DE3872534T2

DE3872534T2 -

Info

Publication number: DE3872534T2
Application number: DE88810030T
Authority: DE
Inventors: Jr. Rowland Parker Washington Michigan 48094 Blythe; Mahdi Bakir Flanders N.J. 07836 Fawzi; Russell Ulmer Somerville N.J. 08876 Nesbitt; Steven Bernard Forest Hills New York 11375 Silbering
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1987-01-28
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 1993-01-28
Anticipated expiration: 2008-01-23
Also published as: AU602047B2; DK39888A; AU1039488A; JPS63192723A; EP0277096A3; JP2837847B2; DE3872534D1; ZA88227B; NZ223311A; EP0277096A2; IE880183L; DK167210B1; EP0277096B1; DK39888D0; PH25144A

Description

Thrombin, ein proteolytisches Enzym, ist für die Hämostase von wesentlicher Bedeutung. Es stellt ein Hauptreagens bei der Bildung von Blutpropfen über eine Fibrinproduktion dar. Wegen seiner Wirksamkeit als Gerinnungshilfsmittel eignen sich Thrombin und seine Zubereitungen als Mittel zum Stillen von Blutungen bei Durchführung chirurgischer Maßnahmen. Obwohl trockenes Thrombin verfügbar ist, werden flüssige Zubereitungen aus Handhabungs- und Zeiterwägungen in der Regel bevorzugt.
Bis heute gibt es noch keine hächstabilen flüssigen Thrombinzubereitungen, die sowohl lagerungsstabil als auch für eine Verwendung bei chirurgischen Maßnahmen gebrauchsfertig sind. Dies ist darauf zurückzuführen, daß Thrombin nach dem Auflösen in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung infolge Denaturierung und Autolyse des Thrombinproteins rasch seine Aktivität verliert.
Es hat sich nun gezeigt, daß sterile lagerungsstabile Thrombinzubereitungen bereitgestellt werden können, wenn man gereinigtem Thrombin in einem geeigneten Medium stabilisierende Mengen bestimmter Puffer zusetzt. Gegebenenfalls können auch physiologische Kochsalzlösung und ein oder mehrere Polyolstabilisator(en) verwendet werden.
Diese Erfindung kommt der in der US-Patentanmeldung Ser.No. 791 836 vom 28. Oktober 1985 (US-A-4 696 812) offenbarten Erfindung nahe.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wurde eine Lösung mit 2000 U/ml (Einheiten pro Milliliter) gereinigten Thrombins in 0,45 M NaCl-Lösung mit 50% (v/v) Glycerin und 0,05 M Phosphatpuffer (pH-Wert: 6,0) zubereitet. Diese Lösung hatte nach 6-monatiger Lagerung bei Raumtemperatur (25ºC) ihre gesamte ursprüngliche Gerinnungsaktivität behalten. Nach 12-monatiger Lagerung bei Raumtemperatur behielt diese Lösung immer noch 80% ihrer ursprünglichen Aktivität.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform zeigte eine Zusammensetzung mit 1500 U/ml gereinigten Thrombins, 0,05 M Acetatpuffer, 2,7% (0,45 M) NaCl und 25% Glycerin bei einem pH-Wert von 5,0 nach 6-monatiger Lagerung bei 25ºC eine auf fibrometrischen Bestimmungen basierende Aktivität von 86%.
Diese bevorzugten Zusammensetzungen zeigten eine noch bessere Aktivitätserhaltung bei einer Lagerung bei 4ºC, d.h. 100% bei dem Phosphatsystem nach 12 Monaten und 95% bei dem Acetatsystem nach 12 Monaten.
Die Thrombinzusammensetzungen und die Verfahren gemäß der Erfindung sind bekannten Zubereitungen und Verfahren zur Unterstützung der Blutgerinnung in mehrerer Hinsicht überlegen.
Anders als pulverförmige Zubereitungen brauchen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bzw. Zubereitungen vor Gebrauch nicht wieder aufbereitet zu werden. Somit müssen keine entscheidenden Erwägungen bezüglich des Abmessens, Mischens oder Sterilisierens einer oder mehrerer Komponente(n) bzw. eines oder mehrerer Behälter(s) angestellt werden. Die vorliegenden Zubereitungen lassen sich mit lediglich minimalem, d.h. geringfügigem oder keinem Präparationsaufwand vor ihrem Endgebrauch einsetzen.
Weiterhin ist die Stabilität der vorliegenden thrombinhaltigen Materialien so gut, daß praktisch keine Notwendigkeit zum Anlegen von Lagerverzeichnissen und/oder einer Drehung der Produkte besteht. Anders als die meisten Lösungen von Thrombin in physiologischer Kochsalzlösung oder Wasser, die bei 4ºC lediglich etwa 1 Woche lang stabil sind, sind die vorliegenden Zubereitungen derart konzipiert, daß sie bei normalen Kühlschranktemperaturen (d.h. 4ºC) und bei Raumtemperatur (d.h. 25ºC) 6 Monate lang oder mehr stabil bleiben.
Es ist bekannt, daß hohe Konzentrationen von Glycerin, Rohrzucker (Sucrose) und sonstigen Polyolen Proteine in Lösung zu stabilisieren vermögen. Im Falle von Thrombin ist es bekannt, daß eine Glycerinkonzentration von 67% eine 1000 U/ml- Thrombinlösung in hohem Maße stabilisieren kann. Die Anwendung hoher Glycerinkonzentrationen ist jedoch bei der großtechnischen Herstellung einer sterilen Thrombinlösung wegen der hohen Viskosität einer solchen Zubereitung unpraktisch. Die vorliegenden Zubereitungen mit 50% oder weniger Glycerin vermeiden diese Probleme.
Beim Studium der folgenden Beschreibung der Erfindung werden weitere Vorteile und Aspekte der Erfindung deutlich.
Die Erfindung umfaßt im weitesten Sinne:
I. Thrombinzusammensetzungen oder -zubereitungen, vorzugsweise Lösungen, die gereinigtes Thrombin, ein Polyol und mindestens einen Puffer enthalten;
II. Als Verband geeignete Gerinnungsmittelprodukte mit Zubereitungen gemäß I. und
III. Verfahren zur Herstellung der Thrombinzusammensetzungen oder -zubereitungen gemäß I.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Zubereitungen müssen in einem flüssigen Medium weitestgehend gereinigtes Thrombin sowie einen oder mehrere Puffer gemäß der Erfindung enthalten. Sie können physiologische Kochsalzlösung und sonstige üblicherweise in Proteinzubereitungen eingesetzte Substanzen enthalten.
Unter dem Ausdruck "Zubereitungen" sind sämtliche Arten von Rezepturen, in denen Thrombin in weitestgehend löslich gemachter oder hochdispergierter Form in Kombination mit einem oder mehreren Glykol(en) und Puffer(n) enthalten ist, zu verstehen.
Flüssige Zubereitungen werden in der Regel bevorzugt. Besonders gut eignen sich Lösungen von Thrombin. Bei der Zubereitung einer flüssigen Rezeptur sollte(n) das (die) verwendete(n) Lösungsmittel oder sonstige(n) Verdünnungsmittel mit Thrombin so weit mischbar sein, daß Produktionsstandards, z.B. die Gleichmäßigkeit der Thrombinkonzentration von Charge zu Charge, ohne weiteres eingehalten werden können.
Bei dem verwendeten Thrombin handelt es sich um ein durch zweistufige Ionenaustauschchromatographie erhaltenes gereinigtes Thrombin. In der ersten Stufe wird DEAE-Sepharose (bei der es sich um eine Diethylaminoethyl-Sepharose handelt) dazu verwendet, einen großen Teil des Nicht-Thrombinproteins zu adsorbieren. In der zweiten Stufe dient CM-Sepharose (bei der es sich um eine Carboxyethyl-Sepharose handelt) dazu, Thrombin zu adsorbieren und das restliche Nicht-Thrombinprotein durch die Säule laufen zu lassen. Beide Sepharosen, nämlich DEAE-Sepharose und CM-Sepharose, stellen Ionenaustauschmaterialien zur Verwendung bei Flüssigchromatographietrennungen dar. Sie werden von der Fa. Pharmacia, Inc., Laboratory Separation Division, 800 Centennial Avenue, Piscataway, New Jersey, 08854, geliefert. Das Thrombin wird aus der Säule entweder mittels 0,05 M Acetatsin 0,45 M NaCl (pH-Wert: 5,0) oder 0,05 M Phosphatsin 0,45 M NaCl (pH-Wert: 6,0) eluiert. Diese Thrombinlösung wird danach mit Glycerin mit entweder einem Acetatpuffer oder einem Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung gemischt, um die als Erfindung anzusehende stabilisierte Lösung zuzubereiten.
Von Thrombin ist bekannt, daß es in physiologischer Kochsalzlösung, d.h. einer Lösung mit 0,9% NaCl in Wasser, löslich ist. Im vorliegenden Falle werden jedoch auch andere Kochsalzlösungen als brauchbar miteinbezogen. Ferner kann auch das gesamte oder ein Teil des NaCl in solchen Lösungen durch ein oder mehrere anderes (andere) geeignetes (geeignete) Salz(e) ersetzt werden.
Wasser stellt das bevorzugte Medium für die erfindungsgemäßen Zubereitungen dar. Zweckmäßigerweise kann (können) jedoch auch ein oder mehrere anderes (andere) Verdünnungsmittel, das (die) die Löslichkeit und/oder Stabilität des Thrombins in den vorliegenden Zubereitungen nicht beeinträchtigt, zum Einsatz gelangen.
Ein derartiges Verdünnungsmittel ist Glycerin. Andere geeignete Polyole sind Mannit, Sorbit, Rohrzucker (Sucrose) und Glucose. Mischungen können ebenfalls verwendet werden. Besonders bevorzugt wird Glycerin.
Das Glycerin oder der (die) sonstige(n) Polyolbestandteil(e) gelangt (gelangen), bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung, in einer Gesamtmenge von etwa 10 bis etwa 60, vorzugsweise 25 bis 50 Gew.-%, zum Einsatz.
Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich sämtliche gewichtsprozentualen Angaben auf das Gewicht der gesamten bzw. fertigen Zubereitungen.
Geeignete Puffersysteme sind solche, deren wäßrige Lösungen den pH-Wert der fertigen Thrombinlösung zwischen 5,0 und 8,0, vorzugsweise 5,0 und 6,0, halten. Bei Verwendung eines Phosphatpuffers sollte der End-pH-Wert der Zubereitung vorzugsweise 6,0 bis 6,5, bei Verwendung eines Acetatpuffers 5,0 betragen.
Die pH-Wertmessungen erfolgen unter Verwendung eines üblichen pH-Meters mit einer Kombinationselektrode.
Geeignete Puffersysteme sind Acetat, Phosphat, Succinat, Bicarbonat, Imidazol, TRIS und die von N.E. Good und S. Izawa in "Methods in Enzymol.", 24, Teil B, 53 (1972) sowie F.W. Ferguson, K.I. Braunschweiger, W.R. Braunschweiger, J.R. Smith, J. McCormick, C.C.Wasmann, N.P. Jarvis, D.H. Bell und N.E. Good in "Anal. Biochem.",104, 300 (1980) beschriebenen Zwitterionenpuffer.
Geeignete Reagentien zur Verwendung in den vorliegenden Puffersystemen sind MES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES und dergleichen. Phosphat sollte lediglich dann verwendet werden, wenn keine Calciumionen vorhanden sind oder wenn EDTA zugegen ist. Mischungen solcher Reagentien können verwendet werden. Bei Verwendung von Mischpuffern sollte der endgültige PH-Wert in geeigneter Weise eingestellt werden.
Bevorzugt werden Puffer mit Phosphationen und Acetationen. Mischungen eignen sich ebenfalls.
Im vorliegenden Falle können die in der US-Patentanmeldung mit der Ser.No. 06/791 836 offenbarten Puffersysteme verwendet werden.
Die Puffer sind in der Pufferlösung zusammen mit Wasser und/oder (einem) anderen geeigneten Verdünnungsmittel(n) in einer Gesamtkonzentration von 0,02 - 1, vorzugsweise 0,05 - 0,10 M enthalten.
Vorgesehen ist ferner die Mitverwendung der verschiedensten sonstigen üblichen Zusätze, z.B. von Antioxidantien, Farbstoffen und Netzmitteln. Gegebenenfalls kann Glutathion mitverwendet werden. Ferner können auch Aminosäuren mitverwendet werden, sofern sie nicht in solchen Mengen vorhanden sind, daß sie die Stabilisierwirkung des Polyols und der Pufferkomponenten auf das gereinigte Thrombin beeinträchtigen. Vorzugsweise sollten sie, wenn überhaupt vorhanden, in lediglich sehr geringen Mengen in Konzentrationen von 0,5% oder weniger vorhanden sein.
Im allgemeinen liegen die zuvor erläuterten Konzentrationsbereiche für die verschiedenen Bestandteile innerhalb der in der folgenden Tabelle I angegebenen Grenzen. Die Prozentangaben beziehen sich auf das Gesamtgewicht der Zubereitung. TABELLE I Zubereitung Bestandteil Breiter Bereich Bevorzugter Bereich Besonders bevorzugter Bereich Thrombin (Einheiten/ml) Pufferlösung (M) Verdünnungsmittel/Lösungsmittel Polyol
Blutgerinnungsmaterialien, wie GELFOAM , SURGICEL und AVICEL sowie Kollagen, die derzeit alleine oder in Kombination mit Thrombinpulver oder Thrombin in physiologischer Kochsalzlösung benutzt werden, können unter Anwendung der verschiedensten Techniken in höchst wirksamer Weise auch mit den stabilisierten Thrombinrezepturen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz gebracht werden. Vorzugsweise wird die stabilisierte Lösung auf das Blutgerinnungsmittel adsorbiert, worauf die Kompresse unter sterilen Bedingungen gefriergetrocknet und verpackt wird.
Solchen Kompressen, insbesondere wenn sie bei Patienten mit Verbrennungen (hierbei ist eine Vermeidung von Infektionen kritisch) zum Einsatz gelangen sollen, können auch antimikrobielle oder antibiotische Mittel einverleibt werden.
Darüber hinaus können auch Netzmittel und andere Salze als NaCl mitverwendet werden. Bei Mitverwendung eines oder mehrerer derartigen (derartiger) Zusatzes (Zusätze) liegt dessen (deren) Konzentration(en) in der Regel innerhalb der in der folgenden Tabelle II angegebenen Grenzen. TABELLE II Zusatz Breiter Bereich Bevorzugter Bereich Besonders bevorzugter Bereich Netzmittel Antioxidantien antimikrobielle Mittel sonstige Zusätze, beispielsweise Salze
Ein bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Gerinnungsmittel verwendbarer Bandagen- oder Verbandtyp ist aus der US-A-4 363 319 bekannt.

Herstellung von Thrombinzubereitungen

Rohthrombin, vorzugsweise vom Rind, wird durch die geschilderte zweistufige Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Das gereinigte Thrombin wird aus der CM-Sepharose durch Zusatz von 0,05 M Phosphat in 0,45 M Natriumchlorid (pH-Wert: 6,0) oder durch Zusatz von 0,05 M Acetat in 0,45 M Natriumchlorid (PH-Wert: 5,0) eluiert. Das aus der Säule eluierte Thrombin is hochkonzentriert. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Thrombinzubereitung muß es verdünnt werden. Dies erfolgt beispielsweise durch Zusatz eines Volumens einer Lösung mit 50% (g/g) Glycerin in 0,05 M Phosphat, 0,45 M Natriumchlorid (pH-Wert: 6,0) zu einem gleichen Volumen des eluierten Thrombins in phosphatgepufferterphysiologischer Kochsalzlösung. Die erhaltene Thrombinzubereitung enthält die gewünschte Konzentration an gereinigtem Thrombin in 25% Glycerin, 0,05 M Phosphat und 0,45 M Natriumchlorid. Diese spezielle Zubereitung besitzt einen pH-Wert von etwa 6,0.
Die erhaltene Zubereitung wird durch Bestimmen der Gerinnungszeit durch Verwendung eines BBL-Fibrometers getestet.

Beispiele

Die folgenden Beispiele dienen einer besseren Veranschaulichung der Erfindung.

Beispiel 1

Die Zubereitung der phosphatgepufferten Thrombinzusammensetzung ist oben beschrieben. Eine acetatgepufferte Zusammensetzung läßt sich in entsprechender Weise durch Ersatz des 0,05 M Phosphats (pH-Wert: 6,0) durch 0,05 M Acetat (pH-Wert: 5,0) herstellen.
Erfindungsgemäße Thrombinzubereitungen lassen sich wie folgt testen:
Die Thrombinaktivitätswerte werden durch Bestimmen der Gerinnungszeit auf einem BBL-Fibrometer ermittelt. Die Fibrinogenquelle ist mit 0,9%iger Kochsalzlösung 1:1 verdünntes gesammeltes Humanplasma. Die Thrombinlösung wird mit 0,5% Polyethylenglykol 8000 in Imidazol gepufferter Kochsalzlösung 200fach verdünnt. In einen Gerinnungsbecher wird 0,2 ml verdünntes Plasma eingetragen. Dieses wird 3 min lang bei 37ºC gehalten und dann mit 0,1 ml verdünnter Thrombinlösung, die ebenfalls 3 min lang bei 37ºC gehalten worden war, versetzt. Die Gerinnungszeit ergibt sich direkt aus der Fibrometerablesung. Die Anzahl an restlichen Thrombineinheiten/ml wird aus einer Eichkurve der Thrombinkonzentration gegen die Gerinnungszeit ermittelt.

Beispiel 2

Die Ergebnisse in der folgenden Tabelle III veranschaulichen die Stabilität von gereinigtem Thrombin in einem Glycerin-Phosphat-System (pH-Wert: 6,0). TABELLE III Lösungsstabilität von gereinigtem Thrombin (2000 Einheiten/ml) bei 40 bzw. 25ºC in verschiedenen Glycerin-Phosphat (0,45 M NaCl, 0,05 M Phosphat, pH-Wert: 6,0)-Mischungen Lagerung Testrezeptur % Aktivität Temperatur (in ºC) Dauer (Monate) Glycerin *verunreinigt
Es sei darauf hingewiesen, daß bei Raumtemperatur keine Thrombinstabilisierung erreicht wird, wenn die Glycerinmenge unter 25% liegt.

Beispiel 3

Die Ergebnisse der folgenden Tabelle IV veranschaulichen die Stabilität von gereinigtem Thrombin in einem Glycerin-Acetat-System (pH-Wert: 5,0). TABELLE IV Lösungsstabilität von gereinigtem Thrombin (1500 Einheiten/ml) bei 4ºC bzw. 25ºC in 25% Glycerin-Acetat-Rezeptur Lagerung Testrezeptur % Aktivität Temperatur (in ºC) (Monate) (ACETAT) (pH-Wert) Dauer (Monate)
Es ist sehr lehrreich, die Stabilitäten ungereinigter und gereinigter Thrombine in ähnlichen Rezepturen zu vergleichen. Eine Lösung von nicht-gereinigtem Thrombin (1500 Einheiten/ml in 25% (g/g) Glycerin, 0,05 M Acetat, 0,45 M NaCl (PH-Wert: 5,0) behielt bei 1-monatiger Lagerung bei 25ºC 68% ihrer ursprünglichen Gerinnungsaktivität. Eine ähnliche Rezeptur mit 1500 Einheiten/ml gereinigten Thrombins behielt nach 1-monatiger Lagerung bei 25ºC 100% ihrer ursprünglichen Aktivität und bei 6-monatiger Lagerung bei 25ºC 86% ihrer Aktivität.

Beispiel 4

Herstellung eines hämostatischen Mittels.

Eine GELFOAM -Kompresse wird mit einer Lösung von gereinigtem Thrombin in 0,05 M Acetatpuffer (pH-Wert: 5,0) mit 0,45 M Kochsalzlösung gesättigt. Danach wird die Kompresse gefriergetrocknet. In einer solchen trockenen Kompresse enthaltenes Thrombin vermag seine Stabilität über längere Zeit hinweg selbst bei Raumtemperatur zu behalten. Es hat sich gezeigt, daß mit gereinigtem Thrombin in Glycerin/Acetat gesättigte GELFOAM -Kompressen bei der Lagerung in nassem Zustand in 6 d bei Raumtemperatur vollständig zerfielen.

Claims

1. Stabile Thrombinzusammensetzung bzw. -zubereitung mit

(a) gereinigtem Thrombin,

(b) einem Polyol und einem Puffer mit entweder Acetat- oder Phosphationen,

wobei die Zubereitung einen pH-Wert von 5,0 bis 6,0 aufweist.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer Phosphationen enthält und der pH-Wert 6,0 bis 6,5 beträgt.

3. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer Acetationen enthält und der pH-Wert 5,0 bis 5,5 beträgt.

4. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyol aus Glycerin besteht.

5. Hämostat zur Verwendung als Wundverband, umfassend die Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und ein Substrat.

6. Verfahren zur Herstellung eines Produkts in Form einer stabilisierten Zubereitung durch Inberührungbringen von gereinigtem Thrombin mit einem Polyol und einem Puffer, wobei das Produkt einen End-pH-Wert von 5,0 bis 6,0 aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer aus einem Phosphatpuffer besteht und der EndpH-Wert 6,0 bis 6,5 beträgt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer aus einem Acetatpuffer besteht und der EndpH-Wert 5,0 bis 5,5 beträgt.