CN1898567A - 通过测定冯维勒布兰德因子分解酶检测血栓症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种血栓形成倾向程度或血栓症的检测方法，其是对冯维勒布兰德因子分解酶进行定量。本发明还公开了一种包含与冯维勒布兰德因子分解酶特异性结合的抗体或其片段的血栓形成倾向程度或血栓症的检测用试剂盒。所述检测方法及检测用试剂盒的简便性、快速性、及特异性优良。

Description

通过测定冯维勒布兰德因子分解酶检测血栓症的方法
技术领域
本发明涉及一种通过测定冯维勒布兰德因子分解酶检测血栓形成倾向程度或血栓症的方法、以及检测用试剂盒。本发明中，可以利用例如采用针对冯维勒布兰德因子分解酶的单克隆抗体和/或多克隆抗体的免疫测定法。
背景技术
在生物体内因血管壁损伤而使内皮下组织暴露时，在血流中流淌的血小板迅速凝集。该凝集必需血浆中的人冯维勒布兰德因子(von-Willebrand factor；以下简称为“vWF”)的参与，它作为引发因子使得在血小板凝集、细胞内颗粒释放等一系列血小板活化过程后形成血栓，进行止血。通常vWF作为分子量20,000kDa以上的巨大分子由血管内皮分泌到血液中，在血液中被金属蛋白酶vWF分解酶切断，以500～20,000kDa的多聚体在血液中循环。疾病时(因阻塞等产生过高的应力的情况)，vWF的立体结构发生变化形成伸展的结构。已知该伸展的vWF具有很高的血小板凝集能力。另一方面，该伸展的vWF容易被vWF分解酶分解。但是，当由于某种原因该酶的活性降低时，通常较少见的巨大vWF分子在血液中会过量存在，其与血小板更有效地结合，由此促进血管内血小板的凝集，从而在微循环中形成血栓。以上述血小板为主体的血栓形成虽然在生理性止血机理上是不可缺少的，但另一方面血栓也会引起心肌梗塞、脑梗塞、脑血栓等血栓性疾病，随着社会的高龄化已列死亡原因的前几位，成为深刻问题。
已经明确vWF分解酶与非常严重的致死率很高的血栓形成性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura；以下简称为“TTP”)的发病有关、在急性的散发性TTP中产生抑制vWF分解酶活性的自身抗体、以及在家族性TTP中vWF分解酶失活。但是关于vWF分解酶自身的鉴定，在1996年仅一部分被提纯(非专利文献1)，全部内容的鉴定一直到2001年才获成功。在体外(in vitro)，如没有1.5mol/L尿素/5mmol/L Tris缓冲液(pH8.0)的存在则不显示酶活性，因此很长一段时间难以进行物质测定。近年来血浆vWF分解酶的提纯已获成功(非专利文献2及3)，并进行了cDNA克隆，其基因归属于ADAMTS(a disintegrin like and metalloprotease withthrombospondin type 1motif)家族，被命名为ADAMTS13(非专利文献4及5)。而在同期，还发现在家族性TTP中，因为在vWF分解酶的基因：ADAMTS13中存在突变而导致vWF分解酶活性显著下降(非专利文献6)。
迄今为止，vWF分解酶的活性测定法是采用组合了SDS-琼脂糖电泳及放射自显影法、或蛋白质印迹法的vWF巨大多聚体的检测法(非专利文献1)。但是该法的测定中必须准备无蛋白酶的vWF，测定需要3天，还包含很多因实验室不同得到的结果也有差别等繁杂的步骤，至今尚未普及到日常的临床检查中。
另外近年来发展了一种测定vWF分解酶活性的方法，该方法包含以下步骤：通过基因重组技术在大肠杆菌中表达作为冯维勒布兰德因子的vWF分解酶分解位点的A2结构域的部分区域，将该重组蛋白质与患者检品混合一定时间，然后组合SDS电泳和蛋白质印迹法，通过检测检品中的vWF分解酶引起的A2结构域的分解产物来检测vWF分解酶的活性(非专利文献7)。但是，本方法也含有制备重组蛋白质、电泳等繁杂的步骤，因此难以在一般的检测室中使用。
另外，尚未清楚原因和特征症状、因免疫学机理介导的血小板破坏亢进而导致血小板减少的疾病被称为特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpra；ITP)，大多数被认为是由针对血小板的自身抗体诱发产生的自身免疫疾病。作为ITP患者的抗血小板抗体识别的抗原，鉴定为主要是血小板膜蛋白质的GPIIb-IIIa，已发展了多种对于该蛋白质的特异性抗体的检测法。其中利用针对GPIIb-IIIa单克隆抗体的抗原捕捉检测法(antigen capture assay)被广泛使用。虽然该方法因特异性高而且假阳性少而闻名，但是其可用的单克隆抗体几乎没有市售，且必需从血小板的提取到溶解等的繁琐的操作，因此有必要开发简便的试剂盒并进行标准化。
非专利文献1：M.Furlan等，《血液》(Blood)，(美国)，1996年，第87卷，p.4223-4234
非专利文献2：H.Gerritsen等，《血液》(Blood)，(美国)，2001年，第98卷，p.1654-61
非专利文献3：K.Fujikawa等，《血液》(Blood)，(美国)，2001年，第98卷，p.1662-6
非专利文献4：X.Zheng等，《生物化学杂志》(The Journal ofBiological Chemistry)，(美国)，2001年，第276卷，p.41059-63
非专利文献5：K.Soejima等，《生化杂志》(The Journal ofBiochemistry)，2001年，第130卷，p.475-80
非专利文献6：G.G.Levy等，《自然》(Nature)，(英国)，2001年，第413卷，p.488-494
非专利文献7：K.Kokame等，《血液》(Blood)，(美国)，2003年，08，2861(即将发表)
发明内容
如上所述，目前尚未出现一种能够简便、更准确地检测血小板凝集参与的血栓症的原因及血栓症的方法，该种检测方法亟需建立。
因此，本发明的目的为建立一种上述业界所希望的血小板凝集参与的血栓症的血栓形成倾向检测方法。通过本发明，可提供一种为了实现挽救率的提高或更加贴合病情的治疗方针的决定等、迄今为止全新的血栓症的治疗的诊断方法。本发明人为达到上述目的，进行了深入研究，结果通过应用针对vWF分解酶单克隆抗体或多克隆抗体的酶联免疫测定法，发现血栓症患者血浆中的vWF分解酶的浓度比健康正常人显著下降的事实，从而完成了本发明。
上述课题可通过本发明的血栓形成倾向程度或血栓症的检测方法解决，该方法的特征在于，对冯维勒布兰德因子分解酶进行定量。
根据本发明的检测方法的优选方案，上述血栓症为急性或慢性骨髓性白血病、急性前髓细胞性白血病、全身性红斑狼疮、肺栓塞、脑梗塞、肝中央静脉闭塞症、急性淋巴细胞白血病、血栓性微血管病、血栓形成性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症综合征、或深部静脉血栓症。
另外，根据本发明的检测方法的另外的优选方案，可检测反复形成回路(シャント建設)的慢性透析患者的血栓形成倾向程度。
根据本发明的检测方法的优选方案，采用与健康正常人相比冯维勒布兰德因子分解酶浓度的降低为指标。
根据本发明的检测方法的更优选的方案，冯维勒布兰德因子分解酶的定量通过使用与冯维勒布兰德因子分解酶特异性结合的抗体或其片段的免疫学方法进行。
本发明涉及一种血栓形成倾向程度或血栓症的检测用试剂盒，其特征为含有与冯维勒布兰德因子分解酶特异性结合的抗体或其片段。
需要说明的是，本说明书中的术语“分析”(例如自身抗体分析)包含判断分析对象物质(例如自身抗体)是否存在的“检测”、以及对分析对象物质的量进行定量或半定量的“测定”。
本发明可以检测例如以肺栓塞、脑血栓、以及白血病等为代表的血栓症患者的血栓性程度，其临床价值非常高。根据本发明方法，可以实现简便性、快速性、及特异性优良的血栓倾向程度或血栓症的诊断。
特别是在vWF分解酶的定量中，现在采用电泳的活性测定法测定需要3天，而且其判断因测定者、测定中使用的试剂等而异，与此相对，使用免疫学方法时测定时间只为3～4小时，且能够重现性很好地进行测定。
附图说明
[图1]表示使用单克隆抗体的组合、或单克隆抗体和多克隆抗体的组合时的标准曲线图。
[图2]表示在使用与vWF分解酶特异性结合的单克隆抗体WH10及单克隆抗体WH2-22-1A时，比较健康正常人和各种疾病组的vWF分解酶量得到的结果图。
[图3]表示在使用与vWF分解酶特异性结合的单克隆抗体WH10及单克隆抗体WH63.1时，比较健康正常人和各种疾病组的vWF分解酶量得到的结果图。
[图4]表示在使用与vWF分解酶特异性结合的单克隆抗体WH10及多克隆抗体时，比较健康正常人和各种疾病组的vWF分解酶量得到的结果图。
[图5]表示在使用与vWF分解酶特异性结合的单克隆抗体WH10及单克隆抗体WH2-22-1A时，慢性透析患者形成回路的有无引起的透析前、透析开始2小时后、及透析后的vWF分解酶量的变化的图。
具体实施方式
[1]本发明的检测方法
在本发明的检测方法中，通过对冯维勒布兰德因子分解酶(vWF分解酶)的浓度进行定量，并与健康正常人的vWF分解酶浓度相比较，可以评价血栓形成倾向程度，并且还可以判断有无血栓症。
本说明书中的“冯维勒布兰德因子分解酶”指特异性地切断冯维勒布兰德因子(vWF)A2结构域中存在的酪氨酸(842)和蛋氨酸(843)，也被称为ADAMTS13的金属蛋白酶。
如后述实施例2所示，与健康正常人相比，与血小板凝集相关的血栓症患者体液样品中含有的vWF分解酶的浓度在统计学意义上显著降低。因此，本发明的检测方法中，对vWF分解酶浓度进行定量，当与健康正常人的vWF分解酶浓度相比降低时，可以判断为血栓症。
作为上述血栓症，可举出例如急性骨髓性白血病(acute myeloidleukemia；AML)、慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia；CML)、急性前髓细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia；APL)、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus；SLE)、肺栓塞、脑梗塞、肝中央静脉闭塞症(veno-occlusive disease；VOD)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia；ALL)、血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy；TMA)、深部静脉血栓症(deepvein thrombosis；DVT)等。上述血栓性微血管病(TMA)的代表疾病包括血栓形成性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenicpurpura；TTP)、溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremic syndrome；HUS)等。
TTP被认为是具有以下5大特征的重症疾患：(1)血小板减少、(2)微血管障碍性溶血性贫血、(3)肾功能障碍、(4)发热、以及(5)不稳定性精神神经障碍。而HUS被认为是具有以下3大主要特征的重症疾患：(1)血小板减少、(2)微血管障碍性溶血性贫血、以及(3)肾功能障碍。从病理表现的类似性考虑TTP和HUS被共同视为TMA的共同病态，在临床诊断上，通过判断有无上述(5)不稳定性精神神经障碍、以及有无肾障碍的恶化来鉴别TTP和HUS。另外近年来建立了vWF分解酶活性及其抑制物效价的测定法，也可根据此方法进行鉴别。
如后述实施例3所示，反复形成回路的患者与未形成回路的患者相比，其vWF分解酶的量显著降低，该现象与反复形成回路患者形成血栓的倾向强相关。另外，透析开始2小时后，与透析后相比vWF分解酶的量显著降低，这与透析过程中显示血栓性，回路容易堵塞的临床观察一致。这些结果显示，vWF分解酶量的降低与血栓形成倾向上升之间具有相关关系。因此，在本发明的检测方法中，对vWF分解酶的浓度进行定量，当与健康正常人的vWF分解酶浓度相比低时，可判断为具有强烈的血栓形成倾向。
在本说明书中，vWF分解酶的浓度低不仅包含vWF分解酶绝对量少的情况，还包含表观vWF分解酶量少的情况，例如因为存在针对vWF分解酶的自身抗体，vWF分解酶与上述自身抗体形成复合物，使表观vWF分解酶量减少的情况。
在本发明的方法中，vWF分解酶的定量可通过例如免疫学方法或生化方法(例如酶化学方法)等进行，优选采用与vWF分解酶特异性结合的单克隆抗体和/或多克隆抗体或它们的片段的免疫测定法进行。
上述抗体片段可使用例如Fab、Fab’、F(ab’)2、或Fv。以下，基于使用抗体(即免疫球蛋白分子本身)的情况对本发明的方法进行说明，但如为本领域技术人员，可以使用适当的抗体片段代替上述抗体。
在本发明方法中，优选使用不同的2种或以上的抗vWF分解酶抗体，具体而言，更优选使用第1抗vWF分解酶单克隆抗体、及通过与该1抗体的结合区域不同的其它区域与vWF分解酶结合的抗vWF分解酶单克隆抗体(即第2单克隆抗体)或多克隆抗体的组合。
抗vWF分解酶单克隆抗体可举出例如小鼠单克隆抗体WH10(IgG1)、WH2-22-1A(IgG1)、WH63.1(IgG1)、WH7-2B(IgG1)、WH14-3(IgG1)、或WH50-3(IgG1)等，优选抗vWF分解酶单克隆抗体中的至少一种为小鼠单克隆抗体WH10(IgG1)、WH2-22-1A(IgG1)、或WH63.1(IgG1)。作为上述第1单克隆抗体，优选上述抗体WH10，作为上述第2单克隆抗体，优选上述抗体WH2-22-1A或WH63.1。
需要说明的是，上述小鼠单克隆抗体WH10、WH2-22-1A、以及WH63.1分别为杂交瘤株WH10、WH2-22-1A、以及WH63.1所产生的抗体。
杂交瘤株WH10及WH63.1分别于2002年(平成14年)9月4日在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(地址： 305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行国际保藏，其保藏编号分别为FERM BP-8174和FERM BP-8175。
杂交瘤株WH2-22-1A于2003年(平成15年)4月22日在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心进行国内保藏，并于2003年(平成15年)9月12日移交为国际保藏。国际保藏编号(国际保藏编号之后的[]内为国内保藏编号)为FERM BP-08483[FERMP-19324]。
本发明中使用的单克隆抗体或多克隆抗体除了可使用vWF分解酶作为免疫原以外，还可采用公知的抗体制造方法进行制备。另外，还可使用虽未保藏但可通过同样的操作得到的所有的抗体：WH7-2B、WH14-3、或WH50-3。
本发明方法中使用免疫测定法时，可依照通常的采用夹心法的酶联免疫测定法(ELISA法)，或者依照通常的竞争法、采用夹心法等的RIA法、凝集法等。这些各种方法的操作及步骤等可按照常法进行。
本发明方法特别优选采用抗vWF分解酶单克隆抗体的2步夹心法。该方法可代表性地如下进行实施。
即，可如下进行实施：使用固定化于适当的载体(例如96孔板等)的抗vWF分解酶单克隆抗体作为第1抗体，使其与含有测定对象物质(即vWF分解酶)的被检样品(例如实验样品等检测物)或vWF分解酶标准溶液在室温下反应2小时(第1步)，然后，通过将作为第2抗体的酶标记抗vWF分解酶抗体(例如，小鼠抗vWF分解酶单克隆抗体)加入上述板中，在室温下反应1小时左右，使上述第2抗体和第1步骤中的反应产物(单克隆抗体与测定对象物质的反应产物)反应(第2步)，然后加入显色溶液进行显色反应，用0.5N硫酸终止显色反应，测定得到的显色反应液的吸光度。
作为另一种优选的方案，在第1步之后，通过将作为第2抗体的抗vWF分解酶兔血清(兔抗vWF分解酶多克隆抗体)加入上述板中，在室温下反应1小时左右，使上述第2抗体和第1步的反应产物(单克隆抗体与测定对象物质的反应产物)反应。还可将一定量抗兔IgG抗体等的标记抗体加入上述板中，在室温下反应1小时左右。通过这些方法，可定量被检样品中的vWF分解酶。
在上述方法中，使用的各抗体的固定化(不溶化)可通过按照常规方法使上述抗体物理或化学地结合在不溶性载体上而进行。作为用于上述不溶化的载体可使用例如聚苯乙烯、交联葡聚糖、离子交换树脂、塑料管、或氨基共聚物等。不溶化可通过例如作为共价键法的重氮法、肽法、或烷基化法、采用交联试剂的载体结合法、采用离子交换树脂等载体的离子键法、或采用玻璃珠等多孔性玻璃作为载体的物理吸附法等来进行。
作为上述多克隆抗体，只要识别抗vWF分解酶，并无特别限制，可利用上述单克隆抗体的制备中公开的将免疫抗原施予哺乳动物而在生物体内产生的抗血清，其可按照常规方法进行采集。
另外，作为用于标记的标记抗体，可使用公知的，例如将已有市售的免疫小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、山羊、马、或牛等动物得到的抗血清用适当的酶、例如过氧化物酶(POD)、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、或酸性磷酸酶等标记得到的抗免疫球蛋白抗体，例如POD标记抗兔IgG抗体或POD标记抗小鼠IgG抗体等。该酶标记可通过常规方法进行。
在本发明方法中，作为被检样品优选例如血浆形态的血液，但除此之外，还可以使用例如细胞组织液、淋巴液、胸腺水、腹水、羊水、胃液、尿、胰脏液、骨髓液、或唾液等各种液体。另外，上述血浆优选为柠檬酸血浆。
作为上述测定系统中使用的溶剂，可采用不会对反应产生不良影响的通常的各种溶剂中的任一种，优选使用pH为约5.0～9.0左右的缓冲液，例如柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液、或碳酸缓冲液等。需要说明的是，本发明中，使上述溶剂中包含约0.1～10w/v％左右的血清和/或约0.1～1M左右的NaCl更符合本发明方法的目的，因而优选。
在本发明方法中，免疫反应结束后的固相-液相(上述2步夹心法中的反应复合物与标记抗体的结合物-非结合标记抗体)的分离可通过例如离心分离、过滤、倾析、或洗涤等常用方法进行。
另外，如上述所分离的各物质的酶标记活性测定，可根据使用的酶种类的不同，按照公知的各种方法进行。作为此时使用的显色溶液，可使用通常的显色溶液，例如使用过氧化物酶时，可使用四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)等，显色反应的终止也可按照常法，通过例如向反应液中添加0.5～4N的硫酸等适当的酶活性抑制剂进行。
[2]本发明的检测用试剂盒
本发明的检测用试剂盒至少含有抗vWF分解酶抗体或其片段，优选含有2种或以上抗vWF分解酶抗体。本发明的检测用试剂盒可用于实施本发明的方法。
本发明的检测用试剂盒更优选使用第1抗vWF分解酶单克隆抗体、和在与该第1抗体的结合区域不同的其它区域与vWF分解酶结合的抗vWF分解酶单克隆抗体(即，第2单克隆抗体)或多克隆抗体的组合。
上述第1抗体优选预先固定在适当的载体(即固定化载体)上。另外，上述第2抗体也可以为标记抗体，或者也可进一步在试剂盒中增加在针对第2抗体的抗体上结合标记得到的标记抗体，以代替对第2抗体的标记化。
在含有上述单克隆抗体的试剂中，也可添加稳定剂、例如甘油或牛血清蛋白等。该抗体试剂可为液态，也可为冷冻干燥品，此时试剂中也可含有水溶性或可与水混合的溶剂。进一步，抗体试剂中可配合使重新组成的试剂系统保持一定pH的缓冲液、或用于防止样品变质的保存剂。缓冲液优选使用在实施本发明方法时使pH约为5.0～9.0的缓冲液。重新组成的试剂优选含有水，也可以将上述水的一部分或全部置换为可与水混合的溶剂。该可与水混合的溶剂可例举公知的溶剂，例如甘油、醇类、或乙二醇醚类等。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明的范围并不受此限定。
实施例1：vWF分解酶的定量
(a)单克隆抗体的组合：vWF分解酶的夹心酶联免疫测定法
在以vWF分解酶为免疫原获得的6种抗vWF分解酶单克隆抗体(WH10、WH2-22-1A、WH63.1、WH7-2B、WH14-3及WH50-3)中，按照以下步骤，研究最适合于测定的抗体组合。
即，将抗vWF分解酶单克隆抗体用磷酸缓冲生理盐水(PBS)稀释为2μg/mL，向96孔EIA板(ヌンク社制)的各孔中各添加100μL，在4℃下包被一晚。接着用PBS洗涤除掉过量的抗体，然后以每孔250μL的量添加含有2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS，在4℃下封闭一晚。用含有0.1％Tween20的PBS(PBST)洗涤除去封闭液，添加100μL检测物(正常人混合血浆)或采用纯化vWF分解酶抗原制备的标准品，在室温下反应2小时。用PBST洗涤除去反应液，然后添加1μg/mL生物素标记的抗vWF分解酶单克隆抗体100μL，在室温下反应1小时。反应后，与上述同样进行洗涤，然后添加100μL的0.1μg/mL过氧化物酶标记的链霉抗生物素(バイオラツド社制)，在室温下反应1小时，洗净后，向各孔中各添加100μL四甲基联苯胺(TMB)溶液/过氧化氢溶液(KPL社)，在室温下反应15分钟。然后使用微孔板用比色计测定450nm处的吸光度。
结果显示，单克隆抗体的任一种组合均可进行测定，但使用单克隆抗体WH10作为固定化抗体进行包被，使用单克隆抗体WH2-22-1A或WH63.1作为第2抗体的组合是能够以最高敏感度进行测定的组合。
(b)单克隆抗体的酶标记
按照Imagawa等的方法(Imagawa等(1982)J.Appl.Biochem.，4，41)用过氧化物酶对抗体WH2-22-1A及WH63.1进行标记。
(c)使用单克隆抗体的夹心酶联免疫测定法
将抗vWF分解酶单克隆抗体WH10以2μg/mL的浓度对96孔EIA板(ヌンク社制)进行包被，使用正常人混合血浆作为标准品，采用实施例1(b)的过氧化物酶标记的WH2-22-1A或WH63.1作为第2抗体，使用TMB溶液/过氧化氢溶液(KPL社)作为基质溶液，0.5N硫酸溶液作为反应终止液，按照实施例1(a)同样的方法进行纯化vWF分解酶的测定。测定450nm处的吸光度。
结果如图1所示。图1中Y轴的单位为吸光度(450nm)。将正常人混合血浆定义为1单位(U)时，如图1所示，可以对0.03U或以上的vWF分解酶进行正确的定量。
(d)单克隆抗体和多克隆抗体的组合：vWF分解酶的夹心酶联免疫测定法
将抗vWF分解酶单克隆抗体WH10用PBS稀释至2μg/mL，按照每孔100μL的量分别添加至96孔EIA板(ヌンク社制)的各孔中的各孔中，在4℃下包被一晚。用PBS洗涤除去过量的抗体，然后以每孔250μL的量向各孔中添加含有25％BLOCK ACE(大日本制药社)的PBS，在室温下封闭2小时。在抽滤除去封闭液之后，添加100μL的正常人混合血浆，在室温下反应2小时。用PBST洗涤除去反应液后，添加100μL的0.5μg/mL抗vWF分解酶多克隆抗体，在室温下反应1小时。反应后，按上述同样的方法进行洗涤，然后添加100μL稀释10000倍的过氧化物酶标记抗兔IgG多克隆抗体(バイオラツド)，在室温下反应1小时后，按上述同样的方法进行洗涤，向各孔中添加100μL的TMB溶液/过氧化氢溶液(KPL社)，在室温下反应5分钟后，添加0.5N硫酸溶液100μL。然后使用微孔板用比色计测定450nm处的吸光度。
结果如图1所示。图1中的符号“PoAb”指多克隆抗体。将正常人混合血浆定义为1单位(U)时，如图1所示，通过使用该抗体组合，也可以对0.03U或以上的vWF分解酶进行正确的定量。
实施例2：各种疾病组中的vWF分解酶浓度的比较
通过实施例1(c)及(d)中所述组合的夹心酶联免疫测定法对血浆中的vWF分解酶进行定量。该定量中，使用正常人混合血浆作为标准物质，将其作为1U。
使用抗体WH10及抗体WH2-22-1A的组合时的结果在图2中示出，使用抗体WH10及抗体WH63.1的组合时的结果在图3中示出，使用抗体WH10及多克隆抗体的组合时的结果在图4中示出。总结健康正常人及各种疾病组中的vWF分解酶量的比较的结果在表1中示出。
图2～图4及表1中的各符号“AML”、“APL”、“CML”、“HUS”、“TTP”、“ALL”、“SLE”及“DVT”分别表示急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)、急性前髓细胞性白血病(acutepromyelocytic leukemia)、慢性骨髓性白血病(chronic myeloidleukemia)、溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremic syndrome)、血栓形成性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenicpurpura)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、深部静脉血栓症(deep vein thrombosis)。另外，表1中的各符号“MEAN”、“SEM”及“normal”分别表示平均值、标准误差、及健康正常人。图2～图4中的Y轴的单位是由正常人混合血浆的稀释系列样品制作的标准曲线计算出的单位。
相对于测定的12例健康正常人vWF分解酶浓度的平均值，各疾病组的vWF分解酶浓度的平均值利用任一种抗体组合所测定的结果均显著低。另外，虽未示出具体的数值，但确认肝中央静脉闭塞症(veno-occlusive disease；VOD)患者，vWF分解酶浓度比正常人低。
  疾病组   健康正常人   AML   APL   CML   TTP   HUS   ALL   肺栓塞   脑梗塞   SLE   DVT
  第2抗体   N＝   12   31   10   4   7   5   11   17   18   12   7
  WH2-22-1A   MEANSEMp＜   1.0270.028-   0.5550.1100.001   0.4310.0290.001   0.5970.0050.001   0.3560.0051E-07   0.3750.0360.001   0.6160.1470.010   0.7110.1040.002   0.6590.0690.001   0.6110.0520.001   0.5840.0740.001
  WH63   MEANSEMp＜   1.0950.205-   0.5850.2190.005   0.6230.1840.050   0.4390.0120.050   0.3250.0256E-05   0.3870.0360.001   0.4710.0730.001   0.6570.1450.050   0.5730.1310.005   0.6170.0320.005   0.5430.0390.010
  POAb   MEANSEMp＜   0.9020.004-   0.6140.0820.001   0.5880.0920.010   0.6290.0020.001   0.3880.0639E-05   0.5220.0390.020   0.6770.1330.067   0.7420.0860.050   0.6390.0760.001   0.7140.0490.020   0.7140.0520.077
实施例3：慢性透析患者是否形成回路引起的透析前、透析开始2小时后、透析后的vWF分解酶量的变化
使用来自反复形成回路的慢性透析患者的血浆、及来自没有形成回路的慢性透析患者的血浆，通过使用实施例1(c)记载的组合中的抗体WH10及抗体WH2-22-1A组合的夹心酶联免疫测定法，对血浆中vWF分解酶进行定量。结果在图5中表示。图5中的Y轴单位为由正常人混合血浆的稀释系列样品制作的标准曲线计算出的单位。另外，图5中的符号“PLT＜10^5”表示血小板数不足1×105/μL。
反复形成回路的患者与未形成回路的患者相比，vWF分解酶量显著降低，与反复形成回路的患者强的血栓形成倾向密切相关。另外，透析开始2小时后与透析后相比vWF分解酶的量显著降低，与在透析过程中显示血栓性，容易形成回路的临床观察一致。
该结果表明，如上所述，通过本发明方法不仅可进行血栓症患者血栓程度的检测，还具有可以容易地监测形成回路的慢性透析患者透析后的血栓性程度、实现回路闭塞的预测、预后的病程现察的优点。
产业实用性
本发明可适用于血栓形成倾向程度或血栓症的检测的用途。
以上，按照特定的方案对本发明进行了说明，但本领域技业人员自明的变形、改良也包含在本发明的范围。
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Claims (6)

1.一种血栓形成倾向程度或血栓症的检测方法，其特征为对冯维勒布兰德因子分解酶进行定量。
2.如权利要求1所述的方法，所述血栓症包括急性或慢性骨髓性白血病、急性前髓细胞性白血病、全身性红斑狼疮、肺栓塞、脑梗塞、肝中央静脉闭塞症、急性淋巴细胞白血病、血栓性微血管病、血栓形成性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症综合征、或深部静脉血栓症。
3.如权利要求1所述的方法，其可检测反复形成回路的慢性透析患者的血栓形成倾向程度。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其采用与健康正常人相比冯维勒布兰德因子分解酶浓度的降低为指标。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，冯维勒布兰德因子分解酶的定量通过使用与冯维勒布兰德因子分解酶特异性结合的抗体或其片段的免疫学方法进行。
6.一种血栓形成倾向程度或血栓症的检测用试剂盒，其特征为包含与冯维勒布兰德因子分解酶特异性结合的抗体或其片段。
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