DE3650610T2

DE3650610T2 - Kapillardurchflussgerät

Info

Publication number: DE3650610T2
Application number: DE3650610T
Authority: DE
Inventors: Jimmy D Allen; Michael E Cobb; Ian Gibbons; Robert S Hillman; Vladimir E Ostoich; Laura J Winfrey
Original assignee: Boehringer Mannheim Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Corp
Priority date: 1985-08-05
Filing date: 1986-07-24
Publication date: 1997-09-25
Anticipated expiration: 2006-07-25
Also published as: EP0483117A3; EP0483117A2; EP0212314B1; EP0485368A2; DE3650530T2; JPH07104356B2; JPH0792169A; EP0212314A3; EP0485368B1; DE3650574D1; JPH0658373B2; EP0488994A3; AU6088486A; EP0488994A2; DE3650530D1; CA1275231C; DE3650610D1; EP0212314A2; EP0488994B1; JPH0769330B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Testvorrichtungen mit Kammern in ihrem Inneren, in die durch Kapillarwirkung Flüssigkeiten gezogen werden, Verfahren zur Verwendung solcher Vorrichtungen und Verfahren zur Herstellung solcher Vorrichtungen.
Bei den Entwicklungen auf dem Gebiet der Diagnose hat es einen explosionsartigen Anstieg der Anzahl an zu bestimmenden Substanzen gegeben. Die Medizin hat diese Bestimmungen größtenteils klinischen Labors überlassen. Die klinischen Labors sind bei der Erfüllung der mannigfachen Bedürfnisse der Medizin auf teure hochentwickelte Geräte und bestens ausgebildetes technisches Personal angewiesen. In einem hochautomatisierten klinischen Labor besteht jedoch ein deutlicher Bedarf, einen oder einige Assay(s) auf stationärer Basis mit minimaler Ausrüstung durchzuführen.
Es gibt auch einen zunehmenden Bedarf an Möglichkeiten zur Analyse in Arztpraxen und zu Hause. Es ist weiterhin notwendig, die an Patienten mit chronischen Erkrankungen, wie Diabetiker, Asthmatiker, Epileptiker und Herzpatienten, verabreichte Arzneimittelmenge zu überwachen, wie sie in einer physiologischen Flüssigkeit, beispielsweise Blut, in Erscheinung tritt. Zu den Tests, die von Interesse sind, gehören der Prothrombinzeit-, der Kaliumion- und der Cholesterintest. Die Bestimmung der Anzahl der roten Blutkörperchen ist ebenfalls ein häufiger Test. Im Fall von Diabetespatienten ist es notwendig, den Zuckerspiegel im Harn oder Blut zu ermitteln.
Zu diesem Zweck sind zahlreiche Ansätze entwickelt worden, die in unterschiedlichem Ausmaß von der instrumentellen oder visuellen Betrachtung des Ergebnisses abhängig sind. Typisch dafür sind die sogenannten "Tauchstäbchen"-("dipstick")-Verfahren. Bei diesen Verfahren wird im allgemeinen ein Kunststoffstreifen verwendet, der mit einer reagenshältigen Matrix beschichtet ist. Die Probe wird auf den Streifen aufgetragen, und das Vorhandensein oder Fehlen eines Analyten wird durch eine farbbildende Reaktion angezeigt. Solche Verfahren haben sich zwar für die qualitative Ermittlung des Vorhandenseins von Analyten in Harn als nützlich erwiesen und können sogar zur groben quantitativen Analyse verwendet werden, sie sind jedoch wegen der störenden Wirkungen roter Blutkörperchen bei Vollblut nicht besonders nützlich, ebensowenig wie für die Durchführung feiner quantitativer Unterscheidungen. Demgemäß besteht nach wie vor ein Bedarf an der Entwicklung von Verfahren und Vorrichtungen, mit denen es möglich ist, Vollblut und andere komplexe Proben mit einem Minimum an Anwendermanipulationen rasch zu analysieren.
Bei vielen kleinen Vorrichtungen auf dem Gebiet der Analyse ist die Verwendung von Kunststoffen mit speziellen Eigenschaften, wie z.B. optische Transparenz und maschinelle Bearbeitbarkeit, notwendig. Mit maschineller Bearbeitbarkeit ist hier die Möglichkeit gemeint, innerhalb der Kunststoffvorrichtung Kammern, Kanäle und Öffnungen mit vorgeschriebenen Abmessungen zu erzeugen. Es sind zwar zahlreiche Kunststoffvorrichtungen entwickelt worden, die Herstellungstechniken sind jedoch aufgrund von Unterschieden bei den Vorrichtungen oder des gewünschten Meßergebnisses nicht austauschbar. Das gilt besonders für Vorrichtungen, die im Inneren des Kunststoffmaterials Kanäle oder andere Kammern mit kleinen Abmessungen enthalten. Es ist sch\vierig, die feinen Kanäle ganz innerhalb einer Kunststoffmatrix zu erzeugen, und wenn sie in der Oberfläche von zwei miteinander dicht zu verbindenden Matrizes hergestellt werden, werden sie während vieler Dichtungsverfahren leicht verformt.
Demgemäß besteht nach wie vor Bedarf an neuen Vorrichtungen zur Verwendung bei Verfahren zum raschen analytischen Testen und an neuen Verfahren zur Herstellung dieser Vorrichtungen.
Powers et al., "IEEE Trans. on Biomedical Engr." (1983) BME-30-228, beschreibt das Bestimmen eines Tupfenmusters zum Nachweis von Blutplättchenaggregation, ebenso wie Reynolds, "Light Scattering Detection of Thromboemboli", Trans. 11. jährliche Tagung der Soc. for Biomaterials, San Diego, Kalifornien, 25-28 April 1985. Reynolds und Simon, "Transfusion" (1980) 20:669-677 beschreibt Größenverteilungsmessungen von Mikroaggregaten in gelagertem Blut. Ebenfalls von Interesse auf diesem Gebiet sind die US-A-2.616.796; 3.810.010; 3.915.652; 4.040.742; 4.091.802; und 4.142.796. Die US-A-4.519.239 beschreibt eine Vorrichtung zum Ermitteln der Fließscherbeanspruchung von Suspensionen in Blut. Ab Leo bietet die HemoCue -Vorrichtung zum Messen von Hämoglobin an. Siehe auch die US-A-4.088.448, die eine Küvette zum Probennehmen mit einem Hohlraum beschreibt, der so definiert ist, daß durch Kapillarwirkung eine Probe in einer Menge in den Hohlraum gezogen wird, die bezogen auf das Volumen des Hohlraums exakt bestimmt ist. Zahlreiche Kunststoffanordnungstechniken, insbesondere Ultraschal-Kunstoffanordnungen, werden in einem von der Branson Sonic Power Company, Danbury, Connecticut, 1979, veröffentlichten Buch mit gleichem Titel beschrieben. Gallagan, "Plastics Engineering", August 1985, 35-37 beschreibt ebenfalls das Ultraschallschweißen von Kunststoff. Die US-A-3.376.208 beschreibt die Glimmentladung, wenn auch für einen anderen Zweck. Die US-A-3.376.208 beschreibt den Einsatz elektrischer Entladung zum Modifizieren einer Filmoberfläche. Eine Vorrichtung, die zum Transport von Flüssigkeiten durch Kapillarfluß verwendet wird, ist in der US-A-4.233.029 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und ein System bereit, bei dem Kapillarkraft eingesetzt wird, um eine Probe in die Kammern im Inneren einer Kunststoffvorrichtung zu ziehen. Die verwendeten Vorrichtungen, insbesondere Kapillarflußvorrichtungen, die für eine konstante Strömungsrate konstruiert sind, umfassen typischerweise zumindest eine Kapillare, die als Pumpe fungiert, üblicherweise zum Regulieren des Probevolumens und der Zeitdauer der Reaktion, eine Kammer, eine Einlaßöffnung, eine Belüftung sowie ein Reagens in der Nähe zumindest einer Oberfläche der Vorrichtung. Die Kapillare und die Kammer sorgen für den Kapillarfluß aufgrund der Oberflächenwirkung und für das Mischen der den Analyten enthaltenden Blutprobe. Das Reagens ist Teil eines Detektionssystems, wodurch eine nachweisbare Änderung in der Fluidität des Blutes in Relation zum Vorhandensein eines Analyten auftritt. Der Analyt kann beispielsweise ein Arzneimittel, ein Pathogen oder ein im Wirt endogenes Material sein. In den meisten Fällen wird eine optische Messung durchgeführt, die die Auswahl eines transparenten Materials erfordert. Vorrichtungen mit ungewöhnlich vorteilhaften Eigenschaften können hergestellt werden durch das Spritzgießen von Acrylnitril-Butadien-Styrol-Copolymer (ABS) zur Bildung einer Vertiefung mit definierten Abmessungen in der Oberfläche zumindest einer Fläche des Polymers, das Erhöhen der Benetzbarkeit der Oberfläche zumindest in den durch die Einbuchtung definierten Abschnitten unter Einsatz von entweder Plasmaätzen oder Glimmentladung, das Vorsehen von Energie-lenkenden Rippen, die angrenzend an die Vertiefung aus der Oberfläche ragen, oder das Vorsehen davon in einem zweiten Kunststoffstück, das so geformt ist, daß es die an die Vertiefungen in der Kunststoffoberfläche angrenzende Fläche berührt, und das Ultraschallschweißen der beiden Kunststoffoberflächen, um im Inneren eine Kammer oder einen Kanal mit definierten Abmessungen zu erzeugen, die bzw. der eine luftdichte Abdichtung um den Umfang der resultierenden Kammer aufweist. Das Herstellungsverfahren kann zwar eingesetzt werden, um Innenkammern mit beliebiger Größe herzustellen, es eignet sich jedoch besonders für die Herstellung von Kammern und Kanälen mit kleinen Abmessungen, die sich zum Herbeiführen von Kapillarfluß eignen.
In den Zeichnungen
sind die Fig. 1A und 1B Draufsichten von zwei Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wobei in Fig. 1A eine einzelne Kapillare und eine Kammer und in Fig. 1B zwei durch eine Kammer getrennte Kapillaren eingesetzt werden.
sind die Fig. 2A und 2B eine Draufsicht und ein seitlicher Aufriß einer Vorrichtung, bei der drei Kammern eingesetzt werden.
ist Fig. 3 eine Draufsicht einer Vorrichtung für eine Vielzahl gleichzeitiger Bestimmungen.
ist Fig. 4 eine Draufsicht einer alternativen Ausführungsform, bei der die Probe in zwei getrennte Kanäle aufgeteilt wird.
ist Fig. 5 eine Draufsicht einer alternativen Ausführungsform, bei der ein verlängerter Kapillarweg eingesetzt wird.
ist Fig. 6 eine Querschnittansicht einer Ausführungsform, die die Anordnung der Kanäle und energielenkenden Rippen während des Herstellungsverfahrens zeigt.
ist Fig. 7 ein Blockdiagramm einer elektronischen Schaltung, die sich zur Verwendung bei einer elektronischen Kapillarpatronenvorrichtung zum Simulieren des Durchgangs von Blut durch eine Kapillare in einem Regelkreis eignet.
ist Fig. 8 ein Diagramm der physikalischen Anordnung und elektronischen Schatung eines Detektors, der die Erschöpfung von Probe in einem Reservoir einer Kapilarvorrichtung ermitteln kann.
Die vorliegende Erfindung stellt Vorrichtungen und Verfahren, wobei bei den Vorrichtungen zum Pumpen von Blut Kapillaren, Kammern und Öffnungen zum Einsatz kommen; zum Regulieren von Messungen und Reaktionszeiten sowie zum Mischen von Reagenzien; und zur Bestimmung eines nachweisbaren Signals bereit. Da bei den Vorrichtungen zum Regulieren der Bewegung von Fluids Kapillaren und andere Kammern zum Einsatz kommen, ist eine präzise Regulierung der Abmessungen der Innenkammern wesentlich. Die nachstehend beschriebenen Herstellungstechniken sorgen für diese präzise Regulierung.
Die Probe kann Blut sein, das direkt wie aus der Quelle erhalten verwendet wird oder auf unterschiedliche Art vorbehandelt werden kann, um seine Eigenschaffen zu modifizieren. Es wird dann durch eine Einlaßöffnung, die die Probe in eine Kammer oder eine Kapillare einbringen kann, in die Vorrichtung eingebracht. Die Probe durchläuft die Vorrichtung dann, indem sie durch die Kapilare(n) oder Kammer(n) läuft, wo die Probe auf ein oder mehrere Reagenzien trifft, die an einem System beteiligt sind, das eine nachweisbare Änderung der Fluidität hervorruft. Durch das Vorhandensein von Öffnungen, die den Weg mit der Atmosphäre an einer oder mehreren Stellen verbinden, kann das Fließen bis zu dieser Stelle beendet werden, sodaß das Medium für verschiedene Zeitspannen inkubiert werden kann oder die Bewegung in Abhängigkeit von der anfänglichen Bewegung, beispielsweise unmittelbar vor der Messung, unterbrochen werden kann.
Es versteht sich, daß die Kapillarwirkung die einzige Antriebskraft ist, auf der die Oberflächenwirkung zwischen der Oberfläche und der Flüssigkeit beruht. Wenn die Probe zu viskos ist, sollte sie verdünnt werden, um für eine Kapillarpumpwirkung zu sorgen, die die gewünschten Manipulationen, wie z.B. Mischen, sowie eine angemessene Strömungszeit zuläßt, wodurch die Zeitdauer des Assays reguliert wird.
Das Blut kann Vorbehandlung unterzogen werden, wie z.B. der Herstellung von Serum aus Blut; zu den Behandlungsverfahren können Konzentrierung durch Filtration, Destillation oder Dialyse; Verdünnung, Filtration, Inaktivierung natürlicher Komponenten, Konzentrierung, Chromatographie, Zugabe von Reagenzien oder chemische Behandlung gehören.
Die Analyten von Interesse sind je nach Zweck des Assay und Quelle sehr unterschiedlich. Zu den Analyten können kleine organische Moleküle, wie Arzneimittel, Hormone, Steroide, Neurotransmitter, Wachstumsfaktoren, handelsübliche Chemikalien, Abbaupodukte, mißbräuchlich verwendete Arzneimittel, Metaboliten oder Kataboliten umfassen. Es können große organische Moleküle determiniert werden, wie Nukleinsäuren, Proteine oder Polysaccharide. Auch Aggregationen von Molekülen können von Interesse sein, insbesondere natürlich auftretende Aggregationen, Viroide, Viren, Zellen, und zwar sowohl prokaryotische als auch eukaryotische, einschließlich einzelliger Mikroorganismen, Säugetierzellen, wie Lymphozyten, Epithelzellen oder neoplastische Zellen.
Meßbare Phänomene von Interesse können einen Hinweis auf physiologische oder nicht-physiologische Vorgänge liefern, wie Blutgerinnung, Blutplättchenaggregation, komplementvermittelte Lyse, Polymerisation oder Agglutination.
Das Probenmedium kann das natürlich auftretende Medium oder die in ein flüssiges Medium, das für die gewünschten Eigenschaften sorgt, die für die Kapillarpumpwirkung und das detektierbare Signal notwendig sind, eingebrachte Probe sein. Zumeist werden wäßrige Medien eingesetzt, und somit sind wäßrige Medien für die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Medien exemplarisch. Die wäßrigen Medien können durch die Zugabe einer Vielzahl mischbarer Flüssigkeiten, insbesondere sauerstoffhältiger organischer Lösungsmittel, wie niederer Alkanole, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Aceton, modifiziert werden. Üblicherweise sind die Lösungsmittel in einer Menge von weniger als etwa 40 Vol.-%, häufiger weniger als etwa 20 Vol.-%, vorhanden. Neben anderen Lösungsmitteln können im Medium andere flüssige oder feste Additive zur Modifikation des Fließverhaltens oder anderer Eigenschaften des Mediums enthalten sein, wie z.B. Zucker, Polyole, Polymere, Detergentien, Tenside und dergleichen, die an Veränderungen der Benetzbarkeit, der Haftung, des Laminarflusses oder der Viskosität beteiligt sind.
Zusätzlich zu den obengenannten Komponenten können für spezifische Zwecke andere Additive enthalten sein. Puffer können wünschenswert sein, um einen bestimmten pH- Wert beizubehalten. Es können Enzyminhibitoren enthalten sein. Andere Reagenzien von Interesse sind Antikörper, Konservierungsmittel, Stabil isatoren, Aktivatoren, Enzymsubstrate und -cofaktoren, Oxidations- oder Reduktionsmittel. Außerdem können im Durchflußweg der Vorrichtung Filtrations- oder Rückhaltevorrichtungen enthalten sein, um Teilchen über einer bestimmten Größe zu entfernen. Zu den Teilchen gehören Zellen, Viren, Latexteilchen, Polymere mit hohem Molekulargewicht, Nukleinsäuren selbst oder in Kombination mit Proteinen, z.B. Nukleosome, magnetische Teilchen oder Ligand- oder Rezeptor-enthaltende Teilchen.
Die Probe kann die detektierbare Komponente des Detektionssystems liefern, oder eine solche Komponente kann zugegeben werden. Die Komponente(n) variiert/variieren je nach der Beschaffenheit des Detektionssystems stark. Ein Detektionsverfahren umfaßt die Verwendung von Teilchen, wobei die Teilchen für Lichtstreuung oder eine Änderung in der Flußrate sorgen. Die Teilchen können Zelten, Polymerteilchen, die mit dem flüssigen System unmischbar sind, Latexteilchen, Aktivkohleteilchen, Metallteilchen, Polysaccharide oder Proteinteilchen, Keramikteilchen, Nukleinsäureteilchen oder agglutinierte Teilchen sein. Die Wahl des Teilchens hängt davon ab, wie leicht das Detektieren ist, von der Dispergierbarkeit oder Stabilität der Dispersion, der Inertheit, der Teilnahme an der Flußänderung und dergleichen. Die Teilchengrößen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 0,1-100 µm, häufiger von etwa 5-15 µm. Weitere Phänomene, die detektiert werden können, sind Änderungen in der Farbe, der Lichtabsorption oder -transmission, der Fluoreszenz oder der Änderung der physikalischen Phase.
Die reine oder formulierte Probe wird in die Eingangsöffnung in die Aufnahmeeinheit der Vorrichtung eingebracht. Die Aufnahmeeinheit kann eine Kapillare oder eine Kammer sein. Die Aufnahmeeinheit kann verwendet werden, um das spezielle Probevolumen zu messen oder kann einfach dazu dienen, die Probe aufzunehmen und sie zur nächsten Einheit der Vorrichtung zu lenken. Die Kapillareinheiten bieten eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich jener einer Meßvorrichtung zur Volumsmessung, einer Dosierpumpe zum Befördern von Flüssigkeit von einer Kammer zu einer anderen, eines Strömungsreglers zum Regeln der Strömungsrate zwischen Kammern, eines Mischers zum Mischen von Reagenzien, und einer Detektiereinheit zum Detektieren. Crößtenteils dienen die Kapillaren als Beförderungseinheiten, Strömungsregulierungseinheiten und Detektionseinheiten. Die Kammern und Kapillaren können in bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens verwendet werden, um verschiedene Vorkommnisse, z.B. Reaktionsbereiche, oder verschiedene strukturelle Einheiten zu definieren.
Die Kapillaren haben üblicherweise in Querrichtung zur Strömungsrichtung einen kleineren Querschnitt oder Durchmesser als die Kammern. Der Querschnitt oder die Länge in Strömungsrichtung kann ähnlich sein oder sich je nach Funktion der Kapilare und der Kammer um einen Faktor 10 oder mehr unterscheiden. Kapillaren haben üblicherweise Durchmesser im Bereich von etwa 0,01 mm bis 2 mm, üblicherweise etwa 0,1 mm bis 1 mm. Die Länge der Kapillare, insbesondere der ersten Kapillare im Durchgangsweg, im spezielleren der ersten Kapillare, wenn sie mit der Eingangsöffnung verbunden ist, beträgt zumindest etwa 3 mm, häufiger zumindest etwa 5 mm, und kann 1 cm oder mehr sein, üblicherweise nicht mehr als etwa 2 cm, während darauffolgende Kapillaren kürzer oder länger sein können, wobei häufig zumindest eine länger ist, bis zu 10 cm lang, üblicherweise nicht länger als etwa 5 cm.
Die erste Kapillare reguliert zu Beginn die Strömungsrate in die Kammer, die üblicherweise als Reaktionskammer dient. So kann die Kapillare zur Regulierung der Zeit, die das Assaymedium mit Reagens in Kontakt bleibt, das enthalten in oder gebunden an die Wände der Kapillare und/oder der Reaktionskammer vorliegt, sowie des Fortschreitens des Assaymediums durch die Kammer beitragen. Andere Komponenten, die die Strömungsrate in der Kammer beeinflussen können, umfassen Ablenkplatten, Wände oder andere Hindernisse in der Kammer, die Geometrie der Kammer, das Reagens in der Kammer und die Beschaffenheit der Oberflächen in der Kapillare und Kammer. Da das In-Kontakt-bringen des Assaymediums und des Reagens zu Beginn in vielen Fällen die Ergebnisse beeinflussen könnte, ist es wünschenswert, daß der Kontakt ausreichend langsam erfolgt, damit ein Gleichgewicht eintreternkann, was z.B. die Auflösung oder die Reaktion betrifft.
Die Kapillarregulierung und die Verwendung relativ dünner wärmeleitender Wände ermöglicht die rasche Wärmeübertragung und isothermische Bedingungen, und alternativ dazu können dicke Wände für adiabatische Bedingungen sorgen. So ermöglicht das kleine Flüssigkeitvolumen in den Kammern und Kapillaren raschen Wärmeaustausch oder effiziente Wärmeisolierung. Außerdem ermöglichen die dünnen Kapillaren bei optisch dichten Proben, z.B. Vollblut, optische Messungen, insbesondere auf Basis der Lichttransmission. Weiters besteht die Möglichkeit für rasches effizientes Mischen, wobei die gesamte Probe durch Beschallung gleichmäßig vermischt werden kann.
Die Kapillare stellt die alleinige Antriebsquelle für die Bewegung von Flüssigkeit durch die Vorrichtung dar. Demgemäß ist sorgfältige Herstellung der Kapillare auf exakte Abmessungen erforderlich. Die Vorrichtung wird normalerweise in horizontaler Position eingesetzt, sodaß die Schwerkraft die Strömungsrate nicht beeinflußt. Die Zusammensetzung der Wände der Kapillare ist so gewählt, daß für den erwünschten Grad an Benetzung und Oberflächenspannung gesorgt ist, oder die Wände sind modifiziert, um für die gewünschten physikalischen Eigenschaften zu sorgen. Die Vorrichtung wird ohne zusätzliche Antriebskraft, wie Pumpen oder Schwerkraft, eingesetzt.
Die Kammern haben ebenfalls eine Vielzahl von Funktionen und dienen als Schutz für die Reagensmischkammern zum Auflösen von Reagens und/oder Umsetzen mit Reagens, zur Volumsmessung, Inkubation und Detektion, wobei das detektierbare Signal ein anderes als ein z.B. mit Strömung in Verbindung stehendes ist. Die Kammern werden hauptsächlich zum Mischen, Inkubieren und Halten von Flüssigkeiten eingesetzt.
Je nach dem speziellen System können die Länge der Kapillaren, ihre Querschmttsfläche, die Volumina der verschiedenen Kammern und ihre Länge und Gestalt stark variieren. Eine Einschränkung für jede der Kapillaren besteht in der Notwendigkeit, daß sie ihre Funktion der Kapillarpumpwirkung für die Strömung erfüllen. Daher kann Luftdurchlässigkeit im Raum um die Kapillare (mit Ausnahme eingebauter Zugangsöffnungen) nicht zugelassen werden. In vielen Fällen sorgen die Kammern ebenfalls für Kapillarwirkung, während die Strömungsrate, die durch die Beschaffenheit der Kapillareoberfläche beeinflußt wird, primär durch die Kapillarwirkung der Kapillaren bestimmt wird.
Um die Handhabung der Reagenzien durch die Anwender der Vorrichtung zu minimieren, können die Reagenzien innerhalb der Vorrichtung zugeführt werden, wobei das Mischen mit den Reagenzien in der Vorrichtung stattfindet. Die Reagenzien können entweder diffusiv oder nichtdiffusiv an die Oberfläche der Vorrichtung gebunden vorhanden sein, d.h. angeklebt, absorbiert, adsorbiert oder kovalent gebunden, sodaß das Reagens in Flüssigkeit aufgelöst werden oder an der Oberfläche fixiert bleiben kann. Wenn die Reagenzien diffusiv gebunden (nicht-kovalent und schwach gebunden) sind, eignet sich das für eine Vielzahl von Situationen. Eine Situation besteht darin, daß die Flüssigkeitsfront das gesamte Reagens auflöst, sodaß die Flüssigkeitsfront eine hohe Konzentration des Reagens aufnimmt und ein Großteil der Reaktion an der Flüssigkeitsfront stattfindet. Eine zweite Situation wäre ein Überschuß eines Reagens mit beschränkter Löslichkeit. In dieser Situation kann das Reagens im flüssigen Medium in einer im wesentlichen gleichmäßigen Konzentration vorhanden sein. Eine dritte Situation besteht in einem Mangel eines Reagens mit beschränkter Löslichkeit, sodaß nur der frühe Teil des Flüssigkeiten eine relativ konstante Reagenskonzentration aufweist. In vielen Fällen ist es wesentlich, daß das Reagens in einem definierten Bereich oder einer Reaktionskammer vorhanden ist, was die Herstellung einer Innenkammer gefolgt von späterer Reagenszugabe praktisch unmöglich macht.
Das Reagens ist zwar größtenteils in einer oder mehreren Einheiten der Vorrichtung vorhanden, Reagenzien können aber auch durch verschiedene Techniken mechanisch eingebracht werden. Beispielsweise kann unter Einsatz eines Septums eine Spritze zum Einbringen eines Reagens eingesetzt werden. Alternativ dazu könnte eine Öffnung vorhanden sein und eine Pipette oder ein anderes Mittel zum Einbringen von fliissigem Reagens in die Einheit verwendet werden. Üblicherweise werden diese alternativen Techniken, wenn sie nicht unabdingbar sind, vermieden.
Das Reagens variiert je nach der Beschaffenheit der Probe, des Analyten und der Art, wie das detektierbare Signal erzeugt wird. Eine chemische Reaktion tritt entweder aufgrund der Bildung kovalenter Bindungen, z.B. Oxidation oder Reduktion, Hydrolyse usw., oder nicht-kovalenter Bindungen, z.B. Komplexbildung zwischen Ligand und Rezeptor, einschließlich Komplexbildung zwischen Nukleinsäuren, auf.
In den verschiedenen Einheiten kann das gleiche oder ein anderes Reagens vorhanden sein, sodaß aufeinanderfolgende Reaktionen auftreten können oder ein Reagens kontinuierlich in das bewegte Medium zugeführt wird. Es kann auch eine Vielzahl von Kammern und Kapillarkanälen vorhanden sein. Häufig weist die erste Einheit einen Reaktanden auf. Die Größe und der Zweck der Kammern kann variieren, wodurch für die verschiedenen Inkubationszeiten, die verschiedenen Reaktionszeiten, das Mischen von Medien aus verschiedenen Kapillaren oder dergleichen gesorgt ist. Es kann jede Anzahl von Kammern eingesetzt werden, üblicherweise nicht mehr als 6, häufiger nicht mehr als etwa 4, wobei die Kammern in Serie oder parallel angeordnet sein können. Die Größe der Einheit, entweder Kapillare oder Kammer, kann von besonderer Wichtigkeit sein, wenn das Reagens fixiert ist, sodaß die Verweilzeit in Kontakt mit dem Reagens durch die Fläche des Reagens, die mit dem Assaymedium in Kontakt steht, beeinflußt wird.
Durch den Einsatz verschiedener Filtrations- oder Ausschlußvorrichtungen (z.B. mechanischer oder magnetischer) kann die Übertragung von Teilchen von einem Kapillarkanal zu einer Kammer oder umgekehrt verhindert werden. Auf diese Weise können rote Blutkörperchen aus dem Blut entfernt werden, verschiedene Komponenten der Probe entfernt werden, oder durch den Einsatz divergierender Kanäle können aus einem Kanal Teilchen entfernt werden und die Teilchen im anderen Kanal beibehalten werden, wobei die beiden Ergebnisse von Interesse sein können.
Der Einsatz der Vorrichtung wird willkürlich in zwei Konzepte unterteilt. Das erste Konzept betrifft ein anderes Merkmal als eine Änderung der Strömungsrate Dazu gehört größtenteils die Absorption, Streuung ode Emission von Licht. Es steht eine große Vielzahl von Vorschriften und Reagenzien zur Verfügung, die für eine Änderung des gemessenen Lichts als Ergebnis von Absorption, Streuung oder Emission bezogen auf die Analytmenge in der Probe sorgen.
Zu Markern, die eingesetzt werden können, gehören Enzyme in Kombination mit Substraten, Kofaktoren oder Inhibitoren, Fluoreszenzmittel, Kombinationen aus Fluoreszenzmitteln und -löschern oder Farbstoffen. In manchen Fällen tritt als Ergebnis des Vorhandenseins des Analyten oder mit dem Analyten eine chemische Reaktion auf, die ein detektierbares Signal liefert. Durch die Anwendung geeigneter Vorschriften kann das Ausmaß von Absorption oder Emission von Licht in der Detektionseinheit direkt mit der Analytmenge in der Probe in Beziehung gesetzt werden.
Die Detektion einer Änderung in der Strömungsrate kann das Signal sein, das aus der Reaktion des Markers resultiert, oder kann das Ergebnis einer Kombination aus einer Vielzahl von Einheiten sein, die die Strömungsrate beeinflussen. Die Änderung der Strömungsrate kann beispielsweise das Ergebnis von Agglutination, Polymerisation, Komplexbildung zwischen Verbindung mit hohem Molekulargewicht oder Aggregationen sein.
Die Messung von Licht, z.B. Streuung, kann eingesetzt werden, um eine Änderung in der Größenpopulation zu messen. Das kann besonders nützlich zur Messung der Agglutination, Klumpung, Gerinnselbildung oder Auflösung sein. Ein Laser kann die Teilchengröße ohne Änderung in der Strömungsrate unterscheiden. Kleine Teilchen haben eine geringe Frequenz und eine hohe Amplitude; große Teilchen (agglutinierte Teilchen) haben eine geringere Frequenz (weniger Teilchen insgesamt) und eine höhere Amplitude (jedes Teilchen ist größer). So kann die Änderung der Teilchengrößenverteilung durch integriertes Rauschen unter Einsatz einer bekannten Schaltung detektiert werden.
Es können verschiedene Situationen bestehen, bei denen das Assaymedium möglicherweise keine Teilchen (zur Streuung fähige Einheiten) oder Teilchen, wie Zeilen oder Latexkugeln, aufweist, wobei das Ergebnis der Reaktion darin besteht, die Teilchengrößenverteilung zu ändern, einschließlich des Übergangs von keinen Teilchen zur Bildung von Teilchen. Es besteht auch die Möglichkeit, mit Teilchen, z.B. Blutgerinnsel, zu beginnen, und als Ergebnis der Reaktion die Größe und Anzahl der Teilchen zu reduzieren, z.B. die Blutgerinnsel aufzulösen.
Vorschriften, die zur Anwendung kommen können, sind jene in der US-A-3.817.837, 3.839.153, 3.998.943, 3.935.074, 4.174834, 4.233.402, 4.208.479, 4.235.869, 4.275.149, 4.287.300, deren relevante Offenbarung durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Wegen der enormen Vielfalt der Vorschriften, die zur Zeit zum Einsatz bei den erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen verfügbar sind, können nur wenige der Veranschaulichung dienen, und es wird auf zahlreiche Patente Bezug genommen, die verschiedene Vorschriften beschreiben.
Gemäß einer ersten exemplarischen Vorschrift kann eine Fluoreszenzmessung durchgeführt werden, bei der eine einzelne Kapillare als Einlaß vorhanden ist, wobei die Kapillare mit Antikörper gegen Analyt beschichtet ist. Die Probe wird mit einem gepufferten Reagens verdünnt, das ein Konjugat aus Analyt mit Fluoreszenzmittel enthält, wodurch das gesamte fluoreszierende Reagens in Abwesenheit von Analyt in der Probe in der Kapillare gebunden wird. Die Kapillare wird dann in die Probe eingetaucht und eine Flüssigkeitsmenge bis zu einem auf der Kapillare markierten Punkt hochgezogen, wobei die Kapillare dann aus der Probe zurückgezogen und das Weiterlaufen der Flüssigkeit in die Kammer zugelassen wird. Wenn die Kammer teilweise oder vollständig voll ist, kann die Fluoreszenz der Kammer als Indikator für die Analytmenge in der Probe abgelesen werden.
Bei Enzymen kann entweder die Vorschrift oder die Vorrichtung variiert werden, um vorzeitige Wechselwirkung zwischen dem Enzym und seinem Substrat oder Inhibitor zu verhindern. Wenn eine einfache Vorrichtung mit zwei Einheiten verwendet wird, bei der eine Kapillare und eine Kammer zum Einsatz kommen, könnte die Verwendung einer Kombination aus Enzymen vorgesehen sein, was als "Channeling" bezeichnet wird, wobei das Produkt eines Enzyms das Substrat des anderen Enzyms ist. Auf diese Weise könnte in einer Einheit ein zweites Enzym mit dem Substrat des ersten Enzyms kombiniert sein, während bei der zweiten Einheit das erste Enzym mit dem Substrat des zweiten Enzyms kombiniert ist.
Man kann die Reaktion durch verschiedene Mittel modulieren. Beispielsweise könnte in der ersten Einheit Antikörper gegen Analyt vorhanden sein und die Probe mit einer gepufferten Lösung eines Konjugats aus Antikörper und erstem Enzyminhibitor kombiniert werden. So wäre die Menge an Enzyminhibitor, die in die zweite Einheit eintreten würde, mit der Analytmenge in der Probe in Beziehung gesetzt. Anstelle eines Systems mit zwei Einheiten könnte ein System mit drei Einheiten vorhanden sein, wobei die erste Einheit die Probe mit dem Enzyminhibitor-Konjugat vermischt, wodurch es nicht notwendig ist, die Probe mit einem flüssigen Medium zu kombinieren. Wenn die Probe farbig ist, wie Blut, kann es notwendig sein, die roten Blutkörperchen auszufiltrieren oder einzufangen, um die Entwicklung von Farbe oder Fluoreszenz zuzulassen oder einen Wellenlängenbereich zu finden, in dem die Entwicklung eines speziellen lichtabsorbierenden Materials abgelesen werden kann.
Durch den Einsatz einer Vielzahl von Einheiten kann ein einzelnes Enzym verwendet werden, wobei das Enzym an den Analyten konjugiert ist. Durch das Vorhandensein von Enzym-Analyt-Konjugat in einer ersten Einheit, gefolgt von Antikörper gegen Analyt in einer zweiten Einheit und den Einsatz einer dritten Einheit, die Enzymsubstrat enthält, als Reaktionskammer, kann die Messung in der dritten Einheit erfolgen.
Durch den Einsatz von Kombinationen aus Filtern und Teilchen könnten ebenfalls ähnliche Wirkungen erzielt werden. Beispielsweise können in der ersten Einheit Enzym- Analyt-Konigate eingesetzt werden, die sich im Assaymedium vollständig auflösen. Eine zweite Einheit kann dann die Teilchen enthalten, die Antikörper gegen den Analyten enthalten. Die Menge an Enzym-Analyt-Konjugat, die sich an die Antikörper bindet, hängt von der Analytmenge in der Probe ab. Durch Vorsehen eines Filters am Ausgang der zweiten Einheit werden alle Teilchen am Filter festgehalten, und nur ungebundenes Enzymkonjugat gelangt durch den Filter zur dritten Einheit. Die dritte Einheit kann dann das Enzymsubstrat enthalten, sodaß die Reaktion des Enzyms mit dem Substrat überwacht werden kann.
Zur Detektion einer Änderung in der Strömungsrate kann eine große Vielzahl von Systemen eingesetzt werden. Von besonderem Interesse ist das natürliche System mit Gerinnselbildung, das zweckmäßig ist, wenn die Probe eine Blutprobe ist. So kann durch die Zugabe einer oder mehrerer Komponenten der Gerinnselkaskade oder einer Komponente, die die vorhandenen natürlich auftretenden Komponenten aktiviert, die Gerinnung für eine Änderung der Strömungsrate sorgen. Insbesondere gehören zu diesen Reagenzien Thromboplastin, die Faktoren I, II, IV, V, VII, VIII, IX, X, XI und XII. Diese Komponenten können einzeln oder in Kombination zugegeben werden. Spezielle Kombinationen umfassen Faktoren des intrinsischen Reaktionswegs (VIII, IX, XI und XII) oder des extrinsischen Reaktionswegs (III, VII) mit den allgemeinen Reaktionsweg- Faktoren I, II, V, X, XIII. Das Gerinnungsassay kann verwendet werden, um eine große Vielzahl von Analyten von Interesse zu ermitteln. Das Gerinnungsassay kann für die Detektion des Vorhandenseins von gerinnungshemmenden Mitteln oder Gerinnungsmitteln verwendet werden. Außerdem kann das Gerinnungsassay für die Detektion der Menge einer speziellen Komponente, die für die Gerinnung notwendig ist, oder einer Komponente, die beim Auflösen der Gerinnsel beteiligt ist, verwendet werden. Zur Veranschaulichung dienende Analyten umfassen die verschiedenen oben angeführten Faktoren, Warfarin, Gewebeplasminogenaktivator, Heparin, Streptokinase, Vitamin K, Anti-Blutplättchen-Arzneimittel oder Protaminsulfat.
Das Gerinnungsassay kann auch verwendet werden, um irgendeinen Analyten von Interesse zu messen, indem der Analyt mit einem zur Gerinnung notwendigen Faktor assoziiert wird. Beispielsweise könnte durch das Konjugieren von Thromboplastin an eine Verbindung, die mit dem Analyten um einen Rezeptor in Wettbewerb treten kann, wobei der Thromboplastin-Rezeptor-Komplex inaktiv ist, das Vorhandensein des Analyten ermittelt werden. Die Probe würde mit dem Rezeptor für den Analyten vermischt, sodaß die Bindungsstellen des Rezeptors durch jeglichen vorhandenen Analyten besetzt würden. Das an den Analyten oder das imitierende Analog konjugierte Thromboplastin wäre das Reagens in der Reaktionskammer. Alle anderen zur Gerinnung erforderlichen Komponenten würden in der Probe gemeinsam mit den Antikörpern für den Analyten eingeschlossen, wenn solche anderen Komponenten nicht in ausreichender Menge natürlich in der Probe vorhanden wären. Die nicht durch Analyt besetzten Rezeptorstellen würden sich an den an das Thromboplastin konjugierten Analyten binden, wobei dem resultierenden spezifischen Bindekomplex Thromboplastinaktivität fehlen würde. Das verbleibende unkomplexierte Thromboplastinkonjugat wäre aktiv und würde die Gerinnung in Gang setzen. Unter Einsatz entsprechender Standards könnte die Zeit zur Strämungsunterbrechung mit der Analytmenge in der Probe in Beziehung gebracht werden. Oder es könnte dafür gesorgt werden, daß bei einer Analytmenge über einem Schwellenwert Strömungsunterbrechung auftritt oder nicht.
Neben der Koagulierung kann Agglutination, Präzipitation oder Pfropfenbildung durch andere Mittel oder, wenn geeignet, eine Erhöhung der Viskosität als Teil des Detektionsschemas eingesetzt werden.
Zur Pfropfenbildung oder Verlangsamung der Strömung auf andere Weise als durch Gerinnung sind im Medium üblicherweise Teilchen eingeschlossen, die in Relation zur vorhandenen Analytmenge vernetzt werden. Das kann durch den Einsatz von Rezeptoren und Liganden, die für den Rezeptor spezifisch sind, erreicht werden, sodaß nicht-kovalente Bindung für mehrfache Verbindungen zwischen den Teilchen mit einer resultierenden Vernetzungsstruktur sorgt, die als Pfropfen dienen kann. Durch Verwendung solcher Teilchen wie S. aureus, das sich spezifisch an Immunkomplexe, rote Blutkörperchen, synthetische oder natürlich auftretende Teilchen bindet, an die Liganden, rheumatoider Faktor, Antikörper, natürlich auftretende Rezeptoren oder dergleichen konjugiert sind, kann die Vernetzung der Teilchen durch das Vorhandensein oder Fehlen des Analyten verzögert oder verstärkt werden. So kann im Fall von Antigenen das Antigen als Brücke zwischen verschiedenen Antikörpern dienen, während im Fall von Haptenen einzelne Haptene die Vernetzung hemmen können, die aus einem polyhaptenischen Molekül resultiert.
Die verschiedenen Kombinationen, die bei den Strömungsmodulationsverfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, kännen auf verschiedene Art veranschaulicht werden. Beispielsweise könnten die Reagenzien eine Agarosekugel umfassen, an die polyklonale Antikörper gegen ein Antigen von Interesse oder monoklonale Antikörper gebunden sind, wobei verschiedene Teilchen für verschiedene epitopische Stellen des Antigens spezifisch sind. Die Probe muß nur die Detektionskomponente und einen beliebigen Analyten umfassen, der vorhanden sein kann. Die Probe würde sich mit den Antikörper-konjugierten Teilchen in der Reaktionseinheit vermischen und dann in die Ausgangseinheit strömen. Das Vorhandensein des Analyten würde zur Vernetzung der Teilchen mit großen amorphen Teilchen führen, was für einen größeren Widerstand der Strömung kleinerer Teilchen sorgen könnte. Mit zunehmenden Anwachsen der Teilchen würde sich schließlich ein Pfropfen bilden und der Fluß aufhören. Im Fall von Haptenen könnte die Probe mit Antikörpern gegen die Haptene kombiniert werden. Das Reagens könnte an Porglas- Kugeln konjugiertes Hapten sein. Verfügbare Antikörper wären zur Vernetzung der Hapten-konjugierten Kugeln fähig, sodaß schlußendlich ein Pfropfen bereitgestellt wird, der weiteren Fluß hemmen würde.
Ähnliche Techniken könnten bei Hemaglutinierung eingesetzt werden, wobei das Teilchen ein rotes Blutkörperchen ist, an das bestimmte Antigene gebunden sind oder wurden. Eine Probe, die Zellen enthalten könnte, die als Teil ihrer Oberflächenmembran das gleiche Antigen autweisen, würde mit den Antigenkonjugierten roten Blutkörperchen-Teilchen kombiniert. Das Reagens wäre ein Antikörper gegen das Antigen. Die Bildungsrate des Pfropfens würde je nachdem variieren, ob Zellen, die das gleiche Antigen enthalten, vorhanden oder nicht vorhanden sind.
Eine weitere Veranschaulichung betrifft Polymere, an denen polyklonale Antikörper befestigt sind, wobei die Polymere so gewählt sind, daß sie nur mäßige Löslichkeit im Assaymedium aufweisen. Die Bindung an antigenische Brücken würde zu Desolubilisierung führen.
Die Polymere könnten mit Nukleinsäuresequenzen konjugiert werden, die zu vorgewählten Sequenzen komplementär sind. Die Sequenzen wären zur Nukleotidsequenz von Interesse oder zueinander nicht komplementär. Die Probe könnte ein Lysat eines Virus oder pathogenen Organismus in einem geeigneten wäßrigen Medium sein, wobei die genomischen Polynukleotide zerkleinert sein könnten. Die Probe würde mit den poymerischen Reagenzien kombiniert. Die Probe würde dann in der Reaktionskammer mit einer Nukleotidsequenz reagieren, die ein Hybrid mit einer zur Nukleinsäuresequenz von Interesse komplementären Sequenz ist und eine zur ans Polymer gebundenen Sequenz komplementäre Sequenz aufweist. So würde die Nukleinsäure von Interesse als Brücke zur Vernetzung der polymerischen Moleküle dienen, um eine polymerische Struktur zu bilden, die den Fluß in der Kapillare beträchtlich verlangsamen würde und, wenn gewünscht, einen Pfropfen bilden könnte.
Bei einer weiteren beispielhaften Ausführungsform würden Zweifach rezeptoren eingesetzt, z.B. Antikörper gegen Analyt und Antikörper gegen ein Teilchen, wie ein Antigen eines roten Blutkörperchens (RBC). Beim Quantifizieren eines mehrwertigen Antigens in Gegenwart von Antigen würde Vernetzung zwischen dem Antigen, Zweifachrezeptor und RBCs auftreten, sodaß große Komplexe gebildet werden, die die Strömungsrate verändern, während in Abwesenheit des Antigens keine Komplexe gebildet würden. Der Assay könnte durchgeführt werden, indem die Probe mit RBCs kombiniert wird, bevor sie in die Vorrichtung eingebracht wird, oder indem RBCs in der Probenaufnahmekammer bereitgestellt werden. Die Reaktionskammer würde den Zweifachrezeptor aufweisen, wo die Komplexbildung in Gang gesetzt würde.
Für einwertige oder Haptenanalyten würde der Assay modifiziert, indem ein Polyhaptenreagens eingesetzt wird, das der Probe vor ihrem Einbringen in die Vorrichtung zugegeben werden könnte. Das Vorhandensein von Hapten würde die Komplexbildung im Gegensatz zu dem Ergebnis, das beim mehrwertigen Antigenanalyten beobachtet wird, verringern.
Es kann jedes System gemessen werden, das zu einer Änderung der Strömungsgeschwindigkeit führt oder an ein Reagens oder System gekoppelt werden kann, das die Strömungsgeschwindigkeit beeinflußt. Es sind bereits verschiedene Systeme genannt worden, die zu Änderungen der Strömungsrate führen. Andere Systeme, die an Verbindungen von Interesse gekoppelt werden könnten, sind die Licht-initiierte Polymerisationskatalyse, die durch Lektin-Vernetzung initiierte zellulare Aggregation, enzymatische Reaktionen, die zu Polymer-Initiation in Verbindung mit wasserlöslichen Monomeren führen, z.B. Hydroxyalkylacrylate.
Es ist offensichtlich, daß das System eine große Vielzahl von Variationen zuläßt, wodurch eine Vielzahl von Vorschriften und Reagenzien möglich ist. So kann gemäß vorliegender Erfindung jede Substanz von Interesse detektiert werden, die das Strömen in einer Kapillare zuläßt.
Das Strömen in der Kapillarkanaleinheit kann durch verschiedene Techniken detektiert werden, die das Detektieren von Flüssigkeitsströmung zulassen, z.B. Strömungssensoren oder Drucksensoren, oder durch Bereitstellen einer detektierbaren Komponente im Assaymedium, die visuell oder durch Diodenassay detektiert werden kann. Techniken, die Flüssigkeitsströmungsbestimmungen zulassen, umfassen die Verwendung von Mitteln zum Messen der Triboelektrizität, Mittel zum Detektieren der Flüssigkeitsdurchgangsrate, das Detektieren von Doppler-Effekten oder dergleichen. Vorzugsweise wird im Medium eine Komponente verwendet, die die Strömungsdetektion durch Detektieren des Durchgangs der Komponente durch den ersten Kapillarkanal, der eine Aufnahmekammer verläßt, ermöglicht.
Die Strömung kann durch die Erzeugung eines Fleckenmusters detektiert werden, das aus der Bewegung von Teilchen im ersten Kapillarkanal und dem Hindurchgehen einer kohärenten Lichtquelle, z.B. Laserstrahl, oder einer LED durch den Kanal resultiert. (Siehe Powers et al., oben).
Ein Fleckenmuster resultiert aus der Interaktion von Teilchen und kohärentem Licht. Strömung (Bewegung) der Teilchen bewirkt, daß sich die Flecken mit einer Frequenz bewegen, die mit der Strömungsrate in Zusammenhang steht, und die Licht- oder Fleckenfluktuationen können durch einen Photodetektor detektiert werden. Der Photodetektor ist zum Detektieren eines Bereichs bestimmt, der nicht größer als etwa die Größe eines Flecks ist. Eine Vielzahl von Photodetektorelementen kann eingesetzt werden, um verschiedene Bereiche zu detektieren und den Durchschnittswert der Signale von jedem Bereich zu bilden. Das Fleckenmuster kann auch verwendet werden um die Größe der Teilchen durch Analyse der Größe der Flecken zu bestimmen.
Durch Einsatz eines Photodetektors kann die Änderung des Lichtmusters als Ergebnis einer Änderung in der Strömungsrate durch geeignete elektronische Mittel, wie Photodioden oder Phototransistoren, ermittelt werden, die das aus dem fluktuierenden Licht resultierende elektrische Signal einer entsprechenden Schaltung zuführen würden. Besonders leicht ist eine fließende Flüssigkeit von einer stationären Flüssigkeit zu unterscheiden. So kann das Verlangsamen oder Aufhören des Flusses leicht detektiert werden, und die Änderung in der Strömungsrate oder die Durchgangszeit durch die erste Kapillare kann vom Beginn des Fließens bis zum Unterbrechen des Flusses ermittelt werden.
Ein mögliches Problem, das bei Kapillarflußvorrichtungen gemäß vorliegender Erfindung auftreten kann, ist die Erschöpfung von Blut oder einer anderen Probe aus dem Reservoir vor dem Unterbrechen des Flusses dadurch, daß das detektierbare Ereignis, wie die Gerinnung, gemessen wird. Wenn die Flüssigkeit im Reservoir nach unten gezogen wird, sodaß im wesentlichen keine Flüssigkeit mehr im Reservoir vorhanden ist, wird der Fluß unterbrochen, da dann Kapillarkräfte in beide Richtungen wirken. Demgemäß ist es nützlich, ein Mittel zum Detektieren dieses anormalen Ergebnisses zu haben, um eine Messung der Strömungsunterbrechung zu vermeiden, die durch diesen Vorgang verursacht wird, wobei dieses Ereignis dafür verwendet wird, die Messung der Flußunterbrechung darzustellen.
Da die tatsächliche Vorrichtung, die die Kapllarkanäle und anderen Kammern enthält, typischerweise eine flache Patrone ist, die in ein Instrument eingesetzt wird, das die verschiedenen elektronischen Messungen vornimmt, kann die Detektion der Reservoirerschöpfung erreicht werden, indem verschiedene Sensoren in die eiektronische Vorrichtung eingebettet werden, die die Reaktionspatrone hält.
Da das Reservoir im allgemeinen außerhalb der elektronischen Vorrichtung liegt, sodaß Blut oder eine andere Flüssigkeit direkt in das Reservoir eingebracht werden kann, erfolgt die Messung der Flüssigkeitserschöpfung im Reservoir typischerweise in Gegenwart von Umgebungslicht und anderen Umgebungsbedingungen, deren Schwankung bei jeder Meßtechnik berücksichtigt werden muß. Eine geeignete Meßtechnik besteht darin, moduliertes Licht auf das Reservoir in einem Bereich zu projizieren, der an die Kapillare angrenzt, die zu den Reaktionskammern und anderen Teilen der Vorrichtung führt. In Flüssigkeiten, die Teilchen enthalten, wie rote Blutkörperchen in Blut, wird Licht durch die Flüssigkeit in alle Richtungen gestreut, obwohl das Licht senkrecht zum Reservoir einfällt. Ein Teil des Lichts wird die Eingangskapillare nach unten gestreut, die dann als Lichtleiter wirkt. Das Vorhandensein von Teilchen in der in der Kapillare befindlichen Flüssigkeit führt jedoch wieder zu gestreutem Licht, das durch die transparenten Wände des Lichtleiters (Kapillare) nach außen gelangt, wo es von einem Photodetektor gemessen werden kann. Der mit Blut gefüllte Kapillarkanal kann als undichter Wellenleiter für Licht betrachtet werden, weil eine Differenz im Brechungsindex zwischen dem Blut (hoher Brechungsindex) und einem es umgebenden Material mit geringem Brechungsindex (Kapilarkanal) für Lichtleitung sorgt, während das Vorhandensein roter Blutkörperchen das Licht durch die Wände des Kapillarkanals streut, wodurch die Undichtheitswirkung entsteht. Da Licht nur in Gegenwart roter Blutkörperchen oder anderer Teilchen gestreut wird, detektiert ein sehr nahe beim Kanal befindlicher Detektor das gestreute Licht. Die Modulation des ausgesandten Lichts isoliert den Detektor von Störungen durch die Umgebung. Wenn das Licht mit einer definierten Frequenz moduliert wird und die Detektionselektronik nur für diese Frequenz empfindlich ist, werden Umgebungswirkungen ausgeschaltet. Die auf das Licht ausgeübte Modulation kann von einer beliebigen Art sein, wie Sinuswellen oder Zerhacken, solange die Moduation durch elektronische oder mechanische Mittel sowohl erzeugt als auch detektiert werden kann. Störungen aus Umgebungslicht können weiters ausgeschaltet werden, indem Infrarotlicht verwendet wird, das (wenn Blut die Probe ist) die zusätzlichen Vorteile erhöhter Streuung und Transmission bietet.
Diese Technik zum Detektieren der Erschöpfung von Flüssigkeit im Reservoir bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Techniken. Die Detektion von Flüssigkeiten in Kapillarkanälen wird normalerweise durch das Messen von Änderungen der Absorption oder Transmission von Licht erreicht, das durch den Kanal geschickt wird. In gewissen Fällen ist das jedoch wegen der physikalischen Einschränkungen, denen das Reservoir und seine Position in der Kapillarvorrichtung sowie die elektronische Vorrichtung, in die die Kapillarvorrichtung eingesetzt ist, unterliegt, nicht möglich. Beispielsweise erfordert es die Größe eines Fingers, wenn Blut von einem Fingerstich erhalten wird, daß das Reservoir ausreichenden Abstand von der elektrischen Vorrichtung aufweist, damit der Finger auf das Reservoir gelegt werden kann. Das bedeutet, daß beide Seiten der Kapillarvorrichtung, die an das Reservoir angrenzen, die elektronische Vorrichtung nicht berühren, da zumindest eine Seite für den Finger zugänglich sein muß.
Beim hier erörterten Verfahren ist es nicht notwendig, daß beide Seiten der Kapillare für die Transmission und Detektion von Licht zur Verfügung stehen. Weil ein Streuungseffekt eingesetzt wird, kann der Detektor entweder auf derselben Seite der Kapillare, auf der Licht einfällt, auf der gegenüberliegenden Seite oder in irgendeiner anderen physikalischen Beziehung vorhanden sein, solange der Detektor an den Kanal an grenzt.
Eine zusätzliche nützliche Steuerungsvorrichtung ist ein Mittel zum Simulieren des Blutflusses durch einen Kapillarkanal, um zu ermitteln, ob die elektronische Vorrichtung, in die die Patrone eingefügt wird, voll betriebstüchtig ist. Es sind zahlreiche Mittel verfügbar, um dieses Ergebnis zu erzielen, aber nachstehend wird eine nützliche Technik beschrieben, von der nicht angenommen wurde, daß sie auf irgendeine ähnliche Weise eingesetzt wurde.
Wie zuvor beschrieben, besteht eine nützliche Technik zum Messen des Blutflusses darin, das Vorhandensein eines Fleckenmusters als Ergebnis der Interaktion zwischen Teilchen und kohärentem Licht zu detektieren. Bei jeder Technik, die den Blutfluß simuliert, wenn ein solches Detektionssystem verwendet wird, ist es notwendig, das Fleckenlichtmuster zu simulieren. Da sich der Detektor und die kohärente Lichtquelle typischerweise in einer engen räumlichen Beziehung direkt einander gegenüber befinden, sodaß das Einsetzen der Kapillarvorrichtung dazu führt, daß Licht von der kohärenten Lichtquelle direkt durch einen Kanal in der Vorrichtung zum Detektor gelangt, erfordert die Simulation des Blutflusses das Einfügen irgendeiner Vorrichtung in die elektronische Vorrichtung, die den Lichtstrahl modulieren kann. Das könnte zwar unter Verwendung einer zweiten Vorrichtung erreicht werden, die beispielsweise moduliertes Licht erzeugen könnte, eine nützliche Technik besteht jedoch darin, Elektronik und Modulationsvorrichtungen direkt in die Kapillarvorrichtung einzubauen, sodaß jede Kapillarpatrone verwendet werden kann, um die Betriebseigenschaften der elektronischen Vorrichtung, die die kohärente Lichtquelle und den Detektor enthält, unmittelbar vor dem Vornehmen der tatsächlichen Messung zu ermitteln. Dafür ist es jedoch notwendig, daß der Fleckenmustererzeuger so beschaffen ist, daß er die tatsächliche Messung dann nicht stört. Ein Mittel, um diese Ergebnisse zu erreichen, besteht darin, eine Vorrichtung vom Flüssigkristallanzeigentyp an der Stelle aufzunehmen, wo die Messung erfolgt. Das Flüssigkristallmaterial ist so gewählt, daß es hindurchgehendes polarisiertes Licht dreht, das typische Mittel, mit dem Flüssigkristalle arbeiten. Entweder in der Patrone selbst oder in der elektronischen Vorrichtung, in die die Patrone eingesetzt wird, sind Polarisationsfilter vorhanden, was dazu führt, daß Licht durch die Polarisationsfilter hindurchgeht, wenn die Flüssigkristallvorrichtung abgeschaltet wird. Wenn jedoch die Flüssigkristallvorrichtung durch das Anlegen einer Spannung aktiviert wird, wird der Durchtritt von Licht blockiert.
Wenn die Flüssigkristallvorrichtung aktiviert wird, dreht sie typischerweise die Polarisation des Laserstrahls, wodurch das Hindurchtreten von Licht verringert wird und Lichtamplitudenfluktuationen erzeugt werden, die als äquivalent zum bewegten Fleckenmuster detektiert werden, das erzeugt wird, indem kohärentes Licht durch den dünnen Film eines teilchenhältigen Fluids geschickt wird, der normalerweise den Kapillarkanal hinunterfließen würde.
Ein Flüssigkristallmaterial mit geringer Viskosität, das eine hohe Brechungsindexänderung aufweist (wodurch rasche Fluktuationen ermöglicht werden) ist wünschenswert. Bei einer typischen Konstruktion werden ein Kristalloszillator und eine Kette binärer Zähler verwendet, von denen die Flüssigkristallanzeigeantriebssignale stammen, ebenso wie die Zeitbasis für die durchzuführenden Messungen.
Für eine weitere Darlegung der Erfindung wird nun eine Anzahl veranschaulichender Vorrichtungen erörtert, die verwendet werden können. Wie bereits angeführt, weist die Vorrichtung zumindest eine Kapillarkanaleinheit, eine Kammereinheit, eine Einlaßöffnung, ein Belüftungsloch und ein an die Oberfläche gebundenes Reagens auf.
Die Vorrichtung ist aus Materialien mit den entsprechenden physikalischen Eigenschaften, wie optische Transmission, Wärmeleitfähigkeit und mechanischen Eigenschaften, hergestellt, die gleichmäßige Reagensbeschichtung und -stabilität zulassen, sowie Medien kompatibilität, beispielsweise Blutkompatibilität. Wenn das Medium Blut ist, sollte das Material eine solche Konfiguration aufweisen, daß gute Strömungsunterbrechung oder -verlangsamung gewährleistet ist, sobald Gerinnung in Gang gesetzt wird. Zu diesem Zweck geeignete Kunststoffe umfassen jene mit hohen freien Oberflächenenergien und geringer Wassersorption, einschließlich PETG, Polyester (Mylar ), Polykarbonat (Lexan ), Polyvinylchlorid, Polystyrol und SAN. Ein besonders bevorzugter Kunststoff ist Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS), insbesondere das von Borg Warner unter dem Markennamen Cycolac angebotene ABS. Da diese Kunststoffe jedoch hydrophob sind und schlechte Reagensbeschichtbarkeit und schlechte Blutströmungsbedingungen aufweisen, können sie durch Behandlung mit Argonplasnia unter Verwendung eines Plasmaätzers oder von Glimmentladung hydrophil gemacht werden. Geeignete Bedingungen sind 10-25 Watt bei 13,56 MHz und 133x10&supmin;&sup6; mPA (1 torr) Kammerdruck für 5-10 min. Alternativ dazu kann in manchen Fällen eine Proteinbeschichtung z.B. mit Albumin, verwendet werden, indem eine Lösung mit etwa 1-5% Serumalbumin durch die Vorrichtung geschickt wird, die Lösung 30 min lang stehen gelassen wird und Abwischen und Trocknen erfolgt. Es können auch andere Modifikationen zur Anwendung kommen. Plasmaätzen und Glimmentladung sorgen für deutlich bessere Strömungsregulierungseigenschaften und Reproduzierbarkeit.
Die Vorrichtung kann auf vielfältige Arten hergestellt werden. Die Aufnahme- und Reaktionskammern können in der Kunststoffplatte durch Vakuumformgebung (PETG), Spritzguß (PETG, Polystyrol, SAN) oder Heißprägen gebildet werden. Kapillaren können gebildet werden, indem ein Kanal in den Kunststoff geätzt wird. Die Vorrichtung kann abgedichtet werden, indem ein Deckstück (mit entsprechenden Lüftungslöchern am Einlaß und Belüftungsloch) auf der Basisplatte angeordnet und durch Ultraschallschweißen oder Lösungsmittelklebung ("solvent bonding") abgedichtet wird. Mit diesen Techniken werden deutlich überlegene Produkte durch Spritzgießen der Kunststoffvorrichtung in Teilen, sodaß eine Vertiefung in zumindest einer Oberfläche von zumindest einem Kunststoffteil gebildet wird, erhalten. ABS-Polymere sind für Spritzguß besonders geeignet und liefern außerdem einen klaren Kunsttoff der für zahlreiche Techniken zur optischen Detektion geeignet ist. ABS-Polymere sind auch zum Ultraschallschweißen geeignet. Vorzugsweise werden die Kammern aus zwei im wesentlichen flachen Kunststoffteilen gebildet, in denen die Kapillaren und anderen Kammern durch Erzeugung von einander entsprechenden Vertiefungen in zwei Oberflächen von zwei Kunststoffteilen mit unterschiedlicher Form ausgebildet werden. Es ist vorzuziehen, daß auf einem der Teile Rippen, die als Energie-Lenkeinrichtung bekannt sind, die Vertiefung mit geringem Abstand vollständig umgeben, sodaß eine Oberfläche der ersten Berührung gebildet wird, wenn die beiden Teile aneinandergelegt werden. Wenn ABS verwendet wird, sind die Rippen typischerweise 0,19 mm ±0013 mm (7,5 mil ± 0,5mil) über der Oberfläche des Kunststoffs. Die Rippen haben typischerweise die Form eines Dreiecks, üblicherweise die eines gleichseitigen Dreiecks. Der Mittelpunkt der Rippe ist typischerweise 0,44 mm ± 0,013 mm (17,5 ± 0,5 mils) von der Kante der Vertiefung, die die Kammer bildet, entfernt. Die Verwendung solcher Energie-Lenkeinrichtungen beim Ultraschallschweißen erzeugt eine hochreproduzierbare Dichtung um die Kanten der Innenkammer, die gebildet wird, wenn die beiden Platten mit Ultraschall aneinandergeschweißt werden. Zugangsöffnungen werden typischerweise gebildet, indem vor dem Schweißen Löcher in die vertieften Oberflächen der einzelnen Kunststoffteile geformt oder gebohrt werden. Demgemäß bilden die geschweißten Rippen eine vollständige Abdichtung um die Seitenkanten der Innenkammern.
Alternativ dazu kann das Muster in ein Doppelklebeband (z.B. 3M Nr. 666 Band, Fasson Fastape A) mit entsprechender Dicke gestanzt werden, das dann in Sandwichanordnung zwischen einer Kunststoffbasis und einem Deckstück angeordnet wird. Oder die Sandwich-Schicht kann aus einem Kunststoffstück mit entsprechender Dicke ausgestanzt werden, das mit Kleber beschichtet und auf die gleiche Weise wie das Band in Sandwichanordnung angeordnet wird. Der Kleber könnte auch durch Siebdruck ("silk-screening") auf die Basis aufgetragen werden, um ein erhöhtes Muster mit gewünschter Dicke zu ergeben.
Die Plattendicke der Vorrichtung im Bereich der Kapillarkanäle ist im allgemeinen gleich oder über etwa 0,05 mm (2 mil), um ein Eindrücken durch Kapillarwirkung zu verhindern. Bei der Ausführungsform mit Sandwichanordnung ist jede der Kunststoffschichten, die die Ober- und Unterseite umfassen, zumindest etwa 10 mi (0,25 mm) dick.
Es können zwar auch andere Materialien, wie Glas, für die Herstellung verwendet werden, aber diesen Materialien fehlen größtenteils eine oder mehrere der wünschenswerten Eigenschaften der angegebenen Materialien, und sie sind daher nicht erörtert worden. Es kann jedoch spezielle Situationen geben, in denen Glas, Keramik oder ein anderes Material Verwendung finden, wie ein Glasfenster für optische Klarheit, Modifikation der Oberflächenspannung und dergleichen.
Die Vorrichtung umfaßt normalerweise ein Reagens innerhalb der Reaktionskammer. Das Formulieren des Reagens/der Reagenzien kann nur mit diesem oder zusammen mit verschiedenen Additiven erfolgen. Die Art, wie es formuliert, in die Reaktionskammer eingebracht und in der Reaktionskammer gehalten wird, muß für rasches Vermischen mit der Probe, reproduzierbare Verteilung in der Kammer, Stabilität während der Lagerung und reproduzierbare Reaktion mit der Probe sorgen.
Um die Reproduzierbarkeit der Verteilung zu gewährleisten, können verschiedene Techniken eingesetzt werden, um das Reagens in die Kammer einzubringen. Wenn die Vorrichtung aus zwei Teilen hergestellt wird, die zusammenpassen, kann das Reagens aufgesprüht, aufgestrichen, in die Kammer als Flüssigkeit eingebracht, lyophilisiert oder verdampft, adsorbiert, kovalent konjugiert oder dergleichen werden. Das aktive Reagens kann mit verschiedenen Stabilisatoren, Exzipienten, Puffern oder anderen Additiven, die an der Reaktion beteiligt sind, kombiniert sein. Alternativ dazu kann an der Reaktionseinheit, üblicherweise der Kammer, eine kleine Phiole oder ein anderer Behälter befestigt sein, wobei die Lagerung als Flüssigkeit erfolgt und die Flüssigkeit in die Reaktionseinheit eingebracht werden kann, bevor die Probe in die Reaktionseinheit eintritt oder gleichzeitig damit. Es kann eine zweite Aufnahmekammer verwendet werden, die mit der Reaktionseinheit durch einen Kapillarkanal verbunden ist, wobei die Übertragung des Reagens in der zweiten Aufnahmekammer zur Reaktionseinheit in Verhältnis zum Einbringen der Probe initiiert wird. Beispielsweise könnte die zweite Aufnahmekammer gefüllt und abgedichtet sein und dann wieder geöffnet werden, wenn die Probe in die Probenaufnahmeeinheit eingebracht wird.
Um das Mischen zu verstärken, können verschiedene mechanische oder Ultraschall- Mittel eingesetzt werden, um die Probe und die Reagenzien zu vermischen, wobei die Mischmittel interne oder externe sein können. Schüttelvorrichtungen, Ultraschall- Überträger, Magnetstäbe und andere mechanische Mischeinrichtungen, Strömungsbrecher, Mischplatten oder -barrieren, Strömungsleiteinrichtungen oder dergleichen können eingesetzt werden. Die spezielle Weise, wie für das Rühren gesorgt wird, wenn überhaupt, variiert stark je nach dem erforderlichen Rührausmaß und der Konstruktion der Vorrichtung.
Es können verschiedene Chemikalien verwendet werden, um die Auflösung auf gleichmäßige Weise zu verstärken. Zu solchen Chemikalien gehören Tenside, Polyole, Zucker, Weichmacher, Flüssigkeiten oder dergleichen. Je nach der Art der Reagenzien können sie auf verschiedene Art formuliert sein, um rasches und gleichmäßiges Mischen zu gewährleisten.
In den Reagenskammern können auch andere Chemikalien vorhanden sein. Wenn beispielsweise eine Vorrichtung zur Messung der Prothrombinzeit verwendet wird, und eine Heparin enthaltende Vergleichsprobe verwendet wird, wie in der US-A-4.731.330 mit dem Titel "Whole Blood Control Sample" beschrieben, wobei diese Anmeldung auf denselben Zessionar übertragen ist wie die vorliegende Anmeldung, kann ein Heparinantagonist verwendet werden, um die Wirkungen von Heparin auf die Prothrombinzeitmessung auszuschalten. Zu den typischen Heparinantagonisten gehören Protaminsulfat und Polybren.
Das Reagens muß nicht auf die Oberfläche der Vorrichtung aufgetragen oder daran gebunden sein, sondern kann auch als löslicher/-es Schwamm oder Gel bereitgestellt sein oder alternativ dazu an ein/eine unlösliche/-en/-es Schwamm, Membran, Papier (z.B. Filterpapier) oder Gel absorbiert sein, der/die/das in die Reaktionseinheit eingebracht wird. Auf diese Weise kann die Flüssigkeit durch die Schaumstruktur gelangen, wobei es das Reagens auflöst, um das Reaktionsgemisch zu bilden.
Das Reagens kann in flüssiger Form in Mikrokapseln bereitgestellt sein. Das flüssige Reagens könnte aus den Mikrokapseln freigesetzt werden, indem auf die Wände der Reaktionseinheit Druck ausgeübt wird, was zum Brechen der Mikrokapselp und Freisetzen des flüssigen Reagens führt.
Wie bereits angeführt, muß das Reagens auch nicht auf eine einzige Reaktionseinheit beschränkt sein. Die gleichen oder verschiedene Reagenzien kännen in die Kapilare oder in aufeinanderfolgende Reaktionseinheiten eingebracht werden. Auf diese Weise kann eine Kaskadenreaktion durchgeführt werden, bei der man daran interessiert ist, jeden Reaktionsschritt einer Sequenz für einen vorbestimmten Zeitraum ablaufen zu lassen, bevor man auf das nächste Reagens trifft. Mehrfach-Reaktionseinheiten ermöglichen auch das Entfernen von Komponenten in der Probe, die die gewünschte Reaktion stören könnten. Durch das Vorhandensein von Rezeptoren in den ersten Einheiten können eine oder mehrere endogene Komponenten entfernt werden. Wo Teilchen zu entfernen sind, können Filter am Eingang oder Ausgang zu einer Reaktionseinheit eingesetzt werden.
Zusätzlich zum chemischen Reagens können in der Reaktionseinheit auch Mikroteilchen enthalten sein, die mit der sich bewegenden Front mitgeführt werden, wobei die Mikroteilchen zum Pfropfenbildungsmechanismus zur Strömungsunterbrechung beitragen können.
Bei der Durchführung des Assays wird auf angemessene Weise eine Probe entnommen und behandelt. Blut kann beispielsweise verdünnt und verschiedene Reagenzien zugegeben werden, insbesondere, wenn daran Interesse besteht, einen bestimmten Gerinnungs- oder gerinnungshemmenden Faktor zu bestimmen. Bei spezifischen Bindeassays können verschiedene Teilchen zugegeben werden, die durch die Zugabe spezifischer Bindungselemente, wie Haptene, Liganden und Rezeptoren, insbesondere Antikörper, funktionalisiert worden sind. In manchen Fällen kann ein System entwickelt werden, wo Gerinnung auftritt, wenn der Analyt nicht vorhanden ist. Daher werden Reagenzien zugegeben, die in Abwesenheit des Analyten in der Reaktionskammer abgebaut würden.
Sobald die verschiedenen Materialien gemischt sind, um das Probemedium zu bilden, wird das Probemedium in die Aufnahmeeinheit eingebracht und durch Kapilarwirkung in die nächste Einheit befördert. Es kann entweder eine visuelle Bewertung der Strömungsratenänderung oder eine elektromechanische Bewertung eingesetzt werden. Als Startzeit für die Messung kann das Erzeugen von Strömung durch den ersten Kapillarkanal oder durch einen darauffolgenden Kapillarkanal oder irgendein Punkt dazwischen ausgewählt werden. Wie bereits angeführt, können verschiedene Mittel eingesetzt werden, um die Strömungsgeschwindigkeit oder die Zeit bis zur Strömungsunterbrechung zu ermitteln.
Zur Messung eines Fleckenmusters, das bei Teilchen erhalten wird, wie sie in Blut vorhanden sind, kann eine Vorrichtung eingesetzt werden, die einen Halbleiterlaser und Photodetektoren umfaßt. Indem ein Photodetektor mit ausreichend kleiner Fläche einem Fleckenmuster ausgesetzt wird, wird ein statistisches Signal (Rauschen) beobachtet. Der Durchschnitt des als DC-Signal beobachteten statistischen Signals ist umgekehrt proportional zur Dichte der roten Blutkörperchen, und Änderungen in der Fluktuation dauern an, bis Strömungsunterbrechung, z.B. Gerinnung, auftritt. Eine solche Vorrichtung kann ein Gehäuse zum Aufnehmen und Halten der Vorrichtung und Mittel zum Regulieren der Temperatur umfassen.
Die Größe der Fläche, die mit einem einzelnen Photodetektor detektiert werden kann, kann auf verschiedene Arten reguliert werden. Eine Art, wie oben angeführt, besteht darin, einen Photodetektor zu verwenden, der nur eine kleine lichtempfindliche Fläche aufweist, bis hinauf zu etwa der Größe des Fleckens. Eine andere Möglichkeit besteht darin, eine optische Faser zu verwenden. Durch Regulieren der Parameter der Faser kann die Fläche reguliert werden, von der die Faser Licht empfängt. Anstelle einer Faser können Linsen eingesetzt werden, um die beobachtete Fläche zu begrenzen, wobei die Linsen von der Vorrichtung getrennt oder in sie eingeformt sein können.
Wenn etwas anderes als Strömungsunterbrechung beteiligt ist, können zur Bestimmung des detektierbaren Signals verschiedene Spektrophotometer, Fluorimeter oder dergleichen eingesetzt werden. Je nach Art der Assayvorschrift kann eine einzelne Bestimmung oder können mehrere Bestimmungen auf Basis eines fixen Werts oder einer kinetischen Bestimmung durchgeführt werden.
Für die vorliegenden Assays können verschiedene Vorrichtungen entwickelt werden. In den Fig. 1A und 1B werden Vorrichtungen dargestellt, die einzelne Kammern und eine oder zwei Kapillareinheiten umfassen. Diese Vorrichtungen können auf verschiedene Arten hergestellt werden, beispielsweise mit zwei Platten, wobei jede der Platten so geformt worden ist, daß sie die speziellen Einheiten darstellt, oder eine der Platten die Einheiten darstellt und die andere eine Deckplatte ist, oder mit drei Platten, wobei sich eine Platte, die die Einheiten darstellende Ausschnitte aufweist, in Sandwichanordnung zwischen den anderen beiden Platten befindet, wobei eine oder die anderen Platten die notwendigen Öffnungen für die verschiedenen Ausgänge bereitstellt. Es können sich auch andere Techniken als nützlich erweisen, um die Kammern- und Kanalhohlräume bereitzustellen.
Beim Einsatz der Vorrichtung 10 von Fig. 1A wird Kapillare 12 in die Probe eingebracht, sodaß die Einlaßöffnung 14 vollständig in der Probe versenkt ist. Es ist wichtig, jegliche Luftblasen zu vermeiden, wo die Luftblasen die Messung stören könnten. Die Innenfläche des oberen Abschnitts von Kapillare 12 ist mit Reagens 16 beschichtet, sodaß, wenn die flüssige Probe die Kapillare 12 durchläuft, das Reagens 16 in der Probe aufgelöst wird. Wenn die Flüssigkeitsfront die Markierung 18 erreicht, wird die Kapilare aus der Probe entfernt, wodurch das Probenvolumen definiert wird, und die Kapilare in eine zweite Flüssigkeit eingesetzt, um kontinuierliche Strömung beizubehalten. Ansonsten kann der Probentropfen ein Reservoir außerhalb der Einlaßöffnung 14 aufrecht erhalten. Die Probe strömt durch Kapillare 12 in Kammer 20 mit Belüftungsloch 22. Ein zweites Reagens 24 wird auf die Innenfläche von Reaktionskammer 20 aufgetragen, wo das Assaymedium eine zweite Umsetzung erfährt.
Bei Verwendung dieser Vorrichtung könnte ein Assaymedium als Probe hergestellt werden, die das Fluid, von dem vermutet wird, daß es den Analyten enthält, sowie ein gepuffertes Gemisch aus Enzym-Analyt-Konjugat umfaßt. Das Reagens 16 wäre Antikörper gegen den Analyten, sodaß das im Assaymedium vorhandene Enzym-Analyt- Konjugat in einer Menge an den Antikörper gebunden wird, die mit der Analytmenge im Assaymedium in Beziehung steht. Das Assaymedium tritt dann in Kammer 20 ein, wo das Reagens Substrat für das Enzym wäre. Es kann ein Substrat mit beschränkter Löslichkeit eingesetzt werden, sodaß die Substratmege rasch das Gleichgewicht erreicht und während der Messung konstant bleibt. Es kann auch eine hohe Konzentration eines löslichen Substrats vorhanden sein, um die Substratkonzentration während der Messung konstant zu halten. Dann kann die Produktbildungsgeschwindigkeit ermittelt werden, die von der Menge an in der Kammer vorhandenem aktivem Enzym abhängig ist. Da die Menge an aktivem Enzym mit der Analytmenge in Beziehung gesetzt werden kann, ist diese Geschwindigkeit daher proportional zur Analytmenge in der Probe. Durch Einsatz eines Substrats und eines Enzyms, das ein gefärbtes oder fluoreszierendes Produkt erzeugt, kann die Geschwindigkeit durch die Änderung der Farbe oder Änderung der Fluoreszenz über einen vorbestimmten Zeitraum überwacht werden.
In Fig. 1B weist die Vorrichtung 30 die Kapillare 32 auf, die in die Kanäle 34 und 36 unterteilt ist, welche die Reagenzien 38 bzw. 40 enthalten. Die beiden Kanäle haben eine gemeinsame Einlaßöffnung 42. Kanal 34 enthält Reagens 38, und diese werden als der erste Kanal und das erste Reagens bezeichnet, wobei es sich um Mikroteilchen handeln könnte, an die Antikörper gegen ein erstes Epitop konjugiert sind. Kanal 36 und Reagens 40, die als zweiter Kanal und zweites Reagens bezeichnet werden, enthalten Mikroteilchen, die monoklonale Antikörper gegen ein zweites Epitop aufweisen. In jedem Fall liegt die Menge an monoklonalem Antikörper in einem beträchtlichen Überschuß gegenüber jeglichem angetroffenen Analyten vor. Der Analyt von Interesse hat ein einzelnes Epitop, das sich an das erste Reagens bindet, und ein einzelnes Epitop, das sich an das zweite Reagens bindet. Die Probe wandert mit einer im wesentlichen konstanten Geschwindigkeit durch die Kanäle, wobei die Reaktion mit jeder Substanz auftritt, die das entsprechende Epitop aufweist.
Alle im Assaymedium vorhandenen Komponenten mit den entsprechenden Epitopen reagieren mit den Teilchenkonjugaten und werden an die Teilchenkonjugate gebunden. Die Teilchenkonjugate verlassen dann die Kanäle 34 und 36 und treten in die Inkubationskammer 44 ein. Die Kammer sorgt ebenfalls für Kapillarwirkung und Rühren aufgrund ihrer Ziehharmonikaform und Leitschaufeln 46, um Wirbelströmung in Kammer 44 zu bewirken. So vermischen und vernetzen sich die Mikroteilchen, wenn das Assaymedium die Kanäle 34 und 36 verläßt, wenn irgendein Analyt vorhanden ist, der die zwei Epitope auf demselben Molekül aufweist.
In der Inkubationskammer haben die Teilchen ausreichend Zeit zum Aggregieren, sodaß beim Eintritt in die Ausgangskapillare 48 die Teilchen, die gebildet werden, eine beträchtliche Wirkung auf die Strömungsrate in Kapillare 48 ausüben. Durch Messen der Strömungsgeschwindigkeit oder Ermitteln der Teilchengröße oder Anzahl an Teilchen in Kapillare 48 kann das Vorhandensein und die Menge eines Analyten mit beiden Epitopen ermittelt werden. Die Strömungsgeschwindigkeit oder ein anderer Parameter kann durch die Geschwindigkeit bestimmt werden, mit der Teilchen über einer bestimmten Größe einen Lichtweg durchlaufen, wobei z.B. minimale Lichtintensitätsfluktuationen oder Streuungsausmaß eingesetzt werden.
Die vorliegende Vorrichtung veranschaulicht die Möglichkeit, daß eine Vielzahl von Kapillaren vorhanden ist, um eine Probe in eine Vielzahl von Teilmengen zu unterteilen, wobei jede der Teilmengen anders behandelt werden kann. Die unterschiedlich behandelten Teilmengen können dann in eine einzelne Kammer zusammengebracht werden, wobei die verschiedenen Abschnitte entsprechend der gewünschten Vorschrift interagieren können. Je nach der Art der Vorschrift kann das resultierende Assaymedium dann in eine Kapillare übertragen werden, die für die Messung sorgen kann, oder kann zur weiteren Modifikation weiter zu zusätzlichen Kammern übertragen werden.
In den Fig. 2A und 2B wird eine Vorrichtung dargestellt, die eine Vielzahl von Kammern aufweist und unterbrochene Strömung zuläßt. Die Vorrichtung so ist aus drei Platten hergestellt, einer oberen Platte 52, einer unteren Platte 54 und einer Abstandhalteplatte 56, die die verschiedenen Kapillareinheiten und Kammereinheiten definiert. Die Vorrichtung weist drei Kammern auf, die Aufnahmekammer 58, die Reaktionskammer 60 und die Abflußkammer 62. Die Einlaßöffnung 64 nimmt die Probe auf, was durch das Füllen von Kammer 58 und das Erreichen der ersten Kapillare 66 gemessen wird. Die Aufnahmekammer 58 ist mit dem ersten Reagens 68 beschichtet, sodaß die Probe in Aufnahmekammer 58 eine Umsetzung erfährt und modifiziert wird.
Die modifizierte Probe geht dann durch Kapillare 66 und tritt in Reaktionskammer 60 ein, die mit dem zweiten Reagens 70 beschichtet ist. Das zweite Reagens ist, wie das erste Reagens, Teil eines Detektionssystems, um ein nachweisbares Signal zu liefern. Belüftungsloch 72 ist vorgesehen, um die Strömung zu unterbrechen und in Reaktionskammer 60 Inkubation zuzulassen. Das kann besonders nützlich sein, wenn der langsame Schritt bei der Entwicklung des Detektionssystems die Komplexbildung ist. Je nach der Art der Vorschrift kann der Inkubationszeitraum eine Inkubation mit bestimmter Zeitdauer oder eine solche sein, die ausreichend lange zugelassen wird, damit sie sicher abgeschlossen ist, woraufhin die Bestimmung erfolgt. Abflußkammer 62 weist ein Ausgangsbelüftungsloch 74 auf, um das Strömen an Zwischenbelüftungsloch 72 vorbei zuzulassen, wenn Zwischenbelüftungsloch 72 geschlossen ist. Nach dem Schließen von Zwischenbelüftungsloch 72 strömt das Assaymedium durch Kapillare 76 in Abflußkammer 62. Anstatt das Belüftungsloch abzudichten, können auch andere Alternativen, wie das Ausüben von Druck oder Zentrifugalkraft, eingesetzt werden, um das Strömen erneut in Gang zu setzen.
Die Vorrichtung besteht aus einem Block 78, der eine solche Konfiguration aufweisen kann, daß er zur Assaybestimmung in ein Instrument eingesetzt werden kann. Wie bereits angegeben, sind die verschiedenen Platten so konstruiert, daß sie ausreichende mechanische Stabilität gewährleisten, damit sie Kapillarwirkung aushalten und die für die Strömung des Assaymediums und die Detektion des nachweisbaren Signals erforderlichen Eigenschaften aufweisen.
Die vorliegende Vorrichtung kann zur Strömungsunterbrechung, wie Koagulation, eingesetzt werden, wobei die Koagulation in der Abflußkammer 62 auftreten kann. Man kann die Strömungsrate in Kapillare 66 messen oder den Zeitpunkt der Strömungsunterbrechung ermitteln, insbesondere, wenn die Kapillare 76 verlängert ist (siehe Fig. 5) und sich in Kapillare 76 ein Pfropfen bildet.
Bei dieser Vorrichtung könnte eine Bestimmung der Teilchenzahl vorgesehen sein, wenn die erste Kammer an Perlen konjugierte Liganden aufweist und der Analyt von Interesse ein spezieller Antikörper ist. Die Probe wird in die Aufnahmekammer 58 eingebracht, wo zwischen den perlenkonjugierten Liganden und jeglichem in der Probe vorhandenem Antikörper eine Reaktion erfolgt. Die Probe strömt dann in Reaktionskammer 60, die ein Reagens enthält, das sich spezifisch an Antikörper- Ligandkomplexe bindet, wie z.B. S.aureus Protein A, oder rheumatoider Faktor, der sich spezifisch an Poly(Antikörper-Ligand)-Komplexe bindet. So wird jedes Perlenkonjugat, das an Antikörper gebunden wird, von der flüssigen Phase des Assaymediums entfernt. Die Vorrichtung 50 kann dann in ein Instrument eingefügt werden, das das Belüftungsloch 72 abdeckt, wodurch Strömung durch Kapillare 76 zugelassen wird. Dann kann die Anzahl an Teilchen oder Perlen im Assaymedium in der Kammer 62 oder Kapillare 76 als Maß für die Menge an Antikörper in der Probe ermittelt werden.
Alternativ dazu kann für Komplexbildung zwischen Fab-Fragmenten und Haupthistokompatibilitäts-Antigenen von Zellen in der Aufnahmekammer 58 gesorgt werden. Dabei besteht Reagens 68 aus Fab-Fragmenten monoklonaler Antikörper, die für das Haupthistokompatiblitäts-Antigen spezifisch sind. Die Fab-Fragmente können von einer Maus- oder anderen nicht-menschlichen Quelle für monoklonale Antikörper stammen.
Das Reagens 70 besteht dann aus Teilchen, an die anti-Maus-Immunglobulin konjugiert ist. Auf diese Weise binden sich die Fab-gebundenen Zellen, wenn sie in die Reaktionskammer 60 eintreten, an die Latexteilchenkonjugate, sodaß erweiterte Strukturen gebildet werden. Beim Schließen von Belüftungsloch 72 durch Einsetzen von Vorrichtung 50 in ein Instrument strömt das Medium durch Kapillare 76, wo große Teilchen durch die Lichtstreuung oder das Transmissionsmuster von Licht durch die Kapillare und Blockierung durch die Zell-Teilchen-Aggregationen ermittelt werden können.
In Fig. 3 wird eine Vorrichtung dargestellt, die für die Bestimmung einer Vielzahl von Analyten in einer einzigen Probe exemplarisch ist. Die Vorrichtung 80 weist eine Aufnahmekammer 82 mit Einlaßöffnung 84 auf.
Die Probe wird in die Aufnahmekammer 82 eingebracht und durch Kapillarwirkung durch Kanal 86 in Reaktionskammer 88 gepumpt. In Reaktionskammer 88 befinden sich ein oder mehrere Reagentien 108, die einen Teil des Detektionssystems darstellen. Von Reaktionskammer 88 wird das Assaymedium dann durch die Kapillaren 90, 92 und 94 zu den Kammern 96, 98 bzw. 100 gepumpt. Die Medien in den Kammern 96 und 98 werden dann durch Nebenkapillaren 102 und 104 zur Endkammer 106 gepumpt. Auf diese Weise kann eine Vielzahl von Reaktionen stattfinden, wobei für weitere Reaktionen Reagentien in den verschiedenen Nebenkammern vorhanden sein können, um die Detektion einer Vielzahl von epitopischen Stellen zu ermöglichen.
Zur Veranschaulichung der obigen Vorrichtung kann aus einem Lysat der Serotyp eines bestimmten Pathogens ermittelt werden. Das Lysat wird durch Einlaßöffnung 84 in die Aufnahmekammer 82 eingebracht und dann in die Reaktionskammer 88 gepumpt. In der Reaktionskammer befindet sich Reagens 108, bei dem es sich um monoklonale Antikörper-Perlen-Konjugate gegen ein bekanntes ("pubic") Epitop des speziellen Pathogens handelt. Dann wird die Teilchenzahl in den Kapillaren 90, 92 und 94 gemessen, was die Basislinie für die Teilchenzahl liefert, die in Kammer 96, 98 und 100 vorhanden sein sollte. In jeder der Kammern 96, 98 und 100 befinden sich monoklonale Antikörper gegen ein Epitop, das für einen speziellen Serotyp spezifisch ist, wobei die Antikörper an größere Perlen konjugiert sind, die durch Lichtstreuungseigenschaften von den Perlen in Kammer 108 unterschieden werden können. Wenn sich daher der Signalcharakter in den Kammern 96, 98 und 100 ändert, ist das ein Hinweis für den speziellen Serotyp.
Wenn ermittelt werden soll, ob der Serotyp ein anderes Antigen von Interesse aufweist, können Antikörper gegen das spezielle Antigen in Kammer 106 vorgesehen werden. Kammer 106, eine enge Kammer, die für Blockierung durch Teilchen anfällig ist, weist Belüftungsloch 110 auf, um Strömen in Kammer 106 zuzulassen. Die Kapillaren 102 und 104 pumpen das Assaymedium aus den Kammern 96 und 98 in Kammer 106, wo das Vorhandensein des speziellen Antigens zur Vernetzung des Antigens führt. Vernetzung des Antigens führt zur Pfropfenbildung.
Es können auch andere Kombinationen aus Markern und Vorschriften eingesetzt werden. Durch Aufteilung des Assaymediums auf mehrere Wege kann das Assaymedium auf mehrere verschiedene Arten behandelt Lind, falls gewünscht, wieder in einer einzigen Kammer vereinigt werden, wie oben angeführt. Das kann in Situationen nützlich sein, wo Interesse an verschiedenen Analyten besteht, die verschiedene Kombinationen aus Epitopen aufweisen, oder wo der Analyt auf verschiedene Arten behandelt werden nuß, um das nachweisbare Signal zu liefern, oder wo es erwünscht ist, dem Analyten verschiedene Kombinationen von Markern zuzugeben, wo die beobachteten Ergebnisse kontrolliert werden sollen oder dergleichen.
In Fig. 4 ist eine Vorrichtung dargestellt, die die gleichzeitige Bestimmung eines Probenhintergrundwerts und des nachweisbaren Signals zuläßt. Die Vorrichtung 120 weist eine Einlaßöffnung 122 auf, die durch Trennwand 124 geteilt ist, die sich durch Kapillare 126, Kammer 128 und die zweite Kapillare 130 erstreckt. Kapilare 130 wird in Abflußkammer 132 mit Belüftungsloch 134 entleert. Kammer 128 ist in zwei Halbkammern oder Semikammern 136 und 138 unterteilt. In Semikammer 136 sind zwei Reagenzien vorhanden, die durch die Schrägstriche und die Kreuze angegeben sind. Die Schrägstriche sind monoklonale Antikörper, die für ein Epitop auf dem Analyten spezifisch sind, wobei die Antikörper nicht-diffusiv an die Oberfläche gebunden sind. Die Kreuze stehen für monoklonale Antikörper, die an Fluoreszenzmittel konjugiert sind, wobei sich die monoklonalen Antikörper an ein anderes Epitop des Analyten binden. Das Fluoreszenmittelkonjugat ist im Bereich nahe der Eingangsöffnung 140 und 142 von Kapillare 126 reversibel an die Oberfläche der beiden Kammern 136 und 138 gebunden.
Bei der Durchführung des Assay wird die Probeneinlaßöffnung in die Probe eingetaucht und zugelassen, daß die Probe in Kapillare 126 hochsteigt. Es wird ausreichend Probe eingebracht, und die beiden Kammern 136 und 138 werden gefüllt.
Während die Probe die beiden Semikammern durchläuft, treten verschiedene Ereignisse auf. In der Probenreaktionskammer wird jeder Analyt sowohl an den an die Oberfläche gebundenen Antikörper als auch an das Fluoreszenzmittelkonjugat gebunden, sodaß die Menge an Fluoreszenzmittelkonjugat, die in der Probenreaktionskammer 136 bleibt, von der Analytmenge in der Probe abhängt. Im Gegensatz dazu bindet sich Probe, die die Kontrollreaktionskammer 138 durchläuft, an das Fluoreszenzmittelkonjugat, geht aber durch die Kammer in Kapillare 130 weiter.
Durch entsprechende optische Einrichtungen kann die Fluoreszenz der beiden Kapillarbereichen 144 und 146 abgelesen werden. Der Kapillarbereich 144 ist der Bereich zur Bestimmung der Analytmenge, während der Kapillarbereich 146 als Vergleich dient. So ist die in Bereich 146 beobachtete Fluoreszenzmenge die maximale Fluoreszenzmenge, die aus der Kombination aus Probe und Fluoreszenzmittelkonjugat verfügbar ist. Jegliche Reduktion der Fluoreszenz im Kapillarbereich 144 ist ein direktes Ergebnis des Vorhandenseins von Analyt. Die beiden Ströme treten dann in Abflußkammer 132 aus.
Wie in Fig. 5 gezeigt, stellt die nächste Ausführungsform 160 einen Serpentinenweg bereit. Die Vorrichtung weist ein Gehäuse 162 auf, bei dem es sich um einen rechteckigen Kunststoffblock handelt, der so geformt ist, daß er in eine (nicht gezeigte) Ablesevorrichtung paßt. Der Block ist an Position 164 zur Ausrichtung auf die Vorrichtung mit einer Markierung versehen. Die Aufnahmekammer 166 hat ein Volumen, das etwa 1,5mal so groß wie das Volumen der Reaktionskammer ist. Die beiden Kammern sind durch den ersten Kapillarkanal 168 verbunden. Die Einlaßöffnung 170 ermöglicht das Einfüllen der Assayprobe durch Spritze, Pipette oder andere zweckmäßige Mittel. Ein serpentinenförmiger Kapiarweg 172 ist mit dem Auslaß 174 von Reaktionskammer 176 verbunden. Der Serpentinenkanal 172 endet in der Reservoirkammer 178, die die Auslaßöffnung 180 aufweist.
In bestimmten Situationen können verschiedene andere Konfigurationen eingesetzt werden. Beispielsweise könnte eine Y-förmige Vorrichtung verwendet werden, bei der ein Arm des Y eine Probenaufnahmekammer aufweist, wobei die Einlaßöffnung abgedichtet ist. Die Probenaufnahmekammer ist durch eine erste Leitung mit dem Mischelement verbunden, das als Schaft des dient. Die erste Leitung kann mit einem Fluid gefüllt sein, das eine Pufferlösung oder ein anderes Verdünnungsmittel sein kann.
Der zweite Arm des Y weist eine Fluidkammer mit einer abnehmbaren Abdichtung über einer Öffnung auf. Die Fluidkammer ist mit einem Fluid gefüllt, das als Verdünnungsmittel, Reagensquelle oder dergleichen dienen kann. Die Fluidkammer kann so groß wie erwünscht sein, damit sie für das gewünschte Verhältnis zwischen Fluid und Probe sorgt. Die Fluidkammer ist durch eine zweite Leitung, die ebenfalls mit dem Fluid der Fluidkammer gefüllt ist, an das Mischelement angeschlossen. Die Querschnitte der ersten und der zweiten Leitung sind so gewählt, daß für das richtige Volumsverhältnis zwischen Fluid und Probe gesorgt wird.
Das Mischelement kann eine Kapillare oder eine Kammer sein. Das Mischelement kann das Endelement der Vorrichtung sein oder an zusätzliche Elemente angeschlossen sein. So kann das Y als komplette Vorrichtung dienen, indem das Mischelement mit einer Auslaßöffnung versehen wird, oder ein Teil einer größeren Vorrichtung sein, indem das Mischelement mit zusätzlichen Kapillaren und/oder Kammern verbunden wird.
Um das Y zu verwenden, werden die Dichtungen von der Flüssigkeitkammer und der Probenkammer entfernt, während die Auslaßöffnung abgedichtet bleibt, um Strömung zu verhindern. Die Einlaßöffnung kann dann mit der Probe in Berührung gebracht und die Auslaßöffnung geöffnet werden. Die Probe und die Flüssigkeit von den beiden Kammern beginnen zu strömen und sich im Mischelement im richtigen Verhältnis zu vermischen. Je nach der speziellen Vorschrift kann eine Anzahl verschiedener Vorgänge bestimmt werden, indem der Fluidstrom in einer der Kapillaren abgelesen wird.
Eine Anwendung besteht darin, in der Flüssigkeitkammer fluoreszierende Antikörper vorzusehen. Wenn die Probe Zellen enthält, die den homologen Liganden aufweisen, führt das Vermischen der fluoreszierenden Antikörper und Zellen zu großen fluoreszierenden Teilchen, da das homologe Antigen auf den Zellen vorhanden ist. Diese großen fluoreszierenden Teilchen können dann auf verschiedene Weise detektiert werden.
Fig. 6 zeigt eine Querschnittansicht durch einen Abschnitt der hypothetischen Vorrichtung, die durch Ultraschallschweißen aus zwei (nicht notwendigerweise in einer der vorhergehenden Figuren gezeigten) Spritzguß-Kunststoffteilen hergestellt werden, vor dem Ultraschallschweißen. Die beiden Kunststofffeile 202 und 204, die verwendet werden, um die Innenkammern zu bilden, werden in Fig. 6A richtig angeordnet (d.h. lagegenau oder rapportgenau) gezeigt. "Lagegenauigkeit" wird hier wie im Druckereiwesen verwendet und bezieht sich auf die richtige Ausrichtung der Vertiefungen, die in der Oberfläche der beiden Teile vorhanden sind, die zum Ausbilden der Innenkammern und Kapillaren verwendet werden. Richtige Lagegenauigkeit kann unterstützt werden, indem die beiden Teile so durch Spritzguß erzeugt werden, daß auf einem Teil Vorsprünge vorhanden sind, die in (nicht Kapillaren oder Kammern bildende) Löcher oder Vertiefungen im zweiten Teil passen. Eine einzige abgerundete Vertiefung 206 bzw. 208 ist in der Oberfläche eines jeden Teils ausgebildet, aber die in der Figur gezeigte Querschnittform schneidet an drei verschiedenen Stellen durch die Vertiefung, von denen zwei zu Kapillarräumen (210 in Fig. 6B) führen, während die verbleibende Stelle zur Bildung einer größeren Reaktionskammer (212 in Fig. 6B) führt. Energie-lenkende Rippen 214 sind in der Oberfläche eines der beiden Kunststofffeile (204) angrenzend an die Außenseite der Vertiefung zu sehen.
Fig. 6B zeigt die gleiche Querschnittansicht nach dem Ultraschallschweißen. Der Kunststoff ist selektiv im Bereich der Energie-lenkenden Rippen geschmolzen, sodaß die beiden Kunststoffteile so ineinander geschmolzen sind, daß eine Dichtung um die Kapillare und die Reaktionskammer gebildet wurde. Um die zerstörenden Wirkungen von durch Ultraschallschweißen verursachter Hitze zu minimieren, wird das Ultraschallschweißen nur durchgeführt, bis eine Dichtung gebildet ist, und muß nicht durchgeführt werden, bis die gesamten Kunststofflächen zusammengeschweißt sind. Ungeschweißte Kontaktflächen werden in Fig. 68 durch die Bezugszahl 216 bezeichnet. Der Einsatz von Energierippen und kurzen Schweißzeiten gewährleistet auch, daß die Abmessungen der Vertiefung durch das Schweißen nicht beeinflußt werden. Die Schweißzeit wird so gewählt, das Schmelzen (Schweißen) die Kante der Vertiefung beinahe, aber nicht ganz erreicht. Die im Bereich der Kapillaren zwischen den beiden Platten zurückbleibenden extrem kleinen Risse beeinträchtigen die Kapilarwirkung nicht.
Fig. 7 zeigt eine elektronische Schaltung, die eingesetzt werden kann, um das Hindurchgehen von Blut durch eine Kapillarströmungsvorrichtung zu simulieren. Die Schaltung umfaßt einen quarzgesteuerten Oszillator, wobei 220 den Quarz und 222 den Oszillator bezeichnet. Das Signal vom Oszillator treibt zwei Frequenzteiler (224 und 226), die die Outputsignale für einen Treiber 228 eines Flüssigkristallanzeigenzelle 230 erzeugen. Die Zelle 230 ist durch ein oszillierendes Signal mit einer spezifischen Oszillationsrate, beispielsweise 128 Hz, vorgespannt. Die Zelle dreht daher ihre Polarisation mit einer Frequenz von 128 Hz. Der Polarisator 231 in Kombination mit der Zelle 230 bewirkt daher, daß als Ergebnis der rotierenden Polarisation abwechselnd Licht blockiert und durchgelassen wird.
Zwei weitere Teiler (232 und 234) treiben eine logische UND-Schaltung (236), deren Output in definierten Intervallen, beispielsweise etwa alle 20 5, zu einem logischen Schalttief verläuft. Wenn der Output zu einem logischen Tief gelangt, stellt der Output einer logischen ODER-Schaltung (238) die Teiler zurück, wodurch der Vorgang unterbrochen wird. Demgemäß werden für den eingestellten Zeitraum, im obigen Beispiel 20 s, Modulationssignale für die Flüssigkristallanzeigenzelle 230 erzeugt.
Die Vorrichtung ist mit einem Startschalter 240 versehen. Wenn der Schalter 240 geschlossen wird, wird das Rückstellsignal gelöscht, und der Vorgang beginnt erneut.
Der Oszillator, die Teiler, die logischen Schaltungen und der Flüssigkristallanzeigentreiber können in der CMOS-Technologie unter Einsatz herkömmlicher Techniken der Elektronikerzeugung verarbeitet werden. Eine CMOS-Vorrichtung kann über mehr als 10.000 Zyklen leicht mit Energie versorgt werden, wenn diese Versorgung durch eine Lithiumknopfbatterie erfolgt.
Fig. 8 zeigt eine Vorrichtung, mit der bestimmt werden kann, wann die in einem Reservoir vorhandene Probe erschöpft ist. In dieser Figur wird angenommen, daß die Probe Blut ist. Wenn Blut auf Probenreservoir 242 aufgebracht wird, beginnt es durch Kapillarwirkung sofort Kapillarkanal 244 hinunter zu strömen. Eine Lichtquelle 246, typischerweise eine Infrarotlicht aussendende Diode (LED) befindet sich angrenzend an das Blutreservoir nahe dem Kapillareneingang. Lichtquelle 246 wird von einem Moduator 248, typischerweise einem Sinuswellen- oder Rechteckwellen-Erzeuger, moduliert. Eine typische Modulationsfrequenz beträgt etwa 8 kHz. Das modulierte Licht wird durch rote Blutkörperchen in der Blutprobe gestreut, und ein Teil dieses Lichts wird durch den Kapillarkanal 244 gelenkt, der in der Kunststoffkapillarströmungsvorrichtung 250 ausgebildet ist. Da die roten Blutkörperchen in der Probe dieses gelenkte Licht weiter streuen, fängt Photodetektor 252, der sich typischerweise sehr nahe beim Einlaß 254 des Kapillarkanals befindet, einen Teil des Streulichts ein.
Der Signaloutput des Photodetektors besteht aus der Überlagerung von Umgebungslicht und Streulicht. Die Streulichtkomponente wird durch ein Bandpaßfilter 256 vom Umgebungslicht abgetrennt und durch Verstärker 258 weiter verstärkt. Dieses Signal wird durch Gleichrichter 260 gleichgerichtet und durch Integrator 262 integriert, um eine dem Streulicht proportionale Gleichspannung zu erzeugen. Andere Arten von Signalerzeugern können verwendet werden, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen, das vom Umgebungslicht und seinen möglichen Variationen abgetrennt werden kann. Beispiele dafür sind Wellenlängen (z.B. der Einsatz von Infrarotlichtquellen), Lichtpulse, Sinuswellenerzeugung und Digitalkodierung. Wenn andere Verfahren als die Frequenzmodulation eingesetzt werden, um das nachweisbare Signal zu erzeugen, bezieht sich der Begriff "Filter", wie in vorliegender Beschreibung verwendet, auf jedes Mittel zum Abtrennen des nachweisbaren Signals von Variationen im Umgebungslicht.
Die exakte Position der Umgebungslichtquelle und des Detektors in bezug auf die Verbindungsstelle zwischen dem Blutreservoir und der Kapillare kann zwar je nach der Cröße der Kapillare, der Stärke der Lichtquelle, der Detektionsgrenze des Detektors, der Absorption der Probe und dergleichen variiert werden, es wird jedoch vorgezogen, daß sich sowohl die Lichtquelle als auch der Detektor relativ nahe bei der Verbindungsstelle befinden, insbesondere, wenn eine stark absorbierende Probe, wie z.B. Blut, eingesetzt wird. Wenn eine Infrarotlichtquelle verwendet wird, ist es vorzuziehen, die Lichtquelle von 0,5 bis 2 mm vom Kapillareneingang anzuordnen, wobei ein infrarotempfindlicher Photodetektor 1 bis 4 mm von der Verbindungsstelle entfernt ist.
Wenn sich das Blutreservoir aufgrund des Kapillarflusses leert, wird der Lichtweg zwischen Lichtquelle 246 und Photodetektor 252 unterbrochen, wodurch der Spannungsoutput vom Integrator 262 verringert wird. Durch Verbinden des Outputs der Integration mit einem Komparator 264 wird ein Logikpegel erzielt, der das Vorhandensein oder Fehlen von Probe im Reservoir anzeigt. Weiters kann durch das Einstellen der Position der Lichtquelle oder der Bezugsspannung des Komparators das Probenvolumen im Reservoir, bei dem die Entscheidung "keine Probe" erfolgt, reguliert werden.
Eine Infrarotlichtquelle wird wegen ihrer größeren Effizienz bei der Umwandlung von elektrischem Strom in Licht im Vergleich zu sichtbares Licht abgegebenen Dioden vorgezogen. Eine Modulationsfrequenz von mehreren Kilohertz (vorzugsweise 3 bis 20 kHz) wird gewählt, um die Modulationsfrequenz von der niedrigen 60 Hz-Frequenz zu entfernen, die bei künstlicher Beleuchtung vorhanden ist, wodurch die Trennung von Umgebungslicht und Signallicht vereinfacht wird. Die Trennung wird durch die Wahl einer lnfrarotlichtquelle noch weiter verstärkt.
Natürlich können die einzelnen Kammern und Kanäle verschiedene Konstruktionen aufweisen. Die Konstruktionen und Kanäle sind so gewählt, das für optimale Empfindlichkeit für bestimmte Assays gesorgt ist. Die Volumina der Kammern werden so gewählt, daß ein entsprechendes Probenvolumen untergebracht werden kann. Die Beschaffenheit und der Querschnitt des ersten Kapillarenkanals gemeinsam mit der Größe der Reaktionskammer reguliert die Verweilzeit des Assaymediums in der Reaktionskammer. Bei manchen Systemen endet eine Reaktion, wenn die Probe die Reaktionskammer verläßt, z.B. Antigen-Antikörper-Komplexbildung, Proenzym zu Enzym usw., wenn eine Komponente an die Oberfläche der Kammer gebunden ist. Die in der Reaktionskammer stattfindende Reaktion kann zu einem Produkt führen, das eine Blockierung im zweiten Kapillarenkanal erzeugt oder verhindert, daß eine Blockierung entsteht. Die Verweilzeit für die Reaktion in der Reaktionskammer kann sorgfältig reguliert werden, indem die Abmessungen der Kapillarkanäle und der Reaktionskammer sowie die Temperatur reguliert werden.
Es ist offensichtlich, daß jede Art von Kapilarkanal eingesetzt werden kann, die für das Unterbringen des richtigen Volumens und den Zeitraum zur Strömungsunterbrechung sorgt. Es können verschiedene Konstruktionen verwendet werden, wie serpentinenförmig, linear, U-förmig, gefaltet oder dergleichen. Der Kanalquerschnitt kann kreisförmig, ellipsenförmig, rechteckig oder eine Kombination daraus sein. Die Länge der Kanäle kann empirisch in Abhängigkeit von den anderen beteiligten Parametern bestimmt werden.
Der Anfangs- oder Dosierungskanal kann einen konstanten oder variierenden Querschnitt haben. Bei einem konstanten Querschnitt verringert sich die beobachtete Strömungsgeschwindigkeit mit der durchlaufenen Weglänge. Daher hat die beobachtete Änderung der Geschwindigkeit zwei Komponenten: (1) eine inhärente Reduktion der Geschwindigkeit, die mit der zunehmenden Reibung mit zunehmender Flüssigkeitweglänge in Verbindung steht, und (2) eine Erhöhung oder Verringerung der Viskosität des Mediums aufgrund jeder stattfindenden Reaktion.
Um die Wirkung der Flüssigkeitweglänge auszuschalten, kann eine verjüngte Kapilare verwendet werden. Die Verjüngung kann errechnet werden, indem der Querschnitt, z.B. die Höhe und Breite des Kanals für jeden Punkt entlang dem Kanaiweg bestimmt wird. Es werden die nachstehenden Gleichungen eingesetzt. Die Gleichungen basieren auf bekannten Prinzipien der Strömungslehre (z.B. R. Byron Bird, Warren E. Steward, Edwin N. Lightfoot, "Transport Phenomena", John Wiley & Sons, Inc. 1960).
Die Strömungsrate Q mit Laser gemessen (im ersten Kapilarkanal) kann definiert werden durch:
worin V die Geschwindigkeit in der 2. Kapillare und A die Fläche des ersten Kapillarkanals ist, und
R = Radius des zweiten Kapillarkanals
µ = Viskosität des Flüssigkeiten
z = Entfernung den 2. Kapillarkanal entlang
ΔP = Druckabfall in der 2. Kapillare
definiert ist durch:
worin γ = Oberflächenspannung des Flüssigkeiten
φ = Kontaktwinkel zwischen Flüssigkeit und Oberfläche
Durch Kombinieren von (1) und (2) wird die Strömungsrate Q zu:
Aus (3) ist zu entnehmen, daß der Radius des zweiten Kapillarkanals proportional zur Entfernung z den Kanal entlang ist:
r = kz 1/3
worin
und Q* die gewünschte konstante Strömungsrate im 2. Kapillarkanal ist.
Unter Einsatz der obigen Gleichungen und Wahl eines gewünschten Q* gibt die folgende Tabelle die Änderungen im Radius an der durch z definierten Position für k = 0,034 an.
Aus der obigen Tabelle geht hervor, daß der Weg sich von einer Kapilare mit konstantem Radius zu einer ändern kann, bei der der Radius mit der Distanz zunimmt (z.B. einem Trichter) oder abnimmt. Diese Formel kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit wie gewünscht zu variieren, wenn sich die Flüssigkeit den Kapillarweg entlang oder durch einen Reagensbereich bewegt. Es kann auch eine pulsierende Strömung in Betracht gezogen werden.
Gemäß vorliegender Erfindung werden neue Vorrichtungen und Verfahren zum Messen einer großen Vielzahl von Probeneigenschaften bereitgestellt, sowie Analyten von Interesse. Die Vorrichtungen ermöglichen die einfache Messung von Volumina, Mischen von Reagenzien, Inkubationen und Bestimmung des Ergebnisses auf visuellem Weg oder durch Instrumente. Das Detektionssystem kann die Absorption oder Emission von Licht, oder die Strömungsmodulation, einschließlich der Verlangsamung, Unterbrechung oder ihrer Umkehr, umfassen. Das betroffene Medium ist Blut, wobei die Gerinnung bestimmt werden kann, oder Reagentien, die die Gerinnung beeinflussen. Ebenfalls von Interesse ist eine große Vielzahl von Analyten, die natürlich auftretende Verbindungen oder synthetische Arzneimittel umfassen. Die Vorrichtungen ermöglichen die gleichzeitige Durchführung von Kontrollen und den Vergleich von Signalen von den beiden Medien. Außerdem können verschiedene Kombinationen aus Kanälen und Kammern eingesetzt werden, sodaß die Wege divergieren und konvergieren können, in eine Vielzahl verschiedener Wege aufgespalten werden können oder eine Probe auf eine Vielzahl Wege verteilt und auf unterschiedliche Arten behandelt werden kann. Die Vorrichtungen können einfach herzustellen und die Serpentinenwege leicht zu konstruieren sein, indem bekannte Herstellungstechniken eingesetzt werden, wobei besonders vorteilhafte Vorrichtungen durch die Verwendung der hierin beschriebenen bevorzugten Herstellungstechniken erhältlich sind.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.

VERSUCHE

BEISPIEL 1: Detektion der Prothrombinzeit

Es wird eine Vorrichtung oder Patrone analog der Vorrichtung von Fig. 5 eingesetzt. Zwei Zelluloseacetatstücke mit einer Dicke von 40 mil werden durch mit Kerbungen versehenes Fason fast tape B voneinander getrennt, um die entsprechende Ausbildung von Kanälen und Kammern zu ergeben. Die Reaktionskammer enthält ein Thromboplastin-Reagens, wobei eine wäßrige Lösung des Thromboplastins in die Kammer eingefüllt und das Wasser verdampft wird, sodaß die Kammer mit Thromboplastin beschichtet verbleibt. Das Thromboplastin-Reagens hat folgende Zusammensetzung: 15 mg/ml Kaninchengehirnthromboplastinextrakt; 1 % Glycin; 0,01 % Thimerosal; 0,01 % Streptomycinsulfat; 0,01% Triton (RTM) X100; 0,08% Phenol; 1% Polyethylenglykol 3500; 4% Saccharose; 0,001 % Polybren . Das Gemisch wird lyophilisiert und mit entionisiertem Wasser zum 0,25fachen des Ausgangsvolumens rekonstituiert. 3 µl der rekonstituierten Flüssigkeit werden dann auf dem Reagensbereich der Vorrichtung angeordnet und lufttrocknen gelassen, bevor die andere Platte oder Abdeckung der Vorrichtung befestigt wird. Dann wird über den Kammern und Kanälen eine Abdeckung angeordnet, und eine 15 µl-Blutprobe wird in die Aufnahmekammer eingebracht. Die Vorrichtung wird dann in ein Überwachungsgerät eingeschoben, das auf 25ºC oder 37ºC temperaturgeregelt ist, wobei ein Galliumarsenid-Halbleiterlaser mit einer Wellenlänge von 0,78 µm einen Strahl an eine Stelle zwischen den Enden des Kanals lenkt, der die Aufnahmekammer und die Reaktionskammer verbindet. Auf der dem Laser gegenüberliegenden Seite befindet sich ein Siliziumphotodetektor mit einer kleinen Fläche, die ausreicht, um das oszillierende fleckenförmige Muster zu detektieren, das daraus resultiert, daß die roten Blutkörperchen durch den Kanal strömen. Ein Gleichstromsignal mit großen Schwankungen wird beobachtet. Das Gleichstromsignal ist invers proportional zur Dichte der roten Blutkörperchen und die Schwankungen dauern an, bis Gerinnung auftritt. Die Zeit wird dann mit bekannten Standards in Beziehung gesetzt, um die Gerinnungseigenschaft des Blutes zu ermitteln. Wenn der Blutquelle Warfarin verabreicht wird, kann die Gerinnungszeit mit der Wirkung von Warfarin auf die Blutgerinnungszeit in Beziehung gesetzt werden.
Außerdem kann die Lichtabsorption im Kanal ermittelt werden, um den Hämatokrit als weiteres Merkmal der Blutprobe zu liefern. Wegen der kurzen Wegänge des Lichts kann unverdünntes Blut verwendet werden, was einen weiteren Vorteil darstellt.

BEISPIEL 2: Detektion von vernetztem Fibrin-Dimer durch Latex-Agglutination

Materialien: "Dimertest latex"-Reagenzien und Kontrollserum (MABCO Ltd.). Es wird eine Patrone analog der in Fig. 5 verwendet. Zwei durch Spritzguß gebildete flache Polystyrolteile werden aneinander geschweißt, um den Kapillarkanal und die Reagenskammer zu bilden. Die Aufnahmekammer (166) ist 0,467 cm breit und 0,09 cm tief. Der erste Kapillarkanal (168) ist 1,3 mm breit und 0,09 mm tief. Die Reagenskammer (176) ist eine Ellipse mit einer 12 mm langen Hauptachse und einer 6 mm langen Nebenachse und ist 0,09 mm tief. Der Serpentinenkapillarweg (172) ist 160 mm lang und erweitert sich von einem Radius von 0,09 mm am Auslaß der Reagenskammer auf 0,185 mm an der Auslaßöffnung (180).
Versuch: Probe (10 µl entweder Puffer oder positiver Vergleich) wurde mit mit Antikörper beschichtetem Latex (40 µl) vermischt; nach 3minütigem sanifem Schütteln wurden 40 µl des Gemisches in die Patrone injiziert, die kein Reagens enthielt, und in ein Kontrollgerät eingeschoben, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Signal vom Laserdetektor wurde auf einem Omega-Schreiber (Modell 1202) unter Einsatz von 5V Gesamtbereich der Empfindlichkeit und einer Schreibgeschwindigkeit von 6 cm/min aufgezeichnet. Die Bewegung von Latexteilchen durch den Lichtstrahl erzeugte eine Spur mit leichtem Rauschen ( 1 Diagrammunterteilung {0,01 des Gesamtbereichs} Peak-Peak). Durch das Vorhandensein des Analyten verursachte Agglutination des Latex (vernetzte Fibrin-Abbauprodukte) führte zu einer beträchtlichen Erhöhung des Rauschens ( 3 Diagrammunterteilungen Peak-Peak).

BEISPIEL 3: Direkte Blutgruppenbestimmung durch Agglutination roter Blutkörperchen Materialien: Mit Natriumzitrat antikoagulierte menschliche Blutproben bekannter Gruppen. Blutgruppenbestimmungs-Antiseren (American Dade).

Versuch: Resuspendiertes Blut (40 µl) wurde mit Antiserum (40 µl) vermischt und 40 µl des Gemisches in leere Patronen injiziert (wie in Beispiel 2) und die Ergebnisse analysiert, wie in Beispiel 2. Positive Agglutination wurde als rasch zunehmender Rauschpegel beobachtet, negative Reaktionen ergaben einen beständigen niedrigen Rauschpegel.

BEISPIEL 4: Direkte Blutgruppenbestimmung durch Strömungsunterbrechung

Materialien: Blutproben wie in Beispiel 3. Es wurden Patronen eingesetzt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Vor dem Verschweißen der beiden Teile der Patrone wurde die Serpentinenspur des unteren Teils gleichmäßig mit 5 µl Bluttypisierungs-Antiserum (American Dade) beschichtet, das gegen 1% Glycin (Na+), pH 7,5, dialysiert worden war, das 0,01% Triton (RIM) X-100, 2% Saccharose und 0,5% Polyethylenglykol 3500 enthielt. Dann wurde das Lösungsmittel (Wasser) durch Verdampfen entfernt und die beiden Teile der Patrone zusammengeschweißt.
Versuch: Blut (40 µl) wurde nach dem Einschieben in ein Überwachungsgerät (wie in Beispiel 1 beschrieben) in die Patronen injiziert. Die Strömungszeit der roten Blutkörperchen am Laserstrahl vorbei bis zur Unterbrechung wurde aufgezeichnet.
*eine positive Reaktion war als Zeit < 120 s definiert.
Agglutination roter Blutkörperchen an der Vorderfront des Blutes verursachte Verstopfen des Wegs und Strömungsunterbrechung. Alle Blutproben ergaben die entsprechende Reaktion.

BEISPIEL 5: Blutgruppenbestimmung durch Strömungsgeschwindigkeitsmessungen

Materialien: Blutproben wie in Beispiel 3; Patronen (wie in Beispiel 2 beschrieben) mit 3 µl American Dade-Bluttypisierungsantiseren, die (wie in Beispiel 4 beschrieben) auf die Reagenskammer aufgetragen und getrocknet wurden.
Versuch: Blut (50 µl) wurde bei Raumtemperatur in die Patronen injiziert. Die Zeit, die das Blut benötigte, um bekannte Distanzen entlang der engen Spur zu erreichen, wurde aufgezeichnet. Strömungsraten wurden dann aufgrund der Kenntnis des Querschnitts der Spur als Funktion der Distanz berechnet.
* eine positive Reaktion wurde als Strömungsrate < 0,030 mm³/s angenommen.
Die Agglutination der roten Blutkörperchen verursachte eine beträchtliche Reduktion der Strömungsraten.

BEISPIEL 6: Verwendung von Filtern zur Modifizierung der Probenzusammensetzung

a. Rote Blutkörperchen wurden durch Filtration durch eine trockene Filterpapierscheibe, die mit anti-menschliche Blutkörperchen-Antikörper imprägniert war, quantitativ aus Voliblut entfernt. Die Scheiben wurde aus Beckman Paragon - Elektrophorese- Blotterpapier (etwa 0,57 mm dick) so ausgeschnitten, daß sie auf die Probenauftragstelle der Patronen paßten. Es wurde eine Metalstanze mit 0,467 cm Durchmesser verwendet. Nachdem die Scheiben genau in die Probenstelle der Spur eingepaßt worden waren, wurden 10 µl anti-menschliche rote Blutkörperchen-Antikörper von einem Kaninchen (Cappel) zugegeben. Das ist genügend Flüssigkeit, um das Papier zu sättigen. Die Flüssigkeit wurde dann unter Vakuum verdampft.
Wenn Blut (40 µl) auf die Scheibe aufgebracht wurde, trat etwa 7 µl klares Plasma in die Spur ein, bevor die Strömung unterbrochen wurde.
b. Mit Natrumdesoxycholat (10 µl x 10%) imprägnierte Filterpapierscheiben (wie oben) wurden unter Vakuum getrocknet und an der Probenaufbringstelle angeordnet. Blut (40 µl) wurde bei 37ºC aufgetragen. Eine klare gleichmäßige rote Lösung frei von jeglichen roten Blutkörperchen wurde in die Spur filtriert und diese damit gefüllt. Das Absorptionsvermögen des verbleibenden Hämolysats kann ein präzises Maß für die Hämogbinkonzentration darstellen.

BEISPIEL 7: Elektronische Patrone

Eine elektronische Patrone, die die Strömung von Voliblut durch eine Kapillare simulieren kann, wurde unter Verwendung eines quarzgesteuerten 32768Hz-Oszillators hergestellt, um zwei 1-16. Frequenzteiler anzutreiben, die die Inputsignale für einen Treiber einer Flüssigkristallanzeigenzelle, die nach dem in Fig. 7 dargelegten elektronischen Diagramm hergestellt wurde, erzeugten. Diese Zelle wurde mit einem in 128 Hz-Intervallen modulierten 2048Hz-Signal vorgespannt Die Zelle drehte daher ihre Polarisation mit einer Frequenz von 128 Hz.
Zwei weitere Teiler treiben eine logische UND-Schaltung, deren Output alle 20 s ein logisches Tief erreichte. An diesem Punkt stellte der Output einer logischen ODER- Schaltung die Teiler zurück, wodurch der Vorgang unterbrochen wurde. Demgemäß wurde das LCD mit Energie versorgt und modulierte ein 20 s-Intervall.
Ein Startschalter war vorgesehen, um das Einstellsignal zu löschen und den Vorgang erneut in Gang zu setzen. Die Oszillatoren, Teiler, logischen Schaltungen und der LCD- Treiber wurden in CMOS-Technologie verarbeitet und durch eine Lithiumknopfbatterie mit Energie versorgt. Die elektronische Patrone hat eine Lebensdauer von mehr als 10.000 Zyklen.

Beispiel 8: Kein-Blut-mehr-Detektor

Die folgende Probenerschöpfungsanzeigevorrichtung wurde auf die in Fig. 8 gezeigte Weise hergestellt. Eine Infrarot-LED wurde in die Obertläche der Analysevorrichtung eingebettet, in die die Kapillarstrompatrone einzuführen war, sodaß ihr Lichtoutput 1 mm vom Kapillareneingang entfernt auf das Blutreservoir auftreffen würde. Die LED wird durch einen Betriebsverstärker mit Energie versorgt, der die Konfiguration eines Rechteckwellengenerators mit etwa 8 kHz hat. Ein infrarotempfindlicher Photodetektor wurde 2 mm von der Verbindungsstelle zwischen Probenreservoir und Kapillarkanal angeordnet. Der Signaloutput des Detektors wurde zu einem Bandpaßfilter mit einem Mittelpunkt bei 8 kHz und einer Bandbreite von 500Hz geschickt und durch einen Verstärker weiter verstärkt. Das verstärkte Signal wurde gleichgerichtet und integriert, wodurch eine zum Streulicht proportionale Gleichstromspannung erzeugt wurde.
Wenn eine Blutprobe in das Reservoir gegeben wird und durch Kapillarwirkung durch die Kapillare in andere Abschnitte der Testpatrone strömt, wird der Lichtweg zwischen der LED und dem Photodetektor unterbrochen, wenn sich das Reservoir leert. Wenn der Spannungsoutput des lntegrators unter 50-30 Milvolt fällt, zeigt der Input dieser Spannung in einen Komparator das Fehlen von Blut im Blutreservoir an.

BEISPIEL 9: Herstellung

Kunststoffpatronen wurden durch Spritzgießen aus Cycolac CTB-Harz (Acrylnitril- Butadien-Styrol-Copolymer) von Borg-Warner Chemicals, Inc. hergestellt. Die Konstruktion des Patronenkapillarkanals und die Gesamtstruktur ist insofern ähnlich der in Fig. 5 gezeigten, als sie ein Probenreservoir, eine erste kurze Kapilare, eine Reagenskammer und eine zweite lange Kapillare enthält. Jedoch unterscheidet sich die Konfiguration der tatsächlichen Kammern und Kapillaren von jener der gezeigten. Die Patrone bestand aus einer Basis mit 0,76 mm (30 mil) und einer Abdeckung mit 0,76 mm (30 mil). Sowohl die Abdeckung als auch die Basis wurden in einem LFE-Modeil Plasmasystem 1002 mit folgenden Einstellungen plasmageätzt: Argondruck 2 torr; Argonstrom 1-3; Vorwärts-RF-Stärke 100; Ätzzeit 20 min. 3 µl Biotrack-Thromboplastin- Reagens wurden dann auf die Basis der ovalen Fläche an der Basis der Patrone aufgetragen und in einer Umgebung, die auf 25ºC und 10% relativer Feuchtigkeit gehalten wurde, 10 min lang trocknen gelassen. Die geätzte Abdeckung wurde dann auf die Basis gelegt und unter Einsatz eines Branson 8400Z-Ultraschall-Schweißgeräts mit folgenden Einstellungen daran festgeschweißt: Abwärtsgeschwindigkeit 3 s; Haltezeit 0,5 s; Schweißenergie 0,5 kJ; und Schweißzeit 0,26-0,30 s.
Nach der Herstellung wurden die Patronen mit Vollblutvergleichen (sowohl anormale als auch normale Gerinnungszeiten) getestet, die in einer gleichzeitig mit vorliegender Anmeldung eingereichten parallelen Anmeldung mit dem Titel "Whole Blood Control Sample" beschrieben werden, wobei der Biotrack Mode Monitor 1000 eingesetzt wurde. Die Prothrombinzeiten wurden aufgezeichnet. Außerdem wurde die Strömungsrate von Blut in einer Patrone ohne Reagens gemessen.
Die Ergebnisse des Tests wurden statistischer Analyse unterzogen. Wenn Wiederholungen vorgenommen wurden, waren das Mittel und der Variationskoeffizient beim normalen Vergleich 12,3 s und 4,9% und beim anormalen Vergleich 20,0 s und 2,9%. Die Strömungsrate von Blut im Kapillarkanal 4 Tage später lag konstant bei 0,06 mm³/s. Diese Ergebnisse sind deutlich besser als bei in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen anderen Herstellungstechniken, einschließlich des in Beispiel 1 beschriebenen Beispiels unter Verwendung eines Bands, das Variationskoeffizienten im Bereich von 10-20% ergab.

Claims

1. Verfahren zur Detektion eines Analyten in einer Blutprobe, welches umfaßt bzw. enthält:

den Einsatz einer Vorrichtung, die einen Kapurweg umfaßt bzw. enthält, der die Antriebskraft zum Bewegen von Blut in die Vorrichtung liefert bzw. vorsieht, worin der Weg ein Reagens enthält, das in Bezug auf den Analyten mit dem Blut interagiert, sodaß eine Änderung in der Fluidität des Blutes verursacht wird, wodurch ein nachweisbares Signal bereitgestellt bzw. vorgesehen wird;

das Einbringen des Blutes in den Kapillarweg;

das Ermöglichen des Durchlaufens des Blutes durch zumindest einen Abschnitt bzw. Teil des Weges und des Reagierens mit dem Reagens; und

das Detektieren einer Änderung in der Fluidität des Blutes als Maß des Vorhandenseins eines Analyten in der Blutprobe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das detektierbare Signal eine Änderung in der Strömungs- bzw. Fließrate bzw. -qualität bzw. -geschwindigkeit bzw. -dauer bzw. Durchflußgeschwindigkeit der Probe ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Änderung in der Strömungs- bzw. Fließrate bzw. -qualität bzw. -geschwindigkeit bzw. -dauer bzw. Durchflußgeschwindigkeit auf das bzw. gemäß dem Unterbrechen des Stroms durch Gerinnung zurückzuführen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das detektierbare Signal die Gerinnung der Blutprobe ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das detektierbare Signal eine Änderung in der Lichttransmission oder -emission ist.

6. System zum Detektieren des Vorhandenseins eines Analyten in Blut, umfassend bzw. enthaltend:

ein Gehäuse, das einen Kapillarweg enthält, der als einzige Antriebsquelle im Weg unabhängig bzw. selbständig Blut in den Weg pumpen kann;

ein innerhalb des Weges enthaltenes Reagens, das das Gerinnen des Blutes verursachen kann, um ein detektierbares Signal in Bezug auf den Analyten bereitzustellen; und

eine Überwachungseinheit, die Mittel zum Halten des Gehäuses, Mittel zum Hindurchschicken von Licht durch den Kapillarweg, Mittel zum Detektieren der Streuung von durch den Weg hinduchgehendem Licht und Mittel zum Analysieren von gestreutem Licht umfaßt bzw. aufweist, um zu ermitteln, wann im Weg Gerinnung auftritt.