JP2776488B2 - フィブリノゲン定量乾燥試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フィブリノゲンを定量
するための乾燥試薬、乾燥材料及びこれらの製造方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】フィブリノゲンの定量は、活性化部分ト
ロンボプラスチン時間（以下、ＡＰＴＴと略す）、プロ
トロンビン時間（以下、ＰＴと略す。）とともに血液凝
固能の異常・正常を調べる検査、あるいは出血多量の患
者等に対しての緊急検査として広く測定されている検査
項目である。

【０００３】従来のフィブリノゲン定量方法としては溶
液状の試薬（以下、溶液試薬という）を用いる方法とト
ロンビンを含有した乾燥試薬を用いる方法との２種の方
法に大別される。

【０００４】溶液試薬を用いる方法には、トロンビン時
間法、重量法、塩析法、抗フィブリノゲン抗体を用いる
方法、ラテックス粒子を使用しての凝集法等が知られて
いる。

【０００５】このうち、塩析法及び抗フィブリノゲン抗
体を用いる方法は、フィブリノゲン活性量ではなくフィ
ブリノゲン抗原量を測定しているため、血液凝固能の正
常・異常を見極める一般的な血液凝固検査では使用され
ていない。

【０００６】又、重量法は、血漿中にトロンビンを加え
反応後、形成されたフィブリン塊の重量を直接測定する
方法であるが操作の煩雑性及び測定値にばらつきがある
点等の理由でほとんど使用されていない。

【０００７】ラテックス粒子を使用しての凝集法による
定量方法は特開昭５７−４５５１号等に示されている。
該定量方法はフィブリンモノマーのラテックス粒子に対
する強い親和性を利用したものである。即ち、まず、血
漿の希釈系列を作製し、該希釈液にラテックス粒子懸濁
液を添加混合し、培養後、該粒子の団塊化を調べ、力価
を記録する。次に同じ希釈液に対してトロンビンを含有
したラテックス粒子懸濁液を添加混合し、培養後、該粒
子の団塊化を調べ、力価を記録する。前者の力価は、血
漿中に存在するフィブリンモノマーの濃度に対応し、後
者の力価は、血漿中に存在するフィブリノゲンの濃度と
フィブリンモノマーの濃度の和に対応するので、後者の
力価から前者の力価を引くことでフィブリノゲンの濃度
を算出するものである。該定量方法は血漿中のフィブリ
ンモノマーとフィブリノゲンとを同時に定量するのに有
用であるが、測定開始してからフィブリノゲンを算出す
るまでにかなり時間を要する点及び試薬準備に時間がか
かる点で緊急検査には対応できない不具合がある。

【０００８】溶液試薬を用いてのフィブリノゲン定量方
法で一般的に使用されているのは、Claussによって見い
だされたトロンビン時間法(Clauss A,Gerinungsphysiol
ogishe Schneiomethode Zur Bestimung des Fibrinogen
s,Acta Heamat,17,237,1957)である。該トロンビン時間
法は、一定量のトロンビンによるフィブリノゲンのフィ
ブリンへの変換速度は主としてフィブリノゲン濃度に依
存することを利用したものである。

【０００９】該定量方法の測定法はまず血漿を任意の緩
衝液に希釈し、該希釈液を予備加温後、トロンビンを含
む試薬溶液を加えて凝固時間を測るものである。該測定
法の終点は、透過光の減衰を検知する光学的測定或は粘
度上昇を検知する物理学的測定で見いだす方法がとられ
ている。該測定法での凝固時間とは、トロンビン試薬溶
液を添加してから前出の終点までの時間を指す。

【００１０】この定量方法及びこの定量方法に用いられ
るトロンビン試薬は広く世の中に受け入れられている。
しかし、トロンビン試薬を用いるフィブリノゲン定量方
法は、凍結乾燥されたトロンビン試薬を蒸留水等で復元
しなければならないこと（復元溶液試薬は長期の保存に
耐えない）、血漿希釈液を予備加温しなければならない
こと等で、測定するまでに時間を要するという欠点があ
った。さらに一度の希釈での定量範囲が狭いため、定量
範囲より低濃度のフィブリノゲンを含有した血漿の場合
は、希釈倍率を下げて再測定し、また、定量範囲より高
濃度のフィブリノゲンを含有した血漿の場合は、希釈倍
率を上げて再測定しなければならないという欠点があっ
た。

【００１１】一方、トロンビンを含有した乾燥試薬を用
いる方法は、近年になって考えられたもので、特表平３
−５０４０７６号公報にその方法が示されている。該測
定方法に用いられるトロンビンを含有した乾燥試薬は、
任意のトロンビン試薬溶液及びプラスミノゲン試薬溶液
とを混合し、さらに該混合液に磁性粒子を添加した溶液
を反応スライドに一定量分注し、その後、凍結乾燥した
ものである。該乾燥試薬を用いた測定方法は、トロンビ
ンを含有した乾燥試薬を任意の反応保持手段上に置き、
次にトロンビンを含有した乾燥試薬に一定量の血漿を加
え、その直後に振動磁場と静止永久磁場の組合せをか
け、該トロンビンを含有した乾燥試薬中に含有される磁
性粒子を運動させ、磁性粒子の運動シグナルを光学的に
モニターするところに特徴がある。該運動シグナルの下
降及び上昇がトロンビンを含有した乾燥試薬内の粘度上
昇及び下降に対応していることを利用して血漿中のフィ
ブリノゲン濃度とプラスミノゲン活性化因子濃度を同時
に測定できる可能性を示唆している。即ち、血漿を添加
して直後に現れる磁性粒子の運動シグナルの負の傾斜の
大きさは血漿中のフィブリノゲン濃度に比例し、磁性粒
子の運動シグナルがプラトーに達してから再度上昇し始
める溶解開始時間は、血漿中のプラスミノゲン活性化因
子の濃度に反比例するとしている。尚、上記公報におい
て、該乾燥試薬を用いたフィブリノゲンの定量方法に関
する技術的手段、その効果についての具体的説明、及び
溶液試薬を用いた定量方法との相関性等についての具体
的記載はなんらなされていない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】上記に示したようなト
ロンビンを含有した乾燥試薬を用いてフィブリノゲンが
定量できれば、測定するまでに時間がかかるという現状
の問題点は克服できる。しかし、本発明者が、特表平３
−５０４０７６号公報の方法に準じて、乾燥試薬を作製
し、該乾燥試薬と任意の血漿とを用いて測定した結果、
得られる磁性粒子の運動シグナルの負の傾斜の大きさに
あまり再現性がみられないことがわかった。 又、既知
濃度のフィブリノゲンを含有する血漿を上記の方法で複
数測定してみたところ、得られる磁性粒子の運動シグナ
ルの負の傾斜の大きさが血漿中のフィブリノゲン濃度に
対応していない場合がかなりあることもわかった。従っ
て、特表平３−５０４０７６号公報の方法に示されてい
るトロンビンを含有した乾燥試薬を用いてのフィブリノ
ゲンの定量は実際には困難であることが判明した。

【００１３】本発明が解決しようとする課題は、上記従
来技術の欠点を補う新しい技術、即ち、測定するまでに
時間を必要としなく且つ正確な定量が可能な乾燥試薬を
用いるフィブリノゲン定量方法の開発である。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記技術
課題を解決すべく鋭意研究を行ってきたところ、トロン
ビンを含有する試薬の溶解性がフィブリノゲンの定量性
能そのものに大きく影響を与えることが判った。即ち、
試薬溶解の均一性がフィブリノゲン定量における再現性
に、又、該試薬の溶解性の向上がフィブリノゲン定量範
囲の拡大につながることをつきとめ、さらに該試薬の溶
解性の均一性及びその向上は、特定の添加剤を用いるこ
とにより達成することができることを見いだし、本発明
を完成し、ここに提案するに至った。

【００１５】 即ち、本発明は、検体と直接接触させて
使用するフィブリノゲン定量乾燥試薬であって、トロン
ビン活性を有する蛋白、磁性粒子、及びアミノ酸又はそ
の塩もしくは糖類を含有してなることを特徴とするフィ
ブリノゲン定量乾燥試薬、並びに緩衝液中にトロンビン
活性を有する蛋白、磁性粒子、及びアミノ酸又はその塩
もしくは糖類を含有させてなる混合液を凍結乾燥するこ
とを特徴とする上記フィブリノゲン定量乾燥試薬の製造
方法である。

【００１６】 又、他の発明は、磁性粒子と組み合わせ
た後に検体と直接接触させて使用するフィブリノゲン定
量乾燥試薬用のフィブリノゲン定量乾燥材料であって、
トロンビン活性を有する蛋白、アミノ酸又はその塩もし
くは糖類を含有してなるフィブリノゲン定量乾燥材料、
並びに緩衝液中にトロンビン活性を有する蛋白、及びア
ミノ酸又はその塩もしくは糖類を含有させてなる混合液
を凍結乾燥することを特徴とする上記のフィブリノゲン
定量乾燥材料の製造方法である。

【００１７】本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬の調
製方法を例示すれば、トロンビン活性を有する蛋白を任
意の緩衝液に溶解し、次に、該溶解液に磁性粒子と添加
剤としてアミノ酸又はその塩もしくは糖類とを添加して
最終溶液とした後、該最終溶液を任意の反応スライドに
一定量分注し、凍結後、凍結乾燥する方法が採用でき
る。

【００１８】上記調製方法において使用する反応スライ
ドは、フィブリノゲン測定時、フィブリノゲン定量乾燥
試薬内の粘度上昇を磁性粒子の運動シグナルの減衰とし
て光学的にモニターできる反応スライドであれば、特に
限られるものではない。例示すると、図１及び図２に示
したような反応スライドが挙げられる。図１は、反応ス
ライドを上方から見た図である。図１の点線で囲んだ部
分が、フィブリノゲン定量乾燥試薬を調製するための最
終溶液の分注口と検体添加口とからなる主要部である。
主要部の構造を詳しく示したのが、図２である。白色の
ポリエステル板Ｃにまず、透明色のポリエステル板Ｂを
貼合わせ、次に、貼合わせた透明色のポリエステル板Ｂ
の上にさらに透明色のポリエステル板Ａを貼合わせて主
要部を構成する。フィブリノゲン定量乾燥試薬用最終溶
液は、図１に示す分注口から注入され、Ｄの部分に該最
終溶液が充填される。この種の反応スライドを使用した
場合、通常上記のフィブリノゲン定量乾燥試薬用最終溶
液を２０〜３０μｌ分注する。

【００１９】以下に述べるフィブリノゲン定量乾燥試薬
中の各構成成分の含量は、特に断わりがない限り、図１
及び図２に示した反応スライドを使用して２５μｌ分注
し、次いで凍結乾燥した場合のスライド１枚当りの重量
及び活性を示す。

【００２０】本発明に用いるトロンビン活性を有する蛋
白は、フィブリノゲンからフィブリンへ変換できる蛋白
を指す。この蛋白として牛由来トロンビン、ヒト由来ト
ロンビン、トロンビン様活性を有するヘビ毒蛋白等が知
られているが、本発明においては、その由来は限定され
ない。フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有されるトロン
ビン活性量は、特に限定されず、通常０．０５ＮＩＨＵ
以上で選べば良いが、０．５ＮＩＨＵ〜１．５ＮＩＨＵ
の範囲が好適である。ところで、上記トロンビン活性を
有する蛋白は、凍結乾燥品として一般に販売され容易に
入手できるので、これを用いるのが簡便である。

【００２１】本発明に用いる磁性粒子は、公知のものが
何等制限なく使用できる。例えば、四三酸化鉄粒子、三
二酸化鉄粒子、鉄粒子、コバルト粒子、ニッケル粒子、
酸化クロム粒子等が挙げられるが、得られる磁性粒子の
運動シグナルの強度の点で四三酸化鉄の微粒子が好適に
使用される。 磁性粒子の粒子径は特に限定されず、通
常平均粒子径０．０１〜１０μｍのものから選べば良い
が、０．１〜３μｍの平均粒子径のものが推奨できる。
フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有される磁性粒子の量
は、特に限定されず、通常２×１０^ー6ｇ〜２×１０^ー4ｇ
の範囲で選べば良いが、２×１０^ー5ｇ〜１．２×１０^ー4
ｇの範囲が好適である。

【００２２】本発明に用いるアミノ酸又はその塩として
は、中性アミノ酸又はその塩，酸性アミノ酸又はその
塩、及び塩基性アミノ酸又はその塩のいずれを使用して
もよいが、フィブリノゲン定量乾燥試薬に検体を添加し
た際の溶解性がより良好な点及び得られる磁性粒子の運
動シグナルがより再現性のある点で酸性アミノ酸又はそ
の塩が好適に使用できる。代表的な酸性アミノ酸または
その塩を例示すると、グルタミン酸，グルタミン酸ナト
リウム，アスパラギン酸，アスパラギン酸ナトリウム等
が挙げられる。また、中性アミノ酸又はその塩として
は、Ｌ−グリシン、Ｌ−グリシン塩酸塩、Ｌ−アラニン
等が、塩基性アミノ酸又はその塩としては、Ｌ−リジ
ン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−アルギニン等が挙げられ
る。

【００２３】本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬に含
有されるアミノ酸又はその塩の量は、０．０２ｍｇ〜１
ｍｇの範囲で選べばよいが、０．２ｍｇ〜０．８ｍｇの
範囲が好適である。

【００２４】本発明に用いる糖類は、単糖類及び多糖類
等の任意の糖類を選べば良いが、得られる磁性粒子の運
動シグナルがより再現性のある点で単糖類が好適に使用
できる。代表的な単糖類を例示するとグルコース，フル
クトース等が挙げられる。また、多糖類としては、ショ
糖、乳糖、デキストリン等が挙げられる。

【００２５】本発明のフィブリノゲン定量試薬に含有さ
れる糖類の量は、０．０２ｍｇ〜１ｍｇの範囲で選べば
よいが、０．２ｍｇ〜０．８ｍｇの範囲が好適である。

【００２６】本発明の乾燥試薬及び乾燥材料において、
上記アミノ酸またはその塩、もしくは糖類を使用しない
場合は、試薬の溶解性が悪くなり、その結果磁性粒子の
運動シグナルが得られず、定量ができない。また、これ
ら以外の添加物を使用した場合は、同様に試薬の溶解性
が悪く磁性粒子の運動シグナルが得られないケースがあ
り、運動シグナルが得られたとしても試薬の溶解性にば
らつきがみられ、その結果運動シグナルの経時変化に再
現性がみられず結局再現性良く正確な定量ができな
い。。

【００２７】凍結乾燥に先立ち、トロンビン活性を有す
る蛋白、磁性粒子、及びアミノ酸又はその塩もしくは糖
類を含有させる緩衝液は、ＰＨ６．０〜ＰＨ８．０の間
で緩衝作用があるものであれば特に限定されない。例示
すれば、２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＨ７．３５））
又は２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．４）等が好適なも
のとして挙げられる。

【００２８】上記必須成分を含む緩衝液溶液の乾燥方法
は、得られる磁性粒子の運動シグナルの強度やフィブリ
ノゲン濃度と凝固時間との相関等の点から凍結乾燥方法
が好ましい。即ち、風乾による乾燥では、試薬の溶解性
が悪いため運動シグナルが弱く終点の検知が難しい。ま
た、例え終点を見い出せたとしても終点から求められる
凝固時間がフィブリノゲン濃度に対応しない場合も生じ
る。 。

【００２９】該凍結乾燥方法は特に限定されない。例示
すると、フィブリノゲン定量乾燥試薬用最終溶液を図１
に示した分注口から反応スライドに分注した後、該反応
スライドをドライアイスや液体窒素で瞬間凍結する等の
一般的な凍結方法が使用できる。又、凍結され最終試薬
の乾燥法も特に限定されないが、前出の凍結した反応ス
ライドを真空状態で−３０℃から室温まで７時間から１
３時間かけて直線的に温度上昇させる方法が好ましい。

【００３０】本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬を用
いてのフィブリノゲン定量は、該試薬を任意の反応保持
手段上に置き、次いで該試薬に一定量の検体を加え、そ
の直後に振動磁場と静止永久磁場の組合せをかけ、試薬
中に含有される磁性粒子を運動させ、そして、その磁性
粒子の運動シグナルを光学的にモニターする装置で行う
ことができる。

【００３１】本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬を用
いてのフィブリノゲン定量に使用できる装置を例示する
と、商品名ＣＧ−０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］，商品名Ｃ
ＯＡＧ−１［和光純薬工業（株）販売］等が挙げられ
る。

【００３２】本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬を用
いてのフィブリノゲン定量は、上記に述べたように該試
薬に検体を添加した後得られる磁性粒子の運動シグナル
強度の経時変化を基に行うことができる。

【００３３】磁性粒子の運動シグナル強度の経時変化を
基に任意の検体のフィブリノゲン濃度を定量する方法
は、特に限定されない。検体を添加して直後に現れる磁
性粒子の運動シグナルの負の傾斜の大きさを利用する公
知の方法の他に、運動シグナル強度の任意の点を終点と
し、検体を添加してから該終点までの時間を凝固時間と
して、該凝固時間を利用する方法等が使用できる。

【００３４】運動シグナル強度の任意の点を終点とし、
検体を添加してから該終点までの時間を凝固時間とする
方法を例示すると、得られた磁性粒子の運動シグナルの
ピーク値に対して所定の割合で減衰した点を終点とし、
検体を添加してから該終点までの時間を凝固時間とする
方法等が挙げられる。このような方法で得られた凝固時
間は検体中のフィブリノゲン濃度に相関している。

【００３５】該凝固時間を利用しての任意の血漿のフィ
ブリノゲン定量法も特に限定されないが、代表的な例を
示すと、まず、フィブリノゲン濃度が既知で且つ濃度の
異なる３種類の血漿を任意の希釈緩衝液に希釈し、該希
釈液を検体として使用し、上記の方法でそれぞれの血漿
に対応する凝固時間を得た後、それを基に検量線を作成
する。次に任意の血漿を前出と同じ希釈緩衝液に同希釈
倍率で希釈し、該希釈液を検体として使用し、上記の方
法で任意の血漿に対応する凝固時間を得た後、前に作成
した検量線を使用して任意の血漿のフィブリノゲン濃度
を見いだす方法が挙げられる。尚、該方法に使用される
検量線は両対数グラフでＸ軸をフィブリノゲン濃度と
し、Ｙ軸を凝固時間とした検量線が好適に使用できる。

【００３６】 他の発明である、磁性粒子と組み合わせ
た後に検体と直接接触させて使用するフィブリノゲン定
量乾燥試薬用のフィブリノゲン定量乾燥材料であって、
トロンビン活性を有する蛋白、アミノ酸又はその塩もし
くは糖類を含有してなるフィブリノゲン定量乾燥材料の
調製方法を例示すれば、トロンビン活性を有する蛋白を
任意の緩衝液に溶解し、次に該溶解液に添加剤としてア
ミノ酸又はその塩もしくは糖類とを添加した最終溶液を
任意の反応カップに一定量分注し、凍結後、凍結乾燥す
る方法が採用できる。

【００３７】該フィブリノゲン定量乾燥材料は、前述の
ごとく、予め溶液状態で磁性粒子を含ませた後に乾燥す
ることによりフィブリノゲン定量乾燥試薬となり得る
が、この定量乾燥材料とスチールボールとを組み合わせ
ることによっても以下のごとくフィブリノゲンの定量が
可能となる。

【００３８】本発明のフィブリノゲン定量乾燥材料を使
用しての測定方法を例示する。ＫＣ−１０Ａ（アメルン
グ社製）の反応カップ中に前述の必須成分からなるフィ
ブリノゲン定量乾燥材料を調製する。ついで、該乾燥材
料上にスチールボール（バクスター社製）を入れた後、
検体を添加する。検体を添加してからスチールボールが
動き出すまでの時間を凝固時間として測定する。このよ
うな方法で得られた凝固時間は検体中のフィブリノゲン
濃度に相関している。該凝固時間を利用しての任意の血
漿のフィブリノゲン定量法は特に限定されないが、先
ず、フィブリノゲン濃度が既知で且つ濃度の異なる３種
類の血漿を任意の希釈緩衝液に希釈し、該希釈液を検体
として使用し、上記の方法でそれぞれの血漿に対応する
凝固時間を得た後、それを基に検量線を作成する。次に
任意の血漿を前出と同じ希釈緩衝液に同希釈倍率で希釈
し、該希釈液を検体として使用し、上記の方法で任意の
血漿に対応する凝固時間を得た後、前に作成した検量線
を使用して任意の血漿のフィブリノゲン濃度を見いだす
方法が挙げられる。尚、該方法に使用される検量線は両
対数グラフでＸ軸をフィブリノゲン濃度とし、Ｙ軸を凝
固時間とした検量線が好適に使用できる。

【００３９】上記フィブリノゲン定量乾燥材料に含有さ
れるトロンビン活性を有する蛋白の含量は特に限定され
ず、通常０．５ＮＩＨＵ以上で選べばよいが、５ＮＩＨ
Ｕ〜１５ＮＩＨＵの範囲が好適である。

【００４０】同じく上記フィブリノゲン定量乾燥材料に
含有されるアミノ酸又はその塩、もしくは糖類の含量
は、０．２ｍｇ〜１０ｍｇの範囲で選べばよいが、２．
０ｍｇ〜８．０ｍｇの範囲が好適である。

【００４１】その他、各構成成分の具体例、乾燥材料の
調製法等は、前出のフィブリノゲン定量乾燥試薬と同様
である。

【００４２】また、該乾燥材料の乾燥方法も、前記理由
と同じ理由により凍結乾燥法を採用することが好まし
い。

【００４３】このフィブリノゲン定量乾燥材料を用いる
ことにより、従来の溶液試薬用のフィブリノゲン定量装
置をそのまま使用して、しかしながら予備加温等の面倒
な操作をすることなしにフィブリノゲンを定量すること
が可能となった。

【００４４】

【発明の効果】本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬を
用いることにより、溶液試薬を用いたトロンビン時間法
によるフィブリノゲン定量方法に比して、トロンビン試
薬の復元などの試薬準備及び検体加温時間が不要とな
り、血漿の希釈のみで迅速にフィブリノゲン定量ができ
るようになった。又、該乾燥試薬は、フィブリノゲンの
定量範囲が広いため、溶液試薬の場合のように定量範囲
から外れたフィブリノゲン濃度をもつ血漿では希釈倍率
を変えて再測定するという操作が実質的に不要となっ
た。ちなみに、従来の溶液試薬では検体の２０倍希釈で
１５０〜８００ｍｇ／ｄｌの濃度範囲しか測定できない
のに対して、本発明の乾燥試薬を用いれば検体の２０倍
希釈で５０〜８００ｍｇ／ｄｌの濃度範囲の測定が可能
で、本発明の乾燥試薬は感度が高く低濃度領域まで同一
希釈で測定できるという特徴を有する。。

【００４５】さらに、本発明のフィブリノゲン定量乾燥
試薬を用いてフィブリノゲンを定量した結果と溶液試薬
を用いてフィブリノゲンを定量した結果との相関が、従
来のトロンビンを含有した乾燥試薬より極めて良くな
り、且つ定量の再現性も好成績が得られ、より信頼性の
ある測定を可能ならしめた。

【００４６】以上の結果、本発明のフィブリノゲン定量
乾燥試薬が開発されたことにより、測定装置が小型化で
き更に操作が簡便になったため、ベッドサイドでのしか
も必ずしも熟練者を必要としない緊急検査に対応できる
ようになった。

【００４７】

【００４８】

【実施例】本発明を一般的に説明してきたが、以下の具
体的な実施例を参照することによりさらに理解できる。
ここに示す実施例は説明の目的だけのものであり、特記
しない限り限定の意図は有しない。

【００４９】実施例１及び比較例１ 添加剤の種類によ
る磁性粒子の運動シグナルの経時変化の比較 乾燥試薬を使用してフィブリノゲンを定量する装置とし
てＣＧ−０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用し、乾燥試薬
としては、グルコースを含有するトロンビン試薬（以
下、グルコース試薬と略す。）と、Ｌ−グルタミン酸ナ
トリウム一水和物を含有するトロンビン試薬（以下、グ
ルタミン酸試薬と略す。）と、牛血清アルブミンを含有
するトロンビン試薬（以下、アルブミン試薬と略す。）
と、Ｔｗｅｅｎ８０を含有するトロンビン試薬（以下、
Ｔｗｅｅｎ８０試薬と略す。）と、ＰＥＧ６０００を含
有するトロンビン試薬（以下、ＰＥＧ６０００試薬と略
す。）と、グリセロールを含有するトロンビン試薬（以
下、グリセロール試薬と略す。）の６種類として、各乾
燥試薬の磁性粒子の運動シグナルの経時変化を比較し
た。 グルコース試薬の調製は、以下のように行った。
トロンビン試薬（デイド社製）に純水を加えて、１００
Ｕ／ｍｌのトロンビン水溶液を作製した。該水溶液と
１．５％グルコース（和光純薬工業製）を含有した３０
ｍＭＨＥＰＥＳ（同仁化学製）緩衝液（ＰＨ７．３５）
とを１：２に混合した。さらに該混合液に最終濃度５ｍ
ｇ／ｍｌになるように磁性粒子（レアメタリック社製）
を添加混合して、グルコース試薬用最終溶液とした。該
最終溶液２５μｌを図１に示す反応スライドに分注し
た。該反応スライドを液体窒素で瞬間凍結し、凍結後、
凍結乾燥することでグルコース試薬を調製した。凍結乾
燥の条件は、真空状態で、−３０℃から２０℃まで８時
間かけて直線的に上昇させる方法で行った。

【００５０】又、グルタミン酸試薬の調製は、以下のよ
うに行った。トロンビン試薬（デイド社製）に純水を加
えて、１００Ｕ／ｍｌのトロンビン水溶液を作製した。
該水溶液と３．０％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和
物（和光純薬工業製）を含有した３０ｍＭＨＥＰＥＳ
（同仁化学製）緩衝液（ＰＨ７．３５）とを１：２に混
合した。さらに該混合液に最終濃度５ｍｇ／ｍｌになる
ように磁性粒子（レアメタリック社製）を添加混合し
て、グルタミン酸試薬用最終溶液とした。該最終溶液２
５μｌを上と同じ反応スライドに分注した。該反応スラ
イドの凍結・凍結乾燥条件は、前出のグルコース試薬の
方法と同様な方法で行った。

【００５１】次に、アルブミン試薬の調製は、以下のよ
うに行った。トロンビン試薬（デイド社製）に純水を加
えて、１００Ｕ／ｍｌのトロンビン水溶液を作製した。
該水溶液と４．５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン（シグマ
社製）を含有した３０ｍＭＨＥＰＥＳ（同仁化学製）緩
衝液（ＰＨ７．３５）とを１：２に混合した。さらに該
混合液に最終濃度５ｍｇ／ｍｌになるように磁性粒子
（レアメタリック社製）を添加混合して、アルブミン試
薬用最終溶液とした。該最終溶液２５μｌを上と同じ反
応スライドに分注した。該反応スライドの凍結・凍結乾
燥条件は、前出のグルコース試薬の方法と同様な方法で
行った。

【００５２】さらに、Ｔｗｅｅｎ８０試薬の調製は、以
下のように調製した。トロンビン試薬（デイド社製）に
純水を加えて、１００Ｕ／ｍｌのトロンビン水溶液を作
製した。該水溶液と０．０７５％Ｔｗｅｅｎ８０（和光
純薬工業製）を含有した３０ｍＭＨＥＰＥＳ（同仁化学
製）緩衝液（ＰＨ７．３５）とを１：２に混合した。さ
らに該混合液に最終濃度５ｍｇ／ｍｌになるように磁性
粒子（レアメタリック社製）を添加混合して、Ｔｗｅｅ
ｎ８０試薬用最終溶液とした。該最終溶液２５μｌを上
と同じ反応スライドに分注した。該反応スライドの凍結
・凍結乾燥条件は、前出のグルコース試薬の方法と同様
な方法で行った。

【００５３】ＰＥＧ６０００試薬の調製は、以下のよう
に行った。トロンビン試薬（デイド社製）に純水を加え
て、１００Ｕ／ｍｌのトロンビン水溶液を作製した。該
水溶液と１．５％ＰＥＧ６０００（コッホライト社製）
を含有した３０ｍＭＨＥＰＥＳ（同仁化学製）緩衝液
（ＰＨ７．３５）とを１：２に混合した。さらに該混合
液に最終濃度５ｍｇ／ｍｌになるように磁性粒子（レア
メタリック社製）を添加混合して、ＰＥＧ６０００試薬
用最終溶液とした。該最終溶液２５μｌを上と同じ反応
スライドに分注した。該反応スライドの凍結・凍結乾燥
条件は、前出のグルコース試薬の方法と同様な方法で行
った。

【００５４】 グリセロール試薬の調製は、以下のよう
に行った。トロンビン試薬（デイド社製）に純水を加え
て、１００Ｕ／ｍｌのトロンビン水溶液を作製した。該
水溶液と０．７５％グリセロール（和光純薬工業製）を
含有した３０ｍＭのＨＥＰＥＳ（同仁化学製）緩衝液
（ＰＨ７．３５）とを１：２に混合した。さらに該混合
液に最終濃度５ｍｇ／ｍｌになるように磁性粒子（レア
メタリック社製）を添加混合して、グリセロール試薬用
最終溶液とした。該最終溶液２５μｌを上と同じ反応ス
ライドに分注した。該反応スライドの凍結・凍結乾燥条
件は、前出のグルコース試薬の方法と同様な方法で行っ
た。比較方法は、先ず、２００ｍｇ／ｄｌのフィブリノ
ゲンを含有する血漿をオーレン緩衝液（シグマ社製）で
２０倍希釈する。次に、フィブリノゲン定量装置ＣＧ−
０１に上記６種類の乾燥試薬をセットし、前出の希釈液
（希釈した血漿からなる検体のことである。以下の実施
例及び比較例においても測定直前に添加する希釈液は検
体と同義である。）２５μｌを添加した後、各試薬から
得られる磁性粒子の運動シグナルを光学的にモニターす
ることで行った。

【００５５】希釈液を添加後の磁性粒子の運動シグナル
の経時変化を見たのが、図３である。Ａのグラフは、グ
ルコース試薬を用いた場合のグラフであり、Ｂのグラフ
は、グルタミン酸試薬を用いた場合のグラフであり、Ｃ
のグラフは、アルブミン試薬を用いた場合のグラフであ
り、Ｄのグラフは、Ｔｗｅｅｎ８０試薬を用いた場合の
グラフであり、Ｅのグラフは、ＰＥＧ６０００試薬を用
いた場合のグラフであり、Ｆのグラフは、グリセロール
試薬を用いた場合のグラフである。図３から容易に判る
ように、磁性粒子の運動シグナルの経時変化が試薬中の
粘度上昇に対応しているのは、グルコース試薬とグルタ
ミン酸試薬とグリセロール試薬である。他の試薬では試
薬の溶解性が悪く、磁性粒子の運動シグナルが試薬中の
粘度上昇に対応していない。

【００５６】比較例２ 添加剤を使用しない乾燥試薬 乾燥試薬を使用してフィブリノゲンを定量する装置とし
てＣＧ−０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用し、乾燥試薬
としては、添加剤を添加しない乾燥試薬（以下、無添加
試薬と略す。）を以下のように調製して磁性粒子のの運
動シグナルの経時変化を調べた。

【００５７】トロンビン試薬（デイド社製）に純水を加
えて、１００Ｕ／ｍｌのトロンビン水溶液を作製した。
該水溶液と３０ｍＭＨＥＰＥＳ（同仁化学製）緩衝液
（ＰＨ７．３５）とを１：２に混合した。さらに該混合
液に最終濃度５ｍｇ／ｍｌになるように磁性粒子（レア
メタリック社製）を添加混合して、無添加試薬用最終溶
液とした。該最終溶液２５μｌを図１に示す反応スライ
ドに分注した。該反応スライドを液体窒素で瞬間凍結
し、凍結後、凍結乾燥することで、凍結乾燥試薬を作製
した。凍結乾燥の条件は、真空状態で、−３０℃から２
０℃まで８時間かけて直線的に上昇させる方法で行っ
た。

【００５８】測定方法は、先ず、２００ｍｇ／ｄｌのフ
ィブリノゲンを含有する血漿をオーレン緩衝液（シグマ
社製）で２０倍希釈する。次に、フィブリノゲン定量装
置ＣＧ−０１に上記乾燥試薬をセットし、前出の希釈液
２５μｌを添加した後、無添加試薬から得られる磁性粒
子の運動シグナルを光学的にモニターすることで行っ
た。

【００５９】無添加試薬を用いた場合は、比較例１のＰ
ＥＧ６０００試薬の場合と同様のグラフとなり磁性粒子
の運動シグナルは得られず、定量不能であった。 実施例２及び比較例３ 凝固時間の再現性 実施例１及び比較例１のグルコース試薬、グルタミン酸
試薬、グリセロール試薬及び特表平３−５０４０７６号
公報で示されている従来の乾燥試薬の４種類の試薬を使
用し、又、フィブリノゲンを定量する装置としてＣＧ−
０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用して、上記の各試薬で
得られる凝固時間の再現性を調べた。

【００６０】試験方法は、まず、２００ｍｇ／ｄｌのフ
ィブリノゲンを含有する血漿をオーレン緩衝液（シグマ
社製）で２０倍希釈する。次に、フィブリノゲン定量装
置ＣＧ−０１に上記試薬をセットし、前出の希釈液２５
μｌを添加した後、試薬から得られる磁性粒子の運動シ
グナルを光学的にモニターすることで行った。この操作
を各試薬につき５回行った。

【００６１】終点の検知方法及び凝固時間の認識方法
は、図４に示した磁性粒子の運動シグナルの経時変化グ
ラフに対して、運動シグナルのピーク値に対して３０％
減衰した点を終点とし、検体を添加してから該終点まで
の時間を凝固時間とする方法を採用した。即ち、図４中
のＡが終点であり、図４中のＢが凝固時間である。

【００６２】結果を示したのが表１である。表１を見て
も判るとおり、得られる凝固時間に再現性が見られるの
は、本発明のグルコース試薬とグルタミン酸試薬のみで
ある。

【００６３】その他の試薬は、試薬の溶解性が均一でな
いために得られる磁性粒子の運動シグナルの経時変化に
再現性が見られない。そのために、得られる凝固時間に
再現性がみられなくなることが判明した。

【００６４】

【表１】

【００６５】実施例３及び比較例４ 乾燥方法の違いに
よる磁性粒子の運動シグナルの経時変化の比較 乾燥試薬を使用してフィブリノゲンを定量する装置とし
てＣＧ−０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用し、乾燥試薬
としては、製造方法の異なるＬ−グルタミン酸ナトリウ
ム一水和物を添加剤としたフィブリノゲン定量乾燥試薬
の２種類として、２種の乾燥試薬の磁性粒子の運動シグ
ナルの経時変化を比較した。

【００６６】製造方法の異なる乾燥試薬とは、凍結後、
凍結乾燥した乾燥試薬（以下、凍結乾燥試薬と略す。）
と風乾した乾燥試薬（以下、風乾試薬と略す。）の２種
類である。

【００６７】凍結乾燥試薬の調製は、以下のように行っ
た。トロンビン試薬（デイド社製）に純水を加えて、１
００Ｕ／ｍｌのトロンビン水溶液を作製した。該水溶液
と３．０％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物（和光
純薬工業製）を含有した３０ｍＭＨＥＰＥＳ（同仁化学
製）緩衝液（ＰＨ７．３５）とを１：２に混合した。さ
らに該混合液に最終濃度５ｍｇ／ｍｌになるように磁性
粒子（レアメタリック社製）を添加混合して、凍結乾燥
試薬用最終溶液とした。該最終溶液２５μｌを図１に示
す反応スライドに分注した。該反応スライドを液体窒素
で瞬間凍結し、凍結後、凍結乾燥することで、凍結乾燥
試薬を作製した。凍結乾燥の条件は、真空状態で、−３
０℃から２０℃まで８時間かけて直線的に上昇させる方
法で行った。 一方、風乾試薬の調製方法は以下のよう
に行った。上記と同様な最終溶液を使用し、該最終溶液
２５μｌを上と同じ反応スライドに分注した。該反応ス
ライドを真空状態で３０℃，１２時間の処理を行うこと
によって、風乾試薬を作製した。

【００６８】比較方法は、先ず、２００ｍｇ／ｄｌのフ
ィブリノゲンを含有する血漿をオーレン緩衝液（シグマ
社製）で２０倍希釈する。次に、フィブリノゲン定量装
置ＣＧ−０１に上記２種類の乾燥試薬をセットし、前出
の希釈液２５μｌを添加した後、各試薬から得られる磁
性粒子の運動シグナルを光学的にモニターすることで行
った。

【００６９】希釈液を添加後の磁性粒子の運動シグナル
の経時変化を見たのが、図５である。

【００７０】Ａのグラフは、凍結乾燥試薬を用いた場合
のグラフであり、Ｂのグラフは、風乾試薬を用いた場合
のグラフである。風乾試薬を用いた場合は、得られる磁
性粒子の運動シグナルが弱いが、凍結乾燥試薬を用いた
場合は、得られる磁性粒子の運動シグナルが十分に強
く、又、再現性の良いものであった。

【００７１】実施例４ フィブリノゲン濃度と得られる
凝固時間の相関性 使用するフィブリノゲン定量乾燥試薬を実施例３の凍結
乾燥試薬とし、フィブリノゲンを定量する装置としてＣ
Ｇ−０１［（株）Ａ＆Ｔ販売］を使用して、得られる凝
固時間とフィブリノゲンの濃度との相関性を調べた。

【００７２】終点の検知方法及び凝固時間の認識方法
は、実施例２と同様に行った。凝固時間とフィブリノゲ
ン濃度との相関性を調べる方法は、以下のように行っ
た。先ず、８００ｍｇ／ｄｌのフィブリノゲンを含有す
るヒト血漿と、フィブリノゲン欠乏ヒト血漿（ジョ−ジ
キング社製）とを使用して、５０〜８００ｍｇ／ｄｌま
でのヒト血漿の希釈系列を作製した。次いで、該希釈系
列の血漿をそれぞれオーレン緩衝液（シグマ社製）で２
０倍希釈した。そして、フィブリノゲン定量装置ＣＧ−
０１に上記凍結乾燥試薬をセットし、前出の希釈液２５
μｌを添加し、上記の方法で各々の希釈液の凝固時間を
求める。最後に、両対数グラフのＸ軸をフィブリノゲン
濃度とし、Ｙ軸を得られる凝固時間としてデータをプロ
ットし、作製したグラフに直線性が見られるか否かで相
関性の有無を調べた。

【００７３】図６にフィブリノゲン濃度と得られる凝固
時間との相関図を示した。図６を見ても判るように、フ
ィブリノゲン濃度と凝固時間との間では直線関係が得ら
れ、相関があることが明確である。又、図６の結果は、
血液凝固能検査で必要とされる５０〜８００ｍｇ／ｄｌ
のフィブリノゲン濃度範囲の全領域が２０倍希釈で一度
に定量できることを示している。

【００７４】さらに、上記血漿を１０倍希釈して凝固時
間を測定した場合でも、４０倍希釈して凝固時間を測定
した場合でも、２０倍希釈した場合と比して定量範囲は
異なるものの、得られた凝固時間と血漿中フィブリノゲ
ン濃度との間では直線関係が得られることが確認でき
た。

【００７５】実施例５ 溶液試薬法と本発明の乾燥試薬
法との相関 ヒト血漿４１検体を用い、溶液試薬を用いる従来の方法
でフィブリノゲンを定量した結果と本発明の乾燥試薬を
使用してフィブリノゲンを定量した結果との相関を比較
した。

【００７６】溶液状の試薬を用いる従来の方法を使用し
てのフィブリノゲンの定量は、試薬をデータファイ・フ
ィブリノゲン（デイド社製）とし、測定装置をＫＣ−１
０（アメルング社製）とし、データファイ・フィブリノ
ゲンの能書に示された方法で定量した。

【００７７】本発明の乾燥試薬を使用してのフィブリノ
ゲンの定量は、以下のように行った。使用するフィブリ
ノゲン定量乾燥試薬を実施例３の凍結乾燥試薬とし、フ
ィブリノゲンを定量する装置としてＣＧ−０１［（株）
Ａ＆Ｔ販売］を使用して行った。尚、終点の検知方法及
び凝固時間の認識方法は、実施例２と同じ方法をとっ
た。先ず、ヒト血漿をそれぞれオーレン緩衝液（シグマ
社製）で２０倍希釈した。次いで、フィブリノゲン定量
装置ＣＧ−０１に上記凍結乾燥試薬をセットし、前出の
希釈液２５μｌを添加し、上記の方法で各々の希釈液の
凝固時間を求める。最後に、実施例４の図６に示したグ
ラフを検量線として使用して、得られる凝固時間から血
漿中のフィブリノゲン濃度を見いだす方法を使用した。

【００７８】図７に溶液試薬を用いる従来の方法で定量
したフィブリノゲン定量値と本発明の方法で定量したフ
ィブリノゲン定量値の相関図を示した。

【００７９】図７をみて判る通り、溶液試薬を用いる従
来の方法で定量したフィブリノゲン定量値と本発明の方
法で定量したフィブリノゲン定量値には相関性が高いこ
とが明確である。

【００８０】実施例６ フィブリノゲン定量乾燥材料に
よる凝固時間とフィブリノゲン濃度との相関性 ＫＣ−１０Ａ（アメルング社製）に適用するフィブリノ
ゲン定量乾燥材料は以下のように調製した。

【００８１】トロンビン試薬（デイド社製）に純水を加
えて、１００Ｕ／ｍｌのトロンビン水溶液を作製した。
該水溶液と３．０％Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和
物（和光純薬工業製）を含有した３０ｍＭＨＥＰＥＳ緩
衝液（同仁化学製）緩衝液（ＰＨ７．３５）とを１：２
に混合し、フィブリノゲン定量乾燥材料用最終溶液とし
た。該最終溶液３００μｌを反応カップ（バクスター社
製）に分注した。該反応カップを液体窒素で瞬間凍結
し、凍結後、凍結乾燥することでフィブリノゲン測定乾
燥材料を調製した。凍結乾燥の条件は、真空状態で、−
３０℃から２０℃まで８時間かけて直線的に上昇させる
方法で行った。

【００８２】測定方法は、該フィブリノゲン定量乾燥材
料をＫＣ−１０Ａにセット後、スチールボール（バクス
ター社製）をいれ、次いで、検体３００μｌを添加して
からスチールボールが動き出す時間を凝固時間とする方
法を採用した。

【００８３】得られる凝固時間とフィブリノゲン濃度と
の相関性を調べる方法は、以下のように行った。まず、
実施例４で作製した２００、３００、４００、５００、
６００、７００ｍｇ／ｄｌのフィブリノゲン濃度を有す
る６種類のヒト血漿をそれぞれオーレン緩衝液（シグマ
社製）で２０倍希釈した。次に、その希釈液を検体とし
て用い、上記の方法で各々の希釈液の凝固時間を求め
た。最後に、両対数グラフのＸ軸をフィブリノゲン濃度
とし、Ｙ軸を得られる凝固時間としてデータをプロット
し、作製したグラフに直線性が見られるか否かで相関性
の有無を調べた。図８にフィブリノゲン濃度と得られる
凝固時間との相関図を示した。図８をみても判るよう
に、フィブリノゲン濃度と凝固時間との間では直線関係
が得られ、相関があることが明確である。従って、この
本発明のフィブリノゲン定量乾燥材料を使用すれば、溶
液試薬用のフィブリノゲン定量装置をそのまま使用して
予備加温等の面倒な準備操作をすることなしにフィブリ
ノゲンを定量することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬による
フィブリノゲン定量に使用する代表的な反応スライドの
例である。

【図２】 図１の反応スライドの部分分解図である。

【図３】 各種乾燥試薬に検体を添加してからの磁性粒
子の運動シグナルの強さの経時変化を示した図である。

【図４】 フィブリノゲン定量乾燥試薬を使用してフィ
ブリノゲン量に対応する凝固時間を得る場合の終点解析
方法を示す図である。

【図５】 凍結乾燥試薬と風乾試薬の磁性粒子の運動シ
グナルの強さの経時変化の違いを示した図である。

【図６】 図４の終点解析法を使用して得られる凝固時
間と血漿中フィブリノゲン濃度の関係を示した図であ
る。

【図７】 従来の溶液試薬法でのフィブリノゲン定量値
と本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬を用いた場合の
フィブリノゲン定量値の相関図である。

【図８】 フィブリノゲン定量乾燥材料を用いて得られ
る凝固時間と血漿中フィブリノゲン濃度の関係を示した
図である。

【符号の説明】

Ａ 透明樹脂板 Ｂ 透明樹脂板 Ｃ 白色樹脂板 Ｄ 試薬充填部

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/86

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検体と直接接触させて使用するフィブリ
   ノゲン定量乾燥試薬であって、トロンビン活性を有する
   蛋白、磁性粒子、及びアミノ酸又はその塩もしくは糖類
   を含有してなることを特徴とするフィブリノゲン定量乾
   燥試薬。
2. 【請求項２】 緩衝液中にトロンビン活性を有する蛋
   白、磁性粒子、及びアミノ酸又はその塩もしくは糖類を
   含有させてなる混合液を凍結乾燥することを特徴とする
   請求項１のフィブリノゲン定量乾燥試薬の製造方法。
3. 【請求項３】 磁性粒子と組み合わせた後に検体と直接
   接触させて使用するフィブリノゲン定量乾燥試薬用のフ
   ィブリノゲン定量乾燥材料であって、トロンビン活性を
   有する蛋白、アミノ酸又はその塩もしくは糖類を含有し
   てなるフィブリノゲン定量乾燥材料。
4. 【請求項４】 緩衝液中にトロンビン活性を有する蛋
   白、アミノ酸又はその塩もしくは糖類を含有させてなる
   混合液を凍結乾燥することを特徴とする請求項３のフィ
   ブリノゲン定量乾燥材料の製造方法。