CN113913491B - 蛋白c活性的测定方法、测定用试剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋白C活性的测定方法、测定用试剂及制备方法，它涉及生物技术领域。它包括试剂R1、试剂R2和样本稀释液，所述的试剂R1包括有蛋白C激活剂、缓冲液、稳定剂和无机盐，所述的试剂R2包括有发色底物、缓冲液、聚乙二醇和无机盐，所述的样本稀释液包括有缓冲液、稳定剂和无机盐。本发明基于发色底物法原理，能够定量检测蛋白C活性，检测时操作简便，检测灵敏度好，激活特异性高，检测线性范围广，检测结果可靠，原料易得并且成本较低，应用前景广阔。

Description

蛋白C活性的测定方法、测定用试剂及制备方法
技术领域
本发明涉及的是生物技术领域，具体涉及蛋白C活性的测定方法、测定用试剂及制备方法。
背景技术
蛋白C(简称PC)是一种维生素K依赖性的血浆丝氨酸蛋白酶原，它是人体内重要的抗凝蛋白。蛋白C是在肝细胞中合成的单链糖蛋白，经过翻译修饰后成为通过二硫键连接的异二聚体复合物。血浆中的蛋白C以酶原形式存在且本身并无生物学作用，只有当蛋白C被激活为活化蛋白C(简称APC)后才能发挥其抗凝血活性。蛋白S(简称PS)通过增强APC对带负电荷的磷脂的亲和力而形成膜结合的APC-PS复合物，使APC对发挥其蛋白水解作用，灭活活化的凝血因子Ⅴa(简称FⅤa)和Ⅷa(简称FⅧa)，从而显示出较强的抗凝活性。
血浆中蛋白C的活性的降低会导致抗凝和促纤溶左右减弱，使血液处于高凝状态，促进血栓形成。蛋白C缺乏所致的血栓栓塞性疾病的首次发病年龄较小且症状易反复出现，是下肢深静脉血栓(简称DVT)和/或和肺栓塞(简称PTE)的不可忽视的遗传性危险因素；因此，建立一种稳定可靠的血浆蛋白C活性检测方法对于以上疾病的诊断和治疗都有着重要意义。
目前，用于检测血浆中蛋白C的方法主要分为两大类，即对其抗原含量的检测和对其抗凝活性的检测。由于抗原测定只能检测血浆中蛋白C的含量，并不能真实准确地评估其功能，所以无法检测到Ⅱ型蛋白C缺陷症。而蛋白C的抗凝活性检测方法包括凝固法和发色底物法，这两种方法都是基于PC被激活为APC后发挥其抗凝活性而建立的，由于凝固法易受到血液中多种干扰因素(如狼疮抗凝物，肝素，直接凝血酶抑制剂等)的影响，所以目前临床使用较少。而发色底物法通过测定产色底物的吸光度变化来推测所测物质的含量和活性，具有良好的稳定性和准确性，不易受到抗凝药物和一些干扰酶类的影响。发色底物法由于其灵敏度好、稳定性和重复性高及抗干扰能力强的优点，被WHO推荐为蛋白C缺乏的首选筛查实验。但限于市面上常用的蛋白C活性检测试剂盒均需国外进口且价格昂贵，限制了此项目在各级医院的开展。
为了解决上述问题，开发一种蛋白C活性的测定方法、测定用试剂及制备方法尤为必要。
发明内容
针对现有技术上存在的不足，本发明目的是在于提供一种蛋白C活性的测定方法、测定用试剂及制备方法，试剂基于发色底物法原理，能够定量检测蛋白C活性，检测灵敏度和特异度好，检测结果可靠，原料易得且成本低，易于推广使用。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：蛋白C活性的测定用试剂，包括试剂R1、试剂R2和样本稀释液，试剂R1和样本稀释液的PH值为7.0-8.5，试剂R2的PH值为6.5-8.0，所述的试剂R1包括有蛋白C激活剂、缓冲液、稳定剂和无机盐，所述的试剂R2包括有发色底物、缓冲液、聚乙二醇和无机盐，所述的样本稀释液包括有缓冲液、稳定剂和无机盐。
作为优选，所述的试剂R1的蛋白C激活剂采用Protac蛋白C激活剂，从铜头蝮蛇毒中提取将PC激活为APC的成分，蛋白C激活剂的用量为0.05-0.50U/ml，可以为0.50U/ml、0.45U/ml、0.40U/ml、0.35U/ml、0.30U/ml、0.25U/ml、0.20U/ml、0.15U/ml、0.10U/ml、0.05U/ml。
作为优选，所述的试剂R1、试剂R2和样本稀释液中的缓冲液采用HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液中的一种或多种组合，缓冲液的用量为20-50mmol/L。其中，所述的试剂R1和样本稀释液中的缓冲液优选采用PH值为7.8-8.2、浓度值为20-50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，试剂R2的缓冲液优选采用PH值为7.4-7.8、浓度值为20-50mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
作为优选，所述的试剂R1和样本稀释液中的稳定剂采用蛋白质、糖类、表面活性剂、助悬剂、抗氧剂中的一种或多种；所述的稳定剂优选采用牛血清白蛋白、甘露醇、海藻糖中的一种或多种。
作为优选，所述的试剂R1和样本稀释液中的无机盐采用NaCl、CaCl2、KCl、CsCl中的一种或多种；所述的无机盐优选为NaCl，NaCl的用量为0.05-0.15mol/L，可以为0.15mol/L、0.14mol/L、0.13mol/L、0.12mol/L、0.11mol/L、0.10mol/L、0.09mol/L、0.08mol/L、0.07mol/L、0.06mol/L、0.05mol/L。
作为优选，所述的试剂R2的无机盐采用NaCl、CaCl2、KCl、CsCl中的一种或多种，所述的无机盐优选为NaCl，NaCl的用量为0.1-1.0mol/L，可以为1mol/L、0.9mol/L、0.8mol/L、0.7mol/L、0.6mol/L、0.5mol/L、0.4mol/L、0.3mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L。
作为优选，所述的试剂R2的发色底物采用p-Glu-Pro-Arg-MNA、Pad-Pro-Arg-pNA·AcOH、THC-Pro-Arg-pNA中的一种，所述的发色底物为Pad-Pro-Arg-pNA·AcOH，用量为0.5-5mmol/L，可以为5mmol/L、4.5mmol/L、4mmol/L、3.5mmol/L、3mmol/L、2.5mmol/L、2mmol/L、1.5mmol/L、1mmol/L、0.5mmol/L。
作为优选，所述的试剂R2的聚乙二醇采用PEG-1500、PEG-4000、PEG-6000、PEG-20000中的一种，所述的聚乙二醇优选为PEG-6000，PEG-6000的用量为0.01-0.50g/ml。
蛋白C活性的测定用试剂的制备方法，其制备步骤为：
(1)制备试剂R1：选取Protac蛋白C激活剂0.15U/ml，PH为8.0的Tris-HCl缓冲液30mmol/L，牛血清白蛋白0.1g/ml，NaCl0.09mol/L，将上述试剂配制好后，以3ml/瓶分装入瓶使用；
(2)制备试剂R2：选取Pad-Pro-Arg-pNA·AcOH 2mmol/L，PH为7.6的Tris-HCl缓冲液30mmol/L，PEG-6000 0.1g/ml，NaCl0.9mol/L，将上述试剂配制好后，以3ml/瓶分装入瓶使用；
(3)制备试剂样本稀释液：PH为8.0的Tris-HCl缓冲液30mmol/L，牛血清白蛋白0.1g/ml，NaCl 0.09mol/L，将上述试剂配制好后，以2ml/瓶分装入瓶使用。
蛋白C活性的测定方法，其步骤为：
(1)首先建立蛋白C活性标准曲线，将蛋白C标准品用样本稀释液进行四次倍比稀释，得到活性分别为12.375％、24.75％、49.5％、99％四份待测标本；
(2)将制备的试剂R1、试剂R2和样本稀释液取出备用；
(3)取30μl不同活性的待测标准品加入反应杯中,加入30μl样本稀释液，并加入试剂R1 100μl，孵育600s后加入试剂R2100μl，测定反应第15s与第300s的吸光度变化值ΔOD；
(4)每管重复测量两次，标准曲线的横坐标为标准品的活性，纵坐标为不同活性的待测标准品测得的ΔOD的均值；
(5)用同样的方法检测待测样本，将测得的ΔOD代入上述标准曲线中即可获得待测样本的PC活性值。
本发明的有益效果：本发明基于发色底物法原理，选择从铜头蝮蛇毒素作为蛋白C激活剂，能够定量检测蛋白C活性，检测时操作简便，检测灵敏度好，激活特异性高，检测线性范围广，检测结果可靠，原料易得并且成本较低，应用前景广阔。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式来详细说明本发明；
图1为本发明测定试剂的标准曲线示意图；
图2为本发明测定试剂的线性范围示意图；
图3为本发明测定试剂的稳定性评估结果示意图；
图4为本发明测定试剂与现有蛋白C活性检测试剂的相关性分析示意图；
图5为本发明测定试剂与现有蛋白C活性检测试剂的一致性分析示意图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
参照图1-5，本具体实施方式采用以下技术方案：蛋白C活性的测定用试剂，包括试剂R1、试剂R2和样本稀释液，试剂R1和样本稀释液的PH值为7.0-8.5，试剂R2的PH值为6.5-8.0，所述的试剂R1包括有蛋白C激活剂、缓冲液、稳定剂和无机盐，所述的试剂R2包括有发色底物、缓冲液、聚乙二醇和无机盐，所述的样本稀释液包括有缓冲液、稳定剂和无机盐。
值得注意的是，所述的试剂R1的蛋白C激活剂采用Protac蛋白C激活剂，从铜头蝮蛇毒中提取的能有效且特异地将PC激活为APC的成分，蛋白C激活剂的用量为0.05-0.50U/ml，可以为0.50U/ml、0.45U/ml、0.40U/ml、0.35U/ml、0.30U/ml、0.25U/ml、0.20U/ml、0.15U/ml、0.10U/ml、0.05U/ml。
值得注意的是，所述的试剂R1、试剂R2和样本稀释液中的缓冲液采用HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液中的一种或多种组合，缓冲液的用量为20-50mmol/L。其中，所述的试剂R1和样本稀释液中的缓冲液优选采用PH值为7.8-8.2、浓度值为20-50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，试剂R2的缓冲液优选采用PH值为7.4-7.8、浓度值为20-50mmol/L的Tris-HCl缓冲液。
所述的试剂R1和样本稀释液中的稳定剂采用蛋白质、糖类、表面活性剂、助悬剂、抗氧剂中的一种或多种；所述的稳定剂优选采用牛血清白蛋白、甘露醇、海藻糖中的一种或多种。
所述的试剂R1和样本稀释液中的无机盐采用NaCl、CaCl2、KCl、CsCl中的一种或多种；所述的无机盐优选为NaCl，NaCl的用量为0.05-0.15mol/L，可以为0.15mol/L、0.14mol/L、0.13mol/L、0.12mol/L、0.11mol/L、0.10mol/L、0.09mol/L、0.08mol/L、0.07mol/L、0.06mol/L、0.05mol/L。
此外，所述的试剂R2的发色底物采用p-Glu-Pro-Arg-MNA、Pad-Pro-Arg-pNA·AcOH、THC-Pro-Arg-pNA中的一种，所述的发色底物为Pad-Pro-Arg-pNA·AcOH，用量为0.5-5mmol/L，可以为5mmol/L、4.5mmol/L、4mmol/L、3.5mmol/L、3mmol/L、2.5mmol/L、2mmol/L、1.5mmol/L、1mmol/L、0.5mmol/L。
所述的试剂R2的无机盐采用NaCl、CaCl2、KCl、CsCl中的一种或多种，所述的无机盐优选为NaCl，NaCl的用量为0.1-1.0mol/L，可以为1mol/L、0.9mol/L、0.8mol/L、0.7mol/L、0.6mol/L、0.5mol/L、0.4mol/L、0.3mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L。
所述的试剂R2的聚乙二醇采用PEG-1500、PEG-4000、PEG-6000、PEG-20000中的一种，所述的聚乙二醇优选为PEG-6000，PEG-6000的用量为0.01-0.50g/ml。
蛋白C活性的测定用试剂的制备方法，蛋白C活性测定试剂包括试剂R1、试剂R2和样本稀释液，均为液体试剂，其制备步骤为：
(1)制备试剂R1：选取Protac蛋白C激活剂0.15U/ml，PH为8.0的Tris-HCl缓冲液30mmol/L，牛血清白蛋白0.1g/ml，NaCl0.09mol/L，将上述试剂配制好后，以3ml/瓶分装入瓶使用；
(2)制备试剂R2：选取Pad-Pro-Arg-pNA·AcOH 2mmol/L，PH为7.6的Tris-HCl缓冲液30mmol/L，PEG-6000 0.1g/ml，NaCl0.9mol/L，将上述试剂配制好后，以3ml/瓶分装入瓶使用；
(3)制备试剂样本稀释液：PH为8.0的Tris-HCl缓冲液30mmol/L，牛血清白蛋白0.1g/ml，NaCl 0.09mol/L，将上述试剂配制好后，以2ml/瓶分装入瓶使用。
蛋白C活性的测定方法，其步骤为：
(1)首先建立蛋白C活性标准曲线，将蛋白C标准品用样本稀释液进行四次倍比稀释，得到活性分别为12.375％、24.75％、49.5％、99％四份待测标本；
(2)将制备的试剂R1、试剂R2和样本稀释液取出备用；
(3)设置反应温度为37℃，测定波长为405nm，取30μl不同活性的待测标准品加入反应杯中,加入30μl样本稀释液，并加入试剂R1100μl，孵育600s后加入试剂R2100μl，测定反应第15s与第300s的吸光度变化值ΔOD；
(4)每管重复测量两次，标准曲线的横坐标为标准品的活性，纵坐标为不同活性的待测标准品测得的ΔOD的均值(图1)；
(5)用同样的方法检测待测样本，将测得的ΔOD代入上述标准曲线中即可获得待测样本的PC活性值。
该测定方法适用于市面上多品牌、型号的凝血分析仪，如北京众驰XL3200c凝血分析仪、日本希森美康CN-6000和CS-5100全自动血凝仪、沃芬TOP700全自动血凝仪、美国贝克曼库尔特ACL7000全自动血凝仪，针对不同的凝血分析仪适当的调整具体的反应参数。
本具体实施方式对测定用试剂进行不精密度评估、线性范围评估、稳定性评估、以及与现有市售试剂的相关性和一致性分析，具体地：
(1)不精密度评估：用于不精密度评估的正常值和病理值的质控血浆采自德国Siemens公司，批号507778C。正常人混合血浆由25名体检正常且凝血相关检查正常的表观健康者的血浆混合而成。
①批内不精密度评估：
取两个水平的质控血浆和正常混合血浆，使用本发明测定试剂连续重复测定20次血浆PC活性，计算算术平均值标准差(SD)以及批内变异系数(CV)，测定结果如表1所示：
表1测定试剂的批内不精密度评估结果
由表1可知，本发明测定试剂的批内不精密度评估的结果变异小，CV为1.01％-2.10％，CV均≤3％。
②日间不精密度评估：
取两个水平的质控血浆和正常混合血浆，分别分装为20份，置于-80℃冰箱内冻存。将3个水平的血浆每天各取出一份，使用本测定试剂每天测定两批，每批重复测定两遍，两批测定的间隔时间应大于4h，共测定20天，计算SD和CV，测定结果如表2所示。
表2测定试剂的日间不精密度评估结果
由表2可知，本发明测定试剂的日间不精密度评估的结果变异小，CV为2.62％-7.80％，CV均≤8％。综上，本发明测定试剂的批内和日间不精密度的变异系数小。
(2)线性范围评估
用于线性范围评估的高值和低值血浆均取自临床，其活性值由德国SiemensBerichrom PROTEIN C试剂测得。选取一份接近预期上限的高值血浆H(PC％：144.40％)，一份接近预期下限的低值血浆L(PC％：22.1％)，按照H、5H+L、4H+2L、3H+3L、2H+4L、H+5L、L的比例稀释为7个点，每个稀释度重复测定两次，计算平均值。检查数据后剔除离群值，判断重复性，最后将测定结果的平均值与理论值进行比较，进行线性回归分析。理论值＝(CL×VL+CH×VH)/(VL+VH)。线性范围评估结果见图2，可知，上述检测结果中无明显离群值，得到的回归方程为：Y＝1.14151+1.00582X,R2＝0.9993≥0.99，表明线性范围约为20％-150％。
(3)稳定性评估
用于稳定性评估的三个水平的血浆均取自临床，使用本测定试剂对其进行PC活性测定，得到的测定值为初始测定值。将测定试剂置于37℃环境中进行热破坏，在热破坏后的第1天、3天、7天、10天、14天分别检测三种血浆的PC活性，将热破坏后的测定值与初始测定值进行相对偏差计算，相对偏差在±10％以内视为稳定。稳定性评估结果如图3所示，可以看出，本发明测定试剂进行热破坏后，三个水平的血浆的PC活性均呈现逐渐上升趋势，相对偏差在进行热破坏的第14天最高。第14天时，高值/中间值和低值血浆的PC活性相较初始测定值的相对偏差分别为4.63％,4.60％,4,72％，均小于5％。该测定试剂的热稳定性好，热破坏后可以稳定至少14天。
(4)与现有市售试剂的相关性和一致性分析
使用本测定试剂检测148份血浆标本，其中包括80例表观健康者和68例DVT患者，同时使用SiemensBerichrom PROTEIN C试剂进行检测，绘制散点图并估计两种检测体系间的相关系数，分析散点图特征选择最佳回归模型，进行线性回归，其检测结果见图4，两种试剂盒的相关系数为r＝0.993，线性回归方程为Y＝-0.00478+1.00865X；同时使用Bland-Altman分析对两种检测体系的检测结果的一致性进行评估，其检测结果见图5。
本具体实施方式为基于发色底物法的原理研制的一种可以检测人血浆蛋白C活性的测定试剂，其技术优势在于：
(1)测定试剂中的蛋白C激活剂protac来源于铜头蝮蛇毒，激活特异性高，不易受到血浆中其他蛋白质和酶类的干扰，易于获得；
(2)测定试剂通过性能评估，检测结果可靠，检测性能优越，批间和批内不精密度的变异系数(CV)低于市售试剂盒；
(3)测定试剂的检测线性范围广，且对于高值样本和低值样本都具有良好的灵敏度；
(4)测定试剂组成简单，进行检测时的操作简便，可以适用于多种品牌和型号的半自动和全自动血凝仪，具有广阔的市场应用前景。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.蛋白C活性的测定用试剂，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和样本稀释液，所述的试剂R1包括有Protac蛋白C激活剂、Tris-HCl缓冲液、牛血清白蛋白稳定剂和NaCl无机盐，所述的试剂R2包括有Pad-Pro-Arg-pNA·AcOH发色底物、Tris-HCl缓冲液、PEG-6000聚乙二醇和NaCl无机盐，所述的样本稀释液包括有Tris-HCl缓冲液、牛血清白蛋白稳定剂和NaCl无机盐；
所述的试剂R1中采用的Protac蛋白C激活剂是从铜头蝮蛇毒中提取将PC激活为APC的成分；
所述的试剂R1中采用的Protac蛋白C激活剂的用量为0.15U/ml；
所述的试剂R2中采用的Pad-Pro-Arg-pNA·AcOH发色底物用量为2mmol/L；
蛋白C活性的测定用试剂的制备方法，其制备步骤为：
(1)制备试剂R1：选取Protac蛋白C激活剂0.15U/ml，PH为8.0的Tris-HCl缓冲液30mmol/L，牛血清白蛋白0.1g/ml，NaCl0.09mol/L，将上述试剂配制好后，以3ml/瓶分装入瓶使用；
(2)制备试剂R2：选取Pad-Pro-Arg-pNA·AcOH2mmol/L，PH为7.6的Tris-HCl缓冲液30mmol/L，PEG-60000.1g/ml，NaCl0.9mol/L，将上述试剂配制好后，以3ml/瓶分装入瓶使用；
(3)制备试剂样本稀释液：PH为8.0的Tris-HCl缓冲液30mmol/L，牛血清白蛋白0.1g/ml，NaCl0.09mol/L，将上述试剂配制好后，以2ml/瓶分装入瓶使用。
2.根据权利要求1所述的蛋白C活性的测定用试剂，其特征在于，所述的试剂R1和样本稀释液的PH值为7.0-8.5，试剂R2的PH值为6.5-8.0。
3.根据权利要求1所述的蛋白C活性的测定用试剂，其特征在于，所述的试剂R1和样本稀释液中采用的Tris-HCl缓冲液PH值为7.8-8.2、浓度值为20-50mmol/L，试剂R2中采用的Tris-HCl缓冲液PH值为7.4-7.8、浓度值为20-50mmo l/L。
4.根据权利要求1所述的蛋白C活性的测定用试剂，其特征在于，所述的试剂R1和样本稀释液中采用的NaCl无机盐的用量为0.05-0.15mol/L。
5.根据权利要求1所述的蛋白C活性的测定用试剂，其特征在于，所述的试剂R2中采用的NaCl无机盐的用量为0.1-1.0mol/L。
6.根据权利要求1所述的蛋白C活性的测定用试剂，其特征在于，所述的试剂R2中采用的PEG-6000聚乙二醇的用量为0.01-0.50g/ml。
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