KR20070007794A

KR20070007794A - 파라옥소나아제 함유 제제

Info

Publication number: KR20070007794A
Application number: KR1020067017760A
Authority: KR
Inventors: 나오미 아사하라; 모토노리 하시모토; 사토시 유키
Original assignee: 미츠비시 웰파마 가부시키가이샤
Priority date: 2004-02-04
Filing date: 2005-02-04
Publication date: 2007-01-16
Also published as: KR101191613B1; ES2405815T3; EP1716865A4; EP1716865A1; JP5106621B2; EP2251033B1; KR20110088574A; WO2005074977A1; JP4681455B2; CA2555339A1; EP2251033A1; JP2011087595A; US9050331B2; CN1925868B; CA2555339C; US20150182602A1; JPWO2005074977A1; US20070280916A1; CN1925868A

Abstract

본 발명은, 파라옥소나아제(PON)를 함유하는 제제, 정제 방법, 안정화 방법 및 PON을 유효 성분으로 하는, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색의 예방 및/또는 치료제를 제공한다.

Description

파라옥소나아제 함유 제제{PARAOXONASE-CONTAINING PHARMACEUTICAL PREPARATION}

본 발명은 파라옥소나아제(이하 PON이라고 부르는 경우도 있음)에 관한 것이다. 상세하게는 PON을 함유하는 제제, 정제 방법, 안정화 방법 및 신규한 의약 용도에 관한 것이다.

파라옥소나아제(인간 혈청 파라옥소나아제 또는 PON1이라고도 함)는, Ca²⁺ 의존성의 분자량 약 45 kDa의 당단백질이며, 혈 중에서 고밀도 리포단백(HDL)을 구성하는 단백 성분의 하나로서 존재하고 있다. PON은 옥손, 유기 인, 신경 가스인 사린 등의 방향족 카르복실산을 가수분해하는 혈청 효소로서 알려져 있으며, 이들의 해독제로서 사용할 수 있다. 최근, PON의 생리 활성이 계속 밝혀지고 있고, 예컨대, 항동맥경화 작용, 항산화 작용 등이 보고되어 있다(비특허 문헌 1, 비특허 문헌 2, 특허 문헌 1).

PON의 정제에 관해서는, 블루 아가로스 처리와 DEAE형 음이온 교환체 처리를 조합하는 방법이 보고되어 있다(비특허 문헌 3, 비특허 문헌 4). 이 보고예에 따르면, 글리세롤과 폴리옥시에틸렌·알킬페닐에테르형의 비이온계 계면 활성제(구체적 으로는 Emulgen, Nonidet P-40, 모두 상품명)의 공존 하에 PON을 정제하는 것이 보고되어 있지만, 그 이외의 것, 예컨대, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(이하 CHAPS라고 부르는 경우도 있음) 등은 개시되어 있지 않다. 또한, PON을 포함하는 혈청 검체에 CHAPS를 첨가하고, 이 효소 활성을 유지하는 것이 보고되어 있지만(특허 문헌 2), 이것은 정제 PON에 관한 것은 아니다.

PON을 의약에 응용하는 것을 시사하는 보고도 몇 가지 이루어져 있다. 예컨대, 생체 중의 PON량과 협심증, 심근경색, 뇌경색의 관계를 시사하는 보고예가 있다(특허 문헌 2). 또한, 특허 문헌 3은, Apo-A1에 관한 허혈 재관류 장애에 관한 보고이지만, 이 중에서 PON도 Apo-A1과 마찬가지로 허혈 재관류 장애에 유효하다는 것이 시사되어 있다. 그러나, 구체적으로 그 효과가 나타나 있는 것은 아니다.

이와 같이 PON은 의약으로서 유용하다는 것이 시사되어 있는 데 지나지 않고, 또 PON을 의약품으로서 안정적으로 공급하는 수단에 대해서는 거의 보고예가 없는 것이 현재 상황이다.

특허 문헌 1: 국제 공개 팜플렛 WO00/30425호

특허 문헌 2: 일본 특허 공개 2000-333674호 공보

특허 문헌 3: 국제 공개 팜플렛 WO03/97696호

비특허 문헌 1: J. Clin. Invest., 1998년, 101권, 1581-1590페이지

비특허 문헌 2: Nature, 1998년, 394권, 284-287페이지

비특허 문헌 3: Drug Methabolism and Disposition, 1991년, 19권 1호, 100-106페이지

비특허 문헌 4: Biochemistry, 1991년, 30권, 10133-10140페이지

비특허 문헌 5: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995년, 92권, 7187-7191페이지

비특허 문헌 6: J. Lipid Reseach, 2001년, 42권, 951-958페이지

비특허 문헌 7: Stroke, 1989년, 20권, 1037-1043페이지

비특허 문헌 8: Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 2000년, 20권, 1311-1319페이지

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

종래의 정제법으로는 고순도의 PON을 효율적으로 회수하는 것이 곤란하다고 예상되었다. 또한 종래부터 사용되고 있는 계면 활성제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌·알킬페닐에테르형의 비이온계 계면 활성제를 이용한 경우, PON의 안정화 효과는 반드시 양호한 것은 아님이 확인되었다. 또한, 이들 계면 활성제 중, 고분자량의 것은 투석 등에 의해 제거할 수 없기 때문에, 크로마토 처리에 의해 정제된 PON을 동물 등에 투여하기 위한 농축 조작을 하면, 이들 계면 활성제도 함께 농축되어 버려, 생체에 대한 악영향이 우려되었다.

본 발명의 목적은, PON을 임상 적용할 수 있게 하기 위한 정제 및 제제화 기술을 제공하는 데에 있다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 PON의 신규한 의약 용도를 제공하는 데에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 상기한 사정을 고려하여 연구를 한 결과, PON의 정제시 및/또는 보존시에 CHAPS를 첨가함으로써, 순도, 활성 발현, 활성 회수율 및 보존 안정성을 개선할 수 있음을 알아냈다.

또한, 본 발명자들은, 허혈 재관류 동물 모델에 있어서 PON이 유용하다는 것을 증명했다.

즉, 본 발명은 하기와 같다:

(1) PON 및 CHAPS를 함유하는 PON 함유 제제,

(2) 폴리올을 더 함유하는 상기 (1)의 제제,

(3) 폴리올이 글리세롤인 상기 (2)의 제제,

(4) PON 함유 용액을, 소수성 담체 처리하고, 이어서 CHAPS의 존재 하에 음이온 교환체 처리하는 것을 특징으로 하는 PON의 정제 방법,

(5) CHAPS 및 폴리올의 존재 하에 음이온 교환체 처리하는 상기 (4)의 정제 방법,

(6) 폴리올이 글리세롤인 상기 (5)의 정제 방법,

(7) PON에 CHAPS를 첨가하는 것을 특징으로 하는 PON의 안정화 방법,

(8) 폴리올을 더 첨가하는 상기 (7)의 안정화 방법,

(9) 폴리올이 글리세롤인 상기 (8)의 안정화 방법,

(10) PON을 유효 성분으로 하는, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색의 예방 및/또는 치료제,

(11) 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 있어서의 예후, 신경 증상 또는 운동 기능을 개선하기 위해 사용되는 상기 (10)의 예방 및/또는 치료제,

(12) PON 및 CHAPS를 함유하는, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제,

(13) 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 있어서의 예후, 신경 증상 또는 운동 기능을 개선하기 위해 사용되는 상기 (12)의 약제,

(14) 폴리올을 더 함유하는 상기 (12) 또는 (13)의 약제,

(15) 폴리올이 글리세롤인 상기 (14)의 약제,

(16) 유효량의 PON을 투여하는 것을 포함하는, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 있어서의 예후, 신경 증상 또는 운동 기능을 개선하는 방법,

(17) 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 있어서의 예후, 신경 증상 또는 운동 기능을 개선하기 위한 약제를 제조하기 위한 PON의 용도.

발명의 효과

본 발명에 의하면, 정제시·보존시의 안정성이 개선된 PON 함유 제제의 공급이 가능하다. 또한, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 유용한 신규한 의약품의 제공이 가능하다.

도 1은 허혈 재관류 모델에 있어서 재관류 직후에 PON을 첫 회 투여했을 때의, 신경 증상의 개선도의 변화를 시간 경과적으로 도시한 것이다. 횡축은 관찰일, 즉 재관류 후의 일수(일)를, 종축은 신경 증상 점수(score)를 각각 나타낸다. 도면 중의 기호(□, △, ○)는 각 관찰일에 있어서의 신경 증상 점수를 나타낸다. 각각의 데이터는 평균치±SEM으로 나타내어진다. 기호와 꺾은선의 조합 중, □과 점선의 조합은 sham군(정상군)을, △와 점선의 조합은 비히클군(질환군)을, ○와 실선의 조합은 PON 투여군을 각각 나타낸다. ＊는 Wilcoxon법을 이용하여 비히클군과 비교했을 때에 위험율 5% 미만으로 유의차가 있음을 나타낸다.

도 2는 허혈 재관류 모델에 있어서 재관류 직후에 PON을 첫 회 투여했을 때의, 운동 기능의 개선도의 변화를 경시적으로 도시한 것이다. 횡축, 데이터 표시, 기호와 꺾은선의 조합의 정의는 도 1의 설명과 같다. 종축은 Rotarod의 보행 시간(초)을 나타낸다. 도면 중의 기호(□, △, ○)는 각 관찰일에 있어서의 Rotarod의 보행 시간을 나타낸다. ＊＊는 t-test법을 이용하여 비히클군과 비교했을 때에 위험율 1% 미만으로 유의차가 있음을 나타낸다.

도 3은 허혈 재관류 모델에 있어서 재관류 3시간 후에 PON을 첫 회 투여했을 때의, 신경 증상의 개선도의 변화를 경시적으로 도시한 것이다. 횡축, 종축, 기호, 데이터 표시, 기호와 꺾은선의 조합의 정의는 도 1의 설명과 같다. ＊는 t-test법을 이용하여 비히클군과 비교했을 때에 위험율 5% 미만으로 유의차가 있음을 나타낸다.

도 4는 허혈 재관류 모델에 있어서 재관류 3시간 후에 PON을 첫 회 투여했을 때의, 운동 기능의 개선도의 변화를 경시적으로 도시한 것이다. 횡축, 데이터 표시, 기호와 꺾은선의 조합의 정의는 도 1의 설명과 같다. 종축과 기호의 정의는 도 2의 설명과 같다. ＊의 정의는 도 3의 설명과 같다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

출발 원료

본 발명에서 이용되는 출발 원료는 PON 함유 용액이라면 특별히 한정되지 않는다. 예컨대, 혈액, 혈장, 혈청, 혈장에서 피브린을 제거한 것, 혈장에서 콘의 저온 에탄올 분획법에 의해 얻어지는 상청 획분 Eff.I 등이 예시된다. 또한, 유전자 재조합 기술을 이용하여 조제된 것이라도 좋다. 구체적으로는, 재조합 기술을 이용하여 CHO 세포, 곤충 세포 등에 발현시킨 재조합 PON을 포함하는 용액(예컨대, 배양액, 배양 상청 등)을 이용할 수 있다(비특허 문헌 5, 비특허 문헌 6을 참조).

정제

본 발명의 정제 방법은, PON 함유 용액을 소수성 담체 처리하고, 이어서 폴리올 및 CHAPS의 존재 하에 음이온 교환체 처리하는 것을 특징으로 하는 것이다. 또는 본 발명의 정제 방법은, PON 함유 용액을 소수성 담체 처리하고, 이어서 CHAPS의 존재 하에 음이온 교환체 처리하는 것을 특징으로 하는 것이다.

소수성 담체 처리

소수성 담체는 불용성 담체에 소수성 기를 결합한 것이다. 불용성 담체로서는 아가로스(상품명 세파로스 등), 가교 덱스트란(상품명 세파덱스 등), 친수성 비닐폴리머(상품명 토요펄 등) 등이 예시된다. 또한 소수성 기로서는, 알킬기, 바람직하게는 탄소수 4∼18의 알킬기(예컨대, 부틸기, 옥틸기, 옥타데실기 등), 또는 페닐기 등이 예시된다. 불용성 담체에 소수성 기를 결합하는 방법은 공지의 방법에 준하여 행할 수 있다. 또한 시판품을 입수할 수도 있다.

소수성 담체 처리의 방법으로서는, 구체적으로는, PON 함유 용액을 소수성 담체에 접촉시켜 PON을 소수성 담체에 흡착시킨 후에, 특정의 용매를 이용하여 PON을 용출함으로써 회수한다. 흡착 조건으로서는, pH 6∼8 정도, 염 농도는 0.01∼0.2 M 정도를 들 수 있다. 또한, 0.1∼2 mM 정도의 칼슘염을 첨가하더라도 좋다. 구체적으로는, 1 mM 염화칼슘을 함유하는 생리 식염수(0.15 M 염화나트륨) 등이 예시된다. 흡착 후에 세정을 행하는 경우는, 흡착과 동일한 조건에 의해 행할 수 있다.

용출시에는, 30∼70 w/v%, 바람직하게는 40∼60 w/v% 정도의 탄소수 1∼4의 알킬렌글리콜류(예컨대, 에틸렌글리콜 등)를 이용한다. 또한, 0.1∼2 mM 정도의 칼슘염을 첨가하더라도 좋다. 구체적으로는, 50 w/v% 에틸렌글리콜, 1 mM 염화칼슘을 함유하는 수용액 등이 예시된다.

음이온 교환체 처리

음이온 교환체는 불용성 담체에 음이온 교환기를 결합한 것이다. 불용성 담체로서는 아가로스(상품명 세파로스 등), 가교 덱스트란(상품명 세파덱스 등), 친수성 비닐폴리머(상품명 토요펄 등) 등이 예시된다. 또한 음이온 교환기로서는, 디에틸아미노에틸기(DEAE형), 4급 암모늄기(Q형), 4급 아미노에틸기(QAE형) 등이 예시된다. 바람직하게는, 4급 암모늄기, 4급 아미노에틸기 등의 강염기성의 것을 이용한다. 불용성 담체에 음이온 교환기를 결합하는 방법은 공지의 방법에 준하여 행할 수 있다. 또한 시판품을 입수할 수도 있다.

음이온 교환체 처리는 폴리올(예컨대, 글리세롤 등) 및 CHAPS(N,N-디메틸-N- (3-설포프로필)-3-[[(3α,5β,7α,12α)-3,7,12-트리히드록시-24-옥소콜란-24-일]-아미노]-1-프로파나뮴, 또는 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)의 공존 하에 행한다. 폴리올의 첨가량으로서는 10∼40 w/v%, 바람직하게는 20∼30 w/v% 정도가 예시된다. CHAPS의 첨가량으로서는 0.01∼1 w/v% 정도가 예시된다. 한편, 본 처리 이후에도 정제를 행하는 경우는 전부 폴리올 및 CHAPS의 공존 하에 행한다.

또한 음이온 교환체 처리는, CHAPS의 존재 하에 행할 수도 있다. 이 경우, 본 처리 이후에도 정제를 행할 때는 전부 CHAPS의 존재 하에 행할 수도 있다.

음이온 교환체 처리의 방법으로서는 구체적으로는, PON 함유 용액을 음이온 교환체에 접촉시켜 PON을 음이온 교환체에 흡착시킨 후에, 고염농도의 용매를 이용하여 PON을 용출함으로써 회수한다. 흡착 조건으로서는, pH 6∼9 정도, 염 농도는 0.001∼0.1 M 정도를 들 수 있다. 또한, 0.1∼2 mM 정도의 칼슘염을 첨가하더라도 좋다. 구체적으로는, 1 mM 염화칼슘, 25 w/v% 글리세롤, 0.5 w/v% CHAPS를 함유하는 25 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5) 등이 예시된다. 흡착 후에 세정을 행하는 경우는, 흡착과 동일한 조건에 의해 행할 수 있다. 또한 용출 조건으로서는, pH 6∼9, 염 농도 0.1∼2 M 정도를 들 수 있다. 또한, 0.1∼2 mM 정도의 칼슘염을 첨가하더라도 좋다. 구체적으로는, 0.1∼1 M의 염화나트륨, 1 mM 염화칼슘, 25 w/v% 글리세롤, 0.5 w/v% CHAPS를 함유하는 25 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5) 등이 예시된다. 또한, 용출에 있어서는, 염 농도를 단계적으로 올리는 방법, 연속적으로 올리는 방법(농도 구배법)의 어느 것으로 행하더라도 좋다.

농축(한외 여과)

음이온 교환체 처리를 한 후에 PON 함유 용액을, 분획 분자량 10∼30 kDa 정도의 한외 여과막을 이용하여 농축할 수 있다.

고정화 콘카나발린 A(이하 ConA라고 부르는 경우도 있음) 처리

고정화 ConA는 불용성 담체에 ConA를 결합한 것이다. 불용성 담체로서는 아가로스(상품명 세파로스 등), 가교 덱스트란(상품명 세파덱스 등), 친수성 비닐폴리머(상품명 토요펄 등) 등이 예시된다. 불용성 담체에 ConA를 결합하는 방법은 공지의 방법에 준하여 행할 수 있다. 또한 시판품을 입수할 수도 있다.

고정화 ConA 처리의 방법으로서는, 구체적으로는 PON 함유 용액을 고정화 ConA에 접촉시켜 PON을 고정화 ConA에 흡착시킨 후에, 고염농도 또는 특정의 용매를 이용하여 PON을 용출함으로써 회수한다. 흡착 조건으로서는, pH 6∼9 정도, 염 농도는 0.1∼0.5 M 정도를 들 수 있다. 또한, 1∼20 mM 정도의 칼슘염, 1∼10 μM 정도의 EDTA염(예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 토류 금속염 등)을 첨가하더라도 좋다. 구체적으로는, 10 mM 염화칼슘, 0.2 M 염화나트륨, 5 μM EDTA 삼나트륨염, 25 w/v% 글리세롤, 0.5 w/v% CHAPS를 함유하는 25 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5) 등이 예시된다. 흡착 후에 세정을 행하는 경우는, 흡착과 동일한 조건에 의해 행할 수 있다.

또한 용출 조건으로서는, pH 6∼9, 염 농도 1∼5 M 정도를 들 수 있다. 또는, pH, 염 농도는 흡착 조건 그대로, 0.1∼0.5 M 정도의 α-메틸만노시드를 이용한다. 또한, 1∼20 mM 정도의 칼슘염, 1∼10 μM 정도의 EDTA염(예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 토류 금속염 등)을 첨가하더라도 좋다. 구체적으로는, 10 mM 염화칼슘, 1∼4 M 염화나트륨, 5 μM EDTA 삼나트륨염, 25 w/v% 글리세롤, 0.5 w/v% CHAPS를 함유하는 25 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5) 또는 0.1∼0.5 M α-메틸만노시드, 10 mM 염화칼슘, 0.2 M 염화나트륨, 5 μM EDTA 삼나트륨염, 25 w/v% 글리세롤, 0.5 w/v% CHAPS를 함유하는 25 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5) 등이 예시된다. 또한, 용출에 있어서는, 염 농도 또는 α-메틸만노시드 농도를 단계적으로 올리는 방법, 연속적으로 올리는 방법(농도 구배법)의 어느 것으로 행하더라도 좋다. 고정화 ConA 처리는 필요에 따라서 행하면 되며, 또한 경우에 따라서 생략할 수도 있다.

음이온 교환체 처리(2회째)

본 처리는 최초의 음이온 교환체 처리에 준하여 반복할 수 있다.

또한 PON의 정제도를 올리기 위해서 공지의 수법으로서 블루 아가로스 처리를 병용할 수도 있다. 그 처리 조건은 공지된 방법에 준하여 행할 수 있다. 다만, 전술한 바와 같이, 폴리올 및 CHAPS의 공존 하에 행한다. 또는 본 처리는 CHAPS의 존재 하에 행할 수도 있다.

본 발명의 정제법으로서 구체적으로는 이하의 방법이 예시된다.

소수성 담체 처리→음이온 교환체 처리→고정화 ConA 처리→음이온 교환체 처리(2회째)

소수성 담체 처리→음이온 교환체 처리→음이온 교환체 처리(2회째)

본 정제법에 의해, 100∼2000 U/A₂₈₀, 바람직하게는 500∼1800 U/A₂₈₀ 정도로 고도 정제된 PON을 조제할 수 있다. 한편 PON 활성의 1U란 1분당 1 nmol의 파라옥손으로부터 동몰량의 4-아미노페놀을 생성할 수 있음을 의미한다. 상세한 것은 참고예 1에 기재한 것과 같다.

제제화

정제된 PON을 이용하여 제제화를 행한다. 정제된 PON으로서는 상기한 정제법에 의해 조제된 것을 이용할 수 있다. 또한, 공지의 정제법에 의해 조제된 것을 이용하여도 좋다. 예컨대, 블루 아가로스 처리와 음이온 교환체 처리를 조합한 형태(특허 문헌 2, 비특허 문헌 3, 비특허 문헌 4) 등이 예시된다.

본 제제에 있어서의 PON의 농도로서는 1∼100 mg/ml(1800∼180000 U/ml) 정도가 예시된다. pH로서는 6∼9 정도, 염 농도로서는 1∼100 mM 정도가 예시된다. 첨가제로서는, 폴리올, CHAPS를 들 수 있다. 폴리올로서는 글리세롤 등이 예시된다. 그 첨가 농도로서는, 폴리올이 1∼5 w/v% 정도, CHAPS가 0.001∼0.1 w/v% 정도가 예시된다. 또한, 염화칼슘 등의 칼슘염, EDTA 등의 킬레이트화제, 트리스 등의 완충액을 이용하더라도 좋다. 그 첨가 농도로서, 칼슘염이 0.01∼1 mM 정도, 킬레이트화제가 0.1∼1 μM 정도, 완충액이 1∼10 mM 정도가 각각 예시된다.

PON 함유 용액에 필요에 따라서 각종 첨가제를 첨가하여, 여과 멸균, 소구분 분주, 동결 건조 등의 방법을 이용하여 PON을 제제화할 수 있다.

용법 용량

본 발명에서 얻어진 PON 함유 제제는 공지의 의약 용도에 이용할 수 있다. 예컨대, 해독제, 동맥경화에의 적용 등이다. 또한 신규한 의약 용도로서는 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색의 예방 및/또는 치료 등에 적용할 수 있다. 투여 방법으로서는 경구 투여·비경구 투여의 어느 것이라도 좋다. 비경구 투여의 경우는 정맥내 투여 등의 주사 등의 형태를 들 수 있다. 그 투여량은 환자의 증상, 성별, 연령, 체중 등에 따라서 적절하게 증감하면 된다. 구체적으로는 0.1∼1000 mg/kg 체중 정도가 예시된다.

특히 PON을 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색의 예방 및/또는 치료에 적용하는 경우는, 구체적으로는, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 있어서의 예후, 신경 증상 또는 운동 기능의 개선 등에 적용할 수 있다. 또한, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색의 의식 장애, 그 질환에 따른 신경 증후, 동작 장애, 특히 일상 생활 동작 장애, 기능 장애 등의 예방 및/또는 치료에 적용할 수 있다.

PON을 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색의 예방 및/또는 치료에 이용할 때의 투여 방법으로서는, 구체적으로는 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색이 발증한 후 48시간 이내, 바람직하게는 24시간 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내, 특히 바람직하게는 3시간 이내에 투여를 개시하여, 1일 1회, 단회 투여 또는 1∼14일간, 바람직하게는 1∼7일간 정도의 연일 투여가 예시된다.

본 발명을 보다 상세히 설명하기 위해서, 이하에 실시예 및 실험예를 들지 만, 본 발명은 이들에 의해 하등 한정되는 것이 아니다.

참고예 1

A. PON 활성의 측정

1) 기질의 조제

기질 원액(파라옥손, 디에틸 p-니트로-페닐포스페이트라고도 함, 시그마사) 7 ㎕을 52 ㎕의 DMSO로 용해한 후, 0.1 M 트리스 염산, 2 mM 염화칼슘(pH 8, 25℃)으로 100배 희석했다. 단, 필요에 따라서 본 측정계에는 상기한 완충액에 헤파린을 첨가(0.5 mg/ml)한 완충액을 이용했다.

2) 측정(실온에서 행함)

96 웰 마이크로플레이트에 시료(PON을 함유함) 20 ㎕, 및 1)에서 조제한 기질 용액 200 ㎕을 첨가, 혼화했다(파라옥손의 최종 농도는 5 mM이 됨). 30분간 동력학적 모드에서 파장 405 nm의 흡광도를 측정하고, 그 결과를 Softmax Version 2.35로 계산했다. 한편 시료의 희석에는 기질 조제용과 동일한 완충액을 이용했다.

3) 활성 산출법

2)에서 얻어진 Vmax in mOD/min을 이용하여 이하의 식으로부터 산출했다. 단, 그 값은 Vmax 상관 계수가 0.95 이상인 값을 채용했다.

PON 활성(U/ml=nmol/mh/ml)=Vmax in mOD/min/17000/0.6×0.22×1000×50

B. PON 항원량은 샌드위치 ELISA법에 의해 측정했다.

실시예 1

인간 혼주 혈장(pooled human plasma)으로부터 조제된 혈청을 이용하여 PON을 정제했다. 인간 혈청을, 1 mM 염화칼슘을 함유하는 생리 식염수로 평형화한 페닐-아가로스 컬럼(페닐-세파로스, 아마샴파마시아)에 어플라이했다. 동용매로 세정한 후에, 50 w/v% 에틸렌글리콜, 1 mM 염화나트륨을 함유하는 수용액으로 흡착한 PON을 용출했다. 그 용액을 한외 여과막(30 kDa)을 이용하여 1 mM 염화칼슘, 25 w/v% 글리세롤, 0.5 w/v% CHAPS를 함유하는 25 mM 트리스염산 완충액(pH 7.5)으로 탈염 농축하고, 동용매로 평형화한 4급 암모늄형-아가로스 컬럼(Q-세파로스, 파마시아)에 어플라이했다. 동용매로 세정한 후에, 염화나트륨 농도를, 0.1 M→0.15 M→0.2 M→0.25 M→1 M의 순으로 단계적으로 올려 용출시켰다. 0.2 M∼0.25 M의 염화나트륨의 용출 획분을 회수하여, 한외 여과막(10 kDa)으로 농축했다.

실시예 2

실시예 1에서 조제된 PON 함유 용액을, 10 mM 염화칼슘, 0.2 M 염화나트륨, 5 μM EDTA 삼나트륨, 25 w/v% 글리세롤, 0.5 w/v% CHAPS를 함유하는 25 mM 트리스염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 ConA 아가로스 컬럼(ConA 세파로스, 아마샴파마시아)에 어플라이했다. 동용매로 세정한 후에, 3 M 염화나트륨을 함유하는 동용매로 PON을 용출했다. 한외 여과막(10 kDa)을 이용하여 농축했다. 그 용액을 실시예 1의 방법에 준하여 4급 암모늄형 아가로스 컬럼(전술)을 이용하여 처리하여, 0.25 M의 염화나트륨의 용출 획분을 회수했다. 그 4급 암모늄형 아가로스 처리(2회째)에 있어서의 활성 회수율은 95%였다. 또한 정제 PON을 SDS-PAGE(환원 조건 하)로 분석한 바, 거의 1 밴드(분자량 45 kDa)로서 검출되었다.

실시예 3

4급 암모늄형 아가로스(Q-세파로스) 처리에 있어서의 용출시의 염화나트륨 농도를, 0.15 M→0.2 M→0.25 M→1 M의 순으로 단계적으로 올려 행하는 것 이외에는 전부 실시예 1에 준하여 행했다. 0.25 M의 염화나트륨의 용출 획분을 회수하여, 한외 여과막(10 kDa)으로 농축했다.

실시예 4

실시예 3에서 조제된 PON 함유 용액을 실시예 1의 방법에 준하여 재차, 4급 암모늄형 아가로스 컬럼을 이용하여 처리하여, 0.2 M의 염화나트륨의 용출 획분을 회수했다. 정제 PON을 SDS-PAGE(환원 조건 하에)로 분석한 바, 거의 1 밴드(분자량 45 kDa)로서 검출되었다.

각 실시예에서 조제된 PON의 정제 거동을 이하의 표에 나타낸다. 실시예 1이 표 1과 2, 실시예 2가 표 3, 실시예 3이 표 4, 실시예 4가 표 5에 대응한다.

검체	용량(ml)	A₂₈₀ 회수율(%)	활성 회수율(%)	비활성(U/A₂₈₀)
혈청	144	100	100	2.14
소수성 담체 처리 후	250	4.2	66.4	31.93

검체	용량(ml)	A₂₈₀ 회수율(%)	활성 회수율(%)	비활성(U/A₂₈₀)
소수성 담체 처리 후	10	100	100	32.91
음이온 교환체 처리 후(0.02 M 염화나트륨 용출 분획)	25	16.8	65.2	126.88
상동(0.25 M 염화나트륨 용출 분획)	25	5.9	26.1	139.06

검체	용량(ml)	A₂₈₀ 회수율(%)	활성 회수율(%)	비활성(U/A₂₈₀)
음이온 교환체 처리액	4	100	100	182.7
고정화 ConA 처리 후	4.9	7.4	31.4	777.4

검체	용량(ml)	A₂₈₀ 회수율(%)	활성 회수율(%)	비활성(U/A₂₈₀)
소수성 담체 처리액	286	100	100	32.41
음이온 교환체 처리 후	250	8.6	62.9	266.04

검체	용량(ml)	A₂₈₀ 회수율(%)	활성 회수율(%)	비활성(U/A₂₈₀)
음이온 교환체 처리액	12	100	100	266.04
음이온 교환체 처리(2회째) 후	25	14.0	57.0	1800.00

실시예 5

10 mg/ml의 정제 PON(실시예 4에 의해 조제), 2.5 w/v% 글리세롤, 0.05 w/v% CHAPS, 0.1 mM 염화칼슘, 20 mM 염화나트륨, 0.5 μM EDTA·3Na를 함유하는 2.5 mM 트리스의 완충액(pH 7.5)의 조성으로 이루어지는 PON 제제를 조제했다.

실험예 1

실시예 1의 소수성 담체(페닐-아가로스, 이하의 실험예 및 참고예 2도 전부 마찬가지) 처리에 의해 얻어진 용출액에 대해서, 각 계면 활성제[폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르(상품명 트리톤 X-100), 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르(상품명 트윈 80), 옥틸티오글루코시드, CHAPS]와 활성 잔존율의 관계를 검토했다. 용매는 1 mM 염화칼슘, 25 w/v% 글리세롤을 함유하는 25 mM 트리스염산 완충액(pH 7.5)으로 했다. 실온에서 30분간 방치한 후에 PON 활성을 측정했다. 결과를 표 6에 나타낸다.

계면 활성제의 종류	계면 활성제의 첨가 농도(%)	활성 잔존률(%)
직전		100
트리톤 X-100	0.1	70
트윈 80	0.1	65
옥틸티오글루코시드	0.25	80
CHAPS	0.5	98

트리톤 X-100, 트윈 80, 옥틸티오글루코시드에 비교하여, CHAPS 쪽이 높은 활성 잔존율을 나타내어, 안정화 효과가 우수하다는 것이 판명되었다.

참고예 2

소수성 담체 처리에 의해 얻어진 용출액을, 1 mM 염화칼슘, 25 w/v% 에틸렌글리콜, 각종 계면 활성제[폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르(상품명 트리톤 X-100), 폴리옥시에틸렌지방산에스테르(상품명 트윈 80), 옥틸글루코시드]를 포함하는 25 mM 트리스염산 완충액(pH 7.4)으로 평형화한 음이온 교환체(DEAE형 아가로스) 컬럼에 어플라이하여, 0.15 M 염화나트륨으로 용출한 경우의 PON의 용출 거동을 확인했다. 트리톤 X-100과 트윈 80의 첨가 농도는 0.1 w/v%, 옥틸글루코시드의 첨가 농도는 0.5 w/v%로 했다. 결과를 표 7에 나타낸다.

검체		A₂₈₀ 회수율(%)	활성 회수율(%)	비활성(U/A₂₈₀)
트리톤 X-100	소수성 담체 처리액	100	100	30.61
트리톤 X-100	음이온 교환체 처리액	14.6	95.0	149.44
트윈 80	소수성 담체 처리액	100	100	28.83
트윈 80	음이온 교환체 처리액	35.6	54.3	121.74
옥틸글루코시드	소수성 담체 처리액	100	100	36.08
옥틸글루코시드	음이온 교환체 처리액	30.5	49.6	58.43

트윈 80에 대해서는, 정제도(비활성)는 트리톤 X-100과 동등하게 되었지만, 활성 회수율은 반감했다. 옥틸글루코시드에서는 정제도·회수율 모두 트리톤 X-100, 트윈 80보다 약간 뒤떨어졌다. 옥틸티오글루코시드를 이용한 경우, 정제도·회수율 모두 옥틸글루코시드와 동등했다(데이터를 나타내지 않음).

실험예 2

소수성 담체 처리에 의해 얻어진 용출액을, 1 mM 염화칼슘, 25 w/v% 글리세롤, 0.5 w/v% CHAPS를 함유하는 25 mM 트리스염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 음이온 교환체(4급 암모늄형 아가로스) 컬럼에 어플라이하여, 0.2∼0.25 M 염화나트륨으로 용출한 경우의 PON의 용출 거동을 확인했다. 결과를 표 8에 나타낸다.

계면 활성제	A₂₈₀ 회수율(%)	활성 회수율(%)	비활성(U/A₂₈₀)
소수성 담체 처리액	100	100	32.91
0.5% CHAPS	22.7	80	129

CHAPS를 이용한 경우의 정제도 및 활성 회수율은 참고예 2의 트리톤 X-100과 거의 동등한 결과였다. 또한 이 조성물은 4℃에서 1개월 동안 보존하더라도 활성은 유지되고 있었다.

실험예 3

소수성 담체 처리에 의해 얻어진 용출액을, 1 mM 염화칼슘, 5 μM EDTA·3Na, 0.5 w/v% CHAPS, 25 w/v% 글리세롤을 함유하는 25 mM 트리스염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 음이온 교환체(4급 암모늄-아가로스) 컬럼에 어플라이하여, 0.2∼0.25 M 염화나트륨으로 용출한 경우의 PON의 용출 거동을 확인했다. 대조로서 글리세롤을 첨가하지 않는 것을 이용했다. 결과를 표 9에 나타낸다.

첨가제	A₂₈₀ 회수율(%)	활성 회수율(%)	비활성(U/A₂₈₀)
소수성 담체 처리액	100	100	32.91
CHAPS+글리세롤	22.7	80	129
CHAPS	13.4	64	152

글리세롤 무첨가의 경우는, 활성 회수율은 보다 낮은 값을 나타냈다. 또한 어플라이 샘플, 얻어진 획분의 안정성에 대해서도, 1주간 보존한 후에 약 50%의 활성 저하가 관찰되었다.

실험예 4

정제한 PON의 래트 뇌경색(허혈 재관류) 모델에 대한 작용을, 경색소의 체적을 지표로 평가했다.

실험 방법

1. 피검 물질 및 조제법

PON은 실시예 5에 준하여 10 mg/ml의 농도로 용매에 용해한 것을 이용했다. 용매는 피검 물질에 이용한 것만을 이용했다.

2. 동물은 CD(SD)계 수컷 래트(체중 300 g 전후, 8주령)를 이용했다.

3. 평가 항목은 경색소의 체적으로 했다.

4. 군 구성 및 투여량

대조군은 허혈 직후에 용매를 래트에 꼬리정맥내 투여했다(예의 수는 6). PON 투여군은 허혈 직후에 10 mg/kg 체중을 래트에게 꼬리정맥내 투여했다(예의 수는 5).

5. 방법

허혈 재관류 모델의 작성

뇌 허혈 재관류는, 비특허 문헌 7에서 개시된 방법에 따라서 제작했다. 즉, 동물을 할로탄 마취 하에서 배위로 고정하여, 경부를 제모 후, 경부 피부를 정중앙 절개했다. 총경동맥을 주위 조직으로부터 박리하고, 우외경동맥 및 총경동맥을 견사로 결찰하여, 내경동맥에 실을 건 후, 내경동맥과 외경동맥의 분기부로부터, 선단 약 2 cm를 직경 0.45 mm로 실리콘 코팅한 봉합사(suture)(4-0 나일론사, 교와도케이고교)를 18 mm 삽입하여, 견사로 내경동맥과 함께 결찰, 고정함으로써 우중대뇌동맥(MCA) 관류 영역을 허혈로 했다. 절개부를 봉합하여 마취에서 깨어나게 했다. 허혈 부하 2시간 후에 다시 절개부를 열어, 봉합사를 약 1 cm 뽑아냄으로써, 우측 MCA 전류 영역의 재관류를 행하고, 다시 절개부를 봉합했다.

경색소 체적의 측정

재관류 24시간 후에 동물을 단두하고, 두개골의 봉합을 따라서 머리를 열어, 뇌 조직을 적출하여, 브레인 슬라이서(RBM-4000C, Brain Matrix)를 이용하여, 뇌 조직을 bregma로부터 전방 (+) 3 mm, 1 mm 및 후방 (-) 1 mm, 3 mm, 5 mm에서 둥글게 잘라 관상(冠狀) 절편을 제작했다. 이어서 2% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC; 나카라이)를 함유하는 0.1 M 인산 완충액 속에서 뇌 절편을 약 10분간 인큐베이트했다. 뇌 절편을 빼내어, 수분을 살짝 제거한 후, 사진 촬영하여, TTC 염색 양성 영역과 음성 영역을 구별했다. 이로부터 화상 해석 장치(Simple PCI, C-IMAGING systems)를 이용하여 경색소 면적을 측정하여, 경색소 체적을 산출했다.

6. 결과를 표 10에 나타낸다.

	예의 수	뇌경색의 체적(mm²)
대조군	6	422.5±36.4
PON 투여군	5	290.4±42.6^*
＊는 위험율 5% 미만으로 유의차가 인정됨을 나타낸다.

PON의 투여에 의해, 동물 실험에 있어서 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색을 유의하게 억제하는 것이 이번에 처음으로 확인되었다.

실험예 5

1) 신경 증상

중대뇌동맥(MCA) 허혈 재관류 모델의 제작

동물을 세보플루란에 의해 호기(呼氣) 마취한 후, 보온 매트(SMS-2000J, Medical System Inc., 37℃ 설정) 상에 배위 고정했다. 경부 중앙을 절개한 후, 우외경동맥 및 우총경동맥을 결찰했다. 내경동맥과 외경동맥의 분기부로부터, 선단 약 2 cm를 직경 0.19∼0.20 mm로 실리콘 코팅한 봉합사(0.2호 계류용 낚시실, OWNER CO., LTD)를 우내경동맥을 따라서 약 0.9 cm 삽입함으로써 MCA를 허혈 상태로 했다. 경부 절개부를 봉합하여 마취로부터 깨우고, 허혈 1시간 후에 상기와 동일하게 마취하여, 봉합사를 뽑아내 MCA를 재관류시켰다. 모델 제작의 가부는, 재관류 직전의 신경 증상에 의해 판단했다. 즉, 동물의 꼬리를 잡아 매달 때, 좌측 앞다리를 굴곡하여, 몸통을 좌측으로 굴곡하는지의 여부로 판정했다. 또한, 우외경동맥 및 우총경동맥을 결찰할 뿐이며, 봉합사를 삽입하지 않는 개체를 제작하여, sham-operation군으로 했다.

신경 증상 점수(Modified Neurologic severity score; NSS)

비특허 문헌 8에 기재된 방법에 따라서, 점수를 붙였다. 즉 이하에 나타내는 증상이 관찰될 때, 항목마다 1 포인트로서 가산하여, 합계 포인트를 점수로 했다.

관찰은, 재관류 1, 3, 5, 7, 9, 14, 19 및 23일 후에 실시했다.

1 포인트가 되는 증상: 꼬리를 잡아 매달 때, 좌측 앞다리를 굴곡한다.

꼬리를 잡아 매달 때, 좌측 뒷다리를 굴곡한다.

꼬리를 잡아 매달 때, 몸통을 좌측으로 굴곡한다.

바닥에 두었을 때, 똑바로 걸 수 없다.

바닥에 두었을 때, 좌측으로 돈다.

바닥에 두었을 때, 좌측으로 기운다.

움직이지 않는다.

떤다.

발작을 일으킨다.

약제의 투여

PON(실시예 5에 의해 조제)은, 재관류 직후 및 재관류 1, 2, 3, 4, 5, 6일 후에 하루 1회 투여했다. 1회의 투여량은 10 mg/10 ml/kg 체중으로 했다. 대조로서, PON을 함유하지 않는 용매만을 동일 투여액량 투여했다(비히클군).

예의 수는 Sham군 5, 비히클군 3, PON 투여군 4로 했다. 결과를 도 1에 도시한다.

2) 운동 기능

시판되는 Rota-rod tredmill for mice(MK-600, 무로마치기카이 주식회사)를 이용하여 측정했다. 즉, 재관류 1, 3, 5, 7, 9, 14, 19, 23일 후에, 일정 스피드(설정 1)로 회전하는 막대 위를 회전 방향과는 역방향으로 걷게 하여, 걷기 시작한 시간부터 막대에서 떨어질 때까지의 시간을 측정했다. 보행 시간은 상한 200초로 했다. 마우스는 미리 시험 전 5일간 보행 연습시켜, 시험 전날에 200초 동안을 걸을 수 있었던 개체만을, 중대뇌동맥(MCA) 허혈 재관류 모델의 제작에 사용하게 했다. 그 외에는 1)과 마찬가지이다. 결과를 도 2에 도시한다.

이들 결과로부터, MCA 허혈 재관류 모델에 있어서 PON을 재관류 직후에 투여함으로써 신경 증상 및 운동 기능이 개선되는 것이 판명되었다. 즉, PON의 MCA 허혈 재관류 모델에 있어서의 예후 개선 효과가 확인되었다.

실험예 6

재관류 3시간 후에 PON을 초회 투여하는 것 이외에는 전부 실험예 5에 준하여 실험을 행하여, 신경 증상을 관찰했다. 예의 수는 Sham군 5, 비히클군 3, PON 투여군 4로 했다. 결과를 도 3에 도시한다.

또한 동일하게 운동 기능도 관찰했다. 예의 수는 Sham군 4, 비히클군 5, PON 투여군 4로 했다. 결과를 도 4에 도시한다.

이들 결과로부터, MCA 허혈 재관류 모델에 있어서 PON을 재관류 3시간 후에 투여함에 의해서도 신경 증상 및 운동 기능이 개선되는 것이 판명되었다. 즉, PON의 MCA 허혈 재관류 모델에 있어서의 예후 개선 효과는, PON의 초기 투여가 재관류 3시간 후의 경우에 있어서도 확인되었다.

본 발명에 의하면, 정제시·보존시의 안정성이 개선된 PON 함유 제제의 공급이 가능하다. 또한, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 유용한 신규한 의약품을 제공할 수 있다.

본 발명을 특정의 형태를 이용하여 상세히 설명했지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고서, 여러 가지 변경 및 변형이 가능한 것은 당업자에게 있어서 명백하다.

한편, 본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허 출원 2004-27727호(출원일: 2004년 2월 4일)를 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 전부 포함되는 것이다.

Claims

파라옥소나아제(PON) 및 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS)를 함유하는 PON 함유 제제.
제1항에 있어서, 폴리올을 더 함유하는 것인 제제.
제2항에 있어서, 폴리올이 글리세롤인 것인 제제.
PON 함유 용액을, 소수성 담체 처리하고, 이어서 CHAPS의 존재 하에 음이온 교환체 처리하는 것을 특징으로 하는 PON의 정제 방법.
제4항에 있어서, CHAPS 및 폴리올의 존재 하에 음이온 교환체 처리하는 것인 정제 방법.
제5항에 있어서, 폴리올이 글리세롤인 것인 정제 방법.
PON에 CHAPS를 첨가하는 것을 특징으로 하는 PON의 안정화 방법.
제7항에 있어서, 폴리올을 더 첨가하는 것인 안정화 방법.
제8항에 있어서, 폴리올이 글리세롤인 것인 안정화 방법.
PON을 유효 성분으로 하는, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색의 예방 및/또는 치료제.
제10항에 있어서, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 있어서의 예후, 신경 증상 또는 운동 기능을 개선하기 위해 사용되는 것인 예방 및/또는 치료제.
PON 및 CHAPS를 함유하는, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제.
제12항에 있어서, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 있어서의 예후, 신경 증상 또는 운동 기능을 개선하기 위해 사용되는 것인 약제.
제12항 또는 제13항에 있어서, 폴리올을 더 함유하는 것인 약제.
제14항에 있어서, 폴리올이 글리세롤인 것인 약제.
유효량의 PON을 투여하는 것을 포함하는, 허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 있어서의 예후, 신경 증상 또는 운동 기능을 개선하는 방법.
허혈 재관류에 따른 장애 및/또는 뇌경색에 있어서의 예후, 신경 증상 또는 운동 기능을 개선하기 위한 약제를 제조하기 위한 PON의 용도.