DK167210B1 - Stabilt thrombinpraeparat, fremgangsmaade til dets fremstilling og hemostat indeholdende praeparatet - Google Patents

Description

i DK 167210 B1

Thrombin, der er et proteolytisk enzym, er essentielt for hemostasis. Det er et hovedreagens ved størkning af blod via fibrindannelse. På grund af dets effektivitet som et størkningshjælpemiddel, er thrombin og præparater heraf 5 anvendelige under kirurgiske operationer til styring af blødning. Skønt tørt thrombin er tilgængeligt, foretrækkes flydende præparater i almindelighed på grund af hensyn til håndtering og tid.

Hidtil har meget stabile flydende thrombinpræparater, 10 der både er stabile ved opbevaring og klar til anvendelse under operation ikke været tilgængelige. Dette skyldes at thrombin, når det opløses i vand eller saltvand, hurtigt taber sin aktivitet på grund af denaturering og autolyse af thrombinproteinet.

15 Det har vist sig, at der kan fremstilles sterile flydende opbevaringsstabile thrombinpræparater ved, at der til oprenset thrombin i et egnet medium sættes stabiliserende mængder af en phosphatpuffer og én eller flere polyolstabili-satorer, og eventuelt også saltvand.

20 Opfindelsen angår således et stabilt flydende throm- binpræparat, som er ejendommeligt ved, at det indeholder (a) oprenset thrombin, (b) en polyol og en phosphatpuf fer, hvorved præparatet har en pH-værdi på ca. 5,0 til ca. 8,0.

25 Opfindelsen angår også en hemostat til anvendelse som et sårforbindingsmiddel, hvilken hemostat er ejendommelig ved, at den indeholder et præparat ifølge opfindelsen og et substrat.

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til frem-30 stilling af et stabilt flydende thrombinpræparat, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at det oprensede thrombin bringes i kontakt med en polyol og en phosphatpuf fer, hvorved produktet har en slut-pH-værdi på ca. 5,0 til ca. 8,0.

Denne opfindelse er beslægtet med den, der omhandles 35 i DK patentansøgning nr. 5126/86.

I en foretrukken udførelsesform fremstilles en opløs- DK 167210 B1 2 ning, der indeholder 2000 U/ml (enheder pr. ml) oprenset thrombin i en 0,45 M NaCl-opløsning, der indeholder 50 vol.-% glycerol og 0,05 M phosphatpuffer, pH 6,0. Denne opløsning bibeholder hele sin oprindelige størkningsaktivitet efter 5 opbevaring ved stuetemperatur (25°C) i 6 måneder. Efter opbevaring i 12 måneder ved stuetemperatur har denne opløsning stadigvæk 80% af sin oprindelige aktivitet.

Dette foretrukne præparat viser endda bedre retention af aktiviteten når det opbevares ved 4°C, f.eks. 100% 10 efter 12 måneder.

Thrombinpræparaterne ifølge opfindelsen har flere fordele i forhold til konventionelle præparater til medvirken ved størkning af blod.

I modsætning til pulveriserede præparater kræver 15 præparaterne ifølge den foreliggende opfindelse ingen genfortynding før anvendelsen. Hensyn til afmåling, blanding, sterilisering osv. af én eller flere komponenter eller beholdere er således ikke vigtige. De her omhandlede præparater kan anvendes med kun minimal dvs. lille eller ingen, til-20 beredning før den endelige anvendelse.

Stabiliteten af de her omhandlede præparater, der indeholder thrombin, er endvidere sådan, at behovet for lagerkontrol (lagerlister) og/eller rotation af produkterne stort set er elimineret. I modsætning til de fleste saltvands 25 eller vand-opløsninger af thrombin, der kun er stabile i ca. 1 uge ved 4°C, er de her omhandlede præparater beregnet til at være stabile ved normale køletemperaturer, (f.eks. ca. 4°C) og ved stuetemperatur (ca. 25°C) i 6 måneder eller mere.

30 Det vides, at store koncentrationer af glycerol, saccharose og andre polyoler kan stabilisere proteiner i opløsning. Med hensyn til thrombin vides det, at en glycerolkoncentration på 67% i høj grad kan stabilisere en 1000 U/ml thrombin-opløsning. Anvendelsen af store glycerolkoncen-35 trationer er imidlertid ikke praktisk ved produktion i stor målestok af en steril thrombin-opløsning på grund af et DK 167210 B1 3 sådant præparats store viskositet. De omhandlede præparater, der indeholder 50% eller mindre glycerol, undgår disse problemer.

Andre fordele og aspekter af opfindelsen vil klart 5 fremgå af den efterfølgende beskrivelse af opfindelsen.

Præparater fremstillet i overensstemmelse med opfindelsen skal i et flydende medium indeholde i det væsentlige oprenset thrombin og en phosphatpuffer. De kan indeholde saltvand eller andre substanser, der i almindelighed anvendes 10 til proteinpræparater.

Skønt betegnelsen "præparater" anvendes, bør det bemærkes, at opfindelsen angår alle typer af formuleringer, i hvilke thrombin, i det væsentlige i opløst eller højdispers form, er til stede i kombination med én eller flere af 15 de omhandlede polyoler og puffere.

Opløsninger af thrombin foretrækkes især. Når der fremstilles et præparat ifølge opfindelsen, foretrækkes det i almindelighed, at det/de anvendte opløsningsmiddel(midler) eller et andet/andre fortyndingsmiddel/fortyndingsmidler 20 har en egnet blandbarhed med thrombin, således at produktionsstandarder let kan opnås, f.eks. ensartet med hensyn til thrombinkoncentrationen fra batch til batch.

Det anvendte thrombin er et oprenset thrombin, der er opnået ved totrins-ionbytningschromatografi. I det første 25 trin anvendes der "DEAE Sepharose" til adsorption af en stor del af det protein, der ikke er thrombin. I det andet trin anvendes der "CM-Sepharose" til adsorbering af thrombin, og det tilbageværende ikke-thrombinprotein tillades at passere gennem søjlen. Thrombinet elueres fra kolonnen under 30 anvendelse af 0,05 M phosphat i 0,45 M NaCl, pH 6,0. Denne thrombinopløsning blandes herefter med glycerol, der indeholder phosphatpuffer og saltvand, for at fremstille den stabiliserede opløsning ifølge den foreliggende opfindelse.

Thrombin vides at være opløseligt i fysiologisk salt-35 vand, dvs. en opløsning, der indeholder ca. 0,9% NaCl i vand. Andre saltvandsopløsninger betragtes imidlertid som DK 167210 B1 4 anvendelige. Endvidere er det muligt at udskifte alt eller dele af natriumchloridet i sådanne opløsninger med ét eller flere andre egnede salte.

Vand er et foretrukket medium til præparaterne ifølge 5 opfindelsen. Imidlertid er anvendelsen af ét eller flere andre fortyndingsmidler, der ikke væsentligt påvirker opløseligheden og/eller stabiliteten af thrombin i de her omhandlede præparater, ønskværdigt.

Et sådant fortyndingsmiddel er glycerol. Andre anven-10 delige polyoler omfatter mannitol, sorbitol, saccharose, glucose og lignende. Blandinger kan anvendes. Glycerol foretrækkes især.

Glycerolen eller en anden polyolkomponent/polyolkom-ponenter kan anvendes i en samlet koncentration på fra ca.

15 10 til ca. 60 vægt-%, fortrinsvis 25-50 vægt-%, baseret på præparatets samlede vægt.

Medmindre andet er anført er alle anførte mængder vægtprocenter baseret på præparaternes samlede vægt.

Egnede puffersystemer er de, hvis vandige opløsninger 20 opretholder pH-værdien af den endelige thrombin-opløsning på mellem ca. 5,0 og ca. 8,0. Det foretrækkes, at den endelige pH-værdi for præparatet er ca. 6,0 til ca. 6,5.

pH-Målinger foretages under anvendelse af et almindeligt pH-meter med en kombinationselektrode.

25 Anvendelige puffersystemer omfatter phosphat.

Egnede reagenser til anvendelse i de omhandlede puffersystemer omfatter MES (2-morpholinoethansulfonsyre), ACES (2 — [ (carbamoylmethyl) amino]-ethansulfonsyre) , BES (N,li-bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsyre), MOPS (3-morpho-30 lino-l-propansulfonsyre), TES (2-{[tris(hydroxymethyl)methyl] -amino}-ethansulfonsyre), HEPES ([4-(2-hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsyre) og lignende. Phosphatet bør kun anvendes i fraværelse af calciumion eller i nærværelse af EDTA. Blandinger af sådanne reagenser kan anvendes. Hvis 35 der anvendes blandede puffere bør den endelige pH-værdi være passende indstillet.

DK 167210 B1 5

Pufferne vil være til stede i pufferopløsningen sammen med vand og/eller andre egnede fortyndingsmiddel/fortyndings-midler i samlede koncentrationer på ca. 0,02 M til ca. 1 M, fortrinsvis ca. 0,05 M til ca. 0,10 M.

5 Anvendelsen af forskellige andre konventionelle til sætningsstoffer, f.eks. antioxidanter, farvestoffer, overfladeaktive midler og lignende er også omhandlet. Glutathion kan anvendes som en eventuel komponent. Aminosyrer kan anvendes som eventuelle komponenter, men tilstedeværelsen heraf 10 må ikke være i sådanne mængder, at de interfererer med den stabiliserende virkning af polyolen og pufferkomponenterne på den oprensede thrombin. I almindelighed foretrækkes det, at de, hvis de i det hele taget anvendes, kun anvendes i ganske små mængder med koncentrationer på 0,5% eller mindre.

15 I almindelighed er koncentrationsintervallerne for de ovenfor beskrevne komponenter inden for de i tabel I anførte grænser. Procenter er baseret på det samlede præparats vægt.

20 25 30 DK 167210 B1 6

Tabel I

Vægtprocent 5

Komponenter Bredt Foretrukket Især fore trukket 10 Thrombin 10-10.000 50-5.000 500-2.000 U/ml

Pufferopløsning 0,01-1,0 0,02-0,2 0,05-0,10 (M) 15

Fortyndings/opløsningsmiddel - - -

Polyol >0-50 10-50 25-50 20

Hemostatiske materialer, såsom "GELFOAM®", "SURGICEL®" og "AVICEL®" og collagen, der hidtil er anvendt alene eller i kombination med thrombinpulver eller thrombin i saltvand, 25 kan effektivt anvendes sammen med de stabiliserede throm-binpræparater ifølge den foreliggende opfindelse under anvendelse af mange forskellige teknikker. Fortrinsvis absorberes den stabiliserede opløsning på det hemostatiske middel, og puden frysetørres, og den pakkes sterilt.

30 Antimikrobielle eller antibiotiske midler kan også inkorporeres i sådanne puder, især til anvendelse på brand-sårspatienter, hvor forebyggelse mod infektioner er kritisk. Endvidere kan der anvendes overfladeaktive midler og andre salte end NaCl. Når ét eller flere af sådanne tilsætnings-35 stoffer er til stede, er koncentrationerne heraf i almindelighed inden for de i tabel II anførte områder.

5 DK 167210 B1 7

Tabel II

Vægtprocent

Tilsætnings- Bredt Foretrukket Især forestoffer trukket 10 Overfladeakti- 0-2 0-0,5 0-0,2 ve midler

Antioxidanter 0-1 0-0,2 0-0,1 15 Antimikrobielle 0-1 0-0,5 0-0,2 midler

Andre tilsætningsstoffer, f.eks. salte 0-5 0-3 0-1 20

En type bandage, der er egnet ved fremstillingen af koagulanter i overensstemmelse med opfindelsen er beskrevet i US-patentskrift nr. 4.363.319.

25 Råt thrombin, fortrinsvis fra okse, oprenses ved hjælp af den ovenfor beskrevne totrins-ionbytningschromatografi.

Det oprensede thrombin elueres fra "CM-Sepharose" ved tilsætning af 0,05 M phosphat i 0,45 M natriumchlorid, pH 6,0.

Det fra søjlen eluerede thrombin er meget koncentreret, og 30 det skal fortyndes til fremstilling af thrombinpræparatet ifølge den foreliggende opfindelse. Dette gøres f.eks. ved tilsætning af et rumfang af en opløsning bestående af 50 vægt-% glycerol i 0,05 M phosphat, 0,45 M natriumchlorid, pH

6,0 til et lige så stort rumfang af elueret thrombin i phos-35 phat-pufret saltvand. Det fremkomne thrombinpræparat indeholder den ønskede koncentration af oprenset thrombin i 25% glycerol, 0,05 M phosphat, 0,45 M natriumchlorid. Dette særlige præparat har en pH-værdi på ca. 6,0.

Det fremkomne præparat undersøges ved måling af størk-40 ningstiden under anvendelse af et BBL-fibrometer.

DK 167210 B1 8

Eksempler

De følgende eksempler tjener til illustration af opfindelsen.

5 Eksempel 1.

Fremstillingen af et phosphat-bufret thrombinpræparat er anført ovenfor.

Thrombinpræparater ifølge den foreliggende opfindelse undersøges ved hjælp af den følgende fremgangsmåde: 10 Thrombinaktivitetsniveauerne bestemmes ved måling af størkningstiden på BBL-fibrometer. Fibrinogenkilden er samlet human plasma fortyndet 1:1 med en 0,9%'s saltvandsopløsning. Thrombinopløsningen fortyndes 200 gange med 0,5% polyethylen-glycol 8000 i imidazol-pufret saltvand. Til en koagulations-15 skål sættes 0,2 ml fortyndet plasma. Denne holdes ved 37°c i 3 minutter, hvorefter der til denne opløsning sættes 0,1 ml fortyndet thrombinopløsning, hvilken også er holdt ved 37°C i 3 minutter. Størkningstiden bestemmes direkte ud fra aflæsningen af fibrometret. Mængden af tilbageværende 20 thrombin i U/ml bestemmes ud fra en standardkurve for throm-binkoncentration versus størkningstid.

Eksempel 2.

Data i tabel III illustrerer stabiliteten af oprenset 25 thrombin i et glycerol-phosphatsystem, pH 6,0.

9 DK 167210 B1

Tabel III

Opløsningsstabilitet af oprenset thrombin (2000 U/ml) ved 4°C og 25°C i forskellige glycerol-phosphatformuleringer (0,45 M NaCl, 0,05 M phosphat, pH 6,0).

5

Opbevaring Undersøgt formulering % Aktivitet

Temp. Tid A B C D

10 (°C) (måneder)

Glycerol 50% (vol.) 25% 10% 25 0 100 100 100 100 1 93 98 2 87 96 15 3 104 96 4 45 20 6 105 81 12 80 25 20 4 0 100 100 100 100 1 92 108 82 88 2 90 110 87 78 3 88 109 96 79 6 106 115 101 62 25 12 106 * 71 27 *Forurenet 30 Det bør bemærkes at, thrombinstabiliteten ikke opret holdes ved stuetemperatur, når glycerolniveauet er lavere end 25%.

35

Claims (6)

1. Stabilt flydende thrombinpræparat, kendetegnet ved, at det indeholder (a) oprenset thrombin, 5 (b) en polyol og en phosphatpuffer, hvorved præparatet har en pH-værdi på ca. 5,0 til ca. 8,0.

2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pH-værdien er ca. 6,0 til ca. 6,5.

3. Præparat ifølge krav 2, kendetegnet 10 ved, at polyolen er glycerol.

4. Hemostat til anvendelse som et sårforbindingsmiddel, kendetegnet ved, at den indeholder præparatet ifølge krav 3 og et substrat.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et stabilt fly-15 dende thrombinpræparat, kendetegnet ved, at det oprensede thrombin bringes i kontakt med en polyol og en phosphatpuffer, hvorved produktet har en slut-pH-værdi på ca. 5,0 til ca. 8,0.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendete g-20 net ved, at slut-pH er ca. 6,0 til ca. 6,5.