DE102017130395A1

DE102017130395A1 - Verfahren zur ortsaufgelösten, flüssigkeitsunterstützten Untersuchung einer auf einem Objektträger angeordneten mikroskopischen Probe, Kompartimentierungseinrichtung und Untersuchungssystem

Info

Publication number: DE102017130395A1
Application number: DE102017130395.2A
Authority: DE
Inventors: Falk Schlaudraff
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2019-06-19

Abstract

Ein Verfahren (200) zur ortsaufgelösten, flüssigkeitsunterstützten Untersuchung einer auf einem Objektträger (1) angeordneten mikroskopischen Probe (2) verwendet eine Kompartimentierungseinrichtung (10) mit einem Kammerbereich (13) umfassend Kammern (15) mit jeweils oberen Öffnungen (16) und unteren Öffnungen (17). Die Kammern sind durch Trennwände (14) abgegrenzt, Die Kompartimentierungseinrichtung (10) wird mittels Ausrichtungsmitteln (18) mit dem Objektträger (1) in Eingriff gebracht, der Kammerbereich (13) in einer definierten Position relativ zu der Probe (2) ausgerichtet und mit der Probe (2) unter Ausbildung eines flüssigkeitsdichten Abschlusses zwischen zumindest einem Teil der Trennwände (14) und der Probe (2) in Kontakt gebracht. Hierdurch werden unterschiedliche Probenbereiche der Probe (2) direkt und ohne weiteren Zwischenschritt jeweils in einzelnen Kammern (13) angeordnet. Es wird wenigstens eine Untersuchungsflüssigkeit in zumindest einen Teil der Kammern (15) eingebracht und in diesen Kammern (15) die flüssigkeitsunterstützte Untersuchung durchgeführt. Eine entsprechende Kompartimentierungseinrichtung (10) und ein Untersuchungssystem (700) sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur ortsaufgelösten, flüssigkeitsunterstützten Untersuchung einer auf einem Objektträger angeordneten mikroskopischen Probe, eine Kompartimentierungseinrichtung zur Verwendung in einem derartigen Verfahren und ein Untersuchungssystem mit einer derartigen Kompartimentierungseinrichtung sowie einem Obj ektträg er.
Stand der Technik
In der Pathologie ist es häufig erforderlich, mikroskopisch identifizierten Bereichen von Dünnschnitten, Ausstrichpräparaten und dergleichen, die auf einem Objektträger angeordnet sind, physiologische, physikalische, chemische, biochemische oder molekularbiologische Eigenschaften zuzuordnen, also einen bestimmten Phänotyp, der durch mikroskopisch identifizierbare Eigenschaften gekennzeichnet ist, mit einem Chemotyp oder Genotyp zu korrelieren. Hierzu ist häufig eine ortsaufgelöste Analyse erforderlich, die es ermöglicht, entsprechende Untersuchungen lokal differenziert vorzunehmen, also beispielsweise bestimmte Zellen, Zellgruppen oder Gewebe, die sich mikroskopisch bzw. optisch von benachbarten Zellen, Zellgruppen oder Geweben unterscheiden lassen, gezielt zu untersuchen und dabei nur deren Chemotyp oder Genotyp, möglichst unbeeinflusst vom möglicherweise abweichenden Chemotyp oder Genotyp benachbarter Zellen, Zellgruppen oder Gewebe, aufzuklären.
Insbesondere im Bereich der Tumorpathologie sollen hierdurch pathologisch als relevant vermutete Bereiche einer entsprechenden mikroskopischen Probe, insbesondere Tumorzellen oder Tumorgewebe, gezielt molekularbiologisch untersucht werden können, um hierdurch beispielsweise zu einer Aufklärung bezüglich Art, Ausdehnung und Charakterisierung von Tumoren zu kommen.
Entsprechende Analysen umfassen herkömmlicherweise typischerweise eine Anfärbung der jeweils zu untersuchenden mikroskopischen Probe(n), beispielsweise von mikroskopischen Serienschnitten, mittels bekannter, gewebedifferenzierender Farbstoffe. Entsprechende Färbungsverfahren sind aus der gängigen Fachliteratur bekannt; routinemäßig kommt beispielsweise eine Färbung mit Hämatoxylin/Eosin zum Einsatz. Insbesondere bekannte Farbstoffe für die Färbung von Präparaten für die Lasermikrodissektion, beispielsweise Kresylviolett, sind hier vorteilhaft, da diese bereits auf die Konservierung der zu untersuchenden Biomoleküle ausgelegt sind. Auch Fluoreszenzmarkierungen mit spezifischen Antikörpern sind Standard.
Die entsprechend angefertigten mikroskopischen Proben werden anschließend typischerweise durch einen Pathologen mikroskopisch betrachtet und visuell-optisch ausgewertet. Alternativ zu einer derartigen „manuellen“ Untersuchung ist es ebenfalls möglich, beispielsweise unter Verwendung von sogenannten Slidescannern, eine oder mehrere mikroskopische Proben automatisch zu scannen und gegebenenfalls unter Verwendung an sich bekannter Bildauswerteverfahren automatisch auszuwerten.
Auf diese Weise mikroskopisch bzw. optisch erkannte Bereiche von mikroskopischen Proben, die einer weiteren Analyse zugeführt werden sollen, können beispielsweise durch einen Pathologen auf dem jeweils verwendeten Objektträger markiert und von dem Objektträger isoliert werden. Für eine entsprechende Isolierung können ebenfalls rein manuelle, aber auch gerätegestützte Verfahren zum Einsatz kommen.
Eine manuelle Isolierung umfasst beispielsweise ein Abkratzen bzw. Abschaben entsprechend markierter Bereiche von dem Objektträger mittels eines Skalpells oder einer Präpariernadel. Das abgekratzte bzw. abgeschabte Material kann in geeigneten Aufnahmegefäßen, beispielsweise den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte oder in einzelnen Probengefäßen, aufgefangen und anschließend einem flüssigkeitsunterstützten Analyseverfahren zugeführt werden.
Eine derartige manuelle Isolierung hat den Nachteil, dass sie ausgesprochen arbeitsaufwändig und dazu vergleichsweise ungenau ist. Beispielsweise in der Tumordiagnostik werden bei einem entsprechenden Vorgehen typischerweise Mischproben erhalten, die vergleichsweise wenig Tumorgewebe bzw. tumorverdächtiges Gewebe und vergleichsweise viel Normalgewebe umfassen. Auf diese Weise wird die gezielte Analyse des Tumorgewebes bzw. des tumorverdächtigen Gewebes erschwert und insbesondere eine Quantifizierung, beispielsweise einer Genexpression, unmöglich gemacht.
Ein alternatives Verfahren zur Isolierung bestimmter, mikroskopisch identifizierten Bereiche von Objektträgern ist die Lasermikrodissektion. Verfahren zur Bearbeitung biologischer Proben durch Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre (siehe z.B. Isenberg, G. et al.: Cell surgery by laser micro-dissection: a preparative method. Journal of Microscopy, Band 107, 1976, Seiten 19-24) und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt. Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einer mikroskopischen Probe isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden.
Beispielsweise kann in bekannten Verfahren der Lasermikrodissektion aus einer Probe mittels eines Infrarot- oder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das entweder unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt oder gegen die Schwerkraft in einen solchen katapultiert wird. Das Dissektat kann dabei aus der Probe auch zusammen mit einer anhaftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten Laser Capture Microdissection wird eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich der Probe und kann in einem darauffolgenden Schritt entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können nach oben katapultierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden.
Durch Lasermikrodissektion kann zwar typischerweise eine hohe Ortsauflösung und eine hohe Selektivität hinsichtlich der zu isolierenden Proben bzw. Probenbereiche erzielt werden, es sind jedoch entsprechend aufwändige Lasermikrodissektionssysteme erforderlich, so dass diese typischerweise in der Routineanalytik nur zögerlich zum Einsatz kommt. Ferner ist, beispielsweise nach einer molekularbiologischen Analyse von bestimmten Probenbereichen, eine Zuordnung hierbei erhaltener Signale zur Morphologie des jeweils diskutierten Bereichs erforderlich, die typischerweise nachträglich erfolgt. Entsprechende Verfahren sind also typischerweise indirekt.
Eine alternativ zu einer Auswahl von bestimmten Probenbereichen ebenfalls mögliche Analyse der gesamten Probe, beispielsweise eines Dünnschnitts, führt in der Regel zu einem Verlust der Zuordnung Phänotyp/Genotyp bzw. Phänotyp/Chemotyp. Dies ist insbesondere deshalb problematisch, weil es in den zuvor erläuterten Fällen, beispielsweise in der Tumordiagnostik, zu einer Maskierung bestimmter Gene bzw. deren Expression durch umliegende Gewebe kommen kann.
Schließlich ist es grundsätzlich auch möglich, auf Grundlage einer Untersuchung von Serienschnitten oder eines gefärbten Schnittes eine Punktion eines zur Herstellung von Schnitten verwendeten Gewebeblocks, beispielsweise mittels einer Hohlnadel, vorzunehmen. Allerdings ist es schwierig, die dreidimensionale Struktur eines entsprechenden Gewebes in angemessener Weise zu berücksichtigen, so dass auch hier unerwünschterweise Mischproben erzeugt werden können und eine eindeutige Zuordnung zur Morphologie der Probe schwierig bis unmöglich ist.
D. Kagawa et al. schlagen in dem Konferenzbeitrag „Nanoblade Array for Spatial Dissection of Single Cells and Tissues", MEMS 2017, Las Vegas, NV, USA, 22. bis 26. Januar 2017, die Verwendung einer mittels Mikrostrukturtechnik aus Silizium hergestellten Schneidgitters vor, das auf eine mikroskopische Probe gedrückt wird und diese dadurch subzellular in Kompartimente unterteilt. Nach einer entsprechenden Kompartimentierung werden die erzeugten Kompartimente mittels einer Mikropipette aufgenommen und können zur weiteren Untersuchung in eine Mikrotiterplatte überführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt sich vor diesem Hintergrund die Aufgabe, Mittel bereitzustellen, die eine gegenüber dem Stand der Technik einfachere und ohne aufwändige technische bzw. zusätzliche arbeitsintensive Schritte durchführbare, ortsaufgelöste und direkte flüssigkeitsunterstützte Untersuchung mikroskopischer Proben auf einem Objektträger ermöglichen.
Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur ortsaufgelösten, flüssigkeitsunterstützten Untersuchung einer auf einem Objektträger angeordneten mikroskopischen Probe, eine Kompartimentierungseinrichtung zur Verwendung in einem entsprechenden Verfahren sowie ein Untersuchungssystem, das eine entsprechende Kompartimentierungseinrichtung sowie einen Objektträger umfasst, mit den jeweiligen Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vor. Bevorzugte Ausgestaltungen sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Ist nachfolgend von einer „flüssigkeitsunterstützten“ Untersuchung die Rede, sei hierunter ein Verfahren verstanden, bei dem eine Probe bzw. ein Probenbereich mit einer Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, die chemisch, biochemisch oder molekularbiologisch auf die Probe bzw. den Probenbereich einwirkt. Typischerweise werden in der eingangs erwähnten Tumordiagnostik molekularbiologische Eigenschaften von tumorverdächtigen Proben bzw. Probenbereichen untersucht. Hierzu kommt typischerweise die bekannte Polymerasekettenreaktion (PCR) zum Einsatz, insbesondere die quantitative PCR (qPCR), oder isothermale Äquivalente solcher Verfahren, welche mittels Fluoreszenzfarbstoffen direkt die Amplifikation bestimmter Nukleinsäuren anzeigt. Zu deren Durchführung ist es erforderlich, eine bestimmte Probe bzw. einen Probenbereich zunächst einer sogenannten Lyse zuzuführen, durch welche Zellstrukturen, insbesondere die umschließenden Zellmembranen bzw. Zellwände, zerstört und die zu untersuchende DNA bzw. RNA oder Proteine freigesetzt werden. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte flüssigkeitsunterstützte Untersuchung ist also typischerweise eine derartige Polymerasekettenreaktion bzw. ein vorbereitender Schritt hierzu. Auch andere flüssigkeitsunterstützte molekularbiologische Untersuchungsverfahren sind grundsätzlich bekannt und können im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Allgemein eignet sich die vorliegende Erfindung für flüssigkeitsunterstützte Untersuchungsverfahren bzw. Reaktionen, die ein Aufheizen oder zyklische Heiz- und Kühlschritte verlangen. Wie auch nachfolgend noch erläutert, können dabei thermisch zumindest teilweise isolierte Kammern geschaffen werden. Selbstverständlich ist das Material entsprechend dem Analyseverfahren geeignet zu wählen (z.B. hitzebeständig).
Eine flüssigkeitsunterstützte Untersuchung einer Probe kann jedoch grundsätzlich auch eine chemische oder biochemische Untersuchung darstellen, die ohne Rückgriff auf molekularbiologische Methoden, d.h. insbesondere ohne eine Amplifizierung von DNA, durchgeführt wird. Beispielsweise kann hierbei eine Enzymaktivität durch Nachweis einer Spaltung bestimmter, beispielsweise fluoreszenzmarkierter, Substrate oder ein Vorliegen bestimmter, diagnostisch relevanter „kleiner“ Moleküle durch chemische Analyse und/oder instrumentelle Analytik wie Chromatographie und/oder Massenspektrometrie erfolgen. Für eine entsprechende Untersuchung ist es jedoch ebenfalls erforderlich, dass eine zu untersuchende Probe bzw. ein Probenbereich in gelöstem Zustand vorliegt. Ein erster Schritt einer derartigen flüssigkeitsunterstützten Untersuchung einer Probe besteht damit typischerweise im Lösen bzw. der zu untersuchenden Probe bzw. des zu untersuchenden Probenbereichs. Hierbei erfolgt also ein Einwirken der Flüssigkeit auf die Probe durch Lösen. Jedoch kann eine entsprechende Flüssigkeit auch bereits eine chemische Reaktion mit der Probe bewirken. Auch hierauf stellt die vorliegende Erfindung ab.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine Untersuchung von Dünnschnitten, die auf Glasobjektträgern, wie sie herkömmlicherweise für die Mikroskopie eingesetzt werden, aufgebracht sind. Typisch in der Tumordiagnostik sind dabei Gewebedünnschnitte mit einer Dicke von ca. 8 bis 20 Mikrometern, die auf grundsätzlich bekannte Weise entwässert, fixiert und beispielsweise unter Verwendung von Hämatoxylin/Eosin oder anderer, insbesondere zur Konservierung zu untersuchender Biomoleküle ausgelegter Farbstoffe gefärbt werden. Eine derartige Probe kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines Mikroskops in der zuvor erläuterten manuellen oder automatischen Weise optisch visualisiert, digitalisiert und beispielsweise archiviert werden. Auch Fluoreszenzmarkierung mit spezifischen Antikörpern können hier zum Einsatz kommen.
Ein wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren unter Verwendung einer Kompartimentierungseinrichtung bereitzustellen, die auf dem Objektträger selbst, der die zu untersuchende Probe und damit deren möglicherweise diagnostisch relevante Probenbereiche trägt, eine Kompartimentierung und damit eine ortsaufgelöste Untersuchung ermöglicht. Die Kompartimentierungseinrichtung weist hierzu einen Bereich mit Kammern, nachfolgend als „Kammerbereich“ bezeichnet, auf, der auf die Probe aufgesetzt werden kann. Durch das Schaffen voneinander möglichst weitgehend fluidisch getrennter Bereiche auf dem Objektträger bzw. der auf dem Objektträger angeordneten Probe wird es auf diese Weise insbesondere möglich, in diesen Bereichen Flüssigkeit zu applizieren und räumlich getrennt mit den jeweiligen Probenbereichen wechselwirken zu lassen, ohne die Kompartimentierungseinrichtung bzw. dessen Kammerbereich von dem Objektträger bzw. der Probe abzunehmen. Auf diese Weise kann beispielsweise in jedem erfindungsgemäß geschaffenen Kompartiment ein Lysat des in dem jeweiligen Kompartiment vorliegenden Probenbereichs gebildet werden und einzelne Lysate, die von anderen Probenbereichen unbeeinflusst sind, können getrennt voneinander untersucht werden. Entsprechendes gilt selbstverständlich auch, wenn keine Lyse vorgenommen wird, sondern ein anderes flüssigkeitsunterstütztes Untersuchungsverfahren zum Einsatz kommt. Beispielsweise können durch den Einsatz der vorliegenden Erfindung lokal aufgelöst insbesondere wässrige Lösungen von Probenbereichen erzeugt und individuell chemischen und/oder instrumentellen Untersuchungsverfahren unterworfen werden, ohne diese beispielsweise in Mikrotiterplatten zu überführen.
Durch eine Durchführung einer flüssigkeitsunterstützten Untersuchung auf dem Objektträger selbst und insbesondere durch eine Erfassung der Ergebnisse, beispielsweise Fluroeszenzintensitäten, während sich die Kompartimentierungseinrichtung noch auf dem Objektträger befindet, entfallen zusätzliche, aufwendige und ggf. fehleranfällige Verfahrensschritte, so dass ein entsprechendes Verfahren einfacher und schneller durchführbar ist. Durch das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren wird es möglich, beispielsweise lokale Unterschiede in den molekularbiologischen bzw. biochemischen Eigenschaften einer Probe direkt abzubilden und bestimmten Probenbereichen zuzuordnen. Durch die Kompartimentierungseinrichtung wird dabei ein Raster geschaffen, dessen Rasterpunkte bzw. -elemente direkt bestimmten Probenbereichen entsprechen.
In dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren wird eine Kompartimentierungseinrichtung verwendet, deren Kammerbereich Kammern aufweist, die sich zwischen einer oberen Ebene und einer unteren, zu der oberen Ebene parallelen unteren Ebene erstrecken. Diese Kammern sind voneinander durch sich zwischen den Ebenen erstreckende Trennwände abgegrenzt und weisen jeweils Öffnungen in Richtung der oberen Ebene und der unteren Ebene auf.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst, die Kompartimentierungseinrichtung mittels Ausrichtungsmitteln mit dem Objektträger in Eingriff zu bringen und dadurch den Kammerbereich in einer definierten Position relativ zu der Probe auszurichten.
Grundsätzlich können im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Ausrichtungsmittel an der Kompartimentierungseinrichtung angeordnet werden oder es kann eine Kompartimentierungseinrichtung verwendet werden, die bereits entsprechende Ausrichtungsmittel aufweist. Alternativ oder zusätzlich dazu können die Ausrichtungsmittel an dem Objektträger angeordnet werden oder es kann ein Objektträger verwendet werden, der die Ausrichtungsmittel bereits aufweist. Die vorliegende Erfindung kann somit auf unterschiedliche Vorrichtungen zurückgreifen, die je nach Art der vorgenommenen Analyse und den entsprechenden Randbedingungen spezifische Vorteile bieten können. Nachfolgend wird überwiegend auf Kompartimentierungseinrichtungen Bezug genommen, an die entsprechende Ausrichtungsmittel, insbesondere in Form eines umlaufenden Stegs bzw. Grats, angebracht sind bzw. angebracht werden. Die entsprechenden Erläuterungen gelten jedoch für einen Objektträger mit anzubringenden bzw. angebrachten Ausrichtungsmitteln in grundsätzlich derselben Weise.
Ein Objektträger mit Ausrichtungsmitteln kann beispielsweise einstückig aus Glas oder einem anderen transparenten Material ausgebildet werden. Insbesondere wenn ein Objektträger zum Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren ohnehin zusätzliche Merkmale wie beispielsweise Strichgitter, Kammern und dergleichen aufweist, und daher ggf. entsprechend bearbeitet werden muss, kann sich auch eine Bereitstellung von Ausrichtungsmitteln an dem Objektträger anbieten, da hierzu typischerweise dasselbe Bearbeitungsverfahren verwendet werden kann. Im anderen Fall kann, durch eine Verwendung bzw. Bereitstellung von Ausrichtungsmitteln nur an der Kompartimentierungseinrichtung bzw. eine separate Bereitstellung von Ausrichtungsmitteln, auf eine entsprechende Bearbeitung verzichtet werden. Auch eine Bereitstellung von, insbesondere miteinander wechselwirkenden, Ausrichtungsmitteln an sowohl der Kompartimentierungseinrichtung als auch an dem Objektträger ist möglich.
Wie auch nachfolgend erläutert, kann der Eingriff mit dem Objektträger beispielsweise dadurch erzielt werden, dass entsprechende Ausrichtungsmittel einer Kompartimentierungseinrichtung eine kappenartige Umschließung des Objektträgers von der Seite aus, auf der die Probe aufgebracht ist, ermöglichen. Auch andere Ausgestaltungen sind möglich. Zusätzlich können, wie ebenfalls nachfolgend erläutert, Mittel vorgesehen sein, die, nachdem die Kompartimentierungseinrichtung mit dem Objektträger in Eingriff gebracht ist, eine Justierung der Lage der Kammern bzw. des Kammerbereichs in Bezug auf die Probe ermöglichen. Vielmehr kann auch bereits durch das Schaffen eines Eingriffs der Kompartimentierungseinrichtung mit dem Objektträger eine feste und definierte Position sichergestellt werden.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren umfasst ferner, den Kammerbereich mit seiner unteren Ebene mit der Probe unter Ausbildung eines flüssigkeitsdichten Abschlusses zwischen zumindest einem Teil der Trennwände und der Probe in Kontakt zu bringen, so dass unterschiedliche Probenbereiche der Probe direkt und ohne weiteren Zwischenschritt jeweils in einzelnen Kammern angeordnet werden. Insbesondere können die Trennwände dabei auf die Probe aufgesetzt oder in die Probe eingedrückt werden, so dass sich ein entsprechender flüssigkeitsdichter Abschluss ausbildet. Dies kann insbesondere zusammen mit dem zuvor erläuterten Schritt erfolgen, in dem die Kompartimentierungseinrichtung mittels der Ausrichtungsmittel mit dem Objektträger in Eingriff gebracht und dadurch der Kammerbereich in der definierten Position relativ zu der Probe ausgerichtet wird. Es ist jedoch auch möglich, erst die definierte Position relativ zu der Probe durch den Eingriff von Kompartimentierungseinrichtung und Objektträger sicherzustellen und erst daran anschließend, beispielsweise durch ein Drücken der Kompartimentierungseinrichtung auf die Probe, den Kammerbereich mit seiner unteren Ebene mit der Probe unter Ausbildung des flüssigkeitsdichten Abschlusses zwischen zumindest einem Teil der Trennwände und der Probe in Kontakt zu bringen. In beiden Fällen decken sich der Kammerbereich bzw. einzelne Kammern desselben einen definierten Bereich der Probe ab, so dass bestimmten Probenbereichen bestimmte Kammern zugeordnet sind. Vor, nach und gegebenenfalls während des Aufbringens der Kompartimentierungseinrichtung liegt der Probenträger auf dem Mikroskoptisch eines Mikroskops, welches ein Digitalisieren des Probenbildes mittels einer Kamera zu jedem Zeitpunkt erlaubt. Weiterhin kann die Probe auf dem Objektträger mit der Kompartimentierungseinrichtung bei Zugabe von Flüssigkeit und auch zur Reaktionsauswertung im Mikroskop verbleiben. Hierbei sind heizbare Mikroskoptische von Vorteil, um Lyse des Gewebes und PCR bzw. isothermale Reaktionen zu begünstigen.
Erfindungsgemäß ist weiter vorgesehen, wenigstens eine Untersuchungsflüssigkeit in zumindest einen Teil der Kammern einzubringen und in diesen eine flüssigkeitsunterstützte Untersuchung durchzuführen, während der Kammerbereich mit seiner unteren Ebene weiterhin mit der Probe in Kontakt gebracht ist. Wie bereits erläutert kann auf diese Weise eine entsprechende Untersuchung erleichtert werden und eine definierte Position von jeweils erhaltenen Ergebnissen in Bezug auf die Probe bleibt bestehen. Hierdurch ergibt sich eine einfach auswertbare und intuitive Detektion von bestimmten lokal aufgelösten, beispielsweise molekularbiologischen oder biochemischen, Probeneigenschaften. Die jeweils erhaltenen Ergebnisse können dabei, wie erwähnt, direkt und lagerichtig bestimmten Probenbereichen zugeordnet werden.
Die in dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren eingesetzte Kompartimentierungseinrichtung umfasst, mit anderen Worten, ein Kammerraster, das auf die auf dem Objektträger angeordnete mikroskopische Probe aufgesetzt werden kann. Ist dies erfolgt, und durch zusätzliche Ausrichtungsmittel eine definierte Position des Kammerbereichs relativ zu der Probe sichergestellt, ist die mikroskopische Probe oder ein bestimmter Bereich hiervon von einer Vielzahl von Kammern überlagert, welche jeweils Flüssigkeit aufnehmen können, die durch die Öffnungen zu der unteren Ebene der Kompartimentierungseinrichtung mit einem entsprechenden Bereich der Probe in Kontakt kommen kann. Eine laterale Kreuzkontamination zwischen den einzelnen Probenbereichen wird durch die sich zwischen der oberen und der unteren Ebene erstreckenden Trennwände verhindert. Die räumliche Erstreckung der Kompartimentierungseinrichtung in Richtung der oberen und unteren Ebene bzw. jeweils parallel hierzu ist dabei typischerweise größer als eine Erstreckung senkrecht zu der oberen und unteren Ebene. Durch die Ausrichtungsmittel ist dabei stets eine eindeutige bzw. definierte und nachvollziehbare Zuordnung von einzelnen Kammern zu bestimmten Probenbereichen möglich. Die Probe kann auf diese Weise analytisch abgerastert werden. Zudem kann die Probe auf dem Objektträger über den gesamten Prozess im Mikroskop verbleiben und entsprechend ausgewertet, insbesondere optisch inspiziert, werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Objektträger mit der Probe also in ein Mikroskopsystem eingebracht werden und die Auswertung kann mittels des Mikroskopsystems durchgeführt werden.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Kompartimentierungseinrichtung umfasst, mit nochmals anderen Worten, einen vorzugsweise flachen Bereich, in dem nebeneinander eine Vielzahl nach oben und unten geöffneter Kammern angeordnet ist, und der auf die Probe in einer Weise aufgesetzt werden kann, dass Kompartimente geschaffen werden, der laterale Wandungen durch die Trennwände der Kompartimentierungseinrichtung und deren Boden durch die Probe bzw. den Objektträger gebildet werden. Nach oben, d.h. zu der der Probe abgewandten Seite und zu der oberen Ebene hin, sind diese Kammern geöffnet und können von hier aus mit einer jeweils gewünschten Flüssigkeit befüllt werden. Eine Analyse kann auf diese Weise noch auf dem Objektträger erfolgen.
Die Kompartimentierungseinrichtung bzw. deren Kammerbereich ist insbesondere dadurch zum Aufsetzen auf zumindest einen Teil der auf dem Objektträger angeordneten mikroskopischen Probe bemaßt, bestimmt und ausgebildet, dass sie bzw. er eine Größe aufweist, die es erlaubt, einen Bereich der Probe mit den genannten Kammern abzudecken und insbesondere einen im wesentlichen flüssigkeitsdichten Abschluss zwischen der unteren Ebene bzw. den in der unteren Ebene endenden Trennwänden einerseits und der Probe bzw. dem Objektträger andererseits zu bilden, wenn die Kompartimentierungseinrichtung auf den Objektträger mit der Probe aufgesetzt ist. Details hierzu werden nachfolgend noch erläutert. Insbesondere schafft die untere Ebene der Kompartimentierungseinrichtung, zu der sich die Kammern jeweils öffnen, einen ebenen Abschluss, der ein insgesamt flächiges Kontaktieren der Probe bzw. des Objektträgers erlaubt.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können Proben in unterschiedlicher Form untersucht werden. Eine entsprechende Probe kann beispielsweise in Form eines Dünnschnitts, eines Ausstrichs, eines Zupf- oder Quetschpräparats, eines Mazerats oder einer Suspension auf den Objektträger aufgebracht werden. Besonders günstig ist es dabei, wenn die Probe lokal differenziert unterschiedliche mikroskopische Strukturen, beispielsweise unterschiedliche Zellen oder Gewebe, aufweist, denen dann durch die erfindungsgemäß vorgeschlagene ortsaufgelöste flüssigkeitsunterstützte Untersuchung lokal aufgelöst unterschiedliche, beispielsweise molekularbiologische oder biochemische, Eigenschaften zugeordnet werden können.
In dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren kann die flüssigkeitsunterstützte Untersuchung insbesondere eine Lysereaktion umfassen, bei der ein Lysat gebildet wird. Die Lyse kann chemisch und/oder unter Verwendung von außen zugeführter Hitze hervorgerufen werden. Das gebildete Lysat kann anschließend einer weiteren Reaktion unterworfen werden. Sämtliche erläuterten Schritte erfolgen dabei, während der Kammerbereich mit seiner unteren Ebene weiterhin mit der Probe in Kontakt gebracht ist und damit die definierte Position relativ zu der Probe weiterhin besteht.
Insbesondere kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Lysereaktion und/oder die weitere Reaktion temperaturgesteuert durchgeführt werden. Insbesondere kann dabei die Untersuchungsflüssigkeit bzw. der Objektträger mit Probe und Kompartimentierungseinrichtung und Untersuchungsflüssigkeit einem Temperaturprogramm mit mehreren, insbesondere zyklisch durchlaufenen, Temperaturstufen unterworfen werden. Dies kann insbesondere im Mikroskop selbst erfolgen, das dazu vorzugsweise entsprechend temperierbare Bereiche, beispielsweise Probentische, aufweist.
Wie bereits erwähnt, kann die weitere Reaktion insbesondere eine Polymerasekettenreaktion, beispielsweise eine Polymerasekettenreaktion mit Fluoreszenzdetektion (qPCR, isothermale Reaktion) und/oder eine weitere Fluroeszenznachweisreaktion umfassen. Besonders vorteilhaft ist es dabei, wenn sich das Ergebnis der jeweiligen weiteren Reaktion direkt in den einzelnen Kammern des Kammerbereichs der Kompartimentierungseinrichtung detektieren lässt, insbesondere visuell, weil auf diese Weise eine besonders einfache Zuordnung zu den jeweils von den entsprechenden Kammern abgedeckten Probenbereichen, welche vor, während und nach der Reaktion mit Hilfe der Mikroskopoptik und mindestens einer Kamera digital erfasst werden können, möglich ist. Auf diese Weise kann, wie bereits mehrfach erwähnt, mittels der Kompartimentierungseinrichtung eine Rasterung einer entsprechenden Probe erfolgen.
In diesem Zusammenhang ist es besonders vorteilhaft, wenn die Probe, insbesondere mittels einer digitalen Auswerteeinrichtung, unter Erhalt bzw. Erzeugung von Auswertungsdaten ausgewertet wird, insbesondere bevor ein beliebiger der zuvor erläuterten Schritte durchgeführt wird und nachdem gegebenenfalls ein vorangehender dieser Schritte durchgeführt wurde, und/oder während der Reaktion selbst. Auf diese Weise können anschließend jeweils Ergebnisse der flüssigkeitsunterstützten Untersuchung für zumindest einen Teil der Kammern mit den oder den jeweiligen Auswertungsdaten korreliert werden. Grundsätzlich kann die Auswertung dabei in Form einer bildgebenden Auswertung, also unter Erhalt bzw. Erzeugung von Bilddaten, vorgenommen werden. Es ist jedoch auch eine nicht bildgebende Auswertung möglich, in der anstelle von Bilddaten andersartige digitale Signale erhalten werden, beispielsweise einzelne Fluoreszenzsignale. Vorteilhaft kann weiterhin sein, alle Schritte in einem Mikroskopsystem durchzuführen, da die Probe nicht manuell von Gerät zu Gerät bewegt werden muss.
In jedem Fall können für einen oder mehrere der selektierten Probenbereiche jeweils unterschiedliche flüssigkeitsunterstützte Untersuchungen festgelegt werden und/oder durchgeführt werden. Auf diese Weise können unterschiedliche Kompartimente einer Probe in einer jeweils angepassten Weise behandelt werden.
Beispielsweise kann ein Verfahren auf Grundlage von Bilddaten umfassen, dass die zuvor aufgenommenen bzw. als Bilddaten erhaltenen Auswertungsdaten in dasselbe Raster unterteilt werden, wie es auch durch die Verwendung der Kompartimentierungseinrichtung bzw. deren Kammerbereichs bereitgestellt wird. Auf diese Weise ist direkt eine Zuordnung von Untersuchungsergebnissen zu entsprechenden Auswertungsdaten und damit Probenbereichen möglich. Auch eine Überlagerung der Auswertungsdaten mit weiteren Auswertungsdaten, die in dem Untersuchungsverfahren erhalten wurden, insbesondere in Form einer sogenannten Heatmap, ist möglich. Beispielsweise kann auch, wenn die Ausrichtungsmittel zusätzlich Justiermittel umfassen, eine durch diese bewirkte Justage bei einer entsprechenden Assoziierung berücksichtigt werden. Hierbei handelt es sich insbesondere um einen Versatz des Kammerbereichs in einem bestimmten Umfang in x-Richtung und y-Richtung, der einer Verschiebung eines Rasters, das durch die Kammern erzeugt wird, entspricht.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Kompartimentierungseinrichtung zur Verwendung in einem Verfahren zur ortsaufgelösten, flüssigkeitsunterstützten Untersuchung einer auf einem Objektträger angeordneten mikroskopischen Probe, welche einen Kammerbereich mit Kammern umfasst, die jeweils obere Öffnungen in Richtung einer oberen Ebene und untere Öffnungen in Richtung einer unteren Ebene aufweisen, und die voneinander durch Trennwände abgegrenzt sind, die sich zwischen der oberen Ebene und der unteren Ebene erstrecken. Erfindungsgemäß zeichnet sich eine derartige Kompartimentierungseinrichtung insbesondere dadurch aus, dass sie Ausrichtungsmittel aufweist oder zur Kopplung mit solchen Ausrichtungsmitteln eingerichtet sind, mittels derer die Kompartimentierungseinrichtung mit dem Objektträger in Eingriff bringbar und der Kammerbereich in einer definierten Position relativ zu der Probe ausrichtbar ist, so dass unterschiedliche Probenbereiche der Probe direkt und ohne weiteren Zwischenschritt jeweils in einzelnen Kammern angeordnet werden können. Die Kompartimentierungseinrichtung kann insbesondere dadurch zur Kopplung mit Ausrichtungsmitteln eingerichtet sein, dass sie Anbringstrukturen, beispielsweise in Form von Graten, Stegen, Rillen, Löchern und dergleichen, zur Befestigung der Ausrichtungsmittel aufweist.
Zu den vorteilhaften Eigenschaften einer entsprechenden Kompartimentierungseinrichtung sei auf die obigen Erläuterungen verwiesen. Die Kompartimentierungseinrichtung kann in ihren unterschiedlichen, auch nachfolgend noch erläuterten Ausgestaltungen in einem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß sämtlichen zuvor erläuterten Ausführungsformen verwendet werden, sofern diese dafür geeignet ist.
Insbesondere können im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Trennwände der Kompartimentierungseinrichtung derart ausgebildet sein, dass die Kammern ein sich parallel zu der oberen Ebene und der unteren Ebene erstreckendes Viel- bzw. Mehreck-, Waben-, Kreis-, Oval-, Quadrat-, Rechtecks- oder Dreiecksraster bilden. Auch andere beliebige Formen, insbesondere speziell an individuelle Proben nach deren Digitalisierung angepasste Formen, können verwendet werden. Dieses Raster wird dabei insbesondere in Draufsicht auf die obere bzw. die untere Ebene erkennbar. Die obere bzw. die untere Ebene des Rasterbereichs können dabei vollständig von einem entsprechenden Raster abgedeckt sein, es kann jedoch auch nur in bestimmten Bereichen ein derartiges Raster ausgebildet sein. Die einzelnen Elemente des Rasters und damit die Kammern der Kompartimentierungseinrichtung können, insbesondere im Fall eines Viel- bzw.Mehreck-, Waben-, Quadrat- oder Rechteckrasters, zwischenraumlos aneinander angrenzen, es ist jedoch auch möglich, ein entsprechendes Raster mit Zwischenräumen bereitzustellen, beispielsweise, aber nicht nur, im Falle eines Kreisrasters. Ein Abstand zwischen entsprechenden Rasterelementen verringert dabei das Risiko einer Kreuzkontamination, insbesondere durch unterhalb der Trennwände ausgetauschte Flüssigkeit, und erleichtert ggf. die Herstellung, ermöglicht jedoch keine lückenlose Erfassung eines zu untersuchenden Probenbereichs.
Spezielle Aufführungen der Kompartimentierungseinrichtung können auch Kammern enthalten, die speziell an eine zuvor visualisierte Probe angepasst wurden, um beispielsweise visuell identifizierte pathologische Bereiche räumlich von gesunden Bereichen abzugrenzen. Solche speziellen Kompartimentierungseinrichtungen, in denen die Kammern oder ein Teil hiervon vorteilhafterweise ein auf eine visuelle Beschaffenheit der Probe abgestimmtes Raster bildet, können beispielsweise mittels 3D-Druck individuell und probenspezifisch erstellt werden.
Die jeweils eingesetzte Rasterung, die beispielhaft für quadratische, rechteckige, wabenförmige und runde Raster unter Bezugnahme auf die beigefügten 4A bis 4D noch näher veranschaulicht wird, kann sich insbesondere nach der jeweiligen bekannten oder mikroskopisch ermittelten Morphologie der zu untersuchenden Probe bzw. deren Probenbereichen und der zur Verfügung stehenden Fertigungstechnik richten. Ein Quadratraster erlaubt in diesem Zusammenhang eine besonders einfache referenzierende Bezugnahme auf bestimmte Probenbereiche, nämlich insbesondere durch Angabe von Zeilen und Spalten, wie auch unter Bezugnahme auf die beigefügte 4A erläutert. Die Quadratrasterung ermöglicht ferner eine äquidistante „Abtastung“ der Probe. Hingegen kann eine Rechteckrasterung beispielsweise dann von Vorteil sein, wenn die untersuchte Probe selbst sich beispielsweise in einer bestimmten Vorzugsrichtung erstreckende Gewebe, Zellen oder dergleichen aufweist. In diesem Fall kann eine Kompartimentierungseinrichtung mit einer Rechteckrasterung beispielsweise derart auf die Probe aufgesetzt werden, dass eine Längserstreckung der einzelnen Rechtecke einer Längserstreckung der Gewebestrukturen entspricht.
Mittels einer Wabenrasterung kann eine lückenlose Abdeckung des untersuchenden Probenbereichs bei gleichzeitiger weitgehender Approximierung einer Kreisform für den Grundriss jeder Kammer erzielt werden, was insbesondere auch bei entsprechender Oberflächenspannung eine besonders günstige Flüssigkeitsausbreitung in sämtliche Bereiche der Kammern ermöglicht. Mit anderen Worten kann eine Flüssigkeit in einem derartigen Fall besonders gut auch in die Ecken der Kammern „hineinlaufen“ und es wird die Bildung von Luftblasen bzw. Toträumen weitgehend vermieden. Entsprechendes gilt verstärkt für ein Kreisraster, wobei, wie insbesondere bei Betrachtung der beigefügten 4D ersichtlich, in einem derartigen Fall jedoch keine vollständige, d.h. lückenlose, Abdeckung der gesamten Probe möglich ist. Bei Flüssigkeiten geeigneter Viskositäten bzw. Oberflächenspannungen kann sich auch die Verwendung eines Dreiecksrasters als günstig erweisen. In diesem Fall kann durch die engen Winkel der Probenkammern durch Kapillarwirkung die Flüssigkeit besonders gut in diese eindringen.
Mit besonderem Vorteil kann eine Kompartimentierungseinrichtung derart ausgebildet sein, dass sich die Trennwände, die sich zwischen der oberen Ebene und der unteren Ebene erstreckenden Kammern abgrenzen, zumindest in einem an die untere Ebene angrenzenden Bereich verjüngen. Auf diese Weise kann, wie auch insbesondere unter Bezugnahme auf die 5A erläutert, jeweils eine „Schneide“ geschaffen werden, die in eine, beispielsweise in Paraffin eingebettete, Probe gedrückt werden kann, so dass im Bereich der unteren Ebene, mit der die Trennwände die Probe bzw. den Objektträger kontaktieren, ein flüssigkeitsdichter bzw. weitgehend flüssigkeitsdichter Abschluss geschaffen wird. Auf diese Weise kann eine Kreuzkontamination zwischen Kammern der Kompartimentierungseinrichtung vermieden werden. Ferner kann durch ein entsprechendes Eindrücken verjüngter Trennwände in die Probe an den jeweiligen Eindruckstellen die Probe mechanisch teilweise vom Objektträger abgelöst werden, so dass hier ein besonders intensiver Angriff der jeweils verwendeten Flüssigkeit möglich ist, was zu kürzeren Bearbeitungszeiten führt.
Alternativ dazu kann in einer Kompartimentierungseinrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung auch eine Verbreiterung der Trennwände zumindest in einem an die untere Ebene angrenzenden Bereich vorgesehen sein, wobei die Trennwände in diesem Fall sich in einem Teil der unteren Ebene erstreckende Kontaktflächen aufweisen. Eine entsprechende Ausgestaltung des insbesondere unter Bezugnahme auf die beigefügte 5B erläutert. Durch eine derartige Ausgestaltung kann insbesondere die Kontaktfläche zwischen den Trennwänden der Kompartimentierungseinrichtung und der Probe vergrößert werden, was ebenfalls zu einer Unterbindung bzw. zumindest Verringerung eines Flüssigkeitsaustausches zwischen den einzelnen Kammern führt. Der Vorteil gegenüber der zuletzt erläuterten Ausführungsform ist der, dass die Probe nicht mechanisch beeinflusst wird; jedoch kann in einem derartigen Fall konstruktionsbedingt aufgrund der verbreiterten Trennwände keine vollständig lückenlose Erfassung der Probe erfolgen.
In sämtlichen Fällen, d.h. der verjüngten oder verbreiterten Ausbildung der Trennwände in einem an die untere Ebene angrenzenden Bereich, aber auch dann, wenn keine speziellen geometrischen Modifikationen vorgenommen werden, kann zur Verbesserung der Abdichtwirkung bzw. Vermeidung eines Flüssigkeitsaustauschs zwischen den Kammern vorgesehen sein, dass die Trennwände zumindest in dem an die untere Ebene angrenzenden Bereich, insbesondere in einem der unteren Ebene zuweisenden Bereich, mit einer flüssigkeitsabstoßenden Beschichtung versehen sind. Hierbei kann es sich insbesondere, falls das flüssigkeitsunterstützte Verfahren die Verwendung einer wässrigen Lösung umfasst, um eine Hydrophobisierung handeln, die eine Benetzung durch die wässrige Lösung verhindert.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist eine Kompartimentierungseinrichtung vorgesehen, bei der sich die Kammern zumindest in einem zu der oberen Ebene angrenzenden Bereich erweitern. Auf diese Weise kann insbesondere die Einbringung von Flüssigkeit erleichtert werden. Die Flüssigkeit kann durch die Verjüngungen sowohl trichterartig in die Kammern fließen; durch die Verjüngungen kann jedoch auch beispielsweise die Führung einer Pipette erleichtert werden.
Zur Erleichterung der Einbringung von Flüssigkeit kann die erfindungsgemäße Kompartimentierungseinrichtung gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform auch eine Flüssigkeitsverteileinrichtung zur Verteilung von Flüssigkeit auf die Kammern aufweisen. Eine derartige Flüssigkeitsverteileinrichtung kann beispielsweise einen Bereich umfassen, in den, beispielsweise mittels einer Pipette, Flüssigkeit eingebracht werden kann, und aus dem, beispielsweise über Kanäle, Kapillaren, Rillen und dergleichen, insbesondere unter Ausnutzung der Kapillarwirkung, die Flüssigkeit in die einzelnen Kammern abfließen kann. Es kann jedoch auch beispielsweise vorgesehen sein, eine entsprechende Kompartimentierungseinrichtung mit einem Flüssigkeitsdamm auszubilden, der oberhalb der oberen Fläche einen entsprechend gekammerten bzw. gerasterten Bereich umgibt. Auf diese Weise kann eine Füllung der Kammern mit Flüssigkeit auch beispielsweise dadurch erfolgen, dass die gesamte Kompartimentierungseinrichtung mit Flüssigkeit überschichtet und, noch vor dem Einsetzen einer Einwirkung der Flüssigkeit auf die Probe, überschüssige Flüssigkeit abgezogen wird.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Ausrichtungsmittel der erfindungsgemäßen Kompartimentierungseinrichtung zur Aufnahme des Objektträgers ausgebildete Aufnahmestrukturen auf. Wie bereits erwähnt, können entsprechende Aufnahmestrukturen beispielsweise ermöglichen, dass die Kompartimentierungseinrichtung insgesamt einen entsprechenden Objektträger in Form einer Kappe überdeckt. Dieser Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung kommt zugute, dass Objektträger, wie sie typischerweise in der Mikroskopie eingesetzt werden, genormte Maße, z.B. 76 x 26 mm oder 48 x 28 mm, aufweisen. Eine Aufnahmestruktur kann daher einen flächigen Bereich aufweisen, der auf die Oberfläche des Objektträgers aufgelegt wird, sowie einen diesen flächigen Bereich umgebenden, gegenüber dem flächigen Bereich vorspringenden Rand, der so bemaßt ist, dass sich ein Objektträger in diesen einsetzen lässt. Auf diese Weise wird eine Vertiefung geschaffen, die den Objektträger aufnimmt, und in der dieser vorzugsweise nicht mehr oder lediglich in geringem Umfang lateral beweglich ist. Anstelle eines vorspringenden Randes können auch Vorsprünge andere Art, beispielsweise Grate, Zapfen und dergleichen, vorgesehen sein, die einen Objektträger an seinen Rändern fassen und diesen vorzugsweise in seiner Position festlegen.
Allgemein ist also eine Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung besonders vorteilhaft, bei der die Aufnahmestrukturen einen durch ein oder mehrere vorspringende Elemente umgebenen Einsatzbereich für den Objektträger aufweisen. Ist ein entsprechender Objektträger in einem derartigen Einsatzbereich eingesetzt, kann, beispielsweise durch eine Horizontalbewegung, der Kammerbereich mit der Probe in Kontakt gebracht werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung umfassen die Ausrichtungsmittel Justiermittel, mittels derer der die Kammern umfassende Kammerbereich über einem mit dem Objektträger in Eingriff gebrachten Bereich der Kompartimentierungseinrichtung justierbar ist. Mit anderen Worten kann also zunächst der Objektträger mit einem hierfür vorgesehenen Bereich der Kompartimentierungseinrichtung in Eingriff gebracht werden, wodurch jedoch der Kammerbereich noch nicht endgültig festgelegt ist. Vielmehr kann letzterer in dieser Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung auch anschließend noch gegenüber dem in Eingriff gebrachten Bereich verschoben werden. Auch hierdurch ist eine definierte Position einstellbar. Eine entsprechende Justierung kann insbesondere dadurch nachvollziehbar gemacht werden, dass die Kompartimentierungseinrichtung bzw. die Justiermittel über eine geeignete Skalierung verfügen, welche anzeigt, in welchem Umfang die Justierung des Kammerbereichs gegenüber einem anderen Bereich der Kompartimentierungseinrichtung erfolgt ist.
Insbesondere kann eine entsprechende Kompartimentierungseinrichtung auch eine Verstellbarkeit zumindest des Kammerbereichs in z-Richtung, d.h. senkrecht zur Oberfläche des Objektträgers ermöglichen und entsprechende Mittel aufweisen. Auf diese Weise ist es möglich, den Kammerbereich ohne Verletzung der Probe von dieser abzuheben, zu verschieben bzw. zu justieren und anschließend wieder auf die Probe aufzusetzen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung kann die Kompartimentierungseinrichtung wenigstens eine Halterung aufweisen, die zur Verbindung mit dem Objektträger oder einer mit dem Objektträger verbindbaren Haltevorrichtung eingerichtet ist. Hierbei kann es sich beispielsweise um Halteelemente handeln, die mittels einer oder mehreren Klammern an einem Objektträger angeklammert werden können, oder um mit der Kompartimentierungseinrichtung selbst dauerhaft verbundene Befestigungseinrichtungen. Auf diese Weise kann die Kompartimentierungseinrichtung unverrückbar und unabnehmbar auf dem Objektträger befestigt und mit diesem zusammen zu einer weiteren Bearbeitung transportiert werden. Eine entsprechende Halterung bzw. Haltevorrichtung kann insbesondere auch einen Deckel umfassen, mittels dessen die Kammern der Kompartimentierungseinrichtung abgedeckt und der in einem die Kammern abdeckenden Zustand befestigt werden kann. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, eine aus der Kompartimentierungseinrichtung, dem Objektträger mit der Probe und dem Deckel gebildete Anordnung zu einer weiteren Bearbeitung zu transportieren, insbesondere zu einer zyklischen oder nichtzyklischen thermischen Behandlung im Rahmen einer Polymerasekettenreaktion. Durch die Verwendung des Deckels kann eine unerwünschte Verdunstung der Flüssigkeit in den Kammern vermieden werden.
Bei einer erfindungsgemäß ausgebildeten Kompartimentierungseinrichtung kann zumindest ein Teil der Kammern ein Volumen von 0,05 bis 50 Mikrolitern aufweisen und/oder es kann eine Anzahl von mindestens zwei Kammern vorgesehen sein. Die Kammern können insbesondere eine Größe in einem Bereich von 0,01 bis 100 Quadratmillimetern aufweisen. Das Kammervolumen, die Anzahl der Kammern und der durch die Kammern abdeckbare Bereich der Probe richten sich insbesondere nach dem jeweils durchzuführenden Untersuchungsverfahren bzw. den Eigenschaften der Probe, insbesondere dem Grad der Feinauflösung von deren Morphologie bzw. der im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewünschten räumlichen Auflösung der Analyse.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf ein Untersuchungssystem umfassend einen Objektträger und zumindest eine Kompartimentierungseinrichtung, wie sie zuvor in unterschiedlichen Ausgestaltungen erläutert wurde. Ein derartiges Untersuchungssystem profitiert von den zuvor bezüglich des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Kompartimentierungseinrichtung und ihrer jeweiligen Ausgestaltungen erläuterten Vorteilen. Auf diese wird daher an dieser Stelle ausdrücklich verwiesen. Das Untersuchungssystem kann insbesondere als ein Mikroskopsystem ausgebildet sein bzw. ein solches Mikroskopsystem umfassen.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Untersuchungssystem umfasst gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform insbesondere einen Deckel, und kann auf diese Weise in Form eines Mehrkammernprobengefäßes beispielsweise in einer molekularbiologischen Analyse verwendet werden. Beispielsweise kann die Anordnung insgesamt in einen Thermocycler verbracht und dort Temperaturzyklen unterworfen werden, wie dies grundsätzlich für eine Polymerasekettenreaktion bekannt ist. Ein entsprechender Thermocycler weist dabei eine oder mehrere Aufnahmen auf, die eine besonders wirksame thermische Kontaktierung der Kammern der Kompartimentierungseinrichtung ermöglichen. Insbesondere kann dabei eine thermische Anbindung durch den Objektträger selbst, der insbesondere eine bessere thermische Leitfähigkeit als eine typischerweise aus Kunststoff ausgebildete Kompartimentierungseinrichtung aufweisen kann, hergestellt werden. Die Kompartimentierungseinrichtung ist dabei insbesondere in den für das jeweilige Untersuchungsverfahren relevanten Temperaturbereichen temperaturfest ausgebildet, beispielsweise in einem Temperaturbereich bis 100 °C.
Neben der klassischen Polymerasekettenreaktion sind auch isothermale Amplifikationsmethoden unter Verwendung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Untersuchungssystems durchführbar, die keine zyklischen Heiz- und Kühlschritte benötigen. Besonderer Vorteil dieser Techniken ist das mögliche Erhitzen der Probe direkt auf dem Mikroskoptisch, z.B. durch Verwendung einer Klimakammer wie für Lebendzellapplikationen, oder durch Verwendung von heizbaren Tischen. Isothermale Amplifikationen erfolgen für gewöhnlich zwischen 35 bis 65 °C und laufen sehr sc hnell ab, so dass das Reaktionsergebnis direkt und schnell mit dem Mikroskop in den einzelnen Kammern ausgelesen werden kann. Bei solchen Methoden werden die Annealing- und Amolifikationstemperaturen aufeinander abgestimmt und das thermische Aufschmelzen von Nukleinsäuren durch Moleküle (z.B. Helikasen oder besondere „strand-displacement Polymerasen) ersetzt.
Daher schlägt die vorliegende Erfindung gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein Untersuchungssystem vor, das eine Temperiereinrichtung zum Erwärmen und/oder Kühlen des Objektträgers mit der Kompartimentierungseinrichtung zur Durchführung der oben erläuterten temperaturabhängigen Reaktionen aufweist.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert, welche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen.
Figurenliste

1 veranschaulicht einen Objektträger mit einer mikroskopischen Probe, der gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ausgewertet werden kann.
2A bis 2D veranschaulichen Anordnungen mit einem Objektträger und einer Kompartimentierungseinrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung in unterschiedlichen Ansichten.
3A bis 3D veranschaulichen Anordnungen mit einem Objektträger und einer Kompartimentierungseinrichtung gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung in unterschiedlichen Ansichten.
4A bis 4C veranschaulichen Rasterungen von Kompartimentierungseinrichtungen gemäß Ausführungsformen der Erfindung.
5A und 5B veranschaulichen eine Ausbildung von Trennwänden von Kompartimentierungseinrichtungen gemäß Ausführungsformen der Erfindung.
6 veranschaulicht ein Verfahren gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
7 veranschaulicht in stark vereinfachter Darstellung ein Untersuchungssystem gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.

In den Figuren sind einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und werden der Übersichtlichkeit halber nicht wiederholt erläutert.
Ausführungsformen der Erfindung
1 veranschaulicht einen Objektträger 1 mit einer mikroskopischen Probe 2, der gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ausgewertet werden kann. Die mikroskopische Probe 2 ist, wie grundsätzlich bekannt und zuvor erläutert, beispielsweise in Form eines mikroskopischen Dünnschnitts mit ca. 8 Mikrometern Dicke auf den Objektträger 1 aufgebracht. Wie ebenfalls erwähnt, kann eine entsprechende mikroskopische Probe 2 jedoch auch beispielsweise in Form eines Ausstrichs, eines Zupf- oder Quetschpräparats, eines Mazerats oder einer Suspension auf den Objektträger aufgebracht sein. Typischerweise ist die mikroskopische Probe 2 auf dem Objektträger in geeigneter Weise angefärbt, beispielsweise unter Verwendung von Hämatoxylin/Eosin, um Gewebestrukturen, Zellkerne, Membranen und dergleichen sichtbar zu machen.
Die mikroskopische Probe 2 soll im dargestellten Beispiel zwei Probenbereiche 2a und 2b umfassen, die beispielsweise tumorverdächtige und daher zu überprüfende Gewebe oder Zellverbände darstellen, und die insbesondere durch eine visuell-optische bzw. automatisierte digitaloptische Analyse erfasst wurden. Wie eingangs erläutert, umfassen herkömmliche Analyseverfahren zur Untersuchung entsprechender Probenbereiche 2a und 2b beispielsweise, diese nach einer entsprechenden optischen Erfassung und gegebenenfalls Markierung manuell oder unter Verwendung von Lasermikrodissektion zu gewinnen und beispielsweise einer molekularbiologischen Analyse zuzuführen. Hierbei treten die bereits eingangs erläuterten Nachteile auf. Daher setzt die vorliegende Erfindung eine Kompartimentierungseinrichtung bzw. ein Verfahren ein, wie sie bzw. es bereits zuvor ausführlich beschrieben wurde und unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Figuren in Ausgestaltungen nochmals im Detail erläutert wird.
In den 2A bis 2D sind ein Objektträger 1 und eine Kompartimentierungseinrichtung 10 gemäß einer Ausführungsform der Erfindung in unterschiedlichen Ansichten veranschaulicht. Die Darstellung der 2A bis 2D ist dabei stark vereinfacht, insbesondere bezüglich der Kompartimentierungseinrichtung 10.
Die Kompartimentierungseinrichtung 10, die beispielsweise aus Kunststoff ausgebildet sein kann und in den 2A und 2B in von dem Objektträger 1 getrenntem und in den 2C und 2D in auf den Objektträger 1 aufgesetztem Zustand veranschaulicht ist, umfasst in der hier veranschaulichten Ausführungsform sich zwischen einer oberen Ebene 11 und einer unteren, zu der oberen Ebene parallelen unteren Ebene 12 erstreckende und voneinander durch sich zwischen den Ebenen erstreckende Trennwände 14 abgegrenzte Kammern 15, die nur in einem Fall mit Bezugszeichen versehen sind. Auf diese Weise wird ein insgesamt mit 13 bezeichneter Kammerbereich gebildet. Es versteht sich, dass eine in der Praxis eingesetzte Kompartimentierungseinrichtung 10 gemäß einer Ausführungsform der Erfindung eine größere oder geringere Anzahl von Kammern 15 aufweisen kann als hier gezeigt. Diese können anstelle eines in den 2A bis 2D dargestellten Quadratrasters auch eine andere Art der Rasterung aufweisen, wie sie beispielsweise auch in den 4A bis 4D veranschaulicht ist.
Die 2A zeigt eine perspektivische Ansicht des Objektträgers 1 mit der Probe 2 und der Kompartimentierungseinrichtung 10 schräg von oben, so dass die für eine nachfolgende Analyse zugängliche Oberseite der Kompartimentierungseinrichtung 10 sichtbar ist. Die 2B zeigt hingegen eine perspektivische Ansicht des Objektträgers 1 mit der Probe 2, die hier nicht gesondert veranschaulicht ist, und die Kompartimentierungseinrichtung 10 schräg von unten, so dass die zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einer Ausführungsform der Erfindung auf den Objektträger 1 aufgesetzten Bereiche der Kompartimentierungseinrichtung 10 sichtbar sind. In 2B wurden nicht alle in 2A bezeichneten Elemente erneut mit Bezugszeichen versehen.
Die Kammern 15 der Kompartimentierungseinrichtung 10 weisen gemäß der hier veranschaulichten Ausführungsform der Erfindung jeweils Öffnungen 16, 17 sowohl zu der oberen Ebene 11 als auch der unteren Ebene 12 auf (jeweils in 2A bzw. 2B an nur einem Beispiel entsprechend bezeichnet). Insbesondere sind die Kammern 15 der Kompartimentierungseinrichtung 10 lateral durch die durchgängig ausgebildeten Trennwände 14 voneinander getrennt, so dass ein lateraler Flüssigkeitsaustausch zwischen den Kammern 15 verhindert wird.
Wie aus 2B ersichtlich, weist die Kompartimentierungseinrichtung 10 Ausrichtungsmittel 18 auf, mittels derer die Kompartimentierungseinrichtung 10 mit dem Objektträger 1 in Eingriff und der Kammerbereich 13 in eine definierte Position relativ zu der Probe 2, die fest auf dem Objektträger 1 angeordnet ist, bringbar ist. Wie ersichtlich, umfassen diese zur Aufnahme des Objektträgers 1 ausgebildete Aufnahmestrukturen 19, die hier in Form eines vorspringenden Rahmens bzw. Stegs ausgebildet sind, der einen Einsetzbereich für den Objektträger 1 umgibt. Wie erwähnt, können auch beispielsweise Zapfen, Leisten oder andere Vorsprünge vorgesehen sein, die eine Horizontalbewegung des Objektträgers 1, wenn sich dieser in einem in die Kompartimentierungseinrichtung 10 eingesetzten Zustand befindet, verhindern.
Die Kompartimentierungseinrichtung 10 ist, wie bereits erwähnt, zum Aufsetzen auf zumindest einen Teil der auf dem Objektträger 1 angeordneten mikroskopischen Probe 2 bemaßt, bestimmt und ausgebildet, wobei der Objektträger 1 in die Kompartimentierungseinrichtung 10 eingesetzt bzw. die Kompartimentierungseinrichtung 10 auf den Objektträger 1 aufgesetzt wird. Dies ist in 2C in einer Ansicht schräg von unten, und damit im Übrigen entsprechend 2B, und in 2D in einem entsprechenden Zustand in Draufsicht veranschaulicht. Wie aus 2C ersichtlich, umgeben dabei die Aufnahmestrukturen 19, die hier in Form eines vorspringenden Rahmens ausgebildet, sind, den Objektträger 1. Die Kompartimentierungseinrichtung 10 ist hier also kappenartig auf den Objektträger 1 mit der Probe 2 aufgesetzt, mit dem Objektträger 1 in Eingriff gebracht, und damit gegen eine Horizontalbewegung gesichert. Der Objektträger 1 bzw. die darauf aufgebrachte Probe 2 befindet sich damit in einer definierten Position relativ zu dem Kammerbereich 13 (in 2C nicht sichtbar).
Wie aus 2D ersichtlich, deckt dabei ein Teil des Kammerbereichs 13 das Objekt 2 oder einen Teil davon ab. Die Kammern (in 2D ohne Bezeichnung) sind über die oberen Öffnungen 16 zugänglich, so dass eine Analyseflüssigkeit in diese eingebracht werden kann.
Es kann insbesondere eine Auswertung unter Erhalt von Auswertungsdaten vorgenommen werden, wie zuvor erläutert. Über die definierte Position des Kammerbereichs 13 relativ zur Probe 2 können dabei Bereiche in den Auswertungsdaten mit einzelnen Kammern 15 korreliert werden, indem über die definierten Position bestimmte Probenbereiche, die in 2D nochmals mit 2a und 2b veranschaulicht sind, auf der Probe 2 mit Positionen zumindest einiger der Kammern 15 assoziiert werden und diese als selektierte Probenbereiche festgelegt werden. Ein selektierter Probenbereich ist hier beispielsweise der Probenbereich 2b. Für einen oder mehrere der selektierten Probenbereiche 2b können dann, unter Erzielung der zuvor erläuterten Vorteile, jeweils unterschiedliche flüssigkeitsunterstützte Untersuchungen festgelegt und/oder durchgeführt werden.
Die obere Ebene 11 und die untere Ebene 12 (nur in 2A gesondert bezeichnet) erstrecken sich insbesondere in dem in 2C und 2D gezeigten Zustand, in dem die Kompartimentierungseinrichtung 10 auf den Objektträger 1 mit der Probe 2 aufgesetzt ist, parallel zu einer oberen Oberfläche des Objektträgers 1 und zu einer Erstreckungsrichtung der Probe 2. Wie auch nachfolgend noch erläutert, schließen dabei die Wände 14 mit der Probe 2 ab und schaffen dabei eine flüssigkeitsdichte Verbindung.
In den 3A bis 3D sind ein Objektträger 1 und einer Kompartimentierungseinrichtung 10 gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung in unterschiedlichen Ansichten veranschaulicht, die den Ansichten gemäß den 2A bis 2D entsprechen, auf die daher ausdrücklich verwiesen wird. Auch die Darstellung der 3A bis 3D ist dabei stark vereinfacht, insbesondere bezüglich der Kompartimentierungseinrichtung 10.
Die in den 3A bis 3D gezeigte Kompartimentierungseinrichtung 10 unterscheidet sich dabei von der in den 2A bis 2D gezeigten Kompartimentierungseinrichtung 10 im Wesentlichen dadurch, dass die Ausrichtungsmittel 18 zusätzlich Justiermittel 20 umfassen, mittels derer der Kammerbereich 13 gegenüber einem mit dem Objektträger 1 in Eingriff gebrachten Bereich der Kompartimentierungseinrichtung 10 justierbar ist. Wie aus der Zusammenschau der 3A bis 3D ersichtlich, kann dabei durch eine Verschiebung in einer Horizontalrichtung x (siehe entsprechend bezeichneten Doppelpfeil) der Kammerbereich 13 verschoben werden und damit justiert werden. Zur besseren Nachvollziehbarkeit eines Umfangs einer entsprechenden Verschiebung kann dabei eine nicht gesondert bezeichnete Skala, beispielsweise mit einem Nonius, vorgesehen sein. Auch eine Verschiebung in einer Richtung y kann, durch nicht gesondert veranschaulichte Justiermittel, vorgesehen sein. Wie erwähnt, können auch Mittel vorgesehen sein, die ein Abheben in z-Richtung, d.h. senkrecht zu den Richtungen x und y, ermöglichen.
4A bis 4D veranschaulichen Rasterungen von Kompartimentierungseinrichtungen 10 gemäß Ausführungsformen der Erfindung. Grundsätzliches zu entsprechenden Rasterungen und die damit jeweils erzielbaren Vorteile wurden bereits oben ausführlich erläutert. Die gezeigten Rasterungen ergeben sich dabei jeweils bei einer Draufsicht auf die obere Ebene 11 bzw. die untere Ebene 12, die in der 2 veranschaulicht ist.
4A zeigt ein Quadratraster, das, wie bereits oben erwähnt, eine besonders einfache Referenzierung in Form von Spalten- und Zeilenangaben (A1, A2, B1, B2, ...) sowie eine äquidistante Auflösung ermöglicht. Hingegen ermöglicht es ein in 4B gezeigtes Rechteckraster beispielsweise, die Auflösung in beiden Lateralrichtungen an eine Vorzugserstreckung von Probenstrukturen anzupassen. Das in 4C gezeigte Wabenraster erlaubt eine Approximierung einer Kreisform bei gleichzeitig lückenloser Abtastung, mit entsprechenden Vorteilen bei der Befüllung der Kammern 15 mit Flüssigkeit. Entsprechendes gilt, wie erwähnt, in verstärktem Maße für das in 4D gezeigte Kreisraster, wobei jedoch nur eine Abtastung mit Lücken möglich ist. Wie erwähnt, ist auch beispielsweise die Verwendung eines Dreiecksrasters möglich. Es versteht sich, dass die in den 4A bis 4C veranschaulichen Rasterungen sich beliebig horizontal erstrecken können und nicht auf die in den 4A bis 4C jeweils veranschaulichte Anzahl von Elementen beschränkt sind.
5A und 5B veranschaulichen eine Ausbildung von Trennwänden 14 von Kompartimentierungseinrichtungen 10 gemäß Ausführungsformen der Erfindung. Die Darstellung entspricht dabei einer Ansicht, in der die obere Ebene 11 und die untere Ebene 12 gemäß 2 senkrecht zur Papierebene in 5A und 5B liegt. Ebenso senkrecht zur Papierebene ist daher die Lateralerstreckungsrichtung des Objektträgers 1 mit der darauf aufgebrachten Probe 2 und deren interessierendem Bereich 2a dargestellt.
Gemäß der in 5A veranschaulichten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verjüngen sich dabei die Trennwände 14 in einem an die untere Ebene 12 angrenzenden bzw. einem dieser zuweisenden Bereich. Auf diese Weise können die Trennwände 14 gewissermaßen mit „Schneiden“ 14a ausgebildet werden, die es, wie bereits zuvor ausführlich erläutert, ermöglichen, die Kompartimentierungseinrichtung 10 in eine Probe 2 einzudrücken und dadurch die zuvor erläuterten Vorteile zu erzielen.
Im Gegensatz dazu weist die Kompartimentierungseinrichtung 10 gemäß der in 5B veranschaulichten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Trennwände 14 auf, die sich zumindest in einem an die untere Ebene 12 angrenzenden und/oder zuweisenden Bereich verbreitern und sich in einem Teil der unteren Ebene 12 erstreckende Kontaktflächen 17 aufweisen. Auf diese Weise lässt sich, alternativ zu der zuvor erläuterten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ebenfalls ein Durchtritt von Flüssigkeit unterhalb der Trennwände 14 der Kompartimentierungseinrichtung 10 vermeiden, insbesondere dann, wenn die Kontaktflächen 17 mit einer flüssigkeitsabweisenden Ausstattung versehen, beispielsweise hydrophobisiert sind.
In 6 ist ein Verfahren gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in Form eines stark vereinfachten, schematischen Ablaufplans dargestellt. Das Verfahren ist insgesamt mit 200 bezeichnet.
In einem ersten Schritt 210 des Verfahrens 200 wird dabei eine auf einem Objektträger 1 aufgebrachten Probe 2 (vergleiche insbesondere 1) beispielsweise visuell-optisch oder digitaloptisch erfasst und entsprechend ausgewertet. Hierbei werden ein oder mehrere Bereiche der Probe 2 als interessierende Bereiche ausgewählt und markiert bzw. gespeichert. Es können beispielsweise digitale Bilddaten der Probe 2 bzw. von deren interessierenden Bereichen erhalten.
In einem zweiten Schritt 220 des Verfahrens 200 wird nun eine zuvor ausführlich erläuterte Kompartimentierungseinrichtung 10 gemäß einer Ausführungsform der Erfindung auf den Objektträger 1 mit der darauf aufgebrachten Probe 2 aufgebracht bzw. aufgesetzt und, falls entsprechende Befestigungsmittel vorgesehen sind, darauf befestigt. Orientierung und Positionierung der Kompartimentierungseinrichtung 10 richten sich insbesondere nach Art, Größe und Anordnung des oder der interessierenden Bereiche.
Die Kompartimentierungseinrichtung 10 wird mittels der Ausrichtungsmittel 18 mit dem Objektträger 1 in Eingriff gebracht und der Kammerbereich 13 wird in einer definierten Position relativ zu der Probe 2 ausgerichtet. Der Kammerbereich 13 wird mit seiner unteren Ebene 12 mit der Probe 2 unter Ausbildung eines flüssigkeitsdichten Abschlusses zwischen zumindest einem Teil der Trennwände 14 und der Probe 2 in Kontakt gebracht, wie ebenfalls bereits zuvor erläutert. In einem dritten Schritt 230 des Verfahrens 200 wird wenigstens eine Untersuchungsflüssigkeit in zumindest einen Teil der Kammern 15 eingebracht, um in diesen anschließend eine flüssigkeitsunterstützte Untersuchung durchzuführen, während der Kammerbereich 13 mit seiner unteren Ebene 12 weiterhin mit der Probe 2 in Kontakt gebracht ist. Das Verfahren 200 wird nachfolgend unter Bezugnahme auf ein isothermes Amplifikationsverfahren unter Verwendung eines Lysepuffers beschrieben, die Erläuterungen gelten dabei jedoch grundsätzlich für ein anderes Untersuchungsverfahren in entsprechender Weise.
In einem vierten Schritt 240 des Verfahrens 200 wird eine Amplifikation vorgenommen, indem beispielsweise zunächst Amplifikationsreagenzien in die Kammern 15 der Kompartimentierungseinrichtung 10, die weiterhin auf den Objektträger 1 aufgesetzt und mit diesem in Eingriff gebracht ist, eingebracht werden. Nach der Zugabe der Amplifikationsreagenzien erfolgt eine Amplifikation unter hier isothermen Bedingungen oder unter Verwendung von Temperaturzyklen. Ein quantitativer Nachweis ist dabei über ein Fluoreszenzdetektionsverfahren möglich. Mit anderen Worten korreliert hierbei eine Anzahl von Amplifikaten mit einer Intensität einer Fluoreszenzmarkierung.
Diese wird in einem fünften Schritt 250 das Verfahren 200 ausgewertet, die insbesondere automatisch eine Position einer entsprechenden Kammer 15 der Kompartimentierungseinrichtung 10 mit der Intensität der Fluoreszenzmarkierung und dabei einen Phänotyp, der mikroskopisch detektiert wurde, mit einem Genotyp, der durch das Amplifikationsverfahren bestimmt wurde, korreliert. Insbesondere können dabei auch die in dem Schritt 210 erhalten Bilddaten über die definierte Position des Kammerbereichs 13 relativ zu der Probe mit den Kammern 15 korreliert werden, indem Positionen 1 auf der Probe 2 mit Positionen zumindest einiger der Kammern 15 assoziiert werden. Auch eine Überlagerung der Bilddaten mit weiteren Bilddaten, die in dem Untersuchungsverfahren erhalten wurden, insbesondere in Form einer Heatmap, ist möglich, wie bereits erwähnt.
In 7 ist ein Untersuchungssystem gemäß einer Ausführungsform der Erfindung stark vereinfacht veranschaulicht und insgesamt mit 700 bezeichnet.
Das Untersuchungssystem kann beispielsweise über eine bildgebende oder nicht bildgebende Auswertungseinheit 701 verfügen, mittels derer, beispielsweise über ein Mikroskopobjektiv 702, ein Objektträger 1 mit einer darauf aufgebrachten Kompartimentierungseinrichtung 10 (hier zusammengefasst mit 703 bezeichnet), in der zuvor erläuterten Weise ausgewertet werden kann. Eine entsprechende Auswertung kann beispielsweise auch unter Verwendung einer Steuereinheit 704 durchgeführt werden. Der Objektträger 1 mit der darauf aufgebrachten Kompartimentierungseinrichtung 10 bzw. 703 kann hierbei auch beispielsweise mittels einer Beleuchtungseinheit 705 (die hier als Durchlicht- Beleuchtungseinheit gezeigt ist, aber auch als Auflicht-Beleuchtungseinheit ausgebildet sein kann) durch- bzw. beleuchtet werden.
Ferner umfasst das Untersuchungssystem 700 eine Temperiereinrichtung 706 zum Erwärmen und/oder Kühlen dies Objektträgers 1 mit der Kompartimentierungseinrichtung 10 bzw. 703 zur Durchführung der oben erläuterten temperaturabhängigen Reaktionen. Die Temperiereinrichtung 706 kann beispielsweise in einen beweglichen Tisch integriert sein.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Isenberg, G. et al.: Cell surgery by laser micro-dissection: a preparative method. Journal of Microscopy, Band 107, 1976, Seiten 19-24 [0009]
D. Kagawa et al. schlagen in dem Konferenzbeitrag „Nanoblade Array for Spatial Dissection of Single Cells and Tissues“, MEMS 2017, Las Vegas, NV, USA, 22. bis 26. Januar 2017 [0014]

Claims

Verfahren (200) zur ortsaufgelösten, flüssigkeitsunterstützten Untersuchung einer auf einem Objektträger (1) angeordneten mikroskopischen Probe (2), bei dem eine Kompartimentierungseinrichtung (10) verwendet wird, die einen Kammerbereich (13) mit Kammern (15) aufweist, die jeweils obere Öffnungen (16) in Richtung einer oberen Ebene (11) und untere Öffnungen (17) in Richtung einer unteren Ebene (12) aufweisen und voneinander durch Trennwände (14) abgegrenzt sind, die sich zwischen der oberen Ebene (11) und der unteren Ebene (12) erstrecken, wobei das Verfahren umfasst, a) die Kompartimentierungseinrichtung (10) mittels Ausrichtungsmitteln (18) mit dem Objektträger (1) in Eingriff zu bringen und den Kammerbereich (13) in einer definierten Position relativ zu der Probe (2) auszurichten, b) den Kammerbereich (13) mit seiner unteren Ebene (12) mit der Probe (2) unter Ausbildung eines flüssigkeitsdichten Abschlusses zwischen zumindest einem Teil der Trennwände (14) und der Probe (2) in Kontakt zu bringen, so dass unterschiedliche Probenbereiche der Probe (2) direkt und ohne weiteren Zwischenschritt jeweils in einzelnen Kammern (13) angeordnet werden, und c) wenigstens eine Untersuchungsflüssigkeit in zumindest einen Teil der Kammern (15) einzubringen und in diesen Kammern (15) die flüssigkeitsunterstützte Untersuchung durchzuführen, während der Kammerbereich (13) mit seiner unteren Ebene (12) weiterhin mit der Probe (2) in Kontakt gebracht ist.
Verfahren (200) nach Anspruch 1, bei dem die Ausrichtungsmittel (18) an der Kompartimentierungseinrichtung (10) angeordnet werden oder bei dem die verwendete Kompartimentierungseinrichtung (10) die Ausrichtungsmittel (18) aufweist.
Verfahren (200) nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem die Ausrichtungsmittel (18) an dem Objektträger (1) angeordnet werden oder bei dem der verwendete Objektträger (10) die Ausrichtungsmittel (18) aufweist.
Verfahren (200) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Probe (2) in Form eines Dünnschnitts, eines Ausstrichs, eines Zupf- oder Quetschpräparats, eines Mazerats oder einer Suspension auf den Objektträger (1) aufgebracht wird.
Verfahren (200) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die flüssigkeitsunterstützte Untersuchung eine Lysereaktion umfasst, bei der ein Lysat gebildet wird, wobei das Lysat zumindest teilweise der weiteren Reaktion unterworfen wird, während der Kammerbereich (13) mit seiner unteren Ebene (12) weiterhin mit der Probe (2) in Kontakt gebracht ist.
Verfahren (200) nach Anspruch 5, bei dem die Lysereaktion und/oder die weitere Reaktion temperaturgesteuert durchgeführt werden.
Verfahren (200) nach Anspruch 5 oder 6, bei dem die weitere Reaktion eine Polymerasekettenreaktion und/oder eine Fluroeszenznachweisreaktion umfasst.
Verfahren (200) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Probe (2) unter Erzeugung von Auswertungsdaten ausgewertet wird, und bei dem jeweils Ergebnisse der flüssigkeitsunterstützten Untersuchung für zumindest einen Teil der Kammern (15) mit den Auswertungsdaten korreliert werden.
Verfahren (200) nach Anspruch 8, bei dem der Objektträger (1) mit der Probe (2) in ein Mikroskopsystem (700) eingebracht wird und die Auswertung mittels des Mikroskopsystems (700) durchgeführt wird, während der Objektträger (1) mit der Probe (2) sich in dem Mikroskopsystem (700) befindet.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die Auswertung vor Schritt a) und/oder nach Schritt a) und vor Schritt b) und/oder vor und/oder nach einem der Teilschritte des Schritts b) gemäß Anspruch 1 durchgeführt wird.
Verfahren (200) nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei dem Bereiche in den Auswertungsdaten über die definierte Position relativ zur Probe (2) mit einzelnen Kammern (15) korreliert werden, indem über die definierten Position bestimmte Probenbereiche (2a, 2b) auf der Probe (2) mit Positionen zumindest einiger der Kammern (15) assoziiert werden und diese als selektierte Probenbereiche (2b) festgelegt werden.
Verfahren (200) nach Anspruch 11, bei dem für einen oder mehrere der selektierten Probenbereiche (2b) jeweils unterschiedliche flüssigkeitsunterstützte Untersuchungen festgelegt und/oder durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche Anspruch 8 bis 12, bei dem die Auswertung in Form einer bildgebenden Auswertung, bei der die Auswertungsdaten als Bilddaten erhalten werden, durchgeführt wird, oder bei dem die Auswertung in Form einer nicht bildgebenden Auswertung, in der die Auswertungsdaten in Form eines oder mehrerer digitaler Signale erhalten werden, vorgenommen wird.
Kompartimentierungseinrichtung (10) zur Verwendung in einem Verfahren zur ortsaufgelösten, flüssigkeitsunterstützten Untersuchung einer auf einem Objektträger (1) angeordneten mikroskopischen Probe (2), die einen Kammerbereich (13) mit Kammern (15) aufweist, die die jeweils obere Öffnungen (16) in Richtung einer oberen Ebene (11) und untere Öffnungen (17) in Richtung einer unteren Ebene (12) aufweisen, und die voneinander durch Trennwände (14) abgegrenzt sind, die sich zwischen der oberen Ebene (11) und der unteren Ebene (12) erstrecken, wobei die Kompartimentierungseinrichtung (10) Ausrichtungsmittel (18) aufweist oder zur Kopplung mit Ausrichtungsmitteln (18) eingerichtet ist, mittels derer die Kompartimentierungseinrichtung (10) mit dem Objektträger (1) in Eingriff bringbar und der Kammerbereich (13) in einer definierten Position relativ zu der Probe (2) ausrichtbar ist, so dass unterschiedliche Probenbereiche der Probe (2) direkt und ohne weiteren Zwischenschritt jeweils in einzelnen Kammern (13) angeordnet werden können.
Kompartimentierungseinrichtung (10) nach Anspruch 14, bei der die Trennwände (14) derart ausgebildet sind, dass die Kammern (15) ein sich parallel zu der oberen Ebene (11) und der unteren Ebene (12) erstreckendes Waben-, Vieleck-, Mehreck-, Kreis-, Oval-, Quadrat-, Rechtecks- oder Dreiecksraster bilden.
Kompartimentierungseinrichtung (10) nach Anspruch 15, bei der die Trennwände (14) derart ausgebildet sind, dass zumindest ein Teil der Kammern (15) ein auf eine visuelle Beschaffenheit der Probe (2) abgestimmtes Raster bildet, wobei zumindest der Kammerbereich (13) der Kompartimentierungseinrichtung (10) probenspezifisch, insbesondere mittels 3D-Druck, erstellt wurde.
Kompartimentierungseinrichtung (10) nach einem der Ansprüche 14 bis 16, bei der sich die Trennwände (14) zumindest in einem an die untere Ebene (12) angrenzenden und/oder dieser zuweisenden Bereich verjüngen oder bei der sich die Trennwände (14) zumindest in einem an die untere Ebene (12) angrenzenden und/oder zuweisenden Bereich verbreitern und sich in einem Teil der unteren Ebene (12) erstreckende Kontaktflächen (17) aufweisen.
Kompartimentierungseinrichtung (10) nach einem der Ansprüche 14 bis 17, bei der die Ausrichtungsmittel (18) zur Aufnahme des Objektträgers (1) ausgebildete Aufnahmestrukturen (19) aufweisen.
Kompartimentierungseinrichtung (10) nach Anspruch 18, bei der die Aufnahmestrukturen (19) einen durch ein oder mehrere vorspringende Elemente umgebenen Einsetzbereich für den Objektträger (1) aufweisen.
Kompartimentierungseinrichtung (10) nach einem der Ansprüche 14 bis 19, bei der die Ausrichtungsmittel (18) Justiermittel (20) umfassen, mittels derer der gekammerte Bereich (13) gegenüber einem mit dem Objektträger (1) in Eingriff gebrachten Bereich der Kompartimentierungseinrichtung (10) justierbar ist.
Untersuchungssystem (700), umfassend einen Objektträger (1) und eine Kompartimentierungseinrichtung (10) nach einem der Ansprüche 13 bis 19.
Untersuchungssystem (700) nach Anspruch 21, das eine Temperiereinrichtung (706) zum Temperieren des Objektträgers (1) und der aufgebrachten Kompartimentierungseinrichtung (10, 703) zum Durchführen temperaturabhängiger Reaktionen aufweist.
Kompartimentierungseinrichtung (10) nach einem der Ansprüche 14 bis 20 oder Untersuchungssystem (600) nach Anspruch 21 oder 22, die oder das zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 eingerichtet ist.