DE69029785T2 - Kinetische Bestimmungsmethode für Endotoxin unter Verwendung von Limulus-Amoebocyten-Lysat und chromogenem Substrat - Google Patents
Kinetische Bestimmungsmethode für Endotoxin unter Verwendung von Limulus-Amoebocyten-Lysat und chromogenem SubstratInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft die Bestimmung von Endotoxin in Flüssigkeiten unter Verwendung einer Bestimmungsmethode auf der Basis eines Limulus-Amoebocyten-Lysates.
- Die Erscheinung der Koagulation des gerinnungsfördernden Enzyms des Amoebocyten-Lysats aus dem Blut des Hufeisenkrebses durch bakterielles Endotoxin ist seit vielen Jahren bekannt und veröffentlicht; s. z. B. Levin, J. und Bangs, F. B., "Clottable Protein in Limulus: Its Localization and Kinetics of its Coagulation by Endotoxin", Thomb. Diath. Heamortz. 19, Seite 186 (1968). Der Gerinnungsmechanismus war Gegenstand eingehender Untersuchungen wie der von Nakamura, S. et al., "Amino Acid Sequence Studies on the Fragments Produced from Horseshoe Crab Coagulogen during Gel Formation: Homologies with Primate Fibrinopeptide B", Biochemical and Biophysical Research Communication, 72(3), p. 902 (1976).
- Die Koagulation des Limulus-Amoebocyten-Lysats, im folgenden LAL, umfaßt die Aktivierung eines gerinnungsfördernden Enzyms durch Endotoxin in Gegenwart von zweiwertigen Kationen, z. B. Ca&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus;, Sr&spplus;&spplus; oder Mn&spplus;&spplus;, und die Spaltung eines gerinnenden Proteins (Koagulogen) an den C-Carboxylen der darin enthaltenen Glycin- und Arginineinheiten durch das resultierende aktivierte Enzym. Die gespaltenen Einheiten des Koagulogens bleiben durch Disulfidbrücken verbunden und polymerisieren unter Bildung eines Thrombus. Außer diesen bekannten Bestandteilen des Amoebocyten-Lysates kommen darin viele andere Proteine und ein bekannter Hemmstoff von der Art eines Lipoproteins vor. Der Mechanismus der Abwandlung der Koagulationsreaktion durch den Hemmstoff und andere Proteine wurde noch nicht bestimmt.
- Wegen der Koagulationseigenschaften des LAL in Gegenwart von bakteriellem Endotoxin (Pyrogen) sind LAL-zubereitungen zu wirtschaftlich bedeutenden Reagenzien für die Anwendung in Endotoxin-Bestimmungsmethoden zur Qualitätskontrolle bei der Herstellung von verschiedenen Flüssigkeiten mit pharmazeutischer oder medizinischer Bedeutung geworden, welche normalerweise parenteral zugeführt werden. Zu diesen Flüssigkeiten gehören Wasser zur Jnjektion, Wasser zur Irrigation, Fettemulsionen zur intravenösen Ernährung, wässrige Emulsionen von Pflanzenöl, Salzlösungen, z. B. parenteral zugeführte Natriumchloridlösungen einschließlich Natriumchlorid zur Injektion USP, Natriumchlorid zur Irrigation USP, Natriumchlorid zur Inhalation, und mit Lactat versetzte Ringerlösung, und Bluterzeugnisse, z. B. normales Serumalbumim, Plasmaprotein und Antihämophiliefaktor USP, Jmmunglobulin, Rho(D)-Immunglobulin und Humanglobulin-Antiserum.
- Die Formulierung von LAL-Reagenzien und die Verbesserung in den LAL-Verfahren ist bereits so weit fortgeschritten, daß ein LAL-Test der empfindlichste und praktischste der bekannten Endotoxin-Tests ist. Der LAL-Test kann durch Bildung eines Thrombus bis hinab zu 10&supmin;¹² g/ml Endotoxin nachweisen. Eine Untersuchung der Health Industries Association (Dabah, et al., "HIMA Collaborative Study for the Pyrogenicity Evaluation of a Reference Endotoxin by the USP Rabbit Test", HIMA Document No. 7, Vol 1 (May, 1979)) zeigte, daß der Kaninchen-Pyrogen-Test der United States Pharmacopeia (USP) ungefähr 10&supmin;&sup9; g/ml Endotoxin nachweisen kann. Daher ist der LAL-Test ungefähr 100mal so empfindlich wie der USP-Kaninchen-Pyrogentext. Außer dem Vorteil der Empfindlichkeit ist der LAL-Test einfacher durchzuführen und kann in etwa einer Stunde, gegenüber drei Stunden für den Kaninchentest, fertig sein.
- Der Nachweis von Endotoxin durch Gerinnung von LAL ist im wesentlichen ein kinetischer Test. Das Endotoxin aktiviert das gerinnungsfördernde Enzym, das gerinnungsfördernde Enzym spal tet das Coagulogen und das gespaltene Coagulogen agglomeriert unter Bildung eines Gels. Mehr Endotoxin führt zu schnellerer Ansammlung von gespaltenem Coagulogen und zu schnellerer Gelbildung, daher ist die für die Gelbildung erforderliche Zeit geringer, wenn mehr Endotoxin zugegen ist. Mit anderen Worten: Die Endotoxinkonzentration steht in umgekehrter Beziehung zu der Gelierzeit in dem Test.
- Die bei dieser Bestimmungsmethode erforderliche genaue Feststellung der Gerinnungszeit ist mit Schwierigkeiten verbunden. Die Aggregation, die Flockung und die Gerinnung sind aufeinanderfolgende Stufen in einem komplexen physikalischen Vorgang mit einer Vielzahl von physikalischen Kräften und wahrscheinlich einer Vielzahl von Komponenten. Die Grenzen zwischen den Stufen sind nicht klar bezeichnet, sondern sind subjektiv festgelegt und können sich unterscheiden, wenn sie von verschiedenen Beobachtern festgestellt werden. LAL ist eine chemisch komplizierte Mischung und kleine Änderungen in der Zusammensetzung können anscheinend gravierende Wirkungen auf den Verlauf des komplizierten Coagulationsphänomens haben. Schließlich ist ein auf der subjektiven Bestimmung der Gelbildung basierender Test in sich schwierig zu automatisieren. Zur Überwindung einiger der mit der genauen Bestimmung der Gelbildung und der damit verbundenen Endotoxin-Konzentration verbundenen Schwierigkeiten wurde eine alternative Bestimmungsmethode entwickelt.
- Die Verwendung chromogener Substrate ist zu einem Mittel sowohl zur Untersuchung als auch zur klinischen Messung verschiedener Enzyme und Hemmstoffe bei dem komplizierten menschlichen Gerinnungsprozeß geworden. Eine lange Liste von enzymspezifischen Substraten sind für die Messung von Enzymen, wie Trypsin, Thrombin, Thromboplastin, Plasmin, Kalikrein, Urokinase und Plasminogen, kommerziell erhältlich. Diese synthetischen Substrate liefern dem Forscher ein wichtiges Mittel zur Verfolgung des hämostatischen Zustands gewisser Aspekte des Gerinnungsvorganges in vitro.
- Iwanaga, et al., "Chromogenic Substrates for Horseshoe Crab dotting Enzyme: Its application for the Assay of Bacterial Endotoxin", Hemostasis 7:183-188 (1978), berichten, daß man zur Messung des Gehaltes an endotoxinaktiviertem gerinnungsförderndem Enzym in LAL aus dem Blut sowohl des japanischen (Tachypleus tridentatus) als auch des amerikanischen (Limulus polyphemus) Hufeisenkrebses synthetische Substrate verwenden kann. Ein Vorteil chromogener Substrate in einem LAL-Test im Vergleich zu einem konventionellen LAL-Geliertest ist, daß die Menge des aktivierten Gerinnungsenzyms quantifiziert werden kann. Die Verwendung gewisser synthetischer peptidartiger Substrate in LAL-Tests zur quantitativen Messung bakteriellen Endotoxins wurde im US-Patent Nr. 4,188,264 beschrieben. Die Offenbarung des Patentes lehrt ein Peptidsubstrat mit einer aus L-Aminosäuren in der Sequenz R&sub1;-gly-arg-R&sub2; bestehenden -Struktur, wobei R&sub1; eine N-blockierte Aminosäure und R&sub2; eine durch enzymatische Hydrolyse unter Bildung einer gefärbten Verbindung HR&sub2; freisetzbare Gruppe ist.
- Ein anderes Patent, US 4,510,241, offenbart ein verbessertes chromogenes Peptid-Substrat zur Verwendung in Tests vom LAL- Typ. Dieses verbesserte Substrat unterscheidet sich von dem vorangehenden am auffallendsten dadurch, daß der gly-Teil in der Sequenz durch ala oder cys ersetzt ist.
- Bei einem LAL-Typ-Test unter Verwendung eines dieser Substrate wird das gerinnungsfördernde Enzym (eine Serin-Protease) in dem LAL durch Endotoxin aktiviert und spaltet die Peptidkette an der Carboxylseite des Arginins, wobei die chromogene Gruppe freigesetzt wird und eine Markerverbindung bildet, welche auf einfache Weise durch Mittel wie Spektralphotometrie erkannt werden kann.
- EP-A-180905 offenbart eine Methode zur Bestimmung von Endotoxinkonzentrationen in Proben und, falls vorhanden, störenden Faktoren durch Zusatz von definierten Mengen von Endotoxin zur Probe und vorzugsweise mindestens zwei verschiedenen Mengen Endotoxin zu gleichen Probenzubereitungen. Die Druckschrift diskutiert die Verwendung eines chromogenen Substrats, legt aber nahe, daß solche Substrate ihrerseits die Endotoxin-LAL- Reaktion hemmen.
- EP-A-0075761 offenbart peptidartige Substrate, die für die quantitative Bestimmung von Endotoxin brauchbar sind. Sie lehrt eine abgewandelte LAL-Endotoxin-Bestimmungsmethode, die auf der Fähigkeit des aktivierten proteolytischen Gerinnungs enzyms beruht, ein Chromophor von einem chromogenen Substrat abzuspalten, in der Form einer klassischen zweistufigen Endpunktbestimmungsmethode.
- Trotz zahlreicher zur Verbesserung der Quantifizierung, der Empfindlichkeit, der Geschwindigkeit und der Genauigkeit entwickelten Abwandlungen bleiben eine Anzahl von Nachteilen mit dem LAL-Test verbunden. Von diesen steht an erster Stelle der begrenzte Empfindlichkeitsbereich (etwa eine Größenordnung) bei der festgelegten Inkubationszeit (Endpunktmethode), sowohl bei der Trübungsmessung als auch bei der Farbmessung. Ein zweiter Nachteil bei Endpunktmethoden ist das Erfordernis, daß ein Laborant zu einem genauen Zeitpunkt die Reaktion beenden oder ablesen muß. Bei dem chromogenen Test muß zur Beendigung des Tests Säure zugefügt werden. In einem Spektralphotometer kann die optische Dichte danach zu jeder beliebigen Zeit abgelesen werden. Bei der turbidimetrischen Endpunktmethode kann die Reaktion nicht gestoppt werden, ohne daß die Trübung beseitigt wird; sie muß unmittelbar nach einer spezifischen Inkubationsperiode ausgelesen werden.
- Ein anderer Weg zur Verbesserung des LAL-Typ-Tests war, die Genauigkeit der Messung des Gerinnungsvorgangs zu verbessern. Dies wurde erreicht, indem man sich auf die Trübungszunahme der Testlösung mit fortschreitender Aggregation konzentrierte, anstatt auf die Gelierung zu warten (Young, et al., (1972) J. Clin. Invest., 51:1790-1797). Der kinetische turbidimetrische LAL-Test liefert verschiedene potentielle Verbesserungen gegenüber der Endpunktmethodik. Die kinetische turbidimetrische Methode verwendet ein einziges Reagenz und erfordert nach Einleitung des Tests keine weitere Aufmerksamkeit des Laboranten; so werden sowohl Präzision als auch Geschwindigkeit und Genauigkeit verbessert. Am wichtigsten ist, daß der Bereich des Tests von einer auf mehr als fünf Größenordnungen erweitert werden konnte. Leider wird bei Trübungsmessungen mit einem Spektralphotometer die durch physikalische Abschirmung verursachte Abnahme des durchgelassenen Lichtes benutzt, und daher ist das Beersche Gesetz nicht anwendbar. Sowohl Teilchengröße und -Anzahl als auch das reflektierte und gebrochene Licht beeinflussen die Messung in verschiedenem Maße. Obwohl elegante elektronische Filterung in Verbindung mit Computerglättung der Daten erfolgreich entwickelt und zur Deutung der Ergebnisse kinetischer Trübungsmessungen angewendet wurden (Novitsky, et al., p. 189-196 und Remillard, et al., pp. 197- 210, beide in Watson, et al., "Detection of Bacterial Endotoxins with the Limulus Amebocyte Lysate Test." Alan R. Liss, Inc., New York, 1987), sind diese Verfahren nur auf spezialisierten optischen Lesegeräten verfügbar. Des weiteren müssen einige Produkte stark verdünnt werden, um überhaupt mit der kinetischen turbidimetrischen Methode bestimmt werden zu können.
- Aufgabe der Erfindung ist es, eine Bestimmungsmethode für Endotoxin mit verbesserter Empfindlichkeit anzugeben.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung von Endotoxin anzugeben, welches über einen vergrößerten Bereich von Endotoxin-Konzentrationen in den interessierenden Flüssigkeiten anwendbar ist.
- Noch eine Aufgabe der Erfindung ist es, eine Methode zur Bestimmung von Endotoxin anzugeben, welche die Meßfehler vermindert.
- Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Substratzusammensetzung für die kinetische Bestimmung anzugeben.
- Diese und andere Aufgaben werden durch die folgenden Ausführungsformen der Erfindung gelöst.
- In einer ersten Ausführung stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von Endotoxin in einer Versuchsflüssigkeit bereit, das gekennzeichnet ist durch die Anwendung einer kinetischen Methode unter Verwendung einer Substratzubereitung für die kinetische Bestimmung mit den Stufen:
- a) Vermischen einer Probe der Versuchsflüssigkeit mit einer Substratzubereitung für die kinetische Bestimmung, die ein chromogenes Substrat, das durch das Gerinnungsenzym gespalten wird, und ein gegen Endotoxin empfindliches Lysat aus Limulus-Amoebocyten enthält in einem für spektralphotometrische Messungen geeigneten Gefäß, wobei sowohl Substrat als auch Lysat in einer Endotoxin bestimmenden Menge zugegen sind;
- b) Einbringen dieses Gefäßes in ein Spektralphotometer, so daß der Spektralphotometerstrahl durch das Gefäß und das Gemisch aus Probe und Substratzubereitung für die kinetische Bestimmung hindurchtritt;
- c) Verfolgen der Änderung in der optischen Absorption des Gemisches aus Probe und Substratzubereitung für die kinetische Bestimmung mit der Zeit;
- d) Bestimmung der für das Auftreten einer vorbestimmten Änderung der Absorption erforderlichen Zeit;
- e) Berechnung der Endotoxin-Konzentration in der Probe durch Vergleich dieser Zeit mit einer Eichkurve, die durch Korrelation der Endotoxin-Konzentration in Eichlösungen mit der für jede der Endotoxin-Eichlösungen für das Erreichen dieser vorbestimmten Änderung der Absorption eines Gemisches aus Endotoxin-Eichlösung und Substratzubereitung für die kinetische Bestimmung erforderlichen Zeit erhalten wird.
- Dieses chromogene Substrat hat bevorzugt die Formel
- R&sub1;-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-B-R&sub2;,
- wobei R&sub1; Wasserstoff, einen blockierenden aromatischen Kohlenwasserstoff oder Acyl; A&sub1; eine aus Ileu, Val oder Leu ausgewählte L- oder D-Aminosäure; A&sub2; Glu oder Asp; A&sub3; Ala oder Cyst; A&sub4; Arg; B eine aus Ester- oder Amid-Bindungsgruppen ausgewählte Bindungsgruppe und R&sub2; eine durch die Bindungsgruppe B an die C-Carboxyl-Endgruppe von Arginin kovalent gebundene chromogene oder fluorogene Gruppe darstellen, und wobei der fluorogene oder chromogene Teil vom Rest der peptidartigen Verbindung in Gegenwart von Endotoxin und gerinnungsförderndem Enzym unter Bildung von zumindest eines Teils einer Markerverbindung enzymatisch abgespalten werden kann.
- In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird eine Zubereitung mit einem chromogenen Substrat und einem Lysatrea genz aus Limulus-Amoebocyten zur Verwendung bei der kinetischen Bestimmung von Endotoxin bereitgestellt, wobei dieses chromogene Substrat eine Verbindung der Formel
- R&sub1;-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-B-R&sub2; ist,
- wobei R&sub1; Wasserstoff, einen blockierenden aromatischen Kohlenwasserstoff oder Acyl; A&sub1; eine aus Ileu, Val oder Leu ausgewählte L- oder D-Aminosäure; A&sub2; Glu oder Asp; A&sub3; Ala oder Cyst; A&sub4; Arg; B eine aus Ester- oder Amid-Bindungsgruppen ausgewählte Bindungsgruppe und R&sub2; eine durch die Bindungsgruppe B an die C-Carboxyl-Endgruppe von Arginin kovalent gebundene chromogene oder fluorogene Gruppe darstellen, und wobei der fluorogene oder chromogene Teil vom Rest der peptidartigen Verbindung in Gegenwart von Endotoxin und gerinnungsförderndem Enzym unter Bildung von zumindest eines Teils einer Markerverbindung enzymatisch abgespalten werden kann; und
- dieses Lysatreagenz aus Limulus-Amoebocyten eine gepufferte wässrige Dispersion eines in einer Endotoxin bestimmenden Menge vorhandenen und gegen Endotoxin empfindlichen Lysats aus Limulus-Amoebocyten und ein den LAL-Inhibitor inaktivierendes oberflächenaktives Mittel umfaßt.
- Durch Verwendung dieser Substratzubereitung und eines kinetischen Bestimmungsverfahrens wird im Vergleich zu früheren auf LAL- und chromogenen Substraten basierenden Endotoxintests die Nachweisgrenze für Endotoxin um ein bis drei Größenordnungen herabgesetzt und der Bereich der nachweisbaren Endotoxinkonzentrationen um mindestens zwei Größenordnungen erweitert. Die erfindungsgemäße Bestimmungsmethode erfordert auch keine weitere Behandlung nachdem die Endotoxin enthaltende Probe mit der kinetischen Substratzusammensetzung vermischt wurde, so daß der durch Handhabung eingeführte Fehler wesentlich vermindert wird.
- Figur 1. Die durch das von dem aktivierten Gerinnungsenzym aus dem chromogenen Substrat (AC-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA) freigesetzte p-Nitroanilin hervorgerufene Absorption bei 405 nm ist gegen die Zeit nach Zusatz des Endotoxins zu der Substratzubereitung für die kinetische Bestimmung aufgetragen.
- Figur 2. Eine auf den kinetischen Bestimmungen in Figur 1 beruhende Eichkurve, wobei der Logarithmus der für das Erreichen der optischen Dichte 0,2 erforderlichen Zeit gegen den Logarithmus der Endotoxinkonzentration in der entsprechenden Verdünnung aufgetragen ist.
- Figuren 3, 4 und 5 sind Eichkurven für drei verschiedene Ansätze des Substrats für die kinetische Bestimmung. Der Logarithmus der für das Erreichen der optischen Dichte 0,2 erforderlichen Zeit ist gegen den Logarithmus der Endotoxinkonzentrationen in den entsprechenden Verdünnungen einer standardisierten Endotoxinprobe aufgetragen.
- Die erfindungsgemäß verbesserte Bestimmungsmethode für Endotoxin beruht auf der Verwendung einer neuen Substratzusammensetzung, welche eine erhöhte Empfindlichkeit und einen weiteren Bestimmungsbereich sowie ein geringeres Potential für Fehler, die während des Verfahrens durch den Bediener verursacht werden, besitzt.
- Bei der Ausführung der Erfindung kann jedes Limulus-Amoebocyten-Lysat (LAL) verwendet werden. Das nach dem US-Patent 4,322,217 hergestellte LAL liefert ausgezeichnete Ergebnisse. Das bevorzugte LAL-Reagenz enthält je ml zwischen 1 und 4 mg Protein des Limulus-Amoebocyten-Lysats und zwischen 0,01 und 0,05 % (wlv) eines den im Limulus-Blut vorhandenen Inhibitor inaktivierenden oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise in Tris/MgCl&sub2;/NaCl-Puffer von pH 7,0 bis 7,5 verdünnt. Ein besonders bevorzugtes oberflächenaktives Mittel ist Zwittergent 3-14 (Calbiochem, Inc.).
- Es sei nochmals erwähnt, daß für diese Erfindung jedes chromogene Substrat, welches durch das Gerinnungsenzym gespalten wird, verwendet werden kann. Jedoch erhält man mit dem nach dem US-Patent 4,510,241 hergestellten chromogenen Substrat ausgezeichnete Ergebnisse. Das am meisten bevorzugte Substrat enthält die Sequenz: Acetat-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA, wobei pNA eine para-Nitroanilin-Gruppe bedeutet. Konzentration und Zusammensetzung der chromogenen Substratlösung gehören zum Fachwissen. Eine typische chromogene Substratlösung enthält zwischen 0,5 und 4 mg/ml des chromogenen Substrats (äquivalent zu 1,4 bis 11 mikromol/ml), hergestellt in Tris/MgCl&sub2;/Nacl-Puffer mit pH 7,0-7,5.
- Mit chromogenen Substraten der Formel R&sub1;-gly-arg-R&sub2; erhält man Absorptionsänderungen, die für die Anwendung bei der unten beschriebenen kinetischen Bestimmung ausreichen. Jedoch hat der Erfinder beobachtet, daß sie zu rasch sich verändernden Grundlinien führen. (Dies könnte auf die Autohydrolyse des Substrates bei den für die kinetische Bestimmung optimalen neutralen pH-Bedingungen zurückzuführen sein, so daß die Aktivierung des Gerinnungsenzyms und die Hydrolyse des chromogenen Substrats simultan ablaufen können.) Obwohl kinetische Bestimmungen unter Anwendung dieses chromogenen Substrats einen weiteren Bereich als die Endpunktbestimmungen des Standes der Technik abdecken, begrenzt die erhöhte Grundlinie die Möglichkeit, niedrige Konzentrationen von Endotoxin zu messen. Dagegen zeigen die mit den bevorzugten Substraten (in US-Patent 4,510,241 gelehrt) ausgeführten kinetischen Bestimmungen viel stabilere Grundlinien und daher größere Empfindlichkeit, was zu einer verbesserten Leistungsfähigkeit des Test mit Proben oder Verdünnungen führt, die sehr geringe Endotoxinkonzentrationen enthalten. Desgleichen ergibt das nach der bevorzugten Methode, gelehrt in US-Patent 4,322,217, hergestellte LAL eine weitere Verbesserung der Empfindlichkeit des kinetischen Tests im Vergleich zu anderen LAL-Zubereitungen, aber auch die kinetischen Tests mit irgendeiner der kommerziell erhältlichen LAL-Zubereitungen zeigt einen verbesserten Bereich und eine verbesserte Empfindlichkeit im Vergleich zu den chromogenen Endpunkt-Bestimmungen nach dem Stand der Technik.
- Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß bevorzugt Salze zweiwertiger Metalle, welche bekanntlich die Aktivierung des gerinnungsförderndem Enzyms verstärken, und Puffer zur Vermeidung von pH-Extrema, die das Gerinnungsenzym inaktivieren könnten, bevorzugt zugegen sind. Alle nach dem Stand der Technik mit dem LAL-System kompatiblen Puffer und Salze können verwendet werden. Ein bevorzugtes Puffersystem enthält den Puffer Tris (Tris(hydroxy)aminomethan) mit den Salzen MgCl&sub2; und NaCl, und, wie oben gezeigt, kann dieses Puffersystem auch für die Herstellung des LAL-Reagenzes und zum Auflösen des chromogenen Substrats verwendet werden.
- Das LAL-Reagenz und die Lösung des chromogenen Substrats können unabhängig voneinander hergestellt werden. Sie können bei 2 bis 8 ºC gelagert werden, bis sie für die Anwendung fertig gestellt werden. Die für die Bestimmung verwendete Substratzusammensetzung zur kinetischen Bestimmung ist eine Mischung der beiden obengenannten Lösungen. Das bevorzugte Verhältnis ist 30 Teile LAL-Lösung zu 70 Teilen.Lösung des chromogenen Substrats.
- Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die Mengen des LAL- Proteins und des in der Substratzusammensetzung für die kinetische Bestimmung vorhandenen chromogenen Substrats aufeinander abgestimmt werden müssen, um sicherzustellen, daß in der Reaktion oder nach Zusatz der Probe in der Testmischung wirksame Mengen dieser zwei Komponenten vorhanden sind. Während der Endotoxinbestimmung in der endgültigen Mischung ist die Konzentration des LAL-Proteins zwischen 0,15 und etwa 0,6 mg/ml, bevorzugt zwischen etwa 0,3 und etwa 0,5 mg/ml. Die Konzentration des chromogenen Substrats in der Testmischung ist zwischen ungefähr 0,5 mmol bis ungefähr 3,9 mmol, bevorzugt ungefähr 1,0 mmol.
- In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Substratzubereitung mit dem LAL-Reagenz und dem chromogenen Substrat in Reagenzgläser gefüllt und nach dem Fachmann wohlbekannten Standard-Lyophilisierungsverfahren lyophilisiert. Dieses lyophili sierte Material ist Im wesentlichen wasserfrei (weniger als 5 %) und kann bei Zimmertemperatur, bevorzugt aber unter Kühlung (0 bis 4 ºC) gelagert werden. Die Substratzusammensetzung wird unmittelbar vor der Verwendung für die Bestimmung durch Zusatz einer Menge sterilen, pyrogenfreien Wassers in das Reagenzglas zwecks Auflösung des lyophilisierten Materials wieder hergestellt. Die zugefügte Wassermenge ist so bemessen, daß in der wiederhergestellten Zubereitung die vor der Lyophilisierung bestehende Feststoffkonzentration erreicht wird.
- Ein Reagenziensatz zur Verwendung bei der Ausführung kinetischer Tests zur Bestimmung von Endotoxin sollte ein oder mehrere Reagenzgläser umfassen, in welchen die Substratzusammensetzung für die kinetische Bestimmung mit dem chromogenen Substrat und dem LAL lyophilisiert worden ist. Darüber hinaus kann der Reagenziensatz Reagenzgläser mit anderen, bei der kinetischen Bestimmung des Endotoxins verwendbaren Reagenzien, wie pyrogenfreies Wasser zur Verdünnung der Proben und standardisierte Endotoxinlösung für die Erstellung der Eichkurven enthalten.
- Das vorliegende Verfahren nutzt die Anfangsstufe der LAL-Endotoxin-Reaktion&sub1; um ein im LAL vorhandenes Enzym zu aktivieren, welches seinerseits ein gefärbtes Teil eines synthetischen Substrates freisetzt, wobei eine nachweisbare Farbänderung in der Reaktionsmischung hervorgerufen wird. Zur Bestimmung der Menge gramnegativen bakteriellen Endotoxins in einem Material wird eine Probe des Materials mit der oben beschriebenen Chromogen-LAL-Substrat-Zusammensetzung in einer Küvette, auf einer Tüpfelplatte oder in einem ähnlichen Gefäß für die spektral photometrische Bestimmung gemischt. Gramnegatives bakterielles Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus-Amoebocyten-Lysat (LAL). Die Anfangsgeschwindigkeit der Aktivierung ist durch die Konzentration des vorhandenen Endotoxins festgelegt. Das aktivierte Enzym katalysiert die Abspaltung eines gefärbten Teils von dem farblosen Substrat und die Reaktion wird spektralphotometrisch über die Zeit verfolgt, um das zeitabhängige Auftreten der nachweisbaren Farbänderung aufzuzeichnen. Die für eine Farbänderung einer bestimmten Größe erforderliche Zeit (Reaktionszeit) steht in umgekehrter Beziehung zu der vorhandenen Menge Endotoxin. Das heißt, daß in Gegenwart einer großen Menge Endotoxin die Reaktion rasch abläuft und daher eine vorgegebene Farbänderung nach einer kürzeren Zeitdauer auftritt. Bei Vorhandensein einer kleineren Menge Endotoxin erhöht sich die Reaktionszeit und die Farbe ändert sich langsamer.
- Die Endotoxin-Konzentration in unbekannten Proben kann aus einer Eichkurve berechnet werden, welche unter Verwendung einer Reihe von Proben mit bekannter Endotoxinkonzentration erstellt wurde. Eine doppeltlogarithmische Beziehung zwischen der für das Auftreten einer bestimmten Farbänderung notwendigen Zeit (Reaktionszeit) und der Endotoxinkonzentration ist zwischen 0,005 und 50 EU/ml linear. Die Konzentration des Endotoxins in einer Probe wird aus deren Reaktionszeit durch Vergleich mit der Reaktionszeit von Lösungen, die bekannte Mengen des Endotoxinstandards enthalten, berechnet.
- Die auf dem kinetischen Verfahren beruhende Endotoxinbestimmungsmethode kann zur Bestimmung von Endotoxin in jeglicher, - 10 für Pharmazie oder Medizin bedeutenden Flüssigkeit verwendet werden, bei der zur Zeit die Bestimmung nach einer anderen -Methode durchgeführt wird. Hierzu gehören Wasser zur Injektion, Wasser zur Irrigation, flüssige Emulsionen für die intravenöse Ernährung, wässrige Emulsionen von Pflanzenöl, Salzlösungen, z. B. parenteral zugeführte Natrium-Chlorid-Lösungen unter Einschluß von Natriumchlorid zur Injektion USP, Natriumchlorid zur Irrigation USP, Natriumchlorid zur Inhalation und laktathaltige Ringer-Lösungen, und Blutprodukte, z. B. normales Serumalbumin, Plasmaproteinfraktionen und Antihämophihe Faktor USP, Immunglobulin, Rho(D)-Immunglobulin und Humanglobulin-Antiserum. Das Verfahren kann auch zum Nachweis von Endotoxin in biologischen Flüssigkeiten verwendet werden, in denen die Anwesenheit von Endotoxin eine diagnostische Bedeutung haben kann, darunter Blut, Lymphe, Urin, Serum, Acites Flüssigkeit, abgesaugte Lungenflüssigkeit und ähnliches.
- Alle Materialien, die mit der Probe oder den Testreagenzien in Berührung kommen, müssen pyrogenfrei sein. Durch 30 min Erhitzen auf 250 ºC können die Materialien pyrogenfrei gemacht werden. Zum Schutz der pyrogenfrei gemachten Materialien vor nachfolgender Verunreinigung aus der Umwelt sollten geeignete Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden. Eine Einstellung des pH- Wertes der Probe in den Bereich von 7,0 bis 8,0 unter Verwendung pyrogenfreien Natriumhydroxids oder pyrogenfreier Salz säure kann erforderlich sein.
- Die zu untersuchenden Proben sollten so gelagert werden, daß jegliche bakteriologische Aktivität zum Stillstand kommt, da sonst der Endotoxingehalt mit der Zeit ansteigen kann. Beispielsweise können Proben bis zu 24 h bei 2 bis 8 ºC gelagert werden; für längere Zeiten sollten sie eingefroren werden.
- Die Bestimmung wird durch Mischung eines Aliquots (Probe) der Testflüssigkeit mit einem vorgelegten Volumen der Substrat- 10 zubereitung für die kinetische Bestimmung eingeleitet. Das Endvolumen des resultierenden Testgemisches wird nach den -Anforderungen des für die Verfolgung der Änderung der Absorption im Verlauf der Reaktion verwendeten speziellen Spektralphotometers festgelegt. Das Volumenverhältnis zwischen Probe und Substratzubereitung kann vom Fachmann leicht so festgelegt werden, daß ein bequemes Pipettieren möglich ist. Die Konzentration der Bestandteile in der Substratzubereitung für die kinetische Bestimmung wird in Abhängigkeit von denen zur Testmischung zugesetzten relativen Volumina so angepaßt, daß die Endkonzentrationen in der Testmischung in dem oben definierten Arbeitsbereich bleiben.
- Nach Vermischen der Probe mit der Substratzubereitung wird das Testgemisch in ein Spektralphotometer eingebracht und die optische Dichte bei der für das benutzte chromogene Substrat charakteristischen Wellenlänge wird zumindest so lange zu bestimmten Zeitpunkten aufgezeichnet, bis die Absorptionsänderung im Vergleich zur anfänglichen Absorption einen vorbestimmten Wert überschreitet. Bei der Auswahl dieses Wertes wird das Bedürfnis nach Empfindlichkeit (große Absorptionsänderung) gegen das Bedürfnis abgewogen, die Bestimmung zu beenden, um das Spektralphotometer für den folgenden Gebrauch freizumachen (kleine Absorptionsänderung). Für den Fachmann ist offensichtlich, daß die Abwägung zwischen diesen Faktoren von den verwendeten Testflüssigkeiten abhängt.
- In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Spektralphotometer ein kommerziell erhältlicher programmierbarer Tüpfelplattenleser, und das Volumen der Mischung wird durch die Größe der Vertiefungen in der Tüpfelplatte bestimmt. In den Vertiefungen der Tüpfelplatte kann eine Vielzahl von Proben verschiedener Testflüssigkeiten oder auch eine Reihe von Endotoxinverdünnungen zum Erstellen der Eichkurve untergebracht werden. Danach wird eine festgelegte Menge der Substratzubereitung zu jeder der Vertiefungen zugefügt, vorzugsweise mit einem Multipipettiergerät, und die Platte mit dem Tüpfelplattenleser bearbeitet, der so programmiert wird, daß er zyklisch nacheinander die Absorption jeder Vertiefung mißt.
- Während der Bestimmung wird die Absorption spektralphotometrisch kontinuierlich verfolgt. Beispielsweise wird unter Verwendung der anfänglichen Absorption der Mischung als Nullwert die für den Anstieg der Absorption um einen bestimmten Betrag, vorzugsweise gleich oder größer als 0,200 Absorptions einheiten, erforderliche Zeit bestimmt. Diese Zeit wird als Reaktionszeit bezeichnet.
- Die Reaktionszeit für jede Probe eines jeden Produkts steht in Beziehung zu der Endotoxinkonzentration dieser Probe. Der Absolutwert der Endotoxinkonzentration der Probe wird durch Vergleich der Reaktionszeit der Probe mit der Reaktionszeit für mindestens eine Vergleichslösung mit bekannter Endotoxinkonzentration bestimmt. Das Verhältnis der Reaktionszeiten (Zeit, in der die Absorption sich um einen vorgegebenen Betrag ändert) der unbekannten im Verhältnis zu der bekannten Probe ist umgekehrt proportional zu dem Verhältnis ihrer Konzentrationen.
- Eine bevorzugte Methode zur Bestimmung der Endotoxinkonzen tration in einer unbekannten Probe besteht darin, den Logarithmus der Reaktionszeit der unbekannten Probe mit einer Eichkurve zu vergleichen, die aus einem Graphen des Logarithmus der Reaktionszeit eine Reihe von Proben mit bekannter Endotoxinkonzentration gegen den Logarithmus der Endotoxinkon-zentration dieser Proben besteht.
- Weil die Endotoxinwerte über einen großen Konzentrationsbe reich bestimmt werden können, ist es möglich, den Mengenbereich jedes gegebenen Tests anzupassen, indem man die Konzentration der für die Erzeugung der Kurve verwendeten Endotoxinstandards anpaßt. Die untenstehende Tafel schlägt ein Verdünnungsschema zur Herstellung einer Reihe von Endotoxinverdünnungen aus einem Endotoxinstandard mit bekannter Endotoxinaktivität vor. Es brauchen nicht alle Verdünnungen für die Erstellung einer Eichkurve verwendet zu werden. Ebenso können auch andere Verdünnungsschemata verwendet werden.
- Eine bevorzugte Methode für die Herstellung von Vergleichsproben umfaßt:
- 1. Man stellt eine Lösung mit 5 EU/ml Endotoxin durch Zufügen von 0,1 ml einer 50 EU/ml Endotoxin-Vorratslösung zu 0,9 ml pyrogenfreien Wassers her. Diese Lösung sollte vor dem weiteren Vorgehen mindestens 1 min kräftig gerührt werden.
- 2. Man überführt 0,1 ml der 1 EU/ml Endotoxinlösung in 0,9 ml pyrogenfreien Wassers in einem geeigneten Behilter und etikettiert 0,5 EU/ml. Die Lösung sollte vor dem weiteren Vorgehen mindestens 1 min kräftig gerührt werden.
- 3. Man überführt 0,1 ml der 0,5 EU/ml Endotoxinlösung in 0,9 ml pyrogenfreien Wassers in einem geeigneten Behälter und etikettiert 0,5 EU/ml. Diese Lösung sollte vor dem weiteren Vorgehen mindestens 1 min lang kräftig gerührt werden.
- 4. Man überführt 0,1 ml der 0,05 EU/ml Endotoxinlösung in 0,9 ml pyrogenfreien Wassers in einem geeigneten Behälter und etikettiert 0,05 EU/ml. Diese Lösung sollte vor dem weiteren Vorgehen mindestens 1 min kräftig gerührt werden.
- Wenn Substanzen in der Probe die LAL-Reaktion stören, kommt es zur Hemmung. Bei der erfindungsgemäßen Methode führt eine solche Hemmung zu einer längeren Reaktionszeit, welche geringere Gehalte von Endotoxin anzeigt, als tatsächlich in der Probe vorhanden sein könnten, sowohl unverdünnt als auch bei geeigneter Verdünnung.
- Um die Abwesenheit einer Hemmung zu dokumentieren, wird ein Aliquot der Probe (oder eine Verdünnung der Probe) mit einer bekannten Menge Endotoxin versetzt.
- Es ist empfehlenswert, daß die in der Probe durch den Endotoxinzusatz sich ergebende endgültige Endotoxinkonzentration beim geometrischen Mittel zwischen der höchsten und der niedrigsten Eichlösung der Eichkurve liegt.
- So sollten beispielsweise bei einem Test mit einer Eichkurve, die sich von 50 bis 0,005 EU/ml erstreckt, die Proben so mit Endotoxin versetzt werden, daß die endgültige Konzentration 0,5 EU/ml beträgt. log Mittelwert antilog
- Erstreckt sich die Eichkurve von 1 bis 0,01 EU/ml, dann sollte der Endotoxinzusatz zu einer Endkonzentration an Endoxin von 0,1 EU/ml führen. log Mittelwert antilog
- Die mit Endotoxin versetzte Lösung wird parallel zu der nicht mit Endotoxin versetzten Probe untersucht und die betreffenden Endotoxinkonzentrationen sowie das wiedergefundene zugesetzte Endotoxin werden berechnet. Das wiedergefundene Endotoxin sollte gleich der bekannten Konzentration des Zusatzes ± 25 % sein.
- -Wenn die Probe (oder Verdünnung) sich als hemmend für die Reaktion herausstellt, kann eine weitere Verdünnung notwendig sein, bis die Hemmung überwunden ist.
- Man kann zunächst durch Messung lofacher Verdünnungen der Probe nach der Hemmung suchen. Wenn die Verdünnung für das Ausbleiben der Hemmung ungefähr festgelegt ist, kann die genaue Verdünnung gefunden werden, indem zweifache Verdünnungen in der Nähe dieser Verdünnung geprüft werden.
- Das Ausmaß der Hemmung oder Verstärkung wird von der Konzen tration der Probelösung abhängen. Wenn mehrere Konzentrationen der gleichen Lösung gemessen werden sollen, muß die Leistungscharakteristik für jede unabhängig festgestellt werden.
- Die gefundenen Hemmungs- oder Verstärkungsmuster können unterschiedlich von den mit dem herkömmlichen LAL-Gelierungstest gefundenen sein. Es kann notwendig sein, den pH-Wert der Probe in den Bereich von 7,0 bis 8,0 mit pyrogenfreiem Natriumhydroxid oder pyrogenfreier Salzsäure einzustellen, um die Hemmung zu überwinden.
- Da für jede Probe die anfängliche Absorption als Nullwert benutzt wird, machen Proben mit einer wesentlichen Eigenfärbung keine besonderen Schwierigkeiten. Wenn jedoch die Eigenfarbe 1,5 Absorptionseinheiten beträgt, sollte die Probe verdünnt und nochmals gemessen werden.
- Herstellung einer Substratzusammensetzung für die kinetische Bestimmung, in Reagenzgläsern lyophilisiert. Das chromogene Substrat wird in gekühltem (0 bis 4 ºC), autoklaviertem und endotoxinfreiem Tris-MgCl&sub2;-NaCl-Puffer und sterilem Wasser zur Injektion, USP, gelöst. Die resultierende Lösung wird durch Ultraf iltration pyrogenfrei gemacht und durch aseptische Filtration sterilisiert. Die Lösung des chromogenen Substrats wird gekühlt (0 bis 4 ºC) bis zur Verwendung gelagert.
- Unverdünntes Lysat wird aus dem Kühlschrank genommen und durch Zusatz von einer gekühlten (0 bis 4 ºC) Lösung von autoklaviertem endotoxinfreiem Tris-MgCl&sub2;-NaCl-Puffer, Zwittergent 3-14-Lösung und sterilem Wasser zur Injektion USP auf den gewünschten Gehalt eingestellt. Das resultierende verdünnte Vorratslysat wird gut gemischt und gekühlt (0 bis 4 ºC).
- Verdünntes Lysat aus dem Vorrat wird aseptisch mit der Lösung des chromogenen Substrats vereinigt, indem man 30 Teile des verdünnten Lysats mit 70 Teilen Lösung des chromogenen Substrats mischt.
- Das vereinigte LAL/Substrat-Reagenz wird in einem getrennten Bereich, der mit laminar-flow-HEPA-Filtration ausgerüstet ist, aseptisch abgefüllt (2,6 ± 0,2 ml). Nach dem Abfüllen werden die endgültigen Behälter mit einem geeigneten Lyophilisierungsstopfen teilweise verschlossen, in das Lyophilisiergerät eingebracht und wie unten beschrieben lyophilisiert.
- Das Produkt wird auf den Tisch gestellt, eingefroren und der Kondensator auf -40 ºC oder darunter gekühlt. Die Kammer wird evakuiert und das Produkt eingedampft, wobei durch die Schlußtrocknung ein Restfeuchtegehalt von 5,0 % oder weniger gesichert wird. ZUSAMMENSETZUNG DES REAGENZ Colyophilisiertes Lysat/Substrat Name und Menge jedes Bestandteils im colyophilisierten Limulus-Amoebocyten-Lysat/chromogenes Substrat-Reagenz.
- * Oberflächenaktives Mittel - Handelsmarke von Calbiochem, Inc., die Menge wird bei jeder Lieferung zur Optimierung der chromogenen Aktivität angepaßt.
- Eichkurve unter Verwendung des kinetischen Endotoxintests mit chromogenem Substrat. 100 µl des colyophilisierten LAL/Substrat-Reagenzes nach Beispiel 1 wurde mit 100 µl von verschiedenen Verdünnungen der US-Referenz-Endotoxin-Zubereitung, EC- 5, in verschiedenen Vertiefungen einer 96er Tüpfelplatte vermischt, wie in Fig. 1 angegeben. Die Tüpfelplatte wurde bei 37 ºC im Kinetik-QCL -Leser inkubiert und die Absorptionswerte bei 405 nm alle 120 s aufgezeichnet.
- In Figur 1 ist die optische Dichte jeder Probe (Verdünnung) gegen die Zeit aufgetragen. Aus diesen Kurven wurde die Reaktionszeit (für das Erreichen von 0,2 Dichte-Einheiten notwendige Zeit) für jede Probe bestimmt.
- Figur 2 zeigt den Graphen des log (Reaktionszeit) über log (Endotoxinkonzentration) für diese Proben.
- Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurden drei Pilotansätze des colyophilisierten LAL/Substrat-Reagenzes hergestellt.
- Die Figuren 3, 4 und 5 stellen Graphen der Eichkurven dar, die mit den Pilotansätzen der Substratzusammensetzung für die kinetische Bestimmung erzeugt worden waren. Jeder Datenpunkt gibt die individuelle Reaktionszeit für jede Wiederholung der Endotoxin-Eichproben wieder. Die Gerade ist die lineare Regressionslinie der doppeltlogarithmischen Korrelation von Reaktionszeit und Endotoxinkonzentration. Wegen der Reproduzierbarkeit der Bestimmungsmethode fällt in diesen Figuren kein Unterschied zwischen den Wiederholungen auf.
- In Tabelle III ist die bei Wiederholungen (N=3) der für die Erzeugung der Eichkurven verwendeten Endotoxin-Eichproben beobachtete Schwankung zusammengefaßt. In allen Fällen ist der Variationskoeffizient kleiner als 5,0 %. TABELLE III Varianz bei Wiederholungsmessungen der Endotoxin-Eichproben
- Doppeltlogarithmische Korrelation und Berechnung der Endotoxinkonzentration in unbekannten Proben. Nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurden die bezeichneten Proben und Eichproben auf die Endotoxinkonzentration untersucht. BEISPIELBERECHNUNGEN
- Eichkurve durch Regression nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate: log (mittlere Reaktionszeit) = -0,213 x (log (Konzentration)) +2,957
- Meßprobe 1: log (mittlere Zeit) von 3,198 entspricht log (Konzentration) von -1,131 oder 0,074 EU/ml.
- Meßprobe 2: log (mittlere Zeit) von 2,975 entspricht log (Konzentration) von 0,085 oder 0,823 EU/ml.
- Ein Reagenziensatz für die kinetische Bestimmung von Endotoxin kann aus folgenden Teilen zusammengestellt werden:
- 8 nach der Beschreibung im Beispiel 2 vorbereitete Reagenzgläser
- 2 Reagenzgläser mit E. coli Endotoxin, welches gegenüber dem Referenzstandard Endotoxin E. coli lot EC-5 (Office of Biologics, U.S. Food and Drug Administration) eingestellt ist
- 3 Reagenzgläser mit pyrogenfreiem Wasser 1 Arbeitsanweisung, welche das kinetische Bestimmungs verfahren und die Anfertigung der Eichkurve beschreibt.
Claims (8)
1. Verfahren zur Bestimmung von Endotoxin in einer
Versuchsflüssigkeit, gekennzeichnet durch die
Anwendung einer kinetischen Methode unter Verwendung einer
Substratzubereitung für die kinetische Bestimmung mit den
Stufen:
a) Vermischen einer Probe der Versuchsflüssigkeit mit
einer Substratzubereitung für die kinetische
Bestimmung, die ein chromogenes Substrat, das durch das
Gerinnungsenzym gespalten wird, und ein gegen
Endotoxin empfindliches Lysat aus Limulus-Amoebocyten
enthält in einem für spektralphotometrische Messungen
geeigneten Gefäß, wobei sowohl Substrat als auch Lysat
in einer Endotoxin bestimmenden Menge zugegen sind;
b) Einbringen dieses Gefäßes in einen Spektralphotometer,
so daß der Spektralphotometerstrahl durch das Gefäß
und das Gemisch aus Probe und Substratzubereitung für
die kinetische Bestimmung hindurchtritt;
c) Verfolgen der Änderung in der optischen Absorption des
Gemisches aus Probe und Substratzubereitung für die
kinetische Bestimmung mit der Zeit;
d) Bestimmung der für das Auftreten einer vorbestimmten
Änderung der Absorption erforderlichen Zeit;
e) Berechnung der Endotoxin-Konzentration in der Probe
durch Vergleich dieser Zeit mit einer Eichkurve, die
durch Korrelation der Endotoxin-Konzentration in
Eichlösungen mit der für jede der Endotoxin-Eichlösungen
für das Erreichen dieser vorbestimmten Änderung der
Absorption eines Gemisches aus Endotoxin-Eichlösung
und Substratzubereitung für die kinetische Bestimmung
erforderlichen Zeit erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das chromogene Substrat
die Formel
R&sub1;-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-B-R&sub2; hat,
wobei R&sub1; Wasserstoff, einen blockierenden aromatischen
Kohlenwasserstoff oder Acyl; A&sub1; eine aus Ileu, Val oder
Leu ausgewählte L- oder D-Aminosäure; A&sub2; Glu oder Asp; A&sub3;
Ala oder Cyst; A&sub4; Arg; B eine aus Ester- oder
Amid-Bindungsgruppen ausgewählte Bindungsgruppe und R&sub2; eine durch
die Bindungsgruppe B an die C-Carboxyl-Endgruppe von
Arginin kovalent gebundene chromogene oder fluorogene Gruppe
darstellen, und wobei der fluorogene oder chromogene Teil
vom Rest der peptidartigen Verbindung in Gegenwart von
Endotoxin und gerinnungsförderndem Enzym unter Bildung von
zumindest eines Teils einer Markerverbindung enzymatisch
abgespalten werden kann.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Lysat aus Limulus-
Amoebocyten ein den LAL-Inhibitor inaktivierendes
oberflächenaktives Mittel enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Lysat aus Limulus-
Amoebocyten ein den LAL-Inhibitor inaktivierendes
oberflächenaktives Mittel enthält.
5. Eine Zubereitung mit einem chromogenen Substrat und einem
Lysatreagenz aus Limulus-Amoebocyten zur Verwendung bei
der kinetischen Bestimmung von Endotoxin, wobei dieser
chromogene Träger eine Verbindung der Formel
R&sub1;-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-B-R&sub2; ist,
wobei R&sub1; Wasserstoff, einen blockierenden aromatischen
Kohlenwasserstoff oder Acyl; A&sub1; eine aus Ileu, Val oder
Leu ausgewählte L- oder D-Aminosäure; A&sub2; Glu oder Asp; A&sub3;
Ala oder Cyst; A&sub4; Arg; B eine aus Ester- oder
Amid-Bindungsgruppen ausgewählte Bindungsgruppe und R&sub2; eine durch
die Bindungsgruppe B an die C-Carboxyl-Endgruppe von
Arginin kovalent gebundene chromogene oder fluorogene Gruppe
darstellen, und wobei der fluorogene oder chromogene Teil
vom Rest der peptidartigen Verbindung in Gegenwart von
Endotoxin und gerinnungsförderndem Enzym unter Bildung von
zumindest eines Teils einer Markerverbindung enzymatisch
abgespalten werden kann; und
dieses Lysatreagenz aus Limulus-Amoebocyten eine
gepufferte wässrige Dispersion eines in einer Endotoxin
bestimmenden Menge vorhandenen und gegen Endotoxin empfindlichen
Lysats aus Limulus-Amoebocyten und ein den LAL-Inhibitor
inaktivierendes oberflächenaktives Mittel umfaßt.
6. Zubereitung nach Anspruch 5, welche lyophilisiert und im
wesentlichen wasserfrei ist.
7. Ein Satz für die Bestimmung von Endotoxin in
Versuchsflüssigkeiten mit wenigstens einem Röhrchen, das die
Zubereitung nach Anspruch 6 enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Gefäß eine
Mikrotüpfelplatte mit einer Vielzahl von Probengemischen in
einer Vielzahl von Vertiefungen und das Spektralphotometer
ein Mikrotüpfelplattenleser, der jede Vertiefung nach
einem sich wiederholenden Schema nacheinander mißt, ist.
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