KR20060123348A

KR20060123348A - 본 윌브랜드 인자 분해효소의 측정에 의한 혈전병의검출방법

Info

Publication number: KR20060123348A
Application number: KR1020067012032A
Authority: KR
Inventors: 토모꼬 오노; 켄지 소에지마; 마사키 히라사미; 와타루 모리카와; 요이치 사카타
Original assignee: 가부시키가이샤 미쓰비시 가가쿠 야토론; 쥬리디컬 파운데이션 더 케모-세로-쎄라퓨틱 리서치 인스티튜트
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2006-12-01
Also published as: US20070275414A1; JP4621593B2; CA2550939A1; JPWO2005062054A1; US8088624B2; EP1712918B1; ES2387880T3; CN1898567A; WO2005062054A1; EP1712918A1; EP1712918A4

Abstract

본 발명은 본 윌브랜드 인자 분해효소를 정량하는 혈전형성 경향의 정도 또는 혈전병의 검출방법을 개시한 것이다. 또한, 본 윌브랜드 인자 분해효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 포함하는 혈전형성 경향의 정도 또는 혈전병 검출용 키트를 개시한다. 상기 검출방법 및 검출용 키트는 간편성, 쾌속성 및 특이성이 우수하다.

본 윌브랜드 인자 분해효소, 혈전병, 검출방법, 혈전형성

Description

본 윌브랜드 인자 분해효소의 측정에 의한 혈전병의 검출방법{Method of Detecting Thrombosis through Measuring of Von Willebrand Factor Splitting Enzyme}

본 발명은 본 윌브랜드 인자 분해효소의 측정에 의한 혈전형성 경향의 정도 또는 혈전병의 검출방법 및 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명에서는, 예를 들면, 본 윌브랜드 인자 분해효소에 대한 모노클로날 항체 및/또는 폴리클로날 항체를 사용하는 면역측정법을 이용할 수 있다.

생체 내의 혈관벽의 상해에 의하여 내피 아래 조직이 노출되면, 혈류 중을 흐르는 혈소판이 빠르게 점착한다. 이 점착에는 혈장 중의 사람 본 윌브랜드 인자(von Willebrand factor; 이하,.[vWF]로 표기)가 필요하며, 이것이 계기가 되어 혈소판 응집, 세포내 과립 방출이라는 일련의 혈소판 활성화 과정이 일어난 후에 혈전이 형성되어 지혈이 일어난다. 통상, vWF는 분자량 20,000kDa 이상의 거대분자로서 혈관내피에서 혈액 내로 분비되고, 여기서 메탈로프로테이즈인 vWF 분해효소에 의하여 절단되어 500~20,000kDa의 멀티머로서 혈액 내를 순환한다. 질환 시(패 색 등에 의한 심한 응력이 생긴 경우)에는 vWF의 입자 구조의 변화가 일어나 확장된 구조가 된다. 상기 확장된 vWF는 혈소판 응집능이 높다고 알려져 있다. 한편, 상기 확장된 vWF는 vWF분해효소에 분해되기 쉽다. 그러나, 어떤 이유로 상기 효소활성이 저하된 경우, 통상 인정되지 않는 거대 vWF분자가 과도하게 혈중에 존재하여, 혈소판과 보다 효과적으로 결합하여, 혈관내에 혈소판의 응집을 촉진하고, 미소순환(微小循環)에 혈전을 형성한다고 생각되어지고 있다. 이러한 혈소판을 주체로하는 혈전형성은 생리적인 지혈기구에 필요불가결한 것이나, 한편으로 혈전은 심근경색, 뇌경색, 뇌혈전이라는 전혈성질환을 일으켜, 사회의 고령화와 함께 사망원인의 상위를 차지하는 심각한 문제가 되고 있다.

vWF 분해효소는 매우 심한 치사율이 높은 혈전성 혈소판 감소성 자반병(thrombotic thrombocytopenic purpura; 이하, [TTP]라고 함)의 발병에 관여하는 경우, 급성의 산발성 TTP에서는 vWF 분해효소 활성을 저해하는 자기항체가 생산되는 경우 및 가족성 TTP에서는 vWF 분해효소 활성은 실활되어 있는 경우가 밝혀져 있다. 그러나 vWF 분해효소 자체의 동정은 1996년에 일부분이 정제된 것 뿐으로(비특허문헌 1), 전체에 대해서는 2001년이 될 때까지 성공하지 못했다. 체외(in vitro)에서는 1.5 mol/L 요산/5mmol/L Tris 완충액 (pH 8.0) 존재 하가 아니면 효소활성을 나타내지 않기 때문에 장기간 물질을 동정하는 것이 곤란하였다. 최근, 혈장 vWF 분해효소의 정제 성공(비특허문헌 2 및 3) 또는 cDNA 클로닝이 수행되어 유전자가 ADAMTS(a distnetgrin like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif) 패밀리에 속하고, ADAMTS13으로 명명되었다 (비특허문헌 4 및 5). 또한, 같은 시기에 가족성 TTP에 대하여, vWF 분해효소의 유전자; ADAMTS13에 변이가 있기 때문에 vWF 분해효소 활성이 크게 저하되어 있는 것을 밝혔다(비특허문헌 6).

vWF 분해효소의 활성측정법은, 종래부터, SDS-아가로스 전기영동 및 오토래디오그라프 또는 웨스턴블럿법을 조합한 vWF 거대 멀티머의 검출법이 이용되어 왔다 (비특허문헌 1). 그러나, 상기 방법에 의한 측정에는 프로테아제 프리의 vWF를 준비하지 않으면 안되는 것과, 측정에 3일이 걸린다는 것, 연구실에 따라 결과가 다른 것 등의 복잡한 공정을 포함하고 있어, 일상의 임상검사로서는 보급되어 있지 않다.

또한, 근래 vWF 분해효소에 대한 본 윌브랜드 인자의 분해부위인 A2 도메인의 부분영역을 유전자 재조합에 의하여 대장균에서 발현시켜, 이의 재조합 단백질과 환자검체를 일정 시간 혼합한 다음, SDS 전기영동과 웨스턴블럿 법을 조합시켜, 검체 중의 vWF 분해효소에 의한 A2 도메인의 분해산물의 검출에 의하여 vWF 분해효소의 활성측정법이 고안되었다 (비특허문헌 7). 그러나, 상기 방법도 재조합 단백질의 제작과 전기영동 등의 복잡한 공정을 포함하기 때문에 일반적인 검사실에서의 사용이 어려운 점이 있었다.

또한, 명백한 원인이나 기초질환이 없이, 면역학적 메카니즘을 매개한 혈소판 파괴의 항진에 의한 혈소판 감소를 초래하는 질환은 특발성 혈소판 감소성 자반병(idiopathic thrombocytopenic purpura; ITP)으로 불리며, 이의 대부분은 혈소판에 대한 자기항체에 의하여 유발된 자기면역질환이라고 생각되어 지고 있다. ITP 환자의 항혈소판항체에 의하여 인식되는 항원으로서는, 주요하게는 혈소판막 단백질인 GPIIb-IIIa가 동정되어 있고, 상기 단백질에 대한 특이항체의 검출법이 다수 고안되어 있다. 이들 중에서도 GPIIb-IIIa에 대한 모노클로날 항체를 이용한 항원 캡쳐 어세이(antigen capture assay)가 광범위하게 이용되고 있다. 상기 방법은, 특이성이 높고, 위양성이 적은 것으로 알려져 있으나, 사용가능한 모노클로날 항체의 대부분이 시판되고 있지 않으며, 혈소판의 채집으로부터 용해 등의 복잡한 조작이 필요하기 때문에, 간편한 키트의 개발 및 표준화가 필요하다.

비특허문헌 1: M. Furlan 등, Blood, 87:223-4234, 1996, 미국

비특허문헌 2: H. Gerritsen 등, Blood, 98:1654-1661, 2001, 미국

비특허문헌 3: K. Fujikawa 등, Blood, 98-1662-1666, 2001, 미국

비특허문헌 4: X. Zheng 등, The Journal of Biological Chmistry, 276:41059-41063, 2001, 미국

비특허문헌 5: K. Sejima 등, The Journal of Biochemistry, 130:475-480, 2001

비특허문헌 6:G.G. Levy 등, Nature, 413, 488-494, 2001, 영국

비특허문헌 7: K. Kokame 등, Blood, 8:2861, 2003, 미국

발명의 개시

발명이 해결하려는 과제

상기와 같이 혈소판 응집이 관여하는 혈전병의 원인 및 혈전병을 간편하고, 보다 확실하게 검출하는 방법은, 아직 없으며, 이에 대한 검출법의 확립이 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 혈소판 응집이 관여하는 혈전병의 혈전형성 경향의 검출법을 확립하는 것이다. 이에 의하여, 구명률의 상승 또는 병의 상태에 따른 진료방침의 결정, 지금까지 없었던 혈전병의 치료를 목적으로한 진단법이 될 것으로 판단된다. 본 발명자들은, 상기 목적에 의하여 예의 연구한 결과, vWF 분해효소에 대한 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 응용한 효소면역측정법에 의하여, 혈전병 환자의 혈장 중의 vWF 분해효소의 농도가 정상인과 비교하여 현저하게 저하되어 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

과제 해결을 위한 수단

상기 과제는 본 발명에 의한, 본 윌브랜드 인자 분해효소를 정량하는 것을 특징으로 하는, 혈전형성 경향의 정도 또는 혈전병의 검출방법에 의하여 해결할 수 있다.

본 발명의 검출방법의 바람직한 양태에 의하면, 상기 혈전병은, 급성 또는 만성골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 전신성 에리토마토디스, 페색전, 뇌경색, 간중심정맥패색증, 급성 림프구성 백혈병, 전혈성 미소혈관장해, 전혈성 혈소판감소성 자반병, 용혈성 요독증증후군, 또는 심부정맥혈전병이다.

또한, 본 발명의 검출방법의 다른 바람직한 형태에 의하면, 션트(shunt)시술을 반복한 만성 투석환자의 혈전형성경향의 정도를 검출한다.

본 발명의 검출방법의 바람직한 양태에 의하면, 정상인과 비교한 본 윌브랜드 인자 분해효소 농도의 저하를 지표로 한다.

또한, 본 발명의 검출방법의 더욱 바람직한 양태에 의하면, 본 윌브랜드 인자 분해효소의 정량은, 본 윌브랜드 인자 분해효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 사용하는 면역학적 수법에 의하여 수행한다.

본 발명은, 본 윌브랜드 인자 분해효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전형성 경향의 정도 또는 혈전병의 검출용 키트에 관한 것이다.

그리고, 본 명세서의 용어 「분석」(예를 들면, 자기항체의 분석)에는, 분석대상물질(예를 들면, 자기항체)의 존재 유무를 판정하는 「검출」과, 분석대상 물질의 양을 정량적 또는 반정량적으로 결정하는 「측정」이 포함된다.

발명의 효과

본 발명은, 예를 들면, 폐색전, 뇌혈전 및 백혈병 등으로 대표되는 혈전병 환자의 혈전성의 정도의 검출을 가능하게 하였고, 이의 임상적 가치는 매우 높다. 본 발명의 방법에 의하면, 간편성, 쾌속성 및 특이성이 우수한 혈전경향의 정도 또는 혈전병의 진단이 가능하다.

특히, vWF 분해효소의 정량에 면역학적 수단을 사용한 경우, 현행의 전기영동에 의한 활성측정법에서는, 측정에 3일이 걸리고, 그 판정도 측정자나 측정에 사용하는 시약 등에 의하여 변동하는 것에 비하여, 특정시간도 3~4시간이 걸리는 동시에, 재현성 좋은 측정이 가능하다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

[1] 본 발명의 검출방법

본 발명의 검출방법에서는, 본 윌브랜드 인자 분해효소(vWF 분해효소)의 농도를 정량하고, 정상인의 vWF 분해효소 농도와 비교하는 것에 의하여, 혈전형성 경향의 정도를 평가할 수 있으며, 또한, 혈전병의 유무를 판단할 수 있다.

본 명세서의 「본 윌브래드 인자 분해효소」는 본 윌브래드 인자(vWF)의 A2 도메인에 존재하는 티로신(842)과 메티오닌(843)을 특이적으로 절단하고, ADAMTS13이라고도 불리는 메탈로프로테아제이다.

후술하는 실시예 2에 나타난 바와 같이, 혈소판 응집이 관여하는 혈전병 환자에서는, 정상인과 비교하여, 체액시료 중에 포함되어 있는 vWF 분해효소의 농도가 통계학적으로 유의하게 저하되어 있다. 따라서, 본 발명의 검출방법에서는 vWF 분해효소의 농도를 정량하고, 정상인의 vWF 분해효소 농도와 비교하여 낮은 경우에 혈전병으로 판정할 수 있다.

상기 혈전병으로는, 예를 들면, 급성골수성백혈병(acute myeloid leukemia;AML), 만성골수성백혈병(chronic myeloid leukemia;CML), 급성전골수구성백혈병(acute promyelocytic leukemia;APL), 전신성 에리토마토디스(systemic lupus erythematosus;SLE), 폐색전, 뇌경색, 간중심정맥패색증(veno-occlusive disease;VOD), 급성림프구성백혈병(acute lymphocytic leukemia;ALL), 혈전성미소혈관장해(thrombotic microangiopathy;TMA) 또는 심부정맥혈전병(deep vein thrombosis:DVT) 등을 들 수 있다. 상기 혈전성미소혈관장해(TMA)의 대표적인 질환으로서는, 혈전성 혈소판 감소성자반병(thrombotic thrombocytopenic purpura;TTP)이나 용혈성요독증증후군(hemolytic uremic syndrome;HUS)등이 포함된다.

TTP는 (1)혈소판감소, (2)미소혈관장해성용혈성빈혈, (3)신장기능장해,(4)발열 및 (5)동요성정신신경장애의 5대 특징이 나타나는 위독한 질환이다. 한편, HUS는 (1)혈소판감소, (2)미소혈관장해성용혈성빈혈 및 (3)신장기능장해의 3가지 주된 특징이 나타나는 위독한 질환이다. 증상의 유사성 때문에 TTP와 HUS는 모두, TMA라는 공통된 병의 상태로 생각되어져 왔으며, 임상진단 상, 전기 (5)동요성정신신경장애의 유무와 신장장애의 경중에 의하여 TTP와 HUS의 감별이 행하여져 왔다. 또한, 근년들어, vWF 분해효소 활성과 이의 저해제 역가의 측정법이 확립되어, 이에 의하여도 감별이 가능하다.

또한, 후술하는 실시예 3에 나타난 바와 같이, 션트 재건을 반복하고 있는 환자에서는 션트재건을 시술하지 않은 환자와 비교하여, vWF 분해효소양이 유의하게 저하되어 있고, 션트 재건을 반복하는 환자에서는 혈전형성 경향이 강한것과 상관이 있다. 또한, 투석개시 2시간 후에는, 투석 후에 비하여 유의하게 vWF 분해효소가 저하되어 있어, 투석 중에 혈전성을 나타내어, 션트가 막히기 쉽게된다는 임상관찰과 일치하였다. 이러한 결과는 vWF 분해효소량의 저하와 혈전형성 경향의 상승과의 사이에 상관관계가 있다는 것을 나타내고 있다. 따라서, 본 발명의 검출방법에서는 vWF 분해효소의 농도를 정량하고, 정상인의 vWF 분해효소 농도와 비교하여 낮은 경우에는 혈전형성 경향이 높다고 판정할 수 있다.

본 명세서에 있어서, vWF 분해효소의 농도가 낮은 것은, vWF 분해효소의 절대량이 낮은 경우가 포함되어 있을 뿐만아니라, 외관상의 vWF 분해효소량이 작은 경우, 예를 들면, vWF 분해효소에 대한 자기항체의 존재에 의하여, vWF 분해효소와 상기 자기항체의 복합체가 형성되어, 외관상의 vWF 분해효소량이 적게되는 경우도 포함된다.

본 발명의 방법에서는, vWF 분해효소의 정량을, 예를 들면, 면역학적 방법 또는 생화학적 방법(예를 들면,효소화학적 방법) 등에 의하여 수행할 수 있고, vWF 분해효소에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 및/또는 폴리클로날 항체 또는 이들의 단편을 이용한 면역측정법에 의하여 수행하는 것이 바람직하다.

상기 항체단편으로는, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 Fv를 이용할수 있다. 이하, 항체(즉, 면역글로불린 분자 그 자체)를 이용한 경우에 기초하여, 본 발명을 설명하고 있으나, 당업자라면, 상기 항체를 대신하여, 적의로 항체단편을 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법에서는, 서로 다른 2 종류 이상의 항 vWF 분해효소항체를 이용하는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는, 제1의 항 vWF 분해효소 모노클로날항체와 이의 제1항체의 결합영역과는 다른 별도의 영역에서 vWF 분해효소와 결합하는 항 vWF 분해효소 모노클로날 항체(즉, 제2의 모노클로날 항체) 또는 폴리클로날 항체와의 조합을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

항 vWF 분해효소 모노클로날 항체로서는, 예를 들면, 마우스 모노클로날 항체 WH10(IgG1), WH2-22-1A(IgG1), WH63.1(IgG1), WH7-2B(IgG1), WH14-3(IgG1), 또는 WH50-3(IgG1) 등을 들수 있다. 항 vWF 분해효소모노클로날 항체의 적어도 1종이 마우스 모노클로날 항체 WH10(IgG1), WH2-22-1A(IgG1) 또는 WH63.1(IgG1)인 것이 바람직하다.

그리고, 상기 마우스 모노클로날 항체 WH10, WH2-22-1A 및 WH63.1은 각각 하이브리도마 주 WH10, WH2-22-1A 및 WH63.1이 생산하는 항체이다.

하이브리도마 주 WH10 및 WH63.1은 각각 2002년(평성 14년) 9월 14일에 독립행정법인 산업기술연합회연구소 특허 생물기탁센타(주소:우305-8566 일본국 이바라기현 츠쿠바시 동1정목1번지1 중앙 제6)에 국제기탁된 것으로, 이의 수탁번호는 각각 FERM BP-8174 및 FERM BP-8175이다.

또한, 하이브리도마 주 WH2-22-1A는 독립행정법인 산업기술연합회연구소 특허 생물기탁센타에 2003년 (평성15년) 4월 22일에 국내기탁된 것으로, 2003년(평성 15년) 9월 12일부터 국제기탁에 이관되어 있다. 국제기탁번호(국제기탁번호에 이어서[] 내는 국내기탁번호)는 FERM BP-08483[FERM P-19324]이다.

본 발명에서 사용하는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체는 면역원으로서 vWF 분해효소를 사용하는 것 이외에는, 공지의 항체제조법에 의하여 제조할 수 있다. 또한, 기탁은 하고 있지 않으나, 동일한 조작에 의하여 얻어진 항체인 WH7-2B, WH14-3 또는 WH50-3도 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 면역측정법을 사용하는 경우에는, 예를 들면 통상의 샌드위치법에 의한 면역측정법(ELISA)법에 따를 수 있으며, 혹은 통상의 경합법, 샌드위치법 등에 의한 RIA법, 응집법 등에 따를 수도 있다. 이들 각 방법의 조작 및 순서 등은 통상의 방법에 따를 수 있다.

특히, 본 발명의 방법은, 항 vWF 분해효소 모노클로날 항체를 사용한 2 스탭 샌드위치법에 따르는 것이 바람직하다. 상기 방법은 예를 들면, 대표적으로는 다음과 같이 실시할 수 있다.

즉, 적당한 담체(예를 들면, 96웰 플레이트 등)에 고상화시킨 항 vWF 분해효소 모노클로날 항체를 제1항체로 사용하여, 이것과 측정대상 물질(즉, vWF 분해효소)을 포함하는 피시험시료(예를 들면, 실험샘플 등의 검체) 또는 vWF 분해효소 표준용액을 실온에서 2시간 반응시키는 [제 1 단계], 이어서, 제2항체로서의 효소표준 항 vWF 분해효소항체(예를 들면, 마우스 항 vWF 분해효소 모노클로날 항체)를 상기 플레이트에 첨가하여, 실온에서 1시간 정도 반응시키는 것에 의하여, 상기 제2항체와 제 1 단계의 반응물(모노클로날 항체와 측정 대상물질과의 반응물)과 반응시키는 [제 2 단계], 이어서, 발색용액을 첨가하여 발색반응시키고, 0.5N 염산에서 발색반응을 정지시켜, 얻어지는 발색반응액의 흡광도를 측정하는 것에 의하여 실시된다.

또한, 다른 바람직한 방법의 형태로서, 제1 단계의 다음으로, 제2항체로서의 항 vWF 분해효소 토끼 혈청(토끼 항 vWF 분해효소 폴리클로날 항체)를 상기 플레이트에 첨가하여, 실온에서 1시간 정도 반응시키는 것에 의하여, 상기 제2항체와 제 1단계에서의 반응물(모노클로날 항체와 측정대상물질과의 반응물)을 반응시킨다. 추가로, 항토끼 IgG 항체 등의 표지 항체 일정량을 상기 플레이트에 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시킬 수도 있다. 상기 방법에 의하여, 피검시료 중의 vWF 분해효소를 정량하는 것이 가능하다.

상기 방법에 있어서, 사용하는 각 항체의 고상화(불용화)는, 통상의 방법에 따라 이들 항체를 불용성 담체에 물리적 또는 화학적으로 결합시키는 것에 의하여 실시할 수 있다. 상기 불용화를 위한 담체로서는, 예를 들면, 폴리스틸렌, 세파덱스, 이온교환수지, 프라스틱칩 또는 아미노공중합체 등을 사용할 수 있다. 불용화는 예를 들면, 공유결합법으로서의 디아조법, 펩티드법 혹은 알킬화법, 가교시약에 의한 담체결합법, 이온교환수지와 같은 담체를 사용한 이온교환법 또는 글래스비드 등의 다공성 글래스를 담체로서 사용하는 물리적 흡착법 등에 의하여 수행할 수 있다.

상기 폴리클로날 항체로서는, 항 vWF 분해효소를 인식하는 것이라면, 특별히 한정되는 것이 아니며, 상기의 모노클로날 항체의 제조에 있어서 개시한 면역항원을 포유동물에 투여하여 생체 내에서 생산되는 항혈청을 이용할 수 있고, 이것은 통상의 방법에 따라 채취할 수 있다.

또한, 표식에 사용되는 표식항체로서는 공지의 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 이미 시판되고 있는 마우스, 랫트, 몰모트, 토끼, 양, 염소, 말 또는 소 등의 동물에 면역하여 얻어지는 항혈청을 적절한 효소, 예를 들면, 퍼옥시다아제(POD), 알칼리포스파다아제, β-D-갈락토시다아제 또는 산성 포스파타아제 등으로 표식한 항면역글로불린 항체, 예를 들면, POD 표지 항토끼 IgG 항체 또는 POD 표지 항마우스 IgG 항체 등을 사용할 수 있다. 상기 효소 표지는 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 피검시료로서는 예를 들면, 혈장형태의 혈액이 바람직하지만, 이 이외에도, 예를 들면, 세포조직액, 림프액, 흉선수, 복수, 양수, 위액, 소변, 췌장액, 골수액 또는 타액 등의 각종 체액을 사용할 수도 있다. 또한, 상기 혈장은 구연산 혈장인 것이 바람직하다.

상기 측정에 이용되는 용매로서는, 반응에 악영향을 주지않는 통상의 각종 용액을 어느 것이든 사용할 수 있으며, pH가 약 5.0~9.0 정도의 완충액, 예를 들면, 구연산 완충액, 인산완충액, 트리스-염산 완충액 도는 탄산완충액 등을 이용하는 것이 바람직하다. 또, 본 발명에 있어서, 상기 용매에 약 0.1~10W/V% 정도의 혈청 및/또는 약 0.1~1M 정도의 NaCl을 포함시키는 것이, 본 발명의 방법의 목적에 따라 합치하고 있어 바람직하다.

본 발명의 방법에서는, 면역반응 종료 후의 고상-액상(상기 2 단계 샌드위치 법에서의 반응복합체와 표지항체와의 결합체-비결합표지항체)의 분리를, 예를 들면, 원심분리, 여과선별, 디칸테이션(decantation,상층액분리) 또는 세정 등의 통상의 방법에 의하여 수행할 수 있다.

또한, 상기와 같이 분리된 각 물질의 효소표지활성의 측정은 사용한 효소의 종류에 따라서, 공지의 각종 방법에 의하여 실시할 수 있다. 이 때, 사용되는 발색용액으로는, 통상의 것, 예를 들면, 퍼옥시다아제를 사용하는 경우에는 테트라메칠벤디딘(TMB), ο-페닐렌디아민(OPD) 등을 사용할 수 있고, 발색반응의 정지도 통상의 방법에 따라, 예를 들면, 반응액에 0.5~4N의 염산 등의 적당한 효소활성 저해제를 첨가하는 것에 의하여 실시할 수 있다.

[2] 본 발명의 검출용 키트

본 발명의 검출용 키트는 vWF 분해효소 항체 또는 그의 단편을 적어도 포함하고, 서로 다른 2이상의 항 vWF 분해효소 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 검출용 키트는 본 발명의 방법을 실시하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 검출용 키트에서는, 제 1의 항 vWF 분해효소 모노클로날 항체와 상기 제 1 항체의 결합영역과 다른 영역에서 vWF 분해효소와 결합하는 항 vWF 분해효소 모노클로날 항체(즉, 제 2의 모노클로날 항체) 또는 폴리클로날 항체와의 조합을 이용하는 것이 더 바람직하다.

상기 제1 항체는 적당한 캐리어(즉, 고상화 담체)에 미리 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 상기 제2 항체는 표식항체일 수도 있으며, 혹은 제 2 항체를 표식화하는 대신에, 제 2 항체에 대한 항체에 표식을 결합시키는 표식항체를 추가로 키트에 포함시킬 수도 있다.

상기 모노클로날 항체를 포함하는 시약 중에는, 안정화제, 예를 들면, 글리세롤 또는 소 혈청 단백질 등을 첨가시킬 수도 있다. 상기 항체시약은 액상품일 수도 있고, 동결건조한 것을 수도 있으며, 이 경우 시약 중에 수용성 또는 물과 혼화할 수 있는 용매를 함유시킬 수도 있다. 추가로, 항체시약에는, 재구성된 시약을 일정의 pH로 유지하기 위한 완충액이나, 시료가 변질되는 것을 방지하기 위한 보존제를 배합할 수도 있다. 완충액으로는, 본 발명의 방법을 실시할 때에 pH를 약 5.0~9.0으로 유지하는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 재구성제는, 바람직하게는 물을 포함하는 것이지만, 상기 물의 일부 또는 전부를 물과 혼화할 수 있는 용매로 치환할 수도 있다. 상기 물과 혼화할 수 있는 용매로서는, 공지의 용매, 예를 들면, 글리세린, 알콜류, 또는 글리콜에테르류 등을 예시할 수 있다.

도 1은 모노클로날 항체의 조합 또는 모노클로날 항체와 폴리클로날 항체의 조합을 사용한 경우의 검량선을 나타낸 그래프이다.

도 2는 vWF 분해효소에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 WH10 및 모노클로날 항체 WH2-22-1A를 사용한 경우의 정상인 및 각종 질환군의 vWF 분해효소량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 vWF 분해효소에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 WH10 및 모노클로날 항체 WH63.1을 사용한 경우의 정상인 및 각종 질환군의 vWF 분해효소량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 vWF 분해효소에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 WH10 및 폴리클로날 항체를 사용한 경우의 정상인 및 각종 질환군의 vWF 분해효소량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 vWF 분해효소에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 WH10 및 모노 클로날 항체 WH2-22-1A를 사용한 경우의 만성투석환자의 션트재건 유무에 의한 투석전, 투석 개시 2시간 후 및 투석 후의 vWF 분해효소량의 추이를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1:vWF 분해효소의 정량>

(a) 모노클로날 항체의 조합:vWF 분해효소의 샌드위치 효소면역측정법

vWF 분해효소를 면역원으로하여 취득한 6 종류의 항 vWF 분해효소 모노클로날 항체(WH10, WH2-22-1A, WH63.1, WH7-2B, WH14-3 및 WH50-3) 중에서, 다음의 순서에 따라, 측정에 가장 적절한 항체의 조합을 조사하였다.

즉, 항 vWF 분해효소 모노클로날 항체를 인산완충화 생리식염수(PBS)에서 2㎍/mL로 희석하고, 96웰 EIA 플레이트(NUNC사 제조)에 각 웰당 100㎕씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 다음으로, 과잉의 항체를 PBS로 세척하여 제거한 후, 2% 소혈청알부민(BSA)를 포함하는 PBS를 각 웰에 250㎕ 씩 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 블록킹을 수행하였다. 블록킹 액을 0.1% Tween 20 함유 PBS(PBST)로 세척하여 제거한 후, 100㎕의 검체(정상 사람의 전혈장) 또는 정제 vWF 분해효소 항원에 의해 제조한 표준품을 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. PBST로 반응액을 세척 하여 제거한 후, 1㎍/mL의 비오틴 표지 항 vWF 분해효소 모노클로날 항체 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 상기와 동일한 방법으로 세척한 후, 0.1㎍/mL의 퍼옥시다아제 표지 스토렙트아비딘(BioRad사 제조) 용액 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰으며, 세척 후, 테트라메칠벤디딘(TMB) 용액과산화수소용액(KPL 사)을 각 웰 당 100㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 15분간 반응시켰다. 이어서, 마이크로플레이트 용 비색계에서 450nm의 흡광도를 측정하였다.

이 결과, 모노클로날 항체의 어떠한 조합도 측정이 가능하였으나, 모노클로날 항체 WH10을 고정화 항체로서 코팅에 사용하고, 모노클로날항체 WH2-22-1A 또는 WH63.1을 2차 항체로서 사용하는 조합이 가장 고감도로 측정이 가능한 조합이었다.

(b) 모노클로날 항체의 효소표지

항체 WH2-22-1A 및 WH63.1을 Imagawa 등의 방법 [Imagawa et al.(1982) J. Appl. Biochem., 4, 41]에 의하여 퍼옥시다아제로 표지하였다.

(c) 모노클로날 항체를 이용한 샌드위치 효소면역측정법

항 vWF 분해효소 모노클로날 항체 WH10을 2㎍/mL의 농도로 96웰 EIA 플레이트(NUNC사 제조)에 코팅을 수행하고, 표준품으로서 정상 사람 전혈장을 사용하여, 2차 항체로서 실시예 1의 (b)에서 퍼옥시다아제 표지한 WH2-22-1A 또는 WH63.1 기질용액으로서 TMB 용액/과산화수소용액(KPL사) 반응정지액으로서 0.5N 황산용액을 사용하여, 실시예 1의 (a)와 동일하게 정제한 vWF 분해효소의 측정을 수행하였다. 측정은 450nm의 흡광도를 측정하였다.

결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 Y 축의 단위는, 흡광도(450nm)이다. 정상 사람 전혈장을 1 Unit(U)로 정의하면, 도 1에 나타난 바와 같이, 0.03U 이상의 vWF 분해효소를 정확하게 정량할 수 있다.

(d) 모노클로날 항체와 폴리클로날 항체의 조합:vWF 분해효소의 샌드위치 효소면역측정법

항 vWF 분해효소 모노클로날 항체 WH10을 PBS로 2㎍/mL로 희석하고, 96 웰 EIA 플레이트(NUNC사 제조) 에 각 웰당 100㎕씩 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 이어서, 과잉의 항체를 PBS로 세척하여 제거한 후, 25% 브록에스(대일본제약사)를 포함하는 PBS를 각 웰당 250㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 2시간 블록킹을 수행하였다. 블록킹액을 흡인하여 제거한 후, 100㎕의 정상 사람 전혈장을 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. PBST로 반응액을 세척하여 제거한 후, 0.5㎍/mL 항 vWF 분해효소 폴리클로날 항체 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 상기와 동일하게 세척한 후, 10,000배 희석한 퍼옥시다아제 표지 항 토끼 IgG 폴리클로날 항체(BioRad) 100㎕를 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시킨 다음, 상기와 동일하게 세척한 후, TMB 용액/과산화수소용액(KPL사)을 각 웰에 100㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 5분간 반응시킨 후, 0.5N의 황산을 100㎕첨가하였다. 그 후, 마이크로플레이트용 비색계로 450nm의 흡광도를 측정하였다.

결과를 표 1에 나타내었다. 도 1의 기호 「PoAb」는 폴리클로날 항체를 의미 한다. 정상 사람 전혈장을 1U로 정의하면, 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 항체의 조합에 의하여도, 0.03U 이상의 vWF 분해효소를 정확하게 정량할 수 있었다.

<실시예 2: 각종 질환군에 있어서, vWF 분해효소 농도의 비교>

실시예 1의 (c) 및 (d)에 기재된 조합의 샌드위치 효소면역측정법에 따라, 혈장 중의 vWF 분해효소를 정량하였다. 상기 정량에 있어서, 정상 사람 전혈장을 표준물질로서 사용하여, 이를 1U로 하였다.

항체 WH10 및 항체 WH2-22-1A의 조합을 사용한 경우의 결과를 도 2에 나타내었고, 항체 WH10 및 항체 WH63.1의 조합을 사용한 경우의 결과를 도 3에 나타내었으며, 항체 WH10 및 폴리클로날 항체의 조합을 이용한 경우의 결과를 도 4에 나타내었다. 또한, 정상인 및 각종 질환자군의 vWF 분해효소량의 비교를 정리한 결과를 표 1에 나타내었다.

도 2 ~ 도 4 및 표 1의 각 기호 「AML」, 「APL」, 「CML」, 「HUS」, 「TTP」, 「ALL」, 「SLE」 및 「DVT」는, 각각 급성골수성백혈병(acute myeloid leukemia), 급성전골수성백혈병(acute promyelocytic leukemia), 만성골수성백혈병(chronic myeloid leukemia), 용혈성요독증증후군(hemolytic uremic syndrome), 혈전성혈소판감소성자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura), 급성림프구성백혈병(acute lymphocytic leukemia), 전신성에리토마토디스(systemic lupus erythematosus) 및 심부정맥혈전병(deep vein thrombosis)를 의미한다. 또한, 표 1의 각 기호 「MEAN」, 「SEM」 및 「normal」은 각각 평균치, 표준오차 및 정상인 을 의미한다. 도 2 ~ 도 4의 Y 축의 단위는, 정상 사람 전혈장의 희석례에서 제작한 검체선으로부터 산출한 Unit이다.

측정한 정상인 12 예의 vWF 분해효소 농도의 평균치에 대하여, 각 질환군의 vWF 분해효소 농도의 평균치는, 어떠한 항체의 조합에 의한 측정결과에 있어서도 이보다 유의하게 낮은 수치를 나타내었다. 또한, 구체적 데이타는 나타내지 않았으나, 간중심정맥패색증(veno-occlusive disease:VOD) 환자에 있어서도, vWF 분해효소가 정상인 보다 낮은 수치인 것을 확인하였다.

<실시예 3: 만성투석환자의 션트 재건의 유무에 의한 투석전, 투석개시 2시간 후, 투석 후의 vWF 분해효소량의 추이>

션트 재건을 반복하여 수행한 만성투석환자 유래의 혈장과, 션트 재건을 한적이 없는 만성투석환자 유래의 혈장을 사용하여, 실시예 1의 (c)에 기재된 조합 중, 항체 WH10 및 항체 WH2-22-1A의 조합을 사용하여 샌드위치 효소면역측정법에 의하여, 혈장 중의 vWF 분해효소를 정량하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 Y 축의 단위는 정상 사람 전혈장의 희석례에서 제작한 검량선으로부터 산출한 Unit이다. 또한, 도 5의 기호 「PLT<10^5」은 혈소판 수가 1×10⁵/㎕ 미만인 것을 의미한다.

션트재건을 반복하고 있는 환자에서는 션트 재건을 한 적이 없는 환자와 비교하여, vWF 분해효소량이 유의하게 낮았으며, 션트 재건을 반복한 환자에서는 혈전형성경향이 강하다는 것과 상관이 있었다. 또한, 투석개시 2시간 후에는, 투석 후와 비교하여 유의하게 vWF 분해효소량이 저하되어 있어, 투석 중에 혈전성을 나타내고, 션트가 막히기 쉽다는 임상관찰과 일치하였다.

이 결과, 이로부터, 본 발명의 방법에 의하면, 혈전증환자의 혈전의 정도의 검출을 수행할 수 있음은 물론이고, 션트 재건을 반복하는 만성투석환자에 있어서, 투석 후의 혈전성의 정도도 용이하게 모니터링할 수 있게 되어, 션트 패색의 예지, 예후의 경과의 관찰도 수행할 수 있는 이점이 있다는 것이 명확하게 되었다.

본 발명은 혈전형성경향의 정도 또는 혈전병의 검출의 용도에 적용할 수 있다.

이상, 본 발명을 특정의 양태에 따라 설명하였으나, 당업자에게 명백한 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims

본 윌브랜드 인자 분해효소를 정량하는 것을 특징으로 하는, 혈전형성 경향의 정도 또는 혈전병의 검출방법.
제1항에 있어서, 혈전병이 급성 또는 만성 골수성백혈병, 급성전골수성백혈병, 전신성 에리스마토디스, 폐색전, 뇌경색, 간중심정맥패색증, 급성림프구성백혈병, 혈전성미소혈관장해, 혈전성혈소판감소성자반증, 용혈성요독증증후군 또는 심부정맥혈전증인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 션트를 반복하여 시술하는 만성투석환자에 있어서 혈전형성 경향의 정도를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 정상인과 비교한 본 윌브랜드 인자 분해효소 농도의 저하를 지표로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 본 윌브랜드 인자 분해효소의 정량을 본 윌브랜드 인자 분해효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 사용하는 면역학적 방법에 의하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
본 윌브랜드 인자 분해효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈전형성 경향의 정도 또는 혈전병 검출용 키트.