DE3242500A1

DE3242500A1 - Gefaesseinheit fuer zytozentrifugen

Info

Publication number: DE3242500A1
Application number: DE19823242500
Authority: DE
Inventors: Egon Dipl.-Chem. 3420 Herzberg Rödel; Gerhart 3360 Osterrode Schröter
Original assignee: Heraeus Christ GmbH
Current assignee: Heraeus Sepatech GmbH
Priority date: 1982-11-18
Filing date: 1982-11-18
Publication date: 1984-05-24
Also published as: FR2536306A1; GB2130395A; GB8327887D0

Description

Hanau, 15. November 1982 ZPL-Zw/ha

Heraeus Christ GmbH, Osterrode

"Gefäßeinheit für Zytozentri fugen"

Die Erfindung betrifft eine GefäOeinheit für die Durchführung der Zytozentrifugation, das heißt der Technik der Zellpräparation aus Suspensionen für medizinische Laboruntersuchungen wie Licht- und Rasterelektronenmikroskopie, wie sie insbesondere von zytologischen Laboratorien für biologische Flüssigkeiten, die Zellen enthalten, verwendet werden. Bei der Zentrifugation setzen sich die Zellen auf mikroskopischen Objektträgern ab. Ihre Verteilung, Form und Größe läßt dann gegebenenfalls auf Krankheiten oder andere Veränderungen schließen. Bei bekannten Zytozentrifuqen wurde mit der sogenannten Filterpapiertechnik gearbeitet, das heißt die Flüssigkei strömt dabei in einen Filterpapierstreifen, während die Zellen sich auf dem Objektträger niederschlagen. Dabei bestanden Schwierigkeiten hinsichtlich der hygienischen Sicherheit und die Gefahr von Zellverlusten. Aufgabe vorliegender Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, die or. gestattet auch auf die Filtrierung bei der Sedimentation von Zellen oder dergleichen völlig zu verzichten. Gelöst wird diese Aufgabe durch die im Anspruch 1 aufgeführten Merkmale Weitere Ausgestaltungen der I" rf in dung sind den Unteransprüchen sowie der Beschreibung und Zeichnungen von Aue; f ühruncjübniüpioler zu entnehmen. Zur Erfindung gohüren auch alle Kombinationen und Unterkoinbinationen der beanspruchten dargos te llLun und beschriebenen Merkmale sowohl unter einander als auch mit an sich bekannten Merkmalen.

BAD ORIGINAL

Die Vorteile, die mit der Erfindung erreichbar sind, sind vorallem folgende:

Nach dem Zentrifugieren braucht lediglich überstehende Flüssigkeit dekantiert zu werden. Die Kosten des Filterpapieres entfallen. Die Gefäßeinheit ist abdichtbar. Zellüberlagerungen beziehungsweise -verschiebungen infolge des Abfließens der Flüssigkeit durch das Filterpapier werden vermieden.

Mit der Erfindung ist es erstmals möglich auf jedem Objektträger Doppelproben wie zum Beispiel Haupt- und Kontrollprobe ein und desselben Patienten gleichzeitig zu untersuchen. Die erfindungsgemäße Gefäßeinheit ist in einer besonders vorteilhaften Ausführung mit konischen Kanälen als Gefäßhohlräume zur Aufnahme der Probe (kegelförmig) versehen und auf diese VJeise ist im Gegensatz zum Stand der Technik sogar eine Zellanreicherung möglich.

Infolge der Durchsichtigkeit des Kammerblocks der Gefäßeinheit sind Verunreinigungen der Probe sofort erkennbar und leicht zu enfernen.

Die Gefäßeinheit ist leicht in den Gefäßträger einsetzbar. Dabei muß nicht auf eine besondere Einbaurichtung geachtet werden. Die Einheit ist auch in einen Behälter wie Becher mit Vorteil leicht einsetzbar (gegebenenfalls mittels Adaptoren), wie sie in Zentrifugen mit Ausschwingrotoren üblich sind. Ein solcher Behälter ist mit Vorteil vakuumdicht verschließbar.

Eine Kennzeichnung (zum Beispiel Patientennummer) wird auf dem Objektträger gut sichtbar bereits vor der Zentrifugation angebracht und verringert dadurch die Verwechslungsgefahr für die Proben. Die Kennzeichnung bleibt in normaler Blick- - 6 -

BAD ORIGINAL

richtung vom Kammerblock der Gefäßeinheit unbedeckt. Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen.

Es zeigen

Abbildung la den Kammerblock der Gefäßeinheiten mit zwei durchgehenden zylindrischen Kanälen parallel zueinander,

Abbildung Ib einen Kammerblock mit zu/ei konischen Kanälen (kegelförmig),

Abbildung 2a den Kammerblock mit mirkroskopischem Objektträger eingesetzt in einen Gefäßträger,

Abbildung 2b den Gegenstand der Abbildung 2a in Seitenansicht,

Abbildung 3 den Kammerblock nach Abbildung la zusammen mit einem Filter und einem Objektträger,

Abbildung 4 die Gefäßeinheit zum Einsetzen in den Schu/enkbecher als Ausschu/ingrotor einer Zentrifuge in ihre Einzelteile zerlegt,

Abbildung 5 einen Ausschu/ingrotor mit Behältern, in die Gefäßeinheiten eingesetzt sind,

Abbildung 6 die Durchführung der Zytozcntrifugation in ihren einzelnen Schritten.

Die Gefäßeinheiten nach der Erfindung bestehen aus im vi/escjntlichen quaderfürrnigen durchsiehtiqun Kamrnerblücken mit je.

BAD ORIGINAL

zwei durchgehenden Bohrungen, die am Boden durch O-Ringe auf dem Objektträger abgedichtet und deren Einfüllöffnungen oben offen sind.

In Abbildung la sind Gefäßeinheiten mit zylindrischen Kanälen 2 als Probeaufnahmeraum und in Abbildung Ib mit konischen (kegelförmigen) Kanälen 3 als Probeaufnahmeraum parallel und symmetrisch zueinander dargestellt. Während der Hohlraum zum Beispiel in Abbildung la et\i/a 1,5 ml betragen kann, kann er bei der Abbildung Ib ein etwa doppelt so großes Probevolumen aufnehmen. Damit kann (bei gleichem Durchmesser der Probenöffnung) eine Anreicherung von Zellen um etwa den Faktor 5 möglich gemacht werden. Die Ausführung mit konischen Kanälen wird deshalb vorgezogen.

Der Kammerblock wird zusammen mit dem Objektträger - wie Abbildung 2a und 2b zeigen - in den Gefäßträger eingesetzt und bildet so eine transportable Einheit. Der Kammerblock 1 wird dabei von Klemmfedern 4 auf dem Gefäßträger 5 festgehalten, wobei zwischen beiden der Objektträger 6 angeordnet ist. Deutlich ersichtlich sind die O-Ringe 7 aus einem Fluorelastomer wie es unter dem Handelsnamen "Viton" erhältlich ist, die in schwalbenschwanzförmigen Nuten unverlierbar gehaltert und dem Boden des Gefäßes zugekehrt sind. Die Klemmfedern 4, welche am Gefäßträger 5 befestigt sind, sind so geformt, daß sie das leichte Einschieben des Kammerblocks gestatten, andererseits diesen in der Arbeitsstellung und während der Schwenkbewegung im Ausschwingrotor der Zentrifuge festhalten. Diese Klemmfedern weisen warzenähnliche Ausbuchtunge oder Erhebungen 9 auf, die die Gefäßei.nheit im Adapter oder Zentrifugenbecher beziehungsweise anderen Behältern festhalten in den die Einheit eingesetzt wird. Nachdem der Block oben mit einer Abdeckplatte 8 abgedockt wurde, die ebenfalls von den Klemmfudern 4 festgehalten wird. In der Abdeckplatte sind zwei kleine Deckel 10 direkt über den Kanälen 2 -beziehungsweise 3 angeordnet, die in Zahl, Form

- 8 BAD ORIGINAL

und Größe don Probeausnehmungon wie Kanälen angepaßt sind. Die Befestigung der Klemmfedern kann lösbar mittels Schrauben 11 am Gefäßträger erfolgen. Der Kammerblock weist Führungsnuten 12 auf, wie sie in Abbildung 3 ersichtlich sind und zur Aufnahme und Halterung der Klemmfedern 4 auf beiden Seiten des Blocks dienen. In Abbildung 3 sind die O-Ringe in Draufsicht und ihre schwalbenschwanzförmigen Nuten ersichtlich, ebenso wie die zentralsymmetrische und spiegelbildliche Ausführung des Kammerblocks 1, der aus transparentem Kunststoff, wie AcryLglas) oder dergleichen besteht. Zwischen dem Gefüßträger und dem Kammerblock kann ein Objektträger mit Kennzeichnungsfeld 15, wie Schriftfeld, an einem schmalen Ende vom Kammerblockende vorstehend ebenso vorgesehen werden, wie ein Filter- oder Papierstreifen 14, falls mit solchen Streifen gearbeitet werden soll. Ersichtlich ist dann die der mit O-Ringen versehenen Seite abkehrte Seite des Kammerblocks, diejenige, welche dem Filterpapierstreifen zugekehrt ist, das heißt der Kammerblock wird für die "Filtertechnik" im Gegensatz zur Dekantiertechnik um 180° gedreht auf den den O-Ringen gegenüberliegende Seite des Blockes. Alle Seiten sollen möglichst eben und glatt sein, um die Abdichtung bzw. Flußrichtungen zu gewährleisten. Die Vorteile der Einbringung der Kennzeichnung auf dem Objektträger sind offensichtlich, weil der Kammerblock dieses nicht verdeckt, sondern das Schriftfeld demgegenüber vorsteht (vgl.. Abbildung 2a). Verwechslungsgefahren sind praktisch ausgeschlossen, weil der BLick auf dieses Kennzeichungsfeld auch in der Zentrifuge bei stillstehendem Rotor möglich ist.

Die Kammerblöcke mit ihren parallelochsigen Probeaufnahmekanäler insbesondere Doppelkanälen (z.B. auch vierfach, sechsfach, achtfach usw.), lassen sich leicht reinigen und desinfizieren bzw. sterilisieren. Verschmutzungen sind leicht erkennbar. Für die Desinfektion der Gefäßeinheiten eignet sich eine in wässrige Losung von Glutartdialdehyd.

-BAD ORIGSNAL

Um die Haftfähigkeit der Zellen auf dem Objektträger zu verbessern, kann dieser mit einer dünnen Schicht Glycerin-Eiweiß oder Glycerin-Gelantine präpariert werden.

Wie aus Abbildung 4 ersichtlich, kann die Gefäßeinheit zerlegt, zusammengebaut und eingesetzt werden in einen Zentrifugierbehälter wie Schwenkbecher einen Ausschwingrotors. Abbildung 4 zeigt von rechts nach links die Deckplatte 8, den Kammerblock 1, den Gefäßträger 5 mit Klemmfedern 4, einen Adapter 16 zum Einsetzen der Gefäßeinheit in einen Behälter 17 vorzugsweise einen Schwenkbecher eines Ausschwingrotor^,! wie er in Abbildung 5 dargestellt und mit 18 bezeichnet ist.

Die Durchführung der Zytozentrifugation ist in Abbildung 6 in ihren einzelnen Schritten dargestellt. Diese sind im einzelnen:

1. Einsetzen des Kammerblocks in den Gefäßträger, in dem sich bereits ein mikroskopischer Objektträger (gegebenenfalls auch ein Filterpapierstreifen dazwischen) befindet.

2. Einfüllen von Untersuchungsmaterial, wie Zellsuspension in die Gefäßeinheit, hier in die Kanäle mittels Pipette von oben in deren offene Einfüllöffnungen.

3. Kennzeichnen des Objektträgers zum Beiapiel mit einer Patientennummer.

4. Einsetzen der Gefäßeinheit in'den Rotor der Zentrifuge. Danach zentrifugieren mit g-Zahlen in der Ebene des Objektträgers zwischen 100 und etwa 1000, bevorzugt zwischen etwa 200 und 800 g und je nach Rotordurchmesser entspricht dies g-Zahlen von 500 und 3000min , bevorzugt zwischen etwa 850 uml 2700min"¹.

- 10 -

BADO

5. Nach dom Zentrifugieren wird die überstehende Flüsigkeit dekantiert zum Beispiel durch abpipettieren oder -gießen.

6. Der Kammerblock u/ird aus dem Cefäßträger zusammen mit dem Objektträger herausgenommen, die Preparate werden anschließend nach bekannten Verfahren eingefärbt und mit Deckgläsern eingedeckt sowie fixiert, das heißt die Zellen u/erden mit in ihren vorhandenen Eiweißstrukturen durch Gerinnung stabilisiert. Normalerweise enthalten Färbelösungen Alkohol. Das Färben geschieht in bekannter Weise in Bädern und für eine genau festgelegte Zeit. Bei der erfindungsgemäße Gefäßeinheit kann die Fixierung unmittelbar nach dem Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit durch Alkohol oder Aldehyd erfolgen. Infolge der gerade durchgehenden Kanäle bei der erfindungsgemäßen Gefäßeinheit im Kammerblock kann die Fixierung mit dem Fixiermittel auch dampfförmig oder als Aerosol zum Beispiel aus einer Sprühflasche erfolgen

Erst danach wird man dann den Objektträger mit dem Zellsediment (dünne Schicht) entnehmen und die Färbung durchführen.

An die Färbung schließt sich normalerweise die Einbettung des Zellpräparates in Gelantine und Abdeckung mit Glasplättschen an. Erst danach wird die eigentliche mikroskopische Untersuchung durchgeführt.

Anwendungen:

Zytozentrifugation im weitesten Sinne ist für eine große Zahl medizinischer Disziplinen interessant:

Zytologie Immunoloqie

Zytopatholoijie Pädiatrie

Urologie Gerontologie

Anatomie Embrylogie

- 11 -

BAD

Genetik Toxikologie

Nuclearmedizin Gerichtsmedizin

Neurologie Biometrie

Maematologie Onkolgie

ferner für Biologen:

' L ■ ■/. -

Botaniker , ■ Virologen Zoologen Biotechnologen

Meeresbiologen Biochemiker

Bakteriologen "*' ' ' Cytochemiker

Palöobotaniker ' · Paläologen

aber auch für andere wichtige Grenzbereiche:

Pharmakologie

Mineralogie Kristal!Untersuchungen

Geologie auf dem Objektträger

Abwasserchemie

Schwebsto ffe Aerosolchemie

Ganz oben im Anwendungsbereich steht die spezielle Onkologie (Krebsforschung) aber auch die Krebsforschung in Zusammenarbeit mit allen anderen o.g. medizinischen Forschungseinrichtungen (insbesondere die -τ-ϋ^ΕθΙ-Θ-ςϊ·«- und Zytopatologie)

Den Zellforschern kommt es bei der Untersuchung in erster Linie auf qualitative Crscheinungsbilder im Zellsediment an, das heißt zum Beispiel morphologische Veränderungen an Zellen oder Zellkernen oder auf Auftauchen von Zclltypen, die nicht erwartet worden sind, usw.

Quantitative Auswertungen beziehen sich höchstens auf das Verhältnis verschiedener·: Zeltfeypen zueinander.

*^; BAD ORIGINAl

Die wichtigsten medizinischen Probeflüssigkeiten in denen Zellen untersucht werden:

Liquor (Hirnflüssigkeit) Prostataflüssigkeit

Cerebrospinal flüssigkeit Geu/ebeflüssigkcit

(Rückenmarkspunktat) Sputum (Speichel)

Urin Blutzellen

Brustflüssigkeit Lymph-Flüssigkeit

Pleurapunktat (Rippenfell- Gallenflüssigkeit flüssigkeit)

Sonstige Anwendungsmöglichkeiten des Zytosystems:

Untersuchungen außer Lichtmikroskopie, die Substanzniederschläge in dünnen Schichten erfordern:

1. Raster elektronenmikroskopIe

2. Immunfluoreszenz

3. Durchstrahl lungs-Clektr on enmikroskopie

4. Autoradiographie
u.a.

BAD ORIGINAL

L e θ r s e i t e

Claims

Hanau, 15. November 1982 ZPL~Zw/ha Heraeus Christ GmbH, Osterrode "Gefäßeinheit für Zytozentrifugen" Ansprüche

1. Gefäßeinheit für Zytozentrifugen mit einem Kammerblock, einem Gefäßträger und einem mikroskopischen Objektträger, wobei zwischen Kammerblock und Objektträger ein Filter oder eine Abdichtung vorgesehen ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Kammerblock mindestens zwei senkrecht oder im wesentlichen senkrecht zu dem Objektträger angeordnete, gerade durchgehende Kanäle enthält, die Gefäßhohlräume bilden und der die Gefäßhohlräume enthaltende Kammerblock von an dem Gefäßträger angeordneten Federelementen in Arbeitsstellung gehalten wird.

2. Gefäßeinheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kammerblock entweder mit einer mit Dichtungen versehenen oder einem Filterpapier zugekehrten Seite in den Gefäßträger einsetzbar ist.

3. Gefäßeinheit nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Kammerblock zylindrische oder konische Kanäle aufweist, deren eine Seite, die dem mikroskopischen Objektträger am Boden des Gefäßträger zugekehrt ist, Dichtringe enthält, die in ihrem Durchmesser dem kleinsten Kann Idiirchmoasi;r angepaßt sind.

BAD

co

4. Gefäßeinheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kainmerblock zentralsymmetrisch und Gpiegelbildlich ausgebildet ist und die Seite, die der die Dichtringe enthaltenden Seite abgekehrt ist und ihr gegenüber liegt, als einem Filterpapier am Boden des Gefäßträgers zugekehrte Seite ausgebildet ist.

5. Gefäf3einheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtringe in dem Kammerblock in Form von O-Ringen ausgebildet sind die in dem Kammerblock herausnehmbar, jedoch unverlierbar, gehaltert sind.

6. Gefäßeinheit nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtringe aus einem Fluor elastomer bestehen.

7. Gefäßeinheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kammerblock Führungsnuten für die Aufnahme der Federolemcnte am Gufäßträger besitzt.

8. Gefäßeinheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kammerblock eine Abdeckplatte aufweist, die in Zahl, Form und Größe den Kanälen, die die Cefäßräume bilden, entsprechende Deckel enthält.

9. Gefäßeinheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abdeckplatte vom Kammerblock abnehmbar ist, um überstehende Flüssigkeit durch Ausgießen oder Abpipetticrcn auü den Kanälen zu entfernen.

10. Gefäßeinheit nuch einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kurnmurbluck aus transpar en teir Kunststoff, insbesondere Acrylglas, bestellt.

-J-

11. Gefäßeinheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß beim Zwischenlagern eines Filterpapieres zwischen Kammerblock und mikroskopischem Objektträger ein Flüssigkeitssammelbehälter die Gefäßeinheit wenigstens teilweise umgibt.

12. Gefäßeinheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter Gefäßträger und Kammerblock umgebend und als Behälter von Zentrifugen- ausschwingrotoren ausgebilet ist, in den die Gefäßeinheit gegebenenfalls mittels Adaptoren einsetzbar ist.

i- - ■' μ

13. Gefäßeinheit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufnahmebehälter vakuumdicht verschließbar ist.

14. Gefäßeinheit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kammerblock kleiner als der Objektträger ausgebildet ist und letzterer mit einer Kennzeichnung versehbar ist, die vom Kammerblock unverdeckt bleibt.

15. Gefäßeinheit nach einem der. vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Federelemente, die am Gefäßträger angeordnet sind, warzenähnliche Erhebungen aufweisen, die die Gefäßeinheit im Behälter festhalten, insbesondere im Behälter-i-vSrf''Ze'n tr if ugenausschwingrotoren gegebenenfalls mittels Adapter.

■ . ! VBAD ORIGINAL