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Gebiet der Erfindung:
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Flusskammer für lichtmikroskopische
und licht spektroskopische Untersuchungen nach dem Oberbegriff des Anspruchs
1 und ein Verfahren zur Probenpräparation
für lichtmikroskopische
Untersuchungen nach Anspruch 13.
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Insbesondere
betrifft die Erfindung eine Flusskammer mit der sowohl bewegliche
als auch immobilisierte Moleküle,
Makromoleküle
oder Zellen mit verschiedenen lichtmikroskopischen sowie spektroskopischen
Techniken (z.B. hochauflösende
Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie,
konfokale Mikroskopie, etc.) untersucht werden können.
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Stand der Technik:
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Objektträger und
Probenschalen für
zu untersuchende Proben werden bei den verschiedensten Untersuchungsmethoden
eingesetzt und müssen daher
vielen unterschiedlichen Anforderungen genügen. Beispielsweise werden
viele biologisch-medizinische Untersuchungen mit Hilfe von lichtmikroskopischen
und/oder spektroskopischen Techniken durchgeführt. Neben der reinen Lichtmikroskopie
(z.B. zur Zelluntersuchung) werden immer öfter Methoden der hochauflösenden-,
Fluoreszenz-, Phasenkontrast- oder der Konfokalen-Mikroskopie sowie
der UV-Spektroskopie
verwendet. Auch werden Kombinationen dieser Methoden eingesetzt.
Insbesondere die Analyse von Fluoreszenzsignalen ist von entscheidender
Bedeutung, um spezifische Reaktionen nachzuweisen.
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Dies
geschieht zumeist über
die qualitative Analyse der Fluoreszenz einer Lösung welche die zu untersuchenden
Moleküle,
Makromoleküle
oder Zellen enthält
(z.B. via Mikroskopie oder Spektroskopie). Dabei befinden sich sowohl
die zu untersuchende Substanz, als auch "Nachweismoleküle" für
diese Substanzen, wie z.B. Antikörper,
in Lösung.
Dies führt
dazu, dass sowohl verhältnismäßig große Mengen
der nachzuweisenden Moleküle
als auch der zu untersuchenden Substanz (oder Zellen) verwendet werden
müssen.
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Die
für derartige
Untersuchungen verwendeten Probenkammern, in denen sich die Lösung mit den
Substanzen befinden, sind zumeist aus Glas oder Quarzglas. Kunststoffbehältnisse
werden, wegen der schlechten optischen Eigenschaft der meisten Kunststoffe
(im Vergleich zu Glas), für
diese Art der Untersuchungen kaum verwendet. Ausnahmen bilden Kunststoffschalen,
die zum Mikroskop oder Spektrometer hin offen sind, so dass das
vom Molekül
emittierte Licht keinen Kunststoff auf seinem Weg zum Detektor hin
durchlaufen muss.
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Aus
der
DE 3102571 A1 ist
beispielsweise eine Petrischale bekannt, die aus Kunststoff besteht und
einen dünnen
Boden von 0,17 mm für
die Mikroskopie aufweist. Diese wird insbesondere für die Zellmikroskopie
verwendet, weist jedoch kein Durchflusssystem auf. Sie besitzt auch
kein Kanalsystem oder Resorvoire, um einen definierten Fluss anzulegen.
Auch sind bei dieser Schale keine speziellen, auf die zu untersuchenden
Substanzen abgestimmte Modifikationen des Kunststoffes vorgesehen.
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Aus
der
US 5170286 ist eine
Beobachtungskammer für
Mikroskopie in Verbindung mit einem angeschlossenen Flusssystem
bekannt. Es handelt sich dabei um eine „Sandwich"-Konstruktion, die im wesentlichen aus
einer speziellen Halterung besteht, in die Mikroskopie-Deckgläser eingelegt
werden, welche durch Deck platten fixiert werden. Dieses System besteht
somit aus mindestens fünf
verschiedenen Elementen die vor jedem Experiment zusammengefügt werden
müssen.
Dadurch ist z.B. ein steriles Arbeiten nur durch aufwendige Vorkehrungen gewährleistet.
Auch müssen
die verwendeten Deckgläser,
die Halterung und die Deckplatten zwischen den Experimenten gereinigt
werden. Der Durchfluss muss in dieser Kammer durch Schlauchverbindungen
zu einem nicht auf der Kammer aufgebrachten Reservoir erzeugt werden.
Dies beinhaltet das Risiko der Luftblasenbildung im Flusssystem.
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Eine
Oberflächenbehandlung
oder Funktionalisierung zur spezifischen Immobilisierung von Molekülen oder
Zellen der eingesetzten Deckgläser
ist nicht vorgesehen. Auch müssen
die eingesetzten Deckgläser
durch Dichtungsringe abgedichtet werden. Dies kann erfahrungsgemäß oft zu
Undichtigkeiten führen
und dazu, dass in der Lösung
befindliche Moleküle
aufgrund eines Kontaktes mit dem Dichtungsring ihre funktionelle
Struktur verändern
oder an diesem adsorbieren. Dies gilt auch für die Halterung, in welcher
die Kanäle
eingebracht sind.
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In
der WO 97/38300 A1 ist ein Mikrokanalsystem aus Acryl beschrieben,
das der elektrophoretischen Auftrennung dient. Der Mikrokanal wird
jedoch nicht zum Durchspülen
von Flüssigkeiten
oder zur hochauflösenden
Mikroskopie verwendet. Auch hat Acryl keine ausreichend guten optischen
Eigenschaften, um hochwertige Mikroskopie durchzuführen. Die
Innenwände
dieses Kanalsystemes werden auch nicht oberflächenbehandelt, mit dem Zweck dort
spezifische Reaktionen analysieren zu können. Die Analyse der in dieses
Kanalsystem eingebrachten Makromoleküle findet in einem eingebrachten Gel
statt. Auch werden in den Kanal eingebrachte Moleküle nicht
durch einen angelegten hydrodynamischen Fluß, sondern durch Verwendung
von elektrischen Feldern bewegt.
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Die
Druckschrift
US 5 922 604 beschreibt dünne Reaktionskammern
zum Detektieren von Mikrofluiden. Hierbei wird die Flüssigkeit
z.B. durch Adhäsionskräfte durch
Kapillaren in ein Reservoir bewegt. Auch hier ist allerdings das
System aus mehreren Bauteilen aufgebaut, die miteinander verklebt werden.
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Die
DE 38 53 457 T2 offenbart
eine Vorrichtung für
einen Prothrombin-Test. Die Vorrichtung besteht hier aus einer Unterlage,
einer sich auf der Unterlage befindlichen Deckschicht, auf der wiederum eine
Bedeckung angebracht ist. Die Deckschicht weist hierbei eine Kanalstruktur
auf, und die einzelnen Bauteile werden bevorzugt miteinander verklebt. Weiterhin
ist es nicht möglich,
die Anzahl der Kunststoff-Bauteile auf unter zwei zu reduzieren.
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In
der
US 5 786 182 werden
Gefäße beschrieben
mit zwei Kammern und einem Kanal. Vorteilhafterweise sind die Reaktionskammern
dabei innerhalb einer Test-Leiste ohne Abdeckung angeordnet. Es
wird zwischen temperaturbeständigen
und temperaturunbeständigen
Reagenzien unterschieden, welche dann mit Hilfe eines Ventils durch
den Kanal miteinander in Verbindung gebracht werden.
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Ebenso
ohne Abdeckung sind auch die Reservoire in der
US 6 159 749 dargestellt, welche eine mehrteilige
Vorrichtung zur Untersuchung chemischer Reaktionen bereitstellt.
Die Reservoire dienen hierbei als Falle für die zu untersuchenden Partikel und
sind durch Mikrokanäle
verbunden.
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Die
Druckschrift
DE 28
29 796 B2 weist eine Vorrichtung mit mehreren Reservoiren
und einem diese verbindenden Kanal auf. Sie besteht vorzugsweise
aus Glas oder Kunststoff und wird gegebenenfalls verschweißt. Als
versiegelnde Abdeckung der Reservoire an deren Oberseite kann eine
Membran gewählt
werden, die zur Durchführung
der Experimente abgezogen oder perforiert werden muss. Die Kanäle befinden
sich an der Unterseite der Reservoire.
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Die
DE 36 50 610 T2 beschäftigt sich
mit Kapillardurchflussgeräten
mit Kapillarkanälen.
Diese Kanäle
sind an mehreren Stellen ausgeweitet, weisen allerdings auch dort
noch Kapillarkräfte
auf. Die Vorrichtung besteht aus zwei spiegelbildlichen Bauteilen,
so dass sich die Kanäle
mit den ausgeweiteten Kanalstellen auf gleicher Höhe befinden.
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In
der
DE 43 34 677 C1 ist
in einen Objektträger
für mikroskopische
Untersuchungen eine Rinne als Kanal geschliffen. Auf dem Objektträger befindet sich
eine Gewindeflasche als Reservoir, die dichtend mit dem Objektträger verklebt
ist. Die Vielzahl an Bauteilen und Fertigungsschritten erfordert
einen hohen Aufwand, ebenso wie die Sterilisation der einzelnen
Bauteile während
der Herstellung der Vorrichtung.
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Die
meisten Techniken mit herkömmlichen Probenkammern
erlauben nur eine quantitative und keine qualitative Analyse der
Signale. Auch stellt sich der Lösungsmittelaustausch,
z.B. bei der Verwendung einer Glasküvette zur Verdünnung, als
sehr aufwendig dar. Der einfache Austausch von Flüssigkeiten
in einer Probenkammer ist jedoch notwendig, um spezielle Reaktionen
von Molekülen
in der Flüssigkeit
mit anderen Molekülen,
Makromolekülen,
Zellen, etc. nachzuweisen, oder um überflüssige Moleküle, welche sich in der Flüssigkeit
befinden, herauszuspülen.
Zudem können überschüssige Moleküle das Fluoreszenzsignal
oder Spektrum des zu untersuchenden Moleküls oder Molekülkomplexes
abschwächen
oder auslöschen.
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Beschreibung der Erfindung:
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Flusskammer zu
entwickeln, die einen schnellen und einfachen Durchfluss und Austausch von
Flüssigkeiten
erlaubt, die zudem eine problemlose Durchführung der genannten Untersuchungen und
eine Immobilisierung von Molekülen,
Makromolekülen
oder ganzen Zellen ermöglicht
und durch die sich die für
eine Untersuchung erforderliche Menge an Nachweismolekülen reduzieren
lässt.
Ferner soll eine Flusskammer bereitgestellt werden, die einfach herzustellen
und zu bedienen ist.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren bereit zu stellen,
das die Durchführung
der genannten Untersuchungsmethoden erleichtert und neue Untersuchungsmöglichkeiten
eröffnet.
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Diese
Aufgabe wird durch eine Flusskammer nach den kennzeichnenden Merkmalen
des Anspruchs 1 und durch das Verfahren nach Anspruch 13 gelöst. Vorteilhafte
Ausgestaltungen gehen aus den Unteransprüchen hervor.
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Demnach
weist die Flusskammer als Probenträger für lichtmikroskopische Untersuchungen eine
Grundplatte auf, die einen oder mehrere Kanäle aufweist, wobei auf der
Oberseite der Grundplatte wenigstens zwei Flüssigkeitsreservoire angeordnet sind,
die mit zumindest einem Kanal ein kommunizierendes System bilden,
dadurch gekennzeichnet, dass die Grundplatte und die Flüssigkeitsreservoire einstückig aus
Kunststoff ausgebildet sind, dass die Kanäle als einseitig offene Kanäle in die
Unterseite der Grundplatte eingebracht sind und dass die Kanäle mittels
einer mit der Grundplatte fest verbundenen Folie abgedeckt sind.
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Vorteilhafterweise
weist die Flusskammer aus Kunststoff als Objektträger für lichtmikroskopische
Untersuchungen in einer Grundplatte wenigstens einen Kanal mit einer
bevorzugten Breite von 0,01 – 20,0
mm und einer bevorzugten Höhe
von 0,01 – 5
mm auf. Sowohl die Eingangsöffnung
als auch die Ausgangsöffnung
des Kanals ist an ein Füssigkeitsreservoir
angeschlossen. Durch die Verbindung der beiden Reservoire durch
den Kanal entsteht ein kommunizierendes System.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Probenpräparation
für lichtmikroskopische
Untersuchungen unter Verwendung obiger Flusskammer wird ein Probenfluss
in dem kommunizierenden System erzeugt, indem der Füllstand
der Reservoire zu Beginn der Untersuchung unterschiedlich ist.
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Vorteilhafterweise
wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
ein Probenfluss durch ein System kommunizierender Röhren erzeugt,
indem ein Reservoir einer Lösung
mit der Probe über
einen dünnen
Kanal mit wenigstens einem weiteren Reservoir verbunden und der
Füllstand
der Reservoire zu Beginn der Untersuchung unterschiedlich ist.
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Eine
zu untersuchende Probenflüssigkeit wird
zur Untersuchung in eines der Flüssigkeitsreservoire
eingefüllt.
Das andere Reservoir kann zunächst leer
bleiben oder mit einer passenden Lösung zum Teil gefüllt werden.
Wesentlich ist jedoch, dass der Flüssigkeitsstand in den beiden
Reservoiren unterschiedlich ist. In diesem Fall fließt die Flüssigkeit
aufgrund von Gravitations- und Kapillarkräften durch den Kanal, ohne
dass zusätzliche
Hilfsmittel erforderlich sind.
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Mit
der erfindungsgemäßen Flusskammer wird
ein unkomplizierter und zugleich zuverlässiger Durchfluss einer zu
untersuchenden Probe durch den Kanal sichergestellt. Untersuchungen
von Molekülen,
etc. mit Hilfe dieser Flusskammer können daher schnell und effizient
durchgeführt
werden, da auch kein kompliziertes externes Kanalsystem angeschlossen
werden muss. Durch die unmittelbare Nähe der Probenreservoire am
Unter suchungsort, d. h. dem Kanal, kann die erforderliche Probenmenge stark
reduziert werden. Die vorgenannten Nachteile herkömmlicher
Probenkammern werden daher vermieden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung für
hochempfindliche Untersuchungsmethoden besteht die Flusskammer aus
einem optisch hochwertigen Kunststoff, d. h. der Kunststoff weist keine
Doppelbrechung und/oder Autofluoreszenz auf. Hierfür können beispielsweise
cyclische Olefine und Polycarbonat verwendet werden. Ferner weist der
Boden und/oder die Decke des Kanals der Flusskammer, entsprechend
den Erfordernissen der verwendeten Untersuchungsmethode bevorzugt
eine Dicke auf, die geringer als 190 μm ist. Dadurch werden optimale
Eigenschaften für
eine Vielzahl von Untersuchungsverfahren erreicht.
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Die
Flüssigkeitsreservoire
haben vorteilhafterweise einen Durchmesser von 1 – 20 mm
und eine Höhe
von 3 – 30
mm. Ferner können
sie trichterförmig
ausgebildet sein, wobei dieser Trichter in die Ein- bzw. Ausgangsöffnung des
Kanals mündet.
Dadurch verbleiben keine Rückstände der
Probe in dem Flüssigkeitsreservoir
und die notwendige Probenmenge für
eine Untersuchung kann weiter reduziert werden.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Flusskammer
sind die Kanten des Kanals, mit welchen dieser an die Ein- und Ausgangsöffnung grenzt,
abgerundet. Dadurch kommt es am Ausfluß bzw, am Einfluß der Probenflüssigkeit
nicht zur Bildung eines Tropfens aufgrund von Oberflächenspannung
und es wird ein ungehindertes Weiterfließen der Flüssigkeit sichergestellt. Die
Oberflächen
des Kanals können
im Bereich des Aus- und Einflusses, je nach den vorgegebenen Eigenschaften
der verwendeten Flüssigkeit,
auch eine hydrophile oder hydrophobe Oberfläche besitzen, um Benetzungsphänomene für den Flüssigkeitstransport zu
nutzen.
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Für bestimmte
Untersuchungsmethoden, wie z. B. Wechselwirkungsuntersuchungen zwischen Molekülen ist
es wünschenswert,
die Moleküle,
Makromoleküle
oder Zellen zu immobilisieren. Hierfür kann eine innere Oberfläche des
Kanals oberflächenbehandelt
oder funktionalisiert sein, z. B. durch Molekülgruppen, wie -COOH, -NH2; Ketone, Alkohole oder durch Makromoleküle, wie
DNA oder Proteine. Die auf dieser Oberfläche immobilisierten Proben können bei
Reaktion mit einem in Lösung
befindlichen Stoff (z. B. Molekül)
eine charakteristische Änderung
ihres Spektrums aufweisen oder ein charakteristisches Fluoreszenzsignal
aussenden. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Flusskammer ist es möglich, die
in Lösung
befindlichen Moleküle
herauszuspülen, so
dass dieses Signal störungsarm
quantitativ analysiert werden kann.
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Die
Kammer besteht in einer bevorzugten Ausführungsform aus einem Stück. Es gibt
somit keine Elemente, die vor der Benutzung gereinigt werden müssen, und
sie kann mit geringem Aufwand steril gehalten werden. Sie muss auch
vor der Benutzung nicht aufwendig zusammengefügt werden. In dieser Ausführungsform
ist sie normalerweise auch nur zur einmaligen Benutzung vorgesehen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung:
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Bevorzugte
Ausführungsformen
einer Flusskammer gemäß der vorliegenden
Erfindung werden an Hand der Zeichnung näher erläutert. In dieser stellen dar:
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1:
die perspektivische Ansicht einer Flusskammer nach der vorliegenden
Erfindung,
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2:
einen Längsschnitt
durch eine erfindungsgemäße Flusskammer,
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3:
einen vergrößerten Ausschnitt
der Flusskammer aus 2,
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4:
einen Längsschnitt
durch eine weitere Ausführungsform
der Flusskammer; und
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5:
eine perspektivische Ansicht der Ausführungsform der Flusskammer
aus 4.
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In 1 ist
eine Ausführungsform
einer Flusskammer 1 mit einer Grundplatte 2 und
zwei kreisförmigen
Flüssigkeitsreservoiren 3 und 3' gezeigt. Die
Flusskammer 1 besteht aus Kunststoff, wobei hierfür bevorzugt
Polycarbonat oder cyclische Olefine verwendet werden. Cyclische
Olefine weisen eine geringe Autofluoreszenz sowie eine geringe Doppelbrechung
auf und bieten somit optimale optische Eigenschaften. Die Grundplatte 2 hat
die typischen Außenmasse
von ca. 26 × 76
mm. In dieser Form ist die Kammer auf einfache Weise auf einem Probentisch
eines beliebigen Mikroskops zu befestigen. Außerdem kann sie leicht sterilisiert
und steril gehalten werden.
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2 stellt
einen Schnitt in Längsrichtung durch 1 dar.
Innerhalb der Grundplatte 2 verläuft ein Kanal 4 mit
Ein- und Ausgangsöffnungen 6 und 6', die nach oben
aus der Grundfläche 2 weisen.
Die Flüssigkeitsreservoire 3 und 3' werden durch
den Kanal 4 miteinander verbunden. Die Reservoire weisen typischerweise
einen Außendurchmesser
von 18 mm und eine Höhen
von 18 mm auf. Der Durchmesser kann jedoch von 1–30 mm und die Höhe von 3–30 mm variieren.
Bei einem unterschiedlichen Flüssigkeitsstand
in den beiden Reservoiren kann die Flüssigkeit aufgrund der Gravitation
und der Kapillarkräfte
durch den Kanal fließen.
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Zur
Bildung eines Kanals 4, der knapp unterhalb der unteren
Oberfläche
der Platte verläuft,
ist in die Grundplatte 2 eine Aussparung eingebracht, die zwischen
0,1 – 5
mm tief und 0,1 – 3
mm breit ist. Der Kanal könnte
auch durch eine entsprechende Aussparung knapp unter der oberen
Oberfläche
der Platte vorgesehen sein. Typischerweise wird die Grundplatte 2 als
Spritzgußteil
hergestellt. Über
der Aussparung in der Grundplatte 2 ist eine Folie 5 angeordnet,
die die Aussparung abdeckt und den Boden bzw. den Deckel des Kanals 4 bildet.
Die Folie kann z.B. durch Verkleben, Heißpressen oder Laminieren über der
Grundplatte angebracht werden. Außerdem kann die Folie 5 schon
vor dem Aufbringen auf die Grundplatte physikalisch oder chemisch
oberflächenbehandelt
werden, um z. B. eine Immobilisierung der Probe zu ermöglichen,
wie vorher beschrieben wurde.
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Um
die Flusskammer 1 der hochauflösenden Mikroskopie zugänglich zu
machen, ist die Folie 5 in einem für die Untersuchungen wesentlichen
Bereich dünner
als 0,2 mm, typischerweise zwischen 0,1 und 0,2 mm. Die Folie 5 ist
aus einem hochtransparenten Kunststoff. Um einen Kondensor eines
Mikroskopes einsetzen zu können,
sind die hierfür
wesentlichen Bereiche der Flusskammer 1 nicht höher als
10 mm. Die Grundplatte 2 kann dann ebenfalls aus hochtransparenten
Kunststoffen sein.
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In 3 ist
die Anordnung des Flüssigkeitsreservoirs 3 über einer
Ein- bzw. Ausgangsöffnung 6, 6' gezeigt. Die
Kante am Übergang
des Kanals 9 in die Eingangsöffnung 6 weist eine
Abrundung 7 in Form eines Meniskus auf. In einem Kanalbereich
vor der Öffnung 6,
kann die Oberfläche
des Kanals hydrophil oder hydrophob ausgebildet sein. Dies kann wiederum
z. B. durch eine Oberflächenbehandlung der
Folie 5 oder der Aussparung in der Grundplatte 2 vor
dem Aufbringen der Folie erfolgen. Durch die Abrundung 7 oder
die eben geschilderte Oberflächenbeschaffenheit
können
Oberflächenspannungen
und Tropfenbildung, die den Flüssigkeitsstrom
behindern, vermieden werden.
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Die
Ausführungsform
der Flusskammer 1 in 4 weist
Flüssigkeitsreservoire 3 und 3' auf, die trichterförmig in
die Ein- und Ausgangsöffnungen 6 und 6' münden. In 5 sind
drei nebeneinander verlaufende Kanäle 4a, 4b und 4c mit
den entsprechenden Flüssigkeitsreservoiren 3a, 3a', 3b, 3b', 3c und 3c' gezeigt. Als
eine Weiterentwicklung kann die Anzahl der Kanäle zwischen 12 und 96 Stück betragen.
Die Außenmasse
der Grundplatte betragen dann typischerweise 126 × 85 mm.
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Die
gezeigten Ausführungsformen
sind beispielhaft und es ist offensichtlich, dass eine Vielzahl weiterer
Ausgestaltungen einer Flusskammer im Sinne der vorliegenden Erfindung
möglich
sind, wie z.B. die Kreuzung von zwei Kanälen oder das Zusammenlaufen
von zwei Kanälen
in einem Einzigen.
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- 1
- Flusskammer
- 2
- Grundplatte
- 3
- Flüssigkeitsreservoir
- 3'
- Flüssigkeitsreservoir
- 3a
- Flüssigkeitsreservoir
- 3a'
- Flüssigkeitsreservoir
- 3b
- Flüssigkeitsreservoir
- 3b'
- Flüssigkeitsreservoir
- 3c
- Flüssigkeitsreservoir
- 3c'
- Flüssigkeitsreservoir
- 4
- Kanal
- 4a
- Kanal
- 4b
- Kanal
- 4c
- Kanal
- 5
- Folie
- 6
- Eingangsöffnung
- 6'
- Ausgangsöffnung
- 7
- Abrundung