CN1295667A - 测定骨吸收速率的方法 - Google Patents
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Abstract
现已将耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP)作为骨吸收的指标。然而,所述的酶在体内有两种形式:TRAP5a和TRAP5b,其中TRAP5b是更具特异性的指标。本发明提供了用于测定骨吸收速率的免疫分析方法,该方法能够进行TRAP5b的特异性测定,通过TRAP5b的量可以反映出骨吸收的速率。该方法可以用于诊断与骨吸收速率改变有关的疾病,例如骨质疏松症。本发明还提供了对这些疾病具有易感性对象的筛选方法以及检验治疗效果的方法。
Description
本发明涉及测定骨吸收速率的方法，特别是其免疫分析方法。本发明进一步涉及诊断与骨吸收速率改变有关疾病(例如骨质疏松症)的方法以及该方法所采用的测试盒(test-kit)。本发明还涉及检验药物治疗与骨吸收速率增加有关疾病效果的方法以及对所述疾病具有易感性对象的筛选方法。本文中公开了骨吸收速率特异性指标的用途。
现存在几种与骨吸收速率改变有关的疾病，最普遍的是骨质疏松症，它多发生在绝经后的妇女身上。骨质疏松症是由骨质丢失引起的，其导致骨架脆弱，很容易骨折。骨折及其它与骨质疏松所引起的疾病治疗对社会来说尚需要很高的耗费，更不用说治疗对象本人。因此需要对患有骨质疏松的人群进行诊断以防止严重后果的发生。目前已能成功地治疗骨质疏松症，例如采用雌三醇替代方法或双膦酸酯治疗方法。
测定骨密度有几种仪器和方法。然而，所用的仪器和操作均非常昂贵，因为其需要较大的空间和较多的人员，同时测定非常缓慢需要有耐心。由于就骨质疏松症而言，人口的年龄分布愈发不容乐观，因此开发特异、迅速、简单和经济的体外骨密度测定方法尤为重要。
实质上，骨中含有两种主要的细胞类型，骨形成成骨细胞以及骨吸收破骨细胞。正常情况下，这两种细胞处于平衡状态，破骨细胞吸收的骨细胞数量与成骨细胞形成的骨细胞数量相同。骨质疏松是由于破骨细胞的活性增加，破骨细胞吸收的骨细胞数量比成骨细胞所产生的骨细胞数量要多，从而导致了失调。
根据其电泳流动性，抗酒石酸磷酸酯酶(TRAP，EC3.1.3.2.)属于5型酸性磷酸酯酶，因此，又称为5型酸性磷酸酯酶。借助酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳至少可以鉴别出7种酸性磷酸酯酶。这些酶之中酸性最强的是位于带5处的酸性磷酸酯酶(Acp5)，它是唯一可以抵抗酒石酸抑制的酶，因此又称为TRAP。此酶为碱性糖蛋白，其在分子的活性部位含有旋转-偶合的铁单位。TRAP的双核铁单位含有两个铁(Ⅲ)离子，其使得蛋白变紫，因此又叫作紫色酸性磷酸酯酶。此蛋白的分子量为32kd。当用β-巯基乙醇还原该酶时，其中的一个铁(Ⅲ)离子被还原，酶变成粉色。TRAP可以在体外用作蛋白酪氨酸磷酸酯酶，它的氨基酸序列含有与磷酸蛋白磷酸酯酶相类似的部位。然而尚不知道它的天然底物。
酪氨酸磷酰化对于许多细胞的功能和鉴别来说是一种重要的调节机制。一般认为TRAP在破骨细胞的功能调节方面起着重要作用。已知TRAP能够产生羟基基团，后者能够与天然的化学物质进行反应并使之破坏掉。在骨吸收过程中，破骨细胞产生游离的氧基团，很显然在骨吸收过程中它们是很显著的。它们的来源尚属未知，但似乎至少部分的羟基基团是由TRAP产生的。正常情况下，含有TRAP的两种类型细胞(即破骨细胞和小泡巨噬细胞)吸收化合物并使之降解。这一共同的特征有利地支持了TRAP参与骨吸收过程的假设。
Hayman，A.R.等人(进展122：3151-3162，1996)通过小鼠体内TRAP基因的靶破坏调查了TRAP的作用。他们发现，缺乏基因的小鼠的软骨内骨化作用被破坏并有轻度的骨硬化。他们的结论是在骨生长过程中需要TRAP进行正常的软骨矿化，TRAP还可以通过对骨基质吸收的关键贡献保持成人骨骼的完整性和灵活性(turnover)。
在正常的人体中，含有明显量TRAP的细胞仅有破骨细胞和活性巨噬细胞。在某些病理情况下，在其它细胞中也能发现TRAP。现已发现，TRAP是在骨吸收过程中从破骨细胞分泌到血液循环中的，因此建议血清中的TRAP的浓度可以作为骨吸收的指标。人们还发现血清中TRAP的浓度与骨吸收的速率相关(Kraenzlin M.E.等人，临床内分泌和代谢杂志71(2)：442-451，1990；Cheung C.K.等人，临床化学，41(5)：679-686，1995；Chamberlain P.等人，临床化学，41(10)：1495-1499，1995以及Halleen J.等人，骨和矿物研究杂志，11(10)：1444-1452，1996)。
1978年，Lam W.K.等人，临床化学，24(7)：1105-1108，1978)报告了成人和儿童血清中TRAP生化性质的研究结果。通过改进的电泳方法，他们发现有两个明显的TRAP带，并将它们指定为5a和5b。TRAP 5a比TRAP 5b更适宜较低的pH环境。在人类的血清中，两种酶形式TRAP 5a和TRAP 5b均可找到。成人和儿童体内TRAP 5a的量是恒定的，但TRAP 5b的量在儿童体内有所提高。
在另一篇论文中(Chen等人，临床化学，25，719-722，1979)，同一个研究小组进行了正常儿童血清中高酸性磷酸酯酶活性显著性的研究。他们发现在巨细胞肿瘤中存在相应于带5 TRAP的血清TRAP活性，但在成骨细胞和肉瘤中则不存在，这一结果表明，TRAP是从破骨细胞中衍生出来的。
W.K.W.Lam等人(临床生物化学，14，177-181，1981)从患有Gaucher疾病的病人的血清和脾脏中分离TRAP。他们指出Gaucher疾病的血清中含有带5b，而Gaucher疾病的脾脏中含有带5a。带5a和带5b含有可以识别的蛋白结构。借助唾液酶从5a上除去碳水化物可以将其转化为5b，这一结果表明，5a和5b结构上唯一有区别的是在5a上存在唾液酸残基，而5b中不存在。两种形式适宜的pH环境不同，5a为5.0，5b为5.5-6.0。
W.K.W.Lam和R.J.Desnick(临床和生物研究进展95，267-278，1982)对Gaucher疾病中的带5形式进行了进一步研究。他们还总结了正常和病理状态标本中酸性磷酸酯酶的电泳特征。结果显示，在正常的血清中，存在痕量的带5a和5b，在任何病理血清中均未发现带5a的水平有所提高。代之出现的是破骨细胞骨肿瘤中、发生骨恶性转移的治疗对象血清中以及患有Gaucher疾病的病人血清中带5b的量有所提高。基于这些结果，研究者得出以下结论：血清酸性磷酸酯酶(特别是其5b形式)的水平依赖于破骨细胞的生理活性。然而他们也指出还需要进一步的证据来支持这一假设。从论文中可以看到的另一个重要发现是这两种酶(带5a和5b)是密切相关的并具有抗原一致性。根据这一陈述，无法找一种既能测定5a又能测定5b的特异性免疫分析方法。1982年之后，没有人再对TRAP 5a和5b的来源进行进一步的研究，所提出的5b破骨细胞的来源尚未证实。
借助分光光度法可以测定TRAP的活性，例如在酒石酸存在下，加入对硝基苯基磷酸酯(pNPP)作为底物(酒石酸可以抑制其它大多数酸性磷酸酯酶)。但是这个方法的特异性不是很好，因此发展了一些更具特异性的测定TRAP方法，例如免疫分析方法。
Stepan J.J.等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.165：1027-1034，1989)以及Kraenzlin M.E.等人(临床内分泌和代谢杂志71(2)：442-451，1990)发展了TRAP免疫分析方法，其采用的是针对TRAP而得到的多细胞系抗体，上述TRAP是从患有多毛细胞白血病治疗对象的脾脏中纯化得到的。他们提出这种分析方法对于检测患有矿物质代谢失调的治疗对象是很有用的。
Cheung C.K.等人(临床化学，41(5)：679-686，1995)公开了TRAP的免疫分析方法，其采用的是针对TRAP而制备得到的多细胞系抗体，上述TRAP是从索血浆(cord plasma)中分离得到的。他们发现儿童体内TRAP浓度显著高于绝经后的妇女，并讨论了将TRAP作为评价骨骼灵活性(turnover)的可能性。
还有针对人类骨头中分离并纯化得到的TRAP制得的多细胞系抗体。其再一次被证明儿童和绝经后妇女的血清中TRAP浓度有所提高(Halleen J等人，骨和矿物研究杂志，11(10)：1444-1452，1996)。
Chamberlain P.等人(临床化学，41(10)：1495-1499，1995)公开了使用一对单克隆抗体进行的两步血清免疫分析方法，其由重组生成的TRAP而得。这些单克隆抗体可以识别TRAP不同的表位，从而使得分析较为敏感。
迄今为止所有公开的免疫分析方法均是测定血清中的总TRAP浓度。然而，本发明是基于以下这样一个发现：对于骨吸收来说，TRAP5b比起总TRAP来说是一个特异性更高的生化指标。在这一点上应该指出的是尽管均被指定为5a和5b，上文中Stepan等人和Kraenzlin所报道的TRAP异构体不应与上文中Lam等人所报道的TRAP异构体相混淆。
因此本发明的一个目标是利用TRAP 5b作为骨吸收的特异性指标。
本发明的另一个目标是提供特异并简单的测定骨吸收速率的方法，特别是提供能够诊断与骨吸收速率明显改变有关的疾病，例如骨质疏松症或其它骨代谢疾病、骨损伤或骨转移。
本发明进一步的目标是能为易感或患有这些疾病的对象提供骨吸收的检测的方法，并且能够追踪他们的治疗效果。
本发明还有一个目标是提供所述方法中使用的试剂盒。
在免疫分析方法中使用耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)作为骨吸收速率的指标可以实现本发明的目的。
因此本发明提供了用于测定治疗对象骨吸收速率的免疫分析方法，其特征在于对来自所述治疗对象体液中的耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)进行测定，TRAP 5b的量可以反映出骨吸收的速率。
特别地，其提供了测定治疗对象骨吸收速率的免疫分析方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过使存在于体液样品中的TRAP与抗体(其可以和总TRAP结合，包括TRAP 5a和TRAP 5b)结合，测定治疗对象体液中的耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)。
(b)在pH5.7-6.3下，测定结合的TRAP的活性，TRAP活性的量(其主要是TRAP 5b)可以反映骨吸收的速率。
本发明还提供了能够诊断与骨吸收速率改变有关的疾病的方法，其特征在于借助免疫分析方法测定所述治疗对象体液中的耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)，TRAP 5b的异常量可以反映与骨吸收速率改变有关的疾病。
本发明进一步提供了检测药物治疗患者体内与骨吸收速率增加有关疾病的效果的方法，其特征在于通过免疫分析方法对所述治疗对象体液样品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)进行测定，通过TRAP5b量的降低可以反映出所述药物的作用。
本发明还提供了对与骨吸收速率增加有关疾病具有易感性的治疗对象的筛选方法，特征在于通过免疫分析方法对所述治疗对象体液样品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)进行测定，TRAP 5b水平提高即表示对所述疾病具有易感性。
本发明还提供了含有能够区分耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)和耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP 5a)抗体的测试盒(test-kit)，该试剂盒在实施本发明方法时是有用的。
图表的简述
图1显示了雌三醇治疗对于血清中总TRAP和TRAP 5b量所产生的作用。
图2显示了血清TRAP 5b和骨矿物密度(BMD)之间呈现负相关。
当TRAP 5b取代治疗对象体液样品中的总TRAP被特异性地进行测定时，在TRAP浓度和骨吸收速率之间获得了显著良好的相关。出乎意料的发现是利用针对TRAP的抗体在免疫分析中有可能对TRAP 5b进行特异性的测定。另外还令人吃惊地发现抗体可以区分TRAP 5a和TRAP 5b。然而，并不需要本发明中使用的抗体对TRAP 5a或TRAP 5b具有特异性，只要是可以识别总TRAP的抗体就可使用。在这种情况下，两种形式酶之间的区分将在与非特异性的抗体反应后通过其它手段获得。例如发现可在一个pH范围内测定TRAP的活性，在这个范围下总TRAP的活性实际上来自TRAP 5b。这些发现可为诊断初级及次级与骨吸收速率改变有关的骨疾病(例如代谢骨疾病、骨损伤或骨转移，尤其是骨质疏松)提供改进的方法。测定TRAP 5b量的方法也可用于检测对骨疾病的治疗效果，例如雌三醇双膦酸酯治疗骨质疏松的效果。其还可用来筛选对骨吸收增加具有易感性的人群，对他们进行治疗从而防止骨折发生。
这里所用的‘治疗对象’是指哺乳动物，优选的是人类。
本申请中使用的‘TRAP’是指耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP，EC3.1.3.2.)，属于5型酸性磷酸酯酶，包括酶的5a和5b两种形式。
‘TRAP 5b’是指TRAP酶的b形式，在其烃链上缺乏唾液酸，适宜的pH环境约为5.7-6.0。
‘TRAP 5a’是指TRAP酶的a形式，在其碳水合物(糖)链上含有唾液酸，适宜的pH环境约为4.9。
Lam W.K.W.等人(临床化学，24(7)，1105-1108，1978)以及Lam W.K.W.等人(临床生物化学，14，177-181，1981)还对所述的酶作过进一步的描述。
优选的(但不必需)体液样品为血液，例如血浆或特别是血清。
在本发明的免疫分析中，采用了针对TRAP的抗体。这里的‘免疫分析’是指任何通过抗原-抗体反应进行化合物测定的分析。免疫分析可以是直接的或间接的，竞争性的或非竞争性的分析。其可以是复合技术也可以是单一的技术。可以对抗原或抗体进行标记以提高检测的灵敏度。这些方法的原则在本领域内是已知的。
本发明中所用的‘针对TRAP的抗体’包括5a和5b非特异性和特异性抗-TRAP抗体。
优选的针对TRAP的抗体是单克隆抗体。所述的单克隆抗体可以是抗体，其可以区分TRAP 5b和TRAP 5a。‘可以区分TRAP 5b和TRAP 5a’的抗体既可是TRAP 5b和TRAP 5a特异性的，或者它们可由所述的特异性抗体与可以识别总TRAP的抗体的任意组合构成，例如TRAP 5b和TRAP 5a。
可以通过几种途径利用能够区分TRAP 5a和TRAP 5b的抗体来测定体液中TRAP 5b的浓度。如果采用TRAP 5b特异性的抗体，当然可以直接测定TRAP 5b。但是，优选的是将TRAP 5b特异性的抗体与能够识别两种酶(即总TRAP)的抗体结合使用。在这种情况下，体液的总TRAP首先与能识别两种酶的抗体进行结合，然后用对TRAP5b具有特异性(但不与TRAP 5a反应)的标记抗体检测结合的TRAP5b。
进一步可能的是使用对TRAP 5a具有特异性的抗体与可以识别总TRAP的抗体的组合。在这种情况下，首先使TRAP 5a与对TRAP5a具有特异性的抗体进行结合，然后用能够识别两种酶的抗体对余下的未结合的TRAP活性(其必定来自TRAP 5b)进行测定。
本发明方法中所用的抗体可以用任意常规的方法进行标记，例如放射标记、酶标记、化学发光标记或荧光标记，目的是提高它们的检测灵敏度。抗生蛋白链菌素-生物素基(biotinyl)系统提供了敏感的检测。采用Delfia系统获得了尤其好的结果，其为时间-分辨的荧光免疫分析方法，Halleen J等人(骨和矿物研究杂志，11：1165-1175，1996)以及Hemmila等人(Anal.Biochem.137：335-343，1984)曾对该方法进行过描述。进一步优选的是使用至少两种不同的抗体，它们可以识别TRAP不同的表位。此举可以获得高度敏感并具有重现性的双部位(two-site)荧光免疫分析。
本发明的试剂盒包含能够区分TRAP 5b和TRAP 5a的抗体。根据本发明，在评价骨吸收速率和诊断与骨吸收速率改变有关的疾病时，上述试剂盒是很有用的。试剂盒包含可以特异识别TRAP 5b的抗体，任意地还可以含有识别总TRAP的抗体。两外，试剂盒还可以含有可以特异识别TRAP 5a及总TRAP的抗体，或者其可以包含TRAP 5b特异性抗体或TRAP 5a特异性抗体。优选的抗体为单克隆抗体。
根据本发明，另一个可以测定TRAP 5b活性的方法是在一定的pH范围内于酒石酸存在下，对酸性磷酸酯进行常规的分光光度测定(参见Halleen J等人，骨和矿物研究杂志，11(10)：1444-1452，1996)，上述pH范围位于TRAP 5b的酶活性峰范围内，但位于TRAP5a的范围之外。根据本发明者测定，TRAP 5a的pH适宜范围约为4.9，TRAP 5b约为5.7-6.0。总TRAP在pH5.5处进行测定。然而现已发现，在TRAP 5a的存在下，测定TRAP 5b的适宜的pH范围是5.7-6.3，优选的是5.8-6.2，特别优选的是6.0-6.2，6.1是最适宜的pH值。尽管分光光度法不能区分TRAP 5a和TRAP 5b，但在所述的pH范围下，所测得的活性实质上均来自TRAP 5b。pH6.1下TRAP 5a的活性仅为pH4.9下活性的20-30％。(如果在没有TRAP 5a存在下测定时，在pH5.9下获得的TRAP 5b的活性稍高一些)。在pH6.1下，5a活性占总TRAP活性的比例小于10％。因此在pH6.1下，大于90％测定得到的TRAP的活性来自5b。
在免疫分析中，TRAP 5b和TRAP 5a具有不同的适宜pH值这一优势可以提供经济和简单的TRAP 5b测定方法。此过程使得非特异性的TRAP抗体(既与5a又与5b结合)得以利用，即它们首先与体液中总TRAP进行结合。然后用分光光度法等方法在pH范围5.7-6.3下测定TRAP的活性，其主要来自TRAP 5b的活性。
碳水合物含量上的不同也可以用来区别TRAP 5b和TRAP 5a。例如首先使总TRAP与能够识别5a和5b的抗体结合。结合的总TRAP与标记的Galanthus Nivalis凝集素(GNA)或拌刀豆球蛋白A(ConA)植物血凝素，这些物质能与具有终端果糖的糖类(例如TRAP5b)结合，但其不与TRAP 5a结合，原因是TRAP 5a的糖链上具有终端唾液酸。
当然在本发明方法中，可以使用上述过程的任意组合测定TRAP5b。下列实施例将进一步说明本发明但并不限制本发明。
实施例1
采用标准的实验方案进行单克隆抗体的制备。将提纯的并用Freund’s辅助剂进行过乳化的人类骨TRAP(Halleen J等人，骨和矿物研究杂志，11(10)：1444-1452，1996)以两周的间隔给予BALB/c小鼠4次注射，每次20μg/小鼠。之后将动物杀死。将脾细胞与骨髓瘤细胞系P3-X-63-Ag8.653进行杂交，将杂交瘤在HAT介质中培养。在抗鼠LgG-包裹的微滴培养皿中培养100μl上清夜，筛选克隆，接着培养人类的骨TRAP。最后，在培养皿中，通过培养200μl反应混合物(0.1M乙酸钠，pH6.0，8mM pNPP以及40mM酒石酸钠)对结合酶的活性进行1小时测定。加入16μl 0.5M氢氧化钠终止反应。在405nm处用ELISA平皿读数仪测定吸收。获得了两种TRAP单克隆抗体，O1A和JIB。这两种抗体既可以识别TRAP 5a也可以识别TRAP 5b，但是不同的表位。
人们发现，利用作为抗原的重组TRAP(Chamberlain P.等人，临床化学，41(10)：1495-1499，1995)开发出来的单克隆抗体4E6不与从骨中分离纯化得到的TRAP反应。代之出现的是它可以特异性识别含有唾液酸的TRAP的5a形式。使400ng 4E6在抗鼠IgG-包裹的微滴培养皿中培养1小时。然后在这些平皿中使血清样品(200μl)培养1小时。作为对照，将同样来源的血清样品按照相似的方法在空的抗鼠IgG-包裹的微滴培养皿中进行培养。从这些平皿中取3份等份样品(各50μl)，与100μl含有400ng铕标记O1A和生物素化J1B的Delfia分析缓冲液进行混合。混合物于Delfia平皿振荡器的不断振摇下，在抗生蛋白链菌素包裹的微滴培养皿中培养2小时(1296-001Delfia平皿振荡器，Wallac Oy，Turku，Finland)，然后用Delfia洗涤缓冲液进行洗涤。最后用Delfia增强溶液填充平皿，振摇5分钟，测定结合的荧光。Halleen J等人(骨和矿物研究杂志，11：1165-1175，1996)以及Hemmila等人(Anal.Biochem.137：335-343，1984)曾对此方法进行了进一步的描述。
结果列于表1。可以发现在绝经前和绝经后的妇女身上TRAP 5a的量几乎相同，但两组之间的TRAP 5b量的差异是非常显著。与采用总的TRAP相比，特异性的测定TRAP 5b使得TRAP作为骨吸收指标的用途有了显著的改进。另外还证实儿童体内TRAP 5b的量水平要高于成人，而TRAP 5a的量在成人和儿童之间几乎是恒定的。
表1．血清中TRAP的量(μg/l)
1后/前=绝经前妇女与绝经后妇女的TRAP酶比例。
2儿童/前=儿童与绝经前妇女的TRAP酶比例。
实施例2
对抗鼠IgG-包裹的微滴培养皿进行预洗涤，在不断振摇下，在这些培养皿中使单克隆TRAP-抗体O1A(400ng抗体/平皿)培养1小时。洗涤这些平皿，在不断振摇下，使来自40位健康成人的血清样品在这些培养皿培养1小时。洗涤平皿，通过培养200ml反应混合物(0.1M乙酸钠，pH5.9，8mM pNPP以及40mM酒石酸钠)对培养皿中结合的TRAP活性测定1小时。加入25ml 0.32M氢氧化钠终止反应，在405nm处用ELISA平皿读数仪测定吸收。
基于这些实验结果，得到了两组数据：“高”组，其含有8个具有最高总TRAP活性的样品以及“低”组，其含有8个具有最低总TRAP活性的样品。在两组中，分别特异地测定TRAP 5a和TRAP 5b，首先使5a和抗体4E6结合，然后按照上述方法，用抗体O1A测定未结合的活性，即TRAP 5b的活性。在pH5.0下测定TRAP 5a的活性，在pH5.9下测定TRAP 5b的活性。结果(405nm处的吸收)列于表2。可以看到，两组中TRAP 5a的含量基本相同，而高组中TRAP 5b的含量则显著较高。
表2．在高和低活性血清下TRAP的活性
| pH | 高(平均值±SD) | 低(平均值±SD) | 高/低 |
| 5a5b | 0.414±0.1390.610±0.227 | 0.415±0.0890.171±0.043 | 0.9983.550 |
最后，通过与抗体O1A的结合，对来自两组的总TRAP进行测定，按照上述方法，在不同的pH值下测定结合的TRAP活性。结果(405nm处的吸收)列于表3。该结果清楚地显示：当pH增加时，两组之间的差异也在增加。在pH6.1下，可以获得最大的差异。
表3．在不同pH值下TRAP的活性
| pH | 高(平均值±SD) | 低(平均值±SD) | 高/低 |
| 5.05.55.96.1 | 0.786±0.2000.738±0.2361.085±0.3320.931±0.298 | 0.683±0.1160.455±0.0780.538±0.0880.377±0.085 | 1.151.622.022.48 |
实施例3
对不同pH值下的血清TRAP 5a和TRAP 5b的活性进行了研究。具体作法是使血清样品中的TRAP 5a与抗体4E6结合，然后用抗体O1A与剩余的TRAP 5b进行结合。按照实施例2第一段中所述方法测定结合的TRAP活性，除了乙酸盐缓冲液的pH如所示的变化。表4列出了不同pH值下，以pNPP作为底物时得到的TRAP 5a和TRAP 5b的吸收值(A405)。“％5”一栏表示每一个pH下，5a活性与总TRAP活性(5a+5b)的比例，例如在pH4.7下，“％5”为0.256/0.354=72％。
表4
由表4可见，对于特异性地测定TRAP 5b来说，pH6.1最为适宜，此时，TRAP 5a的干扰最低(9.3％)，而TRAP 5b在适宜的pH范围内(5.7-5.9)最为活跃。通常，在pH5.5处测定血清TRAP活性，这是在测定总血清TRAP时所观察到的最适宜的pH值(由于在pH5.5处，TRAP 5a和TRAP 5b的结合活性最大，参见上表中“5a+5b”一栏)。
实施例4
将实施例3中所述的测定TRAP的特异方法(其中在pH6.1处测定与O1A结合的血清TRAP5b的活性)与双部位分析方法(其中通过使TRAP与O1A结合，测定总血清TRAP，并且采用Delfia系统，利用铕标记的J1B，检测总TRAP)进行比较。采集绝经后妇女(年龄大于70岁)的血清样品，用以研究6个月的雌三醇替代治疗(HRT)对血清TRAP含量的作用。根据测定TRAP 5b的特异方法，经过6个月的HRT(p=0.001)，TRAP 5b的活性下降了48％，而在对照组中(其用安慰剂代替雌三醇)，经过6个月的HRT，TRAP 5b的活性增加了2％。6个月后，两个组用双部位分析法得到的总TRAP的量下降了15-20％。这些结果显示，经过6个月的HRT，测定总TRAP的双部位分析方法在检测骨吸收速率变化方面不够敏感，而特异性测定TRAP 5b的方法则可以检测到经过6个月的HRT后，TRAP 5b几乎达到50％的降低。这些结果表明，在检测骨质疏松患者的HRT治疗时，上述方法是非常有用的。因此在雌三醇替代治疗检测骨吸收速率变化时，TRAP 5b比起用双部位分析方法检测总TRAP来说是一项更好的指标。结果列于图1。
实施例5
最后，采用一系列绝经后妇女的血清样品，对血清TRAP 5b量及总血清TRAP与骨矿物密度(BMD)的相关关系进行了研究。结果显示，TRAP 5b与BMD的负相关性(r=-0.540，p=0.001***)比总TRAP与BMD的负相关性(r=-0.156，p=0.1488，没有显著的相关性)更为显著。图2显示了TRAP 5b与BMD的相关曲线。
这些数据令人信服地说明在骨吸收速率检测方面，TRAP 5b比起总血清TRAP来说，是一个更为特异和敏感的指标。
Claims (19)
1．在治疗对象身上测定骨吸收速率的免疫分析方法，其特征在于在所述治疗对象的体液样品中测定耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)，通过TRAP 5b的量可以反映出骨吸收的速率。
2．权利要求1中所述的方法，其中采用了耐抗酒石酸磷酸酯酶(TRAP)的单克隆抗体。
3．权利要求1或2中所述的方法，其中存在于体液样品中的TRAP首先与抗体结合，该抗体与全部的TRAP(TRAP 5a和TRAP 5b)结合，在pH5.7-6.3之间测定结合的TRAP的活性。
4．权利要求3中所述的方法，其中在pH约为6.1时用分光光度法测定TRAP的活性。
5．权利要求2中所述的方法，其中的单克隆抗体能够区分所使用的TRAP 5b和TRAP 5a。
6．权利要求5中所述的方法，其中存在于体液样品中的TRAP首先与TRAP 5a特异性抗体结合，之后可以测定未结合的TRAP的活性。
7．权利要求6中所述的方法，其中可以通过分光光度法或免疫分析方法测定未结合的TRAP的活性。
8．权利要求1，6或7中所述的方法，其中在pH5.7-6.3之间进行TRAP的活性测定。
9．权利要求8中所述的方法，其中在pH约为6.1时测定TRAP的活性。
10．权利要求1或5中所述的方法，其中至少使用了两种不同的单克隆抗体，它们可以识别TRAP的不同表位。
11．权利要求10中所述的方法，其中采用了时间-分辨荧光免疫分析。
12．前述任意权利要求中所述的方法，其中的体液样品为血清。
13．诊断治疗对象体内与骨吸收速率改变有关疾病的方法，其特征在于在所述治疗对象的体液样品中测定耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)，通过TRAP 5b的异常量可以反映出与骨吸收速率改变有关的疾病。
14．权利要求13中所述的方法，其中所述的失调为骨质疏松症。
15．含有能够区分耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)和耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP 5a)抗体的测试盒(test-kit)。
16．检测药物治疗治疗对象体内与骨吸收速率增加有关疾病的效果的方法，其特征在于通过免疫分析方法对所述治疗对象体液样品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)进行测定，通过TRAP 5b量的降低可以反映出所述药物的作用。
17．权利要求16中所述的方法，其中的疾病为骨质疏松症。
18．对与骨吸收速率增加有关疾病具有易感性的治疗对象的筛选方法，特征在于通过免疫分析方法对所述治疗对象体液样品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)进行测定，TRAP 5b水平提高即表示对所述疾病具有易感性。
19．权利要求18中所述的方法，其所述的疾病为骨质疏松症。
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