JP4681455B2 - パラオキソナーゼ含有製剤 - Google Patents
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Description
(1)PONおよびCHAPSを含むPON含有製剤、
(2)さらにポリオールを含む上記(1)の製剤、
(3)ポリオールがグリセロールである上記(2)の製剤、
(4)PON含有溶液を、疎水性担体処理し、次いでCHAPSの存在下に陰イオン交換体処理することを特徴とするPONの精製方法、
(5)CHAPSおよびポリオールの存在下に陰イオン交換体処理する上記(4)の精製方法、
(6)ポリオールがグリセロールである上記(5)の精製方法、
(7)PONにCHAPSを添加することを特徴とするPONの安定化方法、
(8)さらにポリオールを添加する上記(7)の安定化方法、
(9)ポリオールがグリセロールである上記(8)の安定化方法、
(10)PONを有効成分とする、虚血再灌流に伴う障害および/または脳梗塞の予防及び/又は治療剤、
(11)虚血再灌流に伴う障害および/または脳梗塞における予後、神経症状あるいは運動機能を改善するために使用される上記(10)の予防及び/又は治療剤、
(12)PONおよびCHAPSを含む、虚血再灌流に伴う障害および/または脳梗塞の予防及び/又は治療するための薬剤、
(13)虚血再灌流に伴う障害および/または脳梗塞における予後、神経症状あるいは運動機能を改善するために使用される上記(12)の薬剤、
(14)さらにポリオールを含む上記(12)または(13)の薬剤、
(15)ポリオールがグリセロールである上記(14)の薬剤、
(16)有効量のPONを投与してなる虚血再灌流に伴う障害および/または脳梗塞における予後、神経症状あるいは運動機能を改善する方法、
(17)虚血再灌流に伴う障害および/または脳梗塞における予後、神経症状あるいは運動機能を改善するための薬剤を製造するためのPONの使用。
本発明で用いられる出発原料はPON含有溶液であれば特に限定されない。例えば、血液、血漿、血清、血漿からフィブリンを除去したもの、血漿からコーンの低温エタノール分画法により得られる上清画分Eff.Iなどが例示される。また、遺伝子組換え技術を利用して調製されたものであってもよい。具体的には、組換え技術を用いてCHO細胞、昆虫細胞等に発現させた組換えPONを含む溶液(例えば、培養液、培養上清など)を用いることができる(非特許文献5、同6を参照)。
本発明の精製方法は、PON含有溶液を疎水性担体処理し、次いでポリオールおよびCHAPSの存在下に陰イオン交換体処理することを特徴とするものである。あるいは本発明の精製方法は、PON含有溶液を疎水性担体処理し、次いでCHAPSの存在下に陰イオン交換体処理することを特徴とするものである。
疎水性担体は不溶性担体に疎水性基を結合したものである。不溶性担体としてはアガロース(商品名セファロースなど)、架橋デキストラン(商品名セファデックスなど)、親水性ビニルポリマー(商品名トヨパールなど)等が例示される。また疎水性基としては、アルキル基、好ましくは炭素数4〜18のアルキル基(例えば、ブチル基、オクチル基、オクタデシル基など)、またはフェニル基等が例示される。不溶性担体に疎水性基を結合する方法は公知の方法に準じて行うことができる。また市販品を入手することもできる。
陰イオン交換体は不溶性担体に陰イオン交換基を結合したものである。不溶性担体としてはアガロース(商品名セファロースなど)、架橋デキストラン(商品名セファデックスなど)、親水性ビニルポリマー(商品名トヨパールなど)等が例示される。また陰イオン交換基としては、ジエチルアミノエチル基(DEAE型)、四級アンモニウム基(Q型)、四級アミノエチル基(QAE型)等が例示される。好ましくは、四級アンモミウム基、四級アミノエチル基などの強塩基性のものを用いる。不溶性担体に陰イオン交換基を結合する方法は公知の方法に準じて行うことができる。また市販品を入手することもできる。
陰イオン交換体処理後にPON含有溶液を、分画分子量10〜30kDa程度の限外濾過膜を用いて濃縮することができる。
固定化ConAは不溶性担体にConAを結合したものである。不溶性担体としてはアガロース(商品名セファロースなど)、架橋デキストラン(商品名セファデックスなど)、親水性ビニルポリマー(商品名トヨパールなど)等が例示される。不溶性担体にConAを結合する方法は公知の方法に準じて行うことができる。また市販品を入手することもできる。
本処理は最初の陰イオン交換体処理に準じて繰り返すことができる。
疎水性担体処理→陰イオン交換体処理→固定化ConA処理→陰イオン交換体処理(2回目)
疎水性担体処理→陰イオン交換体処理→陰イオン交換体処理(2回目)
本精製法により、100〜2000U/A280、好ましくは500〜1800U/A280程度に高度精製されたPONを調製することができる。なおPON活性の1Uとは1分間当たり1nmolのパラオキソンから同モル量の4−アミノフェノールを生成できることを意味する。詳細は参考例1に記載のとおりである。
精製されたPONを用いて製剤化を行う。精製されたPONとしては上記の精製法により調製されたものを用いることができる。また、公知の精製法により調製されたものを用いてよい。例えば、ブルーアガロース処理と陰イオン交換体処理を組合せた態様(特許文献2、非特許文献3、同4)などが例示される。
本発明で得られたPON含有製剤は公知の医薬用途に用いることができる。例えば、解毒剤、動脈硬化への適用などである。また新規な医薬用途としては虚血再灌流に伴う障害および/または脳梗塞の予防及び/又は治療等に適用可能である。投与方法としては経口投与・非経口投与のいずれでもよい。非経口投与の場合は静脈内投与などの注射などの態様が挙げられる。その投与量は患者の症状、性別、年齢、体重などに応じて適宜増減すればよい。具体的には0.1〜1000mg/kg体重程度が例示される。
A.PON活性の測定
1)基質の調製
基質原液(パラオキソン、ジエチルp−ニトロ−フェニルホスフェートともいう、シグマ社)7μLを52μLのDMSOで溶解後、0.1Mトリス塩酸、2mM塩化カルシウム(pH8、25℃)で100倍希釈した。但し、必要に応じて本測定系には上記の緩衝液にヘパリンを添加(0.5mg/mL)した緩衝液を用いた。
2)測定(室温で行う)
96ウエルマイクロプレートに試料(PONを含む)20μLおよび、1)で調製した基質溶液200μLを添加、混和した(パラオキソンの終濃度は5mMとなる)。30分間動力学的モードで波長405nmの吸光度を測定し、その結果をSoftmax Version 2.35で計算した。なお試料の希釈には基質調製用と同じ緩衝液を用いた。
3)活性算出法
2)で得られたVmax in mOD/minを用いて以下の式より算出した。但し、当該値は、Vmax相関係数が0.95以上の値を採用した。
ヒトプール血漿から調製された血清を用いてPONを精製した。ヒト血清を、1mM塩化カルシウムを含む生理食塩水で平衡化したフェニル−アガロースカラム(フェニル−セファロース、アマシャムファルマシア)にアプライした。同溶媒で洗浄した後に、50w/v%エチレングリコール、1mM塩化ナトリウムを含む水溶液で吸着したPONを溶出した。当該溶液を限外濾過膜(30kDa)を用いて1mM塩化カルシウム、25w/v%グルセロール、0.5w/v%CHAPSを含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で脱塩濃縮し、同溶媒で平衡化した四級アンモニウム型−アガロースカラム(Q−セファロース、ファルマシア)にアプライした。同溶媒で洗浄した後に、塩化ナトリウム濃度を、0.1M→0.15M→0.2M→0.25M→1Mの順にステップワイズに上げて溶出させた。0.2M〜0.25Mの塩化ナトリウムの溶出画分を回収して、限外濾過膜(10kDa)で濃縮した。
実施例1で調製されたPON含有溶液を、10mM塩化カルシウム、0.2M塩化ナトリウム、5μM EDTA3ナトリウム、25w/v%グリセロール、0.5w/v%CHAPSを含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したConAアガロースカラム(ConAセファロース、アマシャムファルマシア)にアプライした。同溶媒で洗浄した後に、3M塩化ナトリウムを含む同溶媒でPONを溶出した。限外濾過膜(10kDa)を用いて濃縮した。当該溶液を実施例1の方法に準じて四級アンモニウム型アガロースカラム(前述)を用いて処理し、0.25Mの塩化ナトリウムの溶出画分を回収した。当該四級アンモニウム型アガロース処理(2回目)における活性回収率は95%であった。また精製PONをSDS−PAGE(還元条件下)で分析したところ、ほぼ1バンド(分子量45kDa)として検出された。
四級アンモニウム型アガロース(Q−セファロース)処理における溶出時の塩化ナトリウム濃度を、0.15M→0.2M→0.25M→1Mの順でステップワイズに上げて行う以外は全て実施例1に準じて行った。0.25Mの塩化ナトリウムの溶出画分を回収して、限外濾過膜(10kDa)で濃縮した。
実施例3で調製されたPON含有溶液を実施例1の方法に準じて再度、四級アンモニウム型アガロースカラムを用いて処理し、0.2Mの塩化ナトリウムの溶出画分を回収した。精製PONをSDS−PAGE(還元条件下)で分析したところ、ほぼ1バンド(分子量45kDa)として検出された。
10mg/mLの精製PON(実施例4により調製)、2.5w/v%グリセロール、0.05w/v%CHAPS、0.1mM塩化カルシウム、20mM塩化ナトリウム、0.5μM EDTA・3Naを含む2.5mMトリスの緩衝液(pH7.5)の組成からなるPON製剤を調製した。
実施例1の疎水性担体(フェニル−アガロース、以下の実験例および参考例2も全て同様)処理により得られた溶出液について、各界面活性剤[ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル(商品名トリトンX−100)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(商品名トウイーン80)、オクチルチオグリコシド、CHAPS]と活性残存率の関係を検討した。溶媒は1mM塩化カルシウム、25w/v%グリセロールを含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)とした。室温で30分間放置後にPON活性を測定した。結果を表6に示す。
疎水性担体処理により得られた溶出液を、1mM塩化カルシウム、25w/v%エチレングリコール、各種界面活性剤[ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル(商品名トリトンX−100)、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル(商品名トウイーン80)、オクチルグリコシド]を含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で平衡化した陰イオン交換体(DEAE型アガロース)カラムにアプライし、0.15M塩化ナトリウムで溶出した場合のPONの溶出挙動を確認した。トリトンX−100とトウイーン80の添加濃度は0.1w/v%、オクチルグルコシドの添加濃度は0.5w/v%とした。結果を表7に示す。
疎水性担体処理により得られた溶出液を、1mM塩化カルシウム、25w/v%グリセロール、0.5w/v%CHAPSを含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化した陰イオン交換体(四級アンモニウム型アガロース)カラムにアプライし、0.2〜0.25M塩化ナトリウムで溶出した場合のPONの溶出挙動を確認した。結果を表8に示す。
疎水性担体処理により得られた溶出液を、1mM塩化カルシウム、5μM EDTA・3Na、0.5w/v%CHAPS、25w/v%グリセロールを含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化した陰イオン交換体(四級アンモニウム−アガロース)カラムにアプライし、0.2〜0.25M塩化ナトリウムで溶出した場合のPONの溶出挙動を確認した。対照としてグリセロールを添加しないものを用いた。結果を表9に示す。
精製したPONのラット脳梗塞(虚血再灌流)モデルに対する作用を、梗塞巣の体積を指標に評価した。
1.被験物質および調製法
PONは実施例5に準じて10mg/mLの濃度で溶媒に溶解したものを用いた。溶媒は被験物質に用いたもののみを用いた。
2.動物は、CD(SD)系雄性ラット(体重300g前後、8週齢)を用いた。
3.評価項目は、梗塞巣の体積とした。
4.群構成および投与量
対照群は虚血直後に溶媒をラットに尾静脈内投与した(例数は6)。PON投与群は虚血直後に10mg/kg体重をラットに尾静脈内投与した(例数は5)。
5.方法
虚血再灌流モデルの作製
脳虚血再灌流は、非特許文献7で開示された方法に従い作製した。すなわち、動物をハロタン麻酔下で背位に固定し、頚部を除毛後、頚部皮膚を正中切開した。総頚動脈を周囲組織より剥離し、右外頚動脈及び総頚動脈を絹糸にて結紮して、内頚動脈に糸をかけた後、内頚動脈と外頚動脈の分岐部より、先端約2cmを直径0.45mmにシリコンコーティングした栓子(4−0ナイロン糸、協和時計工業)を18mm挿入し、絹糸にて内頚動脈とともに結紮、固定することにより右中大脳動脈(MCA)灌流領域を虚血にした。切開部を縫合し麻酔より覚醒させた。虚血負荷2時間後に再び切開部を開けて、栓子を約1cm引き抜くことにより、右MCA灌流領域の再灌流を行い、再び切開部を縫合した。
再灌流24時間後に動物を断頭し、頭蓋骨の縫合に沿って開頭し、脳組織を摘出して、ブレインスライサー(RBM−4000C、Brain Matrix)を用いて、脳組織をbregmaより前方(+)3mm、1mm及び後方(−)1mm、3mm、5mmで輪切りにして冠状切片を作製した。引き続き2% 2,3,5−triphenyltetrazolium chloride(TTC;ナカライ)を含む0.1Mリン酸緩衝液中で脳切片を約10分間インキュベートした。脳切片を取り出し、水分を軽く除いた後、写真撮影し、TTC染色陽性領域と陰性領域を区別した。これより画像解析装置(Simple PCI、C−IMAGING systems)を用いて梗塞巣面積を測定し、梗塞巣体積を算出した。
6.結果を表10に示す。
1)神経症状
中大脳動脈(MCA)虚血再灌流モデルの作製
動物をセボフルレンにより呼気麻酔した後、保温マット(SMS−2000J,Medical System Inc.、37℃設定)上に背位固定した。頸部中央を切開後、右外頚動脈および右総頚動脈を結紮した。内頚動脈と外頚動脈の分岐部より、先端約2cmを直径0.19〜0.20mmにシリコンコーティングした栓子(0.2号渓流用釣り糸、OWNER CO.,LTD)を右内頚動脈に沿って約0.9cm挿入することによりMCAを虚血状態とした。頸部切開部を縫合し麻酔より覚醒させ、虚血1時間後に上記同様に麻酔し、栓子を抜去してMCAを再灌流させた。モデル作製の可否は、再灌流直前の神経症状により判断した。即ち、動物の尻尾をもって吊るすとき、左前肢を屈曲し、胴を左に屈曲するか否かで判定した。また、右外頚動脈および右総頚動脈を結紮するのみで、栓子を挿入しない個体を作製し、sham−operation群とした。
非特許文献8に記載された方法に従い、スコアー付けを行った。即ち以下に示す症状が観察される時、項目毎に1ポイントとして加算し、合計ポイントをスコアーとした。
尻尾をもって吊るすとき、左前肢を屈曲する。
尻尾をもって吊るすとき、左後肢を屈曲する。
尻尾をもって吊るすとき、胴を左に屈曲する。
床に置いた時、真直ぐ歩けない。
床に置いた時、左に回る。
床に置いた時、左に傾く。
動かない。
震える。
発作を起こす。
PON(実施例5により調製)は、再灌流直後及び再灌流1、2、3、4、5、6日後に1日1回投与した。1回の投与量は10mg/10mL/kg体重とした。対照として、PONを含有しない溶媒のみを同投与液量投与した(ビークル群)。
2)運動機能
市販のRota−rod tredmill for mice(MK−600、室町機械株式会社)を用いて測定した。すなわち、再灌流1、3、5、7、9、14、19、23日後に、一定スピード(設定1)で回転する棒上を回転方向とは逆向きに歩かせ、歩き始めた時間から棒から落下するまでの時間を測定した。歩行時間は、上限200秒とした。マウスは予め試験前5日間歩行練習させ、試験前日に200秒間を歩けた個体のみを、中大脳動脈(MCA)虚血再灌流モデルの作製に供した。その他は1)と同様である。結果を図2に示す。
再灌流3時間後にPONを初回投与する以外は全て実験例5に準じて実験を行い、神経症状を観察した。例数はSham群5、ビークル群3、PON投与群4とした。結果を図3に示す。
Claims (7)
- パラオキソナーゼ(PON)を有効成分とする脳梗塞の予防及び/又は治療剤。
- 脳梗塞における予後、神経症状あるいは運動機能を改善するために使用される請求項1に記載の予防及び/又は治療剤。
- さらに3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホネート(CHAPS)を含む請求項1又は2に記載の予防及び/又は治療剤。
- さらにポリオールを含む請求項1ないし3のいずれか1項に記載の予防及び/又は治療剤。
- ポリオールがグリセロールである請求項4に記載の予防及び/又は治療剤。
- パラオキソナーゼ(PON)を有効成分とする脳梗塞の予防及び/又は治療のための注射用溶液剤。
- 製剤中のPON濃度が1〜100mg/mL(1800〜180000U/mL)である請求項6に記載の注射用溶液剤。
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