DE3853541T2 - Koagulierungstestsysteme unter verwendung paramagnetischer teilchen. - Google Patents

Koagulierungstestsysteme unter verwendung paramagnetischer teilchen.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur erleichterten Durchführung von Koagulationstests, beispielsweise Diagnostiktests (medizinische Diagnose).
  • In diesem Dokument wird der Ausdruck "Koagulationstest" verwendet, um eine Klasse von Testen zu bezeichnen, welche (i) Gerinnungs- oder Gerinnselbildungstests (ii) Gerinnselauflösungstests und (iii) Gerinnungsparametertests einschließen.
  • Blutgerinnungsreaktionen, ausgeführt als klinische Tests, messen im allgemeinen die Zeit, die für die Bildung der Fibringerinnung erforderlich ist. Die meistbekannte dieser Reaktionen ist der Prothrombinzeittest.
  • Es existieren viele Ansätze zum Messen für Gerinnselbildung in Prothrombinzeittests. Sämtliche dieser auf Gerinnselbildung basierende Tests verwenden Thromboplastin, um mit einer Blutprobe des Patienten zu reagieren. Verfügbare Ansätze unterscheiden sich in den verwendeten Vorrichtungen, um zu erfassen, wenn Gerinnselbildung auftritt. Sie können sich ebenso in den verwendeten Gerätetypen unterscheiden und in den Bestandteilen und/oder den Additiven der Reagenzien.
  • Blutgerinnungstests werden hauptsächlich verwendet zum Screenen, zur Diagnose und zum Überwachen von Patienten, welche eine Therapie mit Anti-Koagulanzien erhalten. Es gibt viele Typen von Koagulationstests. Diese schließen ein: Prothrombinzeit (PT), partielle Thromboplastinzeit (PTT), aktivierte, partielle Thromboplastinzeit (APTT), Fibrinogentest, Thrombingerinnungszeit (TCT), aktivierte Gerinnungszeit (ACT) usw. Der Prothrombinzeittest ist der am häufigsten durchgeführte dieser Tests.
  • Eine hauptsächliche Verwendung der Prothrombinzeit (PT) Bestimmungen ist es, Patienten, welche orale Antikoagulanzien wie Beispielsweise Warfarin, erhalten, zu überwachen. Eine genaue Überwachung der Gerinnung in diesen Patienten ist wichtig, um ein wiederkehrendes Gerinnen (Thrombose) zu verhindern und um die Gerinnungsmechanismen hinreichend aktiv zu halten, um eine Spontanblutung zu verhindern. Das Messen der Prothrombinzeit liefert Information, um eine bessere Arzneimittelkontrolle zu erlauben, welche durch die Regulierung der Arzneimitteldosierung erzielt wird.
  • In der herkömmlichen Praxis werden PT-Tests durch die Zugabe eines flüssigen Reagenzes zu einer Plasmaprobe durchgeführt. Die Reagenzien werden typischerweise in trockener Form geliefert und bestehen im wesentlichen aus Gewebsthromboplastin und Calciumchlorid. Das trockene Reagenz wird vor Verwendung durch Zugabe einer abgemessenen Menge an destilliertem Wasser aufgelöst.
  • Diese Reagenzien sind wärmeempfindlich und eine Kühlung vor Verwendung ist erforderlich. Die Lagerfähigkeit der Reagenzien in trockener Form beträgt von 1 bis 2 Jahre. Wenn das Reagenz jedoch aufgelöst worden ist, ist es nennenswert labiler und muß innerhalb von wenigen Stunden verwendet werden oder weggeworfen werden. In manchen Fällen können die aufgelösten Reagenzien einige Tage unter Kühlung aufbewahrt werden.
  • Prothrombinzeittests werden durchgeführt durch Mischen von Probe und Reagenz bei 37 ºC und Überwachen des Fortschreitens der Reaktion bis ein wahrnehmbares Gerinnsel (oder "Gelgerinnsel") erfaßt ist. Die Entwicklung eines Gelgerinnsels ist der Endpunkt dieser Reaktion. Dieser Endpunkt kann durch verschieden Wege erfaßt werden; durch Viskositätsänderung, durch Elektrodenreaktion und meist verbreitet durch photometrische Mittel. Das Testergebnis wird im allgemeinen verglichen mit einem Ergebnis unter Verwendung eines normalen (Kontroll-) Plasmas.
  • Vor der Durchführung des Testes wird eine Blutprobe in einem Röhrchen oder einer Spritze gesammelt, welche ein Antikoagulans (Citrat) enthält. Die Blutprobe wird zentrifugiert und das Plasma (beispielsweise durch Dekantieren) von den roten Blutkörperchen getrennt. Eine abgemessene Menge (gewöhnlich 0,1 ml) des Plasmas wird in das Reaktionsgefäß oder die Küvette pipetiert. Eine abgemessene Menge des Reagenz wird dann manuell mittels einer Pipette oder automatisch mittels eines anderen volumetrischen Abgabesystems, welches in der Lage ist eine bekannte, vorgegebene Reagenzmenge abzumessen, hinzugefügt. Alternativ kann die Probe direkt zu dem Reagenz zugegeben werden.
  • Typischerweise werden 0,2 ml Reagenz verwendet. Die Zugabe des Reagenz löst die Reaktion aus. Existierende Blutgerinnungstests und insbesondere PT-Tests weisen alle wenigstens einen der folgenden Nachteile auf: Schwierigkeit bei der Durchführung, Erfordernis von gut ausgebildeten Personal, Ungenauigkeit bei der Messung, Reagenzinstabilität, großer Reagenzienverbrauch usw.
  • Daher besteht ein starker Bedarf an einem einfachen, leichten und genauen Verfahren zur Durchführung von Blutgerinnungstesten, z. B. zur medizinischen Anwendung. Solch ein Verfahren soll auf einer minimalen Anzahl an Manipulationen sowohl an Probe als auch am Reagenz basieren. Idealerweise sollte ein derartiges Verfahren leicht von Personen ohne extensive klinische Laborausbildung verwendet werden und sollte keine Probe oder reagenzhaltige Lösungsherstellung erfordern. Es sollte nicht die Probleme aufweisen, welche mit der Reagenzinstabilität verbunden sind und sollte sehr genau sein. Es sollte eine wirksame Mischung von Probe und Reagenz erlauben. Es sollte lediglich eine kleine Probenmenge erfordern. Und es sollte in der Lage sein, mit automatischen Behandlungen der Probe durchgeführt zu werden, z. B. sollte es keine Zentrifugation der Blutprobe oder irgendeinem anderen off-line Zelltrennungsprozeß erfordern. Verfügbare Gerinnselauflösungstests und Gerinnungsparametertests leiden gleichermaßen an hervorspringenden Nachteilen.
  • Gerinnungsparametertests werden hierin als Funktions- und Struktur- basierende Teste in dem weitem Gebiet der Gerinnungsdiagnostik bezeichnet, welche nicht Gerinnselbildung oder Gerinnselauflösungsprozesse verwenden, um Endpunkte zu erzeugen. Die meisten dieser Teste verwenden chromogene synthetische Substrate, um Molekularmarker oder spezifische Faktoren oder Komponenten welche mit der Gerinnung im Zusammenhang stehen, zu quantifizieren. Diese sind typischerweise funktionsreaktionsbasierende Teste im Gegensatz zu den meisten Immunassays, welche die selben Moleküle erfassen können, aber Strukturerkennung verwenden und daher noch inhibierte Komponenten oder defektive Komponenten identifizieren können, wobei keines funktionell sein muß. Die vorliegende Erfindung handelt nicht spezifisch von Immunassays, kann jedoch im allgemeinen anwendbar sein auf homogene chromogene und fluorogene Immunassays.
  • Die US-A-3 650 698 offenbart eine Vorrichtung zur Bestimmung der Koagulationsgeschwindigkeit von Flüssigkeiten, welche einen vorrückenden Filmstreifen umfaßt, der Flecke eines reaktionsintensivierenden Mittels, wie beispielsweise magnetische Partikel, umfaßt. Blutplasmaproben werden sukzessive aus den Fleck mit dem intensivierenden Mittel gegeben. Anschließend wird ein Reagenz zugegeben und die Mischung wird rotierenden Magnetfeldern ausgesetzt um das Mischen zu fördern. Die optischen Transmissioneigenschaften der Mischung werden gemessen, um zu bestimmen, wenn die Magnetpartikel in Fibrinsträngen gesammelt sind.
  • Die EP-A-212,314 offenbart eine Kapillarflußvorrichtung welche als eine Dosierpumpe und eine Durchflußkontrolleinrichtung für ein Testmedium wirkt, um eine zeitgesteuerte Reaktion mit einer Reagenz, welches in der Vorrichtung enthalten ist zur Verfügung zu stellen.
  • Die WO 88/07666 kann gemäß Artikel 54(3) EPÜ genannt werden. Sie offenbart ein Verfahren zum Durchführen eines Prothrombinzeittestes unter Verwendung von Magnetpartikeln in Verbindung mit einer Testkomponente.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnungstestes an einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe zur Verfügung, wobei es umfaßt:
  • (i) Zugeben einer zweiten Testkomponente zu einer ersten Testkomponente, wobei die erste Komponente ein trockenes Gerinnungstestreagenz umfaßt, welches kein Prothrombinzeittestreagenz ist, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und magnetische Partikel in inniger Vermischung damit enthaltend, wobei die zweite Komponente Gesamtblut oder Plasma ist, und wobei die erste Komponente (ia) einem oszillierenden Magnetfeld, (ib) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (ic) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld, ausgesetzt wird; und
  • (ii) Überwachung der Bewegung, welche in Magnetpartikeln durch (ia) oder (ib) oder (ic) induziert wird, um die Gerinnungstestmessung zu erhalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Verfügung zum Durchführen eines Gerinnselauflösungstests an einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe welche biochemische Komponenten enthält, die in einer Gerinnselauflösung oder in die Aktivierung oder Inhibierung der Gerinnselauflösung involviert sind, welches die folgenden Schritte umfaßt:
  • (i) Zugeben einer abgemessenen Menge der Probe zu einem Reagenz, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und ein Fibringerinnsel enthaltend mit magnetischen Partikeln in inniger Vermischung hiermit, wobei das Reagenz, welches magnetische Partikel enthält (ia) einen oszillierenden Magnetfeld, (ib) einen sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (ic) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationärem permanenten Magnetfeld, ausgesetzt wird; und
  • (ii) überwachen der Bewegung der Magnetpartikel, welche durch (ia), (ib) oder (ic) induziert wird.
  • Die vorligende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnselauflösungstestes zur Verfügung, welches umfaßt:
  • (i) In-Kontakt-Bringen einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe mit einer trockenen Zusammensetzung, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau, welche wenigstens ein Gesamtblut- oder Plasmagerinnsel herstellendes Reagenz enthält und Magnetpartikel in inniger Vermischung mit der Zusammensetzung, um Gerinnsel enthaltende Magnetpartikel zu erhalten; dann
  • (ii) Zugeben eines Gesamtblut- oder Plasmagerinnselauflösungstestreagenzes zu dem Gerinnsel, wodurch die Gerinnselauflösungstestmessung gestartet wird und optisches Überwachen der Bewegung in den Magnetpartikeln, induziert durch (ia) ein oszillierendes Magnetfeld (ib) ein sich bewegendes permanentes Magnetfeld oder (ic) einer Kombination eines oszillierenden Magnetfeldes und eines stationären, permanenten Magnetfeldes.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnselauflösungstestes zur Verfügung, welches umfaßt:
  • In-Kontakt-Bringen einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe mit einer trockenen Zusammensetzung, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau, enthaltend wenigstens ein Gesamtblut- oder Plasmagerinnsel erzeugendes Reagenz und Magnetpartikel in inniger Vermischung damit, und wobei man einen oszillierenden Magnetfeld, (b) einen sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (c) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld, aussetzt, wobei die Probe oder die trockene Zuammensetzung ein Gerinnselauflösungstestreagenz umfaßt, wodurch die Gerinnselauflösungstestmessung ausgelöst wird und Bilden eines Gerinnsels, welches Magnetpartikel enthält und wobei es nachfolgend erlaubt wird, daß die Auflösung des Gerinnsels durch das Gerinnselauflösungstestreagenz fortschreitet, wodurch die Gerinnselauflösungstestmessung durch Überwachung der Bewegung der Magnetpartikel erhalten wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt noch ein weiteres Verfahren zum Durchführen eines Gerinnselauflösungstestes an einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe zur Verfügung, welche biochemische Komponenten enthält, die in die Blutgerinnselauflösung oder in die Aktivierung oder Inhibierung der Gerinnselauflösung involviert sind, die folgenden Schritte umfassend:
  • In-Kontakt-Bringen einer Geamtblut- oder Plasmaprobe mit einem Fibringerinnsel, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und Magnetpartikel enthaltend in inniger Vermischung damit, wobei das Gerinnsel (a) einem oszillierenden Magnetfeld (b) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (c) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld ausgesetzt wird, wodurch die Gerinnselauflösungstestmessung ausgelöst wird, und Überwachung der Bewegung der Magnetpartikel.
  • Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zum Durchführen eines Koagulationstestes zur Verfügung, welches die folgenden Schritte umfaßt:
  • (i) Man setzt ein Reaktionselement, welches (1) eine Probenvertiefung zurn Aufnehmen einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe und (2) eine Reaktionskammer trägt, welche ein getrocknetes Gerinnungstestreagenz enthält, welches kein Prothrombinzeittestreagenz ist, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Format, und welches Magnetpartikel in inniger Vermischung damit enthält, wobei die Probenvertiefung und die Reaktionskammer in Fluidverbindung durch eine Transportzone einer solchen Geometrie stehen, daß ein Probenvolumen, welches in der Probenvertiefung plaziert wurde, von der Probenvertiefung zu der Reaktionskammer transportiert wird, einem oszillierenden Magnetfeld aus.
  • (ii) Hinzufügen einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe, welche für Gerinnung empfindlich ist zu der Probenvertiefung, wobei das Reagenz aufgelöst wird und die Partikel freigesetzt werden, um sich in einem oszillierenden Muster zu bewegen, welches durch das oszillierende Magnetfeld induziert wird; und
  • (iii) optisches Überwachen der Reaktionskammer, um Kinetiken für den Gerinnungstest zu messen, welche Änderungen in dem Grad der Partikelbewegung relativ zu dem Magnetfeld entsprechen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Element zur Verfügung zum Durchführen eines Gerinnungs- oder Gerinnselauflösungstestes oder eines Testes für Gerinnungsparameter an einer flüssigen Probe zur Verfügung, wobei das Element eine Kanalstruktur darin umfaßt, welche eine Probenvertiefung und ein Reaktionsvolumen in Fluidkommunikation miteinander definiert, wobei das Reaktionsvolumen wenigstens ein trockenes Testreagenz enthält, welches angeordnet ist in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und welches Magnetpartikel in inniger Vermischung damit enthält, und wobei das Reaktionsvolumen definiert wird durch eine obere Oberfläche welche daran angeheftet eine semipermeable Schicht zum Signalisieren des Eingangs der Probe in das Reaktionsvolumen mittels einer Änderung in dessen Reflexionsfähigkeit, wobei die Kanalstruktur eine Geometrie aufweist, welche eine flüssige Probe, wenn in der Probenvertiefung angeordnet, über eine Kapillarwirkung dazu veranlaßt, in das Reaktionsvolumen gezogen zu werden und dieses zu füllen, und wobei die flüssige Probe stationär bleibt, nachdem das Reaktionsvolumen gefüllt wurde.
  • Die vorliegenden Erfindung stellt ferner noch ein trockenenes Gerinnungstestreagenz zur Verfügung, welches Magnetpartikel in inniger Vermischung damit umfaßt, wobei das Reagenz ausgewählt wird aus:
  • (1) Einem partiellen Thromboplastinreagenz und Calciumchlorid;
  • (2) einem Partiellen Thromboplastinreagenz, Calciumchlorid und einem Aktivator;
  • (3) Thrombin oder einem Schlangengift mit thrombotischer Aktivität;
  • (4) einem Fibringerinnsel, oder Plasminogen und einem Fibringerinnsel;
  • (5) einem Plasminogenaktivatortestreagenz, enthaltend (a) Plaminogen und (b) entweder Fibrin, einem Schlangengift mit thrombotischer Aktivität, oder Thrombin;
  • (6) einem Plasminogentestreagenz, enthaltend (a) einen Plaminogenaktivator und (b) entweder Fibrin, ein Schlangengift mit thrombotischer Aktivität, oder Thrombin;
  • (7) einen natürlichen oder synthetischen Plasminogenaktivator; und
  • (B) ein α-2-Antiplasmintestreagenz, enthaltend Fibrin und Plasmin.
  • Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Kit zur Verfügung zum Durchführen eines Koagulationstestes, umfassend einen Permanentmagneten, Zeitmeßmittel und ein Element, welches wenigstens ein trockenes Gerinnungstestmittel enthält, welches kein Prothrombinzeittestreagenz ist, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Format und enthaltend Magnetpartikel in inniger Vermischung damit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein System zum Durchführen einer Koagulationstestmessung zur Verfügung mit:
  • (i) Einem Instrument mit einem Temperaturkontrollmittel, einem Mittel zum Erzeugen eines oszillierenden Magnetfeldes oder zum Bewegen eines permanenten Magnetfeldes, Beleuchtungsmittel und ein photometrisches Überwachungsmittel; und
  • (ii) einem Element zum Durchführen des Koagulationstestes, wobei das Element umfaßt Eine Kanalstruktur, welche eine Probenvertiefung und ein Reaktionsvolumen in Fluidverbindung miteinander definiert, wobei die Kanalstruktur eine Geometrie aufweist, welche eine flüssige Probe, welche in der Probenvertiefung plaziert wird, veranlaßt, in das Reaktionsvolumen über eine Kapillarwirkung gezogen zu werden und dieses aufzufüllen, wobei das Reaktionsvolumen wenigstens ein trockenes Koagulationstestreagenz aufweist, welches kein Prothrombinzeittestreagenz ist, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und welches Magnetpartikel in inniger Vermischung damit enthält.
  • Die vorliegende Erfindung stellt noch ein weiteres System zum Durchführen eines Koagulationstests zur Verfügung mit:
  • (i) einem Reaktionselement welches umfaßt: (1) Eine Probenvertiefung zum Aufnehmen einer flüssigen Probe und (2) eine Reaktionskammer, welche ein trockenes Koagulationstestreagenz enthält, welches kein Prothrombinzeittestreagenz ist, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau, Magnetpartikel in inniger Mischung damit enthaltend;
  • (ii) wobei die Probenvertiefung und die Reaktionskammer in Fluidverbindung durch eine Transportzone von solcher Geometrie stehen, daß ein Volumen der flüssigen Probe, welches in der Probenvertiefung plaziert wird, von der Probenvertiefung zu der Reaktionskammer transportiert wird;
  • (iii) Mittel zur optischen Überwachung der Reaktionskammer; und
  • (iv) Mittel, um die Reaktionskammer einem oszillierenden Magnetfeld auszusetzen;
  • wobei, wenn die Probe in die Reaktionskammer eingeführt wird, das trockene Koagulationstestreagenz aufgelöst wird und die Magnetpartikel dadurch freigesetzt werden, um sich in einem oszillierenden Muster zu bewegen, welches durch das oszillierende Magnetfeld induziert wird, und demzufolge eine Messung der Kinetiken des Gerinnungstestes, welche Änderungen in dem Grad der Magnetpartikelbewegung relativ zu dem oszillierenden Magnetfeld entsprechen, zur Verfügung stellen.
  • Die Gerinnungs- oder Gerinnselauflösungs- oder Gerinnungsparametertestverfahren der vorliegenden Erfindung sind simpel, einfach und genau.
  • Die Koagulationstestverfahren der vorliegenden Erfindung erfordern keine Herstellung einer reagenzenthaltenden Lösung und minimieren Probleme, welche mit Reagenzieninstabilität verbunden sind. Die Verfahren sind hochgenau, reproduzierbar und sehr präzise. Sie erlauben ein wirksames Mischen von Probe und Reagenzien und erfordern lediglich eine kleine Probenmenge.
  • Das Element der vorliegenden Erfindung erlaubt die leichte und genaue Durchführung von diagnostischen Koagulationstests und kann in diagnostischen Koagulationstests verwendet werden, ohne die Herstellung einer Reagenzlösung aus Trockenreagenz zu erfordern. Ein derartiges Element erlaubt die genaue, reproduzierbare und präzise Untersuchung von Proben mit minimaler Pribenmanipulation. Das Element zum Durchführen eines diagnostischen Koagulationstestes erfordert keine Abmessung von Probe oder Reagenz zum Durchführen des Tests und erlaubt einen diagnostischen Koagulationstest mit optimaler Genauigkeit und mit wirksamer Mischung von Probe und Reagenzien. Das Element zum Durchführen eines diagnostischen Koagulationstestes erfordert lediglich eine sehr kleine Probenmenge und ist in der Lage Tests am Gesamtblut durchzuführen ohne die roten Blutkörperchen vom Plasma zu trennen.
  • Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um Gerinnselbildungszeiten, Gerinnselauflösungs (Lyse)-Zeiten und Gerinnungsparameter zu messen. Grundsätzlich umfaßt der durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gesstellte Test die folgenden Schritte. Einer erste, mit Magnetpartikeln beladene Komponente des Tests, wird an einem Reaktionsaufnahmemittel, z. B. eine im wesentlichen flache Oberfläche, einem Reaktionsobjektträger (reaktion slide) oder einer Mikrotiterplatte angeordnet. Die erste Komponente wird dann der Wirkung (1) eines stationären oszillierenden Magnetfeldes oder (2) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (3) einer Kombination aus einem oszillierenden Feld und einem stationären permanenten Magnetfeld, ausgesetzt. Eine zweite Komponente des Tests wird dann zu der ersten Komponente hinzugegeben und die Wirkung des Magnetfeldes/der Magnetfelder oder des sich bewegenden Permanenten auf die Magnetpartikel wird überwacht.
  • In einem seiner Aspekte wird das Verfahren zum Durchführen eines Blutgerinnungstestes verwendet. In dieser Anwendung wird die folgende Schrittabfolge verwendet:
  • (1) Zugeben einer abgemessenen Menge einer flüssigen Probe, die untersucht werden soll, zu einem Reaktionsaufnahmemittel, z. B. einer im wesentlichen flachen Oberfläche, einem Reaktionsobjektträger oder einer Mikrotiterplatte beladen mit einer Kombination von (i) Magnetpartikeln und (ii) wenigstens einem trockenen Reagenz, wobei die Kombination in einem im wesentlichen verteilten oder einem im wesentlichen abgeflachten Format angeordnet wird;
  • (2) Man setzt die Kombination (1) einem oszillierenden Magnetfeld oder (2) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (3) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären Magnetfeld aus; und
  • (3) Überwachen der Bewegung der Magnetpartikel.
  • In einem anderen Aspekt wird das Verfahren verwendet zum Durchführen eines Gerinnselauflösungs-(Lyse)tests. In dieser Anwendung wird die folgende Schrittabfolge verwendet:
  • (1) Zugeben einer Probe mit einer gerinnselauflösenden Komponente zu einem mit Magnetpartikel beladenen Reagenz und angeordnet auf ein Reaktionsaufnahmemittel, z. B. eine im wesentlichen flachen Oberfläche, ein Reaktionsobjektträger oder einer Mikrotiterplatte, wobei man die geronnene Probe (1) einem oszillierenden Magnetfeld oder (2) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (3) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld aussetzt; und
  • (2) Überwachen der Bewegung der Magnetpartikel.
  • Es gibt unterschiedlich Arten, auf welche man den anfänglichen Schritt des Zugebens einer Probe mit einer gerinnselauflösenden Komponente zu einem mit Magnetpartikeln beladenen und oben diskutierten Reagenz durchführen kann. Demzufolge ist es möglich, eine Probe, welche ein gerinnselauflösendes Reagenz enthält, zu einem mit den Magnetpartikeln beladenen Reagenz hinzuzufügen, anstelle des Hinzufügens einer Probe mit einer gerinnselauflösenden Komponente zu einem mit Magnetpartikeln beladenen Reagenz hinzuzufügen. Es ist ebenfalls möglich, eine Probe, welche eine gerinnselauflösende Komponente/Komponenten oder Initiator(en) oder Inhibitor(en) des gerinnselauflösenden Prozesses enthält, zu einem mit Magnetpartikeln beladenen Reagenz hinzuzufügen. Alternativ ist es möglich, eine Probe, welche eine gerinnselauflösende Komponente/Komponenten oder Initiator(en) des gerinnselauflösenden Prozesses enthält, zu einem mit Magnetpartikeln beladenen Reagenz hinzuzufügen, welche zuerst die Gerinnselbildung initiieren und dann erlauben, daß Gerinnselauflösung auftritt.
  • Dieses Verfahren kann vorteilhaft durchgeführt werden in einem neuen Reaktionsobjektträger, der einen Teil dieser Erfindung bildet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen Reaktionsobjektträger zur Verfügung ausgerüstet mit einer Membran für Überwachungstests, welche Farbe entwickeln (d. h. chromogene Tests) oder welche Farbänderungen beinhalten.
  • In einer Durchführung eines derartigen chromogenen Tests, z. B. einem Gerinnungsparametertest umfaßt die vorliegende Erfindung das Zugeben einer Probe zu der Probenvertiefung auf einem Element, welches eine Kanalstruktur, die eine Probenvertiefung und ein Reaktionsvolumen in Verbindung miteinander umfaßt, definiert, wobei das Reaktionsvolumen definiert wird durch eine obere Oberfläche, welche hieran angeheftet eine Membran aufweist, wobei das Element eine abgemessene Menge wenigstens eines Reagenzes in dem Reaktionsvolumen enthält.
  • Ein spezifisches Probenvolumen wird in das Reaktionsvolumen durch Kapillarwirkung gezogen und berührt die Membran und das Reagenz, um eine Reaktion zwischen der Probe und dem Reagenz auszulösen. Die Reaktion wird überwacht durch Überwachen jeglicher Farbänderung in der Membran.
  • Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und viele diese begleitende Vorteile wird sofort erhalten und wird besser verstanden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung, wenn man sie im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet, wobei gleiche Bezugszeichen identische oder entsprechende Teile durch die verschiedenen Ansichten bezeichnen.
  • Fig. 1 verdeutlicht die Kombination von Magnetpartikeln und trockenem Reagenz nach der Zugabe der Probe auf die flache Oberfläche bei einer Vergrößerung von ungefährt 100X wobei Partikel-Cluster gezeigt sind, welche einer Oszillation zwischen Orientierungszuständen unterliegen. Unter dem Einfluß des magnetischen Feldes bilden die Partikel Säulenstrukturen oder Stapel. Obwohl es nicht exakt bekannt ist wie dies geschieht, werden diese Stapel unter dem Lichtmikroskop bei einer Vergrößerung von 100X beobachtet. In den Stapeln sind die einzelnen Partikel zu klein um aufgelöst zu werden. Jeder Stapel glich einem zylindrischen Objekt oder Stiel mit einer unregelmäßigen Oberfläche und einem etwas variablen Durchmesser entlang der Länge des Zylinders. Einige Stiele waren dünner als andere.
  • Fig.2 verdeutlicht die Beziehung zwischen (A) der elektromagnetischen Wellenform, (B) die Orientierung der Kombination von Magnetpartikeln und Trockenreagenz nachdem eine Probe hinzugefügt wird, und (C) das AC-gekoppelte elektrische Signal aus dem Photodetektor, welches die Magnetpartikeloszillation wiedergibt, wenn der Test durchgeführt wird.
  • Fig. 3 verdeutlicht eine Spurbildung, welche durch Überwachung des optischen Signals der Oszillation zwischen Orientierungszuständen der Magnetpartikel erhalten wird.
  • Fig. 4 verdeutlicht eine zeitgedehnte Ansicht der in Fig. 3 oben verdeutlichten Spurbildung.
  • Fig. 5 ist ein längsvertikaler Querschnitt eines Reaktionsobjektträgers zusammen mit einer Vorrichtung zum Verwenden von Magnetpartikeln, um eine Koagulationsreaktion zu messen.
  • Fig. 6 verdeutlicht zwei Ansichten einer im wesentlichen flachen Oberfläche, auf welcher die vorliegenden Tests durchgeführt werden können, zusammen mit magnetfelderzeugenden Mitteln, in einer Anordnung, welche geeignet ist zum Messen einer Koagulationsreaktion.
  • Fig. 7 verdeutlicht zwei Ansichten des Verfahrens zum Bewirken einer Magnetpartikeloszillation, um das Flackerphänomen unter Verwendung einer linearen einfachen Bewegung eines einzelnen Permanentmagneten zu erzeugen.
  • Fig. 8 verdeutlicht das Verfahren zum Bewirken von Magnetpartikeloszillation, um das Flackerphänomen unter Verwendung eines einzelnen Elekromagneten zu erzeugen.
  • Fig. 9 verdeutlicht zwei Ansichten eines Verfahrens zum Bewirken einer Magnetpartikeloszillation, um das Flackerphänomen unter Verwendung einer Orbitalbewegung eines einzelnen Permanentmagneten zu erzeugen.
  • Fig. 10 verdeutlicht eine Spurbildung, welche erhalten wird durch Überwachen des optischen Signals der Oszillation zwischen Orientierungszuständen der Magnetpartikel in einem Gerinnungsauflösungstest und einer Standardkurve, welche beim Durchführen der Messung verwendet wird.
  • Fig. 11 verdeutlicht einen Reaktionsobjektträger mit einer Membran als einen integralen Teil des Reaktionsvolumens, um Speziestrennung vor oder nach einer chemischen Reaktion zu bewirken, um, falls erforderlich, das Enthalten von Reagenzien innerhalb der Membran zu Verfügung zu stellen, und es erlaubt, bequeme Reflexmessungen durchzuführen.
  • Fig. 12 ist eine Schnittansicht des Reaktionsobjektträgers aus Fig. 11, ausgestattet mit einer Membran, wobei verdeutlicht wird, wie eine Reflexmessung durchgeführt werden kann.
  • Fig. 13 ist eine Draufsicht auf eine Abdeckung einer ersten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Reaktionsobjektträgers.
  • Fig. 14 ist eine Draufsicht auf eine Auflage eines Reaktionsobjektträgers gemäß einer ersten Ausführungsform.
  • Fig. 15 ist eine Draufsicht auf die Basis eines Reaktionsobjektträgers gemäß der ersten Ausführungsform.
  • Fig. 16 ist eine perspektivische Explosionsdarstellung der in den Fig. 13 - 15 gezeigten Teile, wobei die Elemente so orientiert sind, wie in dem zuammengebauten Reaktionsobjektträger.
  • Fig. 17 ist eine Draufsicht auf die Elemente der Fig. 13- 15 wenn sie zusammengebaut sind.
  • Die Fig. 18 a, b und c verdeutlichen Aufrißquerschnitte eines Fragmentes eines erfindungsgemäßen Reaktionsobjektträgers, welche eine Modifikation verdeutlichen, in welcher der Reaktionsobjektträger einen Abstandshalter umfaßt, welcher Auflagen einschließt.
  • Fig. 19 ist eine Explosionsansicht einer unterschiedlichen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reaktionsobjektträgers.
  • Fig. 20 ist eine Draufsicht auf die unterschiedliche Ausführungsform der Fig. 19.
  • Die Fig. 21 bzw. 22 sind Aufrißquerschnitte, genommen entlang den Linien XVII-XVII und XVIII-XVIII der Fig. 20.
  • Fig. 23 zeigt einen transversalen Querschnittsaufriß eines Reaktionsobjektträgers, einer Ausführungsform einer Lichtquelle, ebenfalls im Schnitt und einen Lichtdetektor, wobei die Lichtquelle und der Lichtdetektor zum Durchführen einer Lichtstreuungsmessung angeordnet sind.
  • Fig. 24 ist eine Draufsicht auf einen Reaktionsobjektträger, angeordnet in einem Gehäuse zum Durchführen einer Lichtstreuungsmessung, wobei eine Abdeckung des Gehäuses entfernt ist.
  • Fig. 25 ist ein Aufrißquerschnitt genommen entlang der Linie XXI-XXI der Fig. 24, welche ebenfalls die Gehäuseabdeckung zeigt.
  • Fig. 26 verdeutlicht schematisch eine Vorrichtung zum Messen der Prothrombinzeit.
  • Fig. 27 verdeutlicht schematisch einen vertikalen Querschnitt einer Modifikation eines Reaktionsobjektträgers, welcher keine Klebeschichten verwendet, wobei die Abbildung verdeutlicht, daß Licht in diese Ausführungsform eintritt.
  • Fig. 28 verdeutlicht die Verwendung eines Reaktionsobjektträgers (ungeschnitten) externe Wellenleiter und eine Vorrichtung zum Durchführen einer Transmissions/Absorbtionsmessung.
  • Fig. 29 ist eine ähnliche Ansicht wie in Fig. 26, welche gleichzeitige Messungen von Lichtstreuung und Transmission/Absorbtion verdeutlicht.
  • Fig. 30 zeigt einen Reaktionsobjektträger, angeordnet über einer teilweise integrierten Kugel zum Durchführen einer Messung, welche auf Reflexion basiert.
  • Fig. 31 verdeutlicht die Verwendung eines Permanentmagneten auf der Abdeckung des Reaktionsobjektträgers zum Aufbauen von konvektiven Strömungen in dem Reaktionsraum.
  • Fig. 32 verdeutlicht die Verwendung einer Spule für das Aufbauen von konvektiven Strömungen innerhalb des Reaktionsraumes.
  • Fig. 33 verdeutlicht eine Vorrichtung zum Erzeugen lokalisierter Deflektion der Abdeckung, um konvektive Strömungen innerhalb des Reaktionsraumes zu erzeugen.
  • Fig. 34 ist ein transversaler Querschnittaufriß eines Reaktionsobjektträgers, ausgestattet mit einer Membran zum selektiven Speziestransport und Reflexmessung mit magnetischen Partikeln in dem Reaktionsvolumen zum Aufbauen von konvektiven Strömungen wie durch das zur Verfügung gestellte oszillierende Magnetfeld angetrieben.
  • Fig. 36 ist ein Fragment der Fläche des Reaktionsvolumens, welches die das trockene Reagenz enthaltende Schicht zeigt, die an der Basis des Reaktionsobjektträgers gelegen ist.
  • Fig. 37 ist eine Draufsicht auf einen Reaktionsobjektträger vom Parallelflußtyp mit zwei Reaktionsräumen, wobei ebenfalls Lichtquellen und Detektoren gezeigt sind.
  • Fig. 38 ist ein transversaler Querschnittsaufriß, genommen entlang der Linie LXVI-LXVI von Fig. 37; wobei die Fig. 37 und 38 zusammen eine Vorrichtung verdeutlichen, welche verwendet werden kann im Durchführen von zwei unterschiedlichen Testen aus derselben Probe.
  • Die Fig. 39 (a und b) und 40 (a und b) verdeutlichen variierte Zwei-Komponenten-Aufbauten des Reaktionsobjektträgers.
  • Die Fig. 41-46 und 48 liefern erfindungsgemäß erhaltene Daten.
  • Fig. 49 verdeutlicht einen Probenapplikator, welcher mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
    • - Anwendung für Koagulationstest:
  • Eine Ausführungsform eines Verfahrens zur Durchführung eines Koagulationstestes an einer Probe umfaßt:
  • (i) Zugeben einer ersten Komponente, welche erforderlich ist für den Test zu einer zweiten Komponente, welche erforderlich ist für den Test, wobei die zweite Komponente ein Reagenz umfaßt, welches mit Magnetpartikeln beladen ist und wobei die zweite Komponente (1a) einem oszillierenden Magnetfeld oder (1b) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (1c) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld ausgesetzt wird; und
  • (ii) Überwachung der Bewegung, welche in den Magnetpartikeln durch entweder das oszillierende Magnetfeld oder das sich bewegende permanente Magnetfeld oder die Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und dem stationären permanenten Magnetfeld induziert wird, um den Test durchzuführen.
  • Eine andere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Durchführen eines Koagulationstestes, welches umfaßt:
  • (1) Zugeben einer Probe zu einer Probenvertiefung eines Elementes, welches eine Kanalstruktur, die eine Probenvertiefung und ein Reaktionsvolumen in Verbindung miteinander umfaßt, wobei das Reaktionsvolumen definiert wird durch eine obere Oberfläche, welche eine daran angeheftete Membran oder eine Gelschicht aufweist, wobei das Element eine abgemessene Menge wenigstens eines Reagenzes enthält, welches in dem Reaktionsvolumen gelegen ist; wobei ein spezifisches Volumen der Probe in das Reaktionsvolumen durch Kapillarwirkung gezogen wird und die Membran und das Reagenz berührt, um eine Reaktion zwischen der Probe und dem Reagenz auszulösen; und
  • (2) Überwachen der Reaktion.
  • In einer anderen Ausführungsform enthält das Element eine Kombination von wenigstens einem Reagenz und Magnetpartikeln, welche in dem Reaktionsvolumen gelegen sind. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Reagenz für einen Koagulationstest, wie oben definiert, zur Verfügung.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest ein Reagenz für einen Fibringerinnseltest.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest ein Thromboplastincalciumreagenz.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest ein partielles Thromboplastinreagenz mit Calciumchlorid.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest ein partielles Thromboplastinreagenz mit Calciumchlorid und einem Aktivator.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest Thrombin.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest ein Reagenz für ein Lysetest.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest ein Fibringerinnselauflösungstest.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest ein Plasminogenaktivatortestreagenz enthalten Plasminogen und entweder Fibrin oder Thrombin.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest ein Plasmintestreagenz enthaltend entweder Fibrin oder Thrombin.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest ein Plasminogentestreagenz enthaltend einen Plasminogenaktivator und entweder Fibrin oder Thrombin.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz Streptokinase oder Urokinase.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz natürlicher oder synthetischer Gewebsplasminogenaktivator.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Reagenz für einen Koagulationstest ein Alpha-2-Antiplasmintestreagenz enthalten Fibrin und Plasmin.
    • - Anwendung aus Gerinnungstests:
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnungstestes zur Verfügung, umfassend:
  • (1) Zugeben einer abgemessenen Menge einer zu testenden flüssigen Probe zu einer Kombination von (i) Magnetpartikeln und (ii) wenigstens einem trockenen Reagenz, wobei die Kombination an einem Reagenzaufnahmemittel gelegen ist, welche angeordnet ist in einem im wesentlichen verteilten oder einem im wesentlichen abgeflachten Format und welche man (1a) einem oszillierenden Magnetfeld oder (1b) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (1c) einer Kombination eines oszillierenden Magnetfeldes und eines stationären permanenten Magnetfeldes aussetzt; und
  • (2) Überwachung der Bewegung der Magnetpartikel.
  • In einer anderen Ausführungsforin ist das Verfahren ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnungstests in einem Element zum Durchführen des Testes, welches umfaßt:
  • (1) Zugeben einer flüssigen Probe zu dem Element, wobei das Element eine Kanalstruktur umfaßt, welche eine Probenvertiefung und ein Reaktionsvolumen in Verbindung miteinander definiert, wobei die Kanalstruktur eine Geometrie aufweist, welche die in der Probenvertiefung angeordnete flüssige Probe dazu veranlaßt, über eine Kapillarwirkung in das Reaktionsvolumen gezogen zu werden und es aufzufüllen, wobei die flüssige Probe stationär darin verbleibt, nachdem das Reaktionsvolumen von der flüssigen Probe gefüllt wurde, wobei das Reaktionsvolumen beladen ist mit einer Kombination von (i) Magnetpartikeln (ii) wenigstens einem trockenen Reagenz und wobei die Magnetpartikel (1a) einem oszillierende Magnetfeld oder (1b) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (1c) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld ausgesetzt werden; und
  • (2) Überwachen der Bewegung der Magnetpartikel.
  • In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Element ein Mittel zum Kanalisieren von Licht aus einer äußeren Quelle zu dem Reaktionsvolumen.
  • In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Element ein Mittel zum Erfassen von aus dem Reaktionsvolumen gestreuten Licht.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Element angeordnet in dichter Nachbarschaft zu einem Permanentmagneten und einem Elektromagneten, wobei die Bewegung der Magnetpartikel bewirkt wird durch ein oszillierendes Magnetfeld, welches durch einen Elektromagneten erzeugt wird.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das Element in dichter Nachbarschaft zu einem Permanentmagneten und einem Elektromagneten angeordnet, wobei das Element zwischen dem Permanentmagneten und dem Elektromagneten gelegen ist, und wobei die Bewegung der Magnetpartikel bewirkt wird durch ein oszillierendes Magnetfeld, welches durch den Elektromagneten erzeugt wird.
  • In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Probe Gesamtblut.
  • In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Probe Plasma.
  • In einer anderen Ausführungsform werden die Magnetpartikel durch Anlegen eines oszillierenden Magnetfeldes daran zum Oszillieren veranlaßt.
  • In einer anderen Ausführungsform werden die Magnetpartikel durch Anlegen eines sich bewegenden permanenten Magnetfeldes daran zum sich bewegen veranlaßt.
  • In einer anderen Ausführungsform umfaßt das trockene Reagenz Thromboplastincalciumreagenz.
    • - Anwendung auf Gerinnselauflösungstests:
  • Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnselauflösungstestes zur Verfügung, umfassend: In-Kontakt-Bringen einer Patientenblut- oder Plasmaprobe ein Trockenreagenz enthaltend wenigstens ein gerinnselerzeugendes Reagenz und paramagnetische Partikel und optisches Überwachen der Bewegung in den Partikeln, welche durch ein Magnetfeld induziert wird; und Überwachung der Bewegung, um Gerinnungs- und Auflösungsendpunkte an derselben Probe zu bestimmen.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Durchführen eines Testes an biochemischen Komponenten zur Verfügung, welche involviert sind in die Gerinnselauflösung oder in die Aktivierung oder Inhibierung der Gerinnselauflösung. Dieses Verfahren umfaßt:
  • (1) Zugeben einer abgemessenen Probenmenge zu einem Reagenz, welches ein mit Magnetpartikeln beladenes standartisiertes Gerinnsel enthält, wobei das mit den Magnetpartikeln beladene Reagenz auf einer im wesentlichen flachen Oberfläche gelegen ist und (1a) einem oszillierenden Magnetfeld oder (1b) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (1c) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationärem permanten Magnetfeld ausgesetzt wird; und
  • (2) Überwachen der Bewegung der Magnetpartikel.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnselauflösungstestes, welches umfaßt:
  • (1) Zugeben einer abgemessenen Menge eines Gerinnselauflösenden Reagenzes oder einer Probe, enthaltend eine Gerinnselauflösende Komponente zu einer geronnenen Probe, die mit Magnetpartikeln beladen ist, wobei die geronnene Probe, welche mit Magnetpartikeln beladen ist, auf einer im wesentlichen flachen Oberfläche gelegen ist und (1a) einem oszillierenden Magnetfeld oder (1b) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (1c) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationärem permanenten Magnetfeld ausgesetzt wird; und
  • (2) Überwachen der Bewegung der Magnetpartikel.
  • In dieser Ausführungsform kann der Gerinnselauflösungstest als ein Gewebsplasminogenaktivatortest verwendet werden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform kann auf die Probe selbst durch das Reagenz eingewirkt werden, zu welcher es derart gegeben wird, daß die Probe zuerst ein Gerinnsel bildet und später aufgrund von Gerinnselauflösungsinitiatoren, Komponenten und/oder Arzneimitteln, die in der Probe enthalten sind, einer Gerinnselauflösung unterliegt, wobei die Gerinnselbildungs- und Gerinnselauflösungsprozesse beide überwacht werden und davon diagnostische Information abgeleitet wird.
    • - Anwendung auf Gerinnungsparametertests:
  • Die Erfindung stellt ebenfalls ein Element zum Durchführen eines Gerinnungsparametertests zur Verfügung. Das Element umfaßt eine Kanalstruktur darin, welche eine Probenvertiefung und ein Reaktionsvolumen in Verbindung miteinander definiert, wobei das Reaktionsvolumen durch eine obere Oberfläche de iniert wird, welche hieran angeheftet eine semipermeable Schicht aufweist, z. B. eine Membran oder eine Gelschicht, wobei die Kanalstruktur eine Geometrie aufweist, die eine flüssige Probe, welche in derselben Probenvertiefung angeordnet wurde, dazu veranlaßt, in das Reaktionsvolumen über eine Kapillarwirkung gezogen zu werden und es zu füllen, wobei nachdem das Reaktionsvolumen gefüllt wurde, die flüssige Probe stationär darin verbleibt. In einer anderen Ausführungsform ist die semipermeable Schicht ein Mittel zum Überwachen einer Reaktion in dem Reaktionsvolumen.
  • In einer anderen Ausführungsform ist wenigstens ein trokkenes Reagenz innerhalb der semipermeablen Schicht enthalten.
  • In einer anderen Ausführungsform ist wenigstens eine Trockenreagenzschicht auf der Oberfläche der semipermeablen Schicht gelegen, welche nicht an der transparenten Oberfläche befestigt ist.
  • In einer anderen Ausführungsform enthält das Reagenz wenigstens ein Enzym.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die semipermeable Schicht aus einer Mehrzahl von laminierten Membraneinheiten gefertigt, wobei jede Membran wenigstens ein trockenes Reagenz enthält.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls einen Kit zum Durchführen eines Koagulationstestes zur Verfügung, umfassend einen Permanentmagneten, ein Zeitmeßmittel und einen Reaktionsobjektträger, beladen mit wenigstens einem trockenen Reagenz, beladen mit paramagnetischen Partikeln.
  • In einer anderen Ausführungsform umfaßt der Kit eine Transferpipette, welche aus einem im wesentlichen nicht thrombogenen Material hergestellt ist und welche in der Lage ist, eine Blutprobe aus einer Hautpunktionsstelle aufzunehmen und die Probe zu dem Element, welches das trockene Reagenz enthält, zu transferieren.
  • In einer anderen Ausführungsform enthält der Kit eine Pipette zum Sammeln und Transferieren oder Anwenden einer Probe, insbesondere eines einzelnen Probentropfens. Die Pipette, die in Fig. 49 verdeutlicht ist, kann aus einem Polyolefin in Form eines Augentropferapplikators hergestellt sein, um eine Probe von einer Quelle (z. B. einer Fingerpunktionsstelle oder auch ein Reagenzglas) zu der Probenvertiefung eines Keaktionsobjektträgers zu transferieren. Ein bevorzugter Applikator enthält einen Stamm mit einer Kapillarbohrung (802) und einer Birne (800) mit einem Loch (801) darin. Das Loch ist unbedeckt gelassen, wenn über Kapillarwirkung durch die offene Spitze des Stammes zu einer vormarkierten Füllinie (803) oder darüber geführt wird. Das Loch ist bedeckt z. B. mit einem Finger und die Birne wird gequetscht um die Probe auszustoßen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Innere der Kapillare mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt werden.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls ein System zum Durchführen von Blutkoagulationsmessungen zur Verfügung mit einem Instrument, mit Mitteln zur Temperatursteuerung, Mitteln zum Erzeugen eines oszillierenden Magnetfeldes oder eines sich bewegenden permanenten Magnetfeldes, welches in der Lage ist, Magnetpartikelbewegung zu bewirken, einem Beleuchtungsmittel und welches wenigstens ein trockenes Reagenz enthält, das mit paramagnetischen Partikeln beladen ist und in der Lage ist eine Gesamtblut- oder Plasmaprobe aufzunehmen,
  • Mittel zum photometrischen Messen der Magnetpartikelbewegung und Interpretation der Ergebnisse der Magnetpartikelbewegung, um Testbestimmungen durchzuführen und einem Element, welches das Reagenz enthält.
    • Magnetpartikelbewegung:
  • In der vorliegenden Erfindung wird ein Magnetpartikel induziert sich zu bewegen durch Aussetzen entweder (1) einem oszillierenden Magnetfeld oder (2) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (3) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld. Die Bewegung (Oszillation oder Flacker) der Magnetpartikel wird dann überwacht in der Durchführung des Tests.
  • Das oszillierende Magnetfeld wird erzeugt durch ein oszillierendes Magnetfelderzeugungmittel, welches selbst stationär bezüglich des Reagenzaufnahmemittels ist, z. B. eine im wesentlichen flache Oberfläche, auf welcher der Test durchgeführt wird. Wie in Fig. 1 verdeutlicht, bewirken sowohl das oszillierende Magnetfeld als auch das sich bewegende permanente Magnetfeld, daß sich die Magnetpartikel, die auf der flachen Oberfläche 500 gelegen sind, in säulenförmige Aggregate 601 und 602 aggregieren. Diese Aggregate werden durch das oszillierende Magnetfeld dazu veranlaßt, zwischen den Orientierungszuständen 101 und 602 zu wechseln, um zu erzeugen, was dem unbewaffneten Auge eines Beobachters als ein Flackern" oder periodische Fluktuationen zwischen hellem und abgedunkeltem reflektierten oder gestreutem Licht erscheint.
  • Demzufolge aggregieren die Partikel unter der Einwirkung des oszillierenden Magnetfeldes oder des sich bewegenden permanenten Magnetfeldes, wie unter Vergrößerung beobachtet, um Zylinder- oder Säulenformen zu bilden, welche einer ungefähr 90º Änderung in der Orientierung unterliegen, um helles und abgedunkeltes reflektiertes oder gestreutes beobachtbares Licht zu erzeugen.
  • Fig. 8 verdeutlicht die im wesentlichen flache Oberfläche 500, welche mit einer Kombination aus Reagenz und Magnetpartikeln 501 beladen ist und ein Mittel 506 zum Erzeugen eines oszillierenden Magnetfeldes.
  • Wie in Fig. 7 und 9 verdeutlicht, wird das permanente magnetische Feld erzeugt durch ein Erzeugungsmittel für ein permanetes Magnetfeld, welches bewegt wird in einer Richtung parallel zu der Hauptebene der im wesentlichen flachen Oberfläche, Linie 502 in Fig. 7 und Linie 504 in Fig. 9. Dieses sich bewegende permanente Magnetfeld bewirkt ein ähnliches Aggregations- und Bewegungsphänomen bei den Magnetpartikeln, wie es mit dem oszillierenden Magnetfeld beobachtet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in Fig. 6 verdeutlicht, wird eine Kombination eines oszillierenden Magnetfeldes und ein stationäres permanentes Magnetfeld verwendet. In dieser Ausführungsform werden sowohl der Permanentmagnet 503 als auch das Mittel zum Erzeugen des oszillierenden Magnetfeldes bezüglich des Reaktionsaufnahmemittels der im wesentlichen flachen Oberfläche 500, auf welchem der Test durchgeführt wird, stationär gehalten.
  • In einer Gerinnungsreaktion identifiziert die Abnahme der Bewegung der Magnetpartikel den Gerinnungsendpunkt. In einer Gerinnselauflösungsreaktion identifiziert der Beginn der erhöhten Bewegung der Magnetpartikel den Gerinnselauflösungsendpunkt.
    • Die Reaktionsaufnahmemittel:
  • Die Gerinnungs- und Gerinnselauflösungstests der Erfindung werden durchgeführt auf einem Reaktionsaufnahmemittel. Dieses Reaktionsaufnahmemittel kann irgendein Mittel sein, welches die Reagenzien, die in dem Test verwendet werden, tragen und eine Überwachung der Magnetpartikelbewegung erlauben. Derartige Reaktionsaufnahmemittel schließen Mikrotiterplatten ein, ihre Äquivalente, im wesentliche flache Oberflächen oder den unten diskutierten Reaktionsobjektträger, der durch vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird.
    • Die Reagenzien:
  • Die Reagenzien, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden sind jene, welche in den Testen die hierin beschrieben werden verwendet werden. Sie werden unterschieden durch die Tatsache, daß sie in inniger Vermischung Magnetpartikel enthalten. Die Magnetpartikel liegen in einer Menge von 0,5 oder weniger bis 15 Milligramm Magnetpartikel, vorzugsweise 1 bis 10 Milligramm pro Milliliter Trockenreagenz vor.
    • Die Tests: - Gerinnungstests:
  • Einige der Schlüsselelemente, Parameter und Merkmale des vorliegenden Verfahrens zum Durchführen von Gerinnungstesten (d. h. Prothrombinzeit) werden unten diskutiert.
  • Eines der wichtigsten Merkmale der vorliegenden Erfindung ist es, daß sie verwendet: (i) Ein Reaktionsaufnahmemittel, z. B. eine hauptsächlich oder im wesentlichen flache Reaktionsoberfläche und (ii) eine abgeflachte oder dünne Mischung von Reagenz(ien) und Magnetpartikeln. Die Oberfläche der Reagenz- und Magnetpartikelzusammensetzung ist derart aufgebaut, daß die Oberflächenfläche der Reagenz-Probenmischung (oder projizierte Fläche) groß ist im Verhältnis zu Ihrem Volumen.
  • Die mit den trockenen Reagenzien, welche Magnetpartikel enthalten, verbundene Methodologie ist nicht sehr reproduzierbar und daher nicht sehr hilfreich, es sei denn, daß die Probe zu einem trockenen Reagenz zugefügt wird, welches angeordnet ist in einem verteilten oder im wesentlichen abgeflachten Format, eher als in einem kubischen oder sphärischen Volumen. Das verteilte oder abgeflachte Format erleichtert die Auflösung des Reagenzes. Zusätzlich und am wichtigsten stellt das verteilte oder abgeflachte Format eine größere Sichtfläche zur Gerinnselbildung, welche überwacht werden soll, zur Verfügung.
  • Obwohl die Kapillarobjektträgergeometrie derart ist, daß der Reaktionsobjektträger, der in größerem Detail unten, siehe z. B. Fig. 16, in weiteren Einzelheiten beschrieben ist, ideal geeignet ist zum Erzeugen eines geeigneten abgeflachten Formates, dem Unterbringen des Reagenzes und Messen der Probe, wobei der Test perfekt arbeiten wird durch einfaches Hinzufügen der zuvor abgemessenen Probenmenge auf einer festen Oberfläche (z. B. einer Mikrotiterplattenvertiefung oder einer im wesentlichen flachen Oberfläche), welche ein Trockenreagenz enthält, welches paramagnetische Partikel darin inkorporiert aufweist. Demzufolge kann ein aktzeptables Ergebnis erhalten werden ohne einen Reaktionsobjektträger. In diesem Aspekt der Erfindung wird ein einfaches, allgemeines Reaktionsaufnahmemittel verwendet.
  • Es ist wichtig, daß das Trockenreagenz derart hergestellt wird, daß es schnell nach Zugabe der Blut- oder Plasmaprobe aufgelöst werden kann. Gefriertrocknen auf einer Oberfläche oder auch besser, zwischen zwei Oberflächen dicht angeordnet bei einer Kapillare oder ein naher Kapillarabstand arbeitet am besten.
  • Dies erzeugt eine Masse mit niedrigem Materiegehalt, welche eine rasche Probendurchdringung und Auflösung ermöglicht.
  • Obwohl Gefriertrocknen die besten Ergebnisse für die Herstellung eines trockenen auf Paramagnetpartikeln basierenden PT-Reagenzes geliefert hat, können Raumtemperatur, Vakuum, Trocknungsmittel, Konvektion oder andere Trocknungstypen ebenfalls verwendet werden, um gute Ergebnisse zu erhalten. Beispielsweise kann Raumtemperaturlufttrocknung des Reagenzes auf der Basis eines Reaktionsobjektträgers (mit plaziertem Abstandshalter) gefolgt von Anheftung an die Abdeckung ein selbst abmessendes Trockenreagenz enthaltendes Element erzeugen.
  • Das Verhältnis von Probe zu Kombinationsreagenz und Magnetpartikeln, welches verwendet werden kann, um gute Testergebnisse zu erhalten, ist veränderlich. Wenn zu viele Magnetpartikel vorliegen wird die Oberfläche, wo die Reaktion stattfindet sehr dunkel und übervoll werden und es kann schwierig sein, das "Flacker"-Signal zu lesen. Wenn die Partikel zu gering sind, kann das Flackersignal zu schwach sein und das Signal-Rausch-Verhältnis wäre niedrig.
  • In einer typischen Prothrombinzeitreaktion werden 0, 2 Milliliter (200 Mikroliter) an Thromboplastin-Calciumreagenz zu 0,1 Milliliter Plasmaprobe zugegeben. Kleine Veränderung können die Testreproduzierbarkeit beeinträchtigen. Im allgemeinen messen Instrumente, die flüssige Reagenzien handhaben die Koagulation unter Verwendung einer Gesamtmenge von 300 Mikrolitern Reaktionsmischung. Um weniger flüssiges Reagenz oder Probe zu verwenden, kann ein teureres Instrument erfordern, welches in der Lage ist, kleinere Reaktionsvolumina zu überwachen und kann einen Pipettenfehler einführen, der davon abhängt, wie klein es ist.
  • In dem Trockenreagenzreaktionssystem werden ungefähr 25 Mikroliter Thromboplastin-Calciumreagenz, enthaltend paramagnetische Partikel (bei ungefähr 5 bis 50 Milligramm pro Liter Flüssigkeit) lyophilisiert, um ein Trockenreagenz herzustellen. Jedoch können 0,5 bis 5 Milligramm pro Milliliter erfolgreich angewendet werden, um ein gutes Reagenz herzustellen und auch weniger als 0,5 Milligramm pro Milliliter können in dem tatsächlichen Reaktionsobjektträger verwendet werden (siehe unten). Zu diesem Trockenreagenz werden ungefähr 25 Mikroliter Plasma- (oder Gesamtblut-) Probe hinzugefügt, um den Test durchzuführen. Demnach wird das 2:1 Verhältnis von Reagenz zu Plasma ersetzt durch eine 1:1 Proportion von gelösten Stoffen in einem gegebenen Probenvolumen.
  • Die Konzentration des Reagenzes und der Endreaktionsmischung ist auch wichtig. Da das Trockenreagenzsystem eine Auflösung von Reagenz vor der Reaktion mit der flüssigen Probe erfordert, kann das Reagenz nicht zu konzentriert vorliegen, oder es wird nicht vollständig aufgelöst, wenn die Probe hinzugegeben wird. Wenn das Reagenz zu verdünnt ist, können schwache Endpunkte resultieren. Basierend auf den an Thromboplastin aus zwei Quellen erhaltenen Daten, kann jetzt noch keine klar abgegrenzte Regel etabliert werden. Eine Quelle ergab erhöhte PT-Testwerte, wenn die Konzentration erhöht wurde (bis zu zweifach) über die empfohlene Norm und erniedrigte Werte, wenn die Konzentration erniedrigt wurde (bis zu einem Viertel der normalen). Die andere Quelle untersucht über einen schmaleren Bereich (verdünnt bis zu einem Viertel der empfohlenen Norm) zeigt den gegensätzlichen Trend.
  • Die Calciumkomponente des Reagenzes ist besonders wichtig. Bei Abwesenheit von Calcium wird das Reagenz nur gut arbeiten mit Gesamtblut ohne einem Antikoagulans, wie beispielsweise Blut, welches in einer Spritze aus einer Venenpunktionsstelle oder mit einer Lanzette aus einer Fingerstichstelle gesammelt wurde. Bei Vorliegen von Calcium kann ein Gesamtblut, welches in einem Reagenzglas oder in einer Spritze mit Citratantikoagulans gesammelt wurde, getestet werden, wie auch das Plasma, welches aus dem mit Citrat versetzten Blut gewonnen wurde.
  • Bei Abwesenheit von Calcium oder bei sehr niedrigen Calciumkonzentrationen ist die Prothrombinzeit von mit Citrat versetztem Blut oder Plasma signifikant verlängert. Die Blutgerinnung kann vollständig gehemmt sein, wenn nicht ausreichend Calcium vorliegt, um die Effekte des Antikoagulans zu überwinden. Bei Vorliegen von Calciumüberschuß ist die Prothrombinzeit ebenfalls verlängert und ein extremer Überschuß (größer als 25 Millimol/Liter) kann die Wirksamkeit des Testes gefährden. Es gibt jedoch einen Bereich an Calciumkonzentrationen, über welchen der Trockenreagenztest die kürzesten Gerinnungszeiten liefern und wirksam sein wird zum Durchführen von Prothrombinzeitbestimmungen an mit Citrat versetztem Plasma, mit Citrat versetzten Gesamtblut, Gesamtblut, gesammelt aus Venenpunktion oder Antikoagulans und Fingerstichgesamtblut (ohne Antikoagulans). Für dieses Reagenz (Calcium) würde ein Bereich von ungefähr 8 bis 13 Millimol/Liter Calcium liegen. Jedoch können unterschiedliche Thromboplastinreagenzien unterschiedliche Calciumkonzentrationsoptima erfordern. Der Bereich von 8 bis 13 Millimol ist daher lediglich eine allgemeine Richtlinie.
  • Die optimale Calciumkonzentration tritt in der Nachbarschaft von 8 Millimol bis 18 Millimol pro Liter auf, vorzugsweise von 8 Millimol bis 13 Millimol pro Liter und besonders bevorzugt von ungefähr 10 Millimol/Liter. Bei einer Calciumkonzentration von bei oder in der Nähe von 10 Millimol/Liter ändern Änderungen im Calcium aufgrund der Calciumgehaltsunterschiede von Patient zu Patient die Testergebnisse nicht.
  • Das neue Verfahren dieser Erfindung kann vorteilhaft nicht nur bei Prothrombinzeittests angewendet werden, sondern auch bei vielen anderen konventionellen klinischen Koagulationstests, insbesondere jene, welche ein Fibringerinnsel als ein Endpunkt messen.
  • Der grundlegende Reaktionsobjektträger (z. B. der Objektträger wie in Fig. 17 verdeutlicht) oder einfach eine im wesentlichen flache Oberfläche kann erfindungsgemäß mit unterschiedlichen Trockenreagenzien verwendet werden, um eine Reihe von Koagulationstests durchzuführen. Beispielsweise kann das vorliegende Verfahren vorteilhaft verwendet werden mit:
  • 1. Partiellem Thromboplastinreagenz mit Calciumchlorid und Magnetpartikeln, um einen partiellen Thromboplastinzeit-Test (PTT) zur Verfügung zu stellen;
  • 2. partiellem Thromboplastinreagenz mit Calciumchlorid und Aktivator und Magnetpartikel, um einen aktivierten partiellen Thromboplastinzeittest (APTT) zur Verfügung zu stellen;
  • 3. Thrombinreagenz und Magnetpartikeln, um einen Thrombingerinnungszeittest (TCT) zur Verfügung zu stellen; oder
  • 4. mit Konzentrationsänderung von Reagenz und Probe, um einen Fibrinogentest zu Verfügung zu stellen. Viele andere Koagulationsreaktionen sind ebenfalls erfindungsgemäß möglich, z. B. unter Verwendung des Objektträgers, wie in Fig. 17 verdeutlicht.
  • Es gibt einige wenige bekannte Prothrombinzeittests, die Trockenreagenzien verwenden. Es gibt ebenfalls einige wenige Prothrombinzeittests, die Magnetpartikel in dem Reagenz verwenden. Keiner war in der Lage erfolgreich sowohl Trockenreagenzien und Magnetpartikel zu kombinieren, welches nun erstmals mit dieser Erfindung in ihrem Koagulationstestaspekt zu Verfügung gestellt wird.
  • Einfaches Versuchen, die Reagenzien der wenigen verfügbaren Systeme, welche auf Magnetpartikel basieren, zu trocken oder gefrierzutrocknen , wird nicht funktionieren und wird dem Zweck jener Systeme zuwiderlaufen (von denen alle auf der Handhabung flüssiger Komponenten basieren). Hinzufügen von Magnetpartikeln zu den sehr wenigen verfügbaren Trockenreagenzsystemen wird keine zusätzliche Verstärkung liefern, da diese Ansätze keine optischen Eigenschaften der paramagnetischen Partikel messen und nicht einfach daran angepaßt werden können.
    • - Gerinnungsparametertest(s):
  • Eine andere bevorzugte Ausführungsform stellt den Reaktionsobjektträger zur Verfügung, der in den Fig. 11 und 12 verdeutlicht ist, welcher in größeren Detail unten diskutiert wird. Diese Ausführungsform stellt einen Objektträger zur Verfügung, ausgerüstet mit einer semipermeablen Schicht, z. B. einer Membran oder einer Gelschicht, Überwachungsmittel und kann verwendet werden, um einen breiten Bereich anderer Tests durchzuführen. Wie in Fig. 11 verdeutlicht, ist der Reaktionsobjektträger, der gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung zur Verfügung gestellt wird, ausgestattet mit einer semipermeablen Schicht 40, welche innerhalb des Reaktionsvolumens 66 gelegen ist. Diese Schicht ist in der Lage, Flüssigkeit und aufgelöste Spezies aus der Testprobe zu absorbieren. Dies bewirkt Änderungen in der Schicht, welche über Reflexionsmessungen überwacht werden kann, was eine Messung für den Test zur Verfügung stellt.
  • Es gibt hunderte von Möglichkeiten für die Verwendung dieser Ausführungsform. In Beziehung zur Blutkoagulation, Messung der Koagulationsvariablen, welche unterschiedliche synthetische chromogene Substrate verwenden, haben zu vielen neuen Tests geführt. Manche Beispiele sind: Anti-Thrombin III, Heparin, Plasminogen, 2-Antiplasmin und Faktor X. Diese neueren amidolytischen Verfahren sind kommerziell verfügbar in Kits und die Anzahl noch neuerer Tests, die auf diesem synthetischen Substratverfahren basieren, ist immer ansteigend. Manche dieser sind beschrieben, z. B. bei Fareed, et al. Clin. Chem. 29/2 225-236 (1983) und Svendsen, et al. Seminars in Thromboses and Hemostasis, 9/4, 250-262 (1983).
  • Die synthetischen Substrate sind Moleküle welche nach enzymatischer Spaltung p-Nitroanilin freisetzen. Dieses erzeugt eine blaßgelbe Farbe. Ein Absorptionspeak existiert in der Nähe von 405 Nanometer und dies ist, wo die Reaktion typischerweise gemessen wird. Unter Verwendung dieses Verfahrens sind typischerweise ein Spektrophotometer, Halb-Mikroküvetten, eine Zentrifuge, um das Blut zu zentrifugieren und das Plasma abzutrennen, ein Wasserbad bei 37ºC und eine Stoppuhr erforderlich. Für anfängliche Geschwindigkeitsmessungen ist typischerweise ein Photometer mit einem auf 37ºC thermostativierten Küvettengehäuse erforderlich.
  • Unter Verwendung des Reaktionsobjekttträgers in Fig. 11 können synthetische Substrattests durchgeführt werden ohne das Erfordernis vorheriger Plasmaabtrennung. In diesem Fall wird eine geeignete Membran zur Blutzellentrennung zusammen mit einem optischen 400 Nanometer-Filter auf dem Photodetektor (Photodiode) verwendet. Unter Verwendung des chromogenen synthetischen Substrats S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-pNA 2HCl) welches kommerziell erhältlich ist in Kombination mit den Trockenreagenzien, welche folgen, können die folgenden Gesamtbluttests durchsgeführt werden:
  • 1. Gewebsplasminogenaktivator, S-2251 und Puffer für einen Plasminogentest (gesamtverfügbares Plasmin);
  • 2. S-2251 und Puffer für einen freien Plasmintest;
  • 3. Plasmin und S-2251 für einen Alpha-2-Antiplasmintest; und
  • 4. Plasminogen, Fibrinfragmente, S-2251 und Puffer für einen Gewebsplasminogenaktivator(t-PA) Test.
  • Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfordert nicht das Vorliegen von Magnetpartikeln. Diese können jedoch vorteilhaft verwendet werden, z. B. durch Vorlegen im Reaktionsraum 40, wie in Fig. 12 verdeutlicht, wo sie dazu dienen können, das Mischen zu verbessern.
    • - Gerinnselauflösungstest(s):
  • Wie zuvor bemerkt, ist die vorliegende Erfindung ebenfalls nützlich um Tests durchzuführen, welche auf einer Gerinnselauflösung oder einer Gerinnsellyse basieren.
  • Gerinnsellysetesttypen gibt es in einer Reihe von Arten und wurden für eine Reihe von Zwecken verwendet. Eine Variante dieser Tests wird unten beschrieben. Diese Test messen alle nicht dieselben biochemischen Parameter. Viele ergeben Ergebnisse, welche nicht zu Ergebnissen von anderen Verfahren in Beziehung stehen.
  • Euglobulinlysezeit - dieser Test basiert auf der Ansäuerung eines Patientenblutplasmas, um Fibrinogen und fibrinolytisch aktive Komponenten auszufällen. Das Präzipitat wird dann wieder aufgelöst in einem Puffer und geronnen. Die Zeit für die vollständige Lyse oder Auflösung dieses Gerinnsels bei 37ºC wird als Euglobulinlysezeit bezeichnet. Normale Euglobulinlysezeiten betragen zwischen 3 und 4 Stunden, können auf 2 Stunden verkürzt sein bei Patienten mit ausgiebiger Fibrinolyse und auf 30 Minuten bei Patienten mit einem klinisch signifikanten Grad an Hämorrhagie.
  • Verdünntes Blut oder Plasmagerinnselauflösungszeit - diese Verfahren beinhalten das Verdünnen eines Patientenplasmas oder eines Gesamtblutes, gerinnen der Probe mit Thrombin und Beobachten der Probe bei 37ºC auf Gerinnselauflösung. Normale Personen variieren über einen weiten Bereich von 2-24 Stunden oder mehr.
  • Fibrinplattenverfahren - Dieses Verfahren verwendet Plasma oder dessen Euglobulinfraktion als eine Probe. Die Probe wird auf einer Platte angeordnet, welche eine dünne Schicht eines standardisierten Fibringerinnsels enthält. Nach einer Inkubationsdauer von 17 bis 20 Stunden werden Lyseflächen gemessen. Es wird berichtet, daß der Test genau ist und verwendet worden ist, um fibrinolytische Aktivität, Plasmin und Plasminogen zu messen. Der Test dauert zu lange, um sinnvoll beim Überwachen einer thrombolytischen Therapie eingesetzt zu werden.
  • Lyse von markierten Fibrinsubstraten - Diese Tests verwenden eine Markierung mit einem radioaktiven Isotop oder eine Fluoreszenzmarkierung am Fibrin. Wenn Fibrin während des lytischen Prozesses verdaut wird, werden Fragmente freigesetzt, welche quantitativ gemessen werden können. Diese Tests können in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden.
  • Thromboelastographie - Diese Verfahren verwenden unterschiedliche Typen an Geräten, um die Scherelastizität des Gerinnsels zu messen. Diese Verfahren benötigen im allgemeinen viele Stunden, um die Lyseteste durchzuführen.
  • Kaseinolytische Verfahren - Kasein, ein Protein, welches in der Milch gefunden wird, kann als ein Substrat für das Enzym Plasmin dienen. Durch Messung der Kaseinabbaurate unter Verwendung von floureszierenden oder radioaktiven Markierungen kann dieses Verfahren verwendet werden, um auf Plasminogenaktivator oder Plasminogen oder Plasmin zu testen.
  • Die obigen Ansätze werden diskutiert bei H.C. Kwaan in "Disorders of Fibrinolysis, Medical Clinics of North America 1972: 56, 163-176. Keine der obigen Ansätze ist bequem zu verwenden und im allgemeinen sind diese Methoden nicht an Gesamtblutmessungen adaptierbar. Manche sind sehr langsam, viele Stunden erfordernd, um ein Ergebnis zu erhalten. Manche erfordern ein teures Gerät. Diese Ansätze sind im allgemeinen nicht geeignet für Realzeitüberwachungen von Patienten, welche eine thrombolytische Therapie erfahren mit Arzneimitteln wie beispielsweise t-PA, Streptokinase, Urokinase usw.
  • Jüngere Verfahren zum Untersuchen biochemischer Komponenten, welche mit einer Gerinnselauflösung verknüpft sind verwenden Ester von Aminosäuren, welche als Substrate für Plasmin wirken. Diese synthetischen Substrate setzen ein Chromophor oder Fluorophor frei und entwickeln eine Farbe (oder Floureszenz), welche überwacht werden kann, wenn sie durch das Enzym Plasmin gespalten werden.
  • Obwohl die Aminosäureester oder amidolytischen Verfahren und ebenfalls kaseinolytischen Verfahren relativ spezifisch sind, und Substrate für Plasmin involviert sind, bestanden manche Bedenken, ausgedrückt in der wissenschaftlichen Literatur, daß Fibrin das reale Substrat ist und daß daher Testverfahren, welche nicht auf Fibrin basieren, nicht so spezifisch sein werden. Nichtsdestoweniger haben insbesondere amidolytische Verfahren an Akzeptanz gewonnen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Element, welches ausgestattet ist mit einer semipermeablen Schicht zur Verfügung, zum Durchführen von Ganzbluttests zum ersten Mal mit diesen Verfahrenstypen, wodurch die Bequemlichkeit der Verwendung dieser Tests deutlich ansteigt. Andere Tests, welche die Gerinnselauflösung betreffen, schließen die Messung von Fibrinabbauprodukten (FDP) oder Fragmenten ein, welche abgebrochen sind, wenn das Gerinnsel aufgelöst wird. Dieses sind in erster Linie Immunassays. Immunassays können verwendet werden, um andere Faktoren welche ebenfalls die Fibrinolyse betreffen, zu messen. Immunassayergebnisse können jedoch keine exakte Beziehung zu metabolischen oder funktionell aktiven Konzentrationen von analysierten biochemischen Spezies haben; da beschädigte und biochemisch gehemmte Spezies wahrscheinlich noch erfaßt werden.
  • Unterschiedliche Anstrengungen, die Gerinnselauflösungstests zu verbessern schließen eine Apparatur ein, welche die Röhrchen sanft für viele Stunden vor und zurück schüttelt, um Gerinnsel innerhalb dieser Röhrchen sich auflösen zu helfen, wobei das nachfolgende Freisetzen von Flüssigkeit aus dem Gerinnsel erlaubt wird, aufgesammelt in hinreichender Menge, um erfaßt zu werden durch Vervollständigen eines Schaltkreises zwischen zwei elektrischen Kontakten, wodurch ein Endpunkt bei der Vervollständigung der Gerinnselauflösung signalisiert wird (H.J. Wilkins und N. Back, American Journal of Clinical Pathology 66, 124-131 (1976). Ein halbautomatisches Verfahren für Gerinnselauflösungstests unter Verwendung des Auftretens von Luftblasen, welche aus dem Gerinnsel freigesetzt werden, wenn es aufgelöst wird, welches 20 Jahre früher entwickelt wurde, wird immer noch benutzt D. Collen, G. Tytgat und M. Verstraete, American Journal of Clinical Pathology 21, 705-707 (1968). Jüngere Verbesserung schließen die Verfeinerungen bei den Fibrinplattenverfahren ein durch genaues Messen kreisförmiger Flächen von verdauten dünnen Schichten des Fibrins auf den Platten: J. Jespersen und T. Astrup Haemostasis 13: 301-315 (1983).
  • Fibrinolytische Tests wurden kürzlich durchgeführt in Mikrotiterplatten und automatisiert unter Verwendung eines Computers, der kompatibel zu den Mikrotiterplattenlesern ist, welche die optische Dichte messen und erfassen können, wenn das Gerinnsel verdaut wird: D.P.Beebe und D.L.Aronson, Thrombosis Research 47: 123-128 (187). R.H.Carlson, R.L. Garnick, A.J.S. Jones und A.M. Meunier haben kürzlich die Leichtigkeit der Verwendung von Trübemessungen (Absorbtion gegen Zeit) gezeigt, gemacht an einem standardisierten Gerinnsel in einem Mikrozentrifugalanalysator um auf t-PA Konzentration in einem Puffer zu testen: Analytical Biochemistry 168, 428, 435 (1988).
  • Keines der oben beschriebenen verfügbaren Verfahren ist bequem zu verwenden für Healzeitüberwachungen von Gesamtblutproben in Anwendungen wie beispielsweise t-PA-Tests, Plasminogentests usw. Die durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellte Methodologie kann bequem durchführen: Eine rasche Gesamtblutgerinnselauflösung, basierend auf Tests unter Verwendung von Trockenreagenzien, um die spezifischen Gehalte von Substanzen, wie beispielsweise: Plasminogenaktivatoren (t-PA), Streptokinase, Urokinase usw; Plasminogen; Plasmin; Inhibitoren; usw. zu bestimmen.
  • Der Test kann auf unterschiedliche Arten verwendet werden:
  • 1. Verfahren, welche auf exogene Gerinnselauflösung basieren - hier wird ein standardisiertes Gerinnsel, hergestellt aus Fibrin (Fibrinogen-Thrombinreaktion) kombiniert mit paramagnetischen Partikeln in einm Trockenreagenzformat. Das Trockenreagenz kann auch andere Faktoren enthalten, wie beispielsweise eine hohe Konzentration an Plasminogen (für Plasminogenaktivatortests). Die Gesamtblutprobe wird hinzugefügt und die Bewegung der paramagnetischen Partikel wird überwacht wie zuvor beschrieben. Das Freisetzen von Partikeln aus dem Gerinnsel zeigt den Beginn der Lyse an und die Zeit, um diesen Beginn zu erreichen sowie auch die Kinetiken der frühen Stufe der Lyse sind propotional zu der Konzentration des lytischen Faktors der untersucht wird.
  • 2. Verfahren, welche auf endogener Gerinnsellyse basieren - hier werden ein Trockenreagenzobjektträger, enthaltend Thrombin (oder ein thrombinähnliches Schlangengift, wie beispielsweise Atroxin, welches weniger heparinempfindlich ist als Thrombin), paramagnetische Parikel und möglicherweise andere Komponenten verwendet. Eine Probe des Patientenblutes wird hinzugefügt. Dieses Blut bildet ein Gerinnsel aufgrund der Wirkung des Thrombins an das Fibrinogen des Patienten. Der Auflösungstest wird dann ausgeführt an dem eigenen Gerinnsel des Patienten anstelle an einem standardisierten Gerinnsel, wodurch Information über das Fibrin des Patienten erhalten wird; z. B. dessen Empfindlichkeit gegenüber Lyse bei einer bekannten Menge an t-PA.
  • Ein neuer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Magnetpartikeln, welche innerhalb des Gerinnsels gefangen sind. Wenn das Gerinnsel aufgelöst ist, werden mehr Magnetpartikel frei, um einer Bewegung (Oszillation) zu unterliegen und das Flackersignal steigt an.
  • So ist es möglich, Gerinnselauflösungspromotoren zu messen, wie beispielsweise den Gewebsplasminogenaktivator unter Verwendung des Keaktionsobjektträgers und Magnetpartikeln. Wie beispielsweise aus Fig. 10 gesehen werden kann, wird ein Trockenreagenzobjektträger, enthaltend ein vorgebildetes Fibringerinnsel, Plasminogen und Magnetpartikel verwendet, um einen bequemen t-PA-Test in dem Reaktionsobjektträgeraufbau, wie in Fig. 17 verdeutlicht, durchzuführen. Dies kann ebenfalls erreicht werden, jedoch mit denkbar größeren Schwierigkeiten, unter Verwendung derselben Trockenreagenzien und wechselndem Magnetfeld ohne einen Reaktionsobjektträger auf einer Oberfläche oder in einem geeigneten Behälter.
  • In Fig. 10 ist ein Gesamtblut t-PA-Test gezeigt. Der Endpunkt ist der Punkt an welchem das Flackersignal über einen Schwellwert anzusteigen beginnt oder eine bestimmte Steigungsänderung. Die Gesamtzeit (Startpunkt bis Endpunkt) steht in umgekehrten Verhältnis zur Konzentration des t-PA und ist hochreproduzierbar. Derselbe Test kann verwendet werden, um andere Plasminogenaktivatoren zu quantifizieren unter Verwendung von geeigneten Standartkurven zur Kalibrierung.
  • Ein ähnlicher Ansatz kann bei anderen Testen verwendet werden, beispielsweise um Plasminogen oder gesamtverfügbares Plasmin zu erfassen, unter Verwendung einer Gesamtblutprobe. Im Falle der Plasminbestimmung werden ein Objektträger, enthaltend Magnetpartikel, und ein vorgebildetes Fibiringerinnsel verwendet. Zur Plasminbestimmung ist ebenfalls ein Plasminogenaktivator als ein Reagenz notwendig.
    • Magnetpartikel:
  • Materialen welche diamagnetisch sind, erfahren keine Anziehung zu einem Magneten und können abgestoßen werden. Paramagnetismus ist eine Eigenschaft, welche einer Substanz verliehen wird durch das Vorliegen von ungepaarten Elektronen in einem Atom oder Molekül, welches das Atom oder Molekül als ein Ganzes veranlaßt, als ein Magnet zu wirken. Diese mikroskopische Magneten ordnen sich selbst mit und werden in Richtung des Feldes gezogen, wenn sie in einem Magnetfeld angeordnet werden. Ferromagnetische Materialien sind paramagnetische Substanzen, welche "Domänen" bilden, die eine sehr große Anzahl an paramagnetischen Atomen enthalten, die in die selbe Richtung ausgerichtet sind. Die Größe der Wechselwirkung von ferromagnetischen Materialien mit einem Magnetfeld ist viel größer als für andere paramagnetische Materialien. Elementares Eisen, Nickel und Cobalt sind ferromagnetische Materialien. In den Beschreibungen, die in dieser Patentanmeldung verwendet werden, sind die Ausdrücke magnetisch und paramagnetisch austauschbar verwendet und schließen die ferromagnetischen Materialien ein.
  • In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist es wichtig, daß ein geeigneter paramagnetischer Partikel verwendet wird. Geeignetheit ist eine Kombination von Inertheit, magnetischen Eigenschaften und Größe. Es ist wichtig, daß die Partikel inert sind und die Reaktion nicht beeinflussen oder beeinträchtigen.
  • Um die Wichtigkeit der magnetischen Eigenschaften zu verdeutlichen, ist Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;) stärker magnetisch als Fe&sub2;O&sub3; und macht eine geeignetere Kombination von Trockenreagenz und Magnetpartikeln. Magnetische Latexpartikel (z. B. von Seradyn, usw.) können ebenfalls verwendet werden, jedoch sind diese weniger stark magnetisch und machen ein schlechteres Reagenz für Gesamtbluttests.
  • Die Größe der Magnetpartikel ist ebenfalls wichtig. Die Partikel sollten im allgemeinen kleiner als 5 Mikron im Durchmesser aufweisen. Kleine Partikel (kleiner als 1 Micron) tendieren dazu besser zu arbeiten als große Partikel. Beispielsweise arbeiten Partikel mit einem Durchmesser von 0,7 Mikron gut. Die Partikel sollten sich nicht leicht absetzen und dicht an der kolloidalen Größe liegen, um beste Ergebnisse zu erhalten. Kleine Größen machen es leichter für Partikel in der Reagenzmischung dispergiert zu werden, sich in dem Magnetfeld zu bewegen und während der Reaktion überwacht zu werden. Zusammenfassung der Magnetpartikeldaten Bezugs-No. Magnet Partikel Partikelgröße Größenbestimmungsverfahren Anmerkungen Fe (Metall) Ni (Metall) Magnetische Latexkugeln Eisenoxide (Durchschnitt) (micron oder weniger typisch) kleiner als Durchmesser Stabförmige Partikel Länge Breite Fisher (mesh Größe) Elektronenmikroskopie Laserlichtstreuung Arbeitet sehr gut Schwieriger zu verwenden setzt sich schnell ab Arbeitet weniger gut als Fe&sub3;O&sub4; Ergibt sehr großes Signal Mag nicht die beste Wahl für "schwache" Gerinnsel und Gerinnselerfassung sein Dichter als Fe&sub3;O&sub4; Setzt sich schnell ab. Sehr dicht. Einiges Partikelrauschen. Nicht so gut wie Ni. Arbeitet jedoch nicht so gut wie Fe&sub3;O&sub4; -- Könnte möglicherweise ausgezeichnet arbeiten, wenn optimiert. Arbeitet gut.
  • Obwohl es auf den ersten Blick erscheinen mag, daß Partikel, welche kleiner als die Lichtwellenlänge sind, nicht arbeiten werden, da derartige Partikel nicht erfaßbar erscheinen führt der geeignete Typ des angelegten Magnetfeldes sogar mit sehr kleinen Partikeln zu Aggregaten, welche leicht sichtbar gemacht werden. Beispielsweise arbeiten Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,3 Mikron (nach dem Fisher-Verfahren) gut, wenn mit Licht aus einer Infrarot-LED mit einer Gipfelemission bei 875 Nanometer (0,875 Mikron) beleuchtet wird. Die Konzentration der paramagnetischen Partikel sollte typischerweise in einem Bereich von ungefähr 5-50 Milligramm/Milliliter des Thromboplastincalciumreagenzes (oder eines anderen Reagenzes) liegen, welches zum Herstellen einer Trockenreagenzmischung verwendet wird, wobei dieses Reagenz in ausreichender Konzentration vorliegt um für das Koagulationstesten verwendet zu werden, bevor die paramagnetischen Partikel hinzugefügt werden.
  • Eisen(II, III)-Oxid (Fe&sub3;O&sub4;) arbeitet gut in dem PT-Reagenz. Nickel(Ni)-Partikel arbeiten nahezu so gut wie Fe&sub3;O&sub4;. Eisen(III)-Oxid (Fe&sub2;O&sub3;) arbeitet ebenfalls. Eisenpartikel (Fe) sind zu stark magnetisch und arbeiten beim Erfassen von schwachen Endpunkten nicht so gut wie Fe&sub3;O&sub4;. Manche magnetischen (paramagnetischen oder superparamagnetischen) Partikel, welche in der beschriebenen neuen Erfindung und für die beschriebenen Anwendungen verwendet werden können und arbeiten werden, sind tatsächlich verwendet worden für einen völlig unterschiedlichen Zweck. Beispielsweise werden die magnetischen Latexkugeln im allgemeinen in Agglutinationstests verwendet, welche typischerweise Antigen-Antikörperreaktionen involvieren. Die anderen Magnetpartikel (Referenz Nr.9) sind jene, welche verwendet werden zum Trennen in Antigen-Antikörperreaktionen.
  • Die Eisen(II,III)-Oxid Partikelgröße, welches das beste Trockenreagenz macht, wird durch den Hersteller unter Verwednung des Fisher-Verfahrens charakterisiert, um durchschnittliche Partikelgrößen zu bestimmen. Nach diesem Verfahren beträgt die durchschnittliche Größe 0,3 Mikron. Nachdem die Partikel in Thromboplastin- (oder Thromboplastin- Calcium)lösung suspendiert worden ist, wird es den schwereren Partikeln erlaubt, sich abzusetzen und lediglich die leichtere Fraktion wird verwendet, um das Trockenreagenz herzustellen. Es wird daher erwartet, daß die mittlere Partikelgröße kleiner als 0,3 Mikron ist.
  • Obwohl es einen nennenswerten Konzentrationsbereich gibt, über welchen die Partikel verwendet werden können, um ein Trockenreagenz zu formulieren, werden die oben beschriebenen Partikel üblichertweise zu der Thromboplastinlösung zu 25 Milligramm/Milliliter zugegeben. Nach dem Entfernen der leichteren Fraktion verbleiben ungefähr 80% des Gesamtvolumens der Partikel zurück und ungefähr 20% des Gesamtvolumens der Partikel gelangen in das Trockenreagenz. Daher glaubt man, das ungefähr 5 Milligramm an Fe&sub3;O&sub4;/Milliliter in dem tatsächlichen Trockenreagenz verwendet werden. In dem Trockenreagenz kann ein Bereich von 0,5 bis 50 Milligramm/Milliliter oder sogar niedriger als 0,5 verwendet werden.
  • Vorsichtige mikroskopische und Mikrometermessungen der endgetrockneten (gefriergetrockneten) Reagenzien ergeben, daß das Reagenz auf dem Reaktionsobjektträger als eine Beschichtung auf oberen und unteren horizontalen Oberflächen (Abdeckung und Basis) existieren. Mit einer Polyesterabdeckung, einer Polyesterbasis und einem 0,007 Inch dicken Abstandshalter ist das Trockenreagenz, welches die untere Oberfläche (Basis) beschichtet, im allgemeinen weniger als 0,0015 Inch dick und kann bis zu 0,0001 dünn verwendet werden.
  • Das Trockenreagenz, welches die obere Oberfläche (Abdeckung) beschichtet, liegt im Bereich von ungefähr 0,0005 Inch bis 0,0001 Inch oder sogar darunter. Es ist möglich, eine Beschichtung auf der oberen Oberfläche herzustellen, welche unter Verwendung dieser Technik nicht meßbar ist.
  • Häufig erscheinen im wesentlichen sämtliche der Eisenoxidpartikel in dem Reagenz an der unteren Oberfläche. Die Partikel liegen in Clustern wie Unebenheiten oder Berge (oder niedrige Stalagmiten oder Stalagtiten) vor, wenn sie in dem Reagenz erscheinen. Andererseits bildet das Reagenz einen relativ einheitlichen Film, welcher wachsartig erscheint, wenn er abgekratzt wird, sich jedoch sofort nach Zugabe von Wasser oder auch hoher Feuchtigkeit auflöst. Die Filmdickeabmessungen schließen den additiven Beitrag von Stalagmiten oder Stalagtiten ein.
  • Es ist wichtig, daß eine relativ flache Oberfläche für die einer Analyse unterliegende Reagenz-Probenmischung verwendet wird. Eine flache Oberfläche verteilt die Mischung so, daß sie leicht gesehen werden kann und so, das das Partikelflackerphänomen vorteilhaft ausgenutzt werden kann.
  • Eine sanfte Vertiefung oder Senke kann vorteilhaft verwendet werden, um das Trockenreagenz zu lokalisieren und die Probe festzuhalten. In jedem Fall muß die Probe jedoch genau und präzise für die besten Ergebnisse abgemessen oder pipetiert werden. (Eine Parallelplattenanordnung mit Kapillarraum, aufgebaut, um die Probe selbst abzumessen, d.h. ein Reaktionsobjektträger, ist besonders wünschenswert, jedoch nicht essentiell).
  • Wenn das Oberflächenreflexverhalten hoch ist, kann die Untergrundreflexion größer sein als für eine weniger reflektierende Oberfläche. Jede Oberfläche wird arbeiten, aber die Niedrigreflexoberfläche wird besser sein, wenn die Signale schwach sind.
  • Eine Vorbehandlung der Oberfläche mit einem geeigneten oberflächenaktiven Mittel vor der Zugabe des Reagenzes kann erwünscht sein, um das Reagenz durch Verringern des Kontaktwinkels mit der Oberfläche auszubreiten. Oberflächeaktive Mittel (d.h. Tenside oder Detergenzien) sind andererseits nicht notwendig. Wenn eine Parallelplattenanordnung als ein reagenzenthaltendes Element vor dem Trocknen verwendet werden soll, wird das Flüssigreagenz schneller fließen nach einer Oberflächenvorbehandlung mit 0,1% Triton X-100 in destilliertem Wasser.
  • Es ist wichtig eine große Fläche des Reaktionsvolumens zu sehenl um die sehr genauen Ergebnisse zu erhalten, welche durch die Erfindung zur Verfügung gestellt werden. Wenn eine sehr kleine Fläche des abgeflachten Reaktionsvolumens betrachtet wird, sind die Ergebnisse nicht sehr reproduzierbar.
  • Die Ergebnisse sind nicht sehr reproduzierbar, beispielsweise, wenn nur 5 bis 10 mm² einer 100 mm² projizierten Gesamtoberfläche des abgeflachten Reaktionsvolumens übewacht werden. Wenn ein großer repräsentativer Teil der Reaktion betrachtet wird, z. B. 20-50% der gesamten projizierten Flächel sind die Ergebnisse sehr reproduzierbar. Der Bereich für die gesamte projizierte Fläche ist nicht speziell untersucht worden. Es wird angenommen, daß die Größe der projizierten Fläche in Beziehung zu dem Volumen der Reaktionsmischung wichtiger ist als die tatsächlichen Abmessungen und Größe der projizierten Fläche selbst.
  • Die projizierte Fläche könnte sehr klein sein, wenn das Reaktionsvolumen klein ist, aber würde letztlich beschränkt werden durch Leichtigkeit der Betrachtung und weniger zu betrachtende Gesamtpartikel. Wenn die projizierte Fläche sehr groß ist, könnte es schwierig sein die Reaktion gleichzeitig über der ganzen Fläche zu starten. Das Betrachten einer großen Fläche ist am besten, weil die Daten, welche durch beob-¹dies wird berechnet für einen Reaktionsobjektträger enthaltend 25 Mikroliter Reaktionsmischung und mit einer sichtbaren Reaktionsfläche (projizierte Fläche) von ungefähr 100 Quadratmillimetern.
  • achten des Flackermusters erhalten werden zeigen, daß die Bildung von polymerisiertem Fibrin kaum gleichförmig über die Fläche und exakt dieselbe Zeit stattfindet.
  • Die Ergebnisse sind im allgemeinen am besten, wenn diese Sichtfläche innerhalb der projizierten Fläche des Reaktionsvolumens zentriert ist. Die endgültige Sichtfläche dient dazu die gesamte projizierte Fläche des Reaktionsvolumens zu betrachten. Das betrachten der gesamten projizierten Fläche kann marginal bessere Ergebnisse ergeben als Betrachten der zentralen 40-50% der Gesamtfläche. Um sich mit der Zeit ändernde Orientierungsänderungen in den paramagnetischen Partikel zu erzeugen, welche als oszillierende helle und dunkle Flächen erscheinen ist ein sich bewegendes Magnetfeld erforderlich. Die Feldlinienorientierung sollte zwischen senkrecht zu der Ebene des abgeflachten Reaktionsvolumens und einem kleinen Winkel (oder parallel) zu jener Ebene schwingen (cycle). Dieser Winkel kann jeglicher Winkel zwischen 0º und 90º sein, da die Partikelorientierungsextrema das maximale Signal ergeben. Theoretisch könnten 80º und 85º verwendet werden, jedoch würde das Signal klein sein.
  • Das Ziel des Verwendens dieses sich bewegenden Magnetfeldes ist es, die Partikel senkrecht zu der festen Trägeroberfläche und alternativ flach gegen die Oberfläche in einem vollen Kreislauf der Partikelorientierungsänderung zu bewegen. Die erste Orientierung erscheint heller, wenn sie von oben betrachtet wird, die letztere Orientierung erscheint dunkler. Die Oszillations- oder alternierende Lichtintensität fällt ab, wenn sich das Gerinnsel zu bilden beginnt, vermutlich aufgrund eines Einschlusses von manchen der Partikel in dem Fibrinpolymer, welches sich aus der Koagulationsreaktion (Polymerisation von Fibrinogen) gebildet hat.
  • Die Feldstärke sollte groß genug sein, um beobachtbare Orientierungsänderung in den Partikeln zu erzielen, auch wenn Gesamtblutproben verwendet werden und um zu erlauben, daß Koagulationsendpunkte erfaßt werden. Das Vorliegen von Gesamtblut macht es schwieriger ein gutes optisches Signal aus der Partikelbewegung zu erhalten.
  • Die magnetische Flußdichte, um das Flackerphänomen zu erhalten, sollte nicht sehr viel weniger als ungefähr 5 Gauss für Plasma und ungefähr 10 Gauss für Gesamtblut betragen und ist sehr wirksam bei 20 bis 600 Gauss und kann auch größer sein. Demzufolge können magnetische Flußdichten von 5 bis 600 Gauss und darüber verwendet werden.
  • Ausgezeichnete Tests wurden erhalten mit der Anordnung, die in Fig. 5 gezeigt ist, wobei magnetische Flußdichte-Peaks bei +20 Gauss und -20 Gauss ungefähr alle 0,003 Inches in wiederholenden Intervallen innerhalb des Reaktionsvolumens durch den Vorspannmagneten erzeugt wurden. Die elektromagnetische Flußdichte lag im Bereich von +60 zu einem Gipfel von +90 Gauss im zentralen Teil des Reaktionsvolumens, das oberhalb des Zentrums des elektromagnetischen Kernes gelegen war, wenn Strom eingeschaltet wurde. Ein anderer Elektromagnet gab ebenfalls ausgezeichnete Testergebnisse mit demselben Vorspannmagneten. Dieser Elektromagnet erzeugte Flußdichtewerte von +100 bis zu einem Gipfel von +120 bis +130 Gauss.
  • Die Frequenz der Änderung der Magnetfeldorientierung ist wichtig. Wenn die Frequenz weniger als 0,25 Hertz beträgt, wird die Endpunktgenauigkeit schwach sein, da ein Endpunkt nur in den nächsten 2 Sekunden gelesen werden könnte. Wenn die Frequenz höher ist als ungefähr 4 Hertz, wird die Sensitivität bei der Endpunkterfassung niedriger und demzufolge könnte die Genauigkeit ebenfalls schwach sein. Eine Frequenz von ungefähr 1 Hertz ist ein guter Kompromiß. Es erlaubt ein Intervall von 0,5 Sekunden zwischen Signalgipfeln und ist verbunden mit guter Präzision.
  • Eine Rotation der Feldrichtung in der Ebene des abgeflachten Reaktionsvolumens, wie es beispielsweise erhalten werden könnte durch Rotieren eines Permanentmagneten neben (oder oberhalb) der Oberfläche, auf welcher das Reaktionsvolumen ruht, wird keine hochreproduzierbaren Endpunkte mit dem verwendeten Trockenreagenzsystem ergeben. Der Rotations- oder Drehmagnetansatz wie beispielsweise verwendet von Adler (U.S. 3,650,698 und U.S. Re. 27,866) erzeugt whirlpoolartige Effekte mit paramagnetischen Partikeln welche die Partikeldichte zum Zentrum bewegen. Der "Whirlpool" beendet sämtliche oder einen Teil ihrer Bewegung zum Zeitpunkt der Gerinnselbildung. Diese Wirkung ist nicht gut geeignet für Festphasenreagenzien und weist Probleme auf mit der Reproduzierbarkeit, wenn sie mit unseren Trockenreagenzien verwendet wird. Wiederholte Versuche um Endpunkte mit Trockenreagenzien zu erhalten, führten zu schwacher Endpunktreproduzierbarkeit, unter Verwendung der rotierenden Magnetverfahren. Zusätzlich würde manchmal ein Endpunkt erhalten, wie angezeigt durch ein plötzliches Klumpen der Partikel, der Klumpen würde jedoch in dem rotierenden Magnetfeld eine Erfassung noch ungenauer machen.
  • Das zeitlich variierende Magnetfeld kann auf einer Reihe von Wegen erhalten werden. Wenn beispielsweise ein Reaktionsvolumen auf einer Oberfläche angeordnet wird, sind die folgenden Aufbauten möglich:
  • A. Ein Permanentmagnetpol(oder -pole) oder ein mit Energie versorgter Elektromagnet, gelegen unter- oder oberhalb der Oberfläche mit seinen Feldlinien durch die Oberfläche hindurchtretend, wird zurück und vorwärts entlang einer geraden Linie parallel der Oberfläche bewegt. Nach Zugabe einer flüssigen Probe wird dann die Mischung aus Trockenreagenz und Magnetpartikel beobachtet, um mit jedem Durchgang des Magneten zu "flackern". Bei Abwesenheit einer flüssigen Probe werden die Magnetpartikel nicht frei, um sich innerhalb des Trockenreagenzes zu bewegen und es wird im wesentlichen kein Flackersignal beobachtet. Dies ist in Fig. 7 verdeutlicht. Die Fig. 7a und b stellen Ansichten von im wesentlichen flachen Reaktionsoberflächen 500 zur Verfügung, welche beladen sind mit einer Kombination aus Reagenz und Magnetpartikeln 501. Ein Permanentmagnet 503 wird in Richtung 502 verschoben.
  • B. Ein Elektromagnet, vorzugsweise mit einem elektromagnetischem Kern, ist angeordnet unterhalb (oder oberhalb) der Oberfläche so daß, wenn mit Energie versorgt, der Magnet Feldlinien erzeugt, welche durch die Oberfläche hindurchtreten. Wenn der Magnet ein und ausgeschaltet wird, wird beobachtet, daß die Mischung aus Trockenreagenz und Magnetpartikeln (mit zugegebener Probe) flackert. Dieser Ansatz, wie in Fig. 8 gezeigt, ist jedoch weniger dramatisch und erzeugt daher ein niedrigeres Signalniveau als derselbe vor und zurück auf einer geraden Linie bewegte Magnet.
  • C. Ein Permanent oder Elektromagnet, angeordnet unter- oder oberhalb der Oberfläche, wobei siene Feldlinien durch die Oberfläche hindurchtreten, eliptischen oder ähnlicher sich wiederholenden Bahn bewegt. Dies bewirkt, daß sich ein flackerndes Muster ergibt. Dies ist in Fig. 9 verdeutlicht. Die Fig. 9a und b verdeutlichen die Bewegung 504 des Permanentmagneten 503 im Bezug auf die im wesentlichen flache Oberfläche 500.
  • D. Ein flacher dünner Vorspannmagnet (z. B. Permanentstreifen oder Bandmagnet mit mehrfachen Polen, angeordnet in einem sich wiederholenden Streifenmuster entlang der Oberfläche des Magneten) wird direkt unterhalb der Oberfläche angeordnet und ein Elektromagnet, der unterhalb angeordnet ist wird zyklisch mit Energie versorgt. Die ist in Fig. 5 gezeigt. Das Trockenreagenz löst sich einfach auf, wenn Probe hinzugefügt wird und setzt die Magnetpartikel frei. Die Magnetpartikel orientieren sich selbst in mikroskopischen Clustern oder Stapel wie in den Fällen A, B, C, E und F. Die Partikel orientieren sich selbst entlang den Feldlinien des Vorspannmagneten (flach gegen die Oberfläche) und stehen senkrecht auf der Oberfläche (oder in einem steilen Winkel), wenn der Elektromagnet mit Energie versorgt wird. Dies erzeugt ein charakteristische Flackermuster, welches in gewisser Weise unterschiedlich ist von dem welches in A, B oder C erzeugt wird, in sofern, als die Partikel dazu tendieren, sich entlang der Feldlinien des Vorspannmagneten zusätzlich zum Flackern zu konzentrieren.
  • E. Ein permanenter Vorspannmagnet (flach, zylindrisch oder andere geometrische flache Form) ist angeordnet unterhalb der Oberfläche, wo die Magnetpartikel gelegen sind, und ein Elektromagnet mit Polen, welche sich einander gegenüberliegen, so daß die Feldlinien parallel zu der Oberfläche mit den Magnetpartikeln (wenn der Magnet mit Energie versorgt ist) und senkrecht zu der Richtung der Feldlinien, welche aus dem Permanentmagneten hervortreten, verlaufen. Dies ist in Fig. 6 gezeigt. Die Fig. 6a und b verdeutlichen einen stationären Permanentmagneten 503, angeordnet in der Nachbarschaft der im wesentlichen flachen Oberfläche 500 und oszllierende Magnetfeldmittel 505.
  • F. Das dramatischste Flackern wird erhalten in A und C. B, D und E erfordern keine beweglichen Teile und von den dreien ist B am wenigsten wirksam. Andere Kombinationen der Magneten und Geometrien können verwendet werden, solange wie die zugrundeliegenden Prinzipien der Orientierung, um ein Flackermuster zu erzeugen, befolgt werden. Beispielsweise kann ein Permanentmagnetpol nach oben und unter entlang einer vertikalen Linie bewegt werden, wobei an der Spitze seiner Trajektorie sich der Magnetpol in naher Nachbarschaft mit dem Boden der Oberfläche auf welche die Reaktionsmischung gelegen ist befindet. An dem Grund seiner Trajektorie wird er weit genug bewegt, daß seine Magnetfeldlinien nicht länger durch die Oberfläche queren, um Partikelbewegung zu bewirken.
    • Partikelbewegungsüberwachung:
  • Eine Lichtquelle kann verwendet werden, um die Bewegung der Magnetpartikel zu überwachen. Diese Lichtquelle sollte genügend Helligkeit aufweisen, um ein gutes optisches Signal zu erzeugen; ein reflektiertes und/oder gestreutes Lichtsignal. Visuelle Betrachtung in einem gut beleuchteten Raum oder in einem sonnenbeleuchteten Raum ist zufriedenstellend jedoch nicht geeignet für ein automatisches System. Die Wellenlänge ist nicht so kritisch, solange sie von den paramagnetischen Partikeln reflektiert oder gestreut wird, oberhalb und unterhalb der Untergrundstreuung.
  • Eine ultrahelle LED, wie beispielsweise eine Hewlett- Packard HLMP-3750 Galliumarsenidphosphid auf Galliumphosphid- LED welche eine Peakwellenlänge von 635 Nanometern emittiert arbeitet gut. Eine sogar bessere Wahl ist eine Infrarot-LED, wie beispielsweise eine TRW OP 290A Galliumaluminiumarsenid- LED, welche eine Peakwellenlänge von 875 Nanometern aussendet.
  • Die Lichtquelle sollte vernünftigerweise stabil sein, sie im DC oder pulsierenden Modus betrieben wird. Stabilität ist notwendig, so daß Messungen von "hellen" und "dunklen" Peaksignalen während der Partikelorientierungszyklen genau durchgeführt werden könnnen, wobei ein Abfall des Peak-zu-Peak Abstandes als ein Ergebnis des Beginns der Gerinnung sofort unterscheidbar ist.
  • Es ist ebenfalls wichtig, daß das Licht unter einem geeigneten Winkel gemessen wird. Wenn die Oberfläche auf welcher die Reaktionmischung angeordnet ist, transparent ist, ist es möglich, den Flackereffekt durch Transmission durch die Reaktionsmischung zu messen. In diesem Fall wären Lichtquelle und -detektor in einer Sichtlinienkonfiguration angeordnet und die Reaktionsmischung wäre zwischen ihnen gelegen. Dieser Ansatz läßt jedoch nicht viel Raum für Magneten oder oder eine Temperatursteuervorrichtung.
  • Eine praktischere Anordnung ist es den Flackereffekt durch Reflexion oder Streuung von Licht aus der Reaktionsmischung, wie in Fig. 5 verdeutlicht, zu messen. In dieser Anordnung wird die Lichtquelle verwendet, um die Reaktionsmischung zu beleuchten und einen Einfallwinkel (von der Normalen der Oberfläche) zu erzeugen, welcher unterschiedlich ist zu dem Winkel, unter welchem der Detektor die Reaktionsmischung sieht. Dies ist um Spiegelung zu vermeiden, welche beim Reflexionswinkel auftritt (gleich dem Neigungswinkel). Ein typisches Arbeitsschema ist es den Detektor oberhalb der Reaktionsmischung anzuordnen und die Reaktionsmischung mit Licht zu beleuchten, welches von einem Winkel von ungefähr 45º zu der Normalen projiziert wird.
  • Die Lichtintensität aus einer angenäherten Punktquelle fällt ab mit dem Quadrat der Entfernung. Eine herkömmliche lichtaussendende Diode erzeugt einen Lichtkegel. Der intensivste Bereich dieses Kegels ist erwünscht zum Beleuchten der Reaktionsmischung. Dieser intensive "Kegel innerhalb eines Kegels" sollte idealerweise weder mehr noch weniger als das gesamte Reaktionsvolumen beleuchten. Das Bewegen der LED weiter weg von dem Reaktionvolumen wird dazu führen, daß der Kegel sich ausbreitet und die durchschnittliche Lichtintensität bei dem Reaktionsvolumen reduziert wird. Bewegt man die LED näher wird sich der Kegel konzentrieren und Lichtintensität in der Peripherie des Reaktionsvolumens reduzieren, wodurch sich das verfügbare Signal aus diesem Bereich erniedrigt.
  • Zum Überwachen des Flackerphänomens, welches durch das Reagenz erzeugt wird, ergibt die Verwendung eines Signales aus dem Photodetektor, welcher AC-gekoppelt an einen Verstärker ist, im Gegensatz zu einem DC-gekoppelten, die besten Ergebnisse. Von dem AC-gekoppelten verstärktem Signal bestimmt der Zeitpunkt, zu welchem eine große Änderung auftritt die Zeit des Eintretens der Probe in den Reagenz enthaltenden Bereich und dies identifiziert die Zeit zu welcher der Test begonnen hat. Vor diesem Ereignis variiert das Magnetfeld bei einer vorgegebenen Frequenz (z. B. 1 oder 2 Hz).
  • Nach der Signalinitiierung für den Test ist das nächste Signal, welches beobachtet wird eine Oszillation aufgrund des Flackerphänomens. Dieses AC-gekoppelte Signal startet von klein und wächst dann innerhalb weniger Sekunden zu einer Höhe, welche annähernd konstant bleibt oder nur langsam anschließend anwächst, jedoch nicht abnimmt, bis sich ein Gerinnsel zu bilden beginnt. Siehe Fig. 3.
  • Die Abnahme des Signals wird dann verwendet um den Endpunkt oder den Zeitpunkt der Gerinnselbildung zu bestimmen. Die Stärke des AC-Signals wird typischerweise gemessen durch Aufnehmen von Ablesungen sofort nachdem ein Peak aufgetreten ist (z. B. ein positiver Peak). Diese Differenz zwischen jedem Peak (positiv oder negativ) und dem nächsten Peak wird dann bestimmt. Fig. 4 zeigt eine zeitgedehnte Ansicht davon.
  • Diese Differenzwerte werden dann überwacht, um zu sehen wann die Differenzwerte abzufallen beginnen. Dies entspricht dem Beginn der Gerinnung. Was sich als nächstes ereignet ist ein rascherer Abfall der Differenzwerte weil sich das Gerinnsel vollständiger bildet.
  • Es werden Schwellwertkriterien an das Signal angelegt um den Startpunkt und Endpunkt für den Test zu bestimmen. Um den Startpunkt zu bestimmen ist ein Signalniveau erforderlich, welches größer ist als jenes, welches erzeugt werden würde durch Vibration oder durch Änderung in Umgebungsraumbeleuchtung. Änderung in dem Umgebungslicht, obwohl praktisch isoliert von dem photometrischen Detektor, können einen kleinen Effekt aufgrund von Undichtigkeit durch Nähte, Säume oder Öffnungen in der Vorrichtung haben. Die Startpunktschwelle wird oberhalb dieses Untergrundniveaus gesetzt, wo es noch ein sehr merkliches Signal aufgrund der Probeneintrittslichtstreuung und Absorbtion (Refelxion) gibt.
  • Um den Endpunkt zu bestimmen, ist ein Abfall der Peak-zu- Peak-Höhe von zwischen 2 und 20 Prozent, welche für wenigstens 10 Sekunden und vorzugsweise 15 bis 30 Sekunden andauert, modifiziert. Wenn z. B. ein Abfall in der Peakhöhe von 8 Prozent mit einer Zeitdauer von 15 Sekunden ausgewählt wird, dann bestimmt ein Erfüllen dieser beiden Kriterien, daß der letzte Peak, der dem Abfall unmittelbar vorausgeht der nächstidentifizierbare Zeitpunkt des Beginns der Gerinnselbildung ist. Dies bedeutet, wenn während eines 15 Sekunden Intervalls die Peakhöhe um 8% verringert wird und nicht wiederum während dieses Intervalls anwächst, daß ein Endpunkt erreicht wurde.
  • Auswählen einer Schwelle von 2% oder 5% würde ein sensitiveres Kriterium als 15 oder 10% zum Erfassen von schwachen Endpunkten darstellen. Ähnlich wäre das Setzen eines Fensters von 30 Sekunden ein sensitiveres Kriterium als 10 Sekunden. Beispielsweise könnten Peakhöhen, welche mit einem sehr schwachen Gerinnsel verknüpft sind, keine 8% in 10 Sekunden fallen, aber könnten in 15 Sekunden abfallen.
  • Skalierungsfaktoren werden ebenfalls benötigt, um die beobachteten Trockenchemieprothrombinzeiten in jene zu übersetzen, welche den typischerweise in klinischen Laboratorien erhaltenen Werten entsprechen, welche Flüssigreagenzien verwenden. Z. B. kann eine normale Prothrombinzeit von 12 Sekunden unter Verwendung von Flüssigreagenzien mit dem Trockenreagenzsystem als 24 Sekunden beobachtet werden. Eine abnormale Prothrombinzeit von 25 Sekunden mit Flüssigreagenzien kann als 50 Sekunden mit dem Trockenreagenzsystem beobachtet werden.
  • Demzufolge wird ein Skalierungsfaktor oder eine Geradengleichung, welche beiden Testtypen entspricht verwendet, um das Trockenchemieergebnis so auszudrücken, wie es in den heutigen Laboratorien, welche Flüssigreagenzien verwenden üblich ist. Es kann mehr als ein Skalierungsfaktor notwendig sein. Obwohl mit Citrat versetztes Plasma- und mit Citrat versetzte Gesamtblutskalierungsfaktoren (oder Geradengleichungen) beobachtet wurden im wesentlichen identisch zu sein für eine gegebene Reagenzcharge, ist der Skalierungsfaktor im Blut ohne ein Antikoagulans typischerweise unterschiedlich. Es ist daher wichtig, die Probe zu identifizieren und dann den geeigneten Skalierungsfaktor auszuwählen.
  • Der Skalierungsfaktor wird erhalten durch Vergleich von PT Ergebnissen unter Verwendung des Probentyps (für welchen der Faktor entwickelt werden muß) aufgetragen gegen die Ergebnisse derselben Blutproben, welche als Plasmaproben auf einem konventionellen Analyzer gefahren wurden. Die Gleichung oder Tabelle, welche die beiden Wertereihen vergleicht, wird dann erhalten und als ein Skalierungsfaktor verwendet. Dies war bislang kein Problem, weil existierende Testtechniken keine mehrfachen Probenoptionen anboten. Die Skalierungsfaktorauswahl kann automatisch sein, wenn sämtliche Skalierungsfaktorinformation kodiert ist auf dem Reagenz enthaltenden Element und anschließend in den Gerätespeicher übertragen wird.
  • Eine Siliciumphotodiode ist ein idealer Photodetektor zum Überwachen der Reaktion in dieser Anwendung. Sie hat eine schnelle Ansprechzeit und gute Spektralempfindlichkeit bei längeren sichtbaren und Infrarotwellenlängen, wo helle, kostengünstige und hochzuverlässige Lichtquellen (LEDs) Peakemissionen aufweisen. Eine Photodiode hat ebenfalls eine proportionale elektrische Antwort zum erfaßten Licht. Die Photodiode sollte vom Umgebungslicht isoliert sein. Dies kann erreicht werden durch physikalische Isolierung, oder durch die Verwendung eines Filters (z. B. um sämtliche Strahlung mit Ausnahme der infraroten bei derselben Wellenlänge wie die Peakeminissionen der LED auszufiltern) oder durch eine Kombination beider Ansätze.
  • Der Detektor kann derart angeordnet werden, daß er der Oberfläche gegenüberliegt auf welcher die Reagenz-Probenmischung gelegen ist. Das Halbleiterdetektorelement wird gewöhnlich das meiste Licht einfangen, wenn es parallel zu der Ebene dieser beleuchteten Oberfläche positioniert ist. Es ist wichtig, daß der Detektor unter einem solchen Winkel angeordnet ist, daß Spiegelung, reflektiert durch die Reagenz-Probenmischung (oder eher wahrscheinlich der Oberfläche oder einer transparenten Abdeckung z. B. eines Reaktionsobjektträgers) von der Quelle nicht auf die Detektoroberfläche auftrifft. Diese Spiegelung wird das Rauschen erhöhen. Je näher das Photodetektorelement zu der Oberfläche, welches die Reaktionsmischung enthält angeordnet ist, desto mehr Licht wird eingefangen werden und desto höher ist das Signal-Rausch-Verhältnis.
  • Der Photodetektor kann so nahe an dem Objektträger angeordnet werden, wie es praktisch ist, ohne daß Streulicht aus der Quelle Artefakte erzeugt. Dies kann so dicht wie 0,2 Inch oder möglicherweise weniger sein. Der Photodetektor kann weiter zurück bewegt werden (zu einem Inch oder mehr von der Oberfläche) aber letztlich wird das Signal anfangen nennenswert abzufallen aufgrund der umgekehrten Quadratgesetzabschwächung. Analog ist je größer das photoaktive Element des Detektors ist, desto größer ist das eingefangene Licht und desto größer ist das Signal vor Verstärkung. Eine Hammamatsu S2386-8K Photodiode arbeitet gut für diese Anwendung, jedoch können viele andere ähnliche Detektoren verwendet werden.
  • a. Schwelle für den Reaktionsstart: Der Startpunkt des PT-Tests wird genommen, so daß er mit dem Eingang der flüssigen Probe in das Volumen oder Bereich, welcher im Trockenreagenz belegt ist, zusammenfällt. In der derzeitigen optischen Signalerfassungsschaltung wird eine Photodiode (Hammamatsu S2386-8K) verwendet. Ein Photodiodenverstärker liefert eine Verstärkung von 499 000. Ein AC-gekoppelter Verstärker liefert eine Verstärkung von 10. Ein Verstärker mit auswählbarer Verstärkung liefert eine Verstärkung von 1 bis 128. Das Aufbringen einer Probe (oder Startzeit) wird erfaßt durch Suchen nach einer absoluten Änderung des AC-gekoppelten Signales (16-fach verstärkt) von mehr als 3,9% des Maximums (5 Volt) oder größer als (oder gleich) 0,195 Volt.
  • b. Etablieren des Flackerphänomens: Zu einer fixierten Zeit nachdem die Probe erfaßt ist und der Test gestartet ist, wählt die Software die geeignete AC-gekoppelte Signalverstärkung aus. Diese Verstärkung setzt das größte erlaubte Signal, welches anschließend nicht genügend anwachsen kann, um den Verstärker zu sättigen. Es ist aus experimentellen Daten bekannt, daß der Flackereffekt für alle PT-Signale wenigstens 50% der maximalen Signalgröße nach ungefähr 7 Sekunden erreicht hat.
  • c. Flackersignal und Endpunkt Fig. 2 zeigt ein voll etabliertes Flackersignal. In diesem Beispiel wird ein Permanentmagnet verwendet als ein Vorspanner, um maximal horizontale Partikelorientierung zu erreichen. Ein Elektromagnet wird ein und ausgeschaltet, um maximale vertikale Orientierung zu erreichen. Beide Magneten sind in diesem Beispiel unterhalb der Oberfläche angeordnet, auf welcher die Partikel gelegen sind. Das obere Signal (A) entspricht dem Rechteckwellentreiberstrom zu dem Magneten. Das erste Rechteckwellenplateau ist für den eingeschalteten Strom. Das mittlere Signal (B) ist eine Serie aus Schnappschußansichten, genommen von unterhalb der Partikel (tatsächlich Cluster oder Aggregate der Partikel). Der erste ist mit dem mit Energie versorgten Elekromagneten und zeigt maximale vertikale Orientierung. Der zweite ist mit dem nicht mit Energie versorgten E1ektromagneten und zeigt maximale horizontale Orientierung und so weiter. Der Drehpunkt für jeden mikroskopischen "Stapel" von Partikel ist an der Basis oder unteren Oberfläche. Die Partikelstapel, wie unter dem Mikrokop bei 100-facher Vergrößerung gesehen, erscheinen an diese Oberfläche "angewurzelt" und schwanken hin und her mit der Magnetfeldlinienorientierungsänderung. Dies führt zu alternierdem (hellem und dunklem) reflektiertem oder gestreutem Licht, welches einen "Flacker-"Effekt erzeugt.
  • Sowie die Polymerisation des Fibrins fortschreitet, erscheint die Bewegung der Partikelstapel beschränkt in so fern als sie die maximalen vertikalen und/oder horizontalen Positionen nicht länger voll erreichen. Das Flackern ist somit weniger betont. Dies signalisiert den Beginn der Gerinnselbildung.
  • Während dieses Zustandes, wenn mikroskopisch betrachtet wird, erscheinen die Partikel bald angeheftet oder geklebt an eine kaum sichtbare, kaum wahrnehmbare raumfüllende Substanz. Wenn die Stapel sich nun bewegen, erscheint es als bewege sich die Substanz mit ihnen. Einige der Stapel sind verzerrt oder gekrümmt (wie gekrümmte oder gebogene Bäume) und schwanken in abnehmenden Extremen der Orientierung sowie der Gerinnungsprozeß fortschreitet. Die Partikel sind in diesem Zustand definitiv in dem Gerinnsel eingeschlossen und können offensichtlich nicht entfernt werden ohne das Gerinnsel zu zerstören.
  • Das untere Signal (C) ist das AC-gekoppelte optische Signal, welches sich aus dem Partikelflackerphänomen ergibt. Der Abfall in der Peak-zu-Peak Entfernung signalisiert den Beginn der Gerinnselbildung.
  • d. Zusätzliche Information welche aus dem Signal verfügbar ist: Durch Verschieben der Schwelle für die Gerinnselerfassung können "schwächere" Gerinnsel von "stärkeren" Gerinnseln unterschieden werden. Schwächere Gerinnsel zeigen graduellere Peak-zu-Peak Abfälle in Signalstärke als starke Gerinnsel. Das Kontrollplasmaniveau III von Orthodiagnostics, Inc. zeigt z. B. konsistent schwächere Gerinnsel als Pacific Haemostasis, Inc. Kotrollplasma, Niveau III. Die physikalisch-chemische, biochemische oder klinische Signifikanz von Unterschieden in der Gerinnselstärke ist derzeit nicht bekannt. Die Fähigkeit zwischen unterschiedlichen Typen (oder Stärken) von Gerinnseln zu unterscheiden kann diagnostischen Wert haben.
  • Die "Stärke" des Gerinnsels kann tatsächlich ein Maß für die Masse des Gerinnsels oder Gesamtprotein, welches in seine Bildung verwickelt ist, sein. Wenn die Fibrinogenkonzentration signifikant in einer Probe gesenkt wird, welche auf Prothrombinzeit getestet wird, kann der sich ergebende PT-Wert unverändert sein oder leicht erhöht vom normalen sein, jedoch wird der Effekt der Gerinnsel"stärke" rascher beobachtet. Dieser Effekt kann quantifiziert werden durch Messen der Peak-zu-Peak Amplitude (A) direkt vor Beginn des Endpunktes und Peak-zu-Peak Amplitude (B) eine gegebene Zeit nach dem Endpunktbeginn. Je größer das Verhältnis (A-B/A) desto "stärker" oder massiver ist das Gerinnsel.
  • e. Automatische Eingabe von Skalierungsfaktoren: Das Umwandeln der sich ergebenden Testwerte, welche mit dem Trockenreagenz erhalten werden, in Werte, welche Laborergebnisse mit Flüssigreagenzien entsprechen, wird erhalten unter Verwendung eines Skalierungsfaktors oder Umrechnungsfaktors. Dieser Faktor wird zuerst entwickelt durch Auftragen der Trockenreagenzwerte gegen die klinischen Laborwerte für dieselben Proben, über den klinischen Bereich der PT-Werte. Eine Gleichung (z. B. in der Form einer Geraden: y=mx+b) kann jetzt verwendet werden, um jedes Trockenchemieergebnis in den erwartenden Laborwert umzuwandeln. Vier Vorteile ergeben sich: 1) Eine Gleichung kann aufgestellt werden für jeden unterschiedlichen Probentyp, d. h. eine Probe, genommen ohne Antikoagulans oder eine Probe erhalten mit Citratkoagulans. 2) Die Gleichungen können möglicherweise fein eingestellt werden, um die Entsprechung der Trockenchemieergebnisse in eine besondere naßchemische Thromboplastinreagenz/Instrumentenkombination zu erlauben. Das kann ein wichtiger Vorteil werden, da es erlauben könnte, daß dezentralisierte Testergebnisse streng einem besonderen Referenzverfahren entweder innerhalb eines Krankenhauses oder innerhalb einer geographischen Region entsprechen. Standardisierung war ein existierendes Problem für PT-Messungen. 3) Die Skalierungsfaktorgleichungen können geliefert werden zusammen mit dem Reagenzobjektträgern und automatisch zu dem Mikroprozessor des Instrumentes geführt werden, um die erwünschten Ergebnisse zu erreichen. Die Information kann magnetisch oder optisch kodiert werden. 4) Mögliche Unterschiede zwischen Reagenzchargen können automatisch kompensiert werden.
  • Eine typische Skalierungsfaktorgleichung kann wie folgt aussehen:
  • y=0,4x+6
  • wobei: y gleich PT angepaßt an Laborwerte ist
  • x gleich tatsächliches Trockenreagenz PT
  • Der Koagulationstest der Erfindung kann vorteilhaft durchgeführt werden in einem Reaktionsobjektträger mit einer Kanalstruktur, welche eine Probenvertiefung und ein Reaktionsvolumen in Verbindung miteinander definiert. Wenn man diesen Reaktionsobjektträger verwendet, wird das Reaktionsvolumen mit einer abgemessen Menge aus einer Kombination von Magnetpartikel und (ii) wenigstens einem Trockenreagenz beladen. Die Kanalstruktur besitzt eine Geometrie, welche eine flüssige Probe, welche in der Probenvertiefung plaziert wird dazu veranlaßt, in das Reaktionsvolumen über ein Kapillarwirkung gezogen zu werden und es aufzufüllen, wobei nachdem das Reaktionsvolumen gefüllt ist, die flüssige Probe stationär bleibt. Dieses Element ist voll beschrieben in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/033,817, eingereicht am 03. April 1987, auf welche hiermit vollinhaltllich Bezug genommen wird.
  • Im Aufbau dieses Elementes ist der Reaktionsobjektträger hergestellt aus einer Basis, einer Auflage und einer Abdeckung. Die Basis umfaßt eine Hauptoberfläche. Die Auflage ist auf der Basis gelegen. Die Abdeckung ist auf der Auflage gelegen, gegenüber der Basis. Die Auflage umfaßt die Kanalstruktur, welche eine Probenvertiefung und einen Reaktionsraum in Verbindung miteinander definiert. Die Abdeckung umfaßt ein Mittel zum Hinzufügen einer Probe welche analysiert werden soll zu einer Probenvertiefung. Der Test wird durchgeführt durch Überwachen einer Reaktion der Probe in dem Reaktionsvolumen, wobei die Probe als ein Ganzes während im wesentlichen des ganzen Testes stationär ist.
  • In Fig. 13 ist eine Draufsicht auf eine Abdeckung 10 einer ersten Ausführungsform eines Reaktionsobjektträgers gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt. In Fig. 14 ist eine Draufsicht auf eine Auflage 20 der ersten Ausführungsform gezeigt. In Fig. 15 ist eine Draufsicht auf eine Basis 30 der ersten Ausführungsform gezeigt. Fig. 60 ist eine Explosionsansicht, welche die relativen Positionen der Abdeckung 10 der Auflage 20 und der Basis 30 zeigt. Obwohl Fig. 16 den Reaktionsobjektträger als einen Dreikomponentenaufbau zeigt, sind Aufbauten, welche weniger Komponenten erfodern, möglich.
  • Anstelle eines Dreikomponentenaufbaus, wo das Reaktionsvolumen aus Material gebildet ist, welches entfernt ist aus der zweiten oder mittleren Komponente vor dem Zusammenbau, kann eine Zweikomponentenstruktur verwendet werden. Im Falle eines Zweikomponentenstrukturaufbaus, wäre das Reaktionsvolumen gebildet durch Walzprägen der oberen, unteren oder beider Komponenten.² Die Komponenten können dann verbunden werden unter Verwendung eines druckempfindlichen Klebers, der an ausgewählten Bereichen eines oder beider der Komponenten aufgebracht wird, durch Ultraschallschweißen oder andere Typen ² Als eine Alternative zum Walzprägen,welches ein Druckformungsprozeß ist, können Wärmeformtechniken verwendet werden, um die vertieften oder erhabenen Bereiche der Basis oder des Abdeckungsmateriales zu erzeugen.
  • von Wärmeversiegelungsprozessen, unter Verwendung von Lösungsmittelbondierung, oder durch die Verwendung von Spezialklebern (z. B. UV-härtbaren Flüssigkleber), usw.
  • In den Fig. 39a und 39b sind zwei mögliche walzgeprägte Abdeckungsversionen verdeutlicht. In 39a sind die Probenvertiefung 403, Leitung, Reaktionsvolumen 402 und Luftöffnungsbereiche 401 eingeschlossen in dem walzgeprägten erhabenen Bereich der Abdeckung 404. Nach dem Walzprägen der Abdeckung werden das Probenvertiefungsloch und das Luftschlitzloch ausgestanzt oder auf andere Weise erzeugt. Kleber kann jetzt aufgebracht werden auf die ursprüngliche Bodenoberfläche der Abdeckung (aber nicht auf das Dach des Hohlraums), so daß die Abdeckung mit der Basis verbunden werden kann. Alternativ, wie in Fig. 39b gezeigt, kann die Abdeckung einen walzgeprägten Bereich aufweisen, welcher die Probenvertiefung und Luftöffnung ausschließt. In diesem Fall können die Probenvertiefungs- und Luftschlitzlöcher anschließend erzeugt werden, jedoch vorzugsweise vor dem Walzprägen. Kleber kann aufgebracht werden auf die ursprüngliche Bodenoberfläche der Abdeckung wie im vorherigen Fall, um die Abdeckung und die Basis zu verbinden, um den Reaktionsobjektträger herzustellen. Zusätzlich zu den in Fig. 39a und 39b gezeigten Beispielen sind andere Kombinationen möglich zum Beispiel: Den Probenvertiefungsbereich in der walzgeprägten Fläche einschließen, jedoch nicht den Luftöffnungsschlitz einzuschließen; oder den Luftöffnungsschlitzbereich einzuschließen, jedoch nicht die Probenvertiefung.
  • Die Figuren 40a und b zeigen zwei mögliche walzgeprägte Basisversionen. In 40a sind die Leitung, das Reaktionsvolumen 402 und Luftöffnungsbereiche in dem walzgeprägten Abschnitt der Basis eingeschlossen. Das Probenvertiefungsloch 403 und das Luftöffnungsloch 401 sind in dem Abdeckungsstück gelegen. Die Bodenoberfläche der Abdeckung kann beschichtet sein mit Kleber, um zu erlauben sie mit der Basis zu verbinden. Alternativ, wie in 40b gezeigt, kann die walzgeprägte Fläche die Probenvertiefung, Leitung, Reaktionsvolumen und Luftöffnungsschlitz enthalten. Andere Variationen sind ebenfalls möglich.
  • Zusätzlich zum Walzprägen oder verwandten Prozessen können die Komponentenstücke ebenfalls hergestellt werden durch Spritzgießen jedes Stückes. So kann die Abdeckung mit vorgeformten Luftöffnungs- und Probenvertiefungslöchern einstückig spritzgegossen werden mit oder ohne einer geeigneten Hohlraumstruktur und die Basis mit oder ohne einer geeigneten Hohlraumstruktur kann getrennt spritzgegossen werden. Die Formstücke können zur Verfügung gestellt werden mit indizierten Löchern und Stiften für einen automatischen Zusammenbau versehen werden und können auch über ein Gelenk an der Kante verbunden werden, so daß es erlaubt wird eine schnelle Zusammenbauprozedur zu verwenden. In ähnlicher Weise können walzgeprägte Abdeckungs- und Basisabschnitte geformt werden aus kontinuierlichen Rollen aus polymeren Filmmaterial, maschinell zusammengebaut und in einzelne Objektträger zerschnitten werden.
  • Reaktionsobjektträger, welche aus zwei Komponentenstücken gebildet sind, werden im allgemeinen äußerst nützlich zum Durchführen optischer (oder anderer) Messungen, welche keine sandwichartige Schichtwellenleitereigenschaften benötigt. Innere Wellenleiter werden am besten gebildet in einem Reaktionsobjektträger unter Verwendung von drei Schichten (oder mehr), wobei die mittlere Schicht so wirkt als sei sie ein optischer Faserkern und die äußeren Schichten wirken als Umhüllung. Dies beschränkt jedoch nicht die Verwendung externer Wellenleiter zum Einführen von Licht in den Reaktionsobjektträger und zum Führen von Licht aus dem Reaktionsobjektträger heraus, um photometrische Analyse zu erzielen.
  • Fig. 17 ist eine Draufsicht auf die Abdeckung 10, die Auflage 20 und Basis 30, wenn sie zusammengebaut sind.
  • Die Fig. 18 a, b und c sind längsvertikale Querschnitte anderer Ausführungsformen eines Reaktionsobjektträgers 1 gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Abdeckung 10, die Auflage 20 und die Basis 30 sind geschnitten entlang der Linie VI-VI von Fig. 17. Wie unten vollständiger beschrieben wird, enthält der Reaktionsobjektträger 1 gewisse Elemente zusätzlich zu jenen, die in den Fig. 13 bis 16 gezeigt sind.
  • Unter allgemeiner Bezugnahme auf die Fig. 13 bis 18 umfaßt die Abdeckung 10 ein dünnes Glas- oder Polymerblatt, typischerweise transparent, mit einer darin gebildeten Aufnahmeöffnung 14 und einer länglichen Öffnung 12, einem distalen Ende 16 der Abdeckung benachbart. Die Auflage 20 umfaßt ein dünnes Glas- oder Polymerblatt, typischerweise transparent, mit darin gebildetem Ausschnitt, wobei der Ausschnitt eine Geometrie aufweist wie gezeigt, um eine Probenaufnahmeöffnung 22 zu bilden, einem Reaktionsraum 24 und einer Leitung 26, welche dem Reaktionsraum und die Probenaufnahmeöffnung verbindet. (Der Reaktionsraum 24 wird ein Reaktionsvolumen nach Zusammenbau der Abdeckung, der Aulage und der Basis.) Abgeschrägte Wände 25 bilden vorteilhaft einen Übergang zwischen der Leitung 26 und dem Reaktionsraum 24. Das distale Ende 28 der Auflage ist geschlossen wie bei 29 gezeigt. Die Basis 30 umfaßt ein Blatt aus Glas- oder Polymermaterial, typischerweise transparent und typischerweise etwas dicker als sowohl die Abdeckung 10 oder auch Auflage 20. Die Leitung 26 ist wichtig in soweit, daß sie die Probenvertiefung mit dem Reaktionsvolumen verbindet; ihre Bedeutung leitet sich jedoch aus der Tatsache ab, daß sie die Brücke zwischen dem Äußeren und Inneren des Instrumentes darstellt, wobei sie einer Probe erlaubt, aus einer Domäne in die andere zu fließen, ohne eine Klappe oder Luke in dem Instrument öffnen zu müssen. Wenn die Leitung zu kurz ist, ist es schwierig die Probe geeignet zu plazieren ohne die Gerätewand zu berühren. Wenn sie zu weit ist, wird Probe verschwendet; wenn zu dünn oder zu schmal, kann der Fluß gesperrt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Leitung 26 beladen mit einem Material, welches eine vorläufige Reaktion in der Probe auftreten läßt oder die Probe auf andere Weise behandelt, wobei die Einführung einer modifizierten Probe in den Reaktionsraum 24 erlaubt wird.
  • Die Abdeckung 10 und die Basis 30 sind durch einen Abstandshalter 60 getrennt, wobei der Abstandshalter 60 auf der Auflage 20 gemacht ist, und sandwichartig zwischen zwei Klebeschichten 62 liegt, welche jeweils die Auflage 20 mit der Abdeckung 10 und die Auflage 20 mit der Basis 30 verbinden. Jede der Klebeschichten 62 hat dieselbe Form wie die Auflage 20. Dies bedeutet, jede der Probeschichten ist gebildet mit einer Öffnung, welche eine Form aufweist, die der Probenaufnahmeöffnung 22, dem Reaktionsraum 24 und der Leitung 26 der Auflage 20 entspricht. Dementsprechend sind in dem Reaktionsobjektträger eine Probenvertiefung 64, ein Reaktionsvolumen 66 eine Leitung, welche das Reaktionsvolumen 66 und die Probenvertiefung 64 verbinden und eine Öffnung 76, gebildet durch die Öffnung 12 in der Abdeckung 10, welche das Reaktionsvolumen 66 mit der Umgebung des Objektträgers verbindet.
  • In Fig. 18a wird eine Filmschicht 60a sandwichartig zwischen die beiden Klebeschichten 62 gelegt. In Fig. 18c wird eine einzelne dickere Klebeschicht 62 verwendet.
  • Die Bodenoberfläche der Abdeckung 10, welche der Basis 30 gegenüberliegt, befindet sich in räumlichen Abstand von der oberen Oberfläche der Basis 30 durch eine Entfernung, welche genügend klein ist, um eine Probe, die in der Probenvertiefung 64 angeordnet wird, zu veranlassen, in das Reaktionsvolumen 66 aufgrund einer Kapillarwirkung gesogen zu werden. Eine derartige Wirkung wird möglich gemacht durch das Vorliegen der Öffnung 76. Diese Öffnung stellt ebenfalls eine Luftschnittstelle zur Verfügung, welche eine Grenze des Reaktionsvolumens definiert, wenn es mit Flüssigkeit gefüllt ist, wodurch es der selbstabmessenden Funktion des Reaktionsobjektträgers behilflich ist.
  • Wie in den Fig. 13 bis 15 gezeigt ist die Länge (von links nach rechts in der Zeichnung) der Abdeckung 10 dieselbe wie diejenige der Auflage 20 und die Breite (von oben nach unten in der Zeichnung) der Abdeckung 10 und der Auflage 20 sind dieselben und sind (typischerweise) kleiner als die der Basis 30.
  • Beobachtungen und Messungen chemischer Reaktionen, welche innerhalb des Reaktionsvolumens 66 auftreten, können durch eine Reihe von Verfahren, wie unten vollständiger beschrieben werden, gemacht werden. Derzeit sind optische Verfahren bevorzugt, jedoch wird die Auswahl des Verfahrens von dem durchzuführenden Test abhängig sein.
  • In Fig. 16 ist eine Anzahl von Pfaden gezeichnet, welchen des Licht typischerweise folgen kann zum Durchführen derartiger Messungen und Beobachtungen. Diese Pfade können allein oder in Kombination verwendet werden.
  • In Lichtpfad 40 wird Licht durch eine Seite der Auflage 20 eingeführt und tritt anfänglich durch einen Teil der Auflage, welche zwischen dem geschlossenen Ende 29 und der abgeschrägten Wand 25 angeordnet ist, hindurch. Dieser Teil der Auflage und ihr gegenüberliegender entsprechender Teil wird als ein innerer Wellenleiter 27 bezeichnet. Anschließend tritt das Licht durch das Reaktionvolumen 66 aus durch den entgegengesetzten Wellenleiter 27. Wie schematisch verdeutlicht ist, wird Licht, welches in dieser Richtung durch die Wellenleiter tritt von den oberen und unteren Oberflächen der Auflage 20 im Inneren reflektiert. Der Lichtpfad 40 ist nützlich zum Durchführen von Messungen, welche auf der Transmission oder Absorbtion von Licht durch die Flüssigkeit innerhalb des Reaktionsvolumens 66 basieren, wobei in diesem Fall das Verhältnis der Lichtintensität vor und nach dem Hindurchtreten durch die Probe in Abwesenheit von Streuung oder Ausschluß von Streuung gemessen wird. Das Beer-Lambert Gesetz beschreibt das Phänomen. Standarddetektoren werden in einem Sichtlinienaufbau mit der Lichtquelle verwendet.
  • Der Lichtpfad 41 verdeutlicht eine Messung, welche gemacht werden kann, basierend auf Lichtstreuung, in welcher Licht zuerst transversal durch einen inneren Wellenleiter 27 eingeführt wird, in das Reaktionsvolumen 66 eintritt, dann durch die Probe gestreut wird, wobei ein Teil des gestreuten Lichtes nach unten durch die Basis 30 fortschreitet und dann den Reaktionsobjektträger verläßt. Lichtstreuungsmessungen oder Nephelometrie messen Licht, welches nicht irreversibel durch die Probe absorbiert wird und unter verschiedenen Winkeln herauskommt, wobei die räumliche/Intensitätsverteilung von der Partikelgröße, Form und Wellenlänge der Anregungsenergie abhängig ist, Rayleigh und Mie Theorien sind nützliche Modelle.
  • Es werden Standarddetektoren verwendet. Beispiele sind Photozellen oder Photomultiplier, wobei die lezteren bei sehr niedrigen Lichtniveaus verwendet werden. Die Anregungsquellwellenlänge kann auf einen besonderen Wert fixiert werden. Der Detektor wird typischerweise auf einen vorbestimmten Winkel aus der Richtung der Anregung gesetzt.
  • Die Lichtpfade 42 bzw. 43 zeigen Licht, welches seitlich durch die Seiten der Abdeckung 10 und der Basis 30 eintreten, wobei es innere Totalreflexion erfährt, wenn es direkt oberhalb bzw. unterhalb des Reaktionsvolumens hindurchtritt, und wobei es durch das entegegengesetzte Ende der Abdeckung oder Basis austritt. Wie es vollständiger in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/033,817, eingereicht am 3. April 1987 auf welche hiermit voll inhaltlich Bezug genommen wird, erläutert ist, können derartige Lichtpfade verwendet werden zum Erfassen von Fluoreszenz unter Verwendung einer Auflösungswellerunessung (evanescent wave measurement).
  • Andere Lichtpfade sind möglich, vertikale Pfade einschließend, welche durch die Abdeckung, das Reaktionsvolumen und die Basis hindurchtreten und Lichtpfade, welche eine Reflexion von einer Probe in dem Reaktionsvolumen verwenden, wonach Licht sowohl in das Reaktionsvolumen über den Weg der Abdeckung 10 oder Basis 30 eintreten als auch verlassen kann.
  • Es wird typischerweise wünschenswert sein Streulicht vom Eintreten in den Reaktionsobjektträger auszuschließen. Zu diesem Zweck kann jegliche äußere Oberfläche des Reaktionsobjektträgers, welche nicht verwendet wird für die Lichttransmission wünschenswerterweise mit einer opaquen Farbe gestrichen werden. Die Wahl der Oberflächen, welche so gestrichen werden sollen, wird bestimmt durch den Test der durchgeführt werden soll und die ausgewählten Meßverfahren. Wenn eine der Komponenten 10, 20 oder 30 nicht für die Lichttransmission verwendet wird, kann diese Komponente aus einem Material gefertigt werden, welches selbst opaque ist, wie beispielsweise Metall.
  • Wenn Lichtpfade wie beispielsweise 40 und 41 in Fig. 16 verwendet werden, wird es wichtig so viel Licht wie möglich durch einen oder beiden der inneren Wellenleiter 27 zu übertragen, wobei man die Verluste so niedrig wie möglich hält. Es wurde herausgefunden, daß das Vorliegen der Klebeschicht 62 den Abstandshalter 60 dazu veranlassen kann sich wie eine optische Faser zu verhalten, wobei die Wellenleiter 27 einen Kern einer optischen Faser entsprechen und die Klebeschichten 62 einer Umhüllung entsprechen.
  • Ein nicht zusammenpassender Brechungsindex zwischen den Wellenleitern 27 und den Klebeschichten 62 erzeugt eine innere Totalreflexion an Licht, welches auf die Grenzfläche unter Winkeln, größer als der kritische Winkel auftreffen. Beispielsweise wird auf Fig. 27 Bezug genommen, worin ein Kern 70, eine Umhüllung 71, welche den Kern 70 umgibt und ein einfallender Lichtstrahl 72, welcher den Kern 70 trifft und hindurchtritt, zeigt. Der Kern 70 kann dem inneren Wellenleiter 27 der Auflage entsprechen und die Umhüllung 71 kann der Klebeschicht 62 entsprechen. Wenn beispielsweise das Kernmaterial 70 einen Brechungsindex n&sub1; von 1,62 und die Umhüllung 71 einen Brechungsindex n&sub2; von 1,52 aufweist ist der Sinus des kritischen Winkels n&sub2;/n&sub1; oder 1,521/1,62=0.938 ist. Der kritische Winkel ist dann 69,8 Grad.
  • Fig. 19 stellt eine Explosionsansicht einer unterschiedlichen Ausführungsform des Reaktionsobjektträgers dieser Erfindung zur Verfügung. Eine Draufsicht auf die Ausführungsform ist in Fig. 20 gezeigt mit ausgewählten vertikalen, transversalen Querschnitten, welche in den Fig. 21 und 22 gezeigt sind.
  • Es ist eine Basis 30 gezeigt, auf welcher ein Einschub 110 und eine Einschubabdeckung 100 befestigt sind. Die Einschubabdeckung 100 ist allgemein gebildet durch ein hauptsächliches ebenes Segment 101 mit lateralen Seiten, welche abwärts nach außen, um Wände 104 zu bilden, und dann seitwärts gebogen sind, um Streifen 106 zu bilden. Die Streifen 106 sind an der Basis 30 verbunden mit dem Einschub 110, welcher angeordnet ist zwischen dem ebenen Segment 101 der Einschubabdeckung 100 und der Basis 30, wobei die Höhe der Wände 104 im allgemeinen der Höhe des Einschubs 110 entsprechen.
  • Der Einschub 110 schließt eine Probeaufnahmeöffnung 112 ein, welche mit einer Leitung 114 in Verbindung steht, welche in nach außen abgeschrägten Wänden 116 endet. Da die Länge des Einschubs 110 wesentlich kleiner ist als die Länge der Einschubabdeckung 100, wird ein Reaktionsvolumen 66 rechts von dem Einschub, wie in Fig. 20 gezeigt, gebildet.
  • Demnach kann man sehen, daß die Wände 104 in dem Bereich des Reaktionsvolumens 66 den Funktionen der inneren Wellenleiter der vorherigen Ausführungsform dienen und zu diesem Zweck wenigstens jene Bereiche der Wände 104 die angeordnet sind in der Nachbarschaft des Reaktionsvolumens 66 aus einem transparenten Material gefertigt sind.
  • Obwohl der Einschub 110 mit der Basis 30 verbunden werden kann, sind Variationen möglich. Beispielsweise können der Einschub und die Basis als ein Stück gebildet werden, geformt oder maschninell zu der geeigneten Form- und Kanalstruktur bearbeitet.
  • Wie unten detailiierter beschrieben werden wird, wird ein zusammengebauter Reaktionsobjektträger gemäß den unterschiedlichen Ausführungsformen typischerweise ein oder mehrere Reagenzien enthalten, welche spezifisch ausgewählt sind auf ihre Nützlichkeit zum Durchführen irgendeines der vielen Tests, welche unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionsobjektträger durchgeführt werden können. Beispielsweise kann Flüssigreagenz in dem Reaktionsvolumen durch Füllen durch die Probenvertiefung oder vorzugsweise durch die Öffnung angeordnet werden. Das Reagenz kann dann gefriergetrocknet werden, wobei die exakten Gefriertrocknungsverfahrensbedingungen abhängig sind von den erforderlichen Optima und dem verwendeten Reagenztyp. Demnach wird ein Reaktionsobjektträger zur Verfügung gestellt, gebrauchsfertig, mit einer abgemessenen Menge eines darin angeordneten Reagenzes.
  • Typischerweise kann es erwünscht sein, die inneren Oberflächen des Reaktionsobjektträgers zu modifizieren, welche mit der Probe oder dem Reagenz in Kontakt stehen oder beide die flüssig/fest/Luft-Kontaktwinkel der Oberflächen modifizieren, wobei die Oberflächen behandelt werden, um ihren hydrophilen Charakter zu erhöhen. Eine derartige Behandlung wird die Leichtigkeit, mit der die Probe aus der Probenvertiefung zu dem Reaktionsvolumen fließt, erhöhen.
  • Es gibt eine Reihe von verfügbaren Verfahren zum Herabsetzen der Kontaktwinkel auf einer hydrophoben (oder nichtpolaren) Oberfläche, wodurch sie hydrophiler gemacht wird. Oberflächenaktive Mittel (oder Tenside) welche typischerweise als Benetzungsmittel verwendet werden, können verwendet werden. Beispielsweise können kleine Mengen vom Triton Typ Dispersionsmittel, Tween (Polyoxiethylenderivate von teilweisen Fettsäureestern von Hexitolanhydriden) Typ oberflächenaktiven Mitteln und Brij (Polyoxiethylenether von höheren aliphatischen Alkoholen) Typ Benetzungsmitteln können verwendet werden. Oberflächemodifikation über chemische Derivatisierung von Oberflächenmolekülen kann polare prosthetische Gruppen erzeugen. Andere Techniken schließen Oberflächenmodifikation unter Verwendung kontrollierter elektrischer Entladung oder Plasmabehandlung ein.
  • Es sollte bemerkt werden, daß die Höhe des Reaktionsvolumens kritisch ist und definiert wird durch die Dicke der Abstandshalter 60 (siehe Fig. 18). Diese Höhe sollte einheitlich sein und kann von 0,001 bis 0,02 Inch (ungefähr) betragen. Typischerweise beträgt diese Höhe vorzugsweise 0,002 Inch bis 0,008 Inch und besonders bevorzugt ungefähr 0,006 Inch.
  • Diese Größenordnung ist nicht nur geeignet um funktionelle Kapillarwirkung in den Kanälen zu erzielen, sondern liegt in der gleichen Größenordnung wie es im allgemeinen erforderlich ist für optische Wellenleiter zur Übertragung von Licht durch innere Totalreflexion. Gleichzeitig liegt diese Abmessung ungefähr in der Größenordnung die erforderlich ist, um bevorzugte Phasentrennung zu der Mitte des fließenden Stromes von suspendiertem partikulären oder zellulärem Material in einem Zweiphasensystem (oder Suspension) während aufrechterhaltener Laminarflußbedingungen zu erzeugen, welche erreicht werden können, wie in US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/033,817, eingereicht am 3. April 1987 beschrieben, auf welche hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
  • Für die Herstellung des Reaktionsobjektträgers sollten sämtliche Materialien, welche mit der Probe oder dem Reagenz in Kontakt kommen, relativ inert sein. Die Oberflächeneigenschaften dieser Materialien sollten derart sein, daß eine geeignete Benetzung der Oberfläche durch die Probe erreicht wird, um sinnvolle Fließbedingungen zu schaffen. Im allgemeinen ist ein kleiner Kontaktwinkel am besten.
  • Die Abdeckung 10 kann hergestellt werden aus einem festen dünnen Blatt aus paramagnetischem Material oder einem Laminat, bestehend aus einem beschichteten paramagnetischen Material oder kann hergestellt werden aus Kunststoff oder Glas.
  • Das paramagnetische Material könnte Eisen oder Nickel sein. Chemisch inerte dünne Beschichtungen wie beispielsweise Polyvinylchlorid, Acryl oder Polycarbonat können verwendet werden. Ein Polymer mit eingekapseltem Eisenoxid (z. B. Magnetit) könnte ebenfalls verwendet werden.
  • Die Abdeckung könnte ebenfalls hergestellt werden aus einer Reihe von Gläsern und geschmolzenem Quarz. Polymermaterialien, welche vorteilhaft verwendet werden können schließen ein:
  • Polycarbonat, PET, PETG, (Glycerin-modifiziertes Polyethylenterephthalat), Acetat, Acrylnitril und Cellulosenitrat. Eine Reihe an koextrudierten Filmen, Kompositen und Polymerlegierungen können ebenfalls verwendet werden. Von primärer Wichtigkeit sind Abmessungsstabilität, Steifheit, Elastizität und optische Klarheit (falls erforderlich). Die Fähigkeit eines Materials in dünnen Blättern hergestellt zu werden ist ebenfalls ein Faktor. Methylmetacrylat und Polystyrol sind beide möglicherweise geeignete Materialien aber sind schwierig in dünnen Blättern herzustellen.
  • Die Abdeckung ist typischerweise von größerer Oberflächenfläche (oder projizierter Fläche) als das Reaktionsvolumen. Die Abdeckung kann typischerweise dieselbe Länge und Breite wie der Abstandshalter (z. B. 2 Inch x 0,5 Inch) annehmen, kann aber größer sein, falls erforderlich, oder kleiner.
  • Materialen, welche verwendet werden können, um eine gute bis ausgezeichnete Auflage herzustellen schließen ein: Polycarbonat, PETG, Methylmetacrylat, Polysterol und Glas. Jedoch ist es schwierig, Glas in den erforderlichen Formen herzustellen. Materialien, welche verwendet werden können, um eine gute oder mittelmäßig gute Auflage herzustellen schließen ein: Polyvinylchlorid, Nylon (Polyamide), PET oder Polyethylenterephthalat (z.B. Mylar) und Acetat. Materialien, welche verwendet werden können, um eine akzeptable Auflage herzustellen schließen ein: Acrylnitril, Polyethylenfilm niedriger Dichte, PP/EVA koextrudierter Film, EVA/Nylon/EVA koextrudierter Film, PP/EVA/PE/EVA koextrudierter Film und orientierter Polypropylenfilm. Materialien, welche eine Auflage mit marginaler Akzeptanz erzeugen können, schließen ein: XT und Polyethylenfilme hoher Dichte. Im allgemeinen stellen die besseren Materialien bessere Wellenleiter zur Verfügung, weil sie geringere Lichtstreuverluste aufweisen und gut in dem sichtbaren Spektrum übertragen, wo die am meisten verwendeten Erregungswellenlängen gefunden werden.
  • Es gibt viele Kleber, welche verwendet werden können, um die Auflage auf der Abdeckung und der Basis zu befestigen. Acrylkleber sind allgemein gut. Die besten Kleber behalten eine Flexibilität, sind transparent und haben niedrige Lichtstreuverluste, wenn Sie ausgehärtet sind, druckbehandelt oder auf andere Weise aktiviert sind. Die Länge und Breite der Auflage kann über einen weiten Bereich variiert werden, aber kann typischerweise und ungefähr 2 Inch x 0,5 Inch auf einer 3 Inch x 0,75 Inch Basis sein. Die Dicke des Abstandshalters liegt typischerweise in dem Bereich von 0,002 bis 0,010 Inch. Dünnere Abstandshalter können gelegentlich zu behindertem Kapillarkanalfluß führen. Dickere Abstandshalter tendieren dazu Flüssigkeit an der Luftgrenzfläche, benachbart zu der Kante des Reaktionsvolumen aufgrund geringer Kapillarwirkung bei Leitungen mit größerem Durchmesser zu verlieren.
  • Die Basis ist ein fester Träger und kann hergestellt werden aus einer Reihe von Materialien. Sie sollte starr genug sein, um die Reaktionsvolumengeometrie aufrecht zu erhalten und zu unterstützen, transparent in dem Reaktionsvolumenbereich sein (falls erforderlich zum Überwachen) und in der Lage sein mit der Abstandshalter/Abdeckungskomponente verbunden zu sein. Fluorierte Kohlenwasserstoffe wie beispielsweise Teflon erzeugen schwache Basen, weil sie schwierig zu verbinden sind. Glas ist ein akzeptables Material. Ausgezeichnete Verbindung kann erzielt werden mit auf Polycarbonat oder Methylmetacrylat basierende Materialien. Eine typische Minimaldicke für die Basis ist etwa 0,008 Inch für ein Material wie beispielsweise Polycarbonat. Eine Aluminiumbasis (wenn keine Transparenz erforderlich ist) könnte dünner sein. Wenn die Basis zu dünn ist, kann sie sich zu leicht biegen und das Volumen des Reaktionsvolumens unbeabsichtigt während des Handhabens oder Manipulation während eines Testes ändern. Wenn die Basis zu dick ist, kann es zu lang dauern das thermische Gleichgewicht für einen temperaturgesteuerten Test zu erreichen. Dies ist insbesondere wahr für Materialien mit niedrigen Wärmeleitfähigkeiten. Die Länge und Breite der Basis sind veränderlich.
  • Die Basis kann so klein wie 0,25 Inch sein in der Breite und 1 Inch in der Länge (oder auch kleiner). Typischerweise wird die Basis ungefähr 0,75 Inch an Breite und 3 Inch an Länge aufweisen. Dies stellt genug Raum für eine Probenvertiefung, eine Verbindungsleitung und ein Reaktionsvolumen mit geöffneten Enden zur Verfügung. Es gibt ebenfalls einen Bereich um den Objektträger mit Daumen und Zeigefinger zum Handhaben und Anordnen und einen anderen Bereich für einen optisch oder magnetisch ablesbaren Code um Information für das verwendete analytische Instrument zu liefern. Diese Information kann den Testtyp, Steuerparameter, Kalibrierungsinformation für die Reagenziencharge usw. beinhalten. Wie später beschrieben werden wird, kann die Basis breiter (oder länger) sein wenn verschiedene Tests an derselben Probe durchgeführt werden. In einem derartigen Fall können mehrfache Reaktionsabstandshalter verwendet werden, in paralleler (oder serieller)Verbindung mit der Probenvertiefung. Die Basis könnte aus einem Kompositmaterial bestehen (auf z. B. zwei Schichten, wie beispielsweise eine untere Schicht aus Aluminium, Eisen oder einem anderen Metall mit einem Loch unter dem Reaktionsvolumen). Auf dieser Schicht und daran angeheftet, wäre eine obere Schicht aus transparentem Material wie beispielsweise Polycarbonat, welches den Boden des Reaktionsvolumens definieren würde, um Lichttransmission durch das Loch in der unteren Schicht zu erlauben.
  • Eine Reflexionsschicht kann verwendet werden, um Lichttransmission zu verstärken. Solch eine Schicht kann hergestellt werden durch Anwenden eines dicken Filmes aus Aluminiumfarbe. Andere Verfahren schließen chemische Abscheidung von Silbermetall und Vakuumverdampfungsabscheiden von Silber oder Aluminium ein. Eine andere Herstellungstechnik ist es metallisierten, hitzeversiegelbaren Film zu verwenden, beispielsweise einen metallisierten, linearen Polyethylenfilm (LDPE) niedriger Dichte von ungefähr 20 Mikron Dicke (oder weniger). Andere metallisierte Polymerfilme können ebenfalls verwendet werden, wenn sie mit einem hitzeversiegelbaren Material wie beispielsweise Polyvinylidenchlorid beschichtet sind. Ein Beispiel ist metallisierter, hitzeversiegelbarer Polypropylenfilm (Polypropylen koextrudiert mit hitzeversiegelbaren Materialien). Andere Möglichkeiten schließen metallisiertes Cellophan ein, welches mit einem hitzeversiegelbaren Material beschichtet ist. Metallisierte Filme können hitzeversiegelt oder verleimt werden mit einem Kleber (z. B. Cyanacrylaten) an die Basis und die Abdeckung des Reaktionsobjektträgers. Metallisiertes Glas kann ebenfalls verwendet werden.
  • Fig. 23 ist ein transversaler vertikaler Querschnitt einer bevorzugten Ausführungsform einer äußeren Lichtquelle 120, ein transversaler vertikaler Querschnitt einer repräsentativen Ausführungsform eines Reaktionsobjektträgers 1, wobei der Querschnitt genommen ist in dem Bereich des Reaktionsvolumens 66 und ein Lichtdetektor 121, gezeigt, der unterhalb des Reaktionsobjektträgers 1 im Bereich des Reaktionsvolumens 66 angeordnet ist. Ein Trockenreagenz 125 wird auf den Wänden des Reaktionsvolumens 66 abgeschieden.
  • In dieser Ausführungsform umfaßt die Lichtquelle 120 ein Kunststoffgehäuse 130, welches eine LED 132 trägt mit elektrischen Leitungen 134. Wie gezeigt, wird eine Stufe 136 in dem Gehäuse 130 gebildet. Wie gezeigt, kann die Abdeckung 10 aus einem opaquen Material wie beispielsweise einem Metall gefertigt werden.
  • Während der Verwendung wird die Lichtquelle 120 und der Reaktionsobjektträger 1 dermaßen in die Stufe 136 eingepaßt, daß die Stufe 136 die Basis 30 des Rektionsobjektträgers und die LED 132 aufnimmt und angeordnet ist oberhalb der Basis 30 und in Kontakt mit oder stark benachbart zu einem inneren Wellenleiter 27 des Reaktionsobjektträgers.
  • Die in Fig. 21 verdeutlichte Anordnung ist ausgelegt, einen Lichtpfad zu verwenden, wie beispielsweise ein solcher, der bei 41 in Fig. 16 gezeigt ist. Ein detaillierteres Beispiel der Geräteausrüstung zum Erreichen einer derartigen Messung durch Überwachen von Lichtstreuung durch die Basis des Reaktionsobjektträgers ist gezeigt und diskutiert in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/033,817, eingereicht am 3. April 1987 auf welche hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird. In den Fig. 24 und 25 ist ein Gerät gezeigt zum Messen von Lichtstreuung oder Reflexion durch die Reaktionsobjektträgerabdeckung.
  • Das Gehäuse 140 umfaßt ein unteres Gehäuse 142 und eine Abdeckung 144, welche auf oder integral mit dem unteren Gehäuse 142 ruht. Ein unteres Ende der Wand 146 der Abdeckung 144 ist räumlich entfernt von dem oberen Ende 148 des unteren Gehäuses 142 durch einen Abstand, welcher genügt, um zu erlauben, daß der Reaktionobjektträger 1 eingeführt wird. Seitliche Führungen 150 und Anschlag 152 errichten eine geeignete Position des Reaktionsobjektträgers 1 für eine Messung. Die Lichtquelle 120 und Lichtdetektor 121 sind innerhalb des Gehäuses 140 angeordnet wie gezeigt. Dort ist eine Blende 154 zur Verfügung gestellt, angeordnet unmittelbar unterhalb des Photodetektors 121 um den Winkel an reflektiertem oder gestreutem Licht, welches durch die Abdeckung des Reaktionsobjektträgers hindurchtritt, abzuwenden.
  • Die Probenvertiefung 64 des Reaktionsobjektträgers 1 ist außerhalb des Gehäuses 140 angeordnet, so daß der Reaktionsobjektträger 1 in das Gehäuse 140 eingeführt werden kann, bevor eine Reaktion ausgelöst wird.
  • Der Lichtdetektor 121 kann verwendet werden, um den Fortschritt des Probeneintritts in das Reaktionsvolumen 66 und das anschließende Fortschreiten der Reaktion innerhalb des Rektionsvolumens 66 zu überwachen. Die Lichtquelle 120, Reaktionsvolumen 66 und Lichtdetektor 121 sind in einem Teil des Gerätes angeordnet, welche von Umgebungslicht isoliert ist. Wünschenswerterweise sind jene Teile des Reaktionsobjektträgers 1, welche Umgebungslicht ausgesetzt sind aus opaquen Materialien hergestellt oder sind so gestrichen, daß sie beim Ausschluß von Streulicht aus dem Reaktionsvolumen 66 behilflich sind.
  • Eine Temperatursteuerung für den Reaktionsobjektträger wird zur Verfügung gestellt von Heizern eines Wärmesteuersystems, schematisch verdeutlicht als Element 156. Eine Form eines solchen Heizers kann ein Widerstandsheizstreifen 157 sein, welcher auf dem Boden der Platte 148 befestigt ist. Ungeachtet der verwendeten Form des Wärmesteuersystems, ist es wünschenswert, daß es wenigstens in der Lage ist die Temperatur der Platte 148 auf 37ºC zu halten.
  • Das in den Fig. 24 und 25 gezeigte Gerät ist kein kommerziell erhältlicher Standardtyp, sondern ist stattdessen Kundenangefertigt zur Verwendung mit Reaktionsobjektträgern. Wie in dem Fall der anderen Geräte, welche derzeit verfügbar sind für dezentralisiertes Testen ist optische oder magnetische Codelesefähigkeit gegenwärtig bevorzugt, welche für Identifizierung des durchzuführenden Testes und des besonderen verwendeten Reaktionsobjektträgers zusammen mit Kalibrierinformation sorgt. Ein derartiger Code kann während der Herstellung an dem Reaktionsobjektträger angebracht werden. Zusätzlich können andere Strukturen vorliegen, um Mischen zur Verfügung zu stellen falls erforderlich (unten beschrieben). Wie ebenfalls unten beschrieben wird, wird es erwünscht sein, daß ein Systemmikroprozessor, Anzeige oder andere Datendarstellungsmittel, irgendwelche notwendigen analog/digital Wandler, Netzteile und dergleichen mit der verdeutlichten Geräteausstattung zu verbinden.
  • Wie man aus der Betrachtung der Fig. 25 ersehen kann, ist es wünschenswert, daß der Abstand zwischen dem unteren Ende der Wand 146 und der Platte 148 so niedrig wie möglich ist, um den Ausschluß von Umgebungslicht zu unterstützen.
  • Fig. 26 zeigt ein vereinfachtes Systemblockdiagramm wie das durch einen Detektor empfangene Analogsignal interpretiert werden kann. Die Lichtquelle 120 überträgt Licht durch das Reaktionsvolumen des Reaktionsobjektträgers 1. Reflektiertes oder gestreutes Licht wird überwacht durch den Photodetektor 142 und bei 176 verstärkt. Weitere Verstärkung und Ausgleich des DC-Signals wird erreicht durch Verstärkerschaltung 182. Die Verstärkung des AC-gekoppelten Verstarkers 180 ist durch die Nikroprozessor-CPU wie gezeigt wählbar. Digitalsierung wird erreicht bei 178 unter Verwendung eines eingebauten (on board) A/D-Wandlers und Peak- und Steigungserfassung werden erreicht durch die CPU 178 plus Speicherblöcke 186. Von dem Ausgang 180 werden Signale für Startzeit und Endpunkterfassung bestimmt unter Verwendung eines geeigneten Algorithmus. Die Mikroprozessor-CPU 178 hat andere Eingänge und Ausgänge 184. Diese können Funktionen für Temperatursteuerung, externe Dateneingabe usw. einschließen. Der Block 186 enthält Daten- und Programmspeicher. Die Ergebnisse werden gelesen auf der Anzeige 188. Zusätzlich zum Überwachen der Testkinetiken werden auch die Dynamiken des Probeneingangs in den Reaktionsraum und die anfängliche Wechselwirkung mit dem Reagenz überwacht als eine Konsequenz der Geometrie und Struktur des Reaktionsobjektträgers. Der Anfangsbereich der Kurve dafür liefert Information für Qualitätskontrolle einer geeigneten Probezugabe.
  • Das obige Gerät zeigt ein Beispiel wie Messungen durch Lichtstreuung oder Reflexion durchgeführt werden können. Dieser Messungsansatz wird vorteilhaft verwendet mit dem Reaktionsobjektträgersystem, welches in Fig. 5 gezeigt ist. In Fig. ist ein Reaktionsobjektträger 1 gezeigt, angeordnet oberhalb und in naher Nachbarschaft eines Permanentmagneten 195. Unterhalb des Permanentmagneten 195 ist ein Elektromagnet 196, welcher durch ein Netzteil 199 betrieben wird für zyklierende Ein- und Ausspannung bei einer gewünschten Frequenz. Dort ist ebenfalls eine Lichtquelle (nicht gezeigt) zum zur Verfügung stellen von einfallendem Licht und ein Detektor angeordnet, zum Erfassen von Lichtstrahlen, die von der Probe innerhalb des Reaktionvolumen 66 reflektiert werden.
  • Die reflektierten Strahlen, verdeutlicht als Strahlen 198, werden durch einen Detektor 400 erfaßt. Detektor 400 kann theoretisch an jeder Position zwischen 900 und 100 Positionen, einschließlich der in Fig. 5 gezeigten angeordnet werden. Wenn man jedoch Winkel kleiner als 450 annähert, ist es eher wahrscheinlich, daß der kritische Winkel erreicht wird, so daß eine Totalreflexion von einfallendem Licht aus der Abdeckung verhindern wird, daß die Reaktion überwacht werden kann. Vorzugsweise kann Detektor 400 zwischen 900 und 450, besonders bevorzugt zwischen 900 und 750 angeordnet werden.
  • Eine Messung, die mit einer solchen Vorrichtung durchgeführt werden kann wird nun beschrieben. Der Reaktionsobjektträger wurde zuvor hergestellt durch Bilden eines Breies aus einem Koagulationsreagenz und inerten Magnetpartikeln, die in dem Reagenz suspendiert wurden. Das Koagulationsreagenz war Thromboplastin-Calcium und die Magnetpartikel waren Magnetit. Inerte Magnetpartikel arbeiten gut, wenn sie im Bereich von ungefähr 5 bis 50 Milligramm Pro Milliliter des Flüssigreagenz zur Verfügung gestellt werden. Dieser Brei wurde auf den Reaktionsobjektträger aufgetragen und gefriergetrocknet.
  • Um den Test durchzuführen, wurde Reaktionsobjektträger 1 in die Vorrichtung in die Position, wie in Fig. 5 gezeigt, eingeführt. Die Lichtquelle war eine lichtaussendende Diode und der Detektor war eine Siliciumphotodiode. Ein Blattschreiber wurde AC-gekoppelt an einen Photodiodenverstärker. Der Permanentmagnet 195 war in der Form eines Blattes (welches hergestellt sein kann auf einem flexiblen oder starren magnetischen Material). Die Energie wurde zyklisch mit einer Frequenz von einem Hertz an den Elektromagneten angelegt. Eine Blutplasmaprobe wurde in die Probenvertiefung 64 eingeführt und füllte das Reaktionsvolumen 66, das Trockenreagenz auflösend, wobei die Magnetpartikel wie bei 197 gezeigt resuspendiert werden und die Koagulationsreaktion ausgelöst wird. Der Permanentmagnet 195 bewirkt, daß die Magnetpartikel nach unten gezogen werden in Clustern oder Stapeln und gegen die Basis 30 in einer Orientierung parallel zu der Ebene des Permanentmagneten darniederliegen. Jedoch bewirkt jeder Energiezyklus, der an den Elektromagneten 196 angelegt wird, daß die Stapel der Magnetpartikel sich wie winzige Whisker in einer Orientierungsanordnung entlang der vertikalen Feldlinien aufstellen. Am Ende eines jeden solchen Energiezyklus liegen die Partikel wieder flach.
  • Das erfaßte, reflektierte Licht 198 zeigt ein sich mit der Zeit veränderndes Muster der Lichtintensität in Überein-Stimmung mit den oben wiedergegebenen Änderungen in der Orientierung der Magnetpartikel. Die Lichtintensität ist geringer, wenn die Partikel flach liegen als wenn sie aufrecht stehen.
  • Die erfaßte Lichtintensität zeigt einen anfänglichen Peak bei Probenzugabe. Anschließend zykliert die erfaßte Lichtintensität zwischen Maximal- und Minimalwerten in Überstimmung mit der Zyklusfrequenz des Elektromagneten 156. Während dieser Dauer, vor der Gerinnselbildung steigt der Unterschied zwischen den Maximal- und Minimalwerten der erfaßten Licht intensität an. Die Peak-zu-Peak Lichtintensitätsoszillationen beginnen jedoch von ihren Maximalwerten aus zufallen, wenn ein Gerinnsel begonnen hat sich zu bilden. Für diesen Punkt ist der Endpunkt erreicht worden. In dem Fall der Prothrombinzeit wird die verstrichene Zeit zwischen dem Probenzugabepeak und der Gerinnselbildung oder Gerinnselanfang (Endpunkt) leicht gemessen. Die Auflösung kann etwas erhöht werden durch Erhöhen der Oszillationsfrequenz.
  • Zum Bestimmen der Prothrombinzeit arbeitet der oben beschriebene Ansatz sehr gut unter Verwendung von Gesamtblut wie auch Plasma. Es wird erwartet für andere Typen von Blutkoagulationstests gut zu arbeiten. Die Messung kann gemacht werden unter Verwendung von übertragenem Licht anstelle des beschriebenen Verfahrens der Verwendung von reflektiertem Licht. Es wird jedoch angenommen, daß es weniger bequem ist durchgelassenes Licht als reflektiertes Licht zu verwenden.
  • Alternative Mittel zum Einführen von Licht in das Reaktionsvolumen 66 für unterschiedliche Messungen werden nun diskutiert zusammen mit einer Diskussion von anderen Typen von optischen Messungen. Eine vollständige Diskussion optischer Messungen, basierend auf Transmission, Absorbtion, Chemielumineszenz, Lichtstreuung, Reflexion, Fluoreszenz und Kombinationen dieser Techniken werden in der US-Patentanmdeldung mit der Seriennummen 07/033,817 gefunden, eingereicht am 3. April 1987, auf welche hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
  • Transmission/ Absorbtion oder optische Dichtemessungen, beinhalten eine Messung des Verhältnisses der Lichtintensität vor und nach Lichtdurchtritt durch eine Probe in der Gegenwart von (oder ausschließend) Streuung. Das Beer-Labert Gesetz beschreibt dieses Phänomen. Standarddetektoren werden verwendet in einem "Sichtlinien"-Aufbau mit der Lichtquelle wie in Fig. 28 gezeigt. Glüh- oder LED-Lichtquellen können verwendet werden. Fig. 28 verdeutlicht ebenfalls alternative Mittel zum Einführen von Licht in den Reaktionsobjektträger und zum Messen van Licht, welches den Reaktionsobjektträger verlassen hat. Insbesondere werden zwei äußere Wellenleiter 190, 191 zur Verfügung gestellt, welche jeweils auffallendes Licht zu einer der inneren Wellenleiter 27 des Reaktionsobjektträgers 1 tragen und Licht empfangen, welches durch die anderen inneren Wellenleiter 27 hindurchgetreten ist und Kanalisieren das empfangene Licht im Photodetektor 127. Die äußeren Wellenleiter 190, 191 können aus denselben Materialtypen hergestellt werden, welche verwendet werden, um die Auflage 20 eines Reaktionsobjektträgers wie zuvor beschrieben, herzustellen. Dementsprechend kann man erkennen, daß die Verwendung eines externen Wellenleiters oder Wellenleiter 190, 191 eine Struktur zum Einführen von Licht in den Reaktionsobjektträger 1 zur Verfügung stellt, welcher alternativ zu dem in Fig. 23 verdeutlichten Polymergehäuse 130 ist.
  • Ein optisches Filter 192 kann für eine Wellenlängenauswahl verwendet werden.
  • In Fig. 28 werden kolorimetrische oder turbidometrische Messungen erhalten. Lichtstrahlen treten durch Filter 192, reisen durch den äußeren Wellenleiter 190 und durch einen inneren Wellenleiter 27 und beleuchten dann das Reaktionsvolumen 66. Sie treten durch das Reaktionsvolumen durch den inneren Wellenleiter 27 zur rechten und werden durch einen optionalen zweiten äußeren Wellenleiter 121 übertragen. Die Lichtstreifen werden dann auf einen geeigneten Detektor 121 gerichtet.
  • In Fig. 29 wird ein zweiter Lichtdetektor 121 zum Erfassen von gestreutem Licht und eine Blende 194 zum Beschränken der Erfassung von gestreutem Licht bei oder um 900 zu der Anordnung der Fig. 28 hinzugefügt. Fig. 29 verdeutlicht eine Ausführungsform, die eine simultane Erfassung von Streuung (in diesem Fall bei 900) und Absorbtion erfaßt. Sie basiert auf einer Kombination der Lichtpfade 40 und 41 in Fig. 16. Diese Überwachungsstrategie kann nützlich sein während der Bildung von Niederschlägen oder großen Polymeren mit charkteristischen Absorbtionsspektren.
  • Fig. 30 zeigt eine Ausführungsform, welche auf einer herkömmlichen Reflexmessung basiert. Eine teilweise integrierte Kugel 42 befestigt eine Lichtquelle und einen Lichtdetektor 121. Die teilweise integrierte Kugel ist angeordnet unterhalb der Basis 30 eines Reaktionsobjektträgers 1, welcher ein Reaktionsvolumen 66 und ein Abdeckung 10 aufweist. Strahlen, welche in die teilweise integrierende Kugel aus dem inneren des Reaktionsobjektträgers, rückreflektiert werden, werden erfaßt, um eine Messung der Reaktion zu erlauben. Es sollte bemerkt werden, daß der Abstandshalter 60 nicht verwendet wird, um innere Wellenleiter zur Transmission zur Verfügung zu stellen.
  • Allgemeiner fangen derartige Reflexmessungen Licht ein, welches in irgendeiner erwünschten Richtung aus den Oberflächen oder Oberflächenschichten reflektiert werden. Eine Photodiode oder photoleitende Zelle kann verwendet werden, zusammen mit einem Filter für Wellenlängenspezifität. Die Kubelka-Monk-Theorie ist ein nützliches Modell für reflektierende Systeme.
  • Ein weiteres Verfahren zum Erfassen kann auf Fluoreszenz basieren und die Verwendung von Materialien beinhalten, welche floureszierend sind und demzufolge ultraviolettes Licht absorbieren und Licht einer längeren Wellenlänge emittieren, häufig in dem sichtbaren Bereich. Die Fluorometrie kann in einem Reflexionsmodus verwendet werden, ähnlich der Photodensitometrie, z. B. um Chromatogrammproben zu quantifizieren. Variationen sind möglich zusammen mit der Verwendung von Fluoreszenz in Kombinationen mit anderen Erfassungsmodi. Zum Beispiel kann ein Detektor bei einem festen Winkel, typischerweise 900, angeordnet werden, aus der Richtung der Transmission durch eine Probe wie in der Nephelometrie. Wie jetzt im Zusammenhang mit den Fig. 11 und 12 beschrieben wird, können auf Reflexion basierende Messungen unter Verwendung einer Membran oder Gelschicht als einem integralen Teil des Reaktionsobjektträgers leicht erhalten werden.
  • Fig. 11 verdeutlicht wie ein Reaktionsobjektträger verwendet werden kann, um Reflexionsmessungen auszuführen. Wie man in dem Diagramm sieht ist eine semipermeable Schicht (z. B. eine Membran oder eine Gelschicht) 40 innerhalb des Reaktionsvolumens 66 auf dem Reaktionsobjektträger angeordnet. Diese Schicht ist an der Abdeckung 10 derart befestigt, daß die Schicht in der Lage ist, Flüssigkeit und aufgelöste Spezies zu absorbieren, welche in das Reaktionsvolumen 66 eingeführt werden können. Eine Oberfläche der Schicht ist fest angeheftet oder benachbart mit der oberen inneren flachen Oberfläche des Reaktionsvolumens. Dieses Anheften oder Nachbarschaft verhindert, daß Flüssigkeit und/oder Flüssigkeit plus aufgelöste Spezies am Berühren oder Durchdringen des angehefteten oder benachbarten Bereiches der Schichtoberf läche ohne zuerst durch die anderen Bereiche der Schicht durchzudringen und stellen somit tatsächlich ein Fenster zusammen mit der transparenten Abdeckung 10 zur Verfügung, um zu erlauben, daß Farbänderung in der Schicht sofort beobachtet werden.
  • Die Schicht stellt einen Referenzuntergrund zur Verfügung mit bekannter Reflexionseigenschaft, gegen welche Farbentwicklungen quantitativ gemessen werden können. Die meisten Membranen, membranähnliche Schichten oder Gelschichten unterliegen einer bestimmten Änderung in der reflektierten Lichtintensität, wenn sie naß sind, was man typischerweise an einem Abfall der Lichtintensität sieht. Die Schicht 40 daher, während Verhinderung der direkten Beobachtung der Probe, wenn sie in das Reaktionsvolumen 66 eingeführt wird, wird den exakten Zeitpunkt des Eingangs der Probe in das Reaktionsvolumen signalisieren aufgrund der Reflexionsänderung nach Benetzen der Membran.
  • Probendurchdringung und "Benetzung" in vielen Typen von Membranen oder Gelschichten oder geeignete Hydration (für Gele), hydrophile Natur, Dicke und Porengröße fällt zusammen mit dem Eitritt der Probe in das Reaktionsvolumen. In manchen Fällen wurden Weißmacher, wie beispielsweise Titanoxid, zu der Membran oder dem Gel hinzugefügt, um die Leistungsfähigkeit bei erhöhter Reflexion zu verbessern.
  • In der Tabelle 1 unten sind beispielhafte Abmessungen eines Reaktionsobjektträgers in Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform angegeben. Die Membran- oder Gelschichtstruktur kann gefertigt werden aus einem kreisförmigen Blatt mit seinem Durchmesser kleiner als die kleinste Abmessung des Reaktionsraumes. Alternativ kann die Membran- oder Gelschichtstruktur ausgestattet werden, um die Form des Reaktionsraumes anzupassen mit seiner Kante benachbart zu dem Abstandshalter/Auflage. Die Membran- oder Gelschichtstruktur kann bestehen aus einer Mehrzahl von Scheiben, Rechtecken oder anderen Formen, wobei jede unterschiedliche Reagenzien enthalten kann, so daß mehrfache Reaktionen überwacht werden können. Tabelle 1 Abmessungen: Materialdicke (ungefähr) Abdeckung Abstandshalter Transferkleber Membran- oder Gelschicht Basis Inch
  • * Abstandshalter/Auflage
  • Der Kleber zum Anheften der semipermeablen Schicht an den Reaktionsobjektträger der am besten arbeitet ist von der Art, welche in druckempfindlichen Anwendungen verwendet wird, und eine transparente Verbindung erwünscht ist. Druckempfindliche Kleber werden an der Membran oder Gelschicht anhaften, ohne in die Poren zu fließen und dadurch die Membranfunktion zu gefährden. Obwohl ein doppelseitiges Klebeband oder Film verwendet werden kann, um die Membran oder Gelschicht an dem Reaktionsobjektträger zu befestigen, schafft die Verwendung eines transparenten, druckempfindlichen Klebers ohne eine Filmschicht eine gute Verbindung, ist leicht zu verwenden und ist im allgemeinen dünner als doppelseitige Klebebänder. Ein Acryltransferkleber, der in Rollen mit einer abziehbaren Rückseite (peel off backing) geliefert wird, arbeitet sehr gut.
  • Die semipermeable Schicht kann derart aufgebaut werden, daß suspendiertes Material ausgeschlossen werden kann und nur flüssige oder aufgelöste Spezies oder suspendierte Spezies in die Zwischenräume oder Poren der Schicht eindringen können. Im Falle von aufgelösten oder suspendierten Spezies werden somit Schichten mit einer besonderen Porengrößengrenze die größten Moleküle, Ionen, Kolloide usw., die eindringen können, bestimmen. Die Oberflächenladung auf der Schicht kann hier ebenfalls eine Rolle spielen im Bestimmen von Schwellen für geladene Spezies. All dies ist wohlbekannt in der Technik der, z. B. Membran- oder Gelschichtherstellung und vieler Arten an kommerziell verfügbaren Membranen existieren standardmäßig oder als Kundenformulierungen.
  • Die semipermeable Schicht kann ebenfalls aufgebaut sein, um Blutzellen aus einer Gesamtblutprobe auszuschließen und dadurch ermöglichen, daß Gesamtbluttests erreicht werden können ohne unabhängige Trennungsschritte wie beispielsweise Zentrifugation, welche extra Ausrüstung erfordert, zeitverbrauchend, arbeitsintensiv ist und zusätzliche Handhabung von Blutproben beinhaltet. Die aufgrund des Hämoglobins rote Farbe in dem Blut kann daher im wesentlichen eliminiert werden, unter zur Verfügungstellung eines weiten Bereiches an Wellenlängen, welche verwendet werden können, um Farbstoffe zu messen, ohne daß Soret Band Interferenzen eine signifikante Rolle spielen.
  • Beispielhafte Membranen sind unten zur Verfügung gestellt. Material Porengröße (microns) Beschichtung ungefähre Dicke Gesamtbluttrennfähigkeit Farbentwicklung Nylon Nitrocellulose Nylon (negativ geladen) Polysulfon Fiberglas PEG in Wasser unbeschichtet ausgezeichnet mittelmäßig gut
  • Membranen, die mit Gesamtblut, welches Evans Blau-Farbstoff enthält, getestet wurden.
  • (Anmerkung: Es ist bekannt, daß sich Evans Blau in Blutplasma auflöst und sich weder an rote Blutkörperchen anheftet, noch davon absorbiert wird, noch in diese eindringt. Das Molekulargewicht von Evans Blau ist kleiner als 1000 dalton.)
  • # ohne Schutzfolie (backing) (Schutzfolie wurde vor Verwenden der Membran entfernt).
  • Die Gelschicht kann eine Agarosegelschicht, eine Polyacrylamidgelschicht oder eine Gelatinegelschicht sein.
  • Ein Reagenz oder eine Mischung von Reagenzien kann hinzugefügt werden zu der semipermeablen Schicht (z. B. vor dem Zusammenbau des Objektträgers). In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein Reagenzien direkt auf die semipermeable Schicht zu binden oder zu immobilisieren. Zusätzlich zu der Verwendung von Trockenreagenzien in der semipermeablen Schicht können andere Trockenreagenzschichten in dem Reaktionsvolumen des Reaktionsobjektträgers verwendet werden, wobei die Schichten dieselben oder unterschiedliche Reagezien enthalten. Mehrschichtstrukturen, hergestellt aus einer Mehrzahl an semipermeablen Schichten, können ähnlich verwendet werden, wobei ein weiter Bereich an Möglichkeiten für Tests, welche mehrfache Reagenzien, Molekulargrößenauswahl/ausschluß und immobilisierte Reagenzien involviert sind, zur Verfügung gestellt werden.
  • Fig. 12 zeigt eine Schnittansicht des Reaktionsobjektträgers in Fig. 11. Die semipermeable Schicht 40 ist innerhalb des Reaktionsvolumens 66 angeordnet und angeheftet an die Abdeckung 10 mittels einer transparenten Klebeschicht 42. Lichtstrahlen 43, welche durch die Abdeckung 10 aus einer nicht gezeigten Lichtquelle hindurchprojiziert werden, werden auf der semipermeablen Schicht reflektiert. Die Lichtstrahlen werden unter einem Winkel projiziert, welcher reflektierte Strahlen unter demselben Winkel zu der Normalen (Reflexionswinkel) von direktem Auftreffen auf den Photodetektor 121 reflektiert, um Überstrahlung zu verhindern. Der Photodetektor 121 kann eine Blende 204 erfordern, um die Sicht auf den semipermeablen Schichtbereich des Reaktionsobjektträgers zu beschränken, so daß die projizierte Fläche des Reaktionsvolumens 66 zwischen der Schicht 40 und dem Abstandshalter/Auflage 20 nicht gesehen wird. Der Abstandshalter/Auflage 20 kann von größerer Dicke sein als ein Reaktionsobjektträger ohne eine semipermeable Schicht, um genügend Raum für die semipermeable Schicht zu lassen, und zu erlauben, daß sich der Bereich des Reaktionsvolumens unterhalb der semipermeablen Schicht schnell füllt.
  • Eine weitere Variation ist es, Magnetpartikel in dem Reaktionsvolumen 66 zwischen der Schicht 40 und Basis 30 zu verwenden, um eine kontrollierte Konvektion zu schaffen, wenn die Magnetpartikel in einem oszillierenden Modus über das zeitveränderliche angelegte Magnetfeld angetrieben werden. Dies wird vollständiger später diskutiert und ist in Fig. 34 gezeigt.
  • Unterschiedliche beispielhafte Verfahren zum Einführen von erzwungenen Konvektionsströmen innerhalb des Reaktionsvolumens 66 eines Reaktionsobjektträgers 1 werden nun unter Bezugnahme auf die Fig. 31-34 beschrieben. Derartige erzwungene Konvektionsströme fördern schnelle und gründliche Mischung.
  • Fig. 31 zeigt eine alternative Anordnung zum Mischen. In dieser Abbildung ist ein Permanentmagnet 214 an der Abdeckung 10 befestigt und zu einer Auf/Ab Oszillation durch Elektromagnet 210 veranlaßt der durch ein elektrisches Treibersignal aus 212 versorgt wird. Die Abdeckung 10 bewegt sich zusammen mit dem Magneten 214 als im wesentlichen eine Einheit, periodische Änderungen in dem Volumen des Reaktionsvolumens 66 verursachend. Der Einfluß und Ausfluß von Flüssigkeit erzeugt mischen. Das sich hier ergebende Mischen ist gut geeignet zum Bewegen von Flüssigkeit in der Nachbarschaft der Abdeckungs/Flüssigkeitsinterphase. Um diesen Mischungstyp zu erreichen, kann die Abdeckung 10 aus einem dünnen paramagnetischen Material hergestellt sein, wobei der Bedarf für einen separaten Magneten 214 sich erübrigt. Wenn ein separater Magnet verwendet wird, kann er ringförmig (Doughnut-shaped) oder scheibenförmig sein. Er kann ebenfalls aus einem flexiblen keramischen Material hergestellt sein.
  • Fig. 32 zeigt eine Anordnung, welche noch eine andere Alternative zum Herstellen und Aufrechterhalten einer kontrollierten Konvektion innerhalb des Reaktionsvolumens 66 erzeugt. In diesem Fall wird eine Spule 216 verwendet, mit einein Stab 218 und einer Spule, die betrieben wird durch eine geeignete intermittierende unidirektionale oder zeitveränderliche Stromquelle 220 um Stab 218 gegen die Abdeckung 10 zu drücken und durchzubiegen.
  • In der in Fig. 33 gezeigten Alternative kann ein hervorstehendes Element 222 zur Verfügung gestellt werden, welches durch ein Loch 224 in einer umlaufenden Scheibe 226 hindurchtritt. Eine Spannungsfeder 228 spannt das vorstehende Element 222 nach unten vor wie es in der Zeichnung gezeigt ist. Ein Antrieb 230 bewegt anfänglich die Scheibe 226 nach unten um einen Kontakt zwischen dem Vorspringelement 222 und der Abdeckung eines Reaktionsobjektträgers herzustellen. Zu dieser Zeit drückt das vorstehende Element 222 gegen die Abdeckung 10 bei einem lokalisiertem Druckpunkt mit einer Kraft, deren Größe durch Feder 228 bestimmt wird. Anschließend dreht der Antrieb 230 die Scheibe 226 um deren Achse, wobei der lokalisierte Druckpunkt veranlaßt wird einem Kreis auf der oberen Oberfläche der Abdeckung 10 zu folgen. Die Abdeckung 10 erfährt entsprechend eine lokalisierte Durchbiegung, welche sich in einem kreisförmigen Muster bewegt, der Position des vorstehenden Elementes 222 folgend. Eine derartige lokalisierte Durchbiegung der Abdeckung 10 verursacht ein Mischen in dem Reaktionsvolumen 66. Es wurde herausgefunden, daß eine Durchbiegung von 0,005 Inch bei einer Polycarbonatabdeckung 10 durch eine Kraft von 3 OZS. erzeugt werden kann, angelegt mit einem vorstehenden Element 222 mit einem kreisförmigen Querschnitt von 0,100 Durchmesser und einem gerundeten Boden.
  • Noch ein anderer Ansatz zum Mischen (nicht gezeigt) ist es eine Abdeckung zu verwenden, welche hergestellt ist aus einem piezoelektrischen Material oder ein piezoelektrisches Material enthaltend, welches daran befestigt ist. In diesem Falle würde die Bewegung der Abdeckung piezoelektrisch durch Anlegen der geeigneten Spannung erzeugt.
  • Wie oben bemerkt, kann ein Reaktionsobjektträger gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Tests durchzuführen, in welchen die Ergebnisse gemessen werden unter Verwendung von nicht photometrischen Techniken. Dies bedeutet zusätzlich zur Transduktion von Lichtenergie (z. B. Transducer des photoleitenden Photodioden oder Photomultipliertyps), kann der Reaktionsobjektträger andere Mechanismen zu Energieumwandlung verwenden. Zusätzliche Transducertypen, die auf einem Reaktionsobjektträger gemäß der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, schließen kaloriemetrische Transducer, elektrochemische Transducer und Viskositätstransducer ein.
  • In Fig. 34 ist ein transversaler, vertikaler Querschnitt einer repräsentativen Ausführungsform eines Reaktionsobjektträgers, ähnlich zu der in Fig. 12 gezeigten, jedoch mit Magnetpartikeln 206 eingeschlossen innerhalb des Reaktionsvolumens 66. Ein Elektromagnet 196 wird in oszillierendem Modus betrieben (z. B. einfaches Ein-Aus zyklieren über eine Rechteckwelle) durch Treiberschaltung 199. Die Magnetpartikel, welche an oder nahe der Basis 30 gelegen sind, unterliegen einer Oszillation, wie früher in Fig. 1 abgebildet. Diese erzeugt einen kontrollierten Konvektions- oder Mischungseffekt. Das Mischen wird den Transport der Spezies zu und von der semipermeablen Schicht 40 erleichtern. Licht 43, welches durch die semipermeable Schicht 40 reflektiert wird und durch Photodetektor 121 erfaßt wird, wird die Bildung (oder den Verlust) von Farbe in der semipermeablen Schicht anzeigen. Da die Magnetpartikel nicht direkt durch den Photodetektor gesehen werden, wird kein Flackereffektsignal erfaßt werden, aufgrund der Zwischenanordnung der Membran und werden daher keine Artefakte in die Farbmessung über Reflexion einführen. Mit dem Fortschreiten des Tests tritt eine Farberzeugung (oder Änderung) auf, wie durch Reflexion bestimmt wird, wobei der Test wirksam überwacht werden kann bei schnelleren Reaktionsgeschwindigkeiten aufgrund der kotrollierten Konvektion. Damit diese kontrollierte Konvektion maximal wirksam ist, kann es notwendig sein die Feldstärke und Frequenz auf den besonderen durchzuführenden Test zuzuschneiden, so daß ein optimaler Transport von Spezies zu und von der semipermeablen Schichtoberfläche erzielt wird.
  • Wie oben bemerkt wurde, stellt ein erfindungsgemäßer Reaktionsobjektträger die Lagerung einer vorab gemessenen Reagenzmenge zur Verfügung. Eine Art des zur Verfügung stellens des Vorliegens eines Reagenzes wurde bereits beschrieben, bei welcher ein Flüssigreagenz in einem einzelnen Reaktionsvolumen angeordnet und dann getrocknet wird, so daß das Trockenreagenz die innneren Oberflächen des Reaktionsvolumens beschichten. Andere Verfahren werden jetzt beschrieben unter Bezugnahme auf die Fig. 36-38. In Fig. 36 ist ein Längsquerschnitt eines Bereiches eines Reaktionsobjektträgers 1, gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt. Dort ist eine Reagenz enthaltene Schicht 254, welche angeordnet ist an der Basis 30 in dem Bereich des Reaktionsvolumens 66. Falls erwünscht, kann die reagenzenthaltende Schicht 254 sich weiter nach links als gezeigt erstrecken, die Bereiche der abgeschrägten Wände 25, die Leitung 26 besetzend oder auch sich in die Probenvertiefung 64 erstreckend. Der verdeutlichte Reaktionsobjektträger ist von dem Typ, der über eine Schlitzöffnung (vent opening) in der Abdeckung 10 ventiliert. Eine Reagenzschicht 254 kann verwendet werden, jedoch mit jeder Ausführungs form.
  • Die Fig. 37 und 38 zeigen eine andere Ausführungsform 336 eines Reaktionsobjektträgers gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der Reaktionsobjektträger 336 mehrere Reaktionsvolumina aufweist, die mit einer Probe durch paralleles Füllen gefüllt sind. Unter den Verwendungen von Reaktionsobjektträgern 336 ist jener nützlich, welcher zwei Tests simultan durchführt unter Überwachung von gestreutem und durchgelassenen Licht. Ebenfalls in Fig. 37 und 38 ist eine Ausstattung gezeigt, welche nützlich ist beim Durchführen der Teste mit diesem Reaktionsobjektträger.
  • In Reaktionsobjektträger 336 wurden die Basis 30, der Abstandhalter und die Abdeckung 10 ausgeschnitten wie bei 338 gezeigt, um erste und zweite Beine 340, 342 zu bilden. Die Abdeckung 10 wird zur Verfügung gestellt mit einer Öffnung für die Probenvertiefung 64 und Öffnungen für jede der Schlitze 354, welche jeweils mit dem ersten Reaktionsvolumen 350 und dein zweiten Reaktionsvolumen 352 in Verbindung stehen. Der Abstandshalter ist ausgeschnitten, um die Probenvertiefung 64 zu bilden, und um die allgemeine Leitung 344 zu bilden, welche verzweigt um die erste und zweite verzweigte Leitung 346 und 348 zu bilden, wobei die verzweigten Leitungen jeweils zu den Reaktionsvolumina 350 und 352 führen. Wie aus den vorherigen Ausführungsformen ersichtlich ist, ist der Abstandshalter transparent, um innere Wellenleiter 27, den Reaktionsvolumina benachbart, zur Verfügung zu stellen. Es wird ersichtlich, daß eine Probe, welche in der Probenvertiefung 64 angeordnet wird, aufgrund der Kapillarwirkung durch die allgemeine Leitung 344 angezogen wird und dann geteilt wird, wobei sie durch die verzweigten Leitungen 346, 348 und in die Reaktionsvolumina 350, 352 fortschreiten.
  • Ebenfalls in den Fig. 37 und 38 gezeigt sind eine erste Lichtquelle 356, eine zweite Lichtquelle 358, ein erster Streudetektor 360, ein zweiter Streudetektor 362 und ein Transmissiondetektor 364. Lichtschild 366 schützt das zweite Reaktionsvolumen 352 vom Empfangen von Strahlung aus der ersten Lichtquelle 356. Man kann sehen, daß Licht aus den ersten und zweiten Quellen 356, 358 jeweils in ein erstes und zweites Reaktionsvolumen 350, 352 eintritt, wo ein Teil davon bei 9ºC gestreut wird, und durch die Basis 30 hindurchtritt, wonach das gestreute Licht bei 360 und 362 erfaßt wird. Der Transmissionsdetektor 364 erfaßt denjenigen Teil des Lichtes aus Quelle 358, welcher in dem Reaktionsvolumen 352 weder gestreut noch absorbiert wurde.
    • Beispiele Beispiel 1 t-PA-Test: Inhaltsstoffe:
  • (1.) 12 Mikroliter 0,80 mg/ml humanes Plasminogen
  • (2.) Mikroliter an 0,02 mg/ml Fragmente von humanem Fibirn
  • (3.) 10 Mikroliter von 0,1 M S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-pNa) erhalten von Helena Labaratories, verdünnt in Wasser.
  • Die Inhaltsstoffe wurden gemischt, zu dem Reaktionsobjektträger dazugefügt und gefriergetrocknet in Reaktionsobjektträgern enthaltend Membrankreisflächen.
  • Die Membranen wurden zuvor hergestellt durch Überschichten (oder Imprägnieren) eines herkömmlichen Materials (z. B. 0,45 Mikron Polysulfon (Gelman Sciences Tuffryn Membrane) mit einer 10% Lösung eines Polymers (z. B. Polyethylenglykol, durchschnittliches MG 3400). Weißmacher (z. B. Zinkoxid, Aldrich Chemical Company) kann der Beschichtung zugefügt werden. Getrocknete (47 Grad, 15 Minuten) Membranen wurden beschichtet mit einem Klebstoff (z. B. ein herkömmlicher Transferklebstoff wie beispielsweise ein Scotch 3M Transferband) und dann Kreisscheiben mit einem Papierlochstanzer ausgestanzt. Diese Membrankreisscheiben wurden an die Reaktionsobjektträgerabdeckung angeheftet.
  • Wenn 40 Mikroliter an mit Citrat verseztem Gesamtblut, Serum oder Plasma auf dem Reaktionsobjektträger angeordnet wurden, lösten sich die Reagenzien darin sofort auf und der flüssige Teil der Probe durchdrang rasch die Membran. Abhängend von der Konzentration der t-PA Intensität. Diese Farbänderung wurde erfaßt durch die Abnahme von reflektiertem Licht bei 400 Nanometern, wie gesehen werden kann in einer Auftragung der Photodetektorverstärkerspannung gegen die Zeit. Das Aufstellen einer nach unten gerichteten Steigung, nach einer anfänglichen Verzögerungsphase stellte eine nützliche Kinetikmessung der t-PA Konzentration wie in Fig. 41 gezeigt. Die Steigung oder gemessene Reaktionsgeschwindigkeit wurde gegen die tatsächliche t-PA Konzentration in der Gesamtblutprobe aufgetragen. Eine Standardkurve, welche durch eine Gerade abroxiiniert wurde, ergibt sich wie in Fig. 41b gezeigt. Diese Standardkurve könnte dann verwendet werden, um t-PA Konzentrationen in Gesmatblutproben (oder Serum oder Plasma) zu bestimmen, wenn man einmal die gemessene Reakionsgeschwindigkeit erhalten hat.
    • Beispiel 2 t-PA Test:
  • Ein ähnliches Experiment wurde durchgeführt. In diesem Fall wurden 10 ul .1M S-2251 auf Membrankreisscheiben luftgetrocknet, welche auf den oberen Enden der Objektträger angeheftet waren, bevor die oberen Enden auf die Objektträger gebracht wurden. Die verbleibenden Reagenzien wurden dann in dem Objektträger gefriergetrocknet. Die erhaltenen Ergebnisse waren ähnlich wie jene, welche in Beispiel 1 diskutiert wurden.
    • Beispiel 3 Plasminogen (gesamtverfügbares Plasmin) Test Reagenzien:
  • (1.) 10 Mikroliter 5000 IU/ml t-PA
  • (2.) 18 Mikroliter 0,1 M S-2251 (Helena Labs), verdünnt in Wasser.
  • Die Reagenzien wurden gefriergetrocknet in Reagenzienobjektträger, welche Membrankreisscheiben enthielten, die zuvor beschrieben wurden.
  • Abhängend von der Konzentration des Plasminogens in der Probe, nahm das Plasma eine gelbe Farbe unterschiedlicher Intentsität an. Wie in Beispiel 1 konnte die gemessene Geschwindigkeit erhalten werden und verwendet werden, um eine Standardkurve zu konstruieren zur Interpretation der Testdaten an Gesamtblutproben, wie in Fig. 42 gezeigt.
    • Beispiel 4 Freier Plasmintest Reagenz:
  • (1.) 28 Mikroliter 0,1 M S-2251 (Helena Labs) verdünnt in Wasser
  • Das Reagenz wurde gefriergetrocknet in Reagenzienobjektträger.
  • Abhängend von der Konzentration des freien Plasmins in der Probe, nahm das Plasma eine gelbe Farbe unterschiedlicher Intensität an. Die Ergebnisse waren ähnlich zu jenen, welche in Beispiel 3 gesehen wurden.
    • Beispiel 5 Alpha-2-Antiplasmintest: Reagenzien:
  • !File:ANM\CDOIOIB2] 01121994
  • (1.) 18 Mikroliter 0,3 CU humanes Plasinin (Ortho) aufgelöst in 50% Glycerin in 2 mmol/l HCl.
  • (2.) 10 Mikroliter 0,1 M 5-2251 (Helena Labs) aufgelöst in Wasser.
  • Die Reagenzien wurden gefriergetrocknet in Reagenzienobjektträgern.
  • Das Plasma nahm eine gelbe Farbe an, welche der Konzentration des Alpha-2-Antiplasmins in der Probe umgekehrt entsprach.
    • Gerinnsellysetestbeispiele
  • 1. Ein Objektträger wurde vorbereitet für endogene Gerinnsellyseüberwachung, enthaltend die folgende Mischung aus Reagenzien: Bovines Thrombin, 25 Einheiten/ml (Sigma Chemical Co.), verdünnt in Owen's Veronal Puffer; 10 mg/ml Fe&sub3;O&sub4; Partikel (durchschnittliche Größe 0,3 Mikron nach der Fisher Methode) und Plasminogen, 0,2 mg/ml gemischt mit Thrombin, um eine 0,2 mg/ml Konzentration zu erreichen. Die Reagenzien wurden zu einem Standardreaktionsobjektträger hinzugegeben. Der Objektträger wurde gefriergetrocknet, in Folie verpackt und unter Kühlbedingungen bis zur Verwendung gelagert. Wenn verwendet, wurde der Objektträger in einem Gerät zum Überwachen der Bewegung paramagnetischer Partikel angeordnet, wie woanders in der vorliegenden Patentanineldung beschrieben und automatisch auf eine Temperatur von 37ºC gebracht. Eine frische mit Citrat versetzte Gesamtblutprobe, enthaltend einen therapeuthischen Gehalt an Gewebsplasminogenaktivator (t-PA 1000 IU/ml) wurde in die Probenvertiefung gegeben. Das sich ergebende Signal zeigte Gerinnselbildung und nach ein paar Minuten anschließenden Beginn der Auflösung. In Fig. 43 ist die gesamte Wellenform gezeigt in willkürlichen Signalgröße(Spannung)-Einheiten gegen die Zeit gezeigt. Wie man sehen kann, ist die Wellenform stark in der Zeit komprimiert, so daß es nicht möglich ist, die einzelnen Peaks wie in Fig. 3 und 4 zu identifizieren. Der Gerinnselbildungsbereich (600) in Fig. 43 hat eine negative Steigung (601), welche proportional zu der Fibrinogenkonzentration in der Probe erscheint. Dies ist in Fig. 44a gezeigt. Zusätzlich zur Möglichkeit die Gerinnselbildung zu überwachen, wurde herausgefunden, daß eine Gerinnselauflösungsbeginnzeit 602 in Fig. 43 umgekehrt proportional zu der t-PA Konzentration, wie in Fig. 44b gezeigt, ist.
  • 2. Es wurde ein Objektträger hergestellt zur Überwachung der Empfindlichkeit der endogenen Gerinnsellyse. Der verwendete Objektträger war ein Standardreaktionsobjektträger wie in Beispiel 1 und enthielt dieselben Konzentrationen an Thrombin, paramagnetischen Partikeln und Plasminogen. Zusätzlich enthielten die Objektträger Reagenzien 400 IU rekombinantes t-PA. Der Objektträger wurde gefriergetrocknet wie in Beispiel 1 und auf eine ähnliche Art gelagert. Der Objektträger wurde in demselben Gerät wie in dem vorherigen Beispiel verwendet. Die Probe bestand aus frischem, mit Citrat versetztem Gesamtblut vor Anwendung einer thrombolytischen Therapie. Das sich ergebende Signal zeigte eine Gerinnselbildung, welche normal fortschritt und nach ein paar Minuten anschließend den Beginn der Gerinnselauflösung. Die Empfindlichkeit der Patienten auf Gerinnselauflösung durch t-PA für das verwendete System bei der verwendeten t-PA Konzentration war evident. Dieser Testtyp kann nützlich sein als ein Indikator der Empfindlichkeit auf Lyse oder als ein Screening Werkzeug.
  • 3. Ein Objektträger wurde hergestellt für einen Test auf eine exogene Gerinnselauflösung (oder standardisierter Gerinnselauflösungstest) bestehend aus Reagenzien, welche auf einem Reaktionsobjektträger in dem ersten Stadium luftgetrocknet waren und in dem zweiten Stadium gefriergetrocknet waren. Reagenzien, welche in dem ersten Stadium zu dem Reaktionsobjektträger zugegeben wurden, waren bovines Thrombin; 30 U/ml und Fe&sub3;O&sub4; Partikel, 15 mg/ml. Nach dem Trocknen wurden Fibrinogen, 2 mg/ml und Plasminogen, 0,02 mg/ml der endgültigen Lösung zugefügt. Nachdem eine Gerinnselbildung erreicht war, wurde der Objektträger gefriergetrocknet. Der Objektträger wurde dann angeordnet in einem Gerät wie in den vorherigen Beispielen und eine Probe an frischem, mit Citrat verseztem Gesamtblut, enthaltend t-PA wurde in die Probenvertiefung gegeben. Eine Wellenform, ähnlich jener die in Fig. 43 gezeigt ist, ergab sich. Es wurde herausgefunden, daß der Zeitpunkt des Beginns der Gerinnselauflösung umgekehrt proportional der t-PA Konzentration in der Probe war, wie in der Standardkurve in Fig. 46a gezeigt. Der Test wurde wiederholt unter Verwendung von Plasma aus derselben mit Citrat versezten Probe mit ähnlichen Ergebnissen wie in Fig. 46b gezeigt.
  • 4. Es wurde ein Objektträger hergestellt wie in Beispiel 3, ausgenommen, daß Plasminogen weggelassen wurde und Streptokinase im ersten Stadium hinzugefügt wurde. Der sich ergebende Objektträger wurde in einem Gerät wie in den vorhergehenden Beispielen angeordnet und eine Probe an frischem, mit Citrat versetzein Gesamtblut, enthaltend Plasminogen wurde in die Probenvertiefung gegeben. Es wurde herausgefunden, daß die Zeit des Beginns der Gerinnselauflösung umgekehrt proportional der Plasminogenkonzentration der Probe war.
  • 5. Es wurde ein Objektträger hergestellt für einen exogenen "Gerinnsel"-Auflösungstest für Plasminogen oder Plasminogenaktivator unter Verwendung von quervernezten Caseinmolekülen. Für einen Plasminogenaktivatortest wurde Plasminogen zu dem Objektträgerinhalt hinzugefügt. Für einen Plasminogentest wurde t-PA oder Streptokinase hinzugegeben und Plasminogen weggelassen. Casein (Eastman Kodak) wurde aufgelöst, maximal in 0,1 molarer Natriumhydrogencarbonatlösung, zu welche 45 Milligramm an Fe&sub3;O&sub4; Partikel und 0,2 g an EDC (Sigma Chemical Co., Carbodiimid Quervernetzungsreagenz) hinzugefügt wurden und bei Raumtemperatur für 30 Minuten gemischt. Die sich ergebende Lösung wurde auf Reaktionsobjektträgerböden ausgebreitet, wenn die Objektträger zusammengebaut wurden, luftgetrocknet und verwendet, wie in den vorherigen Beispielen für Gesamtbluttests, einer Korrelation zwischen Lysezeit, wie angezeigt durch paramagnetische Partikelbewegung und Plasminogenaktivator und Plasminogenkonzentration wurden herausgefunden.
    • Blutgerinnungstestbeispiele
  • 1. Reaktionsobjektträger wie in Fig. 17 gezeigt, wurden hergestellt unter Verwendung eines partiellen Thromboplastinreagenzes, Calcium und einen anderen Aktivator und gefriergetrocknet, um APTT Trockenreagenz herzustellen. Die Objektträger wurden unter Kühlbedingungen gelagert bis sie verwendet wurden, um die aktivierten partiellen Thromboplastinzeittests durchzuführen. Diese Tests waren einstufige APTT, im Gegensatz zu herkömmlichen Labortests, welche zweistufige Verfahren verwendeten, wobei die erste Stufe aus einer 5 minütigen Inkubation vor der Calciumzugabe bestand.
  • Fig. 48 zeigt eine Auftragung der APTT Vergleichsstudie. Trockenchemische Objektträger für einen einstufigen APTT-Test unter Verwendung eines Coag-I Prototypsystems wurden getestet und mit dein Referenzverfahren verglichen. Dasselbe Referenzgerät und Pacific Hemostasis Reagenz für APTT wurden verwendet durch das Referenzlaboratorium. Die Ergebnisse waren sehr ermutigend, wie man aus den Daten sehen kann. Das einstufige APTT-Verfahren, wie man anhand dieser Daten sehen kann, korrelierte gut mit dem zweistufigen Referenzverfahren. Obwohl das einstufige Verfahren längere Reaktionszeiten aufweist, ist die Gesamttestzeit kürzer, da der 5-Minuten Inkubationsschritt nicht notwendig war. Der Einstufentest ist auch einfacher durchzuführen. Falls erwünscht können die Einstufenendpunkte auch elektronisch eingestellt werden, um wie zuvor erklärt wurde, als zweistufige Equivalenzpunktwerte ausgegeben zu werden.

Claims (59)

1. Ein Verfahren zur Durchführung eines Koagulationstestes an einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe, umfassend:
(i) Hinzufügen einer zweiten Testkomponente zu einer ersten Testkomponente, wobei die erste Testkomponente ein trockenes Koagulationstestreagenz umfaßt, welches kein Prothrombinzeittestreagenz ist, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und Magnetpartikel in inniger Vermischung damit enthaltend, wobei die zweite Komponente ein Gesamtblut oder Plasma ist, und wobei die erste Komponente (ia) einem oszillierenden Magnetfeld, (ib) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (ic) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld ausgesetzt wird; und
(ii) Überwachung der Bewegung, welche in den Magnetpartikeln durch (ia) oder (ib) oder (ic) induziert wird, um die Koagulationstestmessung zu erhalten.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, welches umfaßt: Zufügen der Probe zu einem Element, welches eine Kanalstruktur umfaßt, die eine Probenvertiefung und ein Reaktionsvolumen in Fluidverbindung miteinander definiert, wobei das Reaktionsvolumen die erste Komponente enthält, die Kanalstruktur eine Geometrie aufweist, welche eine Probe dazu veranlaßt, welche in der Probenvertiefung angeordnet wird, in das Reaktionsvolumen über eine Kapillarwirkung gezogen zu werden und es zu füllen, wobei, nachdem das Reaktionsvolumen gefüllt ist, die Probe stationär darin verbleibt.
3. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Element ferner ein Mittel zum Kanalisieren von Licht aus einer äußeren Quelle zu dem Reaktionsvolumen umfaßt.
4. Das Verfahren nach Anspruch 3, ferner umfassend das Verwenden eines Mittels zum Erfassen von gestreutem oder absorbiertein oder reflektiertem Licht aus dein Reaktionsvolumen.
5. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Element angeordnet ist in naher Nachbarschaft zu einem Permanentmagneten und zu einem Elektromagneten, wobei Bewegung der Magnetpartikel bewirkt wird durch ein oszillierendes magnetisches Feld, welches durch den Elektromagneten erzeugt wird.
6. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Element zwischen dem Permanentmagneten und dem Elektromagneten gelegen ist.
7. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Koagulationstest ein Gerinnungstest ist.
8. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei (i) der Koagulationstest ein Gerinnselauflösungstest ist, (ii) die zweite Komponente eine abgemessene Menge eines Gesamtblut- oder Plasmagerinnselauflösungsreagenzes oder eine Probe, enthaltend eine Gesamtblut- oder Plasmagerinnselauflösungskomponente und (iii) die erste Komponente ein Gesamtblut- oder Plasmagerinnsel ist, welches Magnetpartikel enthält.
9. Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Gerinnselauflösungstest ein Gewebsplasminogenaktivatortest ist.
10. Ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnselauflösungstests an einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe, enthaltend biochemische Komponenten, welche in eine Gerinnselauflösung oder Aktivierung oder Inhibierung der Gerinnselauflösung involviert sind, umfassend:
(i) Zugeben einer abgemessenen Menge der Probe zu einem Trockenreagenz, welches angeordnet ist in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und ein Fibringerinnsel mit Magnetpartikeln in inniger Vermischung damit enthält, wobei das Reagenz, welches Magnetpartikel enthält, (ia) einem oszillierenden Magnetfeld, (ib) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (ic) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld ausgesetzt wird; und
(ii) Überwachung der Bewegung der Magnetpartikel, induziert durch (ia), (ib) oder (ic).
11. Ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnselauflösungstestes, umfassend:
Inkontaktbringen einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe mit einer trockenen Zusammensetzung, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und enthaltend wenigstens ein Gesamtblut- oder Plasmagerinnsel erzeugendes Reagenz und Magnetpartikel in inniger Vermischung mit der Zusammensetzung, um ein Gerinnsel, welches Magnetpartikel enthält, zu erhalten; dann
(ii) Zugeben eines Gesamtblut- oder Plasmagerinnselauflösungstestreagenzes zu dem Gerinnsel, wodurch die Gerinnselauflösungstestinessung initiiert wird und optisches Überwachen der Bewegung in den Magnetpartikeln, induziert durch (ia) ein oszillierendes Magnetfeld, (ib) ein sich bewegendes permanentes Magnetfeld oder (ic) eine Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld.
12. Ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnselauflösungstestes, umfassend:
In-Kontakt-Bringen einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe und einer trockenen Zusammensetzung, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau, enthaltend wenigstens ein Gesamtblut- oder Plasmagerinnsel erzeugendes Reagenz und Magnetpartikel in inniger Vermischung damit, wobei man (a) einem oszillierenden Magnetfeld, (b) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (c) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären Magnetfeld aussetzt, wobei die Probe oder die trockene Zusammensetzung ein Gerinnseltestauflösungsreagenz umfaßt, wodurch die Gerinnselauflösungstestmessung und das Bilden eines Gerinnsels, welches Magnetpartikel enthält, initiiert wird und anschließend erlaubt man, daß die Auflösung des Gerinnsels durch das Gerinnselauflösungstestreagenz fortschreitet, wodurch man die Gerinnselauflösungstestmessung durch Überwachung der Bewegung der Magnetpartikel erhält.
13. Ein Verfahren zum Durchführen eines Gerinnselauflösungstests an einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe, enthaltend biochemische Komponenten, die in die Gerinnselbildung oder in die Aktivierung oder Inhibierung der Gerinnselauflösung verwickelt sind, umfassend::
In-Kontakt-Bringen einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe und eines Fibringerinnsels, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und enthaltend Magnetpartikel in inniger Vermischung damit, wobei das Gerinnsel (a) einem oszillierenden Magnetfeld, (b) einem sich bewegenden permanenten Magnetfeld oder (c) einer Kombination aus einem oszillierenden Magnetfeld und einem stationären permanenten Magnetfeld ausgesetzt wird, wodurch die Gerinnselauflösungstestmessung initiiert wird, und wobei die Bewegungen der Magnetpartikel überwacht werden.
14. Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Probe ein Gerinnselauflösungstestreagenz enthält.
15. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Probe Gesamtblut ist.
16. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Probe Plasma ist.
17. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Magnetpartikel zur Bewegung veranlaßt werden durch Anlegen eines oszillierenden Magnetfeldes daran.
18. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Magnetpartikel zum Bewegen veranlaßt werden durch Anlegen eines sich bewegenden permanenten Magnetfeldes daran.
19. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Trockenreagenz ein Thromboplastincalciumreagenz ist.
20. Ein Verfahren zum Durchführen eines Koagulationstestes, umfassend:
(i) Man setzt einem oszillierenden Magnetfeld ein Reaktionselement aus, welches (1) eine Probenvertiefung zum Aufnehmen einer Gesaintblut- oder Plasmaprobe und (2) eine Reaktionskammer trägt, welche ein trockenes Koagulationstestreagenz enthält, welches kein Prothrombinzeittestreagenz ist, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Format und welches Magnetpartikel in inniger Vermischung damit enthält, wobei die Probenvertiefung und Reaktionskammer in Fluidverbindung über eine Transportzone einer solchen Geometrie steht, daß ein Probenvolumen, welches in der Probenvertiefung angeordnet wird, von der Probenvertiefung zu der Reaktionskammer transportiert wird;
(ii) Hinzufügen einer Gesamtblut- oder Plasmaprobe, welche auf Koagulation empfindlich ist, zu der Probenvertiefung, wobei das Reagenz aufgelöst wird und die Partikel freigesetzt werden, um sich in einem oszillierenden Muster zu bewegen, welches durch das oszillierende Magnetfeld induziert wird; und
(iii) optisches Überwachen der Reaktionskammer, um Kinetiken für den Koagulationstest zu messen, welche Änderungen im Grad der Partikelbewegung relativ zu dem Magnetfeld entsprechen.
21. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 oder 20, wobei das Trockenkoagulationstestreagenz ausgewählt wird aus:
(1) einem partiellen Thromoplastinreagenz und Calciumchlorid;
(2) einem partiellen Thromoplastinreagenz, Calciumchlorid und einem Aktivator;
(3) Thrombin oder einem Schlangengift mit thrombotischer Wirkung;
(4) einem Fibringerinnsel oder Plasminogen und einem Fibringerinnsel;
(5) einem Plasminogenaktivatortestreagenz, enthaltend (a) Plasminogen und (b) entweder Fibrin, ein Schlangengift mit thrombotischer Wirkung oder Thrombin;
(6) einem Plasminogentestreagenz, enthaltend (a) einen Plasminogenaktivator und (b) entweder Fibrin, ein Schlangengift mit thrombotischer Wirkung oder Thrombin;
(7) einem natürlichen oder synthetischen Plasminogenaktivator; und
(8) einem α-2-Antiplasmintestreagenz, enthaltend Fibrin und Plasmin.
22. Das Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 oder 20, wobei das Trockenkoagulationstestreagenz ein Thrombinreagenz oder ein Gerinnsel erzeugendes Reagenz ist.
23. Ein Element zum Durchführen eines Koagulations- oder Gerinnselauflösungstestes oder eines Testes auf Gerinnungsparameter an einer flüssigen Probe, wobei das Element eine Kanalstruktur darin umfaßt, welche eine Probenvertiefung und ein Reaktionsvolumen in Fluidverbindung miteinander definiert, wobei das Reaktionsvolumen wenigstens ein Trockentestreagenz enthält, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und Magnetpartikel in inniger Vermischung damit enthaltend, und wobei das Reaktionsvolumen definiert wird durch eine obere Oberfläche mit daran angehefteter semipermeabler Schicht zum Signalisieren des Eingangs der Probe in das Reaktionsvolumen mittels einer Änderung von deren Reflektion, wobei die Kanalstruktur eine Geometrie aufweist, welche eine flüssige Probe dazu veranlaßt, wenn in der Probenvertiefung angeordnet, in das Reaktionsvolumen über eine Kapillarwirkung gezogen zu werden und es aufzufüllen und wobei, nachdem das Reaktionsvolumen aufgefüllt worden ist, die Flüssigkeit stationär verbleibt.
24. Das Element nach Anspruch 23, wobei die semipermeable Schicht ein Mittel zum Überwachen einer Reaktion in dem Reaktionsvolumen ist.
25. Das Element nach Anspruch 23 oder 24, wobei wenigstens ein Trockentestreagenz in der semipermeablen Schicht enthalten ist.
26. Das Element nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 25, wobei das Element wenigstens eine Trockentestreagenzschicht umfaßt, welche an der Oberfläche der semipermeablen Schicht gelegen ist, welche nicht an einer transparenten Oberfläche befestigt ist.
27. Das Element nach Anspruch 26, wobei das Trockentestreagenz wenigstens ein Enzym enthält.
28. Das Element nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 27, wobei die semipermeable Schicht hergestellt ist aus einer oder mehreren dünnen Schichten aus einem Gel oder einer Membran, wobei jede Gel- oder Membranschicht wenigstens ein trockenes Testreagenz enthält.
29. Das Element nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 28, wobei die semipermeable Schicht aus einer dünnen Gelschicht oder einer Mehrschichtgelstruktur oder einer herkömmlichen Nichtgelmembran mit einer dünnen Gelschicht oder Mehrfachschicht-Gelstruktur daran angeheftet besteht.
30. Das Element nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 29, wobei die obere Oberfläche daran angeheftet eine Mehrzahl an semipermeablen Schichten aufweist, so daß jede Schicht getrennt an die obere Oberfläche angeheftet ist und in der Lage ist, als ein separates Mittel zum Überwachen einer Reaktion verwendet zu werden.
31. Das Element nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 30, wobei die semipermeable Schicht oder eine Mehrzahl der semipermeablen Schichten angeheftet ist an die obere Oberfläche, wobei die semipermeable Schicht oder jede der Mehrzahl der semipermeablen Schichten in der Lage ist, zum Überwachen einer Reaktion verwendet zu werden.
32. Das Element nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 31, wobei das trockene Testreagenz ein Trockenkoagulationstestreagenz, wie in Anspruch 21 definiert ist, ist.
33. Das Element nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 32, wobei das Trockentestreagenz kein Prothrombinzeittestreagenz ist.
34. Das Element nach Anspruch 33, wobei das Trockentestreagenz ein Thrombinreagenz oder Gerinnselerzeugungsreagenz ist.
35. Ein trockenes Koagulationstestreagenz, enthaltend Magnetpartikel in inniger Vermischung damit, wobei das Reagenz ausgewählt ist aus:
(1) einem partiellen Thromboplastinreagenz und Calciumchlorid;
(2) einem partiellen Thromboplastinreagenz, Calciumchlorid und einem Aktivator;
(3) Thrombin oder einem Schlangengift mit thrombotischer Wirkung;
(4) einem Fibringerinnsel oder Plasminogen und einem Fibringerinnsel;
(5) einem Plasminogenaktivatortestreagenz, enthaltend (a) Plasminogen und (b) entweder Fibrin, ein Schlangengift mit thrombotischer Wirkung oder Thrombin;
(6) einem Plasminogentestreagenz, enthaltend (a) einen Plasminogenaktivator und (b) entweder Fibrin, ein Schlangengift mit thrombotischer Wirkung oder Thrombin;
(7) einem natürlichen oder synthetischen Plasminogenaktivator; und
(8) einem α-2-Antiplasmintestreagenz, enthaltend Fibrin und Plasmin.
36. Das Reagenz nach Anspruch 35, wobei das Reagenz ein partielles Thromboplastinreagenz und Calciumchlorid ist.
37. Das Reagenz nach Anspruch 35, wobei das Reagenz ein partielles Thromboplastinreagenz, Calciumchlorid und ein Aktivator ist.
38. Das Reagenz nach Anspruch 35, wobei das Reagenz Thrombin oder ein Schlangengift mit thrombotischer Wirkung ist.
39. Das Reagenz nach Anspruch 35, wobei das Reagenz ein Fibringerinnsel, Plasminogen und ein Fibringerinnsel, ein Schlangengift mit thrombinähnlicher Wirkung oder Thrombin ist.
40. Das Reagenz nach Anspruch 35, umfassend entweder ein Schlangengift mit thrombotischer Wirkung oder eine Kombination des Schlangengiftes mit thrombotischer Wirkung und Thrombin.
41. Das Reagenz nach Anspruch 35, wobei das Reagenz ein Plasminogentestreagenz ist, enthaltend (a) einen Plasminogenaktivator und (b) entweder Fibrin, ein Schlangengift mit thrombotischer Wirkung oder Thrombin.
42. Das Reagenz nach Anspruch 35, wobei das Reagenz Streptokinase oder Urokinase ist.
43. Das Reagenz nach Anspruch 35, wobei das Reagenz einen natürlichen oder synthetischen Gewebsplasminogenaktivator umfaßt.
44. Das Reagenz nach Anspruch 35, wobei das Reagenz ein α- 2-Antiplasmintestreagenz, enthaltend Fibrin und Plasmin ist.
45. Das Reagenz nach Anspruch 35, wobei das Reagenz Thrombin oder ein Schlangengift mit thrombotischer Wirkung umf aßt; und einen natürlichen oder synthetischen Plasminogenaktivator.
46. Das Reagenz nach Anspruch 35, wobei das Reagenz Streptokinase, Gewebsplasminogenaktivator oder Urokinase umfaßt.
47. Ein Kit zum Durchführen eines Koagulationstestes, umfassend einen Permanentmagneten, Zeitmeßmittel und ein Element, welches wenigstens ein Trockenkoagulations testreagenz umfaßt, welches kein Prothrombinzeittestreagenz ist, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Format und Magnetpartikel in inniger Vermischung damit enthaltend.
48. Der Kit nach Anspruch 47, ferner umfassend eine Transferpipette.
49. Ein Kit nach Anspruch 47 oder 48, wobei das Trockenkoagulationstestreagenz ein solches ist, wie in irgendeinem der Ansprüche 35 bis 46 definiert.
50. Ein Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 47 bis 49, wobei das Trockenkoagulationstestreagenz ein Thrombinreagenz oder Gerinnsel erzeugendes Reagenz ist.
51. Ein System zum Durchführen einer Koagulationstestmes-Sung, umfassend:
(i) Ein Instrument mit einem Mittel zur Temperatursteuerung, ein Mittel zum Erzeugen eines oszillierenden Magnetfeldes oder zum Bewegen eines permanenten Magnetfeldes, einem Beleuchtungsmittel und einem fotometrischen Überwachungsmittel; und
(ii) einem Element zum Durchführen des Koagulationstestes, wobei das Element eine Kanalstruktur umfaßt, welche eine Probenvertiefung und ein Reaktionsvolumen in Fluidverbindung miteinander definiert, wobei die Kanalstruktur eine Geometrie aufweist, welche eine flüssige Probe, die in der Probenvertiefung angeordnet wird, dazu veranlaßt, in das Reaktionsvolumen über eine Kapillarwirkung gezogen zu werden und es zu füllen, wobei das Reaktionsvolumen wenigstens ein Trockenkoagulationstestreagenz umfaßt, welches kein Prothrombinzeittestreagenz ist, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau und Magnetpartikel in inniger Vermischung damit enthaltend.
52. Das System nach Anspruch 51, ferner umfassend eine Transferpipette.
53. Das System nach Anspruch 52, wobei die Transferpipette hergestellt ist aus einem im wesentlichen nicht-thrombogenen Material, ein geöffnetes Ende umfaßt, in der Lage ist, mit einer flüssigen Probe durch Kapillarwirkung gefüllt zu werden und in der Lage ist, die flüssige Probe mittels Druck nach Abdecken oder Versiegeln des geöffneten Endes auszustoßen.
54. Das System nach irgendeinem der Ansprüche 51 bis 53, wobei das Gerät ferner umfaßt ein Heizmittel, umfassend einen Widerstandsheizstreifen und einen Thermistor, gelegen in naher Nachbarschaft zu dem Element.
55. Das System nach irgendeinem der Ansprüche 51 bis 54, wobei das Element geeignet ist zum Durchführen eines Gesamtblutkoagulationstestes, die Kanalstruktur eine Geometrie aufweist, welche eine Blutprobe, welche in der Probenvertiefung angeordnet wird, dazu veranlaßt, in das Reaktionsvolumen über eine Kapillarwirkung gezogen zu werden und es zu füllen, wobei, nachdem das Reaktionsvolumen gefüllt ist, die Blutprobe stationär darin verbleibt und wobei das Element an sich selbst angehängt oder befestigt optisch oder magnetisch codierte Kalibrierungs und/oder Qualitätskontrollinformation aufweist, um bei der Durchführung des Testes behilflich zu sein, wobei die Information durch das Gerät lesbar ist.
56. Das System nach irgendeinem der Ansprüche 51 bis 55, wobei die Beleuchtungsmittel ein oder mehrere Lichtquellen einschließen und wobei die fotometrischen Überwachungsmittel einen oder mehrere Detektoren für fotometrisches Überwachen chromogener oder chromomodulierender Spezies, welche in dem Reaktionsvolumen vorliegen, umfassen.
57. Ein System zum Durchführen eines Koagulationstests, umfassend:
(i) ein Reaktionselement, umfassend (1) eine Probenvertiefung zum Aufnehmen einer flüssigen Probe und (2) eine Reaktionskammer, enthaltend ein Trockenkoagulationstestreagenz, welches kein Prothrombinzeittestreagenz ist, angeordnet in einem im wesentlichen abgeflachten Aufbau, enthaltend Magnetpartikel in inniger Vermischung damit;
(ii) die Probenvertiefung und die Reaktionskammer in Fluid-Verbindung durch eine Transportzone einer solchen Geometrie miteinander stehend, daß ein Volumen der flüssigen Probe, welche in der Probenvertiefung angeordnet wird, von der Probenvertiefung zu der Reaktionskammer transportiert wird;
(iii) Mittel zur optischen Überwachung der Reaktionskammer; und
(iv) Mittel, um die Reaktionskammer einem oszillierenden Magnetfeld auszusetzen; wodurch, wenn die Probe in die Reaktionskammer eingeführt wird, das Trockenkoagulationstestreagenz aufgelöst wird, und die Magnetpartikel hierdurch freigesetzt werden, um sich in einem oszillierenden Muster zu bewegen, welches durch das oszillierende Magnetfeld induziert wird, wodurch eine Messung der Kinetiken des Koagulationstestes zur Verfügung gestellt wird, welche Änderungen im Grad der Magnetpartikelbewegung relativ zu dem oszillierenden Magnetfeld entsprechen.
58. Das System nach irgendeinem der Ansprüche 51 bis 57, wobei das Trockenkoagulationstestreagenz ein solches ist wie in irgendeinem der Ansprüche 35 bis 46 definiert.
59. Das System nach irgendeinem der Ansprüche 51 bis 58, wobei das Trockenkoagulationstestreagenz ein Thrombinreagenz oder Gerinnsel erzeugendes Reagenz ist.
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