JPS63192723A - トロンビン製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク分解酵素であるトロンビンは止血にとって必須
物質である。このものはフィブリン生成による凝血塊の
形成における主要な試薬である。凝固助剤としてのその
有効性ゆえにトロンビンおよびその製剤は外科的処置中
の出血を抑制するのに有用である。乾燥トロンビンは入
手しつるが、取扱いおよび時間的配慮から液体製剤が一
般に好ましい。

今まで、貯蔵安定性かつ外科手術中すぐ使用できる高度
に安定な液体トロンビン製剤は何ら存在していない。こ
れはトロンビンが、水または食塩水に溶解された場合に
、トロンビンタンパク質の変性および目己分解ゆえにそ
の活性を速やかに喪失することが原因である。

今、適当な媒体中における精製トロンビンに安定化量の
ある種の緩衝剤を添加することにより、無菌で貯蔵安定
性のトロンビン製剤が製造されうろことが見出された。

所望の場合は、食塩水および１種またはそれ以上のポリ
オール安定剤も使用されうる。

この発明は１９８５年１０月２８日出願の米国特許出願
番号第７９１．８３６号の記載に関連するものであする
。

好ましい態様の一つにおいては、５０％（■ハ）のグリ
セロールおよび０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ６，０）
を含有する０、４５Ｍ　　ＮａＣＱ溶液中における２（
ＩＯＧＩＪ　／　ｍＱ　（単位／　ＩＱ）の精製トロン
ビンを含有する溶液が：Ａ製された。この溶液は、室温
（２５°Ｃ）で６か月貯蔵した後もそのもとの凝固活性
のすべてを保有していた。室温で１２か月貯蔵後でもこ
の溶液はまたもとの活性の８０％を保持していた。

もう一つの好ましい態様においては、０．０５Ｍの酢酸
塩緩衝液、２．７％（０，４５Ｍ）のＮａＣ１２および
２５％のグリセロールと共に１５００　Ｕ　／　ＲＱの
精製トロンビンを含有する組成物はｐｕ５で２５°Ｃで
６か月貯蔵後でフィブロメーターの示度によれば８６％
の活性を示した。

これらの好ましい組成物は４°Ｃで貯蔵された場合には
それより良好な活性さえ示した、すなわち燐酸塩系で１
２か列後で１００％そして酢酸塩系で１２か列後で９５
％を示した。

本発明のトロンビン組成物およびその製法は血液凝固を
助成するための慣用の製剤およびその製法に比較してい
くつかの長所を有する。

粉末製剤と異なり、本発明組成物は使用に先立ち何ら再
構成する必要がない。従って、１種またはそれ以上の成
分（類）または容器（類）の計測、混合、滅菌等は重要
な考慮要件ではない。

本発明の製剤は最終使用前に最小限の、すなわちわずか
しかまたは何ら調製を行うことな（使用されうる。

その上、本発明のトロンビン含有物質の安定性ゆえに製
品の貯蔵目録および／または回転の必要が大きく排除さ
れることとなる。４°Ｃで約１週間しか安定でない大部
分のトロンビンの食塩水溶液または水溶液と異なり、本
発明による製剤は通常の冷蔵温度（すなわち、約４°Ｃ
，）お。

よび室温（すなわち約２５°Ｃ）で６か月またはそれ以
上の期間安定である。

高濃度のグリセロール、スクロース、および池のポリオ
ールが溶液中におけるタンパク質を安定化させうろこと
は知られている。トロンビンの場合、グリセロール濃度
６７％で１００ＯＵ／ｗＱのトロンビン溶液を大きく安
定化させうろことが知られている。しかしながら、高濃
度のグリセロールを用いることは無菌トロンビン溶液の
大規模製造においては実際的でない、何故ならかかる製
剤の粘度が高くなるからである。

５０％またはそれ以下のグリセロールを含有する本発明
組成物によりこの問題が回避される。

本発明の池の利点および観点は以下の記載を考察するこ
とにより明らかとなろう。

本発明は最も広義には下記事項に関する。

１、精製トロンビン、ポリオール、および少くとも１種
の緩衝剤を含有するトロンビン組成物好ましくは溶液。

■、前期Ｉ項の調製物を含有する、傷手当用止血製剤。

■、前期１項のトロンビン組成物の製法。

本発明（−より調製された製剤は液体媒体中に実質上精
製されたトロンビン、および本発明の緩衝剤の１種また
はそれ以上を含有しなければならない。これらは食塩水
、およびタンパク質製剤中に慣用に使用される他の物質
を含有しうる。

「製剤」なる用語を用いてはいるが、その中にはトロン
ビンが実質的に可溶化されるかまたは高度に分散された
形態で、本発明におけるポリオールおよび緩衝剤の１種
またはそれ以上と組み合わされて存在するすべての種類
の配合物が包含されることが意図されることに注意され
ねばならない。

液体製剤が一般に好ましい。トロンビン、の溶１液が大
いに好ましい。液体製剤か調製される場合は、使用され
る溶媒（類）またはその他の希釈剤（類）がトロンビン
と適当な混和性を有していて、それゆえ製剤標準、例え
ばバッチからハツチへのトロンビン濃度の均一性、に容
易ニ合致しうろことが一般的に好ましい。

用いられるトロンビンは二段階イオン交換クロマトグラ
フィーにより得られる精製トロンビンである。第一段階
で、大部分の非トロンビンタンパク質を吸着させるため
にＤＥＡＥセファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）■が用
いられる。第二段階では、６Ｍセファロースを用いてト
ロンビンを吸着させそして残る非トロンビンタンパク質
はカラムを通過せしめる。このトロンビンは０．４５Ｍ
ＮａＣｌ２中の−０，０５Ｍ酢酸塩（ｐｌｌ５．０）を
用いるかまたは０．４５Ｍ　ＮａＣｆ２中の０．０５Ｍ
燐酸塩（ｐＨ８，０）を用いて溶離させる。次にこのト
ロンビンｍ　１（ＩＥを、酢酸塩緩衝液または燐酸塩緩
衝液のいずれかおよび食塩水を含有するグリセロールと
混合して本発明の安定化された溶液を調製する。

トロンビンは生理食塩水、すなわち約０．９％のＮａＣ
ｌ２を含有する水溶液中に溶解しうろことが知られてい
る。しかしながら、他の食塩溶液も使用されうる。さら
に、かかる溶液中のＮａＣＱの全部または一部を他の適
当な塩の１種またはそれ以上で置換することもできる。

本発明の製剤にとって好ましい媒体は水である。しかし
ながら、本発明の製剤におけるトロンビンの溶解度およ
び／または安定性に不利な影響を及ぼさない他の希釈剤
の１種またはそれ以上を用いることが望ましい。

かかる希釈剤の一つはグリセロールである。

他の有用なポリオールにはマンニトール、ソルビトール
、マクロース、グルコース等が包含される。これらの混
合物を用いることもできる。

グリセロールが使用されるのが非常に好ましい。

グリセロールまたは他のポリオール成分（類）は組成物
の総重量に基づき約ｌＯ〜約６０重量％、好ましくは２
５〜５０重量％の総濃度で使用されうる。

もし別に断わりなければ、示される量はすべて組成物の
総重量に基づく重量％である。

適当な緩衝系は、その水溶液が最終的なト。

ンビン溶液のｐｌｌを約５．０〜約８．０１好ましくは
ｐｌ＋約５．０〜約６．０に保持するものである。燐酸
塩緩衝液が用いられる場合はその製剤の最終的なｐｉが
約６．０〜約６．５でありそして酢酸塩緩衝液が用いら
れる場合は最終的なＩ）＋１は約５．０であることが大
へん好都合である。

ｐｌは組合せ電極を用い通常のｐｌｌ計で測定される。

有用な緩衝系には酢酸塩、燐酸塩、フハク酸塩、重炭酸
塩、イミダゾール、トリス、およびＮ、　Ｅ、　Ｇｏｏ
ｄ氏他のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　２
４．　ＰａｒｔＢ、　５３（１９７２）　；および１１
．Ｆ、　Ｆｅｒｇｕｓｏｎ氏他のＡｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４，３００（１９８０）記載の
双性イオン緩衝剤が包含される。

本発明の緩衝系に使用するのに適当な試薬にはＭＥＳ、
　ＡＣＥＳ、　ＢＥＳ、　ＭＯＰＳ、　ＴＥＳ、　ＨＥ
ＰＥＳ等が包含される。燐酸塩はカルシウムイオンが存
在しないかまたはＥＤＴＡの存在下でのみ使用されるべ
きである。かかる試薬の混合物も使用されうる。

もし混合緩衝剤が用いられる場合は、最終的な１）＋１
は適当に調整されねばならない。

ホスヘートイオンおよびアセテートイオンを含有する緩
衝剤が好ましい。それらの混合物を用いることもできる
。

米国特許出顯番号第０６／７９１．８３６号に記載の緩
衝系も本発明で使用されうる。

緩衝剤は水および／または他の適当な希釈剤（類）と共
に、緩衝溶液中に総濃度約０．０２Ｍご約１１Ｍ、好ま
しくは約０．０５Ｍ〜約０．　ＩＯＭで存在しよう。

他の種々の慣用の添加剤、例えば酸化防止剤、着色剤、
界面活性剤等を使用することもできる。

場合によりグルタチオンも一成分として使用されうる。

アミノ酸が場合により使用されうるが、それらは、精製
されたトロンビンに及ぼすポリオールおよび緩衝成分の
安定化作用を妨害するような量で存在してはならない。

一般に、それらはもし存在するとすれば０．５％または
それ以下の少量でのみ使用されるのが好ましい。

一般に、これまでに論じられた成分の濃度範囲は第１表
に示される限界内であろう。表中の％は組成物の総重量
に基づ（。

第　　１　　表 トロンビン、　１０−１０．０００　　　　５０−５．
０００　　　　５００−２，０００単位／ｘ（１ 緩衝溶液　　　０．０１−１．０　　　　　０．０２−
０．２　　　０．０５−０．１０す） 希釈剤／溶媒　　−− ポリオール０−５０　　　　　　　１０−５０　　　　
　２５−５０止血剤 止血物質例えばゲルフォー　ム（ＧＥＬＦＯＡＭ）　＠
、サージセル（ＳｔｌＲＧ　ＩＣＥＬ）■　、およびア
ビセル（ＡＶＩ−ＣＥＬ）■、および今日食塩水中トロ
ンビン末またはトロンビンと組み合せてまたは単独で使
用されるコラーゲンは種々の方法を用い、本発明による
安定化されたトロンビン１　剤と一緒に効果的に使用さ
れうる。好ましくは、安定化された溶液を止血剤上に吸
収させそしてパッドを凍結乾燥させ、無菌的に包装する
。

抗菌剤または抗生物質も、特に感染予防、が決。

定的に重要である火傷患者に使用するために前記パッド
中に混入されうる。さらに、界面活性剤およびＮａＣＱ
以外の塩も使用されつる。かかる添加剤の１種またはそ
れ以上が存在する場合はそれらの濃度は一般に第■表に
示される範囲内にある。

第　　■　　表 界面活性剤　　　０−２　　　　　０−０．５　　　　
　　０−０．２酸化防止剤　　　０−１　　　　　０−
０．２　　　　　　０−０．１抗菌剤　０−１　　０−
０．５　　　０−０．２池の添加剤　　　０−５　　　
　　０−３　　　　　　　０−１例えば塩 本発明による止血剤の製造に適当な包帯の種類の一つは
米国特許第４．３６３．３１９号に記載されている。

トロンビン製剤の製造 好ましくはウシ超厚の粗製トロンビンを前記の２段階イ
オン交換クロマトグラフィーにより精製する。この精製
トロンビンヲ０．４５Ｍ　　ＮａＣＱ中の０．０５Ｍ燐
酸塩（ｐＨ６，０）を添加することによるか、または０
．４５Ｍ　ＮａＣｌ２中０．０５Ｍ酢酸塩（ｐＨ５，０
）を添加することによりＣＭ−セファロースから溶離す
る。カラムから溶出したトロンビンは高度に濃縮されて
おり、本発明によるトロンビン製剤を製造するためには
、希釈されねばならない。これは、例えば燐酸塩緩衝食
塩水中における溶出したトロンビンにｐＨ６，０の０．
０５Ｍ燐酸塩、０．４５Ｍ　　ＮａＣｆ２中の５０％（
ｗ／ｖ）グリセロールを含有する同量の溶液を添加する
ことにより行われる。得られるトロンビン製剤は２５％
グリセロール、０．０５Ｍ燐酸塩、０．４５Ｍ　　Ｎａ
ＣＱ中に所望濃度の精製トロンビンを含有している。こ
の特定の製剤はｐＨ約６゜０を有する。

得られる製剤はＢＢＬフィブロメーターを用いて凝固時
間を測定することにより検定する。　。

以下の実施例により本発明をより詳しく説明する。

実施例　Ｉ 燐酸塩緩衝されたトロンビン組成物の調製は前記したと
おりである。酢酸塩緩衝された組成物は０．０５Ｍ燐酸
塩（ｐＨ＆、０）に代えてｐＨ５，０の０、０５Ｍ酢酸
塩を用いることにより同様にして調製される。

本発明のトロンビン組成物は下記操作により検定される
。

トロンビン活性レベルはＢ　Ｂ　Ｌフィブロメーターで
凝固時間を測ることにより測定される。

フイブリノゲン源はプールされたヒト血漿を０９％食塩
水で１・１に希釈したものである。

トロンビン溶液はイミダゾールにより緩衝された食塩水
中の０．５％ポリエチレングリコール８０００を用いて
２ｏｏｅに希釈する。凝固カップに希釈された血漿０．
２ｚｌを加える。これを３７℃に３分間１呆ち、次にこ
の溶液に希釈されたトロンビン溶液のこれも３７°Ｃで
３分間保持されたちの０．１ｉｆ２を加える。凝固時間
はフィブロメーターの示度から直接測定する。残留する
トロンビン単位／＊Ｑの数字はトロンビン濃度対凝固時
間の標準曲線から測定される。

実施例　■ 第■表に示されるデータにより、ｐＨ６，０のグリセロ
ール燐酸塩系における精製トロンビンの安定性が証明さ
れる。

第■表 精製トロンビン（２０００単（Ｌ／肩のの溶液安定性１
２　　　　　　　　　　　１０６　　　　＊　　　７１
　　２７＊汚染 グリセロールレベルが２５％より低い場合は室温ではト
ロンビンの安定性が保持されないことに注意すべきであ
る。

実施例　■ 第■表に示されるデータによりｐｌ（５，０のグリセロ
ール−酢酸塩系中における精製トロンビンの安定性が証
明される。

第■表 Δ且 （ＮａＣの　　　　　　２．７％　　　　２．７％（西
乍Δ女塩）　　　　　（０，４５Ｍ）　　　　　（０，
４５Ｍ）０．０５Ｍ　　　　　０．１０Ｍ （ｐ）ｌ）　　５．０５．０ ０゜２５　９３９４ 貯蔵温度　　　貯蔵時間 （’Ｃ）　　　　　　（月）　　　　　　　　　Ａ　　
　　　　　Ｂ０．２５　　　　　　　９９　　　　　９
７同じ配合物中における不純なトロンビンと精製トロン
ビンの安定性を比較することが有益である。不純なトロ
ンビンの溶液（１５００単位／Ｉｆ２．２５％（賓／１
）グリセロール、０．０５Ｍ酢酸塩および０．４５Ｍ　
ＮａＣＱ中、（ｐＨ５，０）　）は２５°Ｃで１か月貯
蔵した場合でその当初の凝固活性の６８％を保有してい
ることが判明した。１５００単位／ｚＱの精製トロンビ
ンを含有する同様の配合物は２５°Ｃで１か月経過後で
その当初活性の１００％を保持し、そして２５℃で６か
月経過後でその活性の８６％を保持していることが判明
した。

実施例　■ 止血剤の製造 ０、４５Ｍ食塩水を含有するｐＨ５，ｏの０．０５Ｍ酢
酸塩緩衝液中における精製トロンビンの溶液を用いてゲ
ルフオーム（ｇｅｌｒｏｒｍ■）パラドラ飽和する。こ
のパッドを凍結乾燥する。かかる乾燥パッド中に含有さ
れるトロンビンは室温においてさえもその安定性を長期
間にわたり保持しうる。グリセロール／酢酸塩中に精製
トロンビンを飽和しそして湿潤状態で貯蔵されたゲルフ
オームのパッドは室温で６日後には完全に分解した。

当業者が考えうるような妥当な変形は本発明の範囲から
逸脱することなく行われうろことに留意されたい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）（ａ）精製トロンビン、 （ｂ）ポリオール、および酢酸塩イオンまたは燐酸塩イ
   オンを含有する緩衝剤、 を含有しており、ｐＨ約５．０〜約８．０を有する安定
   なトロンビン組成物。 ２）前記緩衝剤が燐酸塩イオンを含有しそして前記ｐＨ
   が約６．０〜約６．５である請求項１記載の組成物。 ３）前記緩衝剤が酢酸塩イオンを含有しそして前記ｐＨ
   が約５．０〜約５．５である請求項１記載の組成物。 ４）前記ポリオールがグリセロールである請求項２記載
   の組成物。 ５）前記ポリオールがグリセロールである請求項３記載
   の組成物。 ６）請求項４記載の組成物および基質からなる、創傷手
   当に使用するための止血剤。 ７）請求項５記載の組成物および基質からなる、創傷手
   当に使用するための止血剤。 ８）精製トロンビンをポリオールおよび緩衝剤と接触さ
   せる工程からなり、最終的なｐＨ約５．０〜約８．０を
   有する安定化された組成物の製法。 ９）前記緩衝剤が燐酸塩緩衝剤でありそして最終的なｐ
   Ｈが約６．０〜約６．５である請求項８記載の方法。 １０）前記緩衝剤が酢酸塩緩衝剤でありそして最終的な
   ｐＨが約５．０〜約５．５である請求項８記載の方法。