JPH03504076A - 乾燥化学試薬及び常磁性粒子を使用する、正確、迅速かつ簡単な凝固アッセイ実施方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乾燥化学試薬及び常磁性粒子を使用する、正確、迅速かつ簡単な凝固アッセイ実 施方法 技術分野： 本発明は凝固アッセイ例えば診断用アッセイ（医学的診断）を手軽に実施する方 法に関する。

従来技術： 本明細書中、「凝固アッセイ」という用語は、　（ｉ）血餅形成または血餅生成 アッセイ、（ｉｉｌ　血餅溶解ア・ツセイ、及び（ｉｉｉｌ血餅形成パラメータ アッセイを含む種類のア・ソセイを表すように用いている。

臨床アッセイとして使用されている血液凝固反応では一般にフィブリン血餅形成 に要する時間を測定する。これら反応の最も一般的なものはプロトロンビン時間 テストである。

プロトロンビン時間アッセイで血餅形成を測定するには沢山の方法がある。これ らの血餅形成によるアッセイはいずれもトロンボプラスチンを使用して患者血液 試料と反応させる。利用できる方法により、いつ血餅形成が起こったかを検出す るために使用する方法が異なる。また、使用する装置の型並びに試薬の成分及び ／または添加剤も異なる可能性がある。

血液血餅形成アッセイは主としてスクリーニング、診断及び抗凝血剤投与中の患 者のモニターに使用する。多くの型の凝固アッセイがあり、プロトロンビン時間 （ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＰＴ）、活性化トロンボプラスチン 時間（ＡＰＴＴ）　、フィブリノーゲンアッセイ、トロンビン血餅形成時間（Ｔ ＣＴ）、活性化血餅形成時間（ＡＣＴ）等を含んでいる。この中で最もよ〈実施 されているのはプロトロンビン時間である。

プロトロンビン時間（ＰＴ）測定は主としてワーファリンのような経口の抗凝血 剤を投与されている患者のモニターに使用されている。血餅形成（血栓形成）の 再発を予防し、自然の出血を防止に充分活性のある凝固機構を維持するためには 、これらの患者での凝固を正確にモニターすることが重要である。プロトロンビ ン時間テストにより薬剤投与量を調整し、薬剤による疾患管理をより良好にする ための情報が得られる。

従来の方法では、血漿試料に液体試薬を添加してＰＴアッセイを実施する。試薬 は一般に乾燥した形で供給され、主として組織トロンボプラスチン及び塩化カル シウムからなる。使用前に測定した蒸留水を乾燥試薬に加えて再構成する。

これら試薬は熱感受性であり、使用前は冷蔵する必要がある。

乾燥状態の試薬の有効期間は１〜２年である。しかし、再構成したときには試薬 はかなり不安定となり、２〜３時間で使用しないときには廃棄しなければならな い。再構成した試薬を２〜３日冷蔵保存できることもある。

試料と試薬とを３７℃で混合し、知覚できる血餅（または「ゲル血餅」）が検出 されるまで反応の進展をモニターすることによってプロトロンビン時間アッセイ を実施する。ゲル血餅の形成が反応の終点である。この終点は種々の方法、すな わち粘度変化、電極反応及び最も一般的には光度測定により検出できる。

一般に、テスト結果を正常（対照）血漿を使用した結果と比較する。

テスト実施前に、血液試料を抗凝血剤（クエン酸塩）含有の試験管またはシリン ジに集める。血液試料を遠心し、血漿を（例えば傾漠により）赤血球から分離す る。正確に測定した（通常は０．１ｍ１）血漿を反応容器またはキュベツトにピ ペットで入れる。次に、被測定量の試薬を、ピペットにて手動で、または予め設 定した既知量の試薬を測定できる他の容量分配系で自動的に加える。あるいは、 試料を直接試薬に加えることもできる。

一般に、０．２ｍｌの試薬を使用する。試薬の添加により反応が始まる。現存の 血液血餅形成アッセイ特にＰＴアッセイのいずれにも次の欠点が少なくとも１つ ある：実施の困難さ；高度に訓練した人材の必要性；測定の不正確さ；試薬の不 安定性；試薬の大量消費など。

従って、例えば医療用の、血液血餅形成アッセイを実施するための簡便、容易か つ正確な方法が非常に必要であると感じられる。このような方法は試料または試 薬のいずれかの処理が最少限となるものがよい。このような方法は臨床検査の集 中的訓練を受けていない人でも容易に使用でき、試料または試薬含有溶液の調整 を必要としないのが理想的である。試薬の不安定性の問題がなく、非常に正確で あるべきである。試料と試薬とを効果的に混合できるとよい。試料はほんの少量 しか必要としないとよい。そして、試料を自動的に処理できるとよく、例えば、 血液試料の遠心分離や他のいずれのオフライン細胞分離を必要としないとよい。

使用可能な血餅溶解アッセイや血餅形成パラメータアッセイも同様に顕著な欠点 を有している。

血餅形成パラメータアッセイは、本明細書では、終点を得るために血餅形成また は血餅溶解を使用しない、広範な凝固診断における、機能及び構造に基づくアッ セイを意味している。これらアッセイのほとんどは凝固に関与する分子マーカー または特定要素もしくは成分を定量するために発色性合成物質を使用する。これ らは典型的には官能性反応に基づくアッセイであり、大多数のイムノアッセイ、 即ち同じ分子を検出できるが構造認お検出してしまう可能性のあるアッセイとは 対照的である。本発明は限定的にイムノアッセイに関与するものではないが、一 般的には均質な発色性及び蛍光性イムノアッセイに適用できる。

発明の開示 従って、本発明の目的は血餅形成もしくは血餅溶解または血餅形成パラメータア ッセイを実施する簡便で容易な方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は血餅形成もしくは血餅溶解または血餅形成パラメータ アッセイを実施する容易で正確な方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は非常に正確な血餅形成もしくは血餅溶解または血餅形 成パラメータアッセイを実施する方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は試薬含有溶液の調製を必要としない凝固アッセイを実 施する方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は試薬の不安定性に関係する問題を最小限にした凝固ア ッセイを実施する方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は非常に正確で再現性のある凝固アッセイを実施する方 法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は非常に精密な凝固アッセイを実施する方法を提供する ことである。

本発明のもう一つの目的は試料と試薬とを効果的に混合できる凝固アッセイを実 施する方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的はほんの少量の試料しか必要としない凝固アッセイを実 施する方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は容易で正確な診断用凝固アッセイの実施を可能にする 新規な部材を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、乾燥試薬から試薬溶液を調製する必要のない診断用 凝固アッセイに使用できるような部材を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、最小限の試料操作で、試料の正確で再現性のある凝 固アッセイの実施を可能にするような部材を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、最小限の試料操作で、試料の精密な凝固アッセイの 実施を可能にする新規部材を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、アッセイの実施に試料または試薬の測定を必要とし ない診断用凝固アッセイを実施するための新規な部材を提供することである。

本発明のもう一つの目的は最適な精度が得られる診断用凝固アッセイを実施する ための新規な部材を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、試料と試薬とを効果的に混合することができる診断 用凝固アッセイを実施するための新規な部材を提供することである。

本発明のもう一つの目的はほんの少量の試料しか必要としない診断用凝固アッセ イを実施するための新規な部材を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、血漿から赤血球を分離することなく全血についてア ッセイを実施できる診断用凝固アッセイを行うための新規の部材を提供すること である。

本発明の目的は凝固アッセイ用の新規な試薬を提供することである。

驚くべきことに、これらの目的そして以下の発明の説明から明らかになるであろ う他の目的の全てが、凝固または血餅溶解アッセイを実施する本発明方法の発見 により満たされた。

本発明は血餅形成時間、血餅溶解時間及び血餅形成パラメータの測定に使用でき る。本発明の基本的側面では、本発明が提供するアッセイは次のステップからな る。磁気粒子を有するアッセイの第一成分を、反応保持手段例えば実質的に平ら な表面のもの、反応スライドまたはマイクロタイタープレート上に置く。次に、 第一成分を、（１）振動（状態の）静止磁場または（２）運動（状態の）永久磁 場または（３）振動磁場と静止永久磁場の組合せの作用にかける。次に、アッセ イの第二成分を第一成分に加え、磁気粒子に対する磁場または運動性永久磁石の 作用をモニターする。

本発明の一つの面では、本方法を血液凝固アッセイの実施に使用する。その用途 には次の順序のステップを使用する：（１１測定した量のアッセイすべき液体試 料を、　（ｉ）磁気粒反応保持手段例えば実質的に平らな表面のもの、反応スラ イドまたはマイクロタイタープレートに加え、ここで、この組合せは実質的に分 散したまたは実質的に平らにした形態で配置されており； （２）　　前記組合せを、（１）振動磁場または（２）運動永久磁場または（３ ）振動磁場と静止磁場の組合せにかけ；そして（３）　　磁気粒子の動きをモニ ターする。

もう一つの面では、本発明方法を血餅溶解アッセイに使用する。この用途では、 次の順序のステップを使用する：（１）　　磁気粒子を有し、反応保持手段例え ば実質的に平らな表面のもの、反応スライド、またはマイクロタイタープレート 上に載置した試薬に血餅溶解（のための）成分含有試料を加え、ここで、前記凝 固した試料を（１）振動磁場または（２）運動永久磁場または（３）振動磁場と 静止永久磁場との組合せをかけ；そして （２）　　磁気粒子の動きをモニターする。

上記の磁気粒子を有する試薬に血餅溶解成分含有試料を加える第一段階を実施す るには種々の方法がある。従って、磁気粒子を有する試薬に血餅溶解成分含有試 料を加える代わりに、磁気粒子を有する試薬に、血餅溶解試薬含有試料を加える ことができる。また、血餅溶解成分または血餅溶解過程の開始剤もしくは阻害剤 を含有する試料を磁気粒子含有試薬に加えることもできる。或は、磁気粒子含有 試薬に、血餅溶解成分または血餅溶解過程開始剤含有試料を加えて、最初に血餅 形成を開始し、次に血餅溶解させることもできる。

本方法は新規な反応スライド中で有利に実施でき、新規反応スライドも本発明の 一部を構成するものである。

本発明は色を発するアッセイ（すなわち発色アッセイ）または色の変化が関与す るアッセイをモニターするための膜を具備する反応スライドも提供する。

このような発色アッセイ例えば血餅形成パラメータアッセイを実施するときには 、本発明は、互いに接続している試料ウェルと上側表面に膜が結合している反応 容量とを規定（領域決定）している導管構造からなり、被測定量の少なくとも１ つの試薬を反応容量中に含有している部材の試料ウェルに、試料を加えることか らなる。特定量の試料を毛細管現象により反応容量に引き入れ、膜と試薬とを接 触させて試料と試薬の反応を開始させる。膜の色の任意の変化をモニターするこ とにより反応をモニターする。

図面の簡単な説明 添付図面と関連付けて以下の詳細説明を参照すると、容易に本発明及び本発明に 伴う利点の多くをより完全に理解できるであろう。参照番号はいくつかの観点を 通して同じまたは対応の部分を示している。

第１図は、平らな表面に試料を加えた後の磁気粒子と乾燥試薬との組合わせを１ ００倍の倍率で示しており、粒子群が配向状態の間を振動していることが示され る。磁場の影響下では粒子は柱状の構造またはスタックス（山、堆積）を形成す る。こわがどのようにして起こるのかは正確には知られていないが、約１００倍 の倍率の光学顕微鏡でこれらのスタックスが観察された。

スタックス中の各粒子は小さすぎて解像できなかった。各スタックスは不均一表 面を有する円筒状の物体または軸のようであり、円筒の縦に沿って直径は幾らか 異なる。軸によっては他より細いものもある。

第２図は、（Ａ）電磁石波形、（Ｂ）試料添加後の磁気粒子と乾燥試薬の組合せ の配向、及び（Ｃ）アッセイ実施時に磁気粒子の振動を反映する光検出器からの ＡＣ結合電気信号の間の関係を示している。

第３図は、磁気粒子の配向状態間の振動の光学信号をモニターすることにより得 た記録を示している。

第４図は、上記第３図に示す記録を時間を拡大して示した図である。

第５図は、凝固反応測定用に磁気粒子を使用するための装置と反応スライドの垂 直断面図である。

第６図は、本発明アッセイを実施できる実質的に平らな表面と凝固反応を測定す るに適した配置の磁場発生手段との２つの図を示している。

第７図は、１つの永久磁石の単純な直線状運動を使用して明滅現象を発生させる 磁気粒子振動発生法の２つの図を示している。

第８図は、１つの電磁石を使用して明滅現象を発生させる磁気粒子振動発生法を 示している。

第９図は、１つの永久磁石の軌道運動を使用して明滅現象を発生させる磁気粒子 振動発生法の２つの図を示している。

第１０図は、血餅溶解アッセイでの磁気粒子の配向状態間の振動の光学信号をモ ニターして得た記録と測定に使用した標準曲線とを示している。

第１１図は、化学反応の前または後に種を分離し、必要に応じて膜内に試薬を含 有し、簡便に反射率を測定できるように反応容量と一体化した部分としての膜を 有する反応スライドを示している。

第１２図は、膜を具備した第１１図の反応スライドの断面図であり、反射率の測 定法を示している。

第１３図は、本発明反応スライドの第一実施態様のカバーを上から見た図である 。

第１４図は、第一実施態様の反応スライドの上層を上から見た図である。

第１５図は、第一実施態様の反応スライドの基底部を上から見た図である。

第１６図は、組み立てた反応スライドと同様の方向に部材が向いている、第１３ 〜１５図に示す物品の分解組立図である。

第１７図は第１３図〜第１５図の部材の、組立時の上から見た図である。

第１８ａ、ｂ及びＣ図は、本発明の反応スライドの断片の縦断面図であり、反応 スライドが上層を含むスペーサからなる変更例を示している。

第１９図は、本発明の反応スライドの種々の実施態様の分解組立図である。

第２０図は、第１９図の実施態様の上から見た図である。

第２１図及び第２２図は各々、第２０図の線Ｘ■−Ｘ■及びＸ■−Ｘ■での縦断 面図である。

第２３図は、反応スライド、光源の実施態様及び光検出器の横断面図を示してお り、光源及び光検出器は光の散乱を測定するために載置しである。

第２４図は、光の散乱を測定するためにハウジング中に置いた反応スライドを上 から見た図であり、このときハウジングのカバーは外しである。

第２５図は、第２４図の線ＸＸ　Ｉ　−ＸＸ　Ｉでの縦断面図であり、ここでは ハウジングのカバーも示している。

第２６図は、プロトロンビン時間測定用装置の模式図である。

第２７図は、粘着層を使用しない修正例である反応スライドの垂直断面図を図式 化しており、その実施態様に入る光を示している。

第２８図は、反応スライド（断面ではない）、外部導波管及び透過／吸収測定装 置の使用法を示している。

第２９図は、光の散乱と透過／吸収との同時測定を示す第２６図と同様の図であ る。

第３０図は、反射率に基づく測定を行う部分的に一体化された半球上に載置した 反応スライドを示している。

第３１図は、反応空間に対流電流を供給するための反応スライドのカバー上の永 久磁石の使用法を示している。

第３２図は、反応空間に対流電流を供給するためのソレノイドの使用法を示して いる。

第３３図は、反応空間内に対流電流を発生させるためにカバーを局部的に屈曲さ せる装置を示している。

第３４図は、所与の振動磁場で作動するような対流電流を供給し、反応容量内の 磁気粒子による反射率を測定し、選択的に種を運ぶ膜を有する、反応スライドの 縦断面図である。

第３５図は、粘度変換器を有する反応スライドの縦断面図である。

第３６図は、反応スライドの基底部にある乾燥・試薬含有層を示す反応容量の部 分断片である。

第３７図は、２つの反応空間を持つパラレルフロータイブの反応スライドを上か ら見た図であり、光源及び検出器も示している。

第３８図は、第３７図を線Ｌ　ＸＶＩ−Ｌ　ＸＶＩで切った縦断面図であり、ま た第３７図及び第３８図は同じ試料から２つの異なるアッセイを実施しうる装置 を示している。

第３９図（ａ及びｂ）及び第４０図（ａ及びｂ）は反応スライドの種々の二成分 組立体を示している。

第４１〜４８図は、本発明で得たデータを提供する。

第４９図は、本発明に使用できる試料アプリケータを示している。

本発明の最良実施法 一つの一般的な実施態様では、本発明は磁気粒子の動きをモニターすることによ る新規な凝固アッセイモニタリング法を提供する。

もう一つの一般的実施態様では、本発明は磁気粒子を含有する乾燥試薬を提供す る。この乾燥試薬は凝固アッセイに使用する試薬である。

凝固アッセイへの使用： 本発明は、以下の説明からなる、試料の凝固アッセイを実施する方法を提供する 。

もう一つの実施態様では、試料の凝固アッセイを実施する方法は： （ｉ）　　アッセイに必要な第二成分にアッセイに必要な第一成分を加え、ここ で、前記第二成分は磁気粒子を有する試薬からなり、前記第二成分を（Ｉａｌ振 動磁場、（１ｂ）運動永久磁場または（１ｃ）振動磁場と静止永久磁場の組合せ にかけ；そして（１１）　　前記振動磁場または運動永久磁場または振動磁場と 静止永久磁場との組合せのいずれかにより磁気粒子に誘導された動きをモニター して前記アッセイを実施することからなる。

もう一つの実施態様は： （１）　　互いに接続している試料ウェルと反応容量とを規定している導管構造 からなる部材であって、反応容量は膜またはゲル層が接合している上部表面で規 定されている部材における、その試料ウェルに試料を加え、ここで、前記部材は 反応容量中に少なくとも１つの被測定量の試薬を含有しており；特定容量の試料 は毛細管現象により反応容量中に入り、膜及び試薬と接触して試料と試薬の反応 が始まり；そして（２）　　前記反応をモニターする ことからなる凝固反応の実施法である。

もう一つの実施態様では、部材は反応容量内に少なくとも１つの試薬と磁気粒子 の組合せを含有している。

本発明は凝固アッセイ用試薬も提供する。この改良点は試薬が乾燥した形であり 、磁気粒子を含有していることからなる。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬がフィブリン血餅アッセイ用試薬 である。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬がトロンボプラスチンカルシウム 試薬である。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬が塩化カルシ輻 ラムを含む部分的トロンボプラスチンの試薬である。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬が塩化カルシウム及び活性化因子 を含む部分的にトロンボプラスチンの試薬である。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬がトロンビンである。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬が溶解アッセイ用試薬である。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬がフィブリン血餅溶解アッセイ用 試薬である。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬がプラスミノーゲとびフィブリン またはトロンビンのいずれかとを含むプラスミノーゲン活性化因子アッセイ試薬 である。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬がフィブリンまたはトロンビンの いずれかを含むプラスミンアッセイ試薬である。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬がプラスミノーゲン活性化因子と フィブリンまたはトロンビンのいずれかとを含むプラスミノーゲンアッセイ試薬 である。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬がストレプトキナーゼまたはウロ キナーゼである。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬が天然または合成の組織プラスミ ノーゲン活性化因子である。

もう一つの実施態様では、凝固アッセイ用試薬がフィブリン及びプラスミンを含 むα−２−抗プラスミンアッセイ試薬であ血餅形成アッセイへの適用： 本発明は、 （１）　　アッセイすべき液体試料の被測定量を　（ｉ）磁気粒子及び　（１１ ）少なくとも１つの乾燥試薬からなる組合せに加え、ここで、前記組合せを試薬 保持手段上に置き、実質的に分散したまたは実質的に平らな（フラットな）形態 に配置し、そして（１ａ）振動磁場または（１ｂ）運動永久磁場または（ＩＣ） 振動磁場と静止永久磁場の組合せにかけ；そして（２）　　前記磁気粒子の動き をモニターすることからなる血餅形成アッセイを実施する方法を提供する。

もう一つの実施態様では、本発明方法は前記アッセイを実施する部材中で血餅形 成アッセイを実施する方法であり、（１）　　液体試料を前記部材に加え、ここ で、前記部材は互いに接続している試料ウェルと反応容量とを規定している導管 構造からなり、前記導管構造は試料ウェル中の液体試料を毛細管現象により反応 容量に引き入れ満たす幾何学的形態を有し、反応容量を満たした後には液体試料 はそこに静止し、反応容量は（ｉ）磁気粒子及び　（■）少なくとも１つの乾燥 試薬の組合せを有しており、磁気粒子は（ｌａ）振動磁場または（Ｉｂ）運動磁 場または（ＩＣ）振動磁場と静止永久磁場との組合せにかけ；そして （２）　　前記磁気粒子の動きをモニターすることからなる。

もう一つの実施態様では、部材は外部からの光を反応容量に伝える手段を含んで いる。

もう一つの実施態様では、部材は反応容量から分散される光を検出する手段を含 んでいる。

もう一つの実施態様では、部材を永久磁石及び電磁石の近くに置き、電磁石で起 こした振動磁場で磁気粒子を動かす。

もう一つの実施態様では、部材を永久磁石及び電磁石の近くに置くと共に永久磁 石と電磁石の間に位置させ、電磁石で起こした振動磁場で磁気粒子を動かす。

もう一つの実施態様では、試薬が磁気粒子を含んでいる。

もう一つの実施態様では、試料は全血からなる。

もの一つの実施態様では、試料は血漿からなる。

もう一つの実施態様では、磁気粒子は振動磁場をかけることにより振動する。

もう一つの実施態様では、磁気粒子は運動永久磁場をかけることにより動く。

もう一つの実施態様では、乾燥試薬はトロンボプラスチンカルシウム試薬からな る。

一血餅溶解アッセイへの適用。

本発明は、患者の血液または血漿試料、少なくとも１つの血餅生成試薬を含有す る乾燥試薬及び常磁性粒子を接触させ、磁場が誘導する粒子の動きを光学的にモ ニターし；動きをモニターすることによりその試料の血餅形成と溶解の終点を測 定することからなる血餅溶解アッセイを実施する方法も提供する。

もう一つの実施態様では、本発明は血餅溶解または血餅溶解の活性化もしくは阻 害に関与する生化学的成分についてのアッセイを実施する方法を提供する。この 方法は、（１）　　磁気粒子を含む標準化した血餅を含有する試薬に被測定量の 試料を加え、ここで、磁気粒子を含°む試薬は実質的に平らな表面に置き、次い で（１ａ）振動磁場または（１ｂ）運動磁場または（ＩＣ）振動磁場と静止永久 磁場との組合せにかけ；そして（２）　　磁気粒子の動きをモニターすることか らなる。

もう一つの実施態様では、本発明方法は、（１）　　血餅溶解試薬または血餅溶 解成分含有試料の被測定量を磁気粒子を有する血餅形成した試料に加え、ここで 、磁気粒子を有する血餅形成した試料は実質的に平らな表面上に置き、次いで（ １ａ）振動磁場または（ｌｂ）運動磁場または（ｌｃ）振動磁場と静止永久磁場 との組合せにかけ；そして（２）　　磁気粒子の動きをモニターすることからな る、血餅溶解アッセイの実施法である。

この実施態様では、血餅溶解アッセイは組織プラスミノーゲン活性化因子アッセ イとして使用できる。

さらにもう一つの実施態様では、試料自身を添加された試薬により作用させるこ とができるが、この場合、試料が先ず血餅を形成し、次に試料中の血餅溶解開始 剤、成分及び／または薬剤により血餅溶解するように作用させる。血餅形成と血 餅溶解の両方の過程をモニターし、それから診断用の情報を得る。

−血餅形成パラメータアッセイへの適用：本発明は血餅形成パラメータアッセイ を実施する部材も提供する。部材は互いに接続している試料ウェルと反応容量と を規定する導管構造からなり、反応容量は半透過層例えば膜またはゲル層が結合 した上表面により規定されており、導管構造は試料ウェル内の液体試料を毛細管 現象で反応容量に引き入れ満たす幾何学的形態を有しており、反応容量を満たし た後液体試料はそこに静止したままである。もう一つの実施態様では、半透過層 は反応容量中の反応をモニターする手段である。

もう一つの実施態様では、半透過層内に少なくとも１つの乾燥試薬を含んでいる 。

もう一つの実施態様では、少なくとも１つの乾燥試薬は透明な表面に付着してい ない半透過層の表面にある。

もう一つの実施態様では、試薬は少なくとも１つの酵素を含有している。

もう一つの実施態様では、半透過層は複数の積層膜単位からなり、６膜は少なく とも１つの乾燥試薬を含んでいる。

もう一つの実施態様では、部材は磁気粒子と少なくとも１つの乾燥試薬の組合せ を有している。

本発明は、永久磁石と、時間調整手段と、常磁性粒子を有する乾燥試薬少なくと も１つを有する反応スライドとからなる凝固アッセイを実施するためのキットも 提供する。

もう一つの実施態様では、本発明は、本質的に非トロンポゲン性物質からなり、 皮膚の刺点から血液試料を採取し試料を乾燥試薬含有部材に移送する移送ピペッ トを含む。

もう一つの実施態様では、キットは試料特に１滴の試料を採取し、移送または適 用するピペットを含む。第４９図に示すピペットは、採取源（例えば、指の刺点 または試験管でもありうる）から反応スライドの試料ウェルに試料を移送するポ リオレフィンの点眼器型アプリケータでありうる。好適アプリケータは毛細管穴 ８０２を有する幹と、孔８０１のあるバルブ８００を含む。毛細管現象により幹 の開いた先端を通って予め記した充填ライン８０３以上まで充填するときには孔 は覆っていない。孔を例えば指で覆い、バルブをしごいて試料を出す。好適実施 態様では、毛細管の内部を表面活性剤で処理してもよい。

本発明は、温度調節用手段、磁気粒子を動かすことのできる振動磁場または運動 永久磁場を生成する手段、照射手段、常磁性粒子を有する少なくとも１つの乾燥 試薬を含有し、全血または血漿試料を受容できる手段、磁気粒子の動きを測光的 にモニターし、磁気粒子の動きの結果を解釈してアッセイ測定を行う手段、及び 試薬を含有する部材を含む機器からなる血液凝固測定を実施するシステムも提供 する。

磁気粒子運動 本発明では、（１）振動磁場または（２）運動磁場または（３）振動磁場と静止 永久磁場との組合せにかけることにより磁気粒子を動かす。アッセイでは次に、 粒子の運動（振動または明滅）をモニターする。

振動磁場は、アッセイを実施する試薬保持手段例えば実質的に平らな表面のもの に対してそれ自身は静止している振動磁場発生手段で発生させる。第１図に示す ように、振動磁場と運動永久磁場の両者は平らな表面５００上の磁気粒子を凝集 させ柱状の凝集体６０１及び６０２とする。これら凝集体は振動磁場により配向 状態６Ｇ＋と６０２の間を変化し、観察者の裸眼で「明滅」または反射光もしく は散乱光の明暗の周期的変動と映る状態を生じる。

振動磁場または運動永久磁場の影響下で、拡大して観察した粒子は円筒状または 柱状に凝集し、これは約９０°の配向変化して、明と暗の反射または散乱光が観 察できる。

第８図は、試薬と磁気粒子の組合せ５０１を有する実質的に平らな表面５００及 び振動磁場発生手段５０６を示している。

第７図及び第９図に示すように、運動永久磁場は永久磁場発生手段で発生する。

その永久磁場発生手段は第７図の線５Ｇ２及び第９図の線５０４である実質的に 平らな表面の主要面に平行な方向に動く。この運動永久磁場は振動磁場で観察さ れたものと同様な磁気粒子の凝集や運動現象を引き起こす。

本発明の好適実施態様では、第６図に示すように、振動磁場と静止永久磁場の組 合せを使用する。この実施態様では、永久磁石５０３及び振動磁場発生手段５０ ５の両者が、アッセイを実施する反応保持手段すなわち実質的に平らな表面５０ Ｇに対し静止している。

血餅形成反応では、磁気粒子運動の縮小で血餅形成の終点を同定する。血餅溶解 反応では、磁気粒子運動増加の始まりが血餅溶解の終点である。

反応保持手段： 本発明の血餅形成及び血餅溶解アッセイは反応保持手段上で実施する。この反応 保持手段はアッセイに使用する試薬を支持し、磁気粒子運動をモニターできるい ずれの手段でもよい。このような反応保持手段にはマイクロタイターウェル、そ の均等物、実質的に平らな表面のものまたは下記の本発明により提供される反応 スライドを含む。

試　　薬　： 本発明に使用する試薬は本明細書中に記載のアッセイに使用するものである。磁 気粒子を良く練られた混合物中に含有していることが特徴である。乾燥試薬１ｍ ｌに対し０．５以下から５０■好ましくは１から１０■の磁気粒子が存在する。

アッセイニ ー血餅形成アッセイ： 血餅形成アッセイ（つまりプロトロンビン時間）を実施する本発明方法の主要な 要素、パラメータ及び特徴のいくつかを下記に示す。

本発明の重要な特徴の一つは、　（ｉ）反応保持手段例えば実質的にまたは本質 的に平らな反応表面のもの及び　（■）試薬と磁気粒子の平坦状または薄層状の 混合物を使用することである。

試薬−試料混合物の表面（または投影部分）が容積に比べて大きくなるように試 薬と磁気粒子の組成物との表面を配置する。

立方体または球状容量でなく分散したまたは本質的に平らな含有する乾燥試薬に 関連する方法論の再現性はあまり高くなく、従ってあまり有用ではない。分散し たまたは平らな形態により試薬の溶解が促進される。更に、より重要なことには 、分散したまたは平らな形態によりモニターすべき血餅の見える部分が大きくな る。

下記に詳細に示す（例えば、第１６図参照）反応スライドのような毛細管スライ ドの幾何学的形態は適当に平らな形態を作り、試薬を入れ、試料を測定するには 理想的であるが、常磁性粒子含有乾燥試薬を含む固体表面（例えば、マイクロタ イタープレートウェルまたは実質的に平らな表面）に予め測定した量の試料を単 に加えることによりアッセイの実施が完全に良好になろう。従って、許容できる 結果が反応スライドなしに得られる。

本発明のこの面では、簡単な一般的な反応保持手段を使用する。

乾燥試薬は血液または血漿試料添加後退速に溶解できるよう調製することが重要 である。表面上でのさらに好ましくは毛細管またはほぼ毛細管の間隔で近接した ２つの表面の間での凍結乾燥物が最も良く作用する。これにより、試料を迅速に 浸透し溶解させる、物質含量の低い塊が得られる。

乾燥常磁性粒子ベースのＰＴ試薬の調製には凍結乾燥が最良であるが、室温、真 空、乾燥剤、対流その他の乾燥を使用しても良い結果が得られる。例えば、反応 スライド（適所にスペーサがある）の基底部で試薬を室温空気乾燥させ、カバー をかけると自動測定乾燥試薬含有部材ができる。

良好なアッセイ結果を得るために使用できる試料と、試薬と磁気粒子の組合せと の比は種々様々である。磁気粒子が多すぎると、反応を行う表面は非常に暗く、 群集するだろうし、「明滅」信号の読み取りは難しいかもしれない。粒子が少な すぎると、明滅信号が弱すぎることがあり、信号−ノイズ比が低くなろう。

典型的なプロトンビン時間反応では、血漿試料０．１ｍｌに０．２ｍ１（２００ μｍ）のトロンビンカルシウム試薬を加える。小さな変化がアッセイの再現性に 影響することもある。一般に液体試薬を扱う機器では全量３００μ！の反応混合 物を使用して凝固を測定する。より少量の液体試薬または試料を使用するにはよ り少ψ 量の反応容量をモニターできるより高価な機器を必要と、少量になる程度に応じ てピペッティング誤差が生まれることがある。

乾燥試薬反応システム中では、（液体１ｍｌ当り約５〜５０■の）常磁性粒子を 含有するトロンボプラスチン−カルシウム試薬的２５μｌを凍結乾燥させて乾燥 試薬を製造する。しかし、　１ｍｌ当り　０．５〜５■を使用して良好な試薬の 製造に成功することもあり、実際の反応スライドでは　１ｍｌ当り　０．５ｍｌ よりずっと少量を使用することができる（下記参照）。この乾燥試薬に約２５μ ｌの血漿（または全血）試料を加えてアッセイを実施する。従って、試薬と血漿 の比２：ｌは所与容量の試料中ではｔｉｔの溶質の割合となる。

最終反応混合物中の試薬濃度も重要である。乾燥試薬系では液体試料と反応させ る前に試薬を溶解する必要があるため、試薬濃度が高すぎることは不可能で、高 すぎると試料を加えたときに完全には溶解しないであろう。試薬濃度が低すぎる と終点がはっきりしない。

２つの源からのトロンボプラスチンから得たデータに基づいて、はっきりした規 則はまだ確立されていない。一つの源では、推奨基準より（２倍まで）高い濃度 ではＰＴアッセイ値は高く、濃度が（通常の４分の１まで）下がるとアッセイ値 が下がった。

他の源では、より狭い範囲（推奨基準の４分の１まで希釈）について研究したが 反対の傾向を示した。

試薬のカルシウム成分が特に重要である。カルシウムがない場合には、抗凝血剤 を含まない全血、例えば靜朦穿刺部位からンリンジで集めたまたは指の穿刺部位 からランセットで集めた血液に対してのみ試薬は良好な作用を示す。カルシウム があるときには、クエン酸処理した血液から調製した血漿と同様、クエン酸塩抗 凝血剤を含む試験管またはシリンジに集めた全血をアッセイすることができる。

カルシウムが存在しないまたはカルシウム濃度が非常に低いときには、クエン酸 添加した血液または血漿のプロトロンビン時間は顕著に長くなる。抗凝血剤の作 用に打ち勝つに充分なカルシウムが存在しなければ、血餅形成は完全に阻害され る。過剰のカルシウムが存在するときには、プロトロンビン時間はまた長くなり 、極度に過剰なとき（Ｉｌｌ当り２５５Ｍ以上）にはアッセイの有効性が崩れる ことがある。しかし、乾燥試薬アッセイで血餅形成時間が最も短くなる、そして クエン酸添加血漿、クエン酸添加全血、抗凝血剤なしに静脈穿刺で採取した全血 及び（抗凝固剤なしに）指先から採取した全血についてのプロトロンビン時間測 定の実施に効果的なカルシウム濃度域がある。この試薬では、（カルシウム）の 範囲は約８〜１３ミリモル／ｌである。しかし、トロンボプラスチン試薬により 最適なカルシウム濃度は変化しうる。従って、　８〜１３ミリモルの範囲は一般 的な指標にすぎない。

最適カルシウム濃度は１１当りおよそ　８〜１８ミリモル、好ましくは８〜１３ ミリモル、最も好ましくは約ｌＯミリモル付近である。１１当り約１０ミリモル のカルシウム濃度では、患者毎のカルシウム濃度の違いからのカルシウムの量変 化により、テスト結果が変わることはない。

本発明の新規な方法はプロトロンビン時間アッセイにのみ好都合に適用できるの ではなく、多くの他の型の慣用の臨床凝固アッセイ、特に終点としてフィブリン 血餅を測定するものにも適用できる。

種々の乾燥試薬を使用して種々の凝固アッセイを実施するために本発明に従い基 本的反応スライド（例えば第１７図に示すスライド）または単に実質的に平らな 表面を使用できる。例えば、本発明方法は下記のものと共に有利に使用できる： １、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイ用の、トロンボプラスチンカルシウム 試薬及び磁気粒子；２、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）アッセイ用の、 塩化カルシウムを含む一部トロンボブラスチン試薬及び磁気粒子； ３、活性化部分トロンボプラスチン時間（Ａ　Ｐ　Ｔ　Ｔ）アッセイ用の、塩化 カルシウムと活性化因子を有する一部トロンボブラスチン試薬及び磁気粒子； ４、トロンビン血餅形成時間（ＴＣＴ）アッセイ用の、トロンビン試薬及び磁気 粒子；または ５、フィブリノーゲンアッセイ用に試薬及び試料の濃度を変化させること。例え ば第１７図のスライドを使用して、多くの他の凝固反応も本発明に従って実施で きる。

乾燥試薬を使用するプロトロンビン時間アッセイが２〜３知られている。また、 試薬中に磁気粒子を使用するプロトロンビン時間アッセイも２〜３知られている 。乾燥試薬を磁気粒子の両者を合わせることに成功した例はなく、本発明により 初めて凝固アッセイの面で成功した。

磁気粒子に基づく少数の入手可能なシステムで単に試薬を乾燥または凍結乾燥さ せようとする試みでは有効に作用せず、このシステムの目的を損なうことになろ う（これはすべて液体成分の操作による）。極少数の入手可能な乾燥試薬系に磁 気粒子を加える方法は、常磁性粒子の光学特性を測定するのではなく、また単に そのように適応することもできないであろうことから、更なる改良は望めはない であろう。

−血餅形成パラメータアッセイ： もう一つの実施態様では、以下に詳細に述べる第１１ＥＩ及び第１２図に示す反 応スライドを提供する。この実施態様では、モニタリング手段の半透過層、例え ば膜またはゲル層を具備するスライドを提供し、広範囲の他のアッセイの実施に 使用できる。

第１１図に示すように、本発明のこの実施態様で得られる反応スライドは反応容 量６６の中に半透過層４０を具備している。この層はアッセイ試料から液体と溶 解した種を吸収するために使用できる。これにより反射率測定でモニターできる 層の変化が起こり、アッセイの測定が得られる。

この実施態様を適用できる可能性は非常に多い。血液凝固に関しては、種々の合 成発色性基質を使用する凝固変数の測定から沢山の新規なアッセイが導かれた。

例として、抗トロンビン■、ヘパリン、プラスミノーゲン、　２−抗プラスミン 及び第Ｘ因子がある。これらのより新しいアミド溶解法はキットとして市販され ており、これらの合成基質法に基づく更に新しいアッセイがまだ増え続けている 。これらの一部は、例えばＦｅｔｅｅｄら、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｃｈｅｗ、　　２ ９／２２２５−２３６　　（１９１１３）　　及び　Ｓｗｅａｄｓｅａ　ら、５ ５ｍ１ｎｉｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ＋　■ｄ　ｌｌｅｍｏｓｊ＊＋ｉｓ 、　　９／４．　２５０−２６２（１９１１３）に記載されている。

合成基質は酵素切断でｐ−ニトロアニリンを放出する分子である。これは淡黄色 を発する。最大吸収は４０５ナノメータ付近であり、ここで一般的に反応を測定 する。この方法を使用すると、一般に、分光光度計、セミマイクロキュベツト、 血液を回転して血漿を分離する遠心器、３７℃の水浴及びストップウォッチを必 要とする。初速度の測定には、３７℃に自動温度調節したキュベツト容器を有す る光度計が一般に必要である。

第１１図の反応スライドを使用すると、予め血漿を分離する必要なく合成基質ア ッセイを実施できる。この場合、光検出器（フォトダイオード）上の　４００ナ ノメータの光学フィルターと共に、赤血球分離用の適切な膜を使用する。次のよ うな乾燥試薬と共に、市販の発色性合成基質Ｓ　−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖｇｌ− Ｌｅａ−Ｌｙ＋−ｐＨ＾２１１ＣＩ）を使用して、下記の全血アッセイを実施で きる＝１、プラスミノーゲン（利用できるプラスミン全体）アッセイ用の組織プ ラスミノーゲン活性化因子、Ｓ−２２５１及びバッフ２、遊離プラスミンアッセ イ用のＳ−２２５１及びバッファ；３、α−２−抗プラスミンアッセイ用のプラ スミン及びＳ−２２５１、及び ４、組織プラスミノーゲン活性化因子アッセイ（ｔ−ＰＡ）用のプラスミノーゲ ン、フィブリン断片、Ｓ−２２５１及びバッフ本発明のこの実施態様には磁気粒 子は必要ではない。しかし、例えば第１２図に示す反応空間４０中に置くことに より磁気粒子は好都合に使用でき、それは混合を改良するよう作用する。

−血餅溶解アッセイ： 上記のように、本発明は血餅溶解に基づくアッセイの実施にも有用である。

血餅溶解型のアッセイには種々の型があり、多様な目的で使用されてきた。これ らアッセイの色々なものを下記に示す。これらのアッセイは全てが同じ生化学的 パラメータを測定するのではない。他の方法からの結果と相関しない結果が得ら れることも多い。

ニーグロンビン溶解時間−二のテストは患者の血液血漿を酸性化してフィブリノ ーゲン及びフィブリン溶解活性成分を沈澱させることを基としている。次に、沈 澱をバッファに再溶解させ、血餅形成させる。３７℃でこの血餅が完全に溶解す る時間をニーグロンビン溶解時間という。通常のニーグロンビン時間は３〜４時 間の範囲であり、過剰にフィブリツリシスが起こる患者では２時間に、臨床的に 有意な程度に出血している患者では３０分まで短縮されよう。

希釈血液または血漿血餅溶解時間−これらの方法は、患者の血漿または全血を希 釈し、トロンビンで試料を血餅形成し、３７℃で血餅溶解について試料を観察す ることを含む。正常人で２〜２４時間またはそれ以上にわたる広範な範囲で変化 する。

フィブリンプレート法−この方法は試料として血漿またはそのニーグロンビン画 分を使用する。標準化したフィブリン血餅の薄層を含有するプレート上に試料を 置く。１７〜２０時間インキュベートした後、溶解面積を測定する。アッセイは 正確であると報告されており、フィブリン溶解活性、プラスミン及びプラスミノ ーゲンの測定に使用されてきた。このテストは血栓溶解療法のモニターに使用す るには時間がかかりすぎる。

標識フィブリン基質の溶解−これらのアッセイはフィブリンの放射活性アイソト ープ標識または蛍光標識を使用する。溶解過程中にフィブリンが消化されると、 断片が放出され、これを定量できる。これらのアッセイは１〜２時間で実施でき る。

トロンボエラストグラフィー−これらの方法１よ血餅の剪断弾性を測定する種々 の型の装置を使用する。これらの方法で溶解アッセイを実施するには一般１こ数 時間かかる。

カゼイン溶解法−ミルク中に見られる蛋白質のカゼインｉ！酵素プラスミンの基 質として使用できる。蛍光またζよ放射活性標識を使用してカゼインの分解速度 を測定すること佑こより、この方法をプラスミノーゲン活性化因子、プラスミノ ーゲンまた【よプラスミンのアッセイに使用できる。

上記の方法は）１．ｃ、　　Ｋｖｔ＊ｍによりＤｉｓｏｒｄｕｓ　ｏｆ　Ｆｉｂ ｒｉｎｏｌｙｔｉｓ。

Ｍｃｌｉｃｔｌ　Ｃｌ１ｎｉｃｔ　ｏｆＮｏ山Ａ＋ｅｅ＋ｉｅ＆１９７２：５６ ．　１６３−１７６で検討されている。上記方法の中で使用番こ便１ｆＩｊなも の番よなく、一般：ここれらの方法は全血の測定には適用できな（Ａｏあるもの ｉ！非常に時間がかかり、結果を得るまで書こ数時間かかる。また、高価な装置 を必要とするものもある。これらの方法ｌよ一般に番よ、ｔ−ＰＡ、ストレプト キナーゼ、ウロキナーゼ等の薬斉１の血栓溶解療法を受けている患者を即時：こ モニタ１ノングする１こ【よ適していない。

血餅溶解に関連する生化学的成分のより最近のアッセイ法ｉｔプラスミンの基質 として作用するアミノ酸エステルを使用する。

これらの合成基質を酵素プラスミンで切断するとクロモフォアまたはフルオロフ ォアが放出され、色（または蛍光）を発し、これをモニターできる。

アミノ酸エステルまたはアミド溶解法そしてカゼイン分解法は比較的特異的であ り、プラスミンの基質が関与しているが、フィブリンが真の基質であり、従って フィブリンに基づかないアッセイ法は特異的ではないとの懸念が科学文献に発表 されている。しかし、特にアミド溶解法は受は入れられている。

本発明は、これらの型の方法では初めて全血アッセイを実施する半透過層を有す る部材も提供し、このようなアッセイの使用を大いに簡便なものとした。血餅溶 解に関連する他のアッセイにはフィブリン分解産物（Ｆ　Ｄ　Ｐ）または血餅溶 解に際して分解された断片の測定法が含まれる。これらは主としてイムノアッセ イである。イムノアッセイはフィブリン溶解に関連する他の因子の測定にも使用 できる。しかし、破壊された生化学的に阻害された物質もまだ検出される可能性 があるので、イムノアッセイの結果は分析した生化学物質の代謝的または機能的 活性濃度に対し正確に相関はしないかもしれない。

血餅溶解アッセイを改良するさまざまな努力として、試験管を数時間前後緩やか に動かして試験管内の血餅の溶解を助け、その後ロフトから放出される液体を、 ２つの電気接触間の回路を完成させて血餅溶解の完了時に終点の信号を発するよ うにして、検出するに充分な置薬められるようにする装置が開発された（）ｌ、 Ｊ、　Ｗｉｌｋｅ＋＋を及びＮ、　　Ｂｔｃｋｓ　ＡｍｅｒｉｃＲＩＩＪｏｕｒ ｎｓｌ　ｏｆＣｌｉｎｉｃｒｌ　Ｐｔｌｈｏｌｏｇ７６６、　１２４−１３１　 （１９７６１）。２０年前に開発された、血餅溶解につれて血餅から発生する空 気泡の上昇を利用する半自動的な血餅溶解アッセイはいまでも使用されている： Ｄ、　　ＣＣｏ１１ｅ、　Ｇ、Ｔｙ１ｇｇ＋及びＭ、　　Ｖｅ＋ｓｌ＋＊ｅｌｅ 、　Ａａｅ＋１ｃｔｎ　ｊｏｕＩＩｌｏｌ　ｃｌｉｅｉｃＩｌ　？１ｈｏｌｏＨ ２１，７０５−７０７（１９６８）　、より最近の改良正確に測定することによ るフィブリンプレート法の精密化が含まれる：　１．　Ｉｅｓｐｅ＋ｓｅ＋　と Ｔ、　　Ａｓ＋ｒｎｐ、　　Ｈ畠ｅｍｏｓｔ＊ｓｉｓ　！３＋３０１−３１５（ １９８３１゜ 最近、フィブリン溶解アッセイはマイクロタイタープレートで行われ、コンピュ タ−互換性のマイクロタイタープレートリーダーを使用して自動化されている。

それは光学密度を測定し、クロットが消化されたときを検出できる：　Ｄ、　Ｐ 、　Ｂｅｅｂｅ及び［１，Ｌ。

Ａ＋ｏｎｓｏｎ、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉ＠Ｒｔｓｅ＊＋ｃｈ　４７：　１２３− １２８　（１９８？）　ｃ＋　Ｒ，Ｈ。

Ｃ＊ｒｌ＋ｏｎ、　Ｒ，Ｌ、　Ｇｓｒ＋＋ｉｋ、　Ａ、１．Ｓ、　］ｏｎｅｓ及 びＡ、Ｍ、　Ｍｅｕｎｉｅｒはより最近、マイクロ遠心分析器中での標準化血餅 の濁度測定（時間に対する吸光度）を使用してバッファ中のｔ−ＰＡ濃度をアッ セイできる可能性を示した：　Ａｎｔ１７１ｉｃ＊ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ１６８．４２８−４３５　（１９８８１゜上記の使用できる方法にはｔ−ＰＡ アッセイ、プラスミノーゲンアッセイ等のような用途で全血の即時モニタリング に好都合に使用できるものはない。本発明の提供する方法では、プラスミノーゲ ン活性化因子（ｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ等）；プラスミノ ーゲン；プラスミン：阻害剤；等のような物質の具体的な濃度を測定するための 、乾燥試薬を使用した簡便、迅速な全血血餅溶解に基づくアッセイを実施できる 。

アッセイは多くの方法で使用できる： １、外因性血餅溶解を基とする方法−ここでは、フィブリン（フィブリノーゲン −トロンビン反応）からの標準化血餅を乾燥試薬の形態の常磁性粒子と合わせる 。乾燥試薬は他の要素例えば（プラスミノーゲン活性化因子アッセイ用には）高 濃度のプラスミノーゲンも含有できる。前記のように、全血を加え、常磁性粒子 の動きをモニターする。血餅からの粒子の放出は溶解開始を示し、この開始まで の時間及び溶解の初期段階の速度要因はアッセイする溶解因子の濃度と比例する 。

２、内因性血餅溶解を基とする方法−ここでは、トロンビン（または、トロンビ ンよりヘパリン感受性の低い、トロンビン様蛇毒素例えばアトロキシン）、常磁 性粒子、及びことによると他の成分を含有する反応スライドを使用する。患者の 血液試料を加える。この血液は患者のフィブリノーゲンに対するトロンビンの作 用により血餅を形成する。次に、標準化した血餅の代わりに患者自身の血餅につ いて溶解アッセイを行い、患者のフィブリンについての情報例えば既知量のｔ− ＰＡによる溶解され易さを明らかにする。

本発明の新規な面は血餅内に包まれた磁気粒子の使用である。

血餅が溶解するにつれ、より多くの磁気粒子が自由に動き始め（振動）、明滅信 号が増加する。

この方法では、反応スライドと磁気粒子を使用して組織プラスミノーゲン活性化 因子のような血餅溶解促進物質を測定できる。例えば、第１０図に見られるよう に、予め形成したフィブリン血餅、プラスミノーゲン及び磁気粒子を含有する乾 燥反応スライドを使用して、第１７図に示した反応スライド配置で簡便にｔ−Ｐ Ａアッセイを実施する。表面上の反応スライドなしにまたは適当な容器中で、同 じ乾燥試薬と交番磁場を使用しても実施できるがかなり困難になる。

第１０図に全血ｔ−ＰＡアッセイを示す。終点は明滅信号がしきい値以上に上昇 し始めるかはっきりした傾斜の変化を示した点である。全時間（出発点から終点 まで）はｔ−ＦＡ濃度に反比例し、非常に再現性がある。較正用に適切な標準曲 線を使用することによって、同じアッセイを他のプラスミノーゲン活性化因子の 定量に使用できる。

全血を使用する、プラスミノーゲンまたは利用できる全プラスミンを検出するよ うな他のアッセイにも同様の方法が使用できる。プラスミン検出の場合には、磁 気粒子含有スライド及び予め形成した血餅を使用する。プラスミノーゲンの検出 には、試薬としてプラスミノーゲン活性化因子も必要である。

磁気粒子 反磁性物質は磁石に引き付けられることはなく、反発するかも知れない。常磁性 とは、原子または分子全体を磁石として作用するようにさせる原子または分子中 不対電子の存在により付与される特性である。磁場内に置くとこれらの微視的磁 石は互いに並び、磁場に向かって引き付けられる。強磁性材料は同じ方向に整列 した非常に多量の常磁性原子を含有する「ドメイン」を形成する常磁性物質であ る。強磁性材料の磁場との相互作用の強度は他の常磁性材料のそれより非常に強 い。元素鉄、ニッケル及びコバルトは強磁性材料である。本明細書中を通し、磁 気と常磁性という用語は互いに交換でき、強磁性材料も含んでいる。

本発明の実施において、適切な常磁性粒子を使用することが重要である。不活性 度、磁気特性及び大きさの組合せが適当なものである。粒子は不活性であり反応 に影響しないことが重要である。

磁気特性の重要さを説明する。マグネタイト（Ｆｅ３０４）はＦｅ２Ｏ３よりも 非常に磁性が強く、より好適な乾燥試薬と磁気粒子の組合せを作る。磁気ラテッ クス粒子（例えば、Ｓ！目ｄｙ＋＋、　　Ｉｎｃ、製）も使用できるが、非常に 磁性が弱く、全血アッセイには劣った試薬ができる。

磁気粒子の大きさも重要である。粒子の直径は一般に５ミクロン未満がよい。（ １ミクロン未満の）小さい粒子はより大きな粒子よりよい作用を持つ傾向にある 。例えば、直径０．７ミクロンの粒子がよい。粒子は容易に沈澱してはならず、 コロイド状の大きさに近くなると最良の結果が得られる。大きさが小さいと試薬 混合物中に粒子がより簡単に分散され、磁場内に入り、反応の間にモニターされ る。

一見、光の波長より小さい粒子は検出可能ではない様に考えられるため、有効に 作用しないように思われるが、非常に小さい粒子でさえ、使用する磁場の型が適 当であれば容易に目に見える凝集体となる。例えば、平均粒径０．３ミクロン（ フィッシャー法で）の粒子は、８７５ナノメーター（０，８７５ミクロン）で最 大発光となる赤外Ｌ　Ｅ　Ｄからの光を照射するとよく作用する。

常磁性粒子の濃度は一般に１．乾燥試薬混合物を調製するために使用するトロン ボプラスチンカルシウム試薬（または他の試薬）１ｍｌ当り約５〜５０■の範囲 であるとよい。この場合、この試薬は常磁性粒子を加える前に凝固テストに使用 する充分な濃度である。

ＰＴ試薬中で有効に作用する粒子は酸化鉄（ｍ）鉄（ＩＩ）（Ｆｅ３０４）であ る。ニッケル（Ｎ１）粒子もＦｅ３Ｏ４とほぼ同様に作用する。酸化鉄（ｍ）（ Ｆ　ｅ　２０３　）もよく作用する。鉄（Ｆ　ｅ）粒子も強度に磁性であるが、 弱い終点の検出にはＦ　ｅ　３０４と同等には働かない。既述の新規発明に使用 でき、その用途のために作用する磁気（常磁性または超常磁性）粒子の中には全 く違う目的で使用されているものもある。例えば、磁気ラテックス球は一般に、 典型的には抗原−抗体反応に関与する凝集アッセイに使用する。他の磁気粒子（ 参考文献魔９）は抗原−抗体反応での分離に使用できるものである。

最良の乾燥試薬を作る酸化鉄（Ｉ［［）鉄（ＩＩ）粒子の大きさは平均粒径を決 定するフィッシャー法を使用して製造業者が特定化する。この方法によれば、平 均粒径は０，３ミクロンである。

粒子をトロンボプラスチン（またはトロンボプラスチン−カルシウム）溶液に懸 濁した後、重い粒子は沈み、軽い画分のみを乾燥粒子の製造に使用する。従って 、平均粒径は０．３ミクロン未満と予想される。

乾燥試薬を処方するために使用できる粒子の濃度範囲はかなり広いが、上記の粒 子は２５■／ｍｌでトロンボプラスチン溶液に加えるのが一般的である。軽い両 分を除去した後、粒子全容量の約８０％が残り、粒子全容量の約２０％が乾燥試 薬中に入ることになる。従って、実際の乾燥試薬ではｌｌｍ１当り約５■のＦｅ ３Ｏ４が使用されると信じる。乾燥試薬中には、　１ｍｌ当り０５〜５０■また は０５■よりずっと低量で使用できる。

最終的な乾燥（凍結乾燥）試薬を注意深く顕微鏡により、そしてマイクロメータ ーレベルの測定を行うと、試薬は水平表面の上側と下側（カバーと基底部）にコ ーティングとして反応スライドメ協在することか判った。ポリエステルのカバー 、ポリエステルの基底部及び０００フインチの厚さのスペーサでは、下部表面（ 基底部）を被覆する乾燥試薬は一般に０．００１５インチ厚未満であり、０．０ ００１インチ程まで薄くてもよい。

上部表面（カバー）上の乾燥試薬コーティングは約０．０００５インチから０． ０００１インチまたはそれより十分薄い。この手法を使用して、測定不能な上部 表面上のコーティングを作ることもできる。

本質的に全ての酸化鉄粒子が下部表面試薬中にくることがよくある。粒子が試薬 中に現れるときには、バンブや山（または浅い石荀もしくは鍾乳石）のようにな った群集で存在する。そうでなければ、試薬は、こすると螺状でありうるが、水 を加えたときまたは高湿度のときでさえ直ちに溶ける比較的均質なフィルムを形 成する。フィルムの厚さには石荀様または鍾乳石様の分も含む。

分析を行う試薬−試料混合物には比較的平らな表面を使用することが重要である 。混合物をより容易に観察することができ、粒子明滅現象の利点を充分活用でき るように混合物は平らな表面に広げられる。

有利に乾燥試薬を配置し、試料を捕らえるために浅いウェルやくぼみを使用する ことができる。しかし、いずれにしても、最良の結果を得るためには、試料は正 確、精密に測定し、ピペッティングする必要がある。（試料を自動測定するよう に毛細管間隔で配置した平行なプレート配置つまり反応スライダが特に望ましい が、必須ではない）。

表面の反射能が高い場合には、反射能のより低い表面より、バックグラウンドの 反射率が高いかもしれない。どちらの表面もよく作用するであろうが、信号が弱 いときには反射能の低い表面のほうが良いであろう。

試薬の添加前に好適な表面活性剤で表面を予め処理すると、表面との接触角度が 下がって試薬を広げるために望ましいかもしれない。そのとき以外は、表面活性 試薬（すなわち、表面活性剤または洗剤）は必要ではない。液体試薬を乾燥させ る前に試薬含有部材として平行なプレート配置を使用する場合には、蒸留水中０ ．１％のＴｒｉｌｏａ　ｌ−１００で表面を予処理すると液体試薬はより速く流 れるであろう。

本発明で非常に正確な結果を得るためには反応容量の広範な領域を観察すること が重要である。平らな反応容量の非常に小さい部分を観察する場合には、結果の 再現性はあまり良くない。

例えば、平らな反応容量の全投影域１００−中５〜ｌ０ＪＬかモニターしないと 、結果の再現性はあまり良いとはいえない。例えば、全投影域の２０〜５０％＊ という、反応の広範な代表部分を観察すると、結果は非常に再現性のあるものと なる。

蜆 （−れは２５μｌの反応混合物を含有し、観察することのできる反応域（投影域 ）約１００−の反応スライドについて計算した。）全投影域の範囲については具 体的に研究していない。反応混合物の容量に対する投影域の大きさが投影域自身 の実際の大きさよりも重要と思われる。

反応容量が小さいときには投影域は非常に小さくてもよいであろうが、見易さ及 び観察する粒子の総数の少なさが究極的１−は投影域を限定するであろう。投影 域が非常に大きいと、全域で同時に反応を開始するのは難しい。明滅パターンを 観察して得たデータは重合フィブリンが部分全体中で均一にそして同時に形成さ れることは殆どないことを示しており、従って大きな部分を観察することが最も 良い。

反応容量の投影部分内にこの観察域が集まると一般に最良の結果が得られる。究 極的な観察域は反応容量の全投影域を観察することである。全投影域を観察する と、同じ部分の中心の４０〜５０％を観察するよりもほんの僅かにだけ良い結果 となりつる。

振動する明暗領域として現れる常磁性粒子の時間による配向の変化を生じさせる には運動磁場が必要である。磁力線配向は平らな反応容量の面に直角とその面に 低い角度（または平行）との間を反復するとよい。この角度はどんな角度でもよ いが、粒子の配向の両端については０゛と９０°で最大の信号が得られる。理論 的には、８０°及び８５°は使用できるが、信号は小さいであろう。

この運動磁場を使用する目的は、粒子配向変化の１回の全周期中に、固体支持表 面に垂直にそして表面に対して水平に粒子を動かすことである。上から見ると、 最初の配向はより明るく、後者はより暗く見える。血餅の形成が始まると振動ま たは光の強度の交互変換は弱まる。これは、恐らく、凝固反応（フィブリノーゲ ンの重合）から形成されたフィブリンポリマー中に粒子の一部が包まれたためで あろう。

磁場の強さは、全血試料を使用するときでさえ、粒子内で観察可能な配向変化を 起こし、凝固の終点を検出するに充分強いものであるべきである。全血が存在す ると粒子運動から良好な光学的信号を得ることがより困難になる。

明滅現象を得るための磁束密度は、血漿については約５ガウス、全血については 約１０ガウスより非常に低くてはならず、２０〜６００ガウスが非常に有効であ り、ずっと大きくてもよい。従って、５〜６００ガウス以上の磁束密度を使用で きる。

第５図に示す配置で優秀なアッセイが実施できた。ここでは、バイアス磁石が反 応容量内で約０．０３０インチの間隔で＋２０ガウスと一２０ガウスの磁束密度 ピークを発生させた。電流をかけたときには電磁束密度は電磁石抜の中心上にあ る反応容量の中心部で＋６０から最大の＋９０ガウスの範囲であった。もう一つ の電磁石でも同じバイアス磁石で優れたアッセイ結果が得られた。

この電磁石は＋１００から最大の＋１２０〜＋１３０ガウスの束密度を作り出し た。

磁場配向変化の周波数が重要である。周波数が０．２５ヘルツ未満では、終点は 最も近接しても２秒までしか読めないため、終点の精度は低くなるであろう。周 波数が約４ヘルツより高いと、終点検出の感受性は低くなり、従って、精度も低 くなるであろう。約１ヘルツの周波数がちょうど良い妥協点である。信号ピーク の間隔は０．５秒とでき、良好な精度が得られる。

反応容量が載っている表面の下（または上）の永久磁石を回転させることにより 達成できるような、平らな反応容量の面での磁場方向の回転は、使用した乾燥系 ではあまり再現性のある終点は得られないであろう。例えば、＾ｄｌｅ＋　　（ 米国特許３、６５０．６９８及びＵ、Ｓ、　Ｒｅ、　２？、　８６６）が使用し たような、回転磁石法は常磁性粒子で渦巻様作用を起こし、粒子を中心に近づけ るよう動かす。血餅形成時に「渦巻」はその動きを全部または一部止める。この 作用は固相試薬には余り適さず、本発明の乾燥試薬と共に使用すると再現性につ いて問題がある。乾燥試薬で終点を得る試みを繰り返したが、回転磁石法では終 点の再現性は不良であった。さらに、粒子の突然の凝集で示されるように、終点 が得られることもあるが、回転磁場内で凝集物は回転を続けており、検出はさら に不確実なものとなる。

時間で変化する磁場は種々の方法で得られる。例えば、反応容量を表面上に置く と、次の配置が可能である：Ａ４表面を通る磁力線を有丈し、表面の下（または 上）にある永久磁極または励磁された電磁石は表面に平行な直線に沿って前後に 動く。乾燥試薬と磁気粒子の混合物に液体試料を加えると、磁石の各通過に伴う 「明滅」が観察される。液体試料がないときには、磁気粒子は乾燥試薬内で自由 に動くことはできないであろうし、本質的に明滅信号は観察されないようである 。

これは第７図に示している。第７８及びｂ図は、試薬と磁気粒子の組合せ５１１ １を存する実質的に平らな反応表面５００の図を提供する。永久磁石５０３は方 向５０２に移動する。

Ｂ、励磁したときに表面を通る磁力線を磁石が生じさせるように、（好ましくは 強磁性核を有する）電磁石を表面の下（または上）に置く。磁石をオン・オフす ると、乾燥試薬と磁気粒子（及び添加した試料）の混合物の明滅が観察される。

しかし、この方法は、第８図に示すようにあまり劇的ではなく、従って直線を前 後に動かした同じ磁石と比べ弱い信号を発する。

Ｃ１表面を通る磁力線を有し、表面の下または上にある永久磁石または電磁石を 、環状、長円形または同様の繰り返し軌道で表面と平行に動かす。この結果、明 滅パターンが得られる。

これは第９図に示している。第９ａ及びｂ図は実質的に平らな表面５００に関し ての永久磁石５０３の動き５０４を示している。

Ｄ、平らで薄いバイアス磁石（例えば、磁石表面に沿って縞模様の繰り返しとし て配置した複数の極を有するストリップまたはテープ状永久磁石）を、表面の直 接下に置き、その下にある電磁石を周期的に励磁する。これは第５図に示してい る。試料を加えると乾燥試薬は簡単に溶解し、磁気粒子を放出する。

例Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｅ及びＦの場合のように、磁気粒子は微視的な塊または山伏に配 向する。粒子はバイアス磁石の磁力線（表面に対して水平）に沿って向き、電磁 石を励磁すると表面に垂直（または急勾配）になる。これにより、明滅に加えバ イアス磁石の磁力線に沿って粒子が濃くなる傾向にあるＡ、ＢまたはＣで生じる ものとは幾分異なる特徴的明滅パターンが生じる。

Ｅ、磁気粒子が存在する表面の下に配された永久バイアス磁石（平坦な円筒状ま たは他の平坦な幾何学的形状）と、対向する極を有する電磁石。これは、磁力線 が（磁石が励磁されたときに）磁気粒子を有する表面に平行になり、永久磁石か らの磁力線の方向に垂直となるように、互いに向かい合っている。これは第６図 に示す。第６ａ及びｂ図は実質的に平らな表面５００と振動磁場手段５０５の近 くにある静止永久磁石５０３を示している。

Ｆ、最もはっきりした明滅はＡとＣで得られる。Ｂ、Ｄ及びＥでは運動部分を必 要とせず、その中でＢの効果が最も低い。

明滅パターンを生じさせる配向の基礎原理に従う限りは他の磁石や幾何学的形状 も使用できる。例えば、永久磁極は垂直の線に沿って上下に動くことができ、軌 道の頂点では磁極は、反応混合物が載っている表面の底の近くに来る。軌道の底 部では、磁力線が表面を横断し、粒子運動を引き起こすことがなくなるほど遠く まで動く。

粒子運動のモニタリング 光源を使用して磁気粒子の動きをモニターできる。この光源は良好な光学信号す なわち反射及び／または分散光信号を出すのに充分の光度を有すべきである。充 分明る（゛部屋または太陽光の当たる部屋での可視的に観察は満足なものである が、自動の系には適していない。常磁性粒子によりバックグラウンド以上に反射 または分散されるものであれば、波長はそれほど重要ではない。

ピーク波長６３５ナノメーターで発光する、リン化ガリウムＬＥＤ上のｌ１ｅｖ ｌｅｌｌ　Ｐｓｃｋ＊＋ｄ　［ＩＬＭＰ−３７５０リン化亜ヒ酸ガリウムのよう な超明るいＬＥＤがよく機能する。ピーク波長８７５ナノメーターで発光するＴ ＲＹ　０Ｐ２９０Ａ亜ヒ酸アルミニウムガリウムＬＥＤの様な赤外ＬＥＤを選択 するとさらによい。

光源はり、Ｃ，モードまたは脈動モードのいずれで操作してもかなり安定である べきである。粒子の配向周期の間、「明」と「暗」のピーク信号測定を精密に行 い、血餅形成開始によるピーク間距離の減少を容易に識別できるように、上記の 安定性が重要である。

また、適切な角度で光を測定することも重要である。反応混合物が載っている表 面が透明であれば、反応混合物を介した透過により明滅効果を測定できる。この 場合、光源と検出器は視野に一列に並び、反応混合物はその間に置く。しかし、 この方法では磁石または温度調節装置の場所が余りない。

より実際的な構成では、第５図に示すように、反応混合物からの光の反射または 分散により明滅効果を測定する。この構成では、光が反応混合物を照射して、検 出器が反応混合物を見る角度とは異なる光入射角度（表面に直角から）を作るよ うに光源を使用する。これにより（入射角度と等しい）反射角度で発生するぎら ぎらを避ける。一般的な実施法では、反応混合物の上に検出器を置き、直角に対 し約４５度の角度から投影した光で反応混合物を照射する。

おおよその点源からの光の強度は距離の二乗で低下する。慣用の発光ダイオード は円錐状の光を出す。この円錐の最強の部分が反応混合物の照射に望ましい。こ の強力な「円錐内の円錐」がちょうど反応容量全体を照射するのが理想的である 。反応容量からさらにＬＥＤを離すと円錐が広がり、反応容量での光の平均強度 が減少する傾向にある。ＬＥＤをより近づけると円錐は中心に集まり、反応容量 の辺縁部での光の強度が減少し、この部分からの利用できる信号は弱くなるであ ろう。

炉 試薬縁起きた明滅現象をモニターするためには、増幅器に交茜続した光検出器か らの信号を使用すると直流接続とは反対に最良の結果を生む。交流接続した増幅 信号からは、大きな変化が起きた瞬間が試薬含有用部分に試料が入る時間と決定 され、これによりアッセイが始まった時間が同定される。これに先立ち、予め設 定した周波数で磁場（例えば１または２ヘルツ）は変化している。

アッセイの開始信号の後、観察される次の信号は量減反応による振動である。こ の交流接続信号は小さな所から始まり、次に数秒内に高くなり、これはほぼ一定 のままでありまたはその後はんの少しだけ成長するが血餅形成が始まるまで消滅 はしない。第３図参照。

次にこの信号の減衰を使用して血餅形成の終点または瞬間を測定する。交流信号 の強度は一般に、１つのピーク（例えば、正のピーク）が起きた直後に読み取る ことにより測定する。

従って、各ピーク（正または負）と次のピークの差を測定する。

第４図はこれを時間を拡大して示したものである。

次に、これらの差をモニターして何時差が減少し始めるかを調べる。これは血餅 形成の開始に対応する。次には、血餅がより完全に形成されるにつれ差はより急 速に減少する。

しきい値基準を信号に適用し、アッセイの出発点と終点を決定する。出発点を決 定するためには、振動または通常の部屋の明り変化で起きる信号より大きな信号 が必要となる。周囲の光の変化が、分光検出器から実際には離れているにもかか わらず、装置のつなぎ目または通気孔からの漏れがあるために、小さい影響を与 えるかもしれない。試料を入れるときの光の分散及び吸収（反射）によりまだ非 常に大きな信号があり、このバ・ツクグラウンドより出発点のしきい値を高く設 定する。

終点の決定には、少なくとも１０秒好ましくは１５〜３０秒続く、２〜２０％の ピーク間の高さの低下を同定する。例えば、ピーク高の８％の低下と１５秒の時 間を選択すると、これらの基準を両方満たすことにより、低下の直前の最後のピ ークが血餅形成開始を同定できる最も接近した時点であることが決定される。す なわち、１５秒の間隔の間にピークの高さが８％まで低下し、再度上昇しなけれ ば、終点が達成されたのである。

弱い終点の検出には、２％または５％のしきい値を選択すると１５または１０％ より感受性のある基準となろう。同様に、３０秒の長さを設定すると１０秒のも のより感受性が高いであろう。例えば、非常に弱い血餅に伴うピークの高さは、 １０秒で８％は低下しないであろうが１５秒では低下するであろう。

観察された乾燥試薬のプロトロンビン時間を液体試薬を使用して臨床の研究室で 一般に得られる値に対応するものに翻訳するためには基準因子も必要である。例 えば、液体試薬を使用したとき１２秒である正規のプロトロンビン時間は乾燥試 薬系では２４秒として観察されるかもしれない。液体試薬で２５秒である正規で ないダブロトロンビン時間が乾燥試薬系では５０秒として観察されることがある 。

従って、両方の型のアッセイに相関する基準因子または直線の式を使用して、液 体試薬を使用する今日の研究室に慣用の表現で乾燥試薬を使用した結果を表す。

１つ以上の基準因子が必要でありうる。クエン酸添加した血漿またはクエン酸添 加した全血の基準因子（または直線式）が所与の試薬バッチについては本質的に 同じであることが観察されているが、抗凝固剤を含まない血液の基準因子は一般 に異なる。従って、試料を同定し、次に適切な基準因子を選択することが重要で ある。

従来の分析器での血漿試料と同じ血液試料列の結果に対してプロットした、（因 子を開発する必要のある）試料タイプを使用］７たＰＴの結果を比較して基準因 子を得る。次に２組の値を比較する式または表を得て、基準因子として使用する 。現存のアッセイ技術では複数試料の選択ができなかったためこのことが問題と なったことがなかった。全ての基準因子情報を試薬含有部材にコードし、次にそ の機器メモリーに移すと、基準因子は自動的に選択される。

この用途で反応をモニターするためにはシリコンの光ダイオードが理想的な光検 出器である。明るく、安価で、非常に信頼できる光源（ＬＥＤ）がピーク発光を 有する、かなり長波長の可視及び赤外波長で、この光ダイオードの反応時間は速 く、スペクトルの感受性は良好である。光ダイオードは検出した光に対し比例す る電気応答も発する。光ダイオードは周囲の光から隔絶すべきである。物理的な 隔絶または（例えば、ＬＥＤのビーり発光と同じ波長の赤外以外の全ての照射を 妨げるための）フィルターの使用または２つの方法の組合せで隔絶できる。

検出器は試薬−試料混合物が載っている表面に臨むよう１こ置くことができる。

検出器の半導体部材は、この照射される表面に平行に置くと、通常量も多くの光 を捕らえるであろう。光源から、試薬−試料混合物（または、より可能性が高＜ （マ、透明なカバー例えば反応スライドの表面）により反射されたぎらぎらか検 出器の部材表面に当たらないような角度で検出器を置くことが重要である。この ぎらぎらはノイズを増加させるであろう。光検出器部材を反応混合物含有表面の 近くにすれ（ｉする（よど、より多くの光を捕らえ、信号とノイズの比がより高 くなる。

光検出器は、光源生成人工物からの漂遊光を受けることなく、実際的であるだけ スライドの近くに置くことができる。こｉｔは　０．２インチ以下まで近づくこ とができる。光検出器をざら（こ（表面から１インチ以上）離すことができるが 、最終的Ｉこ１よ逆二乗減弱により信号はかなり低下し始めるであろう。同様１ こ、検出器の光活性部材が大きくなるほど、捕らえる光は大きくなり、増幅前の 信号が大きくなる。ＨａｍｌｌＩｍｍｔｌｓｕ　３２３８６−８に光ダイオード はこの用途に適しているが、多くの他の検出器も使用できる。

ａ１反応開始のしきい値：ＰＴアッセイの出発点は乾燥試薬の入っている容量ま たは部分への液体試料の導入と同時とみなす。現在の光学信号検出回路では光ダ イオード（ＨｘＩＩｍｚｍｒｆｓｕＳ２３８６−８ｋ）を使用する。光ダイオー ド増幅器は４９９．０ＧＯのゲインを供給する。交流接続した増幅器は１０のゲ インを供給する。

選択できるゲイン増幅器は１〜１２８のゲインを供給する。最大（５ボルト）の ３．９％以上または０．１９５ボルト以上の交流接続信号（１６倍に増幅）の確 たる変化を捜すことにより試料の添加（または開始時間）を検出する。

ｂ、明滅現象の確立：試料検出及びアッセイ開始の後の決まった時間に、ソフト ウェア−が適当な交流接続信号ゲインを選択する。このゲインは、その後増幅器 を満たすに充分には成長しないであろう最大の許容できる信号を設定する。実験 データから、全てのＰＴ倍信号明滅効果は約７秒後には最大信号の少なくとも５ ０％に達することが知られている。

Ｃ９明滅信号及び終点：第２図は完全な明滅信号を示している。この例では、最 大の水平粒子配向を達成するためのノ（イアスとして永久磁石を使用する。電磁 石のスウィッチを入れたり切ったりして最大の垂直配向を達成する。この例では 、両方の磁石を粒子の載っている表面の下に置く。上の信号（＾）は磁石への矩 形波推進電流に対応する。最初の矩形波のプラトーは作動させた電流についての ものである。中間信号ＣＢ）は、粒子（実際には粒子の塊または凝集体）上から の一連の寸見である。

最初のものは励磁した電磁石によるものであり、最大の垂直配向を示す。二番目 のものは励磁していない電磁石によるもので、最大の水平配向を示す。粒子の微 視的な「山」の各々の支点は基底部または下部表面にある。１００倍の顕微鏡で 観察した粒子の山はこの表面に「根ざす」ようであり、磁力線配向の変化につれ て前後に揺れる。このことから「明滅」効果を生み出す交互（明暗）の反射また は分散光が付与される。

フィブリン凝集が進むにつれ、最大の垂直及び／または水平位がもう完全には得 られないように粒子の山の運動は限定されるようである。従って、明滅の強さが 低くなる。これは血餅形成開始の信号である。

この段階では、顕微鏡的に観察すると、僅かに見え、僅かに識別される空間充填 物質に粒子はすぐに結合または付着するようである。ここで、山が動くにつれ充 填物質も共に動くようである。血餅形成が進行すると、山の一部は（曲がった木 のように）歪んだり、曲がったりし、配向の紙端（下限）に移行する。

この段階では粒子は確実に血餅内に捕らえられており、血餅を破壊せずに取り出 すことは明らかに不可能である。

低い方の信号（Ｃ）は粒子明滅現象による交流接続した光学信号である。ピーク 間距離の低下は血餅形成開始の信号である。

ｄ、信号からのその他の情報：血餅検出のしきい値を動かすと、「より弱い」血 餅をより強力な血餅から区分できる。弱い血餅は強い血餅に比べより漸進的にピ ーク間の信号強度の低下を示すであろう。例えば、Ｏ＋ｌｈｏＤｉｉｇｎｏ＋ｔ ｉｃｓ。

ｆｏｅ、の対照血漿レベルＴＩＴは？ｃｉｌｉｅ　ｔｌｅｍｏｓｌｘｉｉｓ　Ｉ ｎｅ　　の対照血漿レベル■より常に弱い血餅を示す。血餅強度の差異の物理化 学的、生化学的及び臨床的意義は現在の所判っていない。

異なる型（または強度）の血餅を識別する能力が診断的な価値を持つのかも知れ ない。

血餅の「強度」が血餅形成に関与する血餅または全蛋白質量の測定と実際になり える。プロトロンビン時間をアッセイする試料中のフィブリノーゲン濃度が顕著 に低いときには、得られるＰＴ値は変化しないかまたは正常より僅かに高くなり えるが、血餅「強度」の効果はより容易に観察される。この効果は終点開始直前 の最大のピーク間振幅（’Ａ）と終点開始後の所定時間でのピーク間振幅（Ｂ） を測定することにより定量できる。（Ａ−Ｂ）／Ａの比が大きくなると血餅も「 強くなり」またはより大きくなる。

ｅ、基準因子の自動人カニ基準因子または変換因子を使用して、乾燥試薬で得た アッセイ結果の値を液体試薬で得た実験結果に対応する値に変換できる。この因 子は、先ず、ＰＴ値の臨床域にわたり、同じ試料について臨床検査値に対し乾燥 試薬での値をプロットすることにより得られる。ここで、式（例えば、直線の形 ・ｙ＝ｍｘ＋ｂ）を使用して乾燥試薬ア・セイの任？結果を予期する検査値に変 換できる。４つの利点が得られる：１）異なる型の試料、すなわち、抗凝血剤な しに得た試料またはクエン酸塩の抗凝血剤を使用して得た試料の各々について式 を設定できる。２）恐らく、乾燥試薬による結果を特定の湿潤したトロンボプラ スチン試薬／機器に対応させるよう式を微妙に調整できる。病院内または地域内 で分散しているアッセイ結果を特定の参照法によく対応させうるため、これは重 要な利点となりえる。標準化はＰＴ測測定進行中の問題である。３）基準因子の 式を反応スライドとともに導入し、機器のマイクロプロセッサに自動的に入力し 、所望の結果を得ることができる。

情報は磁気的にまたは光学的にコードできる。４）試薬ロット間で起こる可能性 のある誤差を自動的に補償できる。

典型的な基準因子の式は： ｙ＝０．４ｘ＋６ （式中、ｙ＝試験値に調整したＰＴ Ｘ＝実際の乾燥試薬ＰＴ） でありうる。

本発明の凝固アッセイは、互いに接続している試料ウェルと反応容量とを規定す る導管構造からなる反応スライド内で有利に実施できる。この反応スライドを使 用するときには、反応容量に　（ｊ）磁気粒子と　（１１）少なくとも１つの乾 燥容量の組合せの被測定量を入れる。導管構造は、試料ウェル内に置いた液体試 料を毛細管現象により反応容量に引き入れ満たし、反応容量を満たした後には液 体試料は静止する幾何学的形態を有している。この部材については１９８７年４ 月　３日に出願した米国特許出願０７／　０３３，８１７に完全に記載されてお り、これは参考のためこの部材の組立体では、反応スライダは基底部、上層及び カバーからなる。基底部が主要表面となる。上層幌基底部の上にある。カバーは 基底部と反対側の、上層の上にある。上層は互からなる。カバーは分析する試料 を試料ウェルに加える手段からなる。本質的に全アッセイの間静止したままの試 料全体と反応容量内の試料との反応をモニターしてアッセイを実施する。

第１３図は本発明の反応スライドの第一の実施態様のカバー１０を上から見た図 である。第１４図は第一の実施態様の上層２０を上から見た図を示している。第 １５図は第一の実施態様の基底部３０を上から見た図を示している。第１６図は カバー１０．上層２０及び基底部３０の相対位置を示す分解組立図である。第１ ６図では反応スライドが三部品組立体として示されているが、より少ない部品し か必要としない組立体も可能である。

組立前には第二つまり中間の部品から離れた物質から反応容量が形成されている 三部品組立体の代わりに、三部品構造も使用できる。三部品構造の組立体の場合 、反応容量は上部、下部または両部品を圧印（エンボス）加工して形成できる＊ 。次に、例えば超音波溶接もしくは他のヒートシール加工、溶媒による接着の使 用、または特別な粘着剤（例えば、紫外線硬化性粘着剤）の使用により部品の１ つまたは２つの被選択・部分に適用した感圧性粘着剤を使用して部品を結合する ことができる。

（＊加圧加工の１つである圧印の代わりに熱形成法を使用して基底部やカバー材 料に凹凸部を作ることができる。）第３９ａ及びｂ図に２つの可能な被圧印加エ カバーを示す。第３９ａ図では、カバー４０４の圧印加工された曲部分に、試料 ウェル４０３、導管、反応容量４０２及び換気領域４０１を含んで構成されてい る。カバーを圧印加工した後、試料ウェルの穴及び換気孔を開けるかそうでない なら創成する。ここで、カバーを基底部に結合するために、（孔の上ではなく） カバーの元来の下面に粘着剤を付けてもよい。また、第３９ｂ図に示すように、 カバーが試料ウェル及び換気孔を含まない圧印加工領域を有していてもよい。こ の場合、試料ウェルと換気孔を圧印加工の後に作ることもできるが、圧印加工前 の方が好ましい。前記の場合と同様に、粘着剤をカバーの元来の下面に使用して カバーを基底−部に結合させ、反応スライドを製造することができる。第３９ａ 及びｂ図に示す例の他に、他の組合せも可能であり、例えば次のものがある：圧 印加工部分に試料ウェル領域を含むが換気孔は含まないもの；または、換気孔は 含むが試料ウェルは含まないもの。

第４０ａ及びｂ図は２つの被圧印加工・基底部を示している。

第４０ａ図では、基底部の圧印加工部分に導管、反応容量４０２及び換気領域を 含んでいる。試料ウェル孔４０３及び換気孔４０１はカバーの下にある。カバー の下面は粘着剤で被覆して基底部と結合している。また、第４０ｂ図に示すよう に、圧印加工部分に試料ウェル、導管、反応スライド及び換気孔を含むことがで きる。他の変更も可能である。

圧印または関連加工の他に、６片の射出成形により部品片を製造することもでき る。すなわち、予め形成した換気孔と試料ウェルの孔を有するカバーを適当なキ ャビティ構造を有するかまたは有しない１つの片として射出成形でき、適当なキ ャビティ構造を有するかまたは有しない基底部は別に射出成形できよう。成形し た片に自動組立のため指示用の穴またはペグを付は蝶番で結合してもよい。同様 に、圧印加工したカバー及び基底部を連続したポリマーフィルム材料から形成し 、機械で組立て、各スライドに切断してもよい。

２つの部品から形成した反応スライドは一般に、サンドウィッチ層導波路特性を 必要としない光学（または他の）測定を実施するために最も有用である。中間層 が光学ファイバーコアのように作用し、他の層が被覆用に作用する三層（以上） を使用して、内部導波路を反応スライド内に形成するのが最も適当である。しか し、これにより、反応スライド内に光を導入し、分光分析を実施させうるように 反応スライドから光を導き出す外部導波路の使用を制限するものではない。

第１７図は組立時のカバー１０、上層２０及び基底部３０を上から見た図である 。

第１ｇａ、ｂ及び０図は本発明の反応スライド１の他の実施態様の縦方向の垂直 切断図である。カバー１０、上層２０及び基底部３０は第１７図の線ＶＴ−ＶＩ に沿って切断しである。下記に詳細に示すように、反応スライド１は第１３〜１ ６図に示した以外の部材も含んでいる。

ここで第１３〜１８図を一般的に参照すると、カバーｌＯは典型的には透明な薄 いガラスまたはポリマーシートからなり、試料受は入れ口１４とカバーの端１６ に近い細長い開口部１２とが形成されている。

上層２０は、切取り部分が形成されている典型的には透明な薄いガラスまたはポ リマーシートからなる。その切取り部分は、図示したように、試料受は入れ口２ ２、反応空間２４、及び反応空間と試料受は入れ口とを接続する導管２６を形成 する幾何学的形態を有している。（反応空間２４はカバー、上層及び基底部を組 み立てると反応容量となる）。先細壁２５は導管２６と反応空間２４との間の移 行部を形成するのが好都合である。上層の端２８は２９で示すように閉鎖されて いる。

基底部３０は典型的にはカバー１０または上層２０より幾分厚い、典型的には透 明な、ガラスまたはポリマー物質のシートからなる。試料ウェルと反応容量を接 続する点で導管２６が重要である。

その重要性は、機器内にドアーまたは／Ｓラッチ開けることなく１つの領域から 他の領域へと試料の流すことのできる機器の内部と外部との連通路であることで ある。導管が短すぎると、機器壁に触ることなく試料を適正に置くことは困難で ある。もし広すぎると、試料が無駄になり、薄すぎるまたは狭すぎると、流れが 妨げられる。

本発明の好適実施例では、試料中で予備反応を引き起こすか、反応空間２４に導 入させる。

カバー１０と基底部３０はスペーサ６０で分離されており、そのスペーサ６０は ２つの粘着層６２に挟まれた上層２０からできて％ｓる。

２つの粘着層６２は各々、上層２０と力、＜−１０及び上層１０と基底部３０と を結合している。各粘着層６２は上層２０と同じ形をして０る。

すなわち、各粘着層は、上層２０の試料受は入れ口２２、反応空間２４及び導管 ２６に、相当する形状を持つ開口部を有して形成されている。従って、反応スラ イド中には試料ウェル６４と、反応容量６６と、反応容量６６と試料ウェル６４ をつなぐ導管と、スライドの外部と反応容量６６とをつなぐカッ＜−１０内の開 口部１２で形成された換気孔７６と、が形成される。

第１８ａ図では、フィルム層６０ａは２つの粘着層６２１こ挾まれている。第１ ８ｃ図では、一つのより厚い粘着層６２を使用して０る。

基底部３０に面しているカバー１０の下側表面は、試料ウェル６４中の試料を毛 細管現象で反応容量６６に引き入れる１こ充分小さ０間隔だけ、基底部３Ｇの上 側表面と離れている。このような作用は換気孔７６が存在するために可能となる 。この換気孔は、反応容量が液体で一杯になったときその１−フの境界を確定す る空気境界領域となり、反応スライドの自動測定機能を助ける。

第１３〜１５図に示すように、カバーＩＯの長さく図中で左から右）は上層２０ の長さと等しく、カバー１０の幅と上層２Ｇの幅（図中の上下）とは等しく、一 般的に基底部３０の幅よりぼ小さい。

反応容量６６中で起こっている化学反応の観察及び測定は、下記に詳細に述べる 多くの方法で実施できる。現在の所、光学的方法は好ましいが、実施するアッセ イ法に応じて方法を選択するとよい。

第１６図に、このような測定や観察を実施するために光が典型的に進む光路をた くさん示す。これらの光路は単独または組み合わせて利用できる。

光路４Ｇでは、光は上層２０の面を通って導入され、はじめに、閉鎖端２９と先 細壁２５の間の、上層部分を通る。上層のこの部分と反対側の対応部分は内部導 波路２７とする。その後、光は反応容量６６を通過し、反対側の導波路２７を通 って出ていく。図式的に示したように、この方向で導波路を通る光は内部で上層 ２Ｇの上部及び下部表面に反射される。光路４Ｇは、反応容量６６内での流体に よる光の透過または吸収に基づく測定を行うのに有用でで、試料を通過する前と 後の光の強度の比を測定する。ベール−ランバート法（Ｂｅｅ＋−Ｌｉｍｂｅ＋ ｔ　Ｌｓｖ）はこの現象を説明する。

標準検出器は光源と視覚的に一線となるように使用する。

光路４１は、光が先ず内部導波路２７を介して横向きに導入され、反応容量６６ に入り、次に試料で散乱され、散乱光の一部が基底部３０を通り下向きに進み、 反応スライドから出る、光の散乱に基づく測定を示している。光散乱測定または 比濁分析では次の光、即ち試料に非可逆的に吸収され、種々の角度で発光し、空 間／強度分布は粒子の大きさ、形及び励起エネルギーの波長に依存する光を測定 する。ＲＢｌｅｉｇｈ及びＶｉｅの理論は有用なモデルである。

標準検出器を使用する。例としては光学セルまたは光学増幅器があり、後者は光 のレベルが非常に低いときに使用する。励起源波長は特定値に固定できる。一般 に、検出器は励起方向から予め決めた角度に設定する。

光路４２及び４３は各々、カバー１０及び基底部３０の面を通って横向きに入り 、各々反応容量の上下を直接通過して全内部反射を行い、カバーまたは基底部の 反対の端を通って出ていく光を示している。参考のために本明細書で援用する、 １９８７年４月　３日出願の米国特許出願０７／　（１３３，８＋７により詳細 に説明されているように、このような光路はエバネッセント（凋落）波測定を利 用する蛍光の検出に使用できる。

カバー、反応容量及び基底部を通る垂直方向の、光路、及び反応容量中の試料か らの反射率を利用する光路を含め、他の光路も可能である。それによりカバーＩ Ｏまたは基底部３Ｇ経由で光が反応容量に入りかつ反応容量から出ていく。

反応スライドへの入光から漂遊光を除外するのが一般に望ましい。この目的には 、光の伝達に使用しない反応スライドの外部表面はすべて不透明な塗料を塗布す るのが望ましい。そのように塗布する表面は実施するアッセイ及び選択した測定 方法に応じて選択する。部品１０．２０または３Ｇのいずれも光の伝達に使用さ れないときには、金属のようなそれ自身不透明な物質で部品を作ることもできる 。

第１６図の４０及び４１にような光路を使用するときには、内部導波路２７の一 方または両方でできるだけ多（の光を伝達し、消失をできるだけ少なくすること が重要である。粘着層６２の存在によりスペーサ６０に光学ファイバ様作用をさ せることができ、導波路２７は光学ファイバのコアに、粘着層６２は被覆に対応 することが発見された。

導波路２７と粘着層６２の屈折率の不一致により臨界角度以上の角度で境界に入 射する光の全内部反射が生じる。例示のために、第２７図を参照する。第２７図 では、コア７０、コア７０を取り巻く被覆７１及びコア７０に当り通過する入射 光７２が示される。コア７０は上層の内部導波路２７に対応し、被覆７１は粘着 層６２に対応しうる。

例えば、コア７０材料の屈折率ｎ１が１．６２、被覆７１材料の屈折率ｎ２が１ ５２であれば、臨界角度のサイン（正弦）はｎ　２　／　ｎ　１で、　１．５２ １／１．６２＝　　０．９３８である。従って臨界角度は６９．８度である。

第１９図は本発明反応スライドの種々の実施態様の分解組立図を提供する。この 実施態様の上から見た図は第２０図に示し、選択した垂直１ｌＦｒ面図を第２１ 及び２２図に示す。

挿入物１１Ｇ及び挿入物カバー１００が固定した基底部３０を示す。

挿入物カバー１００は一般的に、外向き下方に曲がって壁１０４を形成し、更に 横方向に曲がってタブ１０６を形成する側面を有する概ね平面の部分１０１で形 成されている。タブ１０６は挿入物１１０を有する基底部３０に接合しており、 挿入物１１０は挿入物カバー１００の平面部分１０１　と基底部３０の間にあり 、壁１０４の高さは一般に挿入物１１０の高さに相当する。

挿入物１１０は外に向かって先細の先細壁１１６で終わる導管１１４に接続した 試料受は入れ開口部１１２を含んでいる。挿入物１１０の長さは実質的に挿入物 力、バー１００の長さより短いので、第２０図に示すように反応容量６６は挿入 物の右側に形成する。

従って、反応容量６６の部分内の壁１０４は前記実施態様の内部導波路として作 用することが判り、この目的では、反応容量６６の近くの壁１０４の少なくとも この部分は透明材料で作る。

挿入物１１０は基底部３Ｇに接合していてよいが、変更も可能である。例えば、 挿入物と基底部とを一体に形成し、成形しまたは機械にかけて適当な形状や導管 構造にすることができる。

下記に詳細に示すように、種々の実施態様による組立て反応スライドは、本発明 反応スライドを使用して実施できる多くのナッセイの内の（任意の）いずれかを 実施するのに具体的に選択した１つ以上の試薬を含んでいる。例えば、試料ウェ ルを通して、またはより好ましくは換気孔を通して充填することにより液体試薬 を反応容量中に入れることができる。次に、試薬を凍結乾燥できる。凍結乾燥過 程の正確な条件は必要な最適条件及び使用する試薬の型に依存する。従って、予 め測定した量の試薬を配備した、すぐに使用できる反応スライドが製造される。

一般に、試料または試薬または両者に接触する反応スライドの内部表面を変性さ せて、その表面の液体／固体／気体接触角度を変化させることぐこうして、表面 を処理して親水性を増すこと）が望ましい。このような処理により試料ウェルか ら反応容量への試料の流れが容易になる。

疎水性（または非極性）表面上の接触角度を減少させ、より親水性にするための 方法がたくさんある。湿潤剤として一般に使用する表面活性剤を使用できる。例 えば、少量のトライトン（Ｔｒｉｌｏｎ）型の分散剤、ツウィーン（Ｔｙｅｅｎ 　）　　（無水へキシトールの脂肪酸部分エステルのポリオキンエチレン誘導体 ）型の表面（界面）活性剤、及びブリジ（Ｂｒｉｉ）　　（高級脂肪族アルコー ルのポリオキンエチレンエーテル）型の湿潤剤を使用できる。

表面活性分子を化学誘導して表面変性することにより極性補充基を生成できる。

他の手法には制御した電気放電またはプラズマ処理を使用する表面変性を含む。

反応容量の高さは重要であり、スペーサの厚さで規定されることを特記すべきで ある（第１８図参照）。この高さは均一でなければならず、（約）　　０．００ １〜００２インチの範囲であってよい。

典型的には、この高さは好ましくは０００２〜０．００８インチであり、最も好 ましくは約０．００６インチである。

この大きさは導管中で適切な毛細管作用を行う、のに適当であるばかりでなく、 全内部反射による光の最適な導波路透過に一般的に必要とされるものと等しい。

同時に、この大きさはほぼ、層流条件が持続する間、二層系（または懸濁液）の 懸濁粒子または細胞状物質の流動の中心を選択的に相分離するのに必要な大きさ である。これは参考のために本明細書で援用する、１９８７年４月　３日に出願 の米国特許出願０７／　０３３．８１７に記載されている。

反応スライドの構造上、試料または試薬と接触する全ての物質が比較的不活性で あるべきである。当該物質の表面特性は、試料により表面が適当に湿って適切な 流動状態を提供するようなものであるべきである。一般に小さい接触角度が最も 良い。

カバー１０は常磁性物質の固体薄層からまたは被覆した常磁性物質からなる積層 体から、またはプラスチックもしくはガラスから製造できる。

常磁性物質は鉄またはニッケルでありうる。化学的に不活性な薄いコーティング 例えばポリ塩化ビニル、アクリルまたはポリカーボネートを使用できる。封入し た酸化鉄（例えばマグネタイト）を有するポリマーも使用できる。

カバーは種々のガラス及び溶融水晶からも製造できる。有利にしようできるポリ マー物質には次のものを含む：ボリカーボネート、ＰＥＴ、ＰＥＴＧ　（グリコ ール変性したポリエチレンテレフタレート）、アセテート、アクリルニトリル及 び硝酸セルロース。種々の同時押し出しフィルム、複合体及びポリマーアロイも 使用できる。最も重要なことは大きさの安定性、硬さ、弾力性及び（必要時の） 光学的清澄性である。薄いシートへの材料の加工能も因子の一つである。メタク リル酸メチル及びポリスチレンは両方とも非常に適した物質であるが、薄いシー トに加工するのが離しい。

カバーは典型的には反応容量より表面積（または投影面積）が大きい。カバーは 一般にスペーサ（例えば、２インチ×０．５インチ）と同じ長さと大きさを有す ると思われるが、必要に応じて大きくても小さくてもよい。

良好ないし優良な上層の製造に使用できる物質には次のものを含む・ポリカーボ ネート、ＰＥＴＧ、メタクリル酸メチル、ポリスチレン及びガラス。しかし２、 ガラスは所望の形に加工するのが難しい。良好ないしやや良好の上層の製造に使 用できる物質には次のものを含む：ポリ塩化ビニル、ナイロン（ポリアミド）、 ＰＥＴまたはポリエチレンテレフタレート（例えば、マイラー（ｍｙｌｍｒ）） 及びアセテート。容認できる上層の製造に使用できる物質には次のものを含む： アクリロニトリル、低密度ポリエチレンフィルム、ＰＰ／ＥＶＡ同時押し出しフ ィルム、ＥｖＡ／ナイロン／ＥＶＡ同時押し出しフィルム、ＰＰ／ＥＶＡ／ＰＥ ／ＥＶＡ同時押し出しフィルム及び配向ポリプロピｊノンフィルム。何ｌか容認 できる上層を製造できる物質には次のものを含む：ＸＴ及び高密度ポリエチレン フィルム。一般に、より良い物質は光散乱による消失が少なく、最もよく使用す る励起波長のある可視スペクトルで十分伝達されるために、より良い導波路とな る。

上層をカバー及び基底部にしつかりとめるために使用できる多くの粘着剤がある 。アクリル粘着剤が一般的に良い。最良の粘着剤は幾分柔軟性を保持し、透明で あり、硬化、圧力処理または他の方法で活性化したときの光散乱消失が低いもの である。

上層の長さ及び幅は広い範囲にわたるが、典型的にはおよそ３インチ×０．７ｓ インチの基底上に２インチ×０．５インチである。

スペーサの厚さは典型的には０．００２〜Ｇ、０１０インチの範囲である。スペ ーサが厚くなると毛細管導管の流れを時には妨害することになる。より大きな直 径の導管では毛細管作用が弱くなるため、スペーサが厚くなると反応容量の端に 隣接する空気界面での液体が失われる傾向にある。

基底部は固体の支持体であり、種々の物質で作られる。基底部は反応容量の形態 を保持し支持するに充分堅く、（モニタリングが必要であれば）反応容量領域は 透明であり、スペーサ／カバ一部品に接合できるべきである。フッ素化炭化水素 例えばテフロン（Ｔｅｌｌｏｎ）は接合が困難なため良好な基底部を形成できな い。ガラスは容認できる材料である。ポリカーボネートまたはメタクリル酸メチ ルベース材料を使用すると優れた接合が得られる。ポリカーボネートの様な物質 では、基底部の典型的な最も薄い厚さは約０．００８インチである。（透明度が 必要でなければ）アルミラム基底部はより薄くすることができる。基底部が薄す ぎると、容易に曲がりすぎ、アッセイ中の操作の間に意図せずに反応容量の容量 が変わることがある。基底部が厚すぎると、温度調節されたアッセイでは温度を 平衡にするのに時間が長くかかりすぎる。これは伝熱性の低い物質で特に真実で ある。基底部の長さと幅は可変である。

基底部は幅０．２５インチ、長さ１インチ（またはそれ以下）まで小さくできる 。一般には、基底部の幅は約０．７５インチ、長さは３インチである。これで、 試料ウェル、接続管、及び端が通気孔になっている反応容量に、充分な余地があ る。また、操作した分析機器に情報を提供するための光学的または磁気的に読み 取ることのできるコードのための部分もある。この情報には、アッセイの型、制 御のパラメータ、試薬のバッチ等の較正情報等を含みうる。下記に述べるように 、同一試料について複数のアッセイを実施しようとするときには基底部はより幅 が広くても（より長くても）よい。この場合、試料ウェルと平行に（または順次 ）つなげて複数の反応空間を使用することがある。基底部は複合物質からなるこ とができる（例えば、２層。例えば、反応容量の下にあり穴を有する、アルミニ ウム、鉄または他の金属の下層。この層の上に接合したポリカーボネートのよう な透明な物質の上層。上層は反応容量の底部を規定し、下層の穴を介して光を伝 達できる）。

反射層を使用して光透過を増強することができる。アルミニウム塗料の厚いフィ ルムを使用してこのような層を作ることがニウムの真空蒸着が含まれる。もう一 つの製造法には、金属被覆したヒートシール可能なフィルム例えば、厚さ約２０ ミクロン（またはそれ未満）の金属被覆した線状低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ ）フィルムの使用である。ポリ塩化ビニリデンのようなヒートシール可能な物質 で被覆するのであれば、他の金属被覆したポリマーフィルムも使用できる。例と しては、金属被覆したヒートシール可能なポリプロピレンフィルム（ヒートシー ル可能な物質と同時押し出ししたポリプロピレン）がある。

ヒートシールできる物質で被覆した金属被覆セロファンも使用できる。金属被覆 したフィルムは反応スライドの基底部及びカバーにヒートシールまたは粘着剤（ 例えば、シアノアクリレート）で糊付けする。金属被覆したガラスも使用できる 。

第２３図には、外部光源１２０の好適実施態様の垂直断面図、反応スライドｌの 代表実施態様の垂直断面図（これは反応容量６６の領域での断面図であり、光検 出器１２１　は反応スライド１の反応容量６６の部分の下に配置されている）を 示す。乾燥試薬１２５は反応容量６６の壁土に置く。

この実施態様では、光源１２０は、電気リード線１３４を何するＬ　Ｅ　Ｄ　１ ３２を支持するプラスティックハウジング＋３０からなる。

図示したように、ステップ１３６はノ＼ウジング１３０の中に形成する。図示し たように、カバー１０は金属のような不透明な物質で作ることができる。

使用時には、ステップ１３６が反応スライドの基底部３０を受は入れ、ＬＥＤ１ ３２が基底部３０の上に配され反応スライドの内部導波路と接触するかまたは隣 接するように、光源１２０と反応スライド１とを合わせる。

第２１図に示す配置は第１６図の４１に示すような光路を利用するように設計し である。反応スライドを通る光の分散をモニターすることによりこのような測定 を遂行する機器のより詳細な例の米国特許出願０７／　０３３．８１７に示され ており、検討されている。

第２４及び２５図では、反応スライドカバーを通る光の分散または反射率を測定 する機器を示している。／＼ウジング１４０は下部ノ＼ウジング１４２と下部ハ ウジング１４２の上にあるかまたはそれと一体化しているカバー１４４　とから なる。反応スライド１を挿入するに充分な間隔が、カバー１４４の壁１４６の下 端と下部ノ＼ウジング１４２の頂部との間にある。側面ガイド１５Ｇ及びストッ プ１５２は反応スライドｌを測定に適当な位置に配する。図示したように、光源 ＋２０及び光検出器＋２１はハウジング１４０内に置く。

反応スライドのカバーを通過する反射または分散光の角度を阻止するために光検 出器１２１のすぐ下に開口部＋５４を設ける。

反応開始前にハウジング１４０に反応スラ・イド１を挿入できるように、反応ス ライド１の試料ウェル６４をハウジング＋４０の外部に置く。

光検出器１２１を使用して反応容量６６へ試料の入る過程と反応容量内でのその 後の反応の進展をモニターできる。光源１２０１反応容量６６及び光検出器＋２ １１Ｊ周囲光から隔絶した機器部分に置く。望ましくは、周囲光に曝されている 反応スライドｌのこの部分は不透明物質で作るか、または反応容量６６がら漂遊 光を排除するために塗装する。

部材１５６　として図式的に示した温度調節システムのヒーターにより反応スラ イドを温度調整する。このようなヒーターの一つの形態としてはプレート１４８ の下部に留めた絶縁ヒーターストリップ１５７がある。使用する温度調節系の形 態に関係なく、少なくともプレート１４８の温度を３７℃に維持できることが望 ましい。

第２４及び２５図に示す機器は標準の市販型ではないが、反応スライド中で使用 するように設計したものである。分散テスト法に現在利用できる他の機器の場合 と同様に、較正情報と共に、実施するアッセイ及び使用する特定の反応スライド の確認を行うために光学または磁気コード読み取り能があると好ましい。

このようなコードは製造中に反応スライドに付与できる。更に、（下記のように ）必要に応じて撹拌用の他の構造があってもよい。また下記に示すように、図示 した機器には、システムマイクロプロセッサ、ディスプレーまたは他のデータ表 示手段、アナログからデジタルへ必要な任意の変換器、動力供給器等もあるのが 望ましい。

第２５図の考察から判るように、周囲の光を排除するために壁の下端１４６とプ レート１４８との間の間隔はできるだけ小さいことが望ましい。

第２６図は検出器が受けたアナログ信号の解析の仕方の簡略化したシステムブロ ック図式である。光源１２０は反応スライド１の反応容量を通して光を発信する 。反射されるかまたは分散された光を光検出器１７２でモニターシ、１７６で増 幅する。増幅器回路１８２で更に増幅し、直流信号をオフセットする。示したよ うに、交流信号増幅器１８０はマイクロプロセッサＣＰ　Ｕ　１７８で選択的に 調整する。ボードＡ／Ｄ変換器を使用して１７８でデジタル化し、ＣＰＵ１７８ 　とメモリーブロック＋８６でピークと傾斜を検出する。１８０の出力から、適 当なアルゴリズムを使用して、開始時と終点検出時の信号を測定する。マイクロ プロセッサＣＰ　Ｕ　１７８には他の入力と出力１８４がある。これらには温度 調整、外部データ入力等の機能を含む。ブロック１１１６はデータ及びプログラ ムメモリーを含む。ディスプレー１８８で結果を読む。

アッセイ速度論的要因の他に反応スライドの幾何学形態及び構造による反応空間 への試料の進入の動力学及び試薬との初期の相互作用をモニターする。従って、 曲線の最初の部分は適正な試料添加を管理するための情報を提供する。

上記の機器は光の分散または反射率によりどの様に測定ができるかの例を示して いる。この測定法は第５図に示す反応スライド系に好都合に使用される。第５図 では、反応スライド１は永久磁石１９５の上に近接して置かれているよう示され ている。

永久磁石１９５の下には電磁石１９６があり、これは所望の周波数で電圧を加え たり切ったりする動力供給源１９９で駆動されている。入射光を提供する光源（ 図示せず）、反応容量６６内の試料から反射された光線を検出するために置いた 検出器もある。

光線１９８として示した反射光は検出器４００で検出する。第５図に示すように 、検出器４００は理論的には９０゛　と１０”の間の任意の位置でよい。しかし 、４５゛未満の角度では、カバーの入射光からの全反射が反応のモニターを妨げ るような臨界角度にずっと達し易い。検出器４００は９０°と４５“の間が好ま しく、９０゜と７５゛の間が最も好ましい。

このような装置で実施できる測定を以下に説明する。凝固試薬と試薬に懸濁した 不活性な磁気粒子とのスラリーを形成することによって予め反応スライドを製造 した。凝固試薬はトロンボプラスチン−カルシウムであり、磁気粒子はマグネタ イトであった。液体試薬１ｍｌ当り約５〜５０■の範囲で使用すると不活性磁気 粒子は良好に作用する。そのスラリーを反応スライドに塗布し、凍結乾燥させた 。

７ツセイを実施するために、第５図に示すような位置に反応スライド１を装置に 導入した。光源は発光ダイオードであり、検出器はシリコン光ダイオードであっ た。チャートレコーダーは光ダイオード増幅器に交流接続した。永久磁石１９５ はシートの形状であった（柔軟なまたは硬い磁気物質を材料として使用できる） 。電磁石への電力は１ヘルツの周波数であった。血漿試料を試料ウェル６４に導 入し、反応容量６６を満たし、乾燥試薬を溶解させ、１９７で示すように磁気粒 子を再懸良し、凝固反応を開始させる。永久磁石１９５は磁気粒子を塊状または 山伏で下向きに到し、永久磁石の面と平行な配向で基底部に対して配する。しか し、電磁石１９６に供給するエネルギーの各サイクルに応じ、垂直の磁力線に沿 った配向で小さなほぼひげのように磁気粒子の山が上向きに立つ。このような各 々のエネルギー周期の最後には粒子はまた水平になる。

検出した反射光１９ｇは上記の磁気粒子の配向の変化に従って、光の強さが時間 に応じ変化するパターンを示す。粒子が立っているときより平なときの方が光の 強さが弱い。

試料を加えたときに検出光の強さは最初のピークを示す。その後、検出光の強さ は電磁石１９６のサイクル周波数に応じて最大値と最少値の間を循環する。血餅 形成前の時期には、検出光の強さの最大値と最少値の差異が増加する。しかし、 血餅形成が始まるとピーク間の光の強さの振動はその最大値から低下し始めた。

この点で、終点に達した。プロトロンビン時間の場合は、試料添加のピークと血 餅形成または血餅開始（終点）との間の経過時間は容易に測定できる。振動周波 数が大きくなると解像が幾分の増加しうる。

血漿と同様全血を使用しても、プロトロンビン時間の測定に上記方法は優れてい る。他の型の血液凝固アッセイにも良好に作用することが期待される。反射光を 使用する前述の方法の代わりに透過された光を使用して測定することができる。

しかし、透過光より反射光を使用した方が好都合と思われる。

ここで、種々の測定のための反応容量６６へのその他の光導入が 法と他の型の光学的測定法とについて述る。透過／吸光度、化学発光、光分散、 反射率、蛍光及びこれらの組合せに基づく透過度／吸光度、すなわち光学密度の 測定は、分散光のない（または排除した）ときの、光が試料を通過する前後の光 の強さの比を測定することが関与している。ベール−ランバート法（Ｂｅｅｒ− Ｌｘｍｂｅｒｊ　Ｌｔｖ）がこの現象を説明する。標準検出器は第２８図に示す ように光源と「−列の視野になる」配列とする。自然光またはＬＥＤ光源を使用 できる。

第２８図は反応スライドに光を導入しそして反応スライドを出た光を測定する別 な方法も示している。特に、２つの導波路１９０．１９１を有しており、これは 各々、反応スライド１の内部導波路２７の１つに入射光を運び、他方の内部導波 路２７及び導管を通過した光を受け、受けた光を光検出器＋２１に伝える。外部 導波路１９０．１９＋は、前述の反応スライドの上層２０を製造したものと同じ 型の材料で作ることができる。従って、外部導波路１９０　、１９１を使用する と、第２３図に示したポリマー／＼ウジング１３０の代わりに、反応スライドに 光を導入する構造を提供することが判る。

光学フィルタ１９２は波長の選択のために使用する。

第２８図では、比色または濁度を測定する。光はフィルタ１９２を通り、外部導 波路１９０及び内部導波路２７を通過して、次に反応容量６６を照射する。光は 反応容量を通り、右の内部導波路２７を通り、任意的なり第二の外部導波路ｉ９ １を通って透過される。

次に、光線は適切な検出器１２１に向けられる。

第２９図では、分散光を検出する第二の光検出器１２１及び検出を９０°付近の 光に限定するための開口部１９４を第２８図の配置に付は加えた。第２９図は、 （この場合は９０°）の分散及び吸収を同時に検出できる実施態様を示している 。これは第１６図の光路４０と４１の組合せに基づく。このモニター法は特徴的 な吸収スペクトルを有する沈澱または大きなポリマーの形成の間に有用であるか もしれない。

第３０図は従来の反射率測定に基づ〈実施態様である。部分統合（部分的に一体 となった）球２００に光源１２Ｇ及び光検出器１２１がはめ込まれている。部分 統合球は反応容量６６と力／＜−１０とを持つ反応スライドｌの基底部３０の下 にある。反応スライド内から部分統合球に反射されて戻った光線を測定して反応 を測定することができる。透過用の内部導波路を提供するためにスペーサ６０は 使用しないことに注目すべきである。

より一般的には、このような反射率の測定では表面または表面層の任意所望の方 向に反射した光を捕らえる。光ダイオードまたは光透過セルを波長選択性フィル ターと共に使用できる。

クベルカーモンク理論（にｕｂｅｌｋｇ−Ｍｏｒ＋ｋ　Ｔｂｔｏｔｌ　）が反射 系に有用なモデルである。

もう一つの検出法は蛍光に基づくものでよく、蛍光であり、そのために紫外線を 吸収し、多くは可視域の、より長い波長の光を発する物質の使用が関与する。蛍 光定量法は光学密度測定法と同様に反射モードで使用でき、例えばクロマトグラ ム上で試料を定量する。変更も可能であり、他の検出様式と蛍光法を組み合わせ てもよい。例えば、比濁度肝と同様に、試料を通して透過する方向に対して決ま った角度、典型的には９Ｇ’に検出器を置くことができる。第１１及び１２図を 参照して下記に述べるように、反応スライドと一体化した部分としての膜または ゲル層を使用する反射率に基づく測定が容易に得られる。

第１１図は反射率の測定にどのように反応スライドを使用するかを示している。

図から判るように、反応スライドの反応容量６６内に半透過層（例えば、膜また はゲル層）４０を置く。反応容量６６に導入できる液体及び溶解した種を吸収す るためにこの層を使用できるように、この層をカバー１０に固定する。層の１つ の表面は反応容量の上部内側の平らな表面にしっかりと結合しているかまたは近 接している。結合または近接させることにより、液体及び／または液体と溶解し た種が、半透過層の他の部分をはじめに通らずに層表面の結合または近接部分に 接触または透過することを妨げ、実際には、透明のカバーｌＯと共に窓を設け、 層内の色の変化を容易に観察できるようにする。

層は発色を定量的に測定可能とする既知の反射率の参考バックグラウンドを提供 する。はとんどの膜、膜様の層またはゲル層は湿ると、典型的に光の強さの減少 で示される反射光強度のはっきりした変化を示す。従って、層４０は反応容量６ ６に導入したときに試料を直接観察することを妨げるが、膜が湿ったときの反射 率の変化により反応容量に試料が入った正確な瞬間に信号を出すであろう。適切 な水和量（ゲル用）、親水性、厚さ及び孔の大きさを持つ多くの型の膜またはゲ ル層への試料の浸透及び「湿潤」は反応容量へ試料が入るのと一致する。場合に よっては、酸化チタンのような白化剤を膜またはゲルに添加すると反射能が上昇 して性能が改善される。

本実施態様の反応スライドの大きさを第１表に示す。膜またはゲル層構造は反応 空間の最小の大きさよりも小さな直径を有する丸いシートで作ることができる。

また、膜またはゲル層構造をスペーサ／上層に隣接した端を有する反応空間の形 状に合うように形づくることができる。膜またはゲル層構造は、各々が異なる試 薬を含有する複数の円、四角、その他の形からなり複数の反応をモニターするこ とができる。

３、転移粘着剤　　（、００２インチ）４、膜又はゲル層　　（、００４〜、０ ０６インチ）５、基　　底　　部　　　（０，０１０インチ）反応スライドへ半 透過層を結合させる粘着剤は、結合部が透光性になることが望まれる、感圧性用 途使用型のものが最も良い。感圧性粘着剤は孔内に流れ込み膜の機能を妨げるこ となく膜またはゲル層に粘着する。両面テープまたはフィルムを使用して膜また はゲル層を反応スライドに固定できるであろうが、フィルム層のない透明な感圧 粘着剤は良好な結合能を育し、使用が簡単で、一般に両面粘着テープより薄い。

剥し取る裏張りのあるロールの形のアクリル転写粘着剤が特に優れている。

懸濁した物質を排除し、液体及び溶解した種または懸濁した種のみが層の隙間ま たは孔に浸透できるように半透過膜を構成することができる。溶解または懸濁し た種の場合、孔径に特定の上限を有する層は、浸入することのできる最大の分子 、イオン、コロイド等を限定するであろう。層の表面電荷も荷電種のしきい値を 決定する役割を果たす。このことは全て、例えば膜またはゲル層の製造の分野で 周知であり、標準または通常の処全血試料から赤血球を除去シするように半透過 層を構成してもよい。別の装置を必要とし、時間と手間がかかり、血液種への余 分な操作を必要とする遠心のような独立した分離ステップを行わずに全血アッセ イを実施できるようになる、。判謹従って、血液中のヘモグロビンによる赤い色 は本質的に除外でき、こうして意味あるソレヅト（ｔｏｔｅｌ）干渉なく、クロ モゲンの測定に使用できる広範囲の波長が得られる。

膜の例を次に示す。

過層の下の反応容量部分を迅速に満たすために、スペーサ／上ゲル層はアガロー スゲル層、ポリアクリルアミドゲル層またはゼラチンゲル層であってよい。

試薬及び試薬混合物を（例えば、スライドを組み立てる前に）半透過層に加える こともできる。場合によっては、半透過層に直接試薬を結合または固定すること が有利である。半透過層に乾燥試薬を使用できることに加え、反応スライドの反 応容量に他の乾燥試薬層を使用することができる。乾燥試薬層は同じかまたは異 なる試薬を含有している。複数の半透過膜からなる多層構造も同様に使用でき、 複数の試薬、分子サイズの選択／除外及び固定化された試薬を含む広範囲のアッ セイを可能とする。

第１２図は第１１図の反応スライドの切断図を示す。半透過層４０は反応容量６ ６内にあり、透明な粘着層４２でカバー１０に結合しである。光源（図示せず） からカバー１０を通して投影される光線４３は半透過層で反射される。ぎらぎら を避けるために直角と同じ角度（反射角度）の反射光が光検出器１２１に直接当 たらないように、光線を投影する。光検出器１２１は反応スライドの半透過層部 分に視野を限定して、層４０とスペーサ／上層２０の間の反応容量６６の投影部 分が見えないようにするための開口部２０４を必要とすることがある。半透過層 用に充分な余地を残し、半透であってもよい。フレキンプルなセラミックの磁性 物質で製造層２０は半透過層を有さない反応スライド内より幾分厚くしてもよい 。

もう一つの変法は、層４０と基底部３０の間の反応容量６６内に磁気粒子を使用 して、経時変化する磁場により磁気粒子が振動モードで動くときの対流電流を調 整することである。これは下記に詳述し、第３４図に示す。

反応スライド１の反応容量６６内に強制対流電流を誘導する種々の例示的方法を 第３１〜３４図を参照して説明する。このような強制対流電流は迅速で完全な撹 拌を促進する。

第３１図は別の撹拌用配置を示している。この図では、永久磁石２１４はカバー ＩＯに固定され、２１２からの電気的駆動信号が励磁する電磁石２１０により上 下に振動する。カバーｌＯは本質的に１つの単位として磁石２１４と共に動き、 反応容量６６の容量を周期的に変化させる。液体の出入りの流れにより撹拌する 。ここでの撹拌の結果はカバー／液体境界の近くで液体を動かすのに非常に適し ている。この型の撹拌を行うために、カバー１０は薄い常磁性物質で製造して、 別の磁石２１４を不要にすることができる。別の磁石を使用するときには、ドー ナツ型または円板型してもよい。

第３２図は反応容量６６内で対流零鴇を調整し維持するもう一つの配置を示して いる。この場合、次のソレノイド２１６を使用する。ソレノイドはロッド２１８ 及びコイルを備え、適当な断続的な一方向のまたは経時変化する電流源２２Ｇで 駆動され、ロッド２１８を押し、カバー１０をはずす。ソレノイドは電流を切っ た後にロッドを上向きに戻すためにスプリングを有していてもよい。

第３３図に示すような変法では、軌道ディスク２２６の穴２２４を通る突出部材 ２２２を具備することもできる。張力スプリング２２８は図示したように突出部 材２２２を下向きに付勢する。ドライブ２３０は初めにディスク２２６を下向き に動かし、突出部材２２２と反応スライドのカバー１０を接触させる。この時点 で、突出部材２２２は、スプリング２２８による力で、局在的な圧力でカバーＩ Ｏを押す。その後、ドライブ２３０がディスク２２Ｇをその軸の回りを回転させ 、局在的に圧力を加えている点がカバー１０の上部表面上の円を辿るようにさせ る。従って、カバーＩＯは突出部材２２２の位置に従って円状のパターンを描く 局部的な歪みを持つ。このようにカバー１０が局部的に歪むことにより反応容量 ６６内で撹拌が起こる。直径０．１００の円状の断面と丸底を有する突出部材２ ２２で３ｏｔｓ、の力をかけると、ポリ力カーボネートカバー１０内で０．００ ５インチの歪みが生じうることか発見された。

もう一つの撹拌法（図示せず）は、圧電性物質で製造したまたは付設圧電性物質 を含有したカバーを使用することである。

この場合、適当な電圧を印加することにより圧電的にカッく−が動く。

上記したように、本発明の反応スライドは光度測定法ではない方法を使用して結 集を測定するアッセイの実施に使用できる。

すなわち、光エネルギーの変換（例えば、光導伝性、光ダイオードまたは光増幅 型の変換器）の他に、反応スライドは他の機構を使用してエネルギーを変換する ことができる。本発明の反応スライドに適用できる他の型の変換器には、熱量変 換器、電気化学的変換器及び粘度変換器を含む。

第３４図には、第１２図に示したものと同様であるが、反応容量６６内に磁気粒 子２０６を含む反応スライドの代表的な実施態様の垂直断面図を示している。駆 動回路１９９により電磁石＋９６を振動様式（例えば、矩形波による簡単なオン −オフ回転）で駆動する。第１図に前述したように、基底部３０にまたはその近 くにある磁気粒子は振動する。これにより制御した対流または撹拌効果が得られ る。撹拌により半透過層４０へのまたからの種の移送が促進されるであろう。半 透過層４０で反射され、光検出器１２１で検出される光４３は半透過層内での色 の生成（または消失）を示すであろう。光検出器から磁気粒子は直接は見えない ので、膜の介在によって明滅効果の信号は検出されず、従って、反射率による色 の測定に人為因子が導入されることはない。反射率により測定されるように、ア ッセイが進行し、発色（または変色）が起こるにつれ、制御した対流によりアッ セイはより速い反応速度で効果的にモニターされる。この制御した対流を最も効 果的にするためには、実施する個々のアッセイに磁場強度及び周波数を合わせて 、半透過層表面への及びからの種の輸送を最適にする必要があるかもしれない。

第３５図は粘度変換器の使用を示している。反応スライド１のカバー１０上に載 置した張力ゲージ２４８を示している。張力ゲージ２４８を使用して、カバー１ ０の曲げまたは運動の割合を、或は、ソレノイドで駆動する押しロッド２５Ｇで 下方に押したことからの回復率を測定できる。従って、粘度のモニタリングを利 用して、反応空間内での凝固反応で起きるように、反応容量６６内の流体の粘度 を測定できる。

反応容量６６への及びからの液体の流れが一定となる型の測定には粘度のモニタ リングが有用である。反応容量６６内の液体の粘度が上昇すると、カバーの運動 の妨害が増え、運動が遅延する。

粘度測定で張力ゲージ２４８を使用する代わりに、カバー１０上に載置した圧電 性部材を使用することができる。

上述のように、半発明の反応スライドは予め測定した量の試薬を保存できる。試 薬を存在さておく１つの方法は既に述べでおり、液体試薬を１つの反応容量内に 置き、次に、試薬を乾燥させて乾燥試薬が反応容量の内部表面を被覆するように する。

ここで、第３６〜３８図を参照して他の方法を説明しよう。第３６図には本発明 の反応スライドｌの部分縦断面図を示している。反応容量６６領域内、基底部３ ０上に試薬含有層２５４が示しである。

所望に応じて、試薬含有層２５４を図示したものより左側に更に広げ、先細壁２ ５や導管２６の領域を占め、さらに試料ウェル６４まで延びてもよい。図示した 反応スライドはカバー１０の換気孔を通して換気する型のものである。しかし、 試薬層２５４はどの実施態様にも使用できる。

第３７及び３８図は、本発明の反応スライドのもう一つの実施態様３３６を示し ており、この反応スライド３３６は平行配置充填で試料を充填しである試料容量 を複数個有している。反応スライド３３６の用途の中で、２つのアッセイを同時 に実施し、分散光及び透過光をモニターすることは有用である。第３７及び３８ 図１こは、この反応スライドでの実施に有用な機器の使用も示して０る。

反応スライド３３６では、３３８で示すように基底部３０、スペーサ及びカバー ｌＯが切り離されており、第−及び第二脚を形成する。カバーｌＯには試料ウェ ル６４用開口部と、各々第一反応容量３５０及び第二反応容量３５２と接続して いる換気口３５４それぞれのための開口部がある。試料ウヱル６４と、第−及び 第二分枝回路３４６．３４８につながるよう枝分かれしている共通回路３４４と を形成するよう、スペーサは切り開かれている。分枝回路３４６．３４８は各々 反応容量３５０及び３５２に続いている。前述の実施態様にあるように、スペサ ーは透明であり、反応容量に隣接する導波路２フを提供する。試料ウェル６４に 置いた試料は毛細管作用により共通回路３４４に入り、そこで分かれて、分枝回 路３４６．３４８を進み、反応容量３５０．３５２に入る。

第３７及び３８図には第一光源３５６、第二光源３５８、第一分散検出器３６０ 、第二分散検出器３６２及び透過検出器３６４　も示している。光シールド３６ ６は第二反応容量３５２が第一光源３５６からの放射を受けないよう保護する。

第−及び第二光源３５６．３５８からの光は各々第−及び第二反応容量３５０． ３５２に入り、そこで一部が９０６に分散し、基底部３０を通過し、その後分散 光は３６０及び３６２で検出することが判るであろう。透過検出器３６４は反応 容量３５２で分散も吸収もされなかった光源３５８からの光の一部を検出する。

本発明を一般的に説明してきたが、具体的な実施例を参照することによりさらに 理解できる。ここに示す実施例は説明の目的だけのものであり、特記しない限り 限定の意図は有していない。

実　　施　　例 （１゜）ヒトプラスミノーゲン０８０■／ｍ１１２μ！（２，）ヒトフィブリン 断片０．０２■／ｍｌ　　μｌ（３、）　Ｍｅｌｅｅｓ　Ｌｓｂｏｒｘｌｏ＋ｉ ｔｔから入手し、水で希釈した０、１Ｍ　　　Ｓ　−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖ＠１ −Ｌｅａ−ＬＹｓ　　−ｐｅｇ　　）　　　１０μ！成分を混合し、反応スライ ドに加え、膜の円形物を有する反応スライド内で乾燥させた。

１０％ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、平均分子量３．４００）溶 液で、市販物質（例えば、０．４５ミクロンの孔径のポリスルフォン（Ｇｅｌｍ ｓａ　５ｃｉｅ＋＋ｅｅ＋　Ｔｕｆｆ＋７ｎ　Ｍｅｍｂｒ＊ｎｅ）を被覆（また は含浸）して膜を予め調製した。白色剤（例えば、酸化亜鉛Ａｌｄｒｉｅｂ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ＊１１７）を被覆物に加えてもよい。乾燥（４７℃、 １５分）させた膜を粘着剤（例えば、５ｃｏｔｃｈ　３Ｍ移動テープの様な市販 の移動テープ）で覆い、次に、紙用の穴開は器で丸い穴を開けた。これらの膜円 形物を反応スライドのカバーに接着させた。

クエン酸塩を添加した全血、血清または血漿４０μ！を該反応スライドにかける と、試薬はすぐに溶は込み、試料の液体部分は迅速に膜を透過した。ｔ−ＰＡ濃 度に依存するこの色の強さの変化は、時間に対する光検出器増幅器電圧のプロッ トから判るように、４００ナノメーターの反射光の減少で検出した。最初の遅延 時間の後に下向きの傾斜となり、これにより第４１ａ図に示すような有用なｔ− ＰＡ濃度の動力学的測定が得られた。該反応の傾きまたは測定された反応速度を 全血試料中の実際のｔ−ＰＡ濃度に対してプロットした。第４１ｂ図に示すよう に、はぼ直線の標準曲線が得られた。次ぎに、この標準曲線を使用して、反応速 度を測定した後の全血（または血清または血漿）試料中のｔ−ＰＡ濃度を測定す ることができた。

同様の実験を実施した。この場合、スライドトップに接着した膜内形物上に０． １ＭのＳ　−２２５１１０ｕｊ！載せて風乾させてから、スライドトップをスラ イドに載せた。次ぎに、残留している試薬をスライド内で凍結乾燥させた。得ら れた結果は実施例１と同様であった。

（１，）　　５，０ＯＯＩＵ／＋ｓｌ　　ｔ−ＰＡ　　１Ｇμ！（２，）水で希 釈したＯ、　ＩＭ　　Ｓ　−２２５１（Ｈｅｌｅｎｓ　Ｌｇｂｓ　）　　１８μ ！ 前記の膜円形物を有する試薬スライド内で試薬を凍結乾燥させた。

試料中のプラスミノーゲン濃度に応じて、血漿は種々の強さの黄色を呈した。実 施例１と同様に、反応速度の測定値を得て、これを使用して標準曲線を作成し、 第４２図に示した全血試料についてのアッセイデータを解析した。

（１，）水で希釈した０、１Ｍ　　Ｓ−２２５１（Ｆｌｅｌｅｎｍ　Ｌ＊ｂ＋　 ）２８μ！ 試薬を反応スライド内で凍結乾燥させた。

試料中の遊離プラスミン濃度に応じ、血漿は種々の強さの黄色を呈した。結果は 実施例３と同様であった。

（１，）２ｍｍｏｌ／ｊ　　ＨＣｌ中の５０％グリセロールに溶解した０、３Ｃ Ｕヒトプラスミン（０＋ｌｂｏ　）　　Ｉ８ｔｌｌ（２、）水に溶解しりＧ、Ｉ Ｍ　　Ｓ−２２５１（Ｈｅｌｅｎｓ　Ｌｇｂｓ　）１０μ！ 試薬は試薬スライド中で凍結乾燥させた。

血漿は黄色を呈し、この色の強さは試料中のα−２−抗プラスミン濃度と逆比的 関係にあった。

血餅溶解アッセイ実施例 １、内因性血餅溶解をモニターするために下記の試薬混合物を含有するスライド を作製した：　０ｖｅｎ’ｓ　Ｖｅｒｏｎａｌバッファで希釈したウシトｏンビ ン、２５単位／　ｍｌ　（Ｓｉｇｍ皐Ｃｈｅ＋ａｉｃａｌ　Ｃｏ、）；１０■／ 　ｍｌＦ　ｅ　３０４粒子（Ｆｉ山ｒ法での平均粒径０．３ミクロン）；及び０ ．２■／ｍｌとなるまでトロンビンと混合したプラスミノーゲン、０．２■／ｍ ｌ。試薬を標準反応スライドに加えた。

スライドを凍結乾燥させ、ホイルで包み、使用するまで冷蔵保存した。使用時に 、本明細書に記載したように、該スライドを常磁性粒子の運動をモニターする機 器に入れ、自動的に温度を３７℃とした。治療用量の組織プラスミノーゲン活性 化因子（ｔ−Ｐ　Ａ　；　１０００１　Ｕ／ｍｌ）を含有する新鮮な、クエン酸 塩添加全血を試料ウェルに加えた。得られた信号は血餅形成及び２〜３分後の血 餅溶解開始を示した。時間に対する随意の信号サイズ（電圧）単位で、波形全体 を第４３図に示す。図から判るように、波形は早く非常に圧縮されているため、 第３及び４図に示すような個々のピークを同定することはできない。第４３図の 血餅形成領域（６００）は、試料中のフィブリノーゲン濃度に比例するような負 の傾斜（（６０１）を有する。これを第４４ａ図に示す。血餅形成をモニターで きるばかりでなく、第４３図の血餅溶解開始時間６０２は第４４ｂ図に示すよう にｔ−ＰＡ濃度に反比例することが判った。

２、内因性血餅溶解感受性をモニターするため〃のスライドを作製した。使用し たスライドは実施例１と同じ標準反応スライドであり、同じ濃度のトロンビン、 常磁性粒子及びプラスミノーゲンを含有した。さらに、スライド試薬は組換えｔ −ＰＡ４００１Ｕを含有した。スライドを実施例１と同様に凍結乾燥し、同様の 方法で保存した。スライドは前の実施例と同様の機器に使用した。試料は、新鮮 で、クエン酸塩を添加した、血栓溶解療法を行う前の全血からなった。得られた 信号は正常な血餅形成を示し、これは数分後には血餅溶解開始へと続く。使用し たｔ−ＰＡ濃度では、使用した系でのｔ−ＰＡによる患者り血餅の が溶解のされ易さが明かとなった。この種のアッセイは溶解され易さの指標また はスクリーニング手段として有用でありうる。

３、外因性血餅溶解アッセイ（または標準化した血餅溶解アッセイ）用のスライ ドを作製した。このアッセイは第一段階で反応スライド上で試薬を風乾させ、第 二段階で凍結乾燥させることからなる。第一段階で反応スライドに添加した試薬 は、ウシ−トロンビン３０Ｕ／＋ｅｌ及びＦ　ｅ　３０　＜粒子１５■／ｍｌで あった。

乾燥後、最終溶液中２■／ｍｌのフィブリノーゲン及び０．０２■／ｍＩのプラ スミノーゲンを加えた。血餅を形成した後で、スライドを凍結乾燥させた。次に 、前の実施例と同様にスライドを機ギ 器内に置き、ｔ−ＰＡを含有する新鮮で、クエン酸塩添加した全血試料を試料ウ ェルに加えた。第４３図と同様な波形が得られた。血餅溶解開始時間は、第４６ ａ図の標準曲線に示すように試料中のｔ−ＰＡ濃度に反比例することが判った。

同じクエン酸塩を添加した試料からの血漿を使用してアッセイを繰り返すと第４ ６ｂ図に示したものと同様な結果が得られた。

４、プラスミノーゲンを省き、ストレプトキナーゼを第一段階で加えたことを除 き、実施例３と同様にスライドを作製した。

得られたスライドを前の実施例と同様な機器に配置し、新鮮で、クエン酸塩添加 したプラスミノーゲン含有全血試料を試料つエルに加えた。血餅溶解開始時間は 試料中のプラスミノーゲン濃度に反比例することが判った。

５、架橋結合したカゼイン分子を使用してプラスミノーゲンまたはプラスミノー ゲン活性化因子用の外因性「血餅」溶解アッセイのためのスライドを作製した。

プラスミノーゲン活性化因子アッセイ用に欧、スライド内容物にプラスミノーゲ ンを加えた。プラスミノーゲンアッセイ用に、ｔ−ＰＡまたはストレプトキナー ゼを加え、プラスミノーゲンを省いた。０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液にカゼイ ン（ＥｓｔｆＩ３Ｋｏｄｘｋ　）を最大限溶解し、これにＦｅ３Ｏ４粒子４５■ 及びＥ　Ｄ　Ｃ（ＳｉＨ＋ｕ　ＣｈｅｌｃｚｌＣｏ、　、カルボジイミド架橋試 薬）０．２ｇを加え、室温で３０分間混合した。得られた溶液を反応スライドの 底に広げてのばし、前の実施例と同様に、全血アッセイ用にスライドをまダとめ て空気乾燥させ、使用すると、常磁性粒子運動として示されるような溶解時間と プラスミノーゲン活性化因子及びプラスミノーゲン濃度との相関関係が見られた 。

血液凝固アッセイ実施例 １、前記のように、トロンボプラスチンカルシウム試薬を使用して第１７図に示 す反応スライドを作製し、凍結乾燥させ、プロトロンビン時間アッセイを実施す るまで冷蔵保存した。

Ｃｏ５ｇ１と呼ばれる表現型を用いて機器上でアッセイを実施した。機器モニタ リング、信号処理及びデータ操作は前に詳しく述べである。

この研究は凝固不全が疑われる患者を含む５９人の患者からのクエン酸塩添加全 血及び血漿の試料について報告している。

参照方法（Ｃｏ＊ｇ−Ａ−Ｍｘｌｅ　Ｉ２．　Ｏｒｇ＊ｎｏｏ　Ｔｅｋｎｉｋｘ ；　Ｔｈ＋ｏｍｂｏｉｃ＋ｅｅｎ。

Ｐｓｅｉｌｉｃ　Ｒｅｍｏｓｆ＊ｌｉ＋）に対するＣｏＢ　Ｔの相関係数は血漿 及び血液について各々０，９７及び０．９８であった。Ｃｏ１ｇ　　Ｉのデータ プロットは一回測定の測定値を表し、参照方法のプロットは各試料について２回 測定した平均を表す。

第４７図は、左側に血漿試料、右側に全血試料について得た優れた結果を示して いる。両方のデータを血漿を使用した参照方法の平均値に対しプロットしている 。第４７図の下にまとめたものは得られた統計値を示している。

２、前の実施例のようにして作製した反応スライドを使用して、さらに迅速でよ り簡便なＰＴテストを実施するための、指から採取したばかりの試料の使用可能 性を調べた。第１表に、代表例で得た結果を示す。７個の光学ヘッドを使用して データを迅速に収集した。「Ａｎｔｏｌｅｌ　Ｊ指パンチデバイス（Ｕｌｓｌｅ ＋５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）を使用して各ドナーから全血を得た。複数のフィン ガースティックと複数の指を使用して１７個のＰＴテストを実施した。これらの 研究では、指を絞りすぎることはなく、試料は約２０秒以内に反応スライド上に 置いた。これらの条件下で、ドナーの組織トロンボプラスチンからは後生物が生 じることはないようである。テスト終了の１５分以内に、抗凝固剤を含有しない 滅菌シリンジ内に同じドナーから全静脈血を採取した。約５分間でこの血液をテ ストすることができた。実験室の３人のチームでＰＴアッセイを直ちに開始し、 その間に、３．２％の緩衝化クエン酸塩抗凝固剤を含有する空の試験管にドナー から２個の追加の試料を吸引採取した。１本のクエン酸塩添加試験管を回転させ 、次のテスト用の血漿を回収した。他はクエン酸塩添加全血としてテストした。

下表の結果から、４種類の試料ｑ平均は１２．０〜１３．３秒の範囲であった。

％で表す偏差係数は、６０回の血漿測定値についての２．５％から１７個のフィ ンガースティック測定値についての　５．４％までの範囲であった。

試料の種類　指　　静脈　Ｃｉ＋ＷＢ　　Ｃｉｌ血漿数　　　　　　１７　　　 　３０　　　　６０　　　　　６０平　　　　　均　　１２．９　　　１３．３ 　　　１２．６　　　１２．０標準偏差　０．７　　０．５　　０．５　　０． ３最　　　　　小　　＋１．８　　　１２．２　　　１１．７　　　１１．２最 　　　　　大　　１４．３１４．４　　　　Ｎ、６　　　１２．６範　　　　　 囲　　　２．５　　　　２．２　　　　１．９　　　　１．４偏差係数　５．４ ％　３．８％　４．０％　２５％３、部分トロンボプラスチン試薬、カルシウム 及び粒状の活性化因子を使用して第１７図に示すような反応スライドを作製し、 凍結乾燥させてＡＰＴＴ乾燥試薬スライドを作製した。活性化部分トロンボプラ スチン時間アッセイの実施に使用するまでスライドを冷蔵保存した。これらのア ッセイは、従来のん旦１法を使用するアッセイとは異なり１段階ＡＰＴＴアッセ イである。

従来法では、カルシウム添加前に５分間のインキュベーションを行う第一段階を 含んでいる。

第４８図はＡＰＴＴ比較試験のプロットを示している。Ｃｏｒｇ−１表現型系を 使用する１段階のＡＰＴＴアッセイ用の乾燥試薬スライドをテストし、参照方法 と比較した。参照実験ではＡＰＴＴ用の同じ参照機器及びＰ＊ｃＮｉｃ　１（ｅ ＩＩｏｓｔｓ＋ｉ＋試薬を使用した。データから判るように結果は非常に良好で あった。これ相関する。１段階法の反応時間はより長いが、５分間のインキュベ ーション段階がいらないために全体のテスト時間はより短い。１段階法の方が実 施もより簡便である。所望であれば、前述のように、１段階法の終点を電子的に 調整して２段階法の終点の値に等しく合せて記録させることもできる。

上記の教示に基づいて本発明の多くの変形や変更が可能なことは明かである。従 って、添付の請求の範囲の範囲内で、本発明は本明細書に具体的に示したちの以 外にも実施できると理解されたい。

ＦＩＧ、　１ａ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　／／ ＦＩＧ、　／２ ＦＩＧ、　１４ ＦＩＧ、　１５ ＦＩＧ、／７ ＦＩＧ、　／８Ａ ＦＩＧ、　／８Ｂ　。

ＦＩＧ、　２４ ＦＩ６．３６ ＦＩ６．３９Ｂ ＦＩ６．４０Ｂ Ｆ／Ｇ、４／Ｂ　　　　丁Ｐ”ｐ９” １１ｆｍ　（榔ｘｌＯＯＩ ＦＩＧ、　４５ ＦＩＧ、　　　４６Ａ　　　　　　　　’−丁”量　　、ｔｒｉｍ　　＋ｘｌＯ ＯＩＦＩＧ、　　４６Ｂ ＦＩＧ、　４８ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．凝固アッセイにおいて　磁気粒子含有乾燥試薬を使用したことを特徴とする 凝固アッセイ。 ２．血餅溶解または血餅溶解の活性化もしくは阻害に関与する生化学的成分につ いてのアッセイを実施する方法であって、（ｉ）磁気粒子を有する標準化した血 餅を含有する試薬に被測定量の試料を加え、ここで、磁気粒子含有試薬は反応保 持手段上にあり、（ｌａ）振動磁場、（ｌｂ）運動永久磁場または（ｌｃ）振動 磁場と静止永久磁場の組合せにかけ；そして（ｉｉ）磁気粒子連動をモニターす る ことからなる請求項１の方法。 ３．患者の血液または血漿の試料と、少なくとも１つの血餅生成試薬を含有する 乾燥試薬と、常磁性粒子とを接触させ、少なくとも１つの磁場で誘導された粒子 中の連動を光学的にモニターして試料の血餅形成及び溶解の終点を測定すること からなる血餅溶解アッセイの実施方法。 ４．（ｉ）アッセイに必要な第二成分にアッセイに必要な第一成分を加え、ここ で、第二成分は磁気粒子を有する試薬からなり、該第二成分を（ｌａ）振動磁場 、（ｌｂ）連動永久磁場または（ｌｃ）振動磁場と静止永久磁場の組合せにかけ ；そして（ｉｉ）振動磁場または運動永久磁場または振動磁場と静止永久磁場と の組合せのいずれかにより磁気粒子に誘導された動きをモニターしてアッセイを 実施する ことからなる試料の凝固アッセイの実施方法。 ５。 （１）アッセイすべき液体試料の彼測定量を（ｉ）磁気粒子及び（ｉｉ）少なく とも１つの乾燥試薬とからなる組合せに加え、ここで、該組合せを反応保持手段 上に置き、実質的に分散したまたは実質的に平らな形態に配し、そして（１ａ） 振動磁場または（ｌｂ）連動永久磁場または（ｌｃ）振動磁場と静止永久磁場の 組合せにかけ；そして （２）磁気粒子の動きをモニターする ことからなる血餅形成アッセイを実施する請求項４の方法。 ６．乾燥試薬に磁気粒子を混入してある請求項５の方法。 ７．液体試料が全血からなる請求項５の方法。 ８．液体試料が血漿からなる請求項５の方法。 ９．磁気粒子に振動磁場を印加することにより磁気粒子を振動させる請求項５の 方法。 １０．磁気粒子に連動永久磁場を印加することにより磁気粒子を動かす請求項５ の方法。 １１．乾燥試薬がトロンボプラスチンカルシウム試薬からなる請求項５の方法。 １２．血餅形成アッセイを、そのための部材中で行う方法であって、 （１）液体試料を該部材に加え、ここで、該部材は互いに接続している試料ウェ ルと反応容量とを規定している導管構造からなり、導管構造は試料ウェル中の液 体試料を毛細管現象により反応容量を引き入れ満たす幾何学的形態を有し、反応 容量を満たした後には液体試料はそこに静止し、反応容量は（ｉ）磁気粒子及び （ｉｉ）少なくとも１つの乾燥試薬の組合せを有しており、磁気粒子は（ｌａ） 振動磁場または（ｌｂ）運動磁場または（ｌｃ）振動磁場と静止永久磁場との組 合せにかけ；そして（２）磁気粒子の動きをモニターする ことからなる請求項４の方法。 １３．前記部材が外部光源から反応容量への光を伝える手段を含む請求項１２ １４．前記部材が反応容量からの分散光及び／または吸収光もしくは反射光を検 出する手段を含む請求項１２の方法。 １５．前記部材を永久磁石及び電磁石の近くに置き、電磁石で生じた振動磁場に より磁気粒子の連動を引き起こす請求項１２の方法。 １６．前記部材を永久磁石及び電磁石の近くに置き、前記部材を永久磁石と電磁 石の間に置き、電磁石で生じた振動磁場により磁気粒子の運動を引き起こす請求 項１２の方法。 １７． （１）血餅溶解試薬または血餅溶解成分含有試料の彼測定量を礎気位子を有する 血餅形成された試料に加え、ここで、磁気粒子を有する血餅形成された試料は反 応保持手段上に置き、（ｌａ）振動磁場または（ｌｂ）連動磁場または（ｌｃ） 振動磁場と静止永久磁場との組合せにかけ；そして （２）磁気粒子の動きをモニターする ことからなる血餅溶解アッセイの実施法である請求項４の方法。 １８．血餅溶解アッセイが組織プラスミノーゲン活性化因子アッセイである請求 項１７の方法。 １９．互いに接続している試料ウェルと反応容量とを規定する導管構造からなり 、反応容量は半透過層が接合した上表面で規定されており、導管構造は試料ウェ ル内の液体試料を毛細管現象で反応容量に引き入れ満たす幾何学的形態を有して おり、反応容量を満たした後液体試料はそこに静止したままとなる液体アッセイ 実施用部材。 ２０．半透過層が反応容量内での反応をモニターする手段である請求項１９の部 材。 ２１．前記部材が磁気粒子と少なくとも１つの乾燥試薬との組合せを有する請求 項１９の部材。 ２２．（１）互いに接続している試料ウェルと反応容量とを規定している導管構 造からなり、反応容量が半透過層が接合している上表面で規定されている部材、 め試料ウェルに試料を加え、ここで、該部材は反応容量中に少なくとも１つの被 測定量の試薬を含有しており；特定容量の試料は毛細管現象により反応容量中に 導入され、前記半透過層及び試薬と接触して試料と試薬の反応が始まり；そして （２）反応をモニターする ことからなる凝固反応の実施方法。 ２３．前記部材が反応容量内に少なくとも１つの試薬と磁気粒子との組合せを含 有している請求項２２の方法。 ２４．凝固アッセイ用試薬において、試薬が乾燥した形であり、磁気粒子を含有 していることを特徴とする試薬。 ２５．凝固アッセイ用試薬がフィプリン血餅アッセイ用試薬である請求項２４の 試薬。 ２６．凝固アッセイ用試薬がトロンボプラスチンカルシウム試薬である請求項２ ４の試薬。 ２７．凝固アッセイ用試薬が塩化カルシウムを含む部分トロンボプラスチン試薬 である請求項２４の試薬。 ２８．凝固アッセイ用試薬が塩化カルシウムと活性化因子を含む部分トロンボプ ラスチン試薬である請求項２４の試薬。 ２９．凝固アッセイ用試薬がトロンビンである請求項２４の試薬。 ３０．凝固アッセイ用試薬が溶解アッセイ用試薬である請求項２４の試薬。 ３１．凝固アッセイ用試薬がフィプリン血餅溶解アッセイ用試薬である請求項２ ４の試薬。 ３２．凝固アッセイ用試薬がプラスミノーゲンと、フィブリンまたはトロンビン のいずれかとを含存するプラスミノーゲン活性化因子アッセイ試薬である請求項 ２４の試薬。 ３３．凝固アッセイ用試薬がフィプリンまたはトロンビンのいずれかを含有する プラスミンアッセイ試薬である請求項２４の試薬。 ３４．凝固アッセイ用試薬がプラスミノーゲン活性化因子と、フィプリンまたは トロンビンのいずれかとを含有するプラスミノーゲンアッセイ試薬である請求項 ２４の試薬。 ３５．試薬がストレプトキナーゼまたはウロキナーゼである請求項２４の試薬。 ３６．試薬が天然または合成の組織プラスミノーゲン活性化因子である請求項２ ４の試薬。 ３７．凝固アッセイ用試薬がフィプリン及びプラスミンを含有するα−２−抗プ ラスミンアッセイ試薬である請求項２４の設薬。 ３８．磁気粒子を有する試薬が試料と相互作用して標準化血餅を生成する血餅形 成因子を含有する請求項２の方法。 ３９．磁気粒子を有する試薬が乾燥試薬である請求項２の方法。 ４０．永久磁石、時間調整手段、及び磁気粒子を含む少なくとも１つの乾燥試薬 を有する反応スライドからなる凝固アッセイを実施するキット。 ４１．試料を集め、移送または適用するためのピペットを含む請求項４０のキッ ト。 ４２．温度調節用手段、磁気粒子を動かすことのできる振動磁場または運動永久 磁場を生成する手段、照明手段を備え、常磁性粒子を有する少なくとも１つの乾 燥試薬を含有し、全血または血漿試料を受容できる機器と、磁気粒子の動きを光 学的測定によりモニターし、磁気粒子の動きの結果を解析してアッセイ測定を行 う手段と試薬を含有する部材とを含む血液凝固測定実施用システム。 ４３．本質的に非トロンボゲン性物質からなり、皮膚の刺点から血液試料を採取 し、試料を乾燥試薬含有部材に移送する移送ピペットを含む請求項４２のシステ ム。 ４４．半透過層内に少なくとも１つの乾燥試薬を含有している請求項１９の部材 。 ４５．透明表面には付着していない半透過層の表面に少なくとも１つの乾燥試薬 層が位置する請求項１９の部材。 ４６．試薬が少なくとも１つの酵素を含有している請求項４５の部材。 ４７．半透過層が１つ以上のゲルまたは膜の薄層からできており、各ゲルまたは 膜が少なくとも１つの乾燥試薬を含有している請求項１９の部材。 ４８．半透過層が薄層のゲルもしくは多層のゲル構造またはゲルの薄層もしくは 多層のゲル構造が結合している従来の非一ゲル膜からなる請求項１９の部材。 ４９反応をモニターする手段として、使用する上表面に半透過層単位が別々に結 合するように、上表面に複数の半透過層単位が結合している請求項１９の部材。 ５０．各膜が、反応をモニターする手段として使用する手段として使用されるよ うに、半透過層即ち複数の前記層が下表面に結合する請求項１９の部材。 ５１．抵投性ヒーターストリップとサーミスターからなる加熱手段が試薬含有部 材に近接している請求項４２のシステム。 ５２．ピペットが本質的に非−トロンバデン牲物質からなり、毛細管作用により 試料で満たすことができ、毛細管の換気端を覆うかまたは密封した後に試料を圧 力により放出する請求項４３のシステム。 ５３．トロンビンの全部または一部を蛇毒に代える請求項３２の試薬。 ５４．トロンビンの全部または一部を蛇毒に代える請求項３３の試薬。 ５５．トロンビンの全部または一部を蛇毒に代える請求項３４の試薬。 ５６．常磁性粒子を有する乾燥試薬が液体アッセイ実施用部材中に含まれ、該部 材は少なくとも１つの試料ウェルと該試料ウェルに接続している少なくとも１つ の反応容量とを規定する少なくとも１つの導管構造からなり、該導管構造は試料 ウェル内の液体試料を毛細管現象で反応容量に十分引き入れ満たす幾何学的形態 を有しており、反応容量を満たした後液体試料はそこに静止したままであり、該 部材はアッセイ性能を助ける光学的または磁気的にコードした較正及び／または 品質管理情報に結合茨隔 または装備されており、その情報を前記機器で読み取ることができる請求項４２ のシステム。 ５７．照射手段が、前記部材を照射する１つ以上の光源と、アッセイ実施のため の色原体性または色変性種を光学的にモニターするための１つ以上の検出器とか らなる請求項４２のシステム。 ５８．半透過層が生化学的試料または反応混合物中に懸濁した粒子または細胞性 成分を実質的に透過させない請求項１９の部材。 ５９．半透過層が木質的に溶解した高分子量の種を透過させない請求項１９の部 材。 ６０．半透過層が、層の上または中にあるイオノフォア、担体分子または受容体 分子にょりの層を通して動できない、溶解していない及び溶解した、荷電したま たは荷電していない種を本質的に透過させない請求項１９の部材。