestückung des Halters mit wenigstens einem
Substratträger nach Durchführung wenigstens eines Laborarbeitsschrittes verändert wird. Wesentlich an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass durch die Verwendung von Substratträgern, die flexibel in einem Halter zusammengestellt und angeordnet werden können, eine effektive Untersuchung von Proben ermöglicht wird. Auf vorteilhafte Weise ist es so möglich, dass eine erste Zuordnung für die Inkubation bzw. Anfärbung der Proben und eine zweite Zuordnung für die visuelle Untersuchung der Proben generiert wird, so dass stets eine effektive Bearbeitung der Proben erfolgt. Die Proben bzw. die Substratträger werden hierbei bevorzugt derart angeordnet, dass die Zuordnung in Bezug auf die Inkubation unter Berücksichtigung der nachzuweisenden Antikörper, Antigene bzw. der ausgewählten Biomarker erfolgt, während die Zuordnung für die visuelle Untersuchung und Archivierung der Proben den Ursprung der Proben berücksichtigt. Unter Ursprung ist in diesem Zusammenhang insbesondere die Zugehörigkeit einer Probe zu einem Patienten oder einem Gewebetyp zu verstehen.
Gemäß einer speziellen Weiterbildung erfolgt die Inkubation, in dem die auf einem Substratträger angeordnete Probe in eine Flüssigkeit, in der ein spezieller Reaktant vorgesehen ist, eingetaucht wird. Besonders bevorzugt wird hierbei eine Relativbewegung zwischen der Flüssigkeit und der Probe erzeugt. Diese Relativbewegung kann beispielsweise dadurch hervorgerufen werden, dass der Halter mit dem wenigstens einen daran befestigten Substratträger gemeinsam mit einem Inkubationshalter, der eine Mehrzahl von rinnenförmigen Flüssigkeitsaufnahmen aufweist, in die die Proben quasi kopfüber eingetaucht werden, in eine Schwenkbewegung um eine Längsachse des Halters versetzt wird. Durch diese Schwenkbewegung strömt die in den Rinnen befindliche Flüssigkeit mit dem wenigstens einen Reagenz hin und her, so dass es einerseits zu einem innigen Kontakt zwischen den inkubierten Proben und der Flüssigkeit und andererseits zu einer starken Durchmischung der Flüssigkeit kommt. Die Substratträger sind hierbei bevorzugt im Halter quer zu dessen Längsachse angeordnet.
Beschreibung der Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen:
Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren ohne Beschränkungen des allgemeinen Erfindungsgedanken näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 : Substratträger mit darauf angeordneten Proben biologischen Materials;
Fig. 2: Verschiedene Anordnungen von Proben biologischen Materials auf
Substratträgern;
Fig. 3: Halter in Form eines Befundungsrahmens mit bestückten Substratträgern in verschiedenen Ansichten;
Fig. 4: Darstellung unterschiedlicher Arten der Bestückung eines Halters Form eines
Befundungsrahmens ;
Fig. 5: Draufsicht auf ein Tablett mit mehreren Haltern;
Fig. 6: Verschiedene Ansichten eines Halters Typ Inkubationshalters mit rinnenförmigen
Flüssigkeitsaufnahmen;
Fig. 7: Schematische Darstellung der Inkubation von Substratträgern mit Proben biologischen Materials, die in rinnenförmigen Flüssigkeitsaufnahmen eines
Inkubationshalters angeordnet sind;
Fig. 8: Verschiedene Ansichten eines Halters in Form eines Inkubationshalters mit einer wannenförmigen Flüssigkeitsaufnahme;
Fig. 9: Perspektivansicht eines weiteren Typ eines Halters mit mehreren unterschiedlich bestückten Substratträgern sowie
Fig. 10: Detailansicht eines Befestigungselementes zwischen Halter und Substratträger.
Wesentlich für die erfindungsgemäße Vorrichtung sowie das entsprechende Verfahren ist die Verwendung von Substratträgern 1 , die deutlich kleiner als herkömmliche Objektträger sind. Weiterhin werden derartige Substratträger 1 , die im Folgenden auch als Magnumchips bezeichnet werden, bevorzugt mit mehr als einer Probe 2 und/oder mit mehr als einem Biochip, also einem mit biologischem Material beschichteten Fragment 3, das in dem beschriebenen Fall aus Glas hergestellt ist, genauso aber auch aus einem geeigneten Kunststoff gefertigt sein kann, bestückt. Grundsätzlich können die beschriebenen Substratträger 1 allerdings unterschiedliche Größen aufweisen, wobei die Größe stets dem Bedarf angepasst ist.
Figur 1 zeigt den Aufbau eines erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Substratträgers 1 , wobei Figur 1 a eine Draufsicht und eine Schrägansicht des Substratträgers 1 zeigt, während Figur 1 b eine vergrößerte Detailansicht des Ausschnittes „A" enthält. Der in Figur 1 a dargestellte Substratträger 1 bzw. Magnumchip hat eine Größe von 6 x 19 x 0,6 mm. Auf dem Substratträger 1 gemäß Figur 1 a sind vier Proben 2 biologischen Materials angeordnet, bei denen es sich um paraffinierte Gewebeschnitte, die auf Glasfragmente 3 aufgebracht sind, handelt. Die Glasfragmente 3 mit den paraffinierten Gewebeschnitten stellen sogenannte Biochips 2 dar, die eine bevorzugte Bereitstellung, Handhabung und Untersuchung von biologischem Material ermöglichen. Die Biochips 2 weisen eine Oberfläche von 3,3 x 3,3 mm2 auf. Die Glasfragmente 3 der Biochips 2 haben eine Dicke von 0,15 mm, während die Gewebeschnitte über eine Stärke von etwa 0,004 mm verfügen. Jeder auf dem Substratträger befindliche Biochip 2 stellt eine unabhängige Probe dar, die in Abhängigkeit des Untersuchungsbedarfs weggelassen oder durch eine andere Probe und/oder einen anderen Biochip ersetzt werden kann.
In dem gezeigten Ausführungsbeispiel sind vier Biochips 2 zumindest annähernd in Reihe auf dem Substratträger 1 angeordnet, wobei die Gewebeschnitte auf dem jeweiligen Glasfragment 3 angeordnet sind. An einem Ende des Substratträgers 1 ist eine Kennung 4 in Form eines 2D-Barcodes vorgesehen. Diese Kennung 4 enthält zur Identifizierung der Proben 2 alle für die Untersuchung benötigten Informationen über die Probe 2, insbesondere Gewebeart und Ursprung des Gewebes. Um die Proben 2 zu jedem Zeitpunkt einer Probenprozessierung und/oder -Untersuchung eindeutig zuordnen zu können, ist in einer zentralen Steuereinheit für jede Probe 2 ein entsprechender Identifikationscode hinterlegt. Sowohl bei der Bestückung der Substratträger 1 als auch bei der Inkubation, Untersuchung, Befundung und Archivierung der Proben 2 wird dieser Identifikationscode berücksichtigt. Die Steuereinheit ist in diesem Zusammenhang derart ausgeführt, dass zumindest die Inkubation und die Zuführung der Proben zu einer mikroskopischen Untersuchungseinheit automatisiert gesteuert werden.
Figur 1 b zeigt in einer stark vergrößerten Detailansicht den Ausschnitt„A"- Dargestellt ist hierbei ein auf dem Substratträger 1 angeordneter Biochip 2. Auf dem eigentlichen Chip 3, der als Glasfragment ausgeführt ist, ist biologisches Material in Form eines Gewebeschnitts angeordnet. Figur 1 b verdeutlicht das Größenverhältnis der Dicke des Glasfragmentes 3 einerseits zur Stärke des Gewebeschnitts 5 andererseits.
In der folgenden Tabelle sind die Abmessungen eines Standardobjektträgers denen eines gemäß dem zuvor beschriebenen Ausführungsbeispiel verwendeten Substratträgers 1 gegenüber gestellt. Wie deutlich zu erkennen ist, kann durch die erfindungsgemäße Verwendung von speziellen Substratträgern 1 gemeinsam mit geeigneten Haltern 6 die Anzahl der pro Flächeneinheit platzierbaren Proben 2 deutlich erhöht werden. Darüber hinaus ist eine wesentlich flexiblere Anordnung von Proben 2 möglich.
Abmessung Fläche Anzahl Fläche je Probe
[mm3] [mm2] Proben [mm2]
Standard 76 x 26 x 1 1976 1 bis 3 1976 (für 1 Probe) Objektträger 988 (für 2 Proben)
659 (für 3 Proben)
Magnumchip 19 x 6 x 0,6 1 14 4 28,5 Aufgrund der zuvor dargestellten Größenunterschiede benötigen Vorrichtungen und Geräte, die für die manuelle oder automatische Verarbeitung der auf den Substratträgern 1 gemäß Figur 1 a bzw. auf Magnumchips montierten Proben 2 eingesetzt werden, bei geeignetem Design wesentlich weniger Platz, Energie und Reaktanten, und zwar in Bezug auf sämtliche mit einer Probe durchgeführten Arbeitsschritte, insbesondere Inkubation, Untersuchung, Befundung und Archivierung.
Bei dem mit der vorigen Tabelle erläuterten Ausführungsbeispiel entspricht die theoretisch nutzbare Oberfläche eines Standardobjektträgers in etwa dem Siebzehnfachen der Oberfläche des verwendeten Substratträgers 1 bzw. Magnumchips. In Bezug auf das dargestellte Beispiel ergibt sich für die praktische Anwendung, dass 17 Magnumchips mit je einem Barcode und je 4 Proben (17 X 4 = 68) etwa den gleichen Platz benötigen, wie sonst ein Standardobjektträger.
Die Kapazität von vier Proben 2 auf einem vergleichsweise kleinen, Barcode-tragenden Substratträger 1 ist besonders gut für die typischen Anforderungen eines histopathologisch diagnostischen Labors, z.B. in der Tumordiagnostik, geeignet. Einerseits kann eine große Anzahl von Proben 2 verschiedener Patienten rationell, effektiv und flexibel gefärbt werden, andererseits sind die einzelnen Biochips 2 mit 3,33 x 3,33 mm2 noch groß genug, um bei den meisten Fragestellungen durch die Beurteilung von einem oder einer kleinen Anzahl der Biochips eine optimale Befundung sicher zu stellen.
Eine weitere vorteilhafte Anwendung der gezeigten Substratträger 1 , von denen wenigstens zwei in einer flexiblen Anordnung lösbar an einem Halter 6 befestigbar sind, wird im Zusammenhang mit Figur 2 beschrieben. Hierbei zeigt Figur 2a einen Substratträger 1 mit den Abmessungen gemäß Figur 1 , auf dem nicht eine Mehrzahl von Proben 2 sondern vielmehr eine Probe angeordnet ist. Die Verwendung einer derart großen Probe kann für spezielle Einsatzgebiete der hier beschriebenen Analysevorrichtung bzw. des entsprechenden Verfahrens sinnvoll sein. Ferner sind Figur 2b beispielhaft spezielle Kombinationen unterschiedlich bestückter Substratträger 1 in einem Halter 6 zu entnehmen, wobei vornehmlich die Art einer Probe, die Abmessungen der Biochips und/oder die Größe und Anzahl der Proben pro Substratträger 1 stets bedarfsgerecht angepasst werden kann, um die prinzipiellen Vorzüge der Erfindung optimal zu nutzen. Das hier beschriebene Verfahren und alle Vorrichtungen können vergleichsweise einfach adaptiert werden.
Figur 2a zeigt einen Substratträger 1 , auf dem als Kennung 4 ein 2D Barcode angebracht ist und auf dem sich ein Gewebeschnitt befindet. In diesem Ausführungsbeispiel weist der Substratträger 1 die Maße 48 x 19 x 0,6 mm3 auf. Die Verwendung von großflächigen Gewebeschnitten zusätzlich zu kleineren Gewebeproben ist für bestimmte Anwendungen auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik, insbesondere im Bereich der Histologie bzw. Histopathologie, durchaus sinnvoll. Der Substratträger 1 verfügt wiederum über geeignete Befestigungsmittel 16, so dass dieser in einem Halter 6 befestigt werden kann.
Ergänzend zeigt Figur 2b eine Anordnung verschiedener Substratträger 1 , wie sie auf bevorzugte Weise zusammengestellt und in einem Halter 6 befestigt werden können. Die Substratträger 1 verfügen entweder über Gewebeschnitte unterschiedlicher Anzahl und Größe oder über eine Anordnung von Biochips 2. Die Zusammenstellung der erforderlichen Substratträger 1 mit den darauf befindlichen Proben 2 biologischen Materials erfolgt bedarfsgerecht und kann stets den Erfordernissen der Untersuchung und/oder dem Arbeitsfortschritt, insbesondere in Abhängigkeit des nächsten erforderlichen Arbeitsschrittes, im Labor angepasst werden. Figur 3a zeigt in einer Draufsicht einen Halter 6, der in Form eines Befundungsrahmens ausgeführt ist, und an dem zehn Substratträger 1 befestigt sind. Ein derartiger Halter wird bevorzugt verwendet, um bereits prozessierte, insbesondere angefärbte Patientenproben einer visuellen Untersuchung und/oder Archivierung zuzuführen. Der Halter 6 ist in Form eines Rahmens ausgeführt, an dem die Substratträger 1 mittels geeigneter Befestigungselemente 16 lösbar befestigt sind. Die Substratträger 1 sind quer zur Längsrichtung des Halters 6 angeordnet und verfügen über eine Kennung 4, die als 2D- Code ausgeführt ist und über jeweils vier Proben 2 biologischen Materials, die auf entsprechenden Adhäsionsflächen des Substratträgers 1 angeordnet sind. Auch auf dem Halter 6 ist eine Kennung 7 in Form eines 2D-Codes vorgesehen, so dass das Halter 6 mit den darin befindlichen Substratträgern 1 und Proben jederzeit eindeutig zu identifizieren ist und so auf zuverlässige Weise dem erforderlichen Arbeitsschritt und/oder der Archivierung zuzuführen ist.
Die Figuren 3b bis 3d zeigen den Halter 6 gemäß Figur 3a mit den daran befestigten Substratträgern 1 in Schnitt- bzw. Detailansichten. In Figur 3b ist eine Ansicht entlang des Schnittes „A - A", der mittig in Längsrichtung eines Substratträgers 1 und quer zur Längsachse des Halters 6 verläuft, dargestellt. Auf dem Substratträger 1 sind in Längsrichtung des Substratträgers 1 vier Proben 2 angeordnet. Zusätzlich ist an einem Ende eine Kennung 4 aufgebracht, die eine eindeutige Identifizierung des Substratträgers 1 und der darauf befindlichen Proben 2 ermöglicht. Bei den Proben biologischen Materials handelt es sich in dem dargestellten Ausführungsbeispiel um Gewebeschnitte, die auf das Vorhandensein spezieller Tumorzellen und/oder Tumormarker untersucht werden sollen. Figur 3c zeigt den Ausschnitt„A" in einer vergrößerten Detailansicht. Hierbei ist deutlich der Substratträger 1 mit dem darauf angeordneten Biochip 2, auf dem sich der für eine Untersuchung vorgesehene Gewebeschnitt befindet, zu erkennen. Der Substratträger 1 einschließlich der darauf angeordneten, jeweils einen Gewebeschnitt tragenden Biochips 2 ist von einer Abdeckung 8 in Form eines in seiner Größe auf die mit Substratträgern 1 bestückte Fläche des Halters 6 angepassten Deckglases überdeckt. Zwischen der Abdeckung 8, die an ihrem äußeren Umfang im Randbereich des Halters 6 aufliegt, und den Proben 2 befindet sich ein Eindeckmedium, das für die visuelle Untersuchung der Proben 2 benötigt wird. Üblicherweise wird hierbei entweder ein wasserlösliches oder ein organischen Eindeckmedium verwendet. Alternativ wird in manchen Fällen ein Klebefilm, der mit einem passenden Medium beschichtet ist, verwendet. Durch den Einsatz eines entsprechenden Mediums zum Aufkleben einer Abdeckung wird einerseits für die visuelle Betrachtung die Klarheit der Probe verbessert und andererseits der Gewebeschnitt vor mechanischer Beschädigung geschützt. Bei Verwendung eines organischen Eindeckmediums können die Proben biologischen Materials in der Regel mehrere Jahrzehnte aufbewahrt werden.
Weiterhin zeigt Figur 3d die Einzelheit„B" ebenfalls in einer vergrößerten Detailansicht. Während der Biochip 2 mit seinem tragenden Glassubstrat 3 auf dem Substratträger 1 aufliegt, befindet sich auf der Oberfläche eine Probe 2 biologischen Materials in Form eines Gewebeschnitts. Der Biochip 2 mit dem Gewebeschnitt ist von einer Abdeckung 8 überdeckt, wobei zwischen Abdeckung 8 und Biochip 2 ein Eindeckmedium vorgesehen ist.
Der erfindungsgemäß vorgesehene Halter 6 bietet den Vorteil, dass zur Befundung die Substratträger 1 nach der Anfärbung mit den darauf befindlichen Proben 2 bzw. Biochips wieder in anderen Funktionsgruppen zusammengestellt werden können. So können in einem Halter 6, der in Form eines Befundungsrahmens ausgeführt ist, die Substratträger 1 mit den Proben eines Patienten zusammengestellt werden, obwohl diese Proben zuvor unterschiedliche Färbeprotokolle durchlaufen haben, und somit während des Färbeprozesses anderen Funktionsgruppen zugeordnet waren.
In dem Halter 6 werden die Substratträger 1 zumindest zeitweise und lösbar befestigt, z.B. durch die Verwendung von Clips. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel ist der Halter 6 ein Aluminiumrahmen, auf den eine Abdeckung 8 in Form eines Deckglases aufgebracht ist. Auf dieses Deckglas wurden die Substratträger 1 von der Unterseite her, also quasi kopfüber, aufgeklebt.
Die Größe des gezeigten Halters 6 entspricht der Größe eines herkömmlichen normierten Objektträgers, so dass dieses Halter 6 gemeinsam mit handelsüblichen Mikroskopen, die auf herkömmliche Objektträger ausgerichtet sind, genutzt werden kann. Somit gibt in diesem Fall die Größe des Halters 6 die Größe der Substratträger 1 vor, insbesondere wie viele mit Biochips 2 bestückte Magnumchips 1 und/oder Macrochips mit großflächigen Gewebeschnitten zusammen angeordnet werden können. Bevorzugt werden die Abmessungen derart gewählt, dass zehn mit Biochips 2 bestückte Substratträger 1 bzw. Magnumchips in einem Halter 6 angeordnet werden.
Das Format dieser Halters 6 ermöglicht es, dass Behälter zur Aufbewahrung von herkömmlichen Objektträgern auch zur Aufbewahrung der Halter 6, wahlweise gemeinsam mit oder separat von herkömmlichen Objektträgern, genutzt werden können.
Die Figuren 4a bis 4c zeigen in anschaulicher Form jeweils einen Halter 6 in Form eines Befundungsrahmens mit darin befestigten Substratträgern 1 , wobei die Substratträger 1 in Bezug auf ihre Größe und Bestückung an die jeweiligen Untersuchungserfordernisse angepasst sind. Ein derartiger Halter 6 wird bevorzugt verwendet, um bereits prozessierte Patientenproben einer visuellen Untersuchung und/oder Archivierung zuzuführen. Die Anordnung der Proben 2 auf den Substratträgern sowie der Substratträger 1 innerhalb des Halters 6 wurden hierbei derart vorgenommen, dass eine visuelle Auswertung der Proben 2 besonders effektiv vorgenommen werden kann. Vor allem die erforderlichen Verfahrwege zwischen den einzelnen Proben 2 und der Fokusebene eines für die Untersuchung verwendeten Mikroskops werden hierdurch minimiert. Um eine derart optimierte Auswertung der Proben 2 erreichen zu können, wird in einer Steuerung auf der Grundlage der erforderlichen Untersuchungen sowie eines Analyseplans wenigstens eine Zuordnung generiert, nach der die Bestückung der Substratträger 1 und des Halters 6 erfolgt. Auf vorteilhafte Weise wird eine derartige Zuordnung speziell für jeden Arbeitsschritt während der Bearbeitung und Untersuchung der Proben erstellt und bei der Abarbeitung der einzelnen Untersuchungsschritte berücksichtigt. Diesbezüglich ist es grundsätzlich unerheblich, ob die einzelnen Arbeitsschritte manuell auf der Grundlage entsprechender maschinell erzeugter Handlungsempfehlungen oder aber automatisiert durchgeführt werden.
Während in dem in Figur 4a gezeigten Halter 6 zehn Substratträger 1 mit darauf in Form von Biochips angeordneten Proben 2 befestigt sind, sind in den Haltern 6 gemäß den Figuren 4b und 4c zusätzlich zu Substratträgern 1 mit Biochips 2 auch größere Substratträger 1 vorgesehen, auf die großflächige Gewebeschnitte aufgebracht worden sind. Die Substratträger 1 in dem Halter 6 gemäß Figur 4a verfügen jeweils über eine Kontrolle 9 sowie zwei oder drei Biochips 2 mit Gewebeschnitten. Die Anordnung der Gewebeschnitte auf den Substratträgern 1 und innerhalb des Halters 6 erfolgte in Abhängigkeit ihrer Zugehörigkeit zu den Proben P1 bis P4. Die Zuordnung der einzelnen Gewebeschnitte zu einzelnen diskreten Untersuchungsplätzen auf den Substratträgern 1 sowie innerhalb des Halters 6 wurde mit Hilfe einer Laborsoftware erzeugt.
Figur 5 zeigt ein Tablett 10, in dem wiederum eine Mehrzahl von Haltern 6 mit den darin befestigten Substratträgern 1 zusammengefasst ist. Ein derartiges Tablett 10 kann auf bevorzugte Weise dem Kreuztisch eines Mikroskops für die visuelle Untersuchung der einzelnen Proben 2 zugeführt werden. Genauso eignet es sich für eine vorteilhafte, insbesondere platzsparende Archivierung der Proben 2. Aufgrund der Kennungen 4, 7, 1 1 , die auf den Substratträgern 1 , den Haltern 6 und dem Tablett 10 vorgesehen sind, ist zu jeder Zeit eine eindeutige Identifizierung der einzelnen Proben 2 möglich.
In Figur 6 ist ein Halter 6 in Form eines speziellen Inkubationshalters 12 dargestellt, mit dem die auf den Substratträgern 1 bzw. Magnumchips fixierten Proben 2, hier Gewebeschnitte, effektiv und gut reproduzierbar mit den erforderlichen Reaktanten und/oder Spülflüssigkeiten in Berührung zu bringen sind. Mit derart ausgeführten Haltern 6 kann eine Inkubation der einzelnen auf den Substratträgern angeordneten Patientenproben besonders effektiv erfolgen. In diesem Zusammenhang zeigt Figur 6a einen Inkubationshalter 12 in Schrägansicht, während Figur 6b denselben Inkubationshalter 12 in einer Draufsicht sowie einen Längs- „A - A" und einen Querschnitt „B - B" des Inkubationshalters 12 zeigt.
Wesentlich ist, dass der Inkubationshalter 12 über mehrere, in dem gezeigten Beispiel über fünf, Flüssigkeitsaufnahmen 13 in Form von Rinnen verfügt. Die Rinnen sind hierbei parallel im Korpus des Inkubationshalters 12 angeordnet und jeweils für die Aufnahme eines mit Proben 2 bestückten Substratträgers 1 bzw. eines Magnumchips vorgesehen.
Der Inkubationshalter 12 mit fünf Rinnen 13 ist eine vorteilhafte Ausführungsform, so dass in diesem Fall eine Gruppe von fünf Substratträgern 1 mit den darauf befindlichen Proben 2 eine Vielzahl von Arbeitsschritten im Labor durchläuft. In dem dargestellten Inkubationshalter 12 sind fünf Substratträger 1 mit jeweils vier Biochips 2 vorgesehen, so dass der Inkubationshalter 12 insgesamt 20 unabhängige Proben 2 umfasst. Diese Proben 2 durchlaufen zeitsynchron die gesamten Prozessierungsschritte, insbesondere eine Inkubation mit einem Medium der absteigenden Alkoholreihe, eine immunhistochemische Färbung und eine Inkubation mit einem Medium der aufsteigenden Alkoholreihe. In Ergänzung zu Figur 6 ist in Figur 7 die Inkubation der Proben 2 dargestellt. Der gezeigte Inkubationshalter 12 sowie die Substratträger 1 entsprechen denen, die im Zusammenhang mit Figur 6 erläutert worden sind
Die Inkubation erfolgt vorzugsweise (siehe Fig. 7a bis 7c), indem der Inkubationshalter 12, nachdem die Substratträger 1 in die Rinnen 13 eingelegt worden sind und die benötigte Flüssigkeit 14 in die Rinnen 13 eingefüllt worden ist, in eine Schwenkbewegung um seine Längsachse versetzt wird. Die Flüssigkeit 14 läuft hierbei in den einzelnen Rinnen 13 hin und her, wodurch eine gute Durchmischung der Flüssigkeit 14 gewährleistet ist und ein inniger Kontakt zwischen den Proben 2 und der Flüssigkeit 14 erfolgt. Die Rinnen ragen ferner zu beiden Seiten über das Ende der Substratträger 1 hinaus, so dass sich in diesem Bereich ein Zusatzreservoir 15 befindet, in dem sich überschüssige Flüssigkeit sammelt bevor diese wieder zur anderen Seite strömt. Im Bereich des Zusatzreservoirs 15 ist der Rinnenboden in Längs- sowie in Querrichtung geneigt, so dass eine leichte Wannenform entsteht. Insbesondere die Neigung in Rinnenlängsrichtung ist deutlich der Ansicht des Schnittes„B - B" in Figur 6b zu entnehmen. Ein Zudosieren und/oder eine Entnahme einer Flüssigkeit 14 in bzw. aus den Rinnen 13 erfolgt üblicherweise im Bereich der Zusatzreservoire 15.
Sofern die entsprechenden Analysen mit Standardobjektträgern manuell durchgeführt würden, müssten hierfür zwanzig Objektträger mindestens zwanzigmal in die Hand genommen werden, um die entsprechenden Arbeitsschritte durchzuführen. Dagegen wird gemäß dem erläuterten Ausführungsbeispiel eine gesamte Gruppe, hier bestehend aus 20 Proben 2 und einem Inkubationshalter 12, gehandhabt, und Flüssigkeiten beispielsweise mit einer 5-Kanalpipette abgesaugt bzw. abgegeben. Durch die Verwendung des in Figur 6 gezeigten Inkubationshalters 12 wird der Aufwand für die Prozessierung der einzelnen Proben somit erheblich reduziert.
In Ergänzung zu Figur 6 ist in Figur 7 die Inkubation der Proben 2 im Detail dargestellt. Der dargestellte Inkubationshalter 12 sowie die Substratträger 1 entsprechen denen, die im Zusammenhang mit Figur 6 erläutert worden sind.
Wie den Figuren 7a bis 7c zu entnehmen ist, erfolgt die Inkubation der Proben 2, indem der Inkubationshalter 12 mit den in den Rinnen 13 oder Wannen enthaltenen Substratträgern 12 so bewegt werden, dass sich die Flüssigkeit abwechselnd in die beiden Längsrichtungen der Rinnen 13 oder Wannen bewegt.
Die Reaktionen bei den auf diese Weise inkubierten Gewebeschnitten fallen bemerkenswert einheitlich aus, weil die Reaktanten in der Flüssigkeit ständig gemischt werden.
Demgegenüber gestaltet sich die Inkubation bei den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren oftmals problematisch. Bei der immunhistochemischen Färbung mit „ offenen Tropfen" (Labvision, Dako et.al) liegt dagegen ein mehr oder weniger runder Tropfen über dem Substrat, beispielsweise einem Gewebeschnitt. In der Mitte ist der Tropfen höher als außen, deshalb sieht man oft in der Mitte des Feldes stärkere Reaktionen, da hier mehr Antikörper zur Verfügung steht. Manchmal findet man aber auch das Umgekehrte: Aufgrund der größeren Krümmung der Oberfläche am Rand des Tropfens verdunstet dort die Flüssigkeit schneller als in der Mitte, und es entsteht ein Konzentrationsgradient der Reaktanden mit einem Maximum außen. Dann reagiert der Rand des Gewebeschnittes stärker als die Mitte. Deshalb fällt es bei der mikroskopischen Beurteilung oft schwer, starke von schwachen oder sogar negative von positiven Reaktionen zu unterscheiden, weil man nicht eindeutig weiß, welche Zone des Gewebeschnittes man beurteilen soll. Das Verschwenken der Inkubationshalter gemeinsam mit den Objektträgern während der Inkubation im Rahmen dieser Erfindung behebt diesen Missstand vollständig. Figur 8 zeigt eine alternative Ausführungsform eines Inkubationshalters 12. Dieser verfügt nicht über einzelne Rinnen als Flüssigkeitsaufnahmen 14, sondern über eine vergleichsweise große Wanne. Mit einem derart ausgeführten Inkubationshalter 12 werden bevorzugt Substratträger 1 inkubiert, auf denen sich im Vergleich zu den Biochips 2 großflächige Gewebeschnitte befinden. Im Übrigen erfolgt auch hier die Inkubation durch Schwenken des Inkubationshalters 12.
Im Folgenden wird die vorteilhafte Verwendung eines Halters 6, in dem flexibel unterschiedliche Substratträger 1 angeordnet und befestigt werden können, näher erläutert. In diesem Beispiel werden für acht Patientenproben mit Verdacht auf Brustkrebs Färbungen mit je drei verschieden Antikörpern angefordert, die für die Charakterisierung von Brustkrebs üblich sind: Progesteron Rezeptor, Östrogen Rezeptor, Her2. Des Weiteren sollen für vier Patientenproben durch die Färbung mit vier verschiedenen Antikörpern (EGF, HGF, HGF-Met, RAS) der Verdacht auf Lungenkrebs bestätigt oder entkräftet werden.
Bei der Nutzung von Standardobjektträgern müsste von jeder der Patientenproben für jeden der angeforderten Antikörper mindestens ein Schnitt auf je einen Objektträger aufgezogen werden:
8 x 3 Antikörper für Brustkrebs = 24
4 x 4 Antikörper für Lungenkrebs = 16
40 Standard Objekträger
Mit einem erfindungsgemäß ausgeführten System ist der Aufwand deutlich geringer: 3 Substratträger mit je einem Biochip der Brustkrebs Proben„1 bis 4"
3 Substratträger mit je einem Biochip der Brustkrebs Proben„5 bis 8"
4 Substratträger mit je einem Biochip der 4 Lungenkrebs Proben 10 Substratträger Für die Bestückung der Substratträgers 1 könnte es, wenn das Bioptat des potentiellen Tumors genügend groß (größer als 7 x 7 mm) und das Bioptat in der HE-Übersichtsfärbung hinreichend homogen ist, durchaus ausreichen, nur einen Schnitt zu verwenden, um hieraus einen Biochip 2 zu produzieren
Die Vorteile des beschriebenen Systems werden im Folgenden weiter verdeutlicht. Hierbei wird das erfindungsgemäße System mit dem Einsatz herkömmlicher Objektträger, wie sie beispielsweise von der Firma Dako angeboten werden, verglichen:
Figure imgf000020_0001
Mit dem erfindungsgemäßen System können Untersuchungen von Patientenproben besonders schnell, platzsparend und effektiv durchgeführt werden. Hervorzuheben ist hierbei insbesondere, dass der Bedarf an benötigten Reaktanten deutlich verringert wird. Figur 9 zeigt einen Halter 6, der an einer Aufnahme befestigt oder auf ein Tablett gelegt wird und mit Hilfe der Aufnahme oder dem Tablett um seine Längsachse 17 schwenkbar ist. Die Längsachse 17, um die der Halter 6 während einer Inkubation wenigstens zeitweise in Pfeilrichtung geschwenkt wird, ist in Figur 9 strichpunktiert dargestellt. An dem rahmenformig ausgebildeten Halter 6 sind wiederum Befestigungselemente 16 vorgesehen, über die mehrere Substratträger 1 mit den darauf angeordneten Proben 2, hier Gewebeschnitte, zerstörungsfrei lösbar an dem Halter 6 zu befestigen sind. Hierbei ist es möglich, nur einen oder mehrere, in dem dargestellten Ausführungsbeispiel bis zu acht, Substratträger 1 nebeneinander anzuordnen und an dem Halter 6 zu befestigen. Die Substratträger 1 werden quer zur Schwenkachse 17 angeordnet, so dass nach Inkontaktbringen der Proben 2 mit einer Flüssigkeit 14, die Flüssigkeit 14 aufgrund der Schwenkbewegung parallel zur Längsachse der Substratträger 1 die Proben 2 überströmt, es somit zu einer erzwungenen Relativbewegung zwischen dem Flüssigkeit 14 und der jeweiligen Probe 2 kommt.
Auf bevorzugte Weise erfolgt die Inkubation, wie es beispielsweise in Figur 7 gezeigt ist, indem die auf den Substratträgern 1 angeordneten Proben 2 quasi kopfüber in die Flüssigkeit 14 eingetaucht werden. Hierbei befindet sich die für die Inkubation oder das Waschen vorgesehene Flüssigkeit 14 innerhalb einer als Wanne oder Rinne ausgeführten Flüssigkeitsaufnahme 13 eines Inkubationshalters 12, der schließlich gemeinsam mit dem Halter 6 und den daran befestigten Substratträgern 1 in eine Schwenkbewegung versetzt wird. Ein entsprechend geeigneter Inkubationshalter 12 mit Rinnen ist in Figur 6 und mit einer Wanne in Figur 8 dargestellt. In diesem Zusammenhang ist es denkbar, dass der Halter 6 entsprechend auf den Inkubationshalter 12 aufgelegt oder lösbar an diesem befestigt wird.
Die Flüssigkeit 14 strömt aufgrund der Schwenkbewegung innerhalb der Wanne oder den Rinnen des Inkubationshalters 12 hin und her, so dass einerseits die Flüssigkeit 14 stets gut durchmischt wird und es andererseits zu einem innigen Kontakt zwischen den auf dem Substratträger 1 haftenden Proben 2 und der Flüssigkeit 14, insbesondere einem Reaktanten oder einer Waschflüssigkeit, kommt.
Die Substratträger 1 können hinsichtlich der Anzahl sowie der Ausführung der Proben 2 sehr flexibel bestückt werden. Im dargestellten Ausführungsbeispiel befinden sich entweder bis zu fünf auf Glasfragmente 3 gezogene Gewebeschnitte, die eine quadratische Grundfläche belegen, oder aber größere Gewebeschnitte auf einem Substratträger 1 . Es wird deutlich, dass die dargestellte Anordnung von flexibel bestückbaren Substratträgern 1 in einem Halter 6 eine Vielzahl von unterschiedlichen Bestückungsvarianten des Halters 6 erlaubt. Je nach Bedarf in Bezug auf die geplante Untersuchung werden die einzelnen Proben 2 derart angeordnet, dass insbesondere der Bedarf an den für die Inkubation benötigten Reaktanten minimiert wird. In diesem Zusammenhang stellt die während der Inkubation durchgeführte Schwenkbewegung sicher, dass es einerseits stets zu einem innigen Kontakt zwischen den Reaktanten und den Proben 2 kommt und anderseits die verwendeten Reaktanten gut durchmischt werden.
Die Verwendung einer in Art des in Figur 9 dargestellten Halters 6 ausgeführten Vorrichtung zur flexiblen Befestigung von Substratträgern 1 bietet des Weiteren den Vorteil, dass eine bedarfsgerecht wählbare Zusammenstellung von Substratträgern 1 in ihrer Gesamtheit verhältnismäßig einfach bewegt, bereitgestellt, inkubiert, in Bezug auf eine Untersuchungseinheit positioniert und/oder archiviert werden kann. Trotzdem zeichnet sich das System durch eine besondere Flexibilität aus, da die Zusammenstellung von Substratträgern 1 in einem Halter 6 einfach sowie zu jeder Zeit verändert und so veränderten Bedürfnissen angepasst werden kann.
Um zu jedem Zeitpunkt während der Bereitstellung, der Prozessierung, der Untersuchung und der Archivierung eine exakte Identifikation der einzelnen Proben 2 zu gewährleisten, verfügen sowohl die einzelnen Substratträger 1 , die so genannten Magnumchips, als auch das Halter 6 über eine Kennzeichnung 4, 7 in Form eines Barcodes, bevorzugt eines Data- Matrix-Codes. Mit Hilfe einer derartigen Kennzeichnung 4, 7 können die Proben 2 mit Hilfe einer Laborsoftware und den in einer Laborsteuerung hinterlegten Informationen zu jeder Zeit eindeutig identifiziert, lokalisiert und dem gewünschten Verfahrensschritt zugeführt werden. Im Weiteren ist der in Figur 9 gekennzeichnete Ausschnitt „A" in Figur 10 im Detail dargestellt. Deutlich zu erkennen ist, dass wenigstens ein Befestigungselement 16 vorgesehen ist, über das ein Substratträger 1 einfach und zuverlässig mit dem Halter 6 verbindbar ist. Das Befestigungselement 16 verfügt über eine Kopplungsstelle, an der, beispielsweise mittels eines Rast- oder Clips-Elementes, eine sichere und trotzdem wieder lösbare Verbindung zwischen dem Halter 6 und einem mit Proben 2 bestückten Substratträger 1 herstellbar ist. Das Verbinden des Substratträgers 1 mit einem Halter 6 erfolgt hierbei auf vorteilhafte Weise, ohne dass hierfür ein Werkzeug benötigt wird. Selbstverständlich ist das Befestigungselement 16 derart ausgeführt, dass ein ungewolltes Lösen der Verbindung, insbesondere während des Schwenkvorgangs und auch nach längerer Zeit, zuverlässig ausgeschlossen ist. Ein derartiges Befestigungselement 16 stellt somit sicher, dass eine unterschiedliche Anzahl von Substratträgern 1 auf einfache Weise, schnell, sicher und trotzdem mit sehr hoher Flexibilität als Gesamtheit in einem Halter 6 anzuordnen sind.
Bezugszeichenliste
1 Substratträger
2 Probe
3 Trägerfragment
4 Kennung des Substratträgers
5 Gewebeschnitt
6 Halter in Form eines Befundungsrahmens
7 Kennung des Halters
8 Abdeckung
9 Kontrolle
10 Tablett
1 1 Kennung des Tabletts
12 Halter in Form eines Inkubationshalters
13 Flüssigkeitsaufnahme
14 Flüssigkeit
15 Zusatzreservoir
16 Befestigungselement
17 Längsachse des Halters

Claims

Patentansprüche:
1 . Vorrichtung zur immunologischen und/oder histochemischen Untersuchung von Patientenproben (2), die in Form von Gewebeschnitten und/oder Zellen vorliegen, mit wenigstens einem Substratträger (1 ) zur Aufbringung wenigstens einer der Patientenproben (2) und mit zumindest einem Halter (6, 12), der mit wenigstens einem Substratträger (1 ) bestückbar ist,
dadurch gekennzeichnet, dass Mittel vorgesehen sind, durch die eine Bestückung des Halters (6, 12) mit wenigstens einem Substratträger (1 ) nach Durchführung wenigstens eines Laborarbeitsschrittes veränderbar ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass der Halter wenigstens eine Fläche aufweist, auf der wenigstens ein Substratträger (1 ) zumindest bereichsweise auflegbar ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, dass der Halter und/oder der Substratträger wenigstens ein Befestigungselement aufweist, über das eine lösbare Verbindung zwischen Halter und Substratträger herstellbar ist.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, dass der zumindest eine Halter (6, 12) als
Inkubationshalter ausgeführt ist, der wenigstens einen Substratträger (1 ) während einer Inkubation aufnimmt.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet, dass der Inkubationshalter wenigstens eine
Flüssigkeitsaufnahme (13) aufweist, in die zumindest eine der Patientenproben (2) während einer Inkubation derart eingetaucht wird, dass die Patientenprobe (2) zumindest zeitweise in Kontakt mit einer in der Flüssigkeitsaufnahme (13)
befindlichen Flüssigkeit (14) gebracht wird.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass die Patientenprobe (2) einer Flüssigkeitsoberfläche zugewandt, also kopfüber, in die Flüssigkeit (13) eintauchbar ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeitsaufnahme (13) in Form einer Rinne ausgeführt ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Bewegungsmittel vorgesehen ist, durch das die Flüssigkeit (14) in der Flüssigkeitsaufnahme (13) wenigstens zeitweise relativ zur Patientenprobe (2) bewegbar ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, dass der Inkubationshalter (12) und wenigstens ein Substratträger (1 ) gemeinsam in relativ zu einander fixierter Position und Lage durch das Bewegungsmittel bewegbar sind.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, dass der zumindest eine Halter als Befundungsrahmen ausgeführt ist, der Mittel zur Fixierung wenigstens eines Substratträgers zur
Durchführung einer visuellen Untersuchung der Patientenprobe aufweist.
1 1 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, dass sich die Patientenprobe (2) auf einem Trägersubstrat (3) befindet und mit dem Trägersubstrat (3) auf dem Substratträger (1 ) angeordnet ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 1 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersubstrat (3) eine Kunststofffolie aufweist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, dass der Substratträger (1 ) wenigstens eine Vertiefung zur Aufnahme einer Patientenprobe (2) aufweist.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Substratträger wenigstens ein
Begrenzungssteg vorgesehen ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet, dass die Patientenprobe (2) zumindest zeitweise von einer Abdeckung (8) überdeckt ist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Substratträger (1 ) und/oder der Halter (6, 12) wenigstens einen Identifikationscode zur Identifizierung der Patientenprobe (2) aufweist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Steuerung vorgesehen ist, mittels der unter Zugrundlegung des Identifikationscodes die Aufbringung der Patientenprobe (2) auf den Substratträger (1 ), die Inkubation der Patientenprobe (2), die Bestückung des Halters (6, 12) und/oder die Untersuchung der Patientenprobe (2) wenigstens teilweise automatisiert erfolgt.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17,
dadurch gekennzeichnet, dass die Patientenprobe (2) als ein zumindest zeitweise paraffinierter Gewebeschnitt oder als ein Gefrierschnitt ausgeführt ist.
19. Verfahren zur immunologischen und/oder histochemischen Untersuchung von Patientenproben (2), bei dem wenigstens eine Patientenprobe (2) in Form eines Gewebeschnittes und/oder in Form von Zellen bereitgestellt und auf einen
Substratträger (1 ) aufgebracht wird und bei dem wenigstens ein Substratträger (1 ) mittelbar oder unmittelbar mit einem Halter (6, 12) verbunden wird,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Bestückung des Halters (6, 12) mit wenigstens einem Substratträger (1 ) nach Durchführung wenigstens eines Laborarbeitsschrittes verändert wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet, dass die Patientenprobe (2) durch zumindest teilweises Eintauchen der Probe (2) in eine Flüssigkeit inkubiert wird.
21 . Verfahren nach Anspruch 19 oder 20,
dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Patientenprobe (2) gemeinsam mit dem Substratträger (1 ) und dem Halter (6, 12) während einer Inkubation der Patientenprobe (2) zumindest zeitweise bewegt wird.
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