JP2955345B2 - リムラス変形細胞溶解産物および発色原基質を用いたエンドトキシン反応速度論的アッセイ - Google Patents
リムラス変形細胞溶解産物および発色原基質を用いたエンドトキシン反応速度論的アッセイInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 発明の分野 本発明はリムラス変形細胞溶解産物に基づくアッセイ
による液体中のエンドトキシンの判定に関するものであ
る。
による液体中のエンドトキシンの判定に関するものであ
る。
関連する技術の説明 カブトガニの血液由来の変形細胞溶解産物の前凝血酵
素の細菌性エンドトキシンによる凝集現象は既知のもの
であり、長年例えば、レビン（Levin,J.）とバングス
（Bangs,F.B.）、“リムラス中の凝集タンパク質：その
局在とエンドトキシンによる凝集”、Thomb.Diath.Heam
ortz.19,pg.186（1968）などで報告されてきた。凝集機
構は、例えばS.中村他、“ゲル形成期間のカブトガニ凝
集素由来断片のアミノ酸配列の研究：霊長類フィブリノ
ペプチドＢとの相同性”、Biochemical and Biophysica
l Research Communication,72（３）,P.902（1976）な
どの詳細な研究の対称となってきた。
素の細菌性エンドトキシンによる凝集現象は既知のもの
であり、長年例えば、レビン（Levin,J.）とバングス
（Bangs,F.B.）、“リムラス中の凝集タンパク質：その
局在とエンドトキシンによる凝集”、Thomb.Diath.Heam
ortz.19,pg.186（1968）などで報告されてきた。凝集機
構は、例えばS.中村他、“ゲル形成期間のカブトガニ凝
集素由来断片のアミノ酸配列の研究：霊長類フィブリノ
ペプチドＢとの相同性”、Biochemical and Biophysica
l Research Communication,72（３）,P.902（1976）な
どの詳細な研究の対称となってきた。
リムラス変形細胞溶解産物（Limulus amebocyte lysa
te、以後LAL）の凝集反応はCa＋＋、Mg＋＋,Sr＋＋，ま
たはMn＋＋などの２価陽イオンの存在下でのエンドトキ
シンによる前凝血酵素の活性化、およびそれによって活
性化された酵素が凝血タンパク質（凝血原）に含まれて
いるグリシンおよびアルギニンユニットのＣ−カルボキ
シル基で切断することによるものである。凝血原の切断
されたユニットはジスルフィド結合によって結合された
ままで残り、多量体化して凝血する。変形細胞溶解産物
のこれらの既知の成分に加えて、多数のその他のタンパ
ク質および、リポタンパク質性の既知の阻害物質が存在
する。阻害物質および他のタンパク質による凝血反応の
調節機構はまだ確定されていない。
te、以後LAL）の凝集反応はCa＋＋、Mg＋＋,Sr＋＋，ま
たはMn＋＋などの２価陽イオンの存在下でのエンドトキ
シンによる前凝血酵素の活性化、およびそれによって活
性化された酵素が凝血タンパク質（凝血原）に含まれて
いるグリシンおよびアルギニンユニットのＣ−カルボキ
シル基で切断することによるものである。凝血原の切断
されたユニットはジスルフィド結合によって結合された
ままで残り、多量体化して凝血する。変形細胞溶解産物
のこれらの既知の成分に加えて、多数のその他のタンパ
ク質および、リポタンパク質性の既知の阻害物質が存在
する。阻害物質および他のタンパク質による凝血反応の
調節機構はまだ確定されていない。
細菌性エンドトキシン（発熱原）の存在下でのLALの
凝集特性により、通常は非経口的に投与される、薬学あ
るいは医学目的の多様な液体調製における品質コントロ
ールのためのエンドトキシンアッセイのために、LAL組
成物は商業的に重要な薬剤となってきた。このような液
体には、注射用水；灌注用の水；静脈注入のための脂質
乳濁液；植物注油の水性乳濁液；例えば、注射USPのた
めの塩化ナトリウム、灌注USPのための塩化ナトリウ
ム、吸入剤のための塩化ナトリウム、酪酸を加えたリン
ゲル溶液を含む、非経口的に投与される塩溶液；および
正常血清アルブミン、血漿タンパク質画分、および抗好
血性因子USP、免疫グロブリン、Rho（Ｄ）免疫グロブリ
ンおよび抗ヒトグロブリン血清などの血液由来の液体が
含まれる。
凝集特性により、通常は非経口的に投与される、薬学あ
るいは医学目的の多様な液体調製における品質コントロ
ールのためのエンドトキシンアッセイのために、LAL組
成物は商業的に重要な薬剤となってきた。このような液
体には、注射用水；灌注用の水；静脈注入のための脂質
乳濁液；植物注油の水性乳濁液；例えば、注射USPのた
めの塩化ナトリウム、灌注USPのための塩化ナトリウ
ム、吸入剤のための塩化ナトリウム、酪酸を加えたリン
ゲル溶液を含む、非経口的に投与される塩溶液；および
正常血清アルブミン、血漿タンパク質画分、および抗好
血性因子USP、免疫グロブリン、Rho（Ｄ）免疫グロブリ
ンおよび抗ヒトグロブリン血清などの血液由来の液体が
含まれる。
LAL試薬の組成およびLAL使用法における改善により、
LALアッセイは既知のエンドトキシン試験のなかで最も
感度がよく、実用的なものとなっている。LALアッセイ
は、凝塊の形成により10-12グラム/mlのエンドトキシン
まで検出することができる。保健産業協会調査（ダバー
（Dabah）他、“USPUラビット試験による参考エンドト
キシンの発熱原性評価に関するHIMA共同研究”、HIMA D
ocument No.7,vol.1（1979年５月））により、米国薬局
方（USP）ラビット発熱原アッセイは約10-9グラム/mlの
エンドトキシンを検出できることが示されている。した
がってLALアッセイはUSPラビット発熱原アッセイよりも
約100倍感度がよいことになる。さらに、LALアッセイは
実施がより簡単であり、ラビットアッセイが３時間かか
るのに対し、約１時間以内に終えることができる。
LALアッセイは既知のエンドトキシン試験のなかで最も
感度がよく、実用的なものとなっている。LALアッセイ
は、凝塊の形成により10-12グラム/mlのエンドトキシン
まで検出することができる。保健産業協会調査（ダバー
（Dabah）他、“USPUラビット試験による参考エンドト
キシンの発熱原性評価に関するHIMA共同研究”、HIMA D
ocument No.7,vol.1（1979年５月））により、米国薬局
方（USP）ラビット発熱原アッセイは約10-9グラム/mlの
エンドトキシンを検出できることが示されている。した
がってLALアッセイはUSPラビット発熱原アッセイよりも
約100倍感度がよいことになる。さらに、LALアッセイは
実施がより簡単であり、ラビットアッセイが３時間かか
るのに対し、約１時間以内に終えることができる。
LALの凝血によって検出されるエンドトキシンのアッ
セイは、実質的に反応速度論的アッセイである。エンド
トキシンは凝血酵素を活性化し、その凝血酵素が凝血原
を切断し、切断された凝血原が集合してゲルを形成す
る。エンドトキシンが多いほど切断された凝血原の凝集
が早く、より迅速なゲル形成を行うので、ゲル形成にか
かる時間はエンドトキシンが多いほど短くなる。言い換
えれば、本アッセイでエンドトキシン濃度はゲル化時間
に反比例する。
セイは、実質的に反応速度論的アッセイである。エンド
トキシンは凝血酵素を活性化し、その凝血酵素が凝血原
を切断し、切断された凝血原が集合してゲルを形成す
る。エンドトキシンが多いほど切断された凝血原の凝集
が早く、より迅速なゲル形成を行うので、ゲル形成にか
かる時間はエンドトキシンが多いほど短くなる。言い換
えれば、本アッセイでエンドトキシン濃度はゲル化時間
に反比例する。
本アッセイで必要とされるようば凝血時間の正確な決
定に関しては困難な点がある。凝集、綿状化、および凝
血は、複数の物理力とおそらく複数の因子が関与する複
雑な物理現象の連続的な過程である。過程間の境界は明
確に示されるものではなく、主観的に決定されるもので
あり、異なる観察者によって決定された場合には違う可
能性がある。LALは化学的に複雑な混合物であり、組成
のわずかな変化が複雑な凝血現象の過程に重大な影響を
与える可能性が十分ある。最後に、ゲル形成の主観的決
定に基づいたアッセイは本来自動化することが困難であ
る。ゲル形成および関連するエンドトキシン濃度をを正
確に決定することに関する幾つかの難点を克服するため
に、別のアッセイ方法論が考案された。
定に関しては困難な点がある。凝集、綿状化、および凝
血は、複数の物理力とおそらく複数の因子が関与する複
雑な物理現象の連続的な過程である。過程間の境界は明
確に示されるものではなく、主観的に決定されるもので
あり、異なる観察者によって決定された場合には違う可
能性がある。LALは化学的に複雑な混合物であり、組成
のわずかな変化が複雑な凝血現象の過程に重大な影響を
与える可能性が十分ある。最後に、ゲル形成の主観的決
定に基づいたアッセイは本来自動化することが困難であ
る。ゲル形成および関連するエンドトキシン濃度をを正
確に決定することに関する幾つかの難点を克服するため
に、別のアッセイ方法論が考案された。
発色性基質の使用は、ヒトの複雑な凝血過程における
多様な酵素および阻害剤の研究および臨床的追跡の双方
の手段となってきている。トリプシン、トロンビン、ト
ロンボプラスチン、プラスミン、カリクレイン、ウロキ
ナーゼ、およびプラスミノーゲンなどの酵素の測定のた
めの酵素特異的基質の広範なリストは、商業的に入手可
能である。これらの合成基質は、in vitroの凝血過程の
ある局面の止血状態の追跡に重要な手段を観察者に与え
るものである。イワナガ他、“カブトガニ凝血酵素の発
色性基質：細菌性エンドトキシンアッセイへのその応
用”、Hemostasis 7:183−188（1978）は、日本のカブ
トガニ（タキプレウス・トリデンタタス（Tachypleus t
ridentatus）およびアメリカカブトガニ（リムラス・ポ
リフェムス（Limulus polyphemus）の血液から調製した
LAL中の、エンドトキシンに活性化された前凝血酵素の
レベルを測定するために合成基質が使用可能であること
を報告している。通常のLALゲル化試験と比較した場合
のLALアッセイにおける発色性基質の利点の一つは、活
性化された凝血酵素の量が定量化できることである。細
菌性エンドトキシンを定量的に測定するためのLALアッ
セイにおけるある合成ペプチド型基質の使用は、米国特
許第4,188,265号に記述されている。この特許の開示に
より、配列R1−gly−arg−R2中のＬ−アミノ酸からなる
構造をもつペプチド基質が示されており、ここにおいて
R1はＮ−ブロックアミノ酸を表し、R2は酵素的に加水分
解されて遊離して呈色化合物HR2となる基でである。
多様な酵素および阻害剤の研究および臨床的追跡の双方
の手段となってきている。トリプシン、トロンビン、ト
ロンボプラスチン、プラスミン、カリクレイン、ウロキ
ナーゼ、およびプラスミノーゲンなどの酵素の測定のた
めの酵素特異的基質の広範なリストは、商業的に入手可
能である。これらの合成基質は、in vitroの凝血過程の
ある局面の止血状態の追跡に重要な手段を観察者に与え
るものである。イワナガ他、“カブトガニ凝血酵素の発
色性基質：細菌性エンドトキシンアッセイへのその応
用”、Hemostasis 7:183−188（1978）は、日本のカブ
トガニ（タキプレウス・トリデンタタス（Tachypleus t
ridentatus）およびアメリカカブトガニ（リムラス・ポ
リフェムス（Limulus polyphemus）の血液から調製した
LAL中の、エンドトキシンに活性化された前凝血酵素の
レベルを測定するために合成基質が使用可能であること
を報告している。通常のLALゲル化試験と比較した場合
のLALアッセイにおける発色性基質の利点の一つは、活
性化された凝血酵素の量が定量化できることである。細
菌性エンドトキシンを定量的に測定するためのLALアッ
セイにおけるある合成ペプチド型基質の使用は、米国特
許第4,188,265号に記述されている。この特許の開示に
より、配列R1−gly−arg−R2中のＬ−アミノ酸からなる
構造をもつペプチド基質が示されており、ここにおいて
R1はＮ−ブロックアミノ酸を表し、R2は酵素的に加水分
解されて遊離して呈色化合物HR2となる基でである。
別の特許、米国特許第4,510,241号はLAL型アッセイで
使用するための改善された発色性ペプチド基質を開示し
ている。この改善された基質は、前掲の基質と比較し
て、gly部分がalaまたはcysによって置換されている点
が最も顕著に異なっている。
使用するための改善された発色性ペプチド基質を開示し
ている。この改善された基質は、前掲の基質と比較し
て、gly部分がalaまたはcysによって置換されている点
が最も顕著に異なっている。
これらの基質のうち一つを用いたLAL型アッセイにお
いては、LAL中の前凝血酵素（セリンプロテアーゼ）が
エンドトキシンによって活性化され、アルギニンのカル
ボキシル側でペプチド鎖を切断して発色基を放出させ、
吸光光度測定などの手段によって容易に判読できるマー
カー化合物を形成する。
いては、LAL中の前凝血酵素（セリンプロテアーゼ）が
エンドトキシンによって活性化され、アルギニンのカル
ボキシル側でペプチド鎖を切断して発色基を放出させ、
吸光光度測定などの手段によって容易に判読できるマー
カー化合物を形成する。
定量、感度、速度、および正確度を改善するために考
案された多数の改善にもかかわらず、LALアッセイの多
くの欠点が残っている。第１の欠点は、濁度または発色
固定インキュベーション時間での感度範囲（約１桁）が
限定されていることである（終点法）。終点法の第２の
欠点は、実施者が正確な時間で反応を終止あるいは判読
しなければならないことである。発色試験では、試験を
停止させるためにを添加しなければならない。吸光度は
その後いつでも吸光光度計で測定することができる。終
点濁度測定法では、濁度を破壊する事なく反応を停止さ
せることが不可能であり、特定のインキュベーション時
間後すぐに判読しなければならない。
案された多数の改善にもかかわらず、LALアッセイの多
くの欠点が残っている。第１の欠点は、濁度または発色
固定インキュベーション時間での感度範囲（約１桁）が
限定されていることである（終点法）。終点法の第２の
欠点は、実施者が正確な時間で反応を終止あるいは判読
しなければならないことである。発色試験では、試験を
停止させるためにを添加しなければならない。吸光度は
その後いつでも吸光光度計で測定することができる。終
点濁度測定法では、濁度を破壊する事なく反応を停止さ
せることが不可能であり、特定のインキュベーション時
間後すぐに判読しなければならない。
LAL型アッセイを改善するための別の試みは、凝血現
象の測定の正確さの改善であった。これは、ゲル化を待
つのではなく、凝集が進行する際のアッセイ溶液の濁度
の増加に注目することによって行われた（ヤング他、
（1972）J.Clin,Invest.,51:1790−1797）。反応速度論
的濁度測定LALアッセイは終点方法論に対して幾つかの
改善を与える。反応速度論的方法は、単一の試薬を用
い、試験の開始後は実施者の注意を必要とせず、したが
って正確度、速度、および信頼性がすべて向上する。も
っとも重要なことは、試験の範囲が１から５桁以上増加
させられることである。不運にも、分光光度計による濁
度決定は物理的遮蔽による透過光の減少を用いており、
したがってベーアの法則（Beer′s law）は適用されな
い。粒子の大きさおよび数、また反射光と屈折光はすべ
てさまざまな程度に測定に影響を与える。データのコン
ピューター・スムージングと協調した優秀な電子フィル
ターが開発され、反応速度論的濁度測定の結果を解釈す
るために使用されたが（ワトソン（Watson）他、“リム
ラス変形細胞溶解産物試験による細菌性エンドトキシン
の検出”アラン・Ｒ・リス社、ニューヨーク、1987中
の、ノビツキー（Novitsky）他、p.189−196、および、
レミラード（Remillard）他、pp.197−210）、これらの
方法は特殊な光学読み取り機によってのみ可能である。
さらに、いくつかの産物は反応速度論的濁度測定アッセ
イを行うためには徹底的に希釈しなければならない。
象の測定の正確さの改善であった。これは、ゲル化を待
つのではなく、凝集が進行する際のアッセイ溶液の濁度
の増加に注目することによって行われた（ヤング他、
（1972）J.Clin,Invest.,51:1790−1797）。反応速度論
的濁度測定LALアッセイは終点方法論に対して幾つかの
改善を与える。反応速度論的方法は、単一の試薬を用
い、試験の開始後は実施者の注意を必要とせず、したが
って正確度、速度、および信頼性がすべて向上する。も
っとも重要なことは、試験の範囲が１から５桁以上増加
させられることである。不運にも、分光光度計による濁
度決定は物理的遮蔽による透過光の減少を用いており、
したがってベーアの法則（Beer′s law）は適用されな
い。粒子の大きさおよび数、また反射光と屈折光はすべ
てさまざまな程度に測定に影響を与える。データのコン
ピューター・スムージングと協調した優秀な電子フィル
ターが開発され、反応速度論的濁度測定の結果を解釈す
るために使用されたが（ワトソン（Watson）他、“リム
ラス変形細胞溶解産物試験による細菌性エンドトキシン
の検出”アラン・Ｒ・リス社、ニューヨーク、1987中
の、ノビツキー（Novitsky）他、p.189−196、および、
レミラード（Remillard）他、pp.197−210）、これらの
方法は特殊な光学読み取り機によってのみ可能である。
さらに、いくつかの産物は反応速度論的濁度測定アッセ
イを行うためには徹底的に希釈しなければならない。
（発明の要約） 本発明の目的は、増強された感度を有する、エンドト
キシンをアッセイする方法を与えることである。
キシンをアッセイする方法を与えることである。
本発明のさらなる目的は、問題の液体中のエンドトキ
シン濃度がより広い範囲で適用できるような、エンドト
キシンをアッセイする方法を与えることである。
シン濃度がより広い範囲で適用できるような、エンドト
キシンをアッセイする方法を与えることである。
本発明のさらに別の目的は、アッセイの誤りが少ない
ようなエンドトキシンのアッセイ法を与えることであ
る。
ようなエンドトキシンのアッセイ法を与えることであ
る。
本発明のさらに別の目的は、反応速度論的アッセイ基
質組成を与えることである。
質組成を与えることである。
これらの目的および別の目的は、いかに示す本発明の
態様で与えられる。
態様で与えられる。
本発明は、エンドトキシンによるLAL中の前凝血酵素
の活性化および発色性基質の切断によって活性化された
凝血酵素の検出に基づいた、反応速度論的方法を用いた
エンドトキシンのアッセイ法を意図するものであり。反
応速度論的方法を容易にするために、本発明により、リ
ムラス変形細胞溶解産物試薬および発色性基質の混合物
からなる反応速度論的アッセイ基質組成物が与えられ
る。この基質組成物および反応速度論的決定法の使用に
より、これまでのLALと発色性基質に基づいたエンドト
キシンアッセイと比較して、エンドトキシンの検出限界
が１から３桁低くなり、検出可能なエンドトキシン濃度
範囲が少なくとも２桁増大する。また、本発明のアッセ
イ法は、一旦エンドトキシを含む試料を反応速度論的基
質組成物と混合すると、さらなる操作を必要とせず、そ
のため操作によって生じる誤りが実質的に減少する。
の活性化および発色性基質の切断によって活性化された
凝血酵素の検出に基づいた、反応速度論的方法を用いた
エンドトキシンのアッセイ法を意図するものであり。反
応速度論的方法を容易にするために、本発明により、リ
ムラス変形細胞溶解産物試薬および発色性基質の混合物
からなる反応速度論的アッセイ基質組成物が与えられ
る。この基質組成物および反応速度論的決定法の使用に
より、これまでのLALと発色性基質に基づいたエンドト
キシンアッセイと比較して、エンドトキシンの検出限界
が１から３桁低くなり、検出可能なエンドトキシン濃度
範囲が少なくとも２桁増大する。また、本発明のアッセ
イ法は、一旦エンドトキシを含む試料を反応速度論的基
質組成物と混合すると、さらなる操作を必要とせず、そ
のため操作によって生じる誤りが実質的に減少する。
（詳細な説明） 反応速度論的アッセイのための基質組成物 本発明の改良されたエンドトキシンアッセイ法は、感
度の増強、より広いアッセイ範囲、および途中段階で実
施者によって導入される誤りの可能性の減少を与えるよ
うな、新しい基質組成物の使用に基づいたものである。
本発明の反応速度論的アッセイ法のための新しい基質組
成物は、（１）カブトガニ変形細胞と感度を増大させる
界面活性剤から抽出した溶解産物を含むリムラス変形細
胞溶解産物試薬、（２）発色性基質、および（３）任意
に、その他の塩および緩衝液、の混合物である単一の試
薬からなるものである。
度の増強、より広いアッセイ範囲、および途中段階で実
施者によって導入される誤りの可能性の減少を与えるよ
うな、新しい基質組成物の使用に基づいたものである。
本発明の反応速度論的アッセイ法のための新しい基質組
成物は、（１）カブトガニ変形細胞と感度を増大させる
界面活性剤から抽出した溶解産物を含むリムラス変形細
胞溶解産物試薬、（２）発色性基質、および（３）任意
に、その他の塩および緩衝液、の混合物である単一の試
薬からなるものである。
いかなるリムラス変形細胞溶解産物（LAL）も本発明
の実施にも使用可能であるが、ここに参考として含める
ものである米国特許第4,322,217号によって調製されたL
AL試薬は例外的な結果を与える。望ましいLAL試薬は、
１から4mgのリムラス変形細胞溶解産物タンパク質/ml、
および0.01から0.05％（w/v）のリムラス血液中に存在
する阻害剤を不活化できる界面活性剤、望ましくはTris
/MgCl2/NaCl緩衝液、pH7.0−7.5で希釈したもの、を含
む。特に望ましい界面活性剤は、ツヴィターゲント３−
14（カルビオケル社）である。
の実施にも使用可能であるが、ここに参考として含める
ものである米国特許第4,322,217号によって調製されたL
AL試薬は例外的な結果を与える。望ましいLAL試薬は、
１から4mgのリムラス変形細胞溶解産物タンパク質/ml、
および0.01から0.05％（w/v）のリムラス血液中に存在
する阻害剤を不活化できる界面活性剤、望ましくはTris
/MgCl2/NaCl緩衝液、pH7.0−7.5で希釈したもの、を含
む。特に望ましい界面活性剤は、ツヴィターゲント３−
14（カルビオケル社）である。
さらに、凝血酵素によって切断されるあらゆる発色性
基質も本発明で使用可能である、しかしながら、ここに
参考として含むるものである米国特許第4.510,241号に
したがって調製された発色性基質は例外的な結果を与え
る。最も望ましい基質は、酢酸−Ile−Glu−Ala−Arg−
pNAの配列からなり、ここでpNAはパラ−ニトロアニリン
基を表す。発色性溶液の濃度および組成は本分野の技術
に含まれる。典型的な発色性基質溶液は、Tris/MgCl2/N
aCl緩衝液、pH7.0−7.5中に調製した0.5から4mg/mlの発
色性基質（1.4から11マイクロモル/ml）を含む。組成式
R1−gly−arg−R2を有する発色性基質は、以下に述べる
反応速度論的アッセイにおける使用で適当な吸光度変化
を与えるが、ベースラインが迅速に変化するようになる
ことが発明者らによって見いだされた。（これは、反応
速度論的アッセイに適した中性pH条件で基質が自己加水
分解を起こし、それで凝血酵素の活性化および発色性基
質の加水分解が自然に起こり得る。）この発色性基質を
用いて行う反応速度論的アッセイはそれまでの技術の終
点アッセイよりも広い範囲をカバーするが、この上昇し
たベースラインが低濃度のエンドトキシンを測定する能
力を限定する。一方、望ましい基質（米国特許第4,510,
241号に従う）で行った反応速度論的アッセイはより安
定したベースラインおよび、結果として高い感度を示
し、非常に低濃度のエンドトキシンを含む試料または希
釈物で改善されたアッセイの実施が可能となった。同様
に、米国特許4,322,217号にしたがって、望ましい方法
で調製したLALは、ほかのLAL調製よりもさらに増強され
た反応速度論的アッセイ感度を与えたが、商業的に入手
可能なLAL調製物で行った反応速度論的アッセイはこれ
までの技術で可能であった発色終点アッセイと比較して
改善された範囲と感度を示した。
基質も本発明で使用可能である、しかしながら、ここに
参考として含むるものである米国特許第4.510,241号に
したがって調製された発色性基質は例外的な結果を与え
る。最も望ましい基質は、酢酸−Ile−Glu−Ala−Arg−
pNAの配列からなり、ここでpNAはパラ−ニトロアニリン
基を表す。発色性溶液の濃度および組成は本分野の技術
に含まれる。典型的な発色性基質溶液は、Tris/MgCl2/N
aCl緩衝液、pH7.0−7.5中に調製した0.5から4mg/mlの発
色性基質（1.4から11マイクロモル/ml）を含む。組成式
R1−gly−arg−R2を有する発色性基質は、以下に述べる
反応速度論的アッセイにおける使用で適当な吸光度変化
を与えるが、ベースラインが迅速に変化するようになる
ことが発明者らによって見いだされた。（これは、反応
速度論的アッセイに適した中性pH条件で基質が自己加水
分解を起こし、それで凝血酵素の活性化および発色性基
質の加水分解が自然に起こり得る。）この発色性基質を
用いて行う反応速度論的アッセイはそれまでの技術の終
点アッセイよりも広い範囲をカバーするが、この上昇し
たベースラインが低濃度のエンドトキシンを測定する能
力を限定する。一方、望ましい基質（米国特許第4,510,
241号に従う）で行った反応速度論的アッセイはより安
定したベースラインおよび、結果として高い感度を示
し、非常に低濃度のエンドトキシンを含む試料または希
釈物で改善されたアッセイの実施が可能となった。同様
に、米国特許4,322,217号にしたがって、望ましい方法
で調製したLALは、ほかのLAL調製よりもさらに増強され
た反応速度論的アッセイ感度を与えたが、商業的に入手
可能なLAL調製物で行った反応速度論的アッセイはこれ
までの技術で可能であった発色終点アッセイと比較して
改善された範囲と感度を示した。
通常の技術の一つから明らかとなるように、前凝血酵
素の活性化を促進することが知られている２価金属イオ
ンは存在することが望ましく、凝血酵素を不活化し得る
pHを越えることを避けるために緩衝液が存在することが
望ましい。LAL系と適合することが本分野で知られてい
るあらゆる緩衝液および塩が使用可能である。望ましい
緩衝系には、塩MgCl2とNaClを含むトリス（トリスヒド
ロキシアミノメタン）緩衝液が含まれ、および上述のよ
うに、緩衝系はLAL試薬の調製および発色性基質の溶解
に使用可能である。
素の活性化を促進することが知られている２価金属イオ
ンは存在することが望ましく、凝血酵素を不活化し得る
pHを越えることを避けるために緩衝液が存在することが
望ましい。LAL系と適合することが本分野で知られてい
るあらゆる緩衝液および塩が使用可能である。望ましい
緩衝系には、塩MgCl2とNaClを含むトリス（トリスヒド
ロキシアミノメタン）緩衝液が含まれ、および上述のよ
うに、緩衝系はLAL試薬の調製および発色性基質の溶解
に使用可能である。
LAL試薬と発色性基質溶液は独立に調製することが可
能である。使用のために最終的に調製されるまで、それ
らは２−８℃で保存することができる。本アッセイで使
用される反応速度論的アッセイ基質組成物は上述の２種
の溶液の混合物である。望ましい比率は、LAL溶液30に
対して発色性基質溶液70である。
能である。使用のために最終的に調製されるまで、それ
らは２−８℃で保存することができる。本アッセイで使
用される反応速度論的アッセイ基質組成物は上述の２種
の溶液の混合物である。望ましい比率は、LAL溶液30に
対して発色性基質溶液70である。
本分野の技術者には明らかなように、反応速度論的ア
ッセイに存在するLALタンパク質および発色性基質の量
は、試料添加後の反応液またはアッセイ混合液中に存在
するこれら２種の成分の効果的量を確実なものとするた
めに調節され得る。エンドトキシンアッセイのこの最後
の混合液で、LALタンパク質濃度は約0.15から約0.5mg/m
lで、望ましくは約0.3から0.6mg/mlである。本アッセイ
での発色性基質の濃度は約0.5mMから約3.9mM、望ましく
は約1.0mMである。
ッセイに存在するLALタンパク質および発色性基質の量
は、試料添加後の反応液またはアッセイ混合液中に存在
するこれら２種の成分の効果的量を確実なものとするた
めに調節され得る。エンドトキシンアッセイのこの最後
の混合液で、LALタンパク質濃度は約0.15から約0.5mg/m
lで、望ましくは約0.3から0.6mg/mlである。本アッセイ
での発色性基質の濃度は約0.5mMから約3.9mM、望ましく
は約1.0mMである。
望ましい態様では、LAL試薬と発色性基質を含む基質
組成物はバイアルに入れ、通常の本分野の技術者には既
知の標準的な凍結乾燥法で凍結乾燥する。この凍結乾燥
された物質は実質的に水を含まず（５％以下）、室温
か、あるいは望ましくは冷蔵して（０−４℃）保存する
ことができる。基質組成物は使用直前に、一定体積の滅
菌した発熱原を含まない水を加え、凍結乾燥物質を溶解
するることによって再構成する。加える水の体積は凍結
乾燥前に存在した固体濃度が再構成組成物中で維持され
るようにする。
組成物はバイアルに入れ、通常の本分野の技術者には既
知の標準的な凍結乾燥法で凍結乾燥する。この凍結乾燥
された物質は実質的に水を含まず（５％以下）、室温
か、あるいは望ましくは冷蔵して（０−４℃）保存する
ことができる。基質組成物は使用直前に、一定体積の滅
菌した発熱原を含まない水を加え、凍結乾燥物質を溶解
するることによって再構成する。加える水の体積は凍結
乾燥前に存在した固体濃度が再構成組成物中で維持され
るようにする。
エンドトキシンの判定のための反応速度論的アッセイ
を行う際に使用するための試薬キットは、発色性基質を
含む反応速度論的アッセイ基質組成物とLALを凍結乾燥
したものが入っている１本以上のバイアルを含んでい
る。さらに、試薬キットは、試料希釈用の発熱原を含ま
ない水および標準曲線作成のための標準化されたエンド
トキシン溶液などの、エンドトキシン反応速度論的アッ
セイに有用なほかの試薬のバイアルも含む可能性があ
る。
を行う際に使用するための試薬キットは、発色性基質を
含む反応速度論的アッセイ基質組成物とLALを凍結乾燥
したものが入っている１本以上のバイアルを含んでい
る。さらに、試薬キットは、試料希釈用の発熱原を含ま
ない水および標準曲線作成のための標準化されたエンド
トキシン溶液などの、エンドトキシン反応速度論的アッ
セイに有用なほかの試薬のバイアルも含む可能性があ
る。
反応速度論的アッセイ法 本方法は、LAL中に存在する酵素を活性化するLALエン
ドトキシン反応の最初の部分を利用し、それによって呈
色部分が合成基質から遊離し、反応混合液中で検出可能
な色の変化を生じる。物質中のグラム陰性細菌性エンド
トキシン量を決定するために、物質試料を上述の発色原
−LAL基質組成と分光光度測定のためのキュベット、マ
イクロプレート、あるいは同様な容器中で混合する。グ
ラム陰性細菌性エンドトキシンはリムラス変形細胞溶解
産物（LAL）中の前凝血酵素の活性化を触媒する。活性
化の初速度は存在するエンドトキシンの濃度によって決
定される。活性化された酵素は無色の基質から呈色部分
の遊離を触媒し、その反応は分光光度測定で経時的に追
跡し、検出可能な色変化の時間依存性の現れ方を記録す
る。いかなる固有の規模の色変化に必要な時間（反応時
間）も、存在するエンドトキシン量に反比例する。すな
わち、多量のエンドトキシン保存下では反応が迅速に起
こり、したがって、ある色変化はより短い時間で起こ
る。少量のエンドトキシンの存在下では、反応時間は増
大し、色変化はより遅くなる。
ドトキシン反応の最初の部分を利用し、それによって呈
色部分が合成基質から遊離し、反応混合液中で検出可能
な色の変化を生じる。物質中のグラム陰性細菌性エンド
トキシン量を決定するために、物質試料を上述の発色原
−LAL基質組成と分光光度測定のためのキュベット、マ
イクロプレート、あるいは同様な容器中で混合する。グ
ラム陰性細菌性エンドトキシンはリムラス変形細胞溶解
産物（LAL）中の前凝血酵素の活性化を触媒する。活性
化の初速度は存在するエンドトキシンの濃度によって決
定される。活性化された酵素は無色の基質から呈色部分
の遊離を触媒し、その反応は分光光度測定で経時的に追
跡し、検出可能な色変化の時間依存性の現れ方を記録す
る。いかなる固有の規模の色変化に必要な時間（反応時
間）も、存在するエンドトキシン量に反比例する。すな
わち、多量のエンドトキシン保存下では反応が迅速に起
こり、したがって、ある色変化はより短い時間で起こ
る。少量のエンドトキシンの存在下では、反応時間は増
大し、色変化はより遅くなる。
未知試料中のエンドトキシン濃度は、既知のエンドト
キシン濃度の試料群を用いて作成した標準曲線から算出
することができる。ある一定の色が生じるのに必要な時
間（反応時間）とエンドトキシン濃度の間のlog/log相
関は、0.05から50EU/mlまで直線である。試料中のエン
ドトキシン濃度は既知量の標準エンドトキシンを含む溶
液の反応時間と、試料の反応時間を比較することによっ
て算出される。
キシン濃度の試料群を用いて作成した標準曲線から算出
することができる。ある一定の色が生じるのに必要な時
間（反応時間）とエンドトキシン濃度の間のlog/log相
関は、0.05から50EU/mlまで直線である。試料中のエン
ドトキシン濃度は既知量の標準エンドトキシンを含む溶
液の反応時間と、試料の反応時間を比較することによっ
て算出される。
試料収集と調製 反応速度論法に基づいたエンドトキシンアッセイ法
は、他の方法で現在エンドトキシン判定が行われている
薬学的または医学的興味のあるあらゆる液体に関して、
エンドトキシン濃度を決定するために使用することがで
きる。これには、注射のための水；潅注のための水；静
脈注入のための脂質乳濁液；植物性油の水性乳濁液；非
経口的に投与される、注射USPのための塩化ナトリウ
ム、潅注USPのための塩化ナトリウム、吸入のための塩
化ナトリウム、酪酸を加えたリンゲル溶液などの、塩溶
液；および、正常血清アルブミン、血漿タンパク質画分
および抗好血性因子USP、免疫グロブリン、Rho（Ｄ）免
疫グロブリンおよび抗ヒトグロブリン血清などの血液由
来物などが含まれるが、これに制限されるものではな
い。この方法は、血液、リンパ液、尿、血清、腹水、肺
吸入液などを含む、エンドトキシンの存在が診断的に重
大となるような生物液体中のエンドトキシンを検出する
ためにも使用可能である。
は、他の方法で現在エンドトキシン判定が行われている
薬学的または医学的興味のあるあらゆる液体に関して、
エンドトキシン濃度を決定するために使用することがで
きる。これには、注射のための水；潅注のための水；静
脈注入のための脂質乳濁液；植物性油の水性乳濁液；非
経口的に投与される、注射USPのための塩化ナトリウ
ム、潅注USPのための塩化ナトリウム、吸入のための塩
化ナトリウム、酪酸を加えたリンゲル溶液などの、塩溶
液；および、正常血清アルブミン、血漿タンパク質画分
および抗好血性因子USP、免疫グロブリン、Rho（Ｄ）免
疫グロブリンおよび抗ヒトグロブリン血清などの血液由
来物などが含まれるが、これに制限されるものではな
い。この方法は、血液、リンパ液、尿、血清、腹水、肺
吸入液などを含む、エンドトキシンの存在が診断的に重
大となるような生物液体中のエンドトキシンを検出する
ためにも使用可能である。
検体または試料試薬と接触するすべての物質は発熱原
が混入していてはならない。物質は250℃で30分間加熱
することによって発熱原フリーとすることが可能であ
る。連続的な環境からの混入から発熱原を除いた物質を
保護するために、適当な前注意が必要である。発熱原フ
リーの水酸化ナトリウムあるいは塩酸で試料のpHを7.0
−8.0の範囲に調節することが必要な場合もある。
が混入していてはならない。物質は250℃で30分間加熱
することによって発熱原フリーとすることが可能であ
る。連続的な環境からの混入から発熱原を除いた物質を
保護するために、適当な前注意が必要である。発熱原フ
リーの水酸化ナトリウムあるいは塩酸で試料のpHを7.0
−8.0の範囲に調節することが必要な場合もある。
試験される試料は、すべての細菌学的活性が停止する
ように保存するべきであり、さもなければエンドトキシ
ンレベルが時間と共に増大する。例えば、24時間以内で
は２−８℃で保存する；それ以上の場合にが凍結させ
る。
ように保存するべきであり、さもなければエンドトキシ
ンレベルが時間と共に増大する。例えば、24時間以内で
は２−８℃で保存する；それ以上の場合にが凍結させ
る。
アッセイ法 アッセイ試験する液体の一部（試料）を反応速度論敵
アッセイ基質組成のあらかじめ決めておいた体積と混合
することによって開始する。得られるアッセイ混合液の
最終体積は、反応経過を吸光度の変化で追跡するのに使
用する個々の分光光度計で必要とされる液量に基づいて
決定される。試料と基質組成物の体積比は、便利なピペ
ッティングができるように、本分野の通常の技術者によ
って容易に決定される。アッセイ混合液に加えられる相
対体積に依存して、反応速度論的アッセイ基質組成物中
の要素の濃度を、上で決定したような実行できる範囲
で、アッセイ混合液中の最終濃度を維持するように合わ
せる。
アッセイ基質組成のあらかじめ決めておいた体積と混合
することによって開始する。得られるアッセイ混合液の
最終体積は、反応経過を吸光度の変化で追跡するのに使
用する個々の分光光度計で必要とされる液量に基づいて
決定される。試料と基質組成物の体積比は、便利なピペ
ッティングができるように、本分野の通常の技術者によ
って容易に決定される。アッセイ混合液に加えられる相
対体積に依存して、反応速度論的アッセイ基質組成物中
の要素の濃度を、上で決定したような実行できる範囲
で、アッセイ混合液中の最終濃度を維持するように合わ
せる。
試料を基質組成物と混合した後、アッセイ混合液を分
光光度計中におき、使用する発色性基質に特異的な波長
で吸光度を、少なくとも最初の吸光度の読みと比較した
ときの吸光度変化があらかじめ決定しておいた値を越え
るまで、いくつかの時点で記録し、ここで該値は連続的
使用のために分光光度計を開放するためにアッセイを完
了する必要性（小さい吸光度変化）に対する、感度の必
要性（大きな吸光度変化）のバランスをとるように選択
される。これらの因子の間のバランスは、本分野の通常
の技術者には明らかなように、用いる液体試料によって
変化する。
光光度計中におき、使用する発色性基質に特異的な波長
で吸光度を、少なくとも最初の吸光度の読みと比較した
ときの吸光度変化があらかじめ決定しておいた値を越え
るまで、いくつかの時点で記録し、ここで該値は連続的
使用のために分光光度計を開放するためにアッセイを完
了する必要性（小さい吸光度変化）に対する、感度の必
要性（大きな吸光度変化）のバランスをとるように選択
される。これらの因子の間のバランスは、本分野の通常
の技術者には明らかなように、用いる液体試料によって
変化する。
望ましい態様においては、分光光度計はプログラム可
能な本分野で入手可能なマイクロプレートリーダーであ
り、混合液の体積はマイクロプレートのウェルの大きさ
によって決定される。多様な試験液体の複数の試料、お
よび標準曲線を作成するための一連のエンドトキシン希
釈液を、マイクロプレートのウェルに入れる。各ウェル
に一定料の基質組成物を、望ましくはマイクロピペッタ
ーで加え、連続的に各ウェルの吸光度を繰り返し判読す
るようにプログラムされているマイクロプレートリーダ
ーにプレートを固定する。
能な本分野で入手可能なマイクロプレートリーダーであ
り、混合液の体積はマイクロプレートのウェルの大きさ
によって決定される。多様な試験液体の複数の試料、お
よび標準曲線を作成するための一連のエンドトキシン希
釈液を、マイクロプレートのウェルに入れる。各ウェル
に一定料の基質組成物を、望ましくはマイクロピペッタ
ーで加え、連続的に各ウェルの吸光度を繰り返し判読す
るようにプログラムされているマイクロプレートリーダ
ーにプレートを固定する。
エンドトキシン濃度の算出 アッセイを連続的に行っている間、吸光度は分光光度
測定によって追跡される。混合液の最初の吸光度の読み
をそれ自身のブランクとして、例えば、一定量、望まし
くは0.200吸光度ユニット以上に吸光度が増加するのに
必要な時間を決定する。この時間を反応時間と呼ぶ。
測定によって追跡される。混合液の最初の吸光度の読み
をそれ自身のブランクとして、例えば、一定量、望まし
くは0.200吸光度ユニット以上に吸光度が増加するのに
必要な時間を決定する。この時間を反応時間と呼ぶ。
各産物の各試料に対する反応時間はその試料のエンド
トキシン濃度に対応する。試料のエンドトキシン濃度の
絶対値は、エンドトキシン濃度が既知の少なくとも１つ
のコントロール溶液の反応時間との比較によって決定さ
れる。既知の試料に対するが未知試料の反応時間の比
（あらかじめ決められた量の吸光度変化にかかる時間）
は、その濃度の比に反比例する。
トキシン濃度に対応する。試料のエンドトキシン濃度の
絶対値は、エンドトキシン濃度が既知の少なくとも１つ
のコントロール溶液の反応時間との比較によって決定さ
れる。既知の試料に対するが未知試料の反応時間の比
（あらかじめ決められた量の吸光度変化にかかる時間）
は、その濃度の比に反比例する。
未知試料のエンドトキシン濃度を決定する望ましい方
法は、未知試料の反応時間の対数を、既知のエンドトキ
シン濃度の一連の試料のlog（エンドトキシン濃度）に
対して同一の試料のlog（反応時間）をプロットして作
成した標準曲線と比較することである。
法は、未知試料の反応時間の対数を、既知のエンドトキ
シン濃度の一連の試料のlog（エンドトキシン濃度）に
対して同一の試料のlog（反応時間）をプロットして作
成した標準曲線と比較することである。
決定できるエンドトキシンの値が広い濃度範囲に渡る
ため、曲線を作成するために用いる標準エンドトキシン
濃度を調節することによってあらゆるアッセイの定量的
範囲を調節することが可能である。以下の表は、既知の
エンドトキシン活性の標準エンドトキシンから一連のエ
ンドトキシン希釈液を作成するための希釈法を示すもの
である。標準曲線を作成するためにすべての希釈を行う
必要はない。別の希釈法も同様に用いることができる。
ため、曲線を作成するために用いる標準エンドトキシン
濃度を調節することによってあらゆるアッセイの定量的
範囲を調節することが可能である。以下の表は、既知の
エンドトキシン活性の標準エンドトキシンから一連のエ
ンドトキシン希釈液を作成するための希釈法を示すもの
である。標準曲線を作成するためにすべての希釈を行う
必要はない。別の希釈法も同様に用いることができる。
コントロール試料の望ましい調製法は以下のようであ
る。
る。
1. 0.1mlの50EU/mlエンドトキシンストックを0.9mlの
発熱原フリー水に加えることによって5EU/mlエンドトキ
シンを含む溶液を調製する。この溶液を少なくとも１分
間、次に進む前に激しくボルテックスをかける。
発熱原フリー水に加えることによって5EU/mlエンドトキ
シンを含む溶液を調製する。この溶液を少なくとも１分
間、次に進む前に激しくボルテックスをかける。
2. 0.1mlの5EU/mlエンドトキシン溶液を適当な容器中
の0.9mlの発熱原フリー水に移し、0.5EU/mlと表示す
る。この溶液を次に進む前に少なくとも１分間激しくボ
ルテックスをかける。
の0.9mlの発熱原フリー水に移し、0.5EU/mlと表示す
る。この溶液を次に進む前に少なくとも１分間激しくボ
ルテックスをかける。
3. 0.1mlの0.5EU/mlエンドトキシン溶液を適当な容器
中の0.9mlの発熱原フリー水に移し、0.05EU/mlと表示す
る。この溶液を次に進む前に少なくとも１分間激しくボ
ルテックスをかける。
中の0.9mlの発熱原フリー水に移し、0.05EU/mlと表示す
る。この溶液を次に進む前に少なくとも１分間激しくボ
ルテックスをかける。
4. 0.1mlの0.05EU/mlエンドトキシン溶液を適当な容器
中の0.9mlの発熱原フリー水に移し、0.005EU/mlと表示
する。この溶液を次に進む前に少なくとも１分間激しく
ボルテックスをかける。
中の0.9mlの発熱原フリー水に移し、0.005EU/mlと表示
する。この溶液を次に進む前に少なくとも１分間激しく
ボルテックスをかける。
試験溶液中の他の因子による産物阻害 試料中の物質がLAL反応と相互作用する場合には、阻
害が生じる。本発明の方法において、このような阻害に
より反対時間が長くなり、希釈していないか適当な希釈
の試料中に実際に存在するよりも低い量のエンドトキシ
ンが示唆されることになる。
害が生じる。本発明の方法において、このような阻害に
より反対時間が長くなり、希釈していないか適当な希釈
の試料中に実際に存在するよりも低い量のエンドトキシ
ンが示唆されることになる。
阻害のないことを確かめるために、試料（または試料
の希釈液）の一部に既知量のエンドトキシンを加える。
の希釈液）の一部に既知量のエンドトキシンを加える。
エンドトキシンの添加によって試料中の最終エンドト
キシン濃度が、標準曲線の最高および最低の標準のエン
ドトキシン濃度の間の、対数に基づいて中間点と等しく
なるようにすることが推奨される。
キシン濃度が、標準曲線の最高および最低の標準のエン
ドトキシン濃度の間の、対数に基づいて中間点と等しく
なるようにすることが推奨される。
例えば、50から0.005EU/mlにわたる標準曲線をもつア
ッセイの場合、試料が最終エンドトキシン濃度が0.5EU/
mlを含むようにエンドトキシンを添加する。
ッセイの場合、試料が最終エンドトキシン濃度が0.5EU/
mlを含むようにエンドトキシンを添加する。
log50 ＝ 0.6990 log0.005＝−2.3010 log平均 ＝−0.3010 逆log ＝ 0.5 １から0.01EU/mlにわたる標準曲線をもつアッセイの
場合、試料が最終エンドトキシン濃度が0.1EU/mlを含む
ようにエンドトキシンを添加する。
場合、試料が最終エンドトキシン濃度が0.1EU/mlを含む
ようにエンドトキシンを添加する。
log1.0 ＝ 0.0000 log0.01 ＝−2.0000 log平均 ＝−1.0000 逆log ＝ 0.1 エンドトキシンを加えた溶液を、加えていない試料と
ならべてアッセイを行い、それぞれのエンドトキシン濃
度およびエンドトキシン添加試料から回収されたエンド
トキシンを算出する。回収されたエンドトキシンは添加
した既知の濃度±25％に等しくなるべきである。
ならべてアッセイを行い、それぞれのエンドトキシン濃
度およびエンドトキシン添加試料から回収されたエンド
トキシンを算出する。回収されたエンドトキシンは添加
した既知の濃度±25％に等しくなるべきである。
もしも試料（または希釈液）が反応を阻害するようで
あれば、阻害が見られなくなるまで試料をさらに希釈す
ることが必要である。
あれば、阻害が見られなくなるまで試料をさらに希釈す
ることが必要である。
最初に、試料を10倍希釈で調べることによって阻害に
関するスクリーニングを行う場合があるかもしれない。
おおよその非阻害的希釈が決定できれば、この希釈の周
辺で２倍希釈で調べることによって正確な希釈を見付け
ることができる。
関するスクリーニングを行う場合があるかもしれない。
おおよその非阻害的希釈が決定できれば、この希釈の周
辺で２倍希釈で調べることによって正確な希釈を見付け
ることができる。
阻害または増幅の程度は試料濃度に依存すると考えら
れる。同一の溶液をいくつかの濃度でアッセイすれば、
各々を独立に解析することが必要である。
れる。同一の溶液をいくつかの濃度でアッセイすれば、
各々を独立に解析することが必要である。
阻害または増幅の様式は、伝統的なLALゲル化試験で
見られるものとは異なるようである。
見られるものとは異なるようである。
発熱原フリーノ水酸化ナトリウムまたは塩酸を用い
て、阻害を克服するために試料のpHを7.0から8.0の範囲
に調節することが必要かもしれない。
て、阻害を克服するために試料のpHを7.0から8.0の範囲
に調節することが必要かもしれない。
呈色試料 各試料の最初の吸光度の読みをそれ自身のブランクと
して用いるため、それ自体で顕著な色をもつ試料には特
別な問題は生じない。しかいながら、バックグラウンド
の色が1.5吸光度ユニットならば、試料を希釈して再度
アッセイすべきである。
して用いるため、それ自体で顕著な色をもつ試料には特
別な問題は生じない。しかいながら、バックグラウンド
の色が1.5吸光度ユニットならば、試料を希釈して再度
アッセイすべきである。
実施例１ 凍結乾燥されたバイアル中の反応速度論的アッセイ試
料組成物の調製。発色性基質全体を冷やした（０−４
℃）、高圧滅菌済みのエンドトキシンを含まないトリス
−MgCl2−NaCl緩衝液と注射USPのための滅菌水に溶解す
る。得られた溶液を、限外濾過によって発熱原を除き、
無菌的濾過によって無菌化する。発色性基質溶液は使用
時まで冷やして（０−４℃）保存する。
料組成物の調製。発色性基質全体を冷やした（０−４
℃）、高圧滅菌済みのエンドトキシンを含まないトリス
−MgCl2−NaCl緩衝液と注射USPのための滅菌水に溶解す
る。得られた溶液を、限外濾過によって発熱原を除き、
無菌的濾過によって無菌化する。発色性基質溶液は使用
時まで冷やして（０−４℃）保存する。
希釈していない溶解産物を冷蔵庫から出し、冷やした
（０−４℃）高圧滅菌済みのエンドトキシンを含まない
トリス−MgCl2−NaCl緩衝液、スヴィターゲント３−14
溶液および注射USPのための滅菌水を加えることによっ
て望みのレベルの活性に調製する。得られた希釈溶解産
物をよく混合して冷蔵する（０−４℃）。
（０−４℃）高圧滅菌済みのエンドトキシンを含まない
トリス−MgCl2−NaCl緩衝液、スヴィターゲント３−14
溶液および注射USPのための滅菌水を加えることによっ
て望みのレベルの活性に調製する。得られた希釈溶解産
物をよく混合して冷蔵する（０−４℃）。
希釈溶解産物を無菌的に発色性基質溶液と、30対70の
比で混合する。
比で混合する。
混合したLAL/基質試薬を薄層流動HEPA濾過を装備した
独立の領域に、無菌的に分注する（2.6±0.2ml）。文中
後、最後の容器を適当な凍結乾燥ストッパーで部分的に
ストッパーをかけ、凍結乾燥機との間に装備し、以下に
述べるように凍結乾燥する。
独立の領域に、無菌的に分注する（2.6±0.2ml）。文中
後、最後の容器を適当な凍結乾燥ストッパーで部分的に
ストッパーをかけ、凍結乾燥機との間に装備し、以下に
述べるように凍結乾燥する。
産物を棚におき、凍らせてコンデンサーで−40℃かそ
れ以下まで冷却する。チェンバーを真空下におき、産物
を最終乾燥サイクルにセットし、産物を5.0％以下の残
存水分となるようにする。
れ以下まで冷却する。チェンバーを真空下におき、産物
を最終乾燥サイクルにセットし、産物を5.0％以下の残
存水分となるようにする。
試料の組成 溶解産物／基質の共凍結乾燥物 リムラス変形細胞／発色性基質試薬の共凍結乾燥物中
に含まれるものの名称と量。
に含まれるものの名称と量。
実施例２ 発色性基質による反応速度論的エンドトキシンアッセ
イを用いた標準曲線。実施例１で調製した100μｌの共
凍結乾燥したLAL:基質試薬を、第１図に示されるように
米国参考エンドトキシン調製物、EC−５の100μｌの多
様な希釈液と、96ウェルのマイクロプレートの個々のウ
ェル中で混合した。マイクロプレートを37℃でKinetic
−QCLリーダー中でインキュベートし、405nmの吸光度を
120秒おきに記録した。
イを用いた標準曲線。実施例１で調製した100μｌの共
凍結乾燥したLAL:基質試薬を、第１図に示されるように
米国参考エンドトキシン調製物、EC−５の100μｌの多
様な希釈液と、96ウェルのマイクロプレートの個々のウ
ェル中で混合した。マイクロプレートを37℃でKinetic
−QCLリーダー中でインキュベートし、405nmの吸光度を
120秒おきに記録した。
各試料（希釈液）の吸光度を時間に対して第１図のよ
うにプロットした。これらの曲線から、反応時間（0.2
吸光度ユニットに到達するのに必要な時間）を各試料に
ついて決定した。第２図はこれらの試料のlog（反対時
間）対log（エンドトキシン濃度）のプロットを示して
いる。
うにプロットした。これらの曲線から、反応時間（0.2
吸光度ユニットに到達するのに必要な時間）を各試料に
ついて決定した。第２図はこれらの試料のlog（反対時
間）対log（エンドトキシン濃度）のプロットを示して
いる。
実施例３ ３種の共LAL/基質試薬パイロット・ロットを実施例に
したがって調製した。
したがって調製した。
第３図、第４図、および第５図はパイロット反応速度
論的アッセイ基質組成ロットで作成した標準曲線のグラ
フを示している。各データのポイントは標準エンドトキ
シンの各重複に関する個々の反応時間を示している。線
は、反応時間とエンドトキシン濃度のlog/log相関の最
適直線回帰を示している。アッセイの再現性により、こ
の図では重複実験の多様性は明らかではない。
論的アッセイ基質組成ロットで作成した標準曲線のグラ
フを示している。各データのポイントは標準エンドトキ
シンの各重複に関する個々の反応時間を示している。線
は、反応時間とエンドトキシン濃度のlog/log相関の最
適直線回帰を示している。アッセイの再現性により、こ
の図では重複実験の多様性は明らかではない。
表３は標準曲線の作成するのに用いた標準エンドトキ
シンの重複実験（Ｎ＝３）中に見られる誤差をまとめた
ものである。すべての場合、誤差係数は5.0％以下であ
る。
シンの重複実験（Ｎ＝３）中に見られる誤差をまとめた
ものである。すべての場合、誤差係数は5.0％以下であ
る。
実施例４ 未知試料中のエンドトキシン濃度のlog/log相関と計
算。示されている試料と標準は実施例２で述べた方法で
エンドトキシンに関してアッセイした。
算。示されている試料と標準は実施例２で述べた方法で
エンドトキシンに関してアッセイした。
最小二乗法回帰による標準曲線： log(平均反応時間)＝−0.213×(log(濃度))＋2.957 試料1: 3.198のlog（平均時間）は−1.131または0.074EU/mlのl
og（濃度）に対応する。
og（濃度）に対応する。
試料2: 2.975のlog（平均時間）は0.085または0.823EU/mlのlog
（濃度）に対応する。
（濃度）に対応する。
実施例５ エンドトキシン反応速度論的アッセイキットは以下の
物で構成することができる： 実施例２で述べたように調整した８バイアル 大腸菌ロットEC−５の参考標準エンドトキシンに対し
て標準化した大腸菌エンドトキシンを含む２バイアル 発熱原フリー水を含む３バイアル 反応速度論的アッセイ法と標準曲線作成法を記述した
１冊のインストラクション。
物で構成することができる： 実施例２で述べたように調整した８バイアル 大腸菌ロットEC−５の参考標準エンドトキシンに対し
て標準化した大腸菌エンドトキシンを含む２バイアル 発熱原フリー水を含む３バイアル 反応速度論的アッセイ法と標準曲線作成法を記述した
１冊のインストラクション。
【図面の簡単な説明】 第１図。活性化された凝血酵素によって発色性基質（AC
−Ile−Glu−Ala−Arg−pNA）からｐ−ニトロアニリン
が遊離することによる405nmでの吸光度を、反応速度論
的アッセイ基質組成へのエンドトキシンの添加後の時間
に対してプロットされている。 第２図。0.20.D.に達する時間の対数が対応する希釈に
おけるエンドトキシン濃度の対数に対してプロットされ
ている、第１図の反応速度論的アッセイに基づく標準曲
線。 第３図、第４図、および第５図は、３つの異なる調製物
の反応速度論的アッセイ基質に対する標準曲線である。
0.20.D.に達する時間の対数が標準エンドトキシン試料
の対応する希釈液のエンドトキシン濃度の対数に対して
プロットされている。
−Ile−Glu−Ala−Arg−pNA）からｐ−ニトロアニリン
が遊離することによる405nmでの吸光度を、反応速度論
的アッセイ基質組成へのエンドトキシンの添加後の時間
に対してプロットされている。 第２図。0.20.D.に達する時間の対数が対応する希釈に
おけるエンドトキシン濃度の対数に対してプロットされ
ている、第１図の反応速度論的アッセイに基づく標準曲
線。 第３図、第４図、および第５図は、３つの異なる調製物
の反応速度論的アッセイ基質に対する標準曲線である。
0.20.D.に達する時間の対数が標準エンドトキシン試料
の対応する希釈液のエンドトキシン濃度の対数に対して
プロットされている。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/579 ＣＡ
Claims (5)
- 【請求項１】反応速度論的アッセイ基質組成物を用いる
試験液中のエンドトキシンの測定のための反応速度論的
方法であって、 ａ）試験液の試料を、リムラス変形細胞溶解産物の凝血
酵素の発色性基質と、前凝血酵素を含みかつエンドトキ
シンへの感受性を有するリムラス変形細胞溶解産物とを
含有する反応速度論的アッセイ基質組成物と、分光測定
光路を含む容器内で、エンドトキシンアッセイに適する
条件下で混合して、試料−反対速度論的アッセイ基質組
成物混合物を形成する過程であって、前記発色性基質と
前記溶解産物の両方がエンドトキシン測定量で存在する
過程； ｂ）前記容器を分光光度計内に入れて、該分光光度計の
光線を該容器と該試料−反応速度論的アッセイ基質組成
物混合物に通す過程； ｃ）該試料−反応速度論的アッセイ基質組成物混合物の
吸光度の変化を経時的に追跡する過程； ｄ）予め設定した吸光度変化が起こるのに必要な時間を
測定する過程であって、前記予め設定した吸光度変化が
アッセイ感受性およびアッセイ期間を最適なものにして
いる過程； ｅ）前記時間を、各標準エンドトキシン溶液について標
準エンドトキシン溶液中のエンドトキシンの濃度を前記
予め設定した吸光度変化に達するのに要する時間と相関
させることにより得られる標準曲線と比較することによ
り、該試料中のエンドトキシン濃度を計算する過程であ
って、前記標準エンドトキシン溶液が、該予め設定した
吸光度変化が起こるのに必要な時間を測定する前に、エ
ンドトキシンアッセイに適する条件下で前記反応速度論
的アッセイ基質組成物と混合される過程； を含む方法。 - 【請求項２】発色性基質が、式： R1−A1−A2−A3−A4−Ｂ−R2 （式中、R1は水素、ブロッキング芳香族炭化水素または
アシルを表し;A1はIle、ValまたはLeuから選択されるＬ
またはＤ−アミノ酸を表し;A2はGluまたはAspを表し;A3
はAlaまたはCysを表し;A4はArgを表し;Bはエステルまた
はアミドから選択される連結基を表し；そしてR2はＢ連
結基を介してアルギニンのＣ−カルボキシル末端に共有
結合している発色基または蛍光基を表わし、該蛍光基ま
たは発色基は、エンドトキシンおよび前凝血酵素の存在
下で該発色性基質の残りから酵素的に切断されて色素原
または蛍光原を形成することができる。） を有する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】リムラス変形細胞溶解産物が内因性阻害剤
の存在に起因する低下した感受性を有し、そして、反応
速度論的アッセイ基質組成物が、感受性増進量の該阻害
剤についての不活性化界面活性剤を含有する、特許請求
の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】リムラス変形細胞溶解産物が内因性阻害剤
の存在に起因する低下した感受性を有し、そして、反応
速度論的アッセイ基質組成物が、感受性増進量の該阻害
剤についての不活性化界面活性剤を含有する、特許請求
の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項５】容器がマイクロタイタープレートである特
許請求の範囲第３項記載の方法であって、複数の試料−
反応速度論的アッセイ基質組成物混合物が複数のウェル
中に存在し、そして、分光光度計が各ウェルを反復パタ
ーンで連続的に追跡するマイクロタイタープレートリー
ダーである方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US42830089A | 1989-10-30 | 1989-10-30 | |
| US428300 | 1989-10-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03220456A JPH03220456A (ja) | 1991-09-27 |
| JP2955345B2 true JP2955345B2 (ja) | 1999-10-04 |
Family
ID=23698313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2295164A Expired - Lifetime JP2955345B2 (ja) | 1989-10-30 | 1990-10-30 | リムラス変形細胞溶解産物および発色原基質を用いたエンドトキシン反応速度論的アッセイ |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0426395B1 (ja) |
| JP (1) | JP2955345B2 (ja) |
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| AU (1) | AU644109B2 (ja) |
| CA (1) | CA2028789C (ja) |
| DE (1) | DE69029785T2 (ja) |
| DK (1) | DK0426395T3 (ja) |
| ES (1) | ES2098256T3 (ja) |
| GR (1) | GR3023298T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JP3242733B2 (ja) * | 1993-02-26 | 2001-12-25 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシン特異的測定剤 |
| US6270982B1 (en) | 1997-10-09 | 2001-08-07 | Charles River Laboratories | Methods and compositions for the detection of bacterial endotoxins |
| JP4235279B2 (ja) * | 1998-04-10 | 2009-03-11 | 生化学工業株式会社 | 新規酵素反応測定法 |
| EP1499643A4 (en) * | 2002-04-30 | 2008-04-16 | Biowhittaker Technologies Inc | AUTOMATED SEQUENTIAL INJECTION ANALYSIS SYSTEMS FOR DETERMINING ENDOTOXIN LEVELS IN TRACES |
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| JP5118849B2 (ja) * | 2003-03-17 | 2013-01-16 | チャールズ リバー ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | 微生物夾雑物の検出のための方法および組成物 |
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| WO2004094987A2 (en) * | 2003-04-18 | 2004-11-04 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Kit for detecting endotoxin in aqueous solutions |
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| WO2007078268A2 (en) | 2004-12-02 | 2007-07-12 | Charles River Laboratories, Inc. | Methods and compositions for the detection and/or quantification of gram positive bacterial contaminants |
| EP1836492B1 (en) | 2005-01-13 | 2008-12-31 | Charles River Laboratories, Inc. | Method for classifying a microorganism in a biological sample |
| JPWO2008004674A1 (ja) * | 2006-07-07 | 2009-12-10 | 生化学工業株式会社 | プロクロッティングエンザイム、並びに、これを用いたエンドトキシン又は（１→３）−β−Ｄ−グルカンの検出方法 |
| US20080124248A1 (en) * | 2006-11-29 | 2008-05-29 | Edward Andrew Sobek | Endotoxins and glucans quantification in indoor air |
| US20090286692A1 (en) * | 2008-04-15 | 2009-11-19 | Wainwright Norman R | Cartridge and Method for Sample Analysis |
| JP5489680B2 (ja) * | 2009-12-02 | 2014-05-14 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法、それを実行するためのプログラム及び、生物由来の生理活性物質の測定装置 |
| WO2010104180A1 (ja) | 2009-03-13 | 2010-09-16 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法、それを実行するためのプログラム及び、生物由来の生理活性物質の測定装置 |
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| CU24073B1 (es) | 2011-12-27 | 2015-01-29 | Ct De Investigación Y Desarrollo De Medicamentos Cidem | COMPOSICIÓN A PARTIR DE EXTRACTO DE HEMOCITOS DE LANGOSTA PARA LA DETECCIÓN DE LIPOPOLISACÁRIDOS, PEPTIDOGLICANOS Y 1,3-ß-D-GLUCANOS |
| US20130078665A1 (en) * | 2012-07-18 | 2013-03-28 | Deepika Bodapati | Test strip, a test kit and a method for detection of endotoxin in food |
| US20150293097A1 (en) | 2012-10-08 | 2015-10-15 | General Electric Company | Preloaded test substrates for testing lal-reactive substances, methods of use, and methods of making |
| US10309947B2 (en) | 2013-02-27 | 2019-06-04 | Trace-Ability, Inc. | System and method for radiosynthesis, quality control and dose dispensing |
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| SG11201900767VA (en) * | 2016-08-03 | 2019-02-27 | Lonza Walkersville Inc | Method of detecting an endotoxin using limulus amebocyte lysate substantially free of coagulogen |
| CN110192110B (zh) * | 2017-01-11 | 2023-01-10 | 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 | 无凝固蛋白原的澄清的鲎阿米巴样细胞裂解物 |
| US20190001330A1 (en) | 2017-06-28 | 2019-01-03 | Lonza Walkersville, Inc. | Cartridge for endotoxin detection |
| US11892397B2 (en) * | 2017-10-17 | 2024-02-06 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Endotoxin testing assay and method of same |
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