JP2002510050A

JP2002510050A - 骨吸収速度を測定する方法

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Publication number: JP2002510050A
Application number: JP2000541520A
Authority: JP
Inventors: ハーリーン、ジュッシ; ベーネネン、カレルボ
Original assignee: ハーリーン、ジュッシ; ベーネネン、カレルボ
Priority date: 1998-04-01
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2002-04-02
Anticipated expiration: 2019-03-30
Also published as: WO1999050662A3; AU3149199A; DK1068533T3; DE69921107D1; AU748663B2; CZ20003578A3; PT1068533E; WO1999050662A2; JP3523200B2; EP1068533A2; CN1145030C; ES2232124T3; ATE279728T1; CN1295667A; FI980748A; FI980748A0; EP1068533B1; CZ296736B6; DE69921107T2

Abstract

(57)【要約】酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）は、骨吸収のマーカーとして使用されている。しかし、前記酵素は体内に二つの形態：ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂがあり、そのうちＴＲＡＰ５ｂの方がより特異的なマーカーである。本発明は、骨吸収速度を測定するための免疫測定法であって、ＴＲＡＰ５ｂの量が骨吸収速度を表していることにより、ＴＲＡＰ５ｂの特異的な測定を可能にする方法に関する。前記方法は、骨吸収速度の変化に関連のある疾患、例えば骨粗鬆症を診断する際に有効である。また、このような疾患に対する感受性についてスクリーニングする方法、および治療の効果をモニターする方法を提供する。更に前記方法に使用されるテストキットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の分野］本発明は、骨吸収速度を測定する方法、特にそのための免疫測定法に関する。
本発明は更に、骨粗鬆症のような骨吸収速度の変化に関連のある疾患を診断する
方法、および前記方法に利用可能なテストキットに関する。更に本発明は、被検
者の骨吸収速度の増加に関連のある疾患を治療するための薬剤の効果をモニター
する方法、および前記疾患に対する感受性について被検者をスクリーニングする
方法に関する。骨吸収速度の特異的マーカーを使用することが開示されている。

【０００２】［技術的背景］骨吸収速度の変化に関連のある幾つかの疾患があるが、最も広範囲に広がって
いるのは骨粗鬆症であり、これは閉経後の女性にみられる疾患である。骨粗鬆症
は、骨質量が低下し、その結果、骨折しやすい弱い骨格になることにより引き起
こされる。骨粗鬆症により起こる骨折および疾病の治療は、患者の苦悩は言うま
でもなく社会にとっても費用がかかる。従ってその厳しい結果を避けるため、骨
粗鬆症に罹患する人を診断する必要がある。骨粗鬆症は、例えばエストロゲン置
換もしくはビホスホネート療法による治療が成功している。

【０００３】骨密度を測定するための幾つかの器械および方法がある。しかし、使用される
装置および手法は、多大な空間および人員を必要とし、測定に時間を要し、患者
が常駐しなければならないため、費用がかかる。骨粗鬆症に関する限り、その人
口の年齢分布が、ますます望ましくないものになっているため、骨吸収速度を測
定するための、特異的で迅速で簡便で安価なインビトロの方法を開発することが
重要である。

【０００４】骨は、二つの主要な細胞タイプ、骨形成性骨芽細胞および骨吸収性破骨細胞か
ら実質的に成っている。通常これら二つの細胞タイプはバランスを保っており、
破骨細胞は、骨芽細胞が形成したのと同量の骨を吸収する。骨粗鬆症は、破骨細
胞の活性が増大し、その結果、骨芽細胞が産生するよりも多くの骨を吸収する疾
患に至った結果である。

【０００５】酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ，ＥＣ 3.1.3.2）は、その電気
泳動の移動度によりタイプ５クラスの酸性ホスファターゼに属するため、タイプ
５酸性ホスファターゼとも称される。少なくとも７つの酸性ホスファターゼを、
酸性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により同定することができる。これらのう
ち最も酸性であるのは、バンド５の酸性ホスファターゼ（Acp５）であり、これだけが酒石酸塩による阻害に対して唯一抵抗性を示したため、名称はＴＲＡＰで
ある。この酵素は、その分子の活性部位にスピン結合した鉄ユニットを有する塩
基性糖蛋白質である。ＴＲＡＰの二核の鉄ユニットは、蛋白質を紫色にする二つ
の第二鉄イオンを有し、紫色酸性ホスファターゼとも称される。この蛋白質は、
分子量３２ｋｄである。この酵素を、例えばβ−メルカプトエタノールにより還
元すると、第二鉄イオンの一つが還元され、酵素はピンク色になる。ＴＲＡＰは
、インビトロで蛋白質チロシンホスファターゼとして機能することができ、その
アミノ酸配列は、リン蛋白質ホスファターゼのアミノ酸配列と相同な領域を有す
る。しかし、その天然の基質はまだ知られていない。

【０００６】このチロシンのリン酸化は、多くの細胞の機能および分化に関して重要な制御
メカニズムである。ＴＲＡＰは、破骨細胞の機能を制御する際に重要な役割を果
たすと考えられる。ＴＲＡＰは、その特質で反応したり化合物を破壊したりでき
る水酸基を産生することができる。破骨細胞は、骨吸収の間に酸素遊離基を産生
し、その酸素遊離基が骨吸収において意味のあることは明らかである。その由来
は分からないが、少なくとも一部の水酸基は、ＴＲＡＰにより形成されると思わ
れる。ＴＲＡＰを通常含有する細胞タイプ、即ち破骨細胞および肺胞マクロファ
ージはともに、化合物を取り込み、それらを分解する。この共通の特性により、
ＴＲＡＰが骨吸収に関与しているという仮説は強く支持される。

【０００７】 Hayman, A. R. et al.（Development 122: 3151-3162, 1996）は、マウスでＴ
ＲＡＰ遺伝子を標的破壊することによりＴＲＡＰの役割を研究した。ＴＲＡＰ遺
伝子を欠損するマウスは、軟骨内骨化が混乱し、軽度の大理石骨病であることを
彼らは見出した。ＴＲＡＰが、骨の発達の際の、軟骨の正常な鉱化作用に必要と
されること、更にＴＲＡＰが、骨基質の吸収に重大に寄与することにより、成人
骨格の完全性（integrity）および代謝回転を維持していることを彼らは結論づけた。

【０００８】相当量のＴＲＡＰを含有する唯一のヒト正常細胞は、破骨細胞と活性化マクロ
ファージだけである。ある病理学的状況においては、他の細胞にＴＲＡＰを見出
すこともできる。ＴＲＡＰは、骨吸収の間に破骨細胞から血液循環に分泌される
ことが見出された。従って、血清中のＴＲＡＰ濃度が、骨吸収のマーカーとして
提案され、血清中のＴＲＡＰ濃度は、骨吸収速度と互いに関連があることが見出
された（Kraenzlin M. E. et al. Journal of Clinical Endocrinology and Met
abolism 71(2): 442-451, 1990; Cheung C. K. et al. Clin. Chem. 41(5): 679
-686, 1995; Chamberlain P. et al. Clin. Chem. 41(10): 1495-1499, 1995およびHalleen J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10): 1444-
1452, 1996）。

【０００９】 1978年、Lam W. K. W. et al.（Clin. Chem. 24(7): 1105-1108, 1978）は、成人および子供の血清中におけるＴＲＡＰの生化学的特性の研究について報告し
た。改良した電気泳動法により、彼らは二つの別個のＴＲＡＰバンドを発見し、
これらを５ａおよび５ｂと名付けた。ＴＲＡＰ５ａは、ＴＲＡＰ５ｂより低い
最適ｐＨを有する。両酵素の形態ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂは、ともに
ヒト血清中で発見された。ＴＲＡＰ５ａの量は、成人および子供において一定であるが、ＴＲＡＰ５ｂの量は、子供で高いことが見出された。

【００１０】別の論文（Chen et al., Clin. Chem. 25, 719-722, 1979）において、同グル
ープの研究者らは、正常な子供の血清で酸性ホスファターゼ活性が高いことの意
義を研究した。彼らは、バンド５に相当する血清ＴＲＡＰの活性が、巨細胞腫に
はあるが、骨原性肉腫には存在しないことを示し、このことは、ＴＲＡＰが破骨
細胞に由来することを示唆している。

【００１１】 W.K.W. Lam et al.（Clin. Biochem. 14, 177-181, 1981）は、ゴシェ病に罹患した患者の血清および脾臓からＴＲＡＰを単離した。彼らは、ゴシェ病の血清
がバンド５ｂを含有し、ゴシェ病の脾臓がバンド５ａを含有することを示した。
バンド５ａおよびバンド５ｂは同一の蛋白質構造を有し、シアリダーゼにより５
ａから炭水化物を除去すると５ａは５ｂに変換され、これにより、５ａと５ｂの
構造上の唯一の差異は、５ａにシアル酸残基が存在し、５ｂに存在しないことだ
けであると示唆された。両形態の最適ｐＨは異なり、５ａでは5.0、５ｂでは5.5
〜6.0であった。

【００１２】 W.K.W. Lam and R.J. Desnick（Progress in Clinical and Biological Resea
rch 95, 267-278, 1982）は、ゴシェ病においてバンド５型を更に研究した。彼らは、正常検体および病理検体における酸性ホスファターゼの電気泳動プロフィ
ールをまとめた。彼らは、正常血清に微量の５ａおよび５ｂがともに存在するこ
とを示したが、病理血清にバンド５ａの増加は観察されなかった。その代わりに
彼らは、破骨細胞性骨腫瘍、骨に転移した悪性腫瘍を有する患者の血清、および
ゴシェ病を有する患者の血清において、５ｂ量が増加することを見出した。これ
らの結果に基づいて、血清の酸性ホスファターゼレベル、特に５ｂ型は、破骨細
胞の生理学的活性に主として依存していることが示唆されると、著者らは結論づ
けた。しかし、その仮説を裏付ける更なる証拠が必要であると、彼らは述べてい
る。この論文に由来する他の重要な所見は、両酵素（バンド５ａおよび５ｂ）は
密接に関連があり抗原性としては同じであるという著者の記載である。この記載
によれば、５ａもしくは５ｂの何れかを特異的に測定する免疫測定法を開発する
ことはできないであろう。1982年以降、血清のＴＲＡＰ５ａおよび５ｂの起源は
それ以上研究されず、示唆された５ｂの破骨細胞起源は、確証されていない。

【００１３】ＴＲＡＰ活性は、例えばｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を基質
として供給することにより、他の多くの酸性ホスファターゼを阻害する酒石酸塩
の存在下で、分光測光法により測定することができる。しかしこの方法は、あま
り特異的でないため、ＴＲＡＰを測定するためにより特異的な方法、即ち免疫測
定法が開発されている。

【００１４】 Stepan J.J et al.（Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1027-1034, 1989
）およびKraenzlin M.E. et al. （Journal of Clinical Endocrinology and Me
tabolism 71(2): 442-451, 1990）は、ヘアリーセル白血病患者の脾臓から精製したＴＲＡＰに対して産生されるポリクローナル抗体を用いた、ＴＲＡＰのため
の免疫測定法を開発した。彼らは、この測定法は、無機塩類代謝に疾患をもつ患
者を検出する際に有効であると示唆している。

【００１５】 Cheung C.K. et al.（Clin. Chem. 41(5): 679-686, 1995）は、策状組織（co
rd）血漿から単離されたＴＲＡＰに対して調製されたポリクローナル抗体を用い
た、ＴＲＡＰの免疫測定法を開示している。彼らは、ＴＲＡＰの濃度が子供およ
び閉経後の女性において有意に高いことを見出し、骨代謝回転を評価する際のマ
ーカーとしてＴＲＡＰを使用する可能性を述べている。

【００１６】またポリクローナル抗体は、ヒトの骨から単離、精製されたＴＲＡＰに対して
も調製されている。子供および閉経後の女性は、血清中のＴＲＡＰ濃度が高いこ
とは再度証明されている（Halleen J. et al. Journal of bone and Mineral Re
search 11(10): 1444-1452, 1996）。

【００１７】 Chamberlain P. et al.（Clin. Chem. 41(10): 1495-1499, 1995）は、組換え
によりつくられたＴＲＡＰに対して産生された一対のモノクローナル抗体を用い
た、ＴＲＡＰの二工程の血清免疫測定法を開示している。この一対のモノクロー
ナル抗体により、ＴＲＡＰの異なるエピトープが認識され、感度の高いＴＲＡＰ
の測定法が可能になった。

【００１８】これまでに発表された免疫測定法は全て、血清中のＴＲＡＰの全量を測定して
いる。しかし、本発明は、ＴＲＡＰ５ｂがトータルＴＲＡＰと比べて骨吸収の特
異的な生化学的マーカーであるという発見に基づくものである。このことと関連
して、５ａ、５ｂと称されるものであるが、Stepan et al. and Kraenzlin et a
l. 同上により報告されたＴＲＡＰの異性体を、Lam et al. 同上により報告され
たものと混同してはいけないことを指摘しておく。

【００１９】従って、本発明の目的の一つは、骨吸収の特異的マーカーとしてＴＲＡＰ５ｂを利用することである。

【００２０】本発明の別の目的は、骨吸収速度を測定する特異的で簡便な方法を提供するこ
と、特に、骨吸収速度の有意な変化と関連のある疾患（例えば、骨粗鬆症もしく
は他の骨代謝病、骨障害、または骨転移）を診断する診断方法を提供することで
ある。

【００２１】本発明の別の目的は、前記疾患に罹患しやすいか、もしくは罹患している被検
者の骨吸収をモニターすることができる方法、および前記疾患の治療効果を追跡
する方法を提供することである。

【００２２】本発明の更に別の目的は、前記方法に有効なテストキットを提供することであ
る。

【００２３】［本発明の概要］本発明の目的は、免疫測定法において、骨吸収速度のマーカーとして酒石酸塩
抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）を使用することにより達成することができる。

【００２４】その結果本発明は、被検者の骨吸収速度を測定するための免疫測定法であって
、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）の量が骨吸収速度を表していることにより、前記被検者に由来する体液サンプル中のＴＲＡＰ５ｂを測定することを特徴とする方法を提供する。

【００２５】特に、以下の工程を含む、被検者の骨吸収速度を測定するための免疫測定法を
提供する：（ａ）前記被検者に由来する体液サンプル中に存在するＴＲＡＰを、全ＴＲＡ
Ｐ（ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂ）を結合する抗体に結合させることによ
り、体液サンプル中の酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）を測定する工程、および（ｂ）主としてＴＲＡＰ５ｂであるＴＲＡＰの活性量が骨吸収速度を表していることにより、結合したＴＲＡＰ活性をｐＨ５．７〜６．３の間で測定する工
程。

【００２６】本発明は、被検者の骨吸収速度の変化に関連のある疾患を診断する方法であっ
て、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）の異常な量が骨吸収速度の変化に関連のある疾患を暗示していることにより、前記被検者に由来
する体液サンプル中のＴＲＡＰ５ｂを免疫測定法により測定することを特徴とする方法を更に提供する。

【００２７】本発明は、被検者の骨吸収速度の増加に関連のある疾患を治療するための薬剤
の効果をモニターする方法であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（
ＴＲＡＰ５ｂ）量の減少が前記薬剤の効果を示していることにより、前記被検者の体液サンプル中のＴＲＡＰ５ｂを免疫測定法により測定することを特徴とする方法を更に提供する。

【００２８】本発明は、骨吸収速度の増加に関連のある疾患に対する感受性について被検者
をスクリーニングする方法であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（
ＴＲＡＰ５ｂ）レベルの増大が前記疾患に対する感受性を示していることにより、前記被検者の体液サンプル中のＴＲＡＰ５ｂを免疫測定法により測定することを特徴とする方法を更に提供する。

【００２９】本発明は、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）と酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ａ（ＴＲＡＰ５ａ）とを識別することが可能な抗体を含むテストキットを更に提供する。本テストキットは、本発明の方法を
実施する際に有効である。

【００３０】［発明の詳細な説明］被検者の体液サンプル中の全ＴＲＡＰの代わりにＴＲＡＰ５ｂを特異的に測定すると、ＴＲＡＰ量と骨吸収速度との間に有意に優れた相関関係が達成される
。ＴＲＡＰに対する抗体を利用することにより、免疫測定法で特異的にＴＲＡＰ
５ｂを測定できることを予期せず見出した。驚くべきことに、ＴＲＡＰ５ａと
ＴＲＡＰ５ｂとを識別する抗体を見出した。しかし、本発明で使用する抗体は、必ずしもＴＲＡＰ５ａもしくはＴＲＡＰ５ｂの何れかに特異的である必要は
なく、全ＴＲＡＰを認識する抗体を使用してもよい。その場合、二つの酵素形態
の識別は、非特異的な抗ＴＲＡＰ抗体との反応の後、他の手段により成し遂げら
れる。例えば、全ＴＲＡＰ活性がＴＲＡＰ５ｂに由来するｐＨ範囲でＴＲＡＰ活性を測定できることを見出した。これらの発見により、骨吸収速度の変化に関
連のある一次骨疾患および二次骨疾患（例えば、骨代謝病、または骨障害もしく
は骨転移、特に骨粗鬆症）を診断する改良方法を提供することができる。ＴＲＡ
Ｐ５ｂ量を測定する方法は、骨疾患の治療効果（例えば、骨粗鬆症のエストロゲンもしくはビホスフェート療法の効果）をモニターする際に使用することもで
きる。骨吸収の増大に対する感受性ついてヒトをスクリーニングする際に使用す
ることもでき、これにより骨折を防ぐ治療が可能になる。

【００３１】本発明に関連して使用される「被検者」とは、哺乳類、好ましくはヒトを意味
する。

【００３２】本出願で使用される「ＴＲＡＰ」とは、タイプ５クラスの酸性ホスファターゼ
に属する酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ（ＥＣ 3.1.3.2.）をいい、これには酵素形態５ａおよび５ｂの両方が含まれる。

【００３３】「ＴＲＡＰ５ｂ」は、その炭水化物鎖においてシアル酸を欠損し、最適ｐＨが約５．７〜６．０の間であるＴＲＡＰの酵素形態ｂをいう。

【００３４】「ＴＲＡＰ５ａ」は、その炭水化物鎖においてシアル酸を含み、最適ｐＨが約４．９であるＴＲＡＰの酵素形態ａをいう。

【００３５】前記酵素は、例えばLam W.K.W. et al.（Clin. Chem. 24(7): 1105-1108, 197
8）およびLam W.K.W. et al.（Clin. Biochem. 14, 177-181, 1981）に更に説明
されている。

【００３６】体液サンプルは、好ましくは、血漿もしくは特に血清のような血液サンプルで
あるが、必ずしもそうではない。

【００３７】本発明の免疫測定法において、ＴＲＡＰに対する抗体が使用される。これに関
連して「免疫測定法」とは、測定すべき化合物が抗原抗体反応により検出される
任意の測定法を意味する。免疫測定法は、直接測定法でも間接測定法でもよく、
競合的測定法でも非競合的測定法でもよい。免疫測定法は、サンドイッチ技術で
も単純な技術でもよい。抗原もしくは抗体の何れかを標識して検出を強化するこ
とができる。これらの方法の原理は、当該分野で周知である。

【００３８】本発明で使用される「ＴＲＡＰに対する抗体」には、５ａおよび５ｂに非特異
的な抗体、および特異的な抗ＴＲＡＰ抗体を含む。

【００３９】ＴＲＡＰに対する抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。前記モノク
ローナル抗体は、ＴＲＡＰ５ｂとＴＲＡＰ５ａとを識別することが可能な抗体
であってもよい。「ＴＲＡＰ５ｂとＴＲＡＰ５ａとを識別することが可能な抗
体」とは、ＴＲＡＰ５ｂもしくはＴＲＡＰ５ａの何れかに特異的であってもよ
く、あるいは前記特異的な抗体と全ＴＲＡＰ（即ち、ＴＲＡＰ５ｂとＴＲＡＰ
５ａの両方）を認識する抗体との任意の組み合わせから成っていてもよい。

【００４０】ＴＲＡＰ５ａとＴＲＡＰ５ｂとを識別することが可能な抗体は、体液中のＴ
ＲＡＰ５ｂの濃度を測定するために幾つかの方法で使用することができる。ＴＲＡＰ５ｂに特異的な抗体を使用する場合、当然ながら、直接使用してＴＲＡＰ５ｂを検出することができる。しかし、ＴＲＡＰ５ｂに特異的な抗体を、酵
素の両形態（即ち、全ＴＲＡＰ）を認識する抗体と組合わせて使用することが好
ましい。その場合、体液の全ＴＲＡＰを、まず酵素の両形態を認識する抗体に結
合させ、次いで、ＴＲＡＰ５ｂに特異的であるがＴＲＡＰ５ａとは反応しない
標識抗体を使用して、結合したＴＲＡＰ５ｂを検出する。

【００４１】更に、ＴＲＡＰ５ａに特異的な抗体と全ＴＲＡＰを認識する抗体とを組み合わせて使用することができる。その場合、ＴＲＡＰ５ａを、まずＴＲＡＰ５ａ
に特異的な抗体に結合させ、次いで、残りの結合しなかったＴＲＡＰ活性（これ
は形態５ｂのはずである）を、酵素の両形態を認識する抗体を使用して測定する
。

【００４２】本発明の方法で使用される抗体は、検出を高めるために、例えば放射能ラベル
、酵素ラベル、化学発光ラベル、もしくは蛍光ラベルを用いて任意の慣用的な方
法により標識されていてもよい。ストレプタビジン−ビオチニル（streptavidin
-biotinyl）システムは、感度の高い検出を提供する。例えばHellman J. et al.
J. Bone Miner. Res. 11: 1165-1175, 1996; およびHemmila I. et al., Anal.
Biochem. 137: 335-343, 1984に記載された時間分解（time-resolved）蛍光免疫測定法である、Delfiaシステムを用いて、特に優れた結果が得られた。ＴＲＡ
Ｐの異なるエピトープを認識する少なくとも二つの異なる抗体を使用することが
更に好ましい。これにより、高い感度と再現性を備えた二部位（two-site）の蛍
光免疫測定法が可能になる。

【００４３】本発明のテストキットは、ＴＲＡＰ５ｂとＴＲＡＰ５ａとを識別することが
可能な抗体を含む。このテストキットは、本発明に従って骨吸収速度を評価する
際、並びに骨吸収速度の変化と関連のある疾患を診断する際に有効である。この
テストキットは、ＴＲＡＰ５ｂを特異的に認識する抗体を、必要に応じて全ＴＲＡＰを認識する抗体とともに含んでいてもよい。あるいは、このテストキット
は、全ＴＲＡＰを認識する抗体とともに、ＴＲＡＰ５ａを特異的に認識する抗体を含んでいてもよいし、あるいはＴＲＡＰ５ｂに特異的な抗体およびＴＲＡＰ５ａに特異的な抗体を含んでいてもよい。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。

【００４４】本発明に従ってＴＲＡＰ５ｂ活性を測定する別の実現性は、ＴＲＡＰ５ｂの
酵素活性ピーク内であるが、ＴＲＡＰ５ａの酵素活性ピークの外であるｐＨ範囲において、酒石酸塩の存在下で酸性ホスファターゼ活性の慣用的な分光測光法
（例えば、Halleen J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10):
1444-1452, 1996を参照）を実施することである。本発明者らが測定したとおり
、ＴＲＡＰ５ａの最適ｐＨは、約４．９であり、ＴＲＡＰ５ｂの最適ｐＨは、
約５．７〜６．０である。全ＴＲＡＰは、通常ｐＨ５．５で測定される。しかし
、ＴＲＡＰ５ａの存在下でＴＲＡＰ５ｂを測定するために適切なｐＨ範囲は、
５．７〜６．３、好ましくは５．８〜６．２、特に好ましくは６．０〜６．２で
あることを見出した。ｐＨ６．１が最も好ましい。分光測光法は、ＴＲＡＰ５ａとＴＲＡＰ５ｂとを識別していないが、前記ｐＨ範囲内で測定した活性は、実質的にＴＲＡＰ５ｂである。ＴＲＡＰ５ａのｐＨ６．１での活性は、ｐＨ４
．９における活性のわずか約２０〜３０％である。（ＴＲＡＰ５ｂをＴＲＡＰ
５ａの非存在下で測定すると、ｐＨ約５．９で僅かに高い活性が得られる）。ｐ
Ｈ６．１において、全ＴＲＡＰ活性に対する５ａ活性の割合は、１０％未満であ
る。従ってｐＨ６．１においては、測定されたＴＲＡＰ活性の９０％以上が、形
態５ｂである。

【００４５】免疫測定法でＴＲＡＰ５ａとＴＲＡＰ５ｂの最適ｐＨの差異を利用すること
により、ＴＲＡＰ５ｂを測定する安価で簡便な方法が提供される。この手法により、体液の全ＴＲＡＰを結合させるために最初に使用される（５ａと５ｂの両
方に結合する）非特異的な抗ＴＲＡＰ抗体の利用が可能になる。その後、ＴＲＡ
Ｐ活性は、ＴＲＡＰ５ｂ活性に好ましいｐＨ５．７〜６．３のｐＨ範囲で、例えば分光測光法により測定される。

【００４６】炭水化物含量の差異は、ＴＲＡＰ５ｂとＴＲＡＰ５ａとを識別する際に使用
することもできる。全ＴＲＡＰは、例えばまず５ａと５ｂの両方を認識する抗体
によって結合される。次いで結合した全ＴＲＡＰは、ＴＲＡＰ５ｂのような末端マンノースを有する炭水化物に結合するが、その炭水化物鎖に末端シアル酸を
有するためＴＲＡＰ５ａに結合しない、標識されたGalanthus Nivalis Aggluti nin （ＧＮＡ）もしくはConcanavalin A（ConA）レクチンと反応する。

【００４７】当然、本発明の方法において、ＴＲＡＰ５ｂを測定するために上述の手法の任意の組み合わせを使用することができる。本発明は、本発明を限定しない以下
の実施例において更に説明される。

【００４８】［例１］モノクローナル抗体を、標準的プロトコールを用いて作成した。BALB/cマウス
に、フロイントアジュバントで乳化されたヒト骨ＴＲＡＰ精製物（Halleen J. e
t al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10): 1444-1452, 1996）を、
（１回に20μｇ/マウス）２週間隔で４回注射し、その後動物を屠殺した。脾細胞を骨髄腫細胞株 p3-X63-Ag8.653とハイブリダイズし、そのハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養した。抗マウスＩｇＧでコートされたマイクロタイターウェル
中で100μＬの上清をインキュベートすることにより、クローンをスクリーニングし、次いでヒト骨ＴＲＡＰ精製物をインキュベートした。最後に、結合した酵
素活性を、200μＬの反応混合液（０.１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６.０、８ｍＭｐＮＰＰおよび４０ｍＭ酒石酸ナトリウム）をウェル中で１時間インキュベ
ートすることにより測定した。反応は、１６μＬの０.５Ｍ水酸化ナトリウムを添加することにより停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて405ｎｍの吸光度を測定した。二つのモノクローナルＴＲＡＰ抗体、Ｏ１ＡおよびＪ１
Ｂを得た。両抗体はともに、ＴＲＡＰ５ａとＴＲＡＰ５ｂの両方を認識するが、
異なるエピトープを認識した。

【００４９】抗原として組換えＴＲＡＰを用いて開発されたモノクローナル抗体４Ｅ６（Ch
amberlain P. et al. Clin. Chem. 41(10): 1495-1499, 1995）は、骨から単離、精製されたＴＲＡＰと反応しないことが見出された。その代わり、このモノク
ローナル抗体は、シアル酸を含むＴＲＡＰの５ａ型を特異的に認識することが見
出された。400ｎｇの４Ｅ６を、抗マウスＩｇＧでコートされたマイクロタイターウェル中で１時間インキュベートした。次いで、血清サンプル（200μＬ）を、そのウェル中で１時間インキュベートした。コントロールとして、同じ血清か
らのサンプルを、抗マウスＩｇＧでコートされていないマイクロタイターウェル
中で同様にインキュベートした。そのウェルから50μＬの３サンプルを採取し、
400ｎｇのユーロピウム標識Ｏ１Ａとビオチン標識Ｊ１Ｂを含む100μＬのDelfia
アッセイ緩衝液と混合した。その混合液を、Delfiaプレートシェーカー（1296-0
01 Delfia Plateshaker, Wallac Oy, Turku, Finland）で絶えず振盪しながら、
ストレプタビジン（streptavidin）でコートされたマイクロタイターウェル中で
２時間インキュベートし、次いでDelifa洗浄緩衝液で洗った。最後に、そのウェ
ルを、Delifa増強溶液で満たして、５分間振盪し、結合した蛍光を測定した。こ
の方法は、例えばHellman J. et al. J. Bone Miner. Res. 11: 1165-1175, 199
6; およびHemmila I. et al., Anal. Biochem. 137: 335-343, 1984に更に説明されている。

【００５０】その結果を表１にまとめた。ＴＲＡＰ５ａの量は、閉経前の女性と閉経後の女性とでほぼ同じであるが、両グループ間のＴＲＡＰ５ｂ量の差異は有意であることが分かった。従って、全ＴＲＡＰと比較してＴＲＡＰ５ｂの特異的な測定により、骨吸収のマーカーとしてのＴＲＡＰの有用性が大いに高まった。また
、ＴＲＡＰ５ｂのレベルは、成人より子供の方が有意に高いが、ＴＲＡＰ５ａ
のレベルはほぼ一定であることが確認された。

【００５１】

【表１】

【００５２】［例２］抗マウスＩｇＧでコートされたマイクロタイターウェルを前もって洗浄し、そ
のウェル中で絶えず振盪しながら、モノクローナルＴＲＡＰ抗体Ｏ１Ａ（400ｎｇ抗体/ウェル）を１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、４０人の健康な成人に由来する血清サンプルを、ウェル中で絶えず振盪しながら１時間インキ
ュベートした。ウェルを洗浄し、200ｍＬの反応混合液（０.１Ｍ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ５.９、８ｍＭｐＮＰＰおよび４０ｍＭ酒石酸ナトリウム）をウェル中で１時間インキュベートすることにより、結合したＴＲＡＰ活性を測定した。
反応は、２５ｍＬの０.３２Ｍ水酸化ナトリウムを添加することにより停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて405ｎｍの吸光度を測定した。

【００５３】その結果によると、二つのグループが形成された：ＴＲＡＰの全活性が最も高
い８サンプルを含む「High」と、ＴＲＡＰの全活性が最も低い８サンプルを含む
「Low」。まず抗体４Ｅ６に５ａを結合させて、次いで上述の抗体Ｏ１Ａと結合しなかった活性（即ち、ＴＲＡＰ５ｂ）を測定することにより、ＴＲＡＰ５ａ
およびＴＲＡＰ５ｂを二つのグループで特異的に測定した。ＴＲＡＰ５ａ活性
はｐＨ５.０で測定し、ＴＲＡＰ５ｂ活性はｐＨ５.９で測定した。その結果（4
05ｎｍの吸光度）を表２に示す。両グループはほぼ同量のＴＲＡＰ５ａを含んでいるが、ＴＲＡＰ５ｂの量は、Highグループで著しく高いことが分かる。

【００５４】

【表２】

【００５５】最後に、両グループに由来する全ＴＲＡＰを、抗体Ｏ１Ａに結合させることに
より測定し、結合したＴＲＡＰ活性を異なるｐＨ値で上述のとおり測定した。そ
の結果（405ｎｍの吸光度）を表３に示す。その結果は、ｐＨが増加すると両グループ間の差異が増大することを明らかに示している。最も優れた差異（2.46）
は、ｐＨ６.１で達成される。

【００５６】

【表３】

【００５７】［例３］種々のｐＨにおける血清ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂの活性を研究した
。これは、抗体４Ｅ６を用いて血清サンプル由来のＴＲＡＰ５ａを結合させ、次いで抗体Ｏ１Ａを用いて残りのＴＲＡＰ５ｂを結合させることにより行われた。結合したＴＲＡＰ活性は、酢酸緩衝液のｐＨを表示どおりに変更した以外は
、例２の第一段落で記載されるように測定した。表４は、基質としてｐＮＰＰを
用いて種々のｐＨでＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂについて得られた吸光度
の値（Ａ₄₀₅）を示す。％５ａのカラムは、各ｐＨにおける、全ＴＲＡＰ活性（５ａ＋５ｂ）に対する５ａ活性の割合を示し、例えばｐＨ４.７では、％５ａは0
.256/0.354＝72％である。

【００５８】

【表４】

【００５９】表４によると、ｐＨ６.１は、ＴＲＡＰ５ａの干渉が非常に低く（９.３％）、ＴＲＡＰ５ｂの活性が最適ｐＨの範囲（５.７〜５.９）の活性とほぼ同じであるため、ＴＲＡＰ５ｂを特異的に検出するために最も優れたｐＨ値であると思われる。通常、血清のＴＲＡＰ活性は、ｐＨ５.５が血清の全ＴＲＡＰ活性を測定したときに観察される最適ｐＨ値である（これは、上述の表のカラム５ａ＋
５ｂから分かるように、ＴＲＡＰ５ａとＴＲＡＰ５ｂの合計活性がｐＨ５.５で最も高くなるという事実に依るものである）ため、ｐＨ５.５を用いて検出される。

【００６０】［例４］Ｏ１Ａに結合した血清のＴＲＡＰ５ｂ活性をｐＨ６.１で測定した、例３のＴ
ＲＡＰ５ｂに特異的な方法を、今度は、ＴＲＡＰをＯ１Ａに結合させ、Delfia システムを用いてユーロピウム標識Ｊ１Ｂで全ＴＲＡＰを検出することにより血
清の全ＴＲＡＰを測定する、二部位（two-site）の測定法と比較する。閉経後の
女性グループ（年齢＞７０）に由来する血清サンプルを使用して、血清のＴＲＡ
Ｐ量に対する６ヶ月のエストロゲン置換治療（ＨＲＴ）の効果を研究した。ＴＲ
ＡＰ５ｂに特異的な方法によれば、６ヶ月ＨＲＴ後にＴＲＡＰ５ｂ活性は４８
％減少したが（ｐ＝0.001）、（エストロゲンの代わりにプラシーボを受けた）コントロールグループにおいては、６ヶ月後にＴＲＡＰ５ｂ活性の２％増加が観察された。全ＴＲＡＰに対する二部位（two-site）の測定法により、両グルー
プとも６ヶ月後に１５〜２０％の減少が検出された。これらの結果は、全ＴＲＡ
Ｐを測定する二部位法は、６ヶ月のＨＲＴ後の骨吸収速度の変化を検出する際に
感度が高くなく、ＴＲＡＰ５ｂを特異的に測定する方法は、６ヶ月ＨＲＴ後のほぼ５０％の減少を検出することを示しており、このことは、後者の方法が骨粗
鬆症患者のＨＲＴ治療をモニターする際に非常に有効であることを示唆している
。従って、ＴＲＡＰ５ｂは、全ＴＲＡＰを測定する二部位測定法と比べて、エストロゲン置換治療の間の骨吸収速度の変化を検出するに際し、有意に優れたマ
ーカーである。その結果を図１に示す。

【００６１】［例５］最後に、閉経後の女性の血清サンプルの一団を使用して、血清のＴＲＡＰ５ｂ量および血清の全ＴＲＡＰ量と骨の無機塩類密度（ＢＭＤ）との相関関係を研
究した。その結果は、全ＴＲＡＰ（ｒ＝−0.156, ｐ＝0.1488, 有意な相関関係なし）と比べてＴＲＡＰ５ｂは、ＢＭＤに対して有意に優れた負の相関関係を有すること（ｒ＝−0.540, ｐ＝0.001, ***）を示している。図２はＴＲＡＰ５
ｂのＢＭＤに対する相関曲線を示す。

【００６２】このデータは、血清の全ＴＲＡＰと比べて血清のＴＲＡＰ５ｂが、有意に特異的で感度の高い骨吸収速度のマーカーであることを確信的に示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】血清中の全ＴＲＡＰ量およびＴＲＡＰ５ｂ量に対するエストロゲン治療の効果を示す図。

【図２】血清ＴＲＡＰ５ｂと骨の無機塩類密度（ＢＭＤ）との負の相関関係を示す図。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月１６日（２０００．２．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ベーネネン、カレルボフィンランド国、エフアイエヌ−90550 オウル、ペイコンティエ２・ディー43

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検者の骨吸収速度を測定するための免疫測定法であって、
酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）の量が骨吸収速度を表していることにより、前記被検者に由来する体液サンプル中のＴＲＡＰ５ｂを測定することを特徴とする方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスフ
ァターゼ（ＴＲＡＰ）に対するモノクローナル抗体を使用する方法。
【請求項３】請求項１または２に記載の方法であって、体液サンプル中に
存在するＴＲＡＰを、全ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ５ａおよびＴＲＡＰ５ｂ）を結合
する抗体にまず結合させ、その後、結合したＴＲＡＰ活性をｐＨ５．７〜６．３
の間で測定する方法。
【請求項４】請求項３に記載の方法であって、ＴＲＡＰ活性を、分光測光
法によりｐＨ約６．１で測定する方法。
【請求項５】請求項２に記載の方法であって、ＴＲＡＰ５ｂとＴＲＡＰ
５ａとを識別することが可能なモノクローナル抗体を使用する方法。
【請求項６】請求項５に記載の方法であって、体液サンプル中に存在する
ＴＲＡＰを、ＴＲＡＰ５ａに特異的な抗体にまず結合させ、その後、結合しなかったＴＲＡＰ活性を測定する方法。
【請求項７】請求項６に記載の方法であって、結合しなかったＴＲＡＰ活
性を、分光測光法もしくは免疫測定法により測定する方法。
【請求項８】請求項１、６または７に記載の方法であって、ＴＲＡＰ活性
をｐＨ５．７〜６．３の間で測定する方法。
【請求項９】請求項８に記載の方法であって、ＴＲＡＰ活性をｐＨ約６．
１で測定する方法。
【請求項１０】請求項１または５に記載の方法であって、ＴＲＡＰの異な
るエピトープを認識する、少なくとも二つの異なるモノクローナル抗体を使用す
る方法。
【請求項１１】請求項１０に記載の方法であって、時間分解（time-resol
ved）蛍光免疫測定法を使用する方法。
【請求項１２】請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法であって、前記
体液サンプルが血清サンプルである方法。
【請求項１３】被検者の骨吸収速度の変化に関連のある疾患を診断する方
法であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）の異常な量が骨吸収速度の変化に関連のある疾患を暗示していることにより、前記被検
者に由来する体液サンプル中のＴＲＡＰ５ｂを免疫測定法により測定することを特徴とする方法。
【請求項１４】請求項１３に記載の方法であって、前記疾患が骨粗鬆症で
ある方法。
【請求項１５】酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）と酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ａ（ＴＲＡＰ５ａ）とを識別することが可能な抗体を含むテストキット
【請求項１６】被検者の骨吸収速度の増加に関連のある疾患を治療するた
めの薬剤の効果をモニターする方法であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファター
ゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）量の減少が前記薬剤の効果を示していることにより、前記被検者の体液サンプル中のＴＲＡＰ５ｂを免疫測定法により測定することを特徴とする方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法であって、前記疾患が骨粗鬆症で
ある方法。
【請求項１８】骨吸収速度の増加に関連のある疾患に対する感受性につい
て被検者をスクリーニングする方法であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファター
ゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）レベルの増大が前記疾患に対する感受性を示していることにより、前記被検者の体液サンプル中のＴＲＡＰ５ｂを免疫測定法により測定することを特徴とする方法。
【請求項１９】請求項１８に記載の方法であって、前記疾患が骨粗鬆症で
ある方法。