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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Stabilisierung von
Thrombin und eine Zusammensetzung, die stabilisiertes Thrombin enthält. Insbesondere
bevorzugt betrifft sie ein Mittel zur Stabilisierung eines Thrombin-Reagenz', das im Bereich
klinischer Tests verwendet wird, und ein Reagenz, das stabilisiertes Thrombin
enthält.
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Hintergrund der Erfindung
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Thrombin,
das ein Enzym zur Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin darstellt,
spielt eine sehr wichtige Rolle in einem Prozess der Blutgerinnungs-Reaktion.
Im Bereich klinischer Labortests wird Thrombin häufig benutzt, um die Konzentration
von Fibrinogen zu bestimmen, und um die Aktivität von Thrombin-Inhibitoren, wie
zum Beispiel die Anti-Thrombin-Aktivität, die Hirudin-Aktivität und die
Aktivität
chemisch synthetisierter Inhibitoren, zu messen.
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Jedoch
ist Thrombin im Allgemeinen instabil, und zur Konservierung über einen
langen Zeitraum wird es normalerweise einer Gefriertrocknungs-Behandlung
unterzogen.
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Versuche
zur Stabilisierung von Thrombin sind bis jetzt reichlich durchgeführt worden.
Sie werden zum Beispiel in der japanischen Patent-Offenlegungsschrift
Nr. 39 782/1981, in der japanischen Patent-Veröffentlichung Nr. 76 292/1991,
in den japanischen Patent-Offenlegungsschriften mit den Nummern
93 536/1989, 53 732/1990, 40 433/1989, 33 799/1995 und 328 436/1997,
in der japanischen Patent-Veröffentlichung
Nr. 13 750/1996, in der japanischen Patent-Offenlegungsschrift Nr.
165 604/1995, in der japanischen Patent-Veröffentlichung Nr. 64 747/1995,
in den japanischen Patent-Offenlegungsschriften Nr. 192 723/1988
und 320 683/1992, in der japanischen Patent-Veröffentlichung Nr. 26 956/1983
und in den japanischen Patent-Offenlegungsschriften mit den Nummern
52 267/1998, 112 721/1985 und 68 607/1981 erwähnt.
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US-A-5
304 372 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen
Thrombin-Konzentrats, das für
die therapeutische Verwendung gedacht ist.
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EP-A-0
478 827 offenbart ein stabilisiertes Thrombin, seine Herstellung
und Verwendung als ein Thrombin-Reagenz.
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EP-A-0
444 692 offenbart eine stabile Thrombin-Zusammensetzung zur oralen
Verabreichung.
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US-A-4
409 334 beschreibt eine stabilisierte Thrombin-Zubereitung in fester
oder gelöster
Form.
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Chabbat
J. et al., Thrombosis Res., U.S., Vol. 76, Nr. 6. S. 525–533, 1994
beschreibt eine pasteurisierte Zubereitung eines Fibrin-Klebers,
der hochgradig gereinigtes menschliches Thrombin und Fibrinogen-Konzentrat
umfasst.
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Laut
einer Zusammenfassung, die in der BIOSIS Datenbank (online) erhältlich ist,
beschreibt BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, Philadelphia, PATENTANMELDUNG,
US, Machovich R., Thrombosis Res., Vol. 9, Nr. 2, S. 123–131, 1976
die Wirkung von Calciumphosphat auf Thrombin und dessen Empfindlichkeit
gegenüber
Heparin und Antithrombin-III.
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EP-A-0
221 700 offenbart eine weitere Thrombin-Zubereitung.
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EP-A-0
699 909 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen und
ein Reagenz zu dessen Bestimmung.
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Jedoch
ist keines dieser Verfahren perfekt als ein Verfahren zur Stabilisierung
von Thrombin, und insbesondere zeigt keines derselben eine ausreichende
Stabilisierung für
die Verwendung als diagnostisches Mittel für klinische Labortests.
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In
der Zwischenzeit wird Thrombin, das als Mess-Reagenz verwendet wird,
derart hergestellt, dass Thrombin, das normalerweise von einem Menschen
oder von Tieren stammt, zu einer Lösung hinzugefügt wird,
die einen Puffer oder Stabilisator enthält, um den gewünschten
Titer zu ergeben, und es wird als Lösung oder gefriergetrocknetes
Produkt aufbewahrt und verwendet. Das so hergestellte Thrombin-Reagenz
wird, wie schon erwähnt,
zu verschiedenen Zwecken verwendet, und in jedem Fall wird die Aktivität von Thrombin schließlich selbst
gemessen, wobei das gewünschte
Ziel erreicht ist.
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In
Bezug auf die Messung der Thrombin-Aktivität werden gewöhnlich ein
Messverfahren, das ein künstlich
hergestelltes Substrat verwendet, oder ein Messverfahren eingesetzt,
das Fibrinogen verwendet, welches ein natürliches Substrat ist. Für das erstgenannte
Verfahren ist die kolorimetrische Analyse üblich, während für letzteres die Analyse der
Koagulationszeit gebräuchlich
ist. Bei dem letztgenannten Verfahren zur Analyse der Koagulationszeit
ist ein Verfahren bekannt, bei dem die Koagulationszeit bestimmt
wird, indem die Veränderungen
im gestreuten Licht oder im transmittierten Licht nachgewiesen werden,
und ein physikalisches Verfahren, bei dem die Koagulationszeit bestimmt
wird, indem die Tatsache nachgewiesen wird, dass sich Kugeln aufgrund
der Ausbildung der Koagulation nicht mehr bewegen können.
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Das
größte Problem
bei der Messung der Koagulationszeit bei den vorstehend genannten
Bestimmungsverfahren ist es, dass die Reproduzierbarkeit der Messung
gering ist. Insbesondere die Umwandlungsreaktion von Fibrinogen
zu Fibrin, die Thrombin verwendet, ist eine Übergangsreaktion von einer
Flüssigphasenreaktion
zu einer Festphasenreaktion, und es ist bekannt, dass diese in großem Ausmaß durch
die Reaktionsbedingungen, wie zum Beispiel den pH-Wert oder die
Ionenstärke,
beeinflusst wird.
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Als
Ergebnis des Einflusses von solchen Reaktionsbedingungen ist die
Reproduzierbarkeit gering. Unter solchen Umständen besteht eine rege Nachfrage
nach dem Aufbau eines Messsystems, das flüssiges und stabiles Thrombin
verwendet, von den Reaktionsbedingungen unbeeinflusst ist, und eine
gute Reproduzierbarkeit aufweist.
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Offenlegung der Erfindung
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mittel zur Stabilisierung
von Thrombin, eine Zusammensetzung, die Thrombin enthält, das
stabilisiert ist und eine gute Reproduzierbarkeit bei der Messung
liefert, und ein Reagenz, das die genannte Zusammensetzung enthält, bereitzustellen.
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Die
vorliegenden Erfinder haben eine intensive Untersuchung durchgeführt, und
sie haben als Ergebnis herausgefunden, dass eine Inaktivierung von
Thrombin in allen Fällen
eines gelösten
Zustands, eines gefriergetrockneten Produkts und einer Lösung, die
durch Rekonstituierung nach einer Gefriertrocknungs-Behandlung hergestellt
wurde, verhindert werden kann, wenn Calcium-Ionen oder eine Mischung
von Calcium-Ionen und einer wasserlöslichen organischen Säure in dem
Thrombin enthalten sind. Sie haben des Weiteren herausgefunden,
dass – zusätzlich zu
Calcium-Ionen und einer wasserlöslichen
organischen Säure – ein oberflächenaktives
Mittel, ein Protein, und dergleichen eine stabilisierende Wirkung
auf Thrombin haben. Es wurde auch herausgefunden, dass ein Thrombin-Reagenz
mit einer guten Reproduzierbarkeit bei der Messung dadurch hergestellt
werden kann, dass ein oder mehrere hochmolekulare Polysaccharide
oder synthetische Polymere damit gemischt wird/werden, und zusätzlich zu
den vorstehend genannten Substanzen darin enthalten ist/sind, wobei
eine stabilisierende Wirkung erzielt wird. Als Ergebnis ist die
vorliegende Erfindung erreicht worden.
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Deshalb
umfasst die vorliegende Erfindung eine Verwendung und ein Verfahren
in Übereinstimmung mit
den angefügten
Ansprü chen.
Bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Des
Weiteren wird offenbart:
- (1) ein Mittel zur
Stabilisierung von Thrombin, dadurch gekennzeichnet, dass (eine)
in Bezug auf die Thrombin-Stabilisierung
wirksame Menge(n) von einer oder mehreren Verbindung(en) mit einer
Thrombin stabilisierenden Wirkung enthalten ist/sind, wobei die
Verbindung aus Calcium-Ionen, einem oberflächenaktiven Mittel und einem
Protein ausgewählt
wird;
- (2) das Mittel zur Stabilisierung von Thrombin gemäß dem vorstehend
genannten Punkt (1), wobei (eine) in Bezug auf die Thrombin-Stabilisierung
wirksame Menge(n) von einer oder mehreren Verbindung(en) mit einer
Thrombin stabilisierenden Wirkung – zusätzlich zu einer wasserlöslichen
organische Säure
mit einer Thrombin stabilisierenden Wirkung – enthalten ist/sind, wobei
die Verbindung aus Calcium-Ionen, einem oberflächenaktiven Mittel und einem
Protein ausgewählt
wird;
- (3) das Mittel zur Stabilisierung von Thrombin gemäß dem vorstehend
genannten Punkt (2), wobei mindestens Calcium-Ionen und eine wasserlösliche Säure gemeinsam
verwendet werden und wirksame Mengen derselben in Bezug auf eine
Thrombin-Stabilisierung darin enthalten sind;
- (4) eine Thrombin enthaltende Zusammensetzung, wobei mindestens
eines der Stabilisierungsmittel für Thrombin aus den vorstehend
genannten Punkten (1) bis (3) eingebracht wird;
- (5) die Thrombin enthaltende Zusammensetzung gemäß dem vorstehend
genannten Punkt (4), wobei eine wirksame Menge einer Substanz enthalten
ist, die eine verbessernde Funktion hinsichtlich reproduzierbarer Messungen
aufweist und die aus einer oder mehreren Verbindungen zusammengesetzt
ist, die ausgewählt werden
aus hochmolekularen Polysacchariden und/oder synthetischen Polymeren,
mit der Zielsetzung, die Reproduzierbarkeit von Aktivitätsmessungen
der zu testenden Substanz zu gewährleisten,
wobei ein Reagenz verwendet wird, das Thrombin enthält;
- (6) die Thrombin enthaltende Zusammensetzung gemäß dem vorstehend
genannten Punkten (4) oder (5), wobei die Zusammensetzung flüssig ist;
- (7) ein Verfahren zur Herstellung einer Thrombin enthaltenden
Zusammensetzung, in die mindestens eines der stabilisierenden Mittel
für Thrombin,
die unter den vorstehend genannten Punkten (1) bis (6) beschrieben
sind, eingebracht wird; und
- (8) eine Messmethode, die eine Thrombin enthaltende Zusammensetzung
als Reagenz verwendet, in welche mindestens eines der stabilisierenden
Mittel für
Thrombin, die unter den vorstehend genannten Punkten (1)–(6) beschrieben
sind, eingebracht wird.
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Die beste Art zur Ausführung der
Erfindung
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Die
Verwendung zur Verbesserung der Stabilität bei der Konservierung von
Thrombin gemäß der vorliegenden
Erfindung und das Verfahren zur Stabilisierung von Thrombin in einem
Thrombin-Reagenz
werden in näheren
Einzelheiten hier erläutert.
Die Verwendung zur Verbesserung der Stabilität bei der Konservierung von
Thrombin gemäß der vorliegenden
Erfindung wird dadurch gekennzeichnet, dass ein nicht-ionisches, oberflächenaktives
Mittel und Calcium-Ionen in einem Thrombin-Reagenz für Tests
im klinischen Laboratorium verwendet werden. Darüber hinaus wird eine Verbindung,
die eine wasserlösliche
organische Säure
darstellt und eine Thrombin stabilisierende Funk tion aufweist, zusätzlich und
gemeinsam verwendet. Der Ausdruck „Menge, die in Bezug auf die
Stabilisierung der Verbindung wirksam ist, und eine stabilisierende
Funktion aufweist" bezeichnet
eine Menge, durch welche die Stabilität verbessert wird, und obwohl
es hierfür
keine besondere Beschränkung
gibt, bezeichnet sie zum Beispiel eine Menge der Verbindung mit
einer stabilisierenden Funktion in einem solchen Ausmaß, dass
mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 60% oder stärker bevorzugt
mindestens 70% der Aktivität,
im Vergleich mit der Thrombin-Aktivität unmittelbar nach der Herstellung der
Thrombin-Lösung,
beibehalten werden, wenn eine Lösung,
die Thrombin enthält,
bei 25°C
für sechs
Monate konserviert wird. In diesem Fall bezeichnet der Ausdruck „ein Mittel" ein Verfahren und/oder
ein Medium, das verwendet wird, um das Ziel zu erreichen.
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(Thrombin)
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Das
Thrombin, welches durch das Stabilisierungsmittel für Thrombin
gemäß der vorliegenden
Erfindung stabilisiert werden soll, kann ein beliebiges sein, das
von Tieren stammt, das von humanem Plasma stammt, und das mittels
eines rekombinanten DNA-Verfahrens hergestellt wird. Die Konzentration
des Thrombins in einer Lösung
der Thrombin enthaltenden Zusammensetzung, in welche das Stabilisierungsmittel
eingebracht wird, ist nicht in besonderer Weise beschränkt, sondern
seine Aktivität
kann genau so eingestellt werden, um den beabsichtigten Wert der
Aktivität
zu erhalten.
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(Calcium-Ion)
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In
Bezug auf das Calcium-Ion, das als Stabilisierungsmittel für Thrombin
verwendet wird, können
wasserlösliche
Calciumverbindungen, wie zum Beispiel Calciumchlorid, Calciumlactat,
Calciumgluconat, Calciumglucuronat und Calciumtartrat, als Beispiele
angegeben werden. In Bezug auf solche Calciumverbindungen kann eine
oder können
zwei oder mehrere derselben ausgewählt und verwendet werden.
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Die
wirksame Menge einer Calciumverbindung für die Stabilisierung von Thrombin
kann eine Menge sein, welche die Stabilität gerade verbessert, und obwohl
es keine besondere Beschränkung
hierfür
gibt, liegt die Endkonzentration der Verbindung, wenn das Thrombin
in einem gelösten,
flüssigen
Zustand vorliegt, vorzugsweise im Bereich von 5 mM bis 100 mM, und
stärker
bevorzugt im Bereich von 10 mM bis 50 mM.
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(Organische Säuren)
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In
Bezug auf die organische Säure,
welche als ein Stabilisierungsmittel für Thrombin verwendet wird, wird
eine wasserlösliche,
organische Säure
verwendet, und Ameisensäure,
Essigsäure,
Propionsäure,
Buttersäure,
Valeriansäure,
Oxalsäure,
Malonsäure,
Bernsteinsäure,
Gluconsäure,
Milchsäure,
Glucuronsäure,
Glykolsäure,
Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Glutarsäure, Aminoessigsäure und
Aminocapronsäure
können
als Beispiele angegeben werden. Eine solche organische Säure kann
entweder eine freie Säure
sein oder ein Salz derselben. Es kann eine Säure, oder zwei oder mehr Säuren können ausgewählt und
eingesetzt werden.
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Die
wirksame Menge der organischen Säure
zur Stabilisierung von Thrombin kann eine Menge sein, welche die
Stabilität
gerade verbessert, und obwohl es keine besondere Beschränkung gibt,
liegt die Endkonzentration der organischen Säure, wenn Thrombin in einem
gelösten,
flüssigen
Zustand vorliegt, vorzugsweise im Bereich von 10 mM bis 500 mM,
und stärker
bevorzugt im Bereich von 50 mM bis 200 mM.
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(Oberflächenaktives
Mittel)
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In
Bezug auf das oberflächenaktive
Mittel können
folgende Beispiele angegeben werden: anionische oberflächenaktive
Mittel, wie zum Beispiel Natriumdodecylsulfat, Natriumdodecyl-N-sarcosinat,
Natriumcholat, Natriumdeoxycholat und Natriumtaurodeoxycholat; kationische
oberflächenaktive
Mittel, wie zum Beispiel Cetyltrimethylammoniumbromid, Tetradecylammoniumbromid
und Dodecylpyridiniumchlorid; amphotere oberflächen aktive Mittel, wie zum
Beispiel 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1-propansulfonsäure (CHAPS),
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonium]-2-hydroxy-1-propansulfonsäure (CHAPSO),
Palmitoyltoluidin, Dodecyl-N-betain und Dodecyl-β-alanin;
und nicht-ionische oberflächenaktive
Mittel, wie zum Beispiel Octylglucosid, Peptylthioglucosid, Decanoyl-N-methylglucamid,
Polyoxyethylen-dodecylether, Polyoxyethylen-heptamethylhexylether,
Polyoxyethylen-isooctylphenylether (Triton X-Reihe), Polyoxyethylen-nonylphenylether,
Polyoxyethylen-fettsäureester,
Saccharose-fettsäureester
und Polyoxyethylen-sorbitester
(Tween-Reihe).
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Gemäß der Erfindung
werden nicht-ionische oberflächenaktive
Mittel verwendet. Es kann ein oberflächenaktives Mittel ausgewählt und
eingesetzt werden, oder es können
zwei oder mehrere oberflächenaktive Mittel
ausgewählt
und gemeinsam eingesetzt werden.
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Die
wirksame Menge des oberflächenaktiven
Mittels zur Stabilisierung von Thrombin kann eine Menge sein, welche
die Stabilität
gerade verbessert, und obwohl es keine besondere Beschränkung gibt,
liegt die Endkonzentration des oberflächenaktiven Mittels, wenn Thrombin
in einem gelösten,
flüssigen
Zustand vorliegt, vorzugsweise im Bereich von 0,001 bis 1 Gewicht/Volumen-%,
und stärker
bevorzugt im Bereich von 0,05 bis 0,1 Gewicht/Volumen-%.
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(Protein)
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In
Bezug auf das Protein, das als ein Stabilisierungsmittel für Thrombin
verwendet wird, können
folgende Beispiele angegeben werden: Albumin, Gelatine und Globulin,
und solche Proteine, die keine physiologische oder biochemische
Funktion gegenüber
Thrombin aufweisen, können
im Allgemeinen verwendet werden. Eines dieser Proteine kann ausgewählt und
eingesetzt werden, oder zwei oder mehrere derselben können ausgewählt und
gemeinsam eingesetzt werden.
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Die
wirksame Menge des Proteins zur Stabilisierung von Thrombin kann
eine Menge sein, welche die Stabilität gerade verbessert, und obwohl
es keine besondere Beschränkung
gibt, liegt die Endkonzentration des Proteins, wenn Thrombin in
einem gelösten,
flüssigen
Zustand vorliegt, vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 10 Gewicht/Volumen-%,
und stärker
bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 5 Gewicht/Volumen-%.
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Das
vorstehend erwähnte
Calcium-Ion, die wasserlösliche
organische Säure,
das oberflächenaktive Mittel
und das Protein, welche als Mittel zur Stabilisierung des Thrombins
verwendet werden, werden eingesetzt, indem ihr Einfluss auf die
enzymatische Aktivität
des Thrombins in Betracht gezogen wird, wenn Thrombin in einem gelösten Zustand,
in einem trockenen Zustand oder in einem Zustand konserviert wird,
bei dem ein gefriergetrocknetes Produkt und dergleichen gelöst wird.
Auch wenn eines der Stabilisierungsmittel allein verwendet wird,
ergibt sich eine stabilisierende Wirkung, und wenn zwei oder mehrere
ausgewählt
und verwendet werden, kann eine höhere stabilisierende Wirkung
erwartet werden. Es ist bevorzugt, zwei oder mehrere Stabilisierungsmittel
gemeinsam zu verwenden. Es ist insbesondere bevorzugt, ein Calcium-Ion
und eine wasserlösliche
organische Säure
gemeinsam zu verwenden, wobei dadurch die erhaltene stabilisierende
Wirkung gegenüber
Thrombin nahezu 100% beträgt.
Wenn zwei oder mehrere der vorstehend erwähnten Verbindungen mit einer
stabilisierenden Funktion gegenüber
Thrombin gemeinsam verwendet werden, kann jede der Verbindungen
in einem nutzbringenden Bereich einer jeden Verbindung verwendet
werden. Sowohl in dem Fall, in dem jede der Verbindungen einzeln
verwendet wird, als auch in dem Fall, in dem zwei oder mehrere Verbindungen
gemeinsam verwendet werden, ist die vorstehend erwähnte Konzentration
(sind die vorstehend erwähnten
Konzentrationen) in einer flüssigen
Zubereitung enthalten, wenn das Thrombin in einer flüssigen Zubereitung
vorliegt, während
die Verbindung (die Verbindungen) enthalten ist (sind), nachdem
sie in einer solchen Weise eingestellt wurden, dass die Endkonzentration
(die Endkonzentrationen) erst beim abschließenden Überführen in den flüssigen Zustand
auf die vorstehend erwähnte
Konzentration (auf die vorstehend erwähnten Konzentrationen) eingestellt
wird (werden), wenn das Thrombin in Form einer trockenen Zubereitung oder
in Form einer gefriergetrockneten Zubereitung vorliegt.
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(Zusatzstoffe zur Verbesserung
der Reproduzierbarkeit der Messung)
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Zusätzlich zu
den vorstehend erwähnten
Mitteln zur Stabilisierung des Thrombins ist es ebenso möglich, dass
eines oder mehrere Mittel, das (die) aus hochmolekularen Polysacchariden
und synthetischen Polymeren ausgewählt wird (werden), kombiniert
wird (werden) und in seiner wirksamen Menge (in ihren wirksamen
Mengen) darin enthalten ist (sind). In diesem Fall kann die wirksame
Menge zur Reproduzierbarkeit der Messung eine Menge sein, wodurch
die Reproduzierbarkeit verbessert werden kann, und obwohl es keine
besondere Beschränkung
hierfür
gibt, liegt sie zum Beispiel bei einer solchen Menge, dass ein CV-Wert (coefficient
of variation; Variationskoeffizient) bei 10% oder weniger gehalten
werden kann, vorzugsweise bei 7% oder weniger, und stärker bevorzugt
bei 5% oder weniger, wenn die zu untersuchende Substanz zwanzig
mal unter Verwendung eines Thrombin enthaltenden Reagenz' gemessen wird.
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In
Bezug auf die hochmolekularen Substanzen können folgende Beispiele genannt
werden: Dextran 40, Dextran 70, Dextran 200.000, Dextran 500.000
und Ficol, und in Bezug auf die synthetischen Polymere können folgende
Beispiele genannt werden: Polyvinylalkohol 500, Polyvinylalkohol
1500, Polyvinylalkohol 2000, Polyethylenglykol 1500, Polyethylenglykol
2000, Polyethylenglykol 4000, Polyethylenglykol 6000, Polyethylenglykol
8000, Polyethylenglykol 20.000 und Polyvinylpyrrolidon. Jedoch sind
diese Beispiele nicht beschränkt,
sondern es können
weitere Substanzen verwendet werden, welche dieselbe Wirkung aufweisen
und imstande sind, eine Verbesserung bezüglich der Reproduzierbarkeit
der Messung für
die Testsubstanz unter Verwendung eines Thrombin enthaltenden Reagenz' zu erreichen. In Bezug
auf solche hochmolekularen Substanzen kann eine Substanz ausgewählt und
eingesetzt werden, oder zwei oder mehrere derselben können ausgewählt und
gemeinsam eingesetzt werden.
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Die
wirksame Menge der hochmolekularen Polysaccharide oder der synthetischen
Polymere in Bezug auf die Reproduzierbarkeit kann eine Menge sein,
welche die Reproduzierbarkeit gerade verbessert, und obwohl es keine
besondere Beschränkung
gibt, liegt die Endkonzentration derselben im Bereich von 1 bis
10 Gewicht/Volumen-%, und stärker
bevorzugt im Bereich von 1 bis 3 Gewicht/Volumen-%, wenn das Thrombin
in einem gelösten,
flüssigen
Zustand vorliegt. Die vorstehend erwähnte Konzentration ist (die
vorstehend erwähnten
Konzentrationen sind) in einer flüssigen Zubereitung des Thrombins
enthalten, wenn Thrombin in Form einer flüssigen Zubereitung vorliegt,
während
die Verbindung (die Verbindungen) nach der Einstellung in einer
solchen Weise enthalten sind, dass die Endkonzentration (die Endkonzentrationen)
erst beim abschließenden Überführen in
den flüssigen
Zustand auf die vorstehend erwähnte
Konzentration eingestellt wird (auf die vorstehenden erwähnten Konzentrationen
eingestellt werden), wenn das Thrombin in Form einer trockenen Zubereitung
oder einer gefriergetrockneten Zubereitung vorliegt.
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(Thrombin enthaltende
Zusammensetzung)
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Die
Thrombin enthaltende Zusammensetzung enthält eine Verbindung oder mehrere
Verbindungen mit einer Thrombin stabilisierenden Funktion, welche
Verbindungen mindestens aus dem Calcium-Ion, dem oberflächenaktiven
Mittel und dem Protein ausgewählt
werden, in einer Menge, die für
die Stabilisierung von Thrombin wirksam ist, oder sie enthält darüber hinaus
eine wasserlösliche
organische Säure
mit einer Thrombin stabilisierenden Wirkung in einer wirksamen Menge
derselben. Zusätzlich
zu solchen Verbindungen mit einer Thrombin stabilisierenden Funktion
kann eine Verbindung oder können
mehrere Verbindungen, die aus hochmolekularen Polysacchariden und
synthetischen Polymeren ausgewählt
werden, in einer wirksamen Menge (in wirksamen Mengen) derselben
darin enthalten sein, um damit die Reproduzierbarkeit der Messung der
zu untersuchenden Substanz mittels eines Thrombin enthaltenden Reagenz' zu verbessern. In
der Thrombin enthaltenden Zusammensetzung wird gewöhnlich ein
Puffer in einem flüssigen
Zustand eingesetzt. In Bezug auf seine Art wird ein Puffer mit einer
Pufferfähigkeit
innerhalb eines pH-Bereichs von 4 bis 9 in geeigneter Weise ausgewählt und
eingesetzt. Es kann zum Beispiel eine oder es können mehrere Verbindungen eingesetzt
werden, welche ausgewählt
wird (werden) aus HEPES, MOPS, BIS-TRIS, TRIS, MOPSO, ADA, MES und
dergleichen. Ein geeignetes antiseptisches Mittel kann ebenso zu
der Thrombin enthaltenden Zusammensetzung gegeben werden. In Bezug
auf das Konservierungsmittel wird eines oder werden mehrere eingesetzt, die
aus Ciprofloxacin, Propionsäure,
Natriumbenzoat und dergleichen ausgewählt werden. Falls nötig, können ein
Salz, wie zum Beispiel Natriumchlorid, und übliche Stabilisatoren, wie
zum Beispiel eine Aminosäure
oder ein Saccharid, ebenso darin enthalten sein.
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Die
Thrombin enthaltende Zusammensetzung, welche auf diese Weise hergestellt
wurde, besitzt eine hohe Stabilität im Vergleich mit den herkömmlicherweise
eingesetzten Thrombinreagenzien und Zusammensetzungen, und ihre
Reproduzierbarkeit in der Messung der zu untersuchenden Substanz
unter Verwendung eines Thrombin enthaltenden Reagenz' ist genauso gut.
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Um
es genauer auszudrücken,
werden 5 mM bis 100 mM Calcium-Ionen,
wie zum Beispiel Calciumlactat, zu 5 mM bis 25 mM eines Puffers
gegeben, und anschließend
werden 10 mM bis 500 mM einer organischen Säure, wie zum Beispiel Essigsäure, dazu
gegeben und danach werden darüber
hinaus synthetische Polymere, wie zum Beispiel Polyvinylalkohol
500, in einer Menge von 1 bis 10 Gewicht/Volumen-% und/oder ein
oberflächenaktives
Mittel, wie zum Beispiel Tween 80, in einer Menge von 0,001 bis
1% dazu gegeben. Die Konzentrationen dieser zuzugebenden Verbindungen
können
in geeigneter Weise eingestellt werden. Nach der Zugabe des Konservierungsmittels
wird der pH-Wert der Lösung
auf etwa 6 bis 7 eingestellt, worauf eine Stammlösung zubereitet wird. In dieser
Stammlösung
wird Thrombin in der vorgesehenen Konzentration gelöst, oder
in einer wirksamen Menge, um eine Thrombin-Lösung zuzubereiten. Die erhaltene
Lösung
kann unter Verwendung eines Filters mit einer geeigneten Porengröße filtriert
werden. Die auf diese Weise hergestellte Thrombin-Lösung kann
als ein flüssiges
Reagenz in unverändertem
Zustand verwendet werden, oder sie wird, nachdem sie einer Gefriertrocknungs-Behandlung
unterzogen wurde, in eine Zubereitung eines gefriergetrockneten
Reagenz' überführt und
als solche verwendet. Die vorstehend erwähnten konkreten Beispiele zeigen
lediglich die Beispiele der Thrombin enthaltenden Zusammensetzung,
und die vorliegende Erfindung ist nicht auf solche Beispiele beschränkt.
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Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird nunmehr in näheren Einzelheiten mittels
der folgenden Beispiele erläutert,
obwohl die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
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Beispiel 1 (nicht Teil
der beanspruchten Erfindung)
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Es
wurden vier Arten von Lösungen
hergestellt, das heißt
ein 20 mM HEPES-Puffer (pH 6,0) (Lösung, zu der nichts hinzugefügt wurde);
eine Lösung,
welche durch Zugabe von 25 mM Calciumlactat zu dem vorstehenden
Puffer hergestellt wurde (Lösung,
zu der Calcium hinzugefügt
wurde); eine Lösung,
die durch Zugabe von 100 mM Essigsäure zu dem vorstehenden Puffer
hergestellt wurde, um den pH-Wert auf 6,0 einzustellen (Lösung, zu
der Essigsäure
hinzugefügt
wurde); und eine Lösung,
die durch Zugabe von 25 mM Calciumlactat zu der Lösung, zu
welcher Essigsäure
hinzugefügt
wurde, hergestellt wurde (Lösung,
zu der zwei Substanzen hinzugefügt
wurden), und zu jeder der Lösungen
wurde humanes Thrombin gegeben, um deren Konzentrationen auf 100
NIH-Einheiten/ml einzustellen, so dass eine Thrombin-Lösung hergestellt wurde. Zu der
auf diese Weise hergestellten Thrombin-Lösung wurden 0,1 Gewicht/Volumen-%
Ciprofloxacin als ein Konservierungsmittel gegeben, und die Mischung
wurde einer Sterilfiltration unter Verwendung eines Filters mit
0,22 μm
Porengröße unterzogen,
und jeweils 3 ml der Mischung wurden in ein Glasgefäß gegeben,
dicht verschlossen und bei 25°C
konserviert. Die verbleibende Aktivität des Thrombins wurde unmittelbar
nach der Herstellung, sowie nach 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Monaten gemäß dem japanischen
Arzneimittelbuch gemessen, um die stabilisierende Wirkung in Bezug
auf das Thrombin zu überprüfen. Die
Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle
1: Verbleibende Aktivität
des Thrombins; konserviert bei 25°C
(Einheit: %)
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Die
Ergebnisse zeigen, dass Thrombin stabilisiert wurde, wenn mindestens
Calcium zugegeben wurde, und dass die verbleibende Aktivität von 72%
aufrechterhalten wurde, auch wenn es bei 25°C für 6 Monate konserviert wurde.
Obwohl die Wirkung aufgrund der Zugabe von Essigsäure die
gleiche ist wie sie in der japanischen Patent-Offenlegungsschrift
Nr. 39782/1981 offenbart wurde, war die stabilisierende Wirkung
weiter verbessert, wenn das Calcium darüber hinaus zusätzlich zur
Essigsäure
zugegeben wurde, welche eine organische Säure ist, und eine Abnahme der
Thrombin-Aktivität
wurde überhaupt
nicht bemerkt, auch wenn es bei 25°C für 6 Monate konserviert wurde,
sondern es wurde gefunden, dass eine vollständige Stabilisierung erreicht
wurde.
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Beispiel 2 (nicht Teil
der beanspruchten Erfindung)
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Zu
10 mM HEPES-Puffer (pH 7,0) wurden 150 mM Natriumchlorid und 0,1
Gewicht/Volumen-% Natriumazid gegeben, und danach wurde eine Lösung hergestellt,
bei der Calciumlactat dazugegeben wurde, um seine Konzentration
auf 20 mM einzustellen, und es wurde eine Lösung hergestellt, bei der kein
Calciumlactat dazugegeben wurde. Zu jeder der Lösungen wurde Polyvinylalkohol
205 (PVA 205), Polyvinylalkohol 500 (PVA 500) oder Polyvinylalkohol
1500 (PVA 1500) gegeben oder nicht, um Lösungen herzustellen, die 0,
0,1, 0,5, 1, 2, 3 und 5 Gewicht/Volumen-% desselben enthalten.
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Das
Thrombin wurde in jeder der Lösungen
gelöst,
um die Konzentration auf 100 NIH-Einheiten/ml einzustellen, so dass
Thrombin-Lösungen
hergestellt wurden. Jede der Thrombin-Lösungen wurde für die Messung
der Fibrinogen-Konzentration in einem kommerziell erhältlichen
Kontrollplasma verwendet. Das Kontrollplasma wurde um den Faktor
10 verdünnt,
indem ein Puffer für
die Messung des Fibrinogens verwendet wurde, um eine Probe herzustellen;
50 μl der
bereits hergestellten Thrombin-Lösung wurden
zu 100 μl
dieser Probe gegeben, und es wurde die Zeit bis zum Eintritt der
Koagulation bei 37°C
gemessen.
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Die
vorstehend erwähnten
Verfahrensschritte wurden durchgeführt, indem ein vollständig automatisiertes
Analysegerät
für die
Koagulationsmessung (Coagrex 700; hergestellt von Shimadzu) verwendet
wurde. Dieselbe Probe wurde zwanzigmal für die gleiche Zeit gemessen,
und auf der Grundlage der erhaltenen Koagulationszeit wurde der
Variationskoeffizient (CV) bestimmt, und die Reproduzierbarkeit
wurde verglichen. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle
2: Reproduzierbarkeit des Thrombin-Reagenz', zu dem PVA gegeben wurde
(Einheit: CV-%)
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Aus
Tabelle 2 ist es ersichtlich, dass der Variationskoeffizient in
denjenigen Thrombin-Lösungen
geringer ist, zu denen 20 mM Calciumlactat zugegeben wurden, als
in denjenigen Thrombin-Lösungen,
zu denen kein Calciumlactat zugegeben wurde, so dass die Reproduzierbarkeit
verbessert wurde. Es wurde ebenso gefunden, dass eine Verbesserung
der Reproduzierbarkeit erreicht wurde, wenn Polyvinylalkohol zugegeben wird,
und dass die Wirkung ihr Maximum erreicht, wenn die zugegebene Menge
1 bis 3 Gewicht/Volumen-% beträgt.
Aus den Ergebnissen der Beispiele 1 und 2 wurde gefunden, dass das
Calcium-Ion eine stabilisierende Wirkung auf Thrombin ausübt, und
dass es wirksam ist für
eine Verbesserung der Reproduzierbarkeit.
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Beispiel 3 (nicht Teil
der beanspruchten Erfindung)
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Das
gleiche Verfahren wie in Beispiel 2 wurde durchgeführt, mit
der Ausnahme, dass Dextran 40 (Dex 40), Dextran 70 (Dex 70) und
Dextran 200.000 (Dex 200) anstelle des Polyvinylalkohols verwendet
wurden, und dass deren Konzentrationen auf 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 6,
8 und 10 Gewicht/Volumen-% eingestellt wurden, und dass 20 mM Calciumlactat
in allen Lösungen
enthalten war, worauf die Reproduzierbarkeit verglichen wurde. Das
Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle
3: Reproduzierbarkeit der Thrombin-Reagenzien, zu denen Dextran,
jedoch kein Calcium zugegeben wurde
(Einheit: CV %)
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Es
ist aus Tabelle 3 festzustellen, dass eine Verbesserung der Reproduzierbarkeit
erreicht wird, wenn Dextran, welches ein hochmolekulares Polysaccharid
darstellt, zugegeben wird, und dass die Wirkung ihr Maximum bei
den Konzentrationen von 1 bis 10 Gewicht/Volumen-% erreicht.
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Beispiel 4
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Wie
im Falle der Proben wurden neun Arten von Lösungen hergestellt, das heißt 20 mM
HEPES-Puffer (pH 6,0) (Lösung,
zu der nichts zugegeben wurde); eine Lösung, die durch Zugabe von
25 mM Calciumlactat zu diesem Puffer hergestellt wurde, um den pH-Wert
auf 6,0 einzustellen (Lösung,
zu der Calcium zugegeben wurde); eine Lösung, die durch Zugabe von
100 mM Essigsäure
zu diesem Puffer hergestellt wurde, um den pH-Wert auf 6,0 einzustellen
(Lösung,
zu der Essigsäure
gegeben wurde); eine Lösung,
die durch Zugabe von 0,02 Gewicht/Volumen-% Tween 80 zu diesem Puffer
hergestellt wurde, um den pH-Wert auf 6,0 einzustellen (Lösung, zu
der Tween 80 zugegeben wurde); eine Lösung, die durch Zugabe von
1,0 Gewicht/Volumen-% Rinderserumalbumin zu diesem Puffer hergestellt
wurde, um den pH-Wert
auf 6,0 einzustellen (1% BSA); eine Lösung, die durch Zugabe von
2,0 Gewicht/Volumen-% Rinderserumalbumin zu diesem Puffer hergestellt
wurde, um den pH-wert auf 6,0 einzustellen (2% BSA); eine Lösung, die
durch Zugabe von 0,1 Gewicht/Volumen-% wässriger Gelatine zu dem Puffer
hergestellt wurde, um den pH-Wert auf 6,0 einzustellen (wässrige Gelati ne);
eine Lösung,
die durch Zugabe von 25 mM Calciumlactat zu der vorstehenden Lösung, zu
der Essigsäure
gegeben wurde, hergestellt wurde, um den pH-Wert auf 6,0 einzustellen
(Lösung,
zu der zwei Substanzen gegeben wurden); und eine Lösung, die
durch Zugabe von 25 mM Calciumlactat und 0,02 Gewicht/Volumen-%
Tween 80 zu der vorstehenden Essigsäurelösung hergestellt wurde, um
den pH-Wert auf 6,0 einzustellen (Lösung, zu der drei Substanzen
gegeben wurden). Zu jeder dieser Lösungen wurde humanes Thrombin
gegeben, so dass seine Konzentration auf 100 NIH-Einheiten/ml eingestellt
wurde, worauf die Thrombin-Lösungen
hergestellt wurden.
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Zu
jeder der auf diese Weise hergestellten Thrombin-Lösungen wurde
0,1 Gewicht/Volumen-% Ciprofloxacin als ein antiseptisches Mittel
gegeben, und die Mischung wurde einer Sterilfiltration unter Verwendung eines
Filters von 0,22 μm
Porengröße unterzogen,
und jeweils 3 ml der Mischung wurden in ein Glasgefäß gegeben,
dicht verschlossen und bei 25°C
konserviert. Die verbleibende Aktivität des Thrombins wurde unmittelbar
nach der Herstellung, sowie nach 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Monaten gemäß dem japanischen
Arzneimittelbuch gemessen, um die stabilisierende Wirkung für Thrombin
zu überprüfen. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle
4: (verbleibende Aktivität
des Thrombins, konserviert bei 25°C)
(Einheit:
%)
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Im
Vergleich mit einer Lösung,
die keinen Zusatzstoff enthält,
ist das Ergebnis dergestalt, dass die Stabilität des Thrombins durch die Zugabe
von Calcium, Essigsäure,
Tween 80, 1% BSA, 2% BSA und wasserlöslicher Gelatine verbessert
wurde, und dergestalt, dass bei einer Lösung, zu der zwei Substanzen
(Ca und Essigsäure)
gegeben wurden, und bei einer Lösung,
zu der drei Substanzen (Ca, Essigsäure und Tween 80) zugegeben
wurden, die Stabilität
weiter verbessert wurde.
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Gewerbliche Anwendbarkeit
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Wie
vorstehend vollständig
erläutert,
wurde Thrombin durch die Zugabe wenigstens von Calcium stabilisiert,
und als ein Ergebnis der ergänzenden
Zugabe einer organischen Säure
wurde eine weitere stabilisierende Wirkung erreicht. Es wurde darüber hinaus
gefunden, dass ein oberflächenaktives
Mittel und ein Protein für
die Stabilisierung von Thrombin nützlich waren. Darüber hinaus
wurde gefunden, dass das Calcium-Ion für die Verbesserung der Reproduzierbarkeit
der Messung der Thrombin-Aktivität, einhergehend
mit einer stabilisierenden Wirkung gegenüber Thrombin, wirksam ist.
Es wurde darüber
hinaus gefunden, dass hochmolekulare Polysaccharide und synthetische
Polymere für
eine Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Messung der Thrombin-Aktivitäten nützlich sind.
Somit stellen das stabilisierende Mittel für Thrombin und die Thrombin enthaltende
Zusammensetzung, in welche ein Stabilisierungsmittel gemäß der vorliegenden
Erfindung eingebracht wurde, ein Stabilisierungsmittel bereit, welches
bis jetzt nicht verfügbar war,
und sie stellen eine äußerst nutzbringende
Reagenz-Zusammensetzung für
klinische Tests bereit.
(Einheit: %)