JP2000333674A - パラオキソナーゼに対するモノクローナル抗体及びこれを用いる動脈硬化の判定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】パラオキソナーゼに関連した、優れた動脈硬化
の判定手段を見出すこと。 【解決手段】パラオキソナーゼに対するモノクローナ
ル抗体、このパラオキソナーゼに対するモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ、このパラオキソナ
ーゼに対するモノクローナル抗体と、検体中のパラオキ
ソナーゼとの間における抗原抗体反応を利用する、検体
中のパラオキソナーゼの検出方法及びこの検出方法に
より検出された検体中のパラオキソナーゼの異常によ
り、検体提供者の動脈硬化を判定する方法を提供するこ
とにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、モノクローナル抗
体及びこれを用いた検体中の疾病に関する情報を検出す
る検出方法に関する技術分野の発明である。より具体的
には、本発明は、パラオキソナーゼについての、前記技
術分野の発明である。

【０００２】

【従来の技術】低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）あるい
はその酸化修飾されたリポプロテインは動脈硬化症発症
の引き金となり、また動脈硬化症を促進することで冠動
脈疾患（ＣＡＤ）へ進展させると考えられている。この
ような観点から、血中のＬＤＬコレステロールの上昇
は、冠動脈疾患の進展に対する優れた指標であると考え
られ、数多くの食事指導、あるいは薬剤などによるＬＤ
Ｌコレステロールを低下させる臨床冶験が試みられ、そ
の結果、ＬＤＬを低下させることが冠動脈疾患の低下に
つながるという多くの証拠が得られている。最近では、
４Ｓ（ScandinavianSimbastatin Survival Study ）の
臨床治験においてＣＡＤを有する高コレステロール血症
者における３０％のＣＡＤ発症の危険度をＣＡＤによる
死亡から４２％減少させているという結果が得られてい
る。また、プラバスタチンを服用している高コレステロ
ール血症患者を対象としたＷＯＳＣＯＰＳ（West of Sc
otlandCoronary Prevention Study）、あるいはロバス
タチンを服用している境界領域の高コレステロール血症
者を対象としたＡＦＣＡＰＳ／ＴｅｘＣＡＰＳ（the Ai
r Force/Texas Coronary Atherosclerosis Prevension
Study ）においては、両治験とも、血中のＬＤＬを減少
させる上記の薬剤が、冠動脈疾患の素因を減少させてい
ることが示されている。その他、多くのＬＤＬを低下さ
せる薬剤の単独並びに併用による、冠動脈撮影による臨
床治験においては、冠動脈肥厚の変化はわずかであるに
もかかわらず、ＣＡＤ発症の著明な改善が示されてい
る。

【０００３】

【発明が解決すべき課題】上述したように、ＨＭＧ−Ｃ
ｏＡ還元酵素阻害剤を代表とするスタチン系薬剤によ
り、ＣＡＤの発症は約１／３に減少したことが示された
わけある。しかしながら、このことは逆に、残り約２／
３は薬剤を服用しているにもかかわらずＣＡＤの危険に
さらされていることになる。このことは、未知の、発見
されていない冠動脈疾患のリスクファクター、例えば、
高血圧症、喫煙、糖尿病、肥満、低ＨＤＬコレステロー
ル血症等に挙げられるその他のリスクファクターの、冠
動脈疾患の発症における関与がさらに浮き彫りにされた
ことになる。また、これら血中コレステロールを低下さ
せる薬剤は、肝臓あるいは末梢組織でのコレステロール
の取り込みを亢進させ、あるいは腸管からの胆汁の吸収
を抑制することにより、血中コレステロールを低下させ
る薬剤である。それゆえ、血中での余剰のコレステロー
ルを低下させて、生体内、ひいては血中でのＬＤＬに対
する酸化ストレスによる影響を、上記の血中コレステロ
ールを低下させる薬剤の使用により緩和することは可能
ではあるが、これを完全に取り除いたわけではない。す
なわち、その血中濃度を低下させたといっても、血中に
循環しているＬＤＬは、依然、酸化ストレスの標的であ
ることには変わりはない。

【０００４】また、動脈硬化層のコレステロールの蓄積
は、末梢組織間において酸化修飾されたＬＤＬである
「酸化ＬＤＬ」が、マクロファージあるいは平滑筋中膜
の細胞にスカベンジャー受容体を介して取り込まれるこ
とによると考えられている。このような観点から、血中
における酸化ＬＤＬを測定することが、動脈硬化の発
症、および進展を知る上で重要と考えられる。しかしな
がら、かかる酸化ＬＤＬは末梢で酸化され、速やかにマ
クロファージに取り込まれることから、血中には、この
ような酸化ＬＤＬは存在しないか、あるいは極めて微量
で存在するに過ぎないと考えられる。

【０００５】一方、高密度リポプロテイン（ＨＤＬ）
は、肝以外の末梢組織よりフリーコレステロールを引き
抜き、引き抜いたコレステロールを、肝臓へ運ぶ役割を
していることが知られている。すなわち、ＨＤＬは、コ
レステロール逆転送系の主な役割を担っており、末梢組
織でのコレステロールの蓄積に拮抗的に働き、生体内で
は抗動脈硬化的に作用していることが知られている。し
かしながら、ＨＤＬの代謝については、明確には解明さ
れておらず、どのようにＨＤＬが生体内で抗動脈硬化的
に作用しているのかは未だ明らかにされていない。

【０００６】近年、ＨＤＬの抗酸化作用は、ＨＤＬを構
成している蛋白成分、例えば、アポプロテインＡｌ、Ｌ
ＣＡＴ、パラオキソナーゼ、ＰＡＦ−ＡＨ、ＣＥＴＰ、
ＰＬＴＰ、アポプロテインＪ等に起因していることが提
唱されている。とりわけ、パラオクソン、有機リン、神
経ガスのサリンなどのaromatic carboxylic acidを加水
分解する血清酵素であるパラオキソナーゼについては、
近年抗動脈硬化作用が示されている（Mackness,et al.,
Curr Opin Lipidol,1996;7:69-76）。さらに、パラオキ
ソナーゼは抗酸化作用を有するＨＤＬ結合蛋白であり、
酸化修飾により、動脈硬化を促進する炎症性の分子を破
壊することにより、ＣＡＤへのリスクを軽減していると
いう報告がある（Heinecke,et al.,Am J Hum Genet,199
8;62:20-24）。

【０００７】また、ヒトのパラオキソナーゼの遺伝子
は、第７染色体の長腕ｑ２１−ｑ２２に局在し、血中の
パラオキソナーゼ活性は広範囲にわたることが示されて
おり、これはパラオキソナーゼの１９２番目にコードさ
れているアミノ酸の多型（Ｇｌｎ／Ａｒｇ）によるもの
であることが知られている。前記の１９２番目のアミノ
酸がグルタミンであるＡタイプは、パラオキソナーゼ活
性が低く、アルギニンであるＢタイプは、同活性が約８
倍高い。

【０００８】ＨＤＬ結合パラオキソナーゼが、銅イオン
によるＬＤＬの酸化を阻害すること（Mackness,et al.,
FEBS Lett,1991;286:152-154）、これはＨＤＬがＬＤＬ
の酸化を阻害することにより動脈硬化へのリスクを軽減
しているという仮説を裏付ける事実である。また、パラ
オキソナーゼが酸化修飾されたＬＤＬの酸化リン脂質を
取り除く作用を有するという報告もなされている（Wats
on,et al.,J Clin Invest,1995;96:2882-2891 ）。Ｂタ
イプのパラオキソナーゼとＣＡＤの関連性について多く
の報告があるが、これは、パラオキソナーゼ活性の高い
Ｂタイプの頻度がＡタイプの頻度と比較して、ＣＨＤに
おいて高いことと関連している。さらに、ジーンターゲ
ッティングにより作出したパラオキソナーゼ欠損マウス
は、細菌毒素に対して感受性であり、このマウスから分
離されたＨＤＬはＬＤＬ酸化に対して抗酸化作用を示さ
ず、野生型マウスに比して動脈硬化を発症しやすいこと
が報告されている（Shih,et al.,Nature,1998;394:284-
287 ）。

【０００９】上述したごとく、パラオキソナーゼが、生
体内において抗酸化作用を発揮することが推測されてお
り、パラオキソナーゼが生体内で生じる酸化ストレスに
対し、予防的に働き消費されるのであれば、その活性と
蛋白量を測定すれば、生体内の酸化ストレス、さらには
動脈硬化のレベルを知ることが可能となる。

【００１０】パラオキソナーゼの蛋白定量系について
は、Ｋａｗａｉらのモノクローナル抗体を用いたＥＬＩ
ＳＡ法による定量法が報告されている（Clin Chim Act
a,1991;202:219-226 ）。しかしながら、彼らの用いた
モノクローナル抗体は、血漿より精製したアリルエステ
ラーゼ活性を有する蛋白に対するモノクローナル抗体で
あり、その蛋白の精製品における詳細な記載は認められ
ない。また、疾患との関連性も、肝硬変を患った患者群
と健常者との比較を示したのみであり、血清パラオキソ
ナーゼが、肝臓で合成されることを考えると、かかる臨
床検査は、動脈硬化症との関連性は極めて薄い。また、
最近、Blatter-Garin らのＥＬＩＳＡ法(Blatter-Gari
n,et al.,Biochem J,1994;304:549-554）は、パラオキ
ソナーゼに対する一種類のモノクローナル抗体を用いた
競合ＥＬＩＳＡ法による測定系であり、特異性、再現
性、感度の点で信頼性に乏しい面があることは否めな
い。

【００１１】そこで、本発明において解決すべき課題
は、パラオキソナーゼに関連した、優れた動脈硬化の判
定手段を見出すことである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】この課題を解決するため
に、本発明者は、ヒト血漿に存在するパラオキソナーゼ
を単離・精製し、この精製パラオキソナーゼを免疫抗原
とするモノクローナル抗体を製造し、このモノクローナ
ル抗体に基づく抗原抗体反応を利用した、パラオキソナ
ーゼの検出方法を利用することにより、的確に被検者の
動脈硬化を判定することが可能であることを見出し、本
発明を完成した。

【００１３】すなわち、本発明者は、パラオキソナー
ゼに対するモノクローナル抗体（以下、本発明モノクロ
ーナル抗体ともいう）、本発明モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ（以下、本発明ハイブリドーマ
ともいう）、本発明モノクローナル抗体と、検体中の
パラオキソナーゼとの間における抗原抗体反応を利用す
る、検体中のパラオキソナーゼの検出方法（以下、本発
明検出方法ともいう）及び本発明検出方法により検出
された検体中のパラオキソナーゼの量的・質的な異常を
指標として、検体提供者の動脈硬化を判定する方法（以
下、本発明判定方法ともいう）を提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。 Ａ．本発明モノクローナル抗体ないし同ハイブリドー
マ：本発明モノクローナル抗体は、上述のように、パラ
オキソナーゼに対するモノクローナル抗体である。

【００１５】このようなモノクローナル抗体を得るため
の前提条件として、適切な免疫抗原を選択して用いるこ
とが必要である。本発明においては、免疫抗原として、
ヒトに由来するパラオキソナーゼを用いることが好まし
い。具体的には、例えば、ヒトの血漿に由来するパラオ
キソナーゼを精製して用いることが、本発明検出方法に
おいては、血液検体を特に好適に用いる点及び単離・精
製操作が比較的簡便である等の点において好ましい。

【００１６】血漿からのパラオキソナーゼの単離・精製
は、公知の方法、例えば、Ｇａｎらの方法（Gan,et a
l.,Drug Metabolism and Disposition,19:100-106,199
1: 具体的には、後述する）に従って行うことができ
る。

【００１７】また、免疫抗原として、タンパク質工学的
な手法を用いて得られる、組換えパラオキソナーゼを、
本発明において用いることも可能である。かかる組換え
パラオキソナーゼは、既に知られているパラオキソナー
ゼ遺伝子の塩基配列（Hassett,et al.,Biochemistry,3
0,10141,1991)を基にして、常法、例えば、ＰＣＲ法等
の遺伝子増幅法を、ヒトのゲノムＤＮＡに直接施すこと
により、所望するパラオキソナーゼ遺伝子を入手するこ
とが可能である。

【００１８】すなわち、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、パラ
オキソナーゼ遺伝子の５’末端側と３’末端側の配列を
含むＤＮＡ断片をプライマーとして、ＰＣＲ法等の遺伝
子増幅法により、パラオキソナーゼ遺伝子を大量に増幅
して入手することもできる。

【００１９】さらに、ホスファイト−トリエステル法(I
kehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5956
(1984)) 等の、通常公知の方法を用いて、パラオキソナ
ーゼ遺伝子を化学合成することも可能であり、このよう
な化学合成法を応用したＤＮＡシンセサイザーを用い
て、パラオキソナーゼ遺伝子を合成することもできる。

【００２０】上述のようにして入手され得るパラオキソ
ナーゼ遺伝子を用いて、本発明モノクローナル抗体とし
て用い得る、組換えパラオキソナーゼを、一般的な遺伝
子組換え技術に従って製造することができる。

【００２１】より具体的には、パラオキソナーゼ遺伝子
が、発現可能な形態の遺伝子発現用ベクターに、パラオ
キソナーゼ遺伝子を組み込み、この遺伝子発現用ベクタ
ーの性質に対応する宿主に、この組換えベクターを導入
して形質転換し、この形質転換体を培養等することによ
り、所望するパラオキソナーゼを製造することができ
る。

【００２２】本発明モノクローナル抗体の免疫抗原とし
ては、上述のようにして得られるパラオキソナーゼの全
部又は一部を用いることができる。また、例えば、パラ
オキソナーゼの一部を抗原決定基として用いる場合のよ
うに、用いるパラオキソナーゼが小分子量の場合には、
必要に応じてハプテンに結合したパラオキソナーゼを免
疫抗原とすることも可能である。

【００２３】本発明モノクローナル抗体を製造するため
に、上述のようにして得られる免疫抗原で免疫される動
物も、特に限定されるものではなく、マウス、ラット等
を広く用いることが可能であり、細胞融合に用いる骨髄
腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。

【００２４】免疫は一般的方法により、例えば上記免疫
抗原を免疫の対象とする動物に静脈内、皮内、皮下、腹
腔内等で投与することにより行うことができる。より、
具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュバ
ントと併用して、免疫の対象とする動物に、２週間程度
毎に、上記手法により数回投与し、本発明モノクローナ
ル抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞
を得ることができる。

【００２５】モノクローナル抗体を製造する場合、この
免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細
胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ
１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４
５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．Ｒ
ＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００
７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等
を用いることができる。

【００２６】上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融
合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイ
ンの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495
(1975)）等に準じて行うことができる。

【００２７】より具体的には、この細胞融合は、通常公
知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）又はセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下におい
て、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド
等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で
行い、ハイブリドーマを調製する。

【００２８】所望のハイブリドーマの分離は、通常の選
別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテ
リン及びチミジン）培地で培養することにより行うこと
ができる。すなわち、この選別用培地において目的とす
るハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間
をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行
うことができる。このようにして得られるハイブリドー
マは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナ
ル抗体の検索及び単一クローン化に供することができ
る。

【００２９】目的とするモノクローナル抗体産生株の検
索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，
凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検
索法に従い行うことができる。

【００３０】このようにして得られるパラオキソナーゼ
を認識する本発明モノクローナル抗体を産生する本発明
ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可
能であり、さらに液体窒素中で長時間保存することもで
きる。

【００３１】本発明ハイブリドーマからの本発明モノク
ローナル抗体の採取は、このハイブリドーマを常法に従
って培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブ
リドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動
物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用
いることができる。

【００３２】なお、インビトロで免疫細胞をパラオキソ
ナーゼ又はその一部の存在下で培養し、一定期間後に上
記細胞融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細胞と
のハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリドーマを
スクリーニングすることで本発明モノクローナル抗体を
得ることもできる（Reading,C.L.,J.Immunol.Meth.,53,
261(1982)；Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Biol.,96,114
9(1983））。

【００３３】また、上記のようにして得られるモノクロ
ーナル抗体は、更に塩析，ゲル濾過法，アフィニティク
ロマトグラフィー等の通常の手段により精製することが
できる。

【００３４】このようにして得られる本発明モノクロー
ナル抗体は、パラオキソナーゼに特異反応性を有する抗
体である。なお、この「パラオキソナーゼに特異反応性
を有する」とは、本発明モノクローナル抗体は、少なく
とも、ヒトのパラオキソナーゼに対しては交差反応性を
示すという意味である。

【００３５】このような性質の本発明モノクローナル抗
体は、後述するように、臨床において用い得ることは勿
論のこと、パラオキソナーゼ自体の分離・精製のための
試薬としても極めて有用である。

【００３６】本発明モノクローナル抗体についてのさら
に具体的な内容は、実施例において後述する。このよう
にして得られる本発明モノクローナル抗体を、必要に応
じて標識物質で標識して、後述する本発明に係わる測定
方法等において用いることができる。

【００３７】かかる標識物質は、その標識物質単独で又
はその標識物質と他の物質とを反応させることにより、
検出可能なシグナルをもたらす標識物質であり、具体的
には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホ
スファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，グルコース
オキシダーゼ，グルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ，アルコール脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵
素，ペニシリナーゼ，カタラーゼ，アポグルコースオキ
シダーゼ，ウレアーゼ，ルシフェラーゼ若しくはアセチ
ルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソ
チオシアネート，フィコビリタンパク，希土類金属キレ
ート，ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート等の蛍光物質、¹²⁵Ｉ，¹⁴Ｃ，³
Ｈ等の放射性同位体、ビオチン，アビジン若しくはジゴ
ケシゲニン等の化学物質、又は化学発光物質等を挙げる
ことができる。

【００３８】これらの標識物質による、本発明モノクロ
ーナル抗体の標識方法は、選択すべき標識物質の種類に
応じて、既に公知となっている標識方法を適宜用いるこ
とができる。

【００３９】また、本発明モノクローナル抗体（標識さ
れたものを含む）を、不溶性担体に固定化した、固定化
モノクローナル抗体として、後述する本発明に係わる測
定方法等に用いることもできる。

【００４０】さらに、本発明モノクローナル抗体は、必
要に応じて、不溶性担体に固定化して用いることができ
る。かかる不溶性担体としては、抗体の不溶性担体とし
て既に用いられている各種の不溶性担体を用いることが
できる。具体的には、例えば、マイクロプレートに代表
されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、
フィルター、メンブレン、あるいはセルロース系担体、
アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキス
トラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコ
ール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは多孔性シリ
カ系担体等のアフィニティークロマトグラフィーにおい
て用いられる不溶性担体等が挙げられる。

【００４１】これらの不溶性担体における、本発明モノ
クローナル抗体の固定化方法は、各種の不溶性担体にお
いて既に確立している抗体の固定化方法を、選択すべき
不溶性担体の種類に応じて、適宜選択することができ
る。

【００４２】Ｂ．本発明検出方法：本発明検出方法は、
上述したように、本発明モノクローナル抗体と、検体中
のパラオキソナーゼとの間における抗原抗体反応を利用
する、パラオキソナーゼの検出方法である。

【００４３】このような本発明検出方法の様態として
は、例えばエンザイムイムノアッセイ法、ラジオイムノ
アッセイ法、フルオロメトリーによる解析、ウエスタン
ブロット法等を挙げることができるが、一般的には、エ
ンザイムイムノアッセイ法による解析による方法を選択
することが望ましい。 エンザイムイムノアッセイ法
は、酵素免疫定量法ともいい、標識イムノアッセイ法の
うち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。エ
ンザイムイムノアッセイ法には、いわゆるＢ／Ｆ分離を
必要とする"heterogeneous enzyme immunoassay"と、こ
のＢ／Ｆ分離を必要としない"homogeneous enzyme immu
noassay"とに大別される。本発明検出方法においては、
これらのうち、一般的に測定感度が高いといわれる、前
者の"heterogeneous enzyme immunoassay"を選択するこ
とが好ましく、イムノソルベントを用いる、"enzyme-li
nked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）”を選択する
ことがさらに好ましい。

【００４４】より具体的な検出態様として、いわゆるサ
ンドイッチ法によるエンザイムイムノアッセイ法（以
下、サンドイッチ法ともいう）を例示することができ
る。かかるサンドイッチ法は、特に、操作上の簡便性、
経済上の利便性、とりわけ臨床検査としての汎用性を考
慮すると、特に好ましい検出態様の一つである。

【００４５】このサンドイッチ法を行うに際しては、本
発明モノクローナル抗体が、９６穴マイクロプレートに
代表されるような、多数のウエルを有するマイクロプレ
ートに固定化された、固定化モノクローナル抗体と、西
洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素又はビオチンにより
標識された、本発明モノクローナル抗体を用いることが
好ましい。

【００４６】サンドイッチ法は、少なくとも、下記(a)
及び(b) の工程を含む、エンザイムイムノアッセイ法で
ある。 (a) 不溶性担体に、本発明モノクローナル抗体を固定化
した、固定化モノクローナル抗体に、血液検体等の検体
を反応させる工程。

【００４７】この工程(a) においては、通常は、反応
後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の検体
は、固定化モノクローナル抗体から除去される。 (b)固定化モノクローナル抗体と、試料中のパラオキソ
ナーゼとの結合により形成される、抗原抗体複合体に、
西洋ワサビペルオキシダーゼやビオチン等により標識さ
れた本発明モノクローナル抗体を反応させる工程。

【００４８】この工程(b) においては、通常は、反応
後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の標識さ
れた本発明モノクローナル抗体は、固定化モノクローナ
ル抗体から除去される。

【００４９】また、この工程(b) においては、反応させ
た第２抗体における標識物質の種類に応じた標識シグナ
ルの発現手段を用いて、標識シグナルを顕在化させるこ
とができる。例えば、標識物質としてビオチンを選択し
た場合には、アビジンやストレプトアビジンを用いて、
標識シグナルを顕在化させることができる。また、例え
ば、標識物質として、西洋ワサビペルオキシダーゼを選
択した場合には、その基質を必要に応じて発色物質と共
に添加して、標識シグナルを顕在化することができる。

【００５０】このようにして、顕在化した発色シグナル
を、その発色シグナルの種類に応じた、シグナルの特定
手段を用いて検出することで、所望する検体中のパラオ
キソナーゼの検出を行うことができる。

【００５１】なお、本発明検出方法において用いられる
検体は、本来、パラオキソナーゼが存在する検体であれ
ば特に限定されないが、後述する本発明判定方法が、動
脈硬化について判定する方法であることや、本発明の臨
床検査としての適応等を考慮すると、血漿等の血液検体
であることが好ましい。

【００５２】本発明検出方法の検出対象である、検体中
のパラオキソナーゼ量は、被検者の動脈硬化の進展度合
いの有力な指標となる。すなわち、本発明検出方法によ
り検出された検体中のパラオキソナーゼの異常により、
検体提供者の動脈硬化を判定する、本発明判定方法が提
供される。

【００５３】本発明判定方法においては、動脈硬化が進
展していなければ、検体中のパラオキソナーゼ量が正常
値（８０±２５μg ／ml程度）であるが、動脈硬化が進
展している場合には、生体が動脈硬化に際しての過酷な
酸化ストレスに対抗するために、パラオキソナーゼが大
量に消費されてしまうことになり、量的に低値を示す
か、あるいは質的に異常を示すかによって、動脈硬化の
判定がなされる。

【００５４】すなわち、本発明判定方法においては、本
発明検出方法を用いて、血液検体等の検体中のパラオキ
ソナーゼ量が、正常値よりも少ないか、又は質的に異な
れば、動脈硬化の進展が認められることを判定可能であ
り、本発明判定方法で、「動脈硬化陽性」と判定された
検体提供者に対して、具体的な症状、例えば、狭心症、
心筋梗塞、脳梗塞等が現れる前に、適切な処置を行うこ
とが可能であり、極めて、予防医学上、有用な方法であ
る。なお、本発明判定方法の有用性については、後述す
る実施例において、具体的に述べる。

【００５５】本発明においては、本発明モノクローナル
抗体を、本発明判定方法（本発明検出方法を含む）にお
いて用いるための、本発明モノクローナル抗体を含む動
脈硬化判定用キットも提供される〔以下、本発明判定用
キット（本発明検出用キット）という〕。

【００５６】本発明判定用キットにおいては、本発明モ
ノクローナル抗体を、検体中のパラオキソナーゼの異常
の検出のために供するための要素、例えば、前記の標識
された本発明モノクローナル抗体や固定化された本発明
モノクローナル抗体等が含まれ得る。

【００５７】本発明判定用キットも、上述した本発明判
定方法（本発明検出方法）に対応して、サンドイッチ法
やフルオロメトリーによる判定や検出を容易に行い得る
構成のキットであることが好ましい。

【００５８】

【実施例】以下、本発明を実施例を用いて具体的に説明
するが、この実施例は、本発明の技術的範囲を限定解釈
するべきものではない。パラオキソナーゼ活性測定法 パラオキソナーゼ活性測定はＥｃｋｅｒｓｏｎらの方法
（Am J Hum Genet,35:214-227,1983）に準じて行った。
すなわち、１．０mM ｐａｒａｏｘｏｎ（シグマ社製）
の基質を添加した１．０mM ＣａＣｌ₂ 含有５０mMグリ
シン緩衝液（ｐＨ １０．５）０．２mlの反応液に１０
μl の予めＰＢＳにて１０倍に希釈した血清、あるいは
精製分画を加え、２５℃の条件下で酵素の加水分解によ
り生じるｐ−ニトロフェノールの遊離を分光光度計にて
波長λ＝４１２nmの吸光度の増加を経時的に測定した。
血清および検体のパラオキソナーゼ活性は試料中のパラ
オキソナーゼ活性からバックグランド（非酵素学的反応
により分解され遊離されるｐ−ニトロフェノール）を差
し引いた活性をパラオキソナーゼ活性とした。パラオキ
ソナーゼ活性１Ｕは１分間に１nmolのｐ−ニトロフェノ
ールを遊離する酵素活性と定義される。

【００５９】アリルエステラーゼ活性測定法 アリルエステラーゼ活性測定は、Ｅｃｋｅｒｓｏｎらの
方法（Am J Hum Genet,35:214-227,1983）に準じて行っ
た。すなわち、１mM phenylacetate（和光純薬社製）を
添加した１．０mM ＣａＣｌ₂ を含む２０mM トリス緩
衝液（ｐＨ８．０）０．２mlの反応液に１０μl の予め
ＰＢＳにて１００倍に希釈した血清、あるいは精製分画
を加え、２５℃の条件下で酵素の加水分解により生じる
フェノールの遊離を分光光度計にて、波長λ＝２７０nm
の吸光度の増加を経時的に測定した。血清および検体の
アリルエステラーゼ活性は、試料中のアリルエステラー
ゼ活性からバックグランド（非酵素学的反応により分解
され遊離されるフェノール）を差し引いた活性をアリル
エステラーゼ活性とした。アリルエステラーゼ活性１Ｕ
は１分間に１μmol の phenylacetateを加水分解する酵
素活性と定義される。

【００６０】パラオキソナーゼの精製 血漿からのパラオキソナーゼの精製はＧａｎらの方法
（Drug Metabolism andDisposition,19:100-106,1991
）に準じて行った。すなわち、２種類の樹脂ブルーア
ガロースCibacron blue F3GA-agarose（シグマ社製）、
および陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥイオン交換樹脂（ファ
ルマシア社製）を用いた３ステップによる方法を用い
て、パラオキソナーゼの精製を行った。

【００６１】ブルーアガロースクロマトグラフィー ４００mlの血漿に、４mlの１．０Ｍ ＣａＣｌ₂ を加
え、終濃度１０mMとした。室温にて２時間攪拌後、血漿
を、４℃、５０００ｇ、２０分間遠心分離し、フィブリ
ン塊を取り除いた。次いで、４００mlの血漿に対し予め
３Ｍ ＮａＣｌ含有カラムバッファー（１．０mM Ｃａ
Ｃｌ₂ 、および５μM ＥＤＴＡ含有５０mMトリス緩衝
液、ｐＨ８．０）にて平衡化した４００mlのブルーアガ
ロース（Cibacron blue F3GA-agarose）と室温にて混和
し、３Ｍ ＮａＣｌ含有カラムバッファーを加え全量を
２Ｌとし、室温で混和した。次いで、ブルーアガロース
ゲルに結合したパラオキソナーゼを濾紙（Ｎｏ．３、ワ
ットマン社製）を装着したブチャーファネル（井内盛栄
堂社製）で、全量をろ過した。さらに、６００mlの３Ｍ
ＮａＣｌ含有カラムバッファーで５回洗浄した。洗浄
後、ブルーアガロースゲルを６００mlのカラムバッファ
ーにて２回洗浄した。洗浄後、ブルーアガロースゲルの
スラリーをカラム（２．６×４０ｃｍ、ファルマシア社
製）にカラムバッファーを用いて充填した。次いで、
０．１％デオキシコーレート含有カラムバッファーにて
パラオキソナーゼを溶出した。溶出ファラクションは各
々１０mlずつチューブに分取した。分取した各フラクシ
ョンの蛋白濃度（２８０nmの吸光度）、およびパラオキ
ソナーゼ活性を上述のごとく測定した。その結果、フラ
クションＮｏ．２４〜Ｎｏ．３０の画分に蛋白とパラオ
キソナーゼ活性が認められた（第１図）。このようにし
て得られたパラオキソナーゼ活性が認められる分画Ｎ
ｏ．２４〜Ｎｏ．３０のフラクションをまとめてパラオ
キソナーゼのブルーアガロース分画とした。

【００６２】イオン交換クロマトグラフィー 上述のごとく得られたブルーアガロース分画に同等量の
０．２％Nonidet P-40（ナカライテスク社製）含有トリ
スバッファー（１mM ＣａＣｌ₂ 、４０％グリセロー
ル、および５μM ＥＤＴＡ含有２５mM Ｔｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．０）を加え、混和した。さらに、予め
０．１％Nonidet P-40含有トリスバッファー（１mM Ｃ
ａＣｌ₂ 、２０％グリセロール、および５μM ＥＤＴ
Ａ含有２５mMＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化
した陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥセファロース（ファルマ
シア社製）を等量加え、混和した。この懸濁液を、５０
mlのファルコンチューブに移し、低速にて遠心分離し、
上清を捨てる。さらに、ＤＥＡＥセファロースに０．１
％Nonidet P-40含有トリスバッファー（１mM ＣａＣｌ
₂ 、２０％グリセロール、および５μM ＥＤＴＡ含有
２５mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し、再
度遠心し、洗浄した。この洗浄操作を４回繰り返した
後、ＤＥＡＥセファロースをカラム（１．６×４０cm、
ファルマシア社製）に充填した。次いで、０．１％Noni
det P-40含有トリスバッファー（１mM ＣａＣｌ₂ 、２
０％グリセロール、および５μM ＥＤＴＡ含有２５mM
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ＰＨ８．０）を用いて、塩濃度０
〜０．３５Ｍ ＮａＣｌのグラディエントでパラオキソ
ナーゼを溶出した。溶出ファラクションは、各々１０ml
ずつチューブに分取した。分取した各フラクションの蛋
白濃度、およびパラオキソナーゼ活性を上述のごとく測
定した。その結果、フラクションＮｏ．４０〜Ｎｏ．５
０の画分にパラオキソナーゼ活性が認められた（第２
図）。このようにして得られたパラオキソナーゼ活性が
認められる分画Ｎｏ．４０〜Ｎｏ．５０のフラクション
をまとめてパラオキソナーゼのＤＥＡＥ I 分画とし
た。

【００６３】上述のごとく得られたＤＥＡＥ分画に、同
等量の０．１％Nonidet P-40含有トリスバッファー（１
mM ＣａＣｌ₂ 、２０％グリセロール、および５μM
ＥＤＴＡ含有２５mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）
を加えて混和し、カラム（１．０×１０cm、ファルマシ
ア社製）に充填した。次いで、０．１％Nonidet P-40含
有トリスバッファー（１mM ＣａＣｌ₂ 、２０％グリセ
ロール、および５μMＥＤＴＡ含有２５mM Ｔｒｉｓ／
ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて塩濃度０〜０．３５Ｍ
ＮａＣｌのグラディエントでパラオキソナーゼを溶出し
た。各分画のパラオキソナーゼ活性を上述のごとく測定
し、活性画分をＤＥＡＥ II分画（精製パラオキソナー
ゼ）とした（第３図）。

【００６４】パラオキソナーゼの性状 上述のごとく得られた精製パラオキソナーゼ（ＤＥＡＥ
II分画）の蛋白濃度はＢＣＡ法（ピアース社製のキッ
トによる）を用いて求めたところ、０．５mg／mlであっ
た。さらに、精製パラオキソナーゼのパラオキソナーゼ
活性、およびアリルエステラーゼ活性を上述のごとく測
定し、パラオキソナーゼ活性の比活性を求めたところ、
４０００nmol／min ／mg、および１０００μmol ／min
／mgであった。また、精製パラオキソナーゼの精製度
は、１０％ポリアクリルアミド電気泳動を行った後、ゲ
ルを銀染色（第一化学社製）にて確認した。その結果、
精製パラオキソナーゼは分子量約４６ｋＤａの単一蛋白
であることが認められ、Ｂｌａｔｔｅｒ−Ｇａｒｉｎら
(Biochem J.,1994,304:549-554）、あるいはＧａｎらの
報告による分子量約４５ｋＤａとほぼ同ーの結果であっ
た（第４図）。

【００６５】本発明ハイブリドーマの調製 上述の如く精製した精製パラオキソナーゼ（５０μg ／
ml）を、等量のフロイント完全アジュバントと混和し、
その０．４mlを７週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（雌、日本
ＳＬＣ社）の腹腔に免疫した。２週間後、フロイント不
完全アジュバントを使用して同様に追加免疫を行い、そ
れ以降は２週間に１回、計４回免疫した。

【００６６】最終免疫３日後のマウスの脾細胞４×１０
⁸ 個を、マウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４
（４×１０⁷ 個））と混和し、５０％ポリエチレングリ
コール（平均分子量１５００、ベーリンガーマンハイム
社製）ＰＢＳ溶液を用いて細胞融合を行った。

【００６７】処理後の細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地
（ギブコ社製）中に、９６ウエルプレートにウエル当た
り５×１０⁵ 個の割合になるように播き、翌日からＨＡ
Ｔ試薬（シグマ社製）を添加し、７日間選択培養を行っ
たところ、ほぼ全ウエルにハイブリドーマの増殖が認め
られた。

【００６８】各ハイブリドーマの培養上清中のヒトパラ
オキソナーゼに対して特異的なモノクローナル抗体の有
無は、精製パラオキソナーゼを抗原としたＥＬＩＳＡ法
でスクリーニングした。すなわち、精製パラオキソナー
ゼをウエル当たり５０ngずつ固相化した９６ウエルマイ
クロプレート（固定化精製ヒトパラオキソナーゼプレー
ト）にハイブリドーマの培養上清を５０μl 添加し、室
温下で２時間反応させた（一次反応）。次いで、プレー
トを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで６回洗浄し
た後、同ＰＢＳで４０００倍に希釈したパーオキシダー
ゼ標識ウサギ抗マウスｌｇＧ抗体（Zymed laboratories
社製）を５０μl 加え、室温で１時間反応させた（二次
反応）。反応後、プレートを上記ＰＢＳにて６回洗浄
後、０．０１５％過酸化水素を含む０．２５mg／mlＯＰ
Ｄ溶液（シグマ社製）を各ウエルに１００μl 加え、室
温で３０分間反応させた（基質反応）。反応後、さらに
各ウエルに、２Ｎ硫酸を５０μl 加えて反応を停止し
た。そして、波長４９２nmの吸光度をマイクロプレート
リーダー（ラボシステム社製）で測定した。この結果、
吸光度が１．０以上のハイブリドーマ培養上清を陽性と
した。上記のスクリーニング方法で陽性であったハイブ
リドーマ培養上清について、さらにウエスタンブロット
法でヒト血漿中のパラオキソナーゼとの反応性を確認
し、上記精製パラオキソナーゼを抗原としたＥＬＩＳＡ
法、およびヒト血漿のウエスタンブロット法にて特異性
が認められたクローンを選別した。

【００６９】このように特異性が認められたハイブリド
ーマについて、ＨＴ試薬（シグマ社製）を添加したＲＰ
ＭＩ１６４０培地において、９６ウエルプレートに、ウ
エル当たり０．５個の細胞を播く操作を３回繰り返して
クローニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドー
マ（４Ｃ−１、５−１０Ｄ）が得られた。なお、これら
のハイブリドーマは、mouse hybridoma PON 4C-1（受
託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１７３８５：以下、「４Ｃ−
１」とも記載する）及びmouse hybridoma PON5-10D
（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１７３８６：以下、「５−
１０Ｄ」とも記載する）として、工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている。

【００７０】本発明モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体の大量精製 Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、８週齢、１０匹、日本ＳＬＣ
社）に、上述のようにして得られたハイブリドーマ（４
Ｃ−１、５−１０Ｄ、（各々１０⁶ から１０⁷個／０．
５ml／マウス））の各々を、腹腔内注射により導入し
た。導入１０日後、マウスを麻酔下で開腹し、常法によ
り採取した腹水からモノクローナル抗体（４Ｃ−１、５
−１０Ｄ）を大量に精製した。

【００７１】アイソタイプの決定 マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用キット
（サングスタットメディカル社製）を用い、このキット
に添付の実験操作プロトコールに従って操作を行い、モ
ノクローナル抗体（４Ｃ−１、５−１０Ｄ）のアイソタ
イプを決定した。その結果、モノクローナル抗体４Ｃ−
１のアイソタイプはｌｇＧ２ｂで、同５−１０Ｄはｌｇ
Ｇ１であった。

【００７２】モノクローナル抗体の精製 上述のモノクローナル抗体（４Ｃ−１、５−１０Ｄ）を
含む腹水を各々遠心分離し、各々の上清（各５ml）に５
mlの飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて混和し、２時間
氷冷にて放置した後、４℃、１００００×ｇで１０分間
遠心した。遠心後、沈殿物をバインディングバッファー
（３Ｍ塩化ナトリウム／１．５Ｍグリシン溶液、ｐＨ
８．９）に溶解し、プロテインＡセファロース（ファル
マシア社製）１mlと混和し、４℃で一晩転倒混和した。
翌日、プロテインＡセファロースをカラムに充填し、バ
インディングバッファー６mlで６回洗浄後、溶出バッフ
ァー（０．１Ｍクエン酸溶液、ｐＨ４．０）２mlずつで
溶出し、溶出回収した各々の溶液を、２Ｍトリス溶液
（ｐＨ１０．０）０．２mlで中和した。各溶出フラクシ
ョンの吸光度（波長２８０nm）を測定し、モノクローナ
ル抗体の溶出画分を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）にて透析（４℃、２４時間）し、精製モノクローナ
ル抗体（４Ｃ−１、５−１０Ｄ）を得た。

【００７３】本発明モノクローナル抗体の性状解析 ヒト血漿に対する反応性 上述のようにして得られた精製モノクローナル抗体（４
Ｃ−１、５−１０Ｄ）のヒト血漿に対する反応性は、ヒ
ト血漿を用いたウエスタンブロット法で確認した。ヒト
血漿試料は０．５μl ／レーンの濃度で１０％ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動を行った。次いで、ゲルをＰＶＤＦ膜（ミリポア社
製）に転写した。さらに、転写膜をブロッキング試薬
（５％スキムミルク含有ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中にて４
℃、一晩インキュベートした。次いで、転写膜を０．１
％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５回洗浄
後、上記の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで１μg
／mlの濃度に調製した各精製モノクローナル抗体（４Ｃ
−１、５−１０Ｄ）を室温下で２時間反応させた。反応
後、膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５回洗浄
し、同０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４０００倍
に希釈した２次抗体（ＨＲＰ標識マウスｌｇＧ抗体：Zy
med Laboratories社製）を室温で１時間反応させた。反
応後、膜を同０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５回
洗浄し、ケミルミ試薬（ＮＥＮライフサイエンスプロダ
クト社製）を１分間反応させた。次いで、ケミルミ試薬
を取り除き、Ｘ線フィルムに感光後、フィルムを現像し
反応バンドを検出した。この結果、各精製モノクローナ
ル抗体（４Ｃ−１、５−１０Ｄ）のヒト血漿に対する反
応性は、分子量約４６kDa の蛋白と反応していることが
確認された（第５図）。この結果は、Ｇａｎらが報告し
ている血漿のパラオキソナーゼの分子量約４５kDa とほ
ぼ同様の結果であり、各本発明精製モノクローナル抗体
（４Ｃ−１、５−１０Ｄ）は、血漿中のパラオキソナー
ゼを特異的に結合する抗体であることが示された。

【００７４】精製パラオキソナーゼに対する反応性 上述のようにして得られた精製モノクローナル抗体（４
Ｃ−１、５−１０Ｄ）の精製パラオキソナーゼに対する
反応性は、ヒト血漿より精製した精製パラオキソナーゼ
を用いたＥＬＩＳＡで確認した。

【００７５】上述のようにして得られた精製パラオキソ
ナーゼ１μg ／mlを５０μl ／ウエルで９６ウエルマイ
クロプレートに固相化した（精製パラオキソナーゼ固相
化プレート）。次いで、各ウエルの未反応の抗体を捨
て、２００μl の５％スキムミルク含有ＰＢＳ（ｐＨ
７．４）を各ウエルに加えて室温で２時間反応させ、精
製パラオキソナーゼが固相されていない部分をブロック
した。反応後、各ウエルに予めＰＢＳ（ｐＨ７．４）に
て希釈した各精製モノクローナル抗体（４Ｃ−１、５−
１０Ｄ）（０．００１〜１．０μg ／ml）を５０μl 加
えて、室温で１時間反応させた。反応後、０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で精製パラオキソ
ナーゼ固相化プレートを５回洗浄後、各ウエルに０．１
％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４０００倍に希釈した２
次抗体（ビオチン標識標識マウスｌｇＧ抗体、ザイメッ
ド社製）を１００μl ずつ加えて、室温で２時間反応さ
せた。反応後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）で精製パラオキソナーゼ固相化プレートを５
回洗浄後、各ウエルに、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｐ
ＢＳで２０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビ
ジン（１mg／ml、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ社製）１００μl 加え、室温下で３０分間反応させ
た。反応後、精製パラオキソナーゼ固相化プレートを
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５
回洗浄後、各ウエルに０．０１５％過酸化水素を含む
０．２５mg／mlＯＰＤ（シグマ社製）溶液を１００μl
加え、室温で３０分間反応させた。さらに、精製パラオ
キソナーゼ固相化プレートの各ウエルに２Ｎ硫酸５０μ
l 加えて、反応を停止した。そして、波長４９２nmでの
吸光度をマイクロプレートリーダー（ラボシステム社
製）で測定した。

【００７６】この結果、本発明精製モノクローナル抗体
４Ｃ−１、５−１０Ｄは１．０μg／mlの精製パラオキ
ソナーゼに対して、それぞれ０．１μg ／ml、０．３μ
g ／mlの力価で反応することが示された（第６図）。

【００７７】サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトパラオ
キソナーゼの定量系の確立 固相化モノクローナル抗体の調製 上記の各精製モノクローナル抗体（４Ｃ−１、５−１０
Ｄ）を、ＰＢＳ溶液で希釈（１０ng／ml〜１μg ／ml）
し、これらの各々希釈モノクローナル抗体溶液１００μ
l を９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに加え、４
℃で２４時間インキュベートし、各々のモノクローナル
抗体をマイクロプレートに吸着させた。次いで、各ウエ
ルを２００μl のＰＢＳで４回洗浄した。この洗浄液を
捨て、各ウエルに２００μl のブロッキング試薬（１％
ブロックエース粉末（大日本製薬社製）含有ＰＢＳ、ｐ
Ｈ７．４）を加え、室温で２時間インキュベートし、モ
ノクローナル抗体が結合していない部位をブロックし
た。次いで、各ウエルを２００μl の０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄した。このようにして所望
する固相化モノクローナル抗体プレートを作製した。

【００７８】精製モノクローナル抗体の標識 上記の各精製モノクローナル抗体（４Ｃ−１、５−１０
Ｄ、１mg／ml）を０．１ＭＮａＨＣＯ₃ （ｐＨ８．２〜
８．３）溶液で透析（４℃、２４時間）した。次いで、
ＮＨＳ−ビオチン（１mg／mlを６０μl 、ピアース社
製）を加えて激しく攪拌した後、室温下で４時間インキ
ュベートした。次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析
（４℃、２４時間）して、各々のモノクローナル抗体に
おいて、所望するビオチン標識モノクローナル抗体（以
下、標識モノクローナル抗体という）を調製した。この
ように調製した標識モノクローナル抗体の精製パラオキ
ソナーゼに対する反応性を、上述の固定化精製パラオキ
ソナーゼマイクロプレートで、同様に検討した。その結
果、各々の標識モノクローナル抗体４Ｃ−１、および５
−１０Ｄは、０．０１〜１．０μg ／mlの濃度で、固定
化精製パラオキソナーゼ（１００ng）に反応することが
示された（第７図）。

【００７９】サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量法の確
立 上記の各固定化モノクローナル抗体（４Ｃ−１、５−１
０Ｄ、５００ng／ウエル〜０．５μg ／ウエルの濃度で
固定化した。以下、「固定化マイクロプレート」ともい
う。）の各々を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５
回洗浄した。各々の固定化マイクロプレートの各ウエル
に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで予め希釈した
測定試料（精製パラオキソナーゼ、および健常人血清）
を１００μl 加え、室温で２時間インキュベートした。
インキュベート後、固定化マイクロプレートを０．１％
Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５回洗浄した後、各ウエル
に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで希釈した、上記
のビオチン標識モノクローナル抗体を加え（０．５μg
／mlを１００μl ）、室温下で２時間インキュベートし
た。次いで、固定化マイクロプレートを０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０含有ＰＢＳで５回洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０含有ＰＢＳ２０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレ
プトアビジン（１mg／ml、Vector Laboratories 社製）
の１００μlを各ウエルに加え、室温下で、３０分間イ
ンキュベートした。インキュベート後、固定化マイクロ
プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５回洗
浄した後、固定化マイクロプレートの各ウエルに０．０
１５％過酸化水素を含む０．２５mg／mlＯＰＤ（シグマ
社製）溶液を１００μl 加え、室温で３０分間インキュ
ベートした。さらに、固定化マイクロプレートの各ウエ
ルに、５０μl の２Ｎ硫酸を加えて、反応を停止した。
そして、波長４９２nmでの吸光度をマイクロプレートリ
ーダーで測定した。

【００８０】このような、サンドイッチＥＬＩＳＡによ
る測定試料中のパラオキソナーゼ測定では、実施例で示
したように、健常人の血清や精製パラオキソナーゼを濃
度依存的に測定がなされており、本発明のサンドイッチ
ＥＬＩＳＡによる測定試料中のパラオキソナーゼ量を定
量することが十分に可能であることが示された（第８
図）。

【００８１】この結果、標識モノクローナル抗体および
固定化モノクローナル抗体の組み合わせのうち、特に固
定化モノクローナル抗体は５−１０Ｄと標識モノクロー
ナル抗体４Ｃ−１との組み合わせにより、測定試料中の
パラオキソナーゼ量を測定することが望ましい。

【００８２】また、このような測定試料中のパラオキソ
ナーゼを測定するのに最適な固定化モノクローナル抗体
および標識モノクローナル抗体の濃度は、固定化モノク
ローナル抗体の濃度が２５０ng／ウエルであり、標識モ
ノクローナル抗体の濃度が１５０ng／ウエルであること
が上記の実施例より示された。

【００８３】測定試料の希釈 上述のごとく確立された本発明モノクローナル抗体を用
いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる測定において、測定
試料を血清等のリポタンパクに結合したパラオキソナー
ゼを測定する場合、脂質という疎水性の性状を有するリ
ポタンパク質と結合しており、測定試料中のパラオキソ
ナーゼ量を正確に捉えることが不可能な場合が想定され
る。このような状況を鑑み、測定試料に血清を用いた際
の、試料希釈に用いる希釈液の組成について検討を加え
た。すなわち、上述のごとく確立されたサンドイッチＥ
ＬＩＳＡによるパラオキソナーゼの測定において、血清
試料を試料希釈液としてＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０含有ＰＢＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ含有ＰＢＳ、０．
１％ＣＨＡＰＳ含有ＰＢＳで、１０倍から１００００倍
に希釈した際の血清試料中のパラオキソナーゼ量を測定
した。その結果、どの希釈液においても精製パラオキソ
ナーゼと同様のカーブを示していた（第９図）。中で
も、０．１％ＣＨＡＰＳ含有ＰＢＳを血清試料を用いる
場合に、吸光度が高く得られることより、以後の血清パ
ラオキソナーゼの蛋白定量は同希釈液を用いることし
た。

【００８４】血清試料におけるパラオキソナーゼ量 健常人６６名、および少なくともカルジオアンギオグラ
フィーで冠動脈の１枝以上に、軽度以上の狭窄が認めら
れた冠動脈疾患を患った患者（以下、ＣＨＤという）５
１名の血清を用いてパラオキソナーゼ活性、アリルエス
テラーゼ活性、パラオキソナーゼ蛋白量、および各個人
の１９２番目のアミノ酸における多型性について解析を
行った。パラオキソナーゼ多型性の解析は下記に示した
方法で行った。

【００８５】パラオキソナーゼ多型性解析 ゲノムＤＮＡは末梢血白血球からキアゲンブラッドキッ
ト（キアゲン社製）を用いて抽出した。パラオキソナー
ゼの１９２番目のアミノ酸の置換はＨｕｍｂｅｒｔらの
方法（Narure Genet,3:73-76,1993 ）に準じてＰＣＲ−
ＲＦＬＰ法にて行った。すなわち、センスプライマー
（配列番号１：５' −ｔａｔｔｇｔｔｇｃｔｇｔｇｇｇ
ａｃｃｔｇａｇ）、およびアンチセンスプライマー（配
列番号２：５' −ｃｔｔｇｃｃａｔｃｇｇｇｔｇａａａ
ｔｇｔｔｇ）を用いて、０．５μgのゲノムＤＮＡをＰ
ＣＲ増幅（denature: ９４℃ ２０秒、annealing:６０
℃３０秒、extention:７２℃ ９０秒、３０サイクル）
し、１９３bpのＰＣＲ産物は３％アガロース電気泳動で
確認した。泳動後、ＰＣＲ産物の確認はエチジウムブロ
マイド染色を行い同定した。さらに、このＰＣＲ産物２
０μl を１ＵのＡｌｗｌ制限酵素にて消化し（３７℃、
１６時間）、消化後反応液を３％アガロースゲルにて電
気泳動し、泳動後、エチジウムブロマイド染色して、Ｐ
ＣＲ産物のＡｌｗｌ制限酵素による消化パターンを判別
した。その結果を、第１表に示す。

【００８６】

【表１】

【００８７】第１表に示す通り、健常人６６名における
各パラオキソナーゼ多型性のタイプ別のパラオキソナー
ゼ活性、アリルエステラーゼ活性、パラオキソナーゼ蛋
白量はそれぞれ、ＡＡタイプ：ｎ＝８、パラオキソナー
ゼ活性１８４．２±２９．５nmole ／min ／ml、アリル
エステラーゼ活性１５４．４±２４．２μmol ／min／m
l、パラオキソナーゼ蛋白量１４４．１±３９．８μg
／ml、ＡＢタイプ：ｎ＝２５、パラオキソナーゼ活性５
５３．５±８８．９nmole ／min ／ml、アリルエステラ
ーゼ活性１３３．５±２６．４μmol ／min ／ml、パラ
オキソナーゼ蛋白量１２８．４±３６．６μg ／ml、Ｂ
Ｂタイプ：ｎ＝３３、パラオキソナーゼ活性９５８．９
±１８４．７nmole ／min ／ml、アリルエステラーゼ活
性１１３．１±１９．６μmol ／min ／ml、パラオキソ
ナーゼ蛋白量１１２．１±２９．９μg ／mlであった。

【００８８】ＣＨＤ患者５１名ではそれぞれ、ＡＡタイ
プ：ｎ＝６、パラオキソナーゼ活性１５６．４±６４．
９nmole ／min ／ml、アリルエステラーゼ活性１３１．
２±４５．９μmol ／min ／ml、パラオキソナーゼ蛋白
量９８．１±３７．７μg ／ml、ＡＢタイプ：ｎ＝２
４、パラオキソナーゼ活性５３６．３±１７７．９nmol
e ／min ／ml、アリルエステラーゼ活性１３４．９±４
２．５μmol ／min ／ml、パラオキソナーゼ蛋白量１１
２．７±３８．８μg ／ml、ＢＢタイプ：ｎ＝２１、パ
ラオキソナーゼ活性７６２．９±１９６．５nmole ／mi
n ／ml、アリルエステラーゼ活性９３．１±２４．６μ
mol ／min ／ml、パラオキソナーゼ蛋白量８２．５±２
６．９μg ／mlであった。

【００８９】また、健常者をコントロールとした場合の
ＣＨＤ患者での各々の測定結果について不等分散による
ｔ検定を実施し有意差を検討したところ、パラオキソナ
ーゼ活性はＢＢタイプにおいてｐ＜０．０１、アリルエ
ステラーゼ活性は同じくＢＢタイプにおいてｐ＜０．０
１、パラオキソナーゼ蛋白量はＡＡタイプがｐ＜０．０
５、ＢＢタイプがｐ＜０．０１と有意に低下しているこ
とが認められた。すなわち、健常人よりＣＨＤ患者にお
いてパラオキソナーゼ活性、アリルエステラーゼ活性、
パラオキソナーゼ蛋白量のいずれもが低値であり、とり
わけパラオキソナーゼ蛋白量は低値であることが示され
た。

【００９０】過酷な酸化ストレスの結果生じたと考えら
れるＣＨＤ患者において、抗酸化的に作用するパラオキ
ソナーゼが消費され、その結果パラオキソナーゼ活性を
はじめ、アリルエステラーゼ活性、パラオキソナーゼ蛋
白量のいずれもが低値を示したと考えられる。

【００９１】このように、パラオキソナーゼの活性ない
し蛋白量が、ＣＨＤないし動脈硬化症のマーカーとなり
得ることが示された。以上のように、ＣＨＤ患者におい
ては、パラオキソナーゼが量的に減少する傾向が強いこ
とが明らかになった。よって、検体におけるパラオキソ
ナーゼの活性を、全体量として把握することで、これを
動脈硬化の一次的な指標にすることが可能である。

【００９２】さらに、本試験では、驚くべきことに、パ
ラオキソナーゼの質的な変化にも着目することにより、
より詳細な動脈硬化の判定をすることが可能であること
が明らかになった。

【００９３】ＣＨＤ患者群においては、低ＨＤＬコレス
テロール血症を呈する例が、かなりの頻度で観察され、
この低ＨＤＬコレステロール血症であるということも、
動脈硬化のリスクファクターの一つとして知られてい
る。しかしながら、低ＨＤＬコレステロール血症である
ということが、必ずしも確度の高い動脈硬化の指標であ
るとはいいがたい面もあることも、また事実である。低
ＨＤＬコレステロール血症であるということは、少なく
とも動脈硬化を惹き起こす素因が存在することを示して
いるが、現に、動脈硬化が進展していることを、直接的
に反映していないことも想定される。

【００９４】低ＨＤＬコレステロール血症である場合
に、ＨＤＬ結合性蛋白質であるパラオキソナーゼの量
は、ＨＤＬ量が低下するのと相関して、低値を示す。こ
の時点で、ある程度の動脈硬化のリスクについての知見
を得ることができるが、さらに、パラオキソナーゼの質
的な変化を検出することにより、より突っ込んだ動脈硬
化についての知見を得ることができるはずである。

【００９５】パラオキソナーゼの質的な変化は、パラオ
キソナーゼの単位当りの酵素活性の変化を検出すること
により特定され得る。つまり、パラオキソナーゼの質的
な変化は、パラオキソナーゼ活性を蛋白量当りに換算し
た「特異活性」を求めることにより評価することが可能
である。

【００９６】低ＨＤＬコレステロール血症であるもの
の、動脈硬化が現にそれほど亢進していない場合、パラ
オキソナーゼの特異活性は、健常人の同特異活性とは差
異が認められないが、動脈硬化が現に亢進している場合
には、パラオキソナーゼにおいて質的な変化が認められ
ることが考えられる。

【００９７】上述のパラオキソナーゼの質的な変化につ
いて検討した本試験の結果を、ここに示す。第１表に示
したごとく、パラオキソナーゼ特異活性及びアリルエス
テラーゼ特異活性は、健常人コントロールと比較する
と、ＣＨＤ患者群のパラオキソナーゼ特異活性が、ＡＡ
タイプがｐ＜０．０１、ＢＢタイプがｐ＜０．０５、同
アリルエステラーゼ特異活性が、ＡＡタイプがｐ＜０．
００５、ＡＢタイプ及びＢＢタイプがｐ＜０．０１と、
有意差をもって高値であることが示された。このことか
ら、ＣＨＤ患者群においては、パラオキソナーゼの量的
な異常ばかりではなく、質的な異常が認められることが
明らかとなった。

【００９８】よって、パラオキソナーゼ特異活性及びア
リルエステラーゼ特異活性について検討して、パラオキ
ソナーゼの質的な異常を検出することにより、より詳細
な動脈硬化ないしＣＨＤについての指標を得ることが可
能であることが裏付けられた。

【００９９】上述のように、動脈硬化ないしＣＨＤにお
いて、パラオキソナーゼ特異活性が向上することは、こ
れらの疾患に際しての生体内における酸化反応の亢進に
より、パラオキソナーゼが防御的に働いて消費され、生
体内でのパラオキソナーゼの分解及び産生の代謝が亢進
していることによるものと考えられる。

【０１００】以上、本発明検出方法により検出された検
体中のパラオキソナーゼの量的・質的な異常により、検
体提供者の動脈硬化を判定することが可能であることが
明らかになった。

【０１０１】

【発明の効果】本発明により、パラオキソナーゼに対す
るモノクローナル抗体及びこれを用いた動脈硬化の判定
方法が提供される。

【０１０２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> BML,INC. <120> Monoclonal antibody against paraoxonase <130> PBM36 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:pcr primer <400> 1 tattgttgct gtgggacctg ag 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:pcr primer <400> 2 cttgccatcg ggtgaaatgt tg 22

【図面の簡単な説明】

【図１】ブルーアガロースクロマトグラフィーによるパ
ラオキソナーゼの精製について示した図面である。

【図２】陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ
Ｉ）によるパラオキソナーゼの精製について示した図面
である。

【図３】陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ I
I）によるパラオキソナーゼの精製について示した図面
である。

【図４】精製パラオキソナーゼの銀染色像を示した図面
である。

【図５】精製モノクローナル抗体の血漿に対する反応性
を示した図面である。

【図６】精製モノクローナル抗体の精製パラオキソナー
ゼに対する反応性を、ＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示
した図面である。

【図７】標識精製モノクローナル抗体の精製パラオキソ
ナーゼに対する反応性を、ＥＬＩＳＡ法で検討した結果
を示した図面である。

【図８】本発明検出法における検量線の直線性を、精製
パラオキソナーゼを用いて検討した結果を示した図面で
ある。

【図９】本発明検出法を用いて、検体希釈液のパラオキ
ソナーゼを検出した結果を示した図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡 智一郎 埼玉県川越市的場1361番地１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者 岩崎 忠雄 埼玉県川越市的場1361番地１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者 石原 光昭 埼玉県川越市的場1361番地１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者 江頭 徹 埼玉県川越市的場1361番地１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 BA44 DA02 GA03 HA15 4B065 AA92X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 AA30 BA10 CA42 DA76 DA86 EA55

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】パラオキソナーゼに対するモノクローナル
   抗体。
2. 【請求項２】パラオキソナーゼが、ヒトの血漿に由来す
   るパラオキソナーゼである、請求項１記載のモノクロー
   ナル抗体。
3. 【請求項３】請求項１又は２記載のモノクローナル抗体
   を産生するハイブリドーマ。
4. 【請求項４】請求項１又は２のモノクローナル抗体と、
   検体中のパラオキソナーゼとの間における抗原抗体反応
   を利用する、検体中のパラオキソナーゼの検出方法。
5. 【請求項５】検体が血液検体である、請求項４記載の検
   出方法。
6. 【請求項６】請求項４又は５記載の検出方法により検出
   された検体中のパラオキソナーゼの量的・質的な異常を
   指標として、検体提供者の動脈硬化を判定する方法。