CN101438169A - 通过测量d-二聚体和可溶性纤维蛋白水平检测静脉血栓栓塞性疾病 - Google Patents
通过测量d-二聚体和可溶性纤维蛋白水平检测静脉血栓栓塞性疾病 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及通过测量在血液样品中活化的纤维蛋白溶解过程中产生的D－二聚体和可溶性纤维蛋白的水平，来检测凝血活化的方法和测试，尤其当所述凝血活化引起静脉血栓栓塞性疾病时。本发明的方法基于将对应于可溶性纤维蛋白降解的D－二聚体水平和具有正常阈值的样品的D－二聚体水平进行比较。本发明的测试还可以用于确定患者的抗凝是否充分。
Description
本申请涉及在血液的凝血活化过程中通过分析D-二聚体和可溶性纤维蛋白检测凝血活化的方法和测试，尤其当凝血活化与静脉血栓栓塞性疾病有关时。
纤维蛋白溶解是血液中纤维蛋白的降解过程。纤维蛋白溶解参与许多病理生理过程，并且在组织纤溶酶原激活物和纤溶酶原结合纤维蛋白的情况下被触发，形成三元纤维蛋白-纤溶酶原复合物，其中t-PA对纤溶酶原具有高亲和力，导致纤溶酶的产生，所述纤溶酶是将纤维蛋白降解成D-二聚体的酶。缺少纤维蛋白时，t-PA对纤溶酶原几乎没有亲和力，这解释了循环的纤维蛋白不被降解的事实。
纤维蛋白降解或者纤维蛋白溶解，导致尤其包括“D-二聚体”片段的降解产物的形成。所述D-二聚体与另一纤维蛋白单体分子降解产生的E片段结合，形成DDE复合物，但即使是这种形式的复合物通常也被称为D-二聚体。
在凝血酶(enzyme de la coagulation，即thrombine)作用下，纤维蛋白原转化形成处于纤维蛋白溶解过程的纤维蛋白。在凝血活化期间，产生的凝血酶因此诱导纤维蛋白沉积物的形成和可溶性纤维蛋白的形成，所述纤维蛋白沉积物的形成将形成血栓。为了实现这一过程，凝血酶攻击纤维蛋白原分别位于2条Aα和2条Bβ链的4条肽键，造成两条Aα链释放两个A纤维蛋白肽并且Bβ链释放两个B纤维蛋白肽，引起纤维蛋白单体的形成，所述纤维蛋白单体借助氢键力自发聚合成聚合物的形式，所述氢键通过A和B纤维蛋白肽释放期间暴露的A和B聚合部位之间以及γ和β链末端分别提供的a和b部位之间的相互作用来建立。纤维蛋白多聚体然后立即被因子XIII(a)稳定。体外测试期间凝血酶生成要比体内产生的多得多。因此，体内凝血活化过程中纤维蛋白单体的生成要比体外的生成慢得多，这造成部分形成的单体聚合产生不溶性的纤维蛋白，所述不溶性的纤维蛋白形成血栓，所述单体的另一部分与纤维蛋白原反应，其中a和b部位是可接近的，或者所述单体的另一部分与纤维蛋白原降解产物反应产生可溶性的纤维蛋白，其中纤维蛋白单体与纤维蛋白原结合。
为了见证患者中凝血的活化，确定可溶性纤维蛋白的浓度是非常重要的。所述确定可以利用从血液样品获得的血液或者血浆样品进行，所述血液样品取自患者。
已经表明分析可溶性纤维蛋白是对分析纤维蛋白溶解降解产物的有效补充，因为可溶性纤维蛋白可以检测正在进行的凝血活化，而D-二聚体的浓度指示血栓的降解，即使活化凝血过程被终止。
总之，当纤维蛋白凝块在体内降解时，D-二聚体血浆水平增加。因此，如果血栓存在并且处于降解过程，则无论凝血持续还是终止，D-二聚体水平应该较高。相反，只有当凝血持续时可溶性纤维蛋白的水平才升高。
与D-二聚体的水平相比，可溶性纤维蛋白血浆水平的特异性测量因此能够确定提取待分析样品时患者发生的凝血，并且能够评价凝-溶平衡(balance coagulolytique)。
确定样品中D-二聚体的水平，称为基础水平，反映体内发生的血栓降解，而确定外源加入特异性纤维蛋白血栓溶解剂后获得的D-二聚体水平代表基础D-二聚体和来自可溶性纤维蛋白降解产生的D-二聚体的总和，所述可溶性纤维蛋白也称为循环纤维蛋白。
国际专利申请WO-A-02/18628描述了分析血液样品中可溶性纤维蛋白的方法，其需要将血浆与对可溶性纤维蛋白具有高亲和力的纤溶酶原激活物(PA-Fb sp)接触，然后确定纤维蛋白降解产物(D-二聚体)的水平。因此经PA-Fb sp处理的样品中D-二聚体浓度与未经PA-Fb sp处理的血浆中确定的基础D-二聚体浓度之间的差异表示与可溶性纤维蛋白降解相关的D-二聚体。发明人已经注意到还可以有利地补充现有技术国际申请WO-A-02/18628提供的方法，使其用于静脉血栓栓塞性疾病的诊断，以及弥漫性血管内凝血症(DIVC)的诊断和监测。它还能够确定抗凝治疗是否能够有效的完成。
静脉血栓栓塞性疾病主要包括四肢的静脉血栓形成和肺栓塞，后者由前者血栓形成的并发症造成。还会遇到除了四肢静脉血栓形成以外的静脉血栓形成，因为所有的静脉范围都有可能遭受血栓形成。在处于病理学起源的那些静脉中尤其可以引证肾静脉和肠系膜静脉。血栓栓塞性疾病例如深静脉血栓形成(TVP)和/或肺栓塞(EP)是危急生命的疾病，占据工业化国家残疾和死亡的很大部分，因此建立这些疾病的诊断对于完成检查是非常重要的，所述检查通过影像检查例如诊断静脉血栓形成的超声成像以及诊断肺栓塞的显像或者血管造影。这些探查法的实现很需要技巧，并且一直不能足够迅速的实现。
结果，一直需要定义能够快速诊断患者的血栓栓塞性疾病的测试，所述诊断包括以下可能，即不必求助其他检查就能排除该疾病。
在与凝血相关的疾病诊断领域，已知如果D-二聚体的水平是正常的，则利用D-二聚体的容量是血栓形成的负指标，因为一致认为血栓形成涉及凝血的活化和纤维蛋白溶解。
但是，迄今为止测量的唯一D-二聚体计数缺少特异性，无法使人确认已经形成血管内血栓，因为循环中存在的D-二聚体可能来自于血管外纤维蛋白沉积物的降解。然后原位形成的D-二聚体可能进入循环，从而产生高水平的循环D-二聚体。在本发明中，发明人评估了基于D-二聚体测试并结合确定可溶性纤维蛋白的快速测试的诊断法的相关性，所述可溶性纤维蛋白代表血管内的凝血活化。已经证明这种分析的结合有利于诊断深静脉血栓形成(TVP)和/或肺栓塞(EP)以及诊断弥漫性血管内凝血症(DIVC)。进行的可溶性纤维蛋白测试，称为可溶性可降解纤维蛋白SDF，允许通过确定在外源供给样品的组织纤溶酶原激活物(或者另一血栓溶解剂例如纤维蛋白的特异性纤溶酶原激活物)使其降解期间产生的降解产物，来分析可溶性纤维蛋白。
因此，本发明涉及诊断血液样品中凝血活化的体外方法，所述血液样品取自患者，所述方法包括：
i)测量测试样品中包含的纤维蛋白降解产物的量，包括测量样品中存在的D-二聚体的量并构成D-二聚体的基础水平；
ii)在能够将样品包含的可溶性纤维蛋白降解为降解产物而不造成纤维蛋白原降解的条件下，通过与对纤维蛋白具有高亲和力的纤溶酶原激活物(PA-Fb sp)孵育，来处理样品，并测量被处理样品包含的D-二聚体的量；
iii)计算步骤ii)中用Pa-Fb sp激活物活化后测量的D-二聚体的量和步骤i)中测量的所述活化前D-二聚体的量之间的差异，所述差异构成可溶性纤维蛋白(SDF)的降解度；
iv)将步骤i)测量的D-二聚体水平与确定的所述降解产物的正常阈值进行比较，并且将步骤iii)中计算得到的SDF水平与确定的SDF正常阈值进行比较。
当利用样品进行所述分析法时，有可能确定患血栓栓塞性疾病的风险：如果所述纤维蛋白降解产物或者SDF(D-二聚体)中的至少一个计算水平高于正常值，则存在患病风险，而当纤维蛋白所述降解产物的计算水平和SDF水平低于各自的正常阈值时，所述风险被排除。
无论凝血过程是局部的(例如深静脉血栓形成)还是全身的(例如在DIVC情况下)，本发明的诊断方法都适用于血液凝固的诊断。
如果合适，在上述步骤a)ii)加入纤溶酶原激活物前，可以将柠檬酸和柠檬酸钠的混合物加入样品部分，从所述的样品部分确定可溶性纤维蛋白的降解产物。
选择用于分析降解产物的试剂，用于测量一类给定的降解产物。例如，使用对特定类型的纤维蛋白降解产物具有预先确定的特异性的抗体。
当步骤i)测量的基础D-二聚体浓度的值超过500ng/ml[纳克/毫升]阈值时，D-二聚体的水平被认为是增加的。当步骤iii)计算的对应于可溶性纤维蛋白降解的D-二聚体的浓度的值超过健康个体中确定的300ng/ml阈值时，它被认为是增加的。
利用抗体构成的试剂通过Diagnostica Stago的＂Lia-test＂测试或者Bio-Mérieux的VIDAS测试已经确定了所述阈值。对于其他试剂，应该通过与利用所述试剂获得的结果进行比较来确定阈值。
当已经进行了D-二聚体测量和可溶性可降解纤维蛋白测量后，据认为在血液样品被测试的患者中，当基础纤维蛋白降解产生的(D-二聚体)水平是500ng/ml或者更高，或者当可溶性纤维蛋白的水平超过阈值例如300ng/ml时，存在患血栓栓塞性疾病的风险，所述可溶性纤维蛋白的水平通过特异性纤维蛋白纤溶酶原激活物处理的血浆中存在的D-二聚体水平与D-二聚体的基础水平之间的差异来确定。
生物样品优选是生物液体，例如血浆或者血液样品，或者穿刺液，前提是所述液体与血浆具有相同的纤溶酶原水平。就几乎不包含纤溶酶原的穿刺液来说，必须考虑添加Glu-纤溶酶原，这样的话使得纤溶酶原浓度接近于血浆的纤溶酶原浓度。
在通过产生特异性降解产物来分析可溶性纤维蛋白的方法中使用的对纤维蛋白具有高亲和力(即只活化纤维蛋白中的纤溶酶原)的纤溶酶原激活物可以选自许多已知是纤溶酶原激活物的化合物。但是，它们中的一些既降解纤维蛋白原又降解纤维蛋白，例如链激酶和尿激酶。这些化合物不适合用于本发明的方法，因为它们引起纤维蛋白降解，产生纤维蛋白原降解产物，其干扰纤维蛋白降解产生的产物。
另一组纤溶酶原激活物由被描述为相对纤维蛋白原对降解纤维蛋白具有高特异性的化合物组成。本发明的方法优选利用这另一组化合物的特异性进行，并且例如，使用：
组织纤溶酶原激活物(t-PA)或者其衍生物例如TNK-tPA，其是具有非常高纤维蛋白特异性的t-PA突变体(Cannon C P等，“TNK tissueplasminogen activator compared with front loaded altephase in acutemyocardial infarction results of the TIMI 10B trial(TIMI 10B试验的急性心肌梗塞结果中，TNK组织纤溶酶原激活物与首次负荷剂量阿替普酶的比较)”，Thrombolysis in Myocardial Infarction(TIMI)10B Investigators，Circulation 98(25)，2805-14，1998)；
衍生自普通吸血蝙蝠(Desmodus rotundus)的激活物(bat-tpa或者vPA＝吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活物)或者其衍生物：
DSPAs＝普通吸血蝙蝠PAs，FEKP＝DSPA α1和α2，EKP＝DSPA β，KP＝DSPA γ(Bringmann等：“Structural features mediating fibrin selectivityof vampire bat plasminogen activators(介导吸血蝙蝠纤溶酶原激活物纤维蛋白选择性的结构特征)”，J Biol Chem 270，25596-603，1995)，葡萄球菌激酶(SAK)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的多肽(Collen D：“Staphylokinase：a potent，uniquely fibrin-selective thrombolytic agent(葡萄球菌激酶：强力且独特纤维蛋白选择性血栓溶解剂)”，Nat Med，4-279-84，1998；Sakharov D V等：“Fibrin specificity of a plasminogen activator affectsthe efficiency of fibrinolysis and responsiveness to ultrasound：comparison ofnine plasminogen activators in vitro(纤溶酶原激活物的纤维蛋白选择性影响纤维蛋白溶解效率和超声应答性：体外比较9种纤溶酶原激活物)”.Thromb Haemos，81，605-12，1999)或者其突变体之一(Collen D等，“Recombinant staphylokinase variants with altered immunoreactivity.I：Construction and characterization(免疫反应性改变的重组葡萄球菌激酶变体。I：结构与表征)”.Circulation 94，197-206，1996)。
为了进行上文描述的诊断方法，使用抗D-二聚体的抗体进行本发明方法的两种分析(基础D-二聚体和特异性纤维蛋白纤溶酶原激活物作用后的D-二聚体)。所述抗体已经在现有技术中被描述并且是商品化供应的，例如来自Diagnostica Stago的商品名为“Lia-test”或者来自Bio-Mérieux的商品名为“Vidas”。
为了进行比较，步骤i)和ii)的分析必须使用相同的抗D-二聚体抗体。
利用常规的分析物分析技术，例如ELISA类方法、胶乳粒凝集灵敏方法(用于Lia-test类型)、免疫层析方法等等，分析可溶性纤维蛋白在PA-Fb sp存在条件下降解产生的D-二聚体。可以引用的不同商品化供应的D-二聚体分析测试的实例是，ASSERACHROM D-Di或者STALIATEST D-Di，均由Diagnostic Stago经销。然而在本发明范围内，已经有利地改变ASSERACHROM D-Di ELISA测试的使用条件，以缩短测试时间(与固定化抗体孵育15分钟，并与过氧化物酶标记的抗体孵育15分钟)。
优选地，本发明的体外诊断方法还包括阳性对照样品尤其是阳性对照血浆的处理。
为了获得阳性对照血浆，首先将血浆与少量凝血酶孵育预先确定的时段以便形成可溶性纤维蛋白而不形成纤维蛋白凝块。然后添加凝血酶抑制剂，防止反应继续，从而阻断已经触发的凝血过程。例如，可以使用水蛭素或者肝素作为抑制剂。
有利地确定血浆孵育时间以及凝血酶和阻断抑制剂的浓度，以实现凝血活化，其导致可溶性纤维蛋白的产生而不形成纤维蛋白凝块。
凝血激活物(凝血酶)存在条件下的孵育优选在孵育时段2分钟、室温下进行。然后加入大过量的抑制剂，以确保阻断凝血。
如果抑制剂是水蛭素，当凝血酶终浓度是0.18U/ml时，有利地使用终浓度为100μg/ml的水蛭素；
如果抑制剂是肝素，当使用凝血酶的终浓度是0.18U/ml时，使用肝素的终浓度为500U/ml。
在本发明另一有利的实施方式中，体外诊断方法还包括阴性对照样品尤其是阴性对照血浆的处理。在实施例中将更加详细地给出关于制备所述对照的描述。
本发明评价可溶性纤维蛋白，首先用PA-Fb sp降解可溶性纤维蛋白，然后测量经PA-Fb sp作用产生的特异性降解产物。
尽可能迅速的获得本发明方法的结果非常重要，而这代表样品中存在的可溶性纤维蛋白的量。为此，必须确定使用PA-Fb sp的条件，以便迅速降解可溶性纤维蛋白，并且不伴有循环血浆纤维蛋白原的“污染”降解，所述“污染”降解产生降解产物，其在分析中干扰可溶性纤维蛋白的降解产物。
因此选择PA-Fb sp的使用剂量以及与血浆孵育的时段，以诱导阳性对照中最高的纤维蛋白降解产物水平的增加，而阴性对照中(即，不经凝血激活物处理的那些)几乎不增加。
本发明范围内可以利用使可溶性纤维蛋白特异性降解的各种纤维蛋白溶解激活物。Pa-Fb sp有利地选自上述激活物，即：t-PA或者其衍生物，VPA或者其衍生物，以及葡萄球菌激酶或者其突变体之一。优选地，使用t-PA或者葡萄球菌激酶，更优选地使用t-PA。
条件如下，即样品在37℃孵育15分钟，所测试的葡萄球菌激酶的终浓度范围为1-12μg/ml。最终滞留浓度优选为10μg/ml。孵育时段可以调节，其变化取决于所用Pa-Fb sp的天然功能和浓度。
有利地使用t-PA的终浓度范围为1-2.5μg/ml。优选的，在37℃使用浓度为2μg/ml的t-PA，孵育时段为15分钟。
在本发明特定实施方式中，在可溶性纤维蛋白降解后通过添加纤溶酶抑制剂例如抑肽酶，可以阻断纤溶酶原激活物对可溶性纤维蛋白的降解，而不阻断纤维蛋白原的降解。在实施例中给出了按照等同方式使用抑肽酶或者另外纤溶酶抑制剂的特定特性。例如，使用的抑肽酶量与使用的纤溶酶原激活物量相当。因此，在37℃与纤溶酶原激活物孵育15分钟后添加纤溶酶抑制剂。
在本发明特定实施方式中，在添加纤溶酶原激活物前，可以向被分析样品和对照样品中添加抗凝剂例如包含柠檬酸和柠檬酸钠的溶液。添加柠檬酸和柠檬酸钠的数量和方式在实施例中给出。
在本发明的范围内，上文描述的诊断方法被用于研究静脉血栓的形成。
在本发明诊断方法的特定应用中，所述方法的进行用于深静脉血栓形成的诊断排除。
在本发明特定实施方式中，所述诊断方法的进行用于肺栓塞的诊断排除。
在本发明特定实施方式中，所述方法利用血液样品进行，所述血液样品是在进行抗凝剂治疗前从患者采集的。
原则上，必须在任何抗凝剂治疗前分析可溶性纤维蛋白，以进行静脉血栓形成的诊断排除。如果患者正在接受抗凝剂治疗，则可溶性纤维蛋白的浓度立即降低并达到正常值。在接受治疗的患者中，确定血浆中可溶性纤维蛋白的浓度只能确定抗凝剂是否有效。
在所述方法的特定实施方式中，利用t-PA作为纤溶酶原激活物进行可溶性纤维蛋白分析。
根据下列实施例和附图本发明的其他特征将变得非常清楚。
图1和图2分别显示了被怀疑患有肺栓塞或者深静脉血栓形成的患者中D-二聚体和SDF的比较。在所有情况下，黑色的圆圈对应于患者，白色的圆圈对应于正常人。线显示正常值的上限。
实施例
实施例n°1：
选择用于获得包含可溶性纤维蛋白的阳性血浆对照的凝血酶浓度：
利用下列实验步骤制备阳性对照血浆：
正常血浆 200μl
人凝血酶(Stago，réf00896)，0.5-1U/ml(根据使用的血浆) 20μl
室温下孵育2分钟。
水蛭素(Knoll) 100μg/ml(终浓度)
或者
肝素(Choay) 5000 IU/ml(终浓度) 20μl
以验证：
试管中没有凝块形成；
商品化的可溶性纤维蛋白检测测试是阳性的(例如Stago Laboratories的FS测试)。
实施例n°2
确定已定义孵育条件下使用的Pa-Fb sp的量
为了进行本发明的方法，测试样品中加入的激活物的量必须使其诱导实施例n°1中获得的阳性对照血浆中大量D-二聚体的产生，并且阴性对照血浆(不经凝血酶处理的对照)中没有D-二聚体的显著产生。
随后将对照血浆和阳性对照血浆(n＝21)与不同剂量的Pa-Fb sp在37℃孵育15分钟。孵育期结束时，利用Lia-test或者快速ELISA(D-DiStago)(与捕获抗体在37℃孵育15分钟，与显示抗体在37℃孵育15分钟)确定D-二聚体。
利用ELISA测试获得表II所示结果。
利用Lia-test(n＝5)获得基本类似的结果。
表II：通过提高t-PA和SAK的量降解可溶性纤维蛋白。
*可溶性纤维蛋白＝添加t-PA或者葡萄球菌激酶后的D-二聚体水平-添加t-PA或者葡萄球菌激酶前的基础D-二聚体。
选择的Pa-Fb sp剂量产生：
·未处理的对照血浆(阴性对照)中的增加<300μg/ml；
·阳性对照血浆中的最大增加。
根据这些结果，发现待使用Pa-Fb sp的优选终浓度为：
·对于t-PA为2μg/ml：在这些条件下，能够被纤溶酶原激活物抑制剂(POI)中和的t-PA剂量可以忽略不计；
·对于SAK为10μg/ml(在某些患者或者某些阳性对照中，更低剂量SAK诱导的可溶性纤维蛋白的降解较弱，最有可能是因为样品中存在抗葡萄球菌激酶，所述抗葡萄球菌激酶可以在葡萄球菌(staphylocoques)感染后出现)。
实施例n°3：D-二聚体和可溶性纤维蛋白的分析
在本研究中，分析87例连续患者的D-二聚体和可溶性纤维蛋白，所述患者在急症病房被诊断为疑似患有静脉血栓形成和/或肺栓塞，并且还没有接受治疗。对这些患者，进行超声研究来诊断深静脉血栓形成；进行显像或者肺部血管造影来诊断肺栓塞。在开始抗凝剂治疗前确定D-二聚体和可溶性可降解纤维蛋白(SDF)的水平。表明可溶性可降解纤维蛋白分析的灵敏度类似于D-二聚体分析的灵敏度(对于D-二聚体和可溶性可降解纤维蛋白来说是96％)。有趣的是，在不同的患者中观察到D-二聚体和可溶性可降解纤维蛋白水平的“假阴性”。因此，将两种测试组合可以提高血栓形成诊断的灵敏度(100％)。此外，在诊断静脉血栓栓塞性疾病中，可溶性可降解纤维蛋白的特异性(对于肺栓塞和深静脉血栓形成来说分别是86％和87％)大于D-二聚体的特异性(对于肺栓塞和深静脉血栓形成来说分别是36％和42％)。
在接受治疗有效剂量抗凝剂治疗的患者中观察到可溶性可降解纤维蛋白的迅速正常化。一旦开始抗凝剂治疗，可溶性纤维蛋白的水平就降低。因此，在已经用抗凝剂治疗的患者中，可溶性可降解纤维蛋白不能被用作诊断测试。但是，可溶性可降解纤维蛋白可以被用于监测抗凝剂治疗。总之，这表明与D-二聚体水平有关的可溶性可降解纤维蛋白的水平是预测或者排除肺栓塞和/或深静脉血栓形成的有用临床工具。
在凝血活化期间存在可溶性纤维蛋白。在所述活化的早期观察到它的增加。
在现有技术中，已经开发了数种测试来评价血栓形成患者中的可溶性纤维蛋白，但是，因为可用测试结果的可变性，在排除静脉血栓栓塞性疾病的诊断中确定可溶性纤维蛋白的重要性还没有被确立(1-21)。
本研究的目的是评估基于确定可溶性可降解纤维蛋白水平的新的测试的潜在用途，所述测试是简单、快速和灵敏的，并且对血浆可溶性纤维蛋白聚合体高度特异。
该测试基于评价在诱导可溶性纤维蛋白降解而不诱导血浆纤维蛋白原降解的条件下，血浆与t-PA孵育后产生的D-二聚体。因此，该测试被称为可溶性可降解纤维蛋白(SDF)测试。实际上，尽管可溶性纤维蛋白中有少量纤维蛋白单体，但是纤维蛋白单体被交联在一起，这是因为因子XIII活化与纤维蛋白肽A的释放同步，此外，凝血酶对因子XIII的活化因为纤维蛋白的存在而加快。可溶性可降解纤维蛋白选自体内凝血酶生成的标志物，例如纤维蛋白肽A(FPA，半衰期为3分钟)(23)或者凝血酶抗凝血酶复合物(TAT，半衰期为15分钟)(24)，这是因为它对测量异常不敏感所以其测量可以更灵敏。
进行本研究以评价诊断测试的性能，所述诊断测试基于未接受治疗的连续患者中D-二聚体和可溶性可降解纤维蛋白水平的组合，所述患者在3个不同中心的急症病房就诊，在临床上被怀疑患有肺栓塞(n＝38)或者深静脉血栓形成(n＝49)。就被怀疑患有深静脉血栓形成的情况来说，通过检查超声挤压(compression par ultra-sons)来确诊；通过显像或者肺部血管造影来确诊肺栓塞。被认为是阳性测试的可溶性可降解纤维蛋白的阈值是300ng/ml。
在本研究中，为了分析抗凝血效果，在开始抗凝剂治疗后，还检查了肺栓塞和/或深静脉血栓形成患者中可溶性可降解纤维蛋白和D-二聚体的变化模式，以测试血栓栓塞性疾病治疗的有效性。
方法和装置
血浆样品：收集血液到0.13M柠檬酸盐(9份血液用1份柠檬酸盐)。2500g离心15分钟后，收集血浆并在-20℃冻存直至使用。
但是，当可溶性可降解纤维蛋白的水平非常高时，例如血管内凝血(DIVC)的情况，可溶性可降解纤维蛋白在冷冻和解冻步骤期间可以形成不溶性复合物，因此推荐利用新采集的血浆进行该测试。
血液从健康志愿者或者急症病房的门诊患者获得。接受抗凝剂治疗的患者只用于监测。患者群由表现肺栓塞或者深静脉血栓形成临床迹象的连续患者组成，他们已经通过腿近端静脉挤压的超声分析、肺部显像和肺部血管造影而诊断以确诊。
生物测试
D-二聚体的确定
在STA装置中利用Lia-test(Diagnostica Stago)或者使用VIDAS(Bio-Mérieux)通过ELISA，利用包被抗D-二聚体单克隆抗体的乳胶微粒的凝集来测量D-二聚体。
可溶性可降解纤维蛋白的测量：分3个步骤进行
1-纤维蛋白降解：向200μl血浆添加20μl t-PA、20μg/ml(经处理的血浆)或者20μl生理血清(未处理的血浆)。在37℃孵育15分钟后，通过添加20μl 12.5TIU/ml的抑肽酶(Pentapharm)阻断产生的纤溶酶。
2-然后利用Diagnostica Stago Lia-test D-二聚体测试确定D-二聚体浓度。
3-将可溶性可降解纤维蛋白水平计算为受处理血浆中的D-二聚体浓度与未处理血浆中存在的D-二聚体浓度的差异。
当血浆中的D-二聚体水平超过4000ng/ml时，在降解步骤后稀释样品。
将正常血浆与小剂量的凝血酶孵育较短时间获得用作阳性对照的可溶性纤维蛋白，在所述孵育结束时，用肝素阻断凝血酶。
按照表III显示的方式分析来自被测样品的血浆以及用于可溶性纤维蛋白分析的阳性对照和阴性对照。
表III
在预定时间添加抑肽酶阻断纤溶酶，只造成纤维蛋白而不是纤维蛋白原的降解。
·阳性和阴性对照用ACd重新配制，ACd即1:5稀释的AC。
AC的制备：
柠檬酸，H2O MWt＝210.14 0.16g
柠檬酸三钠，2H2O MWt＝294.10 0.44g
H2O 20ml
结果
测量的特异性
·在正常的健康志愿者(n＝180)中，可溶性纤维蛋白的水平非常低，为300ng/ml或者更少。
·此外，可溶性纤维蛋白的血浆浓度与D-二聚体的血浆浓度没有关系，因为用肝素治疗患者后，纤维蛋白浓度迅速降低，而D-二聚体浓度的降低慢得多，因为它反映了阻断凝血活化后持续的凝块的降解。
被怀疑患有静脉血栓栓塞性疾病或者肺栓塞的患者中D-二聚体的水
平和可溶性纤维蛋白的水平
在正常的健康志愿者(n＝180)中：
平均值是80±106ng/ml，在180名被测试的志愿者中，140名志愿者的可溶性可降解纤维蛋白水平是不能被检测到的。作为阳性测试的阈值是300ng/ml。
在被怀疑患有肺栓塞或者深静脉血栓形成的患者中：
在38例肺栓塞疑似患者中，根据图像分析23例是阳性的，而在49例深静脉血栓形成疑似患者中，根据超声腿近端静脉异常挤压的观察，25例是阳性的。
在两组患者，即患有肺栓塞(n＝23)或者深静脉血栓形成(25)的患者中，2例具有假阴性的可溶性纤维蛋白计数，1例来自肺栓塞组(通过血管造影确认)，另1例来自深静脉血栓形成患者组(通过超声确认)；但是，这2例患者的D-二聚体水平比500ng/ml的阈值更高。相反，2例患者(1例来自肺栓塞组，另1例来自深静脉血栓形成患者组)的D-二聚体水平是正常的(<500ng/ml)，但可溶性可降解纤维蛋白的水平>300ng/ml。当D-二聚体的水平通过Lia 或者
测试确定时，观察到这些假阴性的D-二聚体水平。
利用D-二聚体和可溶性纤维蛋白的组合，在生物值中没有检测到假阴性。
计算D-二聚体和可溶性可降解纤维蛋白的相关性的指数(灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值)。
表III：D-二聚体和可溶性可降解纤维蛋白的灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值
VPP＝阳性预测值
VPN＝阴性预测值
EP＝肺栓塞
TVP＝深静脉血栓形成
SDF＝可溶性可降解纤维蛋白
接受抗凝治疗的患者中D-二聚体和可溶性可降解纤维蛋白水平的变化
在接受治疗有效剂量的未分级肝素或者低分子量肝素治疗的患者中，观察到可溶性可降解纤维蛋白的迅速正常化。第1天后，可溶性可降解纤维蛋白的水平是正常的或者处于正常值上限。所述水平的每日分析显示，肝素治疗期间可溶性可降解纤维蛋白维持在正常参数内。相反，D-二聚体的水平缓慢降低，并且在肝素治疗期间该水平没有达到正常值。在1例患者中，治疗期间可溶性纤维蛋白进一步增加，提示不充分的治疗效果。
讨论
需要适于诊断肺栓塞和/或深静脉血栓形成的非侵入性诊断工具，它能够对大部分病例立即做出诊断以便给出治疗方案。
本研究的目的在于确定D-二聚体和可溶性可降解纤维蛋白的组合是否可用于诊断肺栓塞和/或深静脉血栓形成以及评价抗凝治疗对抑制血栓形成的功效。
关于肺栓塞和深静脉血栓形成测量的灵敏度：对于D-二聚体水平显示假阴性结果的2例患者(1例来自患有肺栓塞的组，另1例来自深静脉血栓形成患者组)具有高于阈值上限的可溶性可降解纤维蛋白水平。这可能归因于异常的纤维蛋白凝块结构(先天或者后天的)，致使凝块对纤维蛋白溶解具有异常的抗性。因为血栓溶解缺陷，这种异常能够直接导致血栓形成风险的升高。
这种低纤溶可以解释患有血栓形成的患者中3％-5％的D-二聚体“假阴性”病例。在确定可溶性可降解纤维蛋白时，纤维蛋白非常容易接近纤维蛋白溶酶。相反，当由纤细和非常致密的纤维蛋白形成时，血栓的纤维蛋白较不容易接近纤维蛋白溶酶，这解释了血栓形成中观察到的3％-5％的D-二聚体假阴性。在2例患者(1例来自肺栓塞组，另1例来自深静脉血栓形成患者组)中检测到关于可溶性可降解纤维蛋白的阴性水平，但这2例患者的D-二聚体水平超过500ng/ml。这表明凝血是非发展的过程，因为凝血酶活性是短暂的。
发明人证明了两种测试(可溶性可降解纤维蛋白和D-二聚体)的组合可用于区别诊断患者的肺栓塞和深静脉血栓形成。
在大多数情况下，血浆D-二聚体满足肺栓塞和深静脉血栓形成诊断要求的标准，因为它们是血栓形成的灵敏标志物，但是缺乏特异性(26-35)。
现在已经确认了D-二聚体不能用于静脉血栓栓塞性疾病的阳性诊断，因为该测试不具有足够的特异性。但是，当D-二聚体的水平正常时，可以在95％的患者中实现血栓栓塞性疾病的诊断。
在本研究中，已经表明可溶性纤维蛋白的特异性比D-二聚体的特异性高得多。诊断静脉血栓栓塞性疾病中D-二聚体测量的这种低特异性可能归因于组织中存在的纤维蛋白的局部纤维蛋白溶酶的降解。组织中局部形成的可溶性纤维蛋白降解产物因为其相对低的分子量弥散到血液中。这得到以下观察的支持：在炎性疾病患者中D-二聚体水平通常高。
在本研究中，还表明了可溶性降解纤维蛋白的水平在血栓形成事件中增加；但是，一旦进行抗凝治疗，在几小时内可溶性可降解纤维蛋白的浓度就降低到正常值。这提示抗凝药物能够有效地阻断血栓形成过程。D-二聚体持续的水平升高归因于抗凝治疗前形成的血栓的降解。因此，我们认为确定可溶性可降解纤维蛋白来评价抗凝剂治疗的效果或者测试新的抗血栓药物的效果是非常重要的。
总之，本研究的结果提示，与D-二聚体的确定有关的可溶性可降解纤维蛋白的确定可以是诊断深静脉血栓形成和肺栓塞以及其他血栓形成事件的有效临床工具。此外，本研究还提示可溶性可降解纤维蛋白可用于监测抗凝治疗的效果。
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Claims (17)
1.诊断血液样品中凝血活化的体外方法，所述血液样品取自患者，所述方法包括：
i)测量所述测试样品所含纤维蛋白降解产物的量，包括测量所述样品中存在的D-二聚体的量并构成D-二聚体的基础水平；
ii)在允许将所述样品所含可溶性纤维蛋白降解为降解产物而不造成纤维蛋白原降解的条件下，通过与对纤维蛋白具有高亲和力的纤溶酶原激活物(PA-Fb sp)孵育，来处理样品，并测量被处理样品所含D-二聚体的量；
iii)计算步骤ii)中用Pa-Fb sp激活物活化后测量的D-二聚体的量和步骤i)中所述活化前D-二聚体的量之间的差异，所述差异构成所述可溶性纤维蛋白(SDF)降解的水平；
iv)将步骤i)测量的D-二聚体水平与所确定的所述降解产物的正常阈值进行比较，并且将步骤iii)中计算得到的SDF水平与所确定的SDF的正常阈值进行比较；
如果步骤i)测量的D-二聚体水平或者计算的SDF水平中的至少一种高于所确定的各自的正常值，则存在患血栓栓塞性疾病的风险，而当步骤i)获得的D-二聚体水平和步骤iii)获得的SDF水平低于各自的正常阈值时，所述风险被排除。
2.如权利要求1所述的方法，其用于研究静脉血栓栓塞性疾病。
3.如权利要求1或者2所述的方法，其用于研究静脉血栓的形成。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其用于深静脉血栓形成的诊断。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其用于肺栓塞的诊断。
6.如权利要求1至5中任一项所述的诊断方法，其中所述血液样品是血浆样品。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述血液样品是受益于抗凝疗法的患者的血液样品。
8.如权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述Pa-Fb sp纤溶酶原激活物是t-PA。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中通过添加纤溶酶抑制剂防止纤维蛋白原降解。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述纤溶酶抑制剂是抑肽酶，其在所述样品与Pa-Fb纤溶酶原激活物于37℃孵育15分钟后添加。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，在所述样品与Pa-Fb纤溶酶原激活物孵育前，向所述样品添加如柠檬酸和柠檬酸三钠的组合物的抗凝剂。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，还包括分析阴性对照样品和阳性对照样品中可溶性纤维蛋白的降解产物。
13.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中使用抗D-二聚体单克隆抗体测量所述D-二聚体。
14.如权利要求1至9中任一项所述的诊断方法，还包括通过进行以下步骤测量阳性对照样品中存在的SDF，所述阳性对照样品由正常血浆样品构成，所述步骤包括：
i)将血浆样品与凝血激活物孵育以便形成可溶性纤维蛋白而不形成纤维蛋白凝块，所述激活物是例如少量凝血酶，以诱导可溶性纤维蛋白的形成；
ii)将所述被处理的样品与足以阻断凝血的量的凝血抑制剂孵育，所述抑制剂例如是肝素或者水蛭素；
iii)在允许将所述样品所含可溶性纤维蛋白降解为其降解产物尤其是D-二聚体，而不降解纤维蛋白原的条件下，将包含可溶性纤维蛋白单体的制备样品与对纤维蛋白具有高亲和力的纤溶酶原激活物(PA-Fb sp)尤其是t-PA接触。
15.如权利要求1至10中任一项所述的诊断方法，其中D-二聚体量的正常阈值是500ng/ml，SDF的正常阈值是300ng/ml，当所述测试样品的测量值小于两个各自的阈值时，可以实现排除血栓栓塞性疾病的诊断。
16.使用如权利要求1至11中任一项所述的方法诊断血栓栓塞性疾病的试剂盒，所述试剂盒包含：
抗D-二聚体单克隆抗体；
对纤维蛋白具有高特异性的纤溶酶原激活物(Pa-Fb sp)；
可溶性纤维蛋白的阳性对照样品，如果合适的话，以及阴性对照样品。
17.如权利要求16所述的试剂盒，还包含纤溶酶抑制剂。
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