KR20090023369A - Ｄ-다이머 및 가용성 피브린 수준 측정에 의한 혈전색전성 정맥 질환의 검출 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈액 시료내 활성화된 섬유소 용해 기간동안 생성되는 가용성 피브린 및 D-다이머를 분석함으로써, 응고 활성화, 특히 혈전색전 정맥 질환을 일으키는 응고 활성을 검출하기 위한 방법 및 테스트에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 가용성 피브린 분해에 상응하는 D-다이머 수준과 정상 역치를 갖는 샘플의 D-다이머 수준을 비교하는 것에 관련된다.

본 발명의 테스트는 항-응고요법이 환자에서 충분한지 여부를 결정하는데도 사용될 수 있다.

혈전색전질환, 가용성 분해가능한 피브린, D-다이머, 분석, 조합

Description

Ｄ-다이머 및 가용성 피브린 수준 측정에 의한 혈전색전성 정맥 질환의 검출{DETECTION OF VENOUS THROMBOEMBOLIC DISEASES BY MEASUREMENT OF D-DIMERS AND SOLUBLE FIBRIN LEVELS}

본 발명은 혈액내 응고 활성화 과정 동안 D-다이머 및 가용성 피브린의 분석을 이용하여 응고활성화, 특히 혈전색전성 정맥 질환과 관련된 응고활성화를 검출하는 방법 및 테스트에 관한 것이다.

섬유소 용해(Fibrinolysis)는 혈액내 피브린의 분해 과정이다. 섬유소 용해는 수많은 병리학적 과정에 관련되어 있으며, 조직 플라스미노겐 활성자 및 플라스미노겐이 피브린에 결합하여 삼원계 피브린-플라스미노겐 복합체를 형성하고, 이 복합체에서 t-PA는 피브린에 높은 친화성을 가지며, 피브린을 D-다이머로 분해하는 효소인 플라스민을 생성하는 상황에 의해 일어난다. 피브린이 없는 경우 t-PA는 플라스미노겐에 대한 친화성이 거의 없으며, 따라서 순환 피브린은 분해되지 않는다.

피브린의 분해 또는 섬유소 용해는 특히 "D-다이머" 단편들을 포함하는 분해 산물의 형성을 초래한다. 상기 D-다이머는 다른 피브린 모노머의 분해에서 유래하는 E-단편과 연합하여 DDE 복합체를 형성하나, 이러한 형태에서도 통상 D-다이머로 명명된다.

섬유소 용해 과정을 겪는 피브린은 응고 효소 즉 트롬빈의 작용에 의해 피브리노겐이 전환됨으로써 형성된다. 응고 활성화 과정 동안 생성된 트롬빈은 이후 혈전을 구성하는 피브린 침적의 형성 및 가용성 피브린의 형성을 유도한다. 이를 위해 트롬빈은 피브리노겐의 2A 알파 및 2B 베타 사슬에 각각 위치하는 4개의 펩타이드 결합을 공격하여, 두개의 A 알파 사슬에서 두개의 A 알파 피브리노펩타이드를 방출하고, B 베타 사슬에서 두개의 B 피브리노펩타이드를 방출하여, 피브린 모노머을 형성시키고, A 및 B 피브리노펩타이드의 방출동안 차단되지 않은 A 및 B 중합화 부위 및 감마 및 베타 사슬 말단의 a 및 b 부위간의 상호작용에 의해 수립되는 수소 결합에 의해 자발적으로 중합하여 폴리머 형태로 된다. 피브린 폴리머는 이후 즉시 XIII(a) 인자에 의해 안정화된다.

트롬빈은 생체내 보다 생체외 테스트에서 더 많이 생성된다. 따라서 피브린 모노머는 생체외에서 생성되는 것보다 생체내 응고 활성화 과정에서 더욱 늦게 생성되며, 형성된 모노머의 일부는 중합하여 혈전을 구성하는 불용성 피브린을 생성하고, 다른 일부는 a 및 b 부위가 사용가능한 피브리노겐, 또는 피브리노겐 분해 산물과 반응하여 피브린 모노머가 피브리노겐과 연합된 가용성 피브린이 생성된다.

가용성 피브린 농도 측정은 환자의 응고 활성화을 확인할 수 있기 때문에 중요하다. 상기 측정은 혈액 샘플이나 환자에서 채취한 혈액샘플에서 얻어지는 혈장 샘플을 사용하여 수행된다.

가용성 피브린의 분석은 섬유소 용해 분해 산물의 분석에 유용한 보완이 되는 것으로 확인되었는데, 응고 활성화 과정이 중단된 경우에도 D-다이머의 농도는 혈전의 분해를 나타내고 가용성 피브린은 진행되는 응고 활성화를 검출할 수 있기 때문이다.

요약하면, 혈장내 D-다이머 수준은 생체내에서 피브린 응괴가 분해되는 동안 증가한다. 따라서 혈전이 존재하고 분해되고 있다면, 응고가 지속되건 중단되었건 간에 D-다이머 수준은 높다. 반면, 가용성 피브린의 수준은 응고가 지속되는 경우에만 상승한다.

D-다이머 수준과 비교하여, 가용성 피브린 혈장 수준의 특이적인 측정은 분석될 샘플이 채취되는 순간 환자에 일어나는 응고를 측정할 수 있게 하며, 이에 더불어 응고분해균형(coagulolytic balance)의 평가가 가능하다.

샘플내 D-다이머 수준의 측정(기저 수준으로 명명됨)은 따라서 생체내에서 일어나는 혈전 분해를 반영하며, 특정 피브린 혈전용해제의 외부적 첨가후 얻어지는 D-다이머 수준의 측정은 기저 D-다이머 및 가용성 피브린의 분해에서 유래되는 D-다이머(순환 피브린으로 명명되기도 함)의 합을 나타낸다.

국제출원 WO-A-02/18628호는 혈액 샘플내 가용성 피브린을 분석하는 방법을 개시하고 있으며, 이는 가용성 피브린에 대해 높은 친화성을 갖는 플라스미노겐 활성자(PA-Fb sp)를 혈장에 접촉시키는 과정을 필요로 하며, 이어 피브린 분해 산물(D-다이머)의 수준을 측정한다. PA-Fb sp로 처리된 샘플내 D-다이머 농도와 PA-Fb sp로 처리되지 않은 혈장에서 측정된 기저 D-다이머 농도와의 차이는 따라서 가용성 피브린 분해에 연관된 D-다이머를 나타낸다. 본 발명자들은 상기 선행 기술 국제 출원 WO-A-02/18628호에서 제안된 방법이 혈전색전성 정맥 질환의 진단 및 파 종혈관내응고(disseminated intra-vascular coagulations; DIVC)의 진단 및 모니터링에 유용하게 보충적으로 수행될 수 있음을 발견하였다. 이는 또한 항응고치료가 효과적으로 수행되고 있는지 여부에 대한 결정도 가능하게 한다.

혈전색전성 정맥 질환은 주로 사지(limb)의 정맥 혈전 및 폐색전을 포함하며, 폐색전은 1차 혈전의 합병증에서 기인된다. 모든 정맥이 혈전증을 경험할 수 있기 때문에 사지 이외의 정맥 혈전도 있을 수 있다. 신장 정맥 및 창자간막 정맥이 특히 병리의 시작점이 되는 정맥으로 인용될 수 있다. 심부정맥혈전증(deep venous thrombosis; DVT) 및/또는 폐색전(pulmonary embolism; PE)과 같은 혈전색전 질환은 생명을 위협하는 질병으로 선진국에서 사망 및 불능의 큰 원인이 되고 있으며, 이러한 질환의 진단을 확립하기 위해서는 정맥 혈전 진단을 위한 초음파 이미징 및 폐색전을 진단하기 위한 신티그래피 또는 혈관조영술과 같은 영상 검사에 의한 조사를 완수하는 것이 불가결하다. 그러나 이러한 해명을 위한 방법들은 수행하기 까다롭고, 충분한 정도로 신속하게 수행될 수 없는 경우가 많다.

결과적으로 환자에 있어 혈전색전 질환의 신속한 진단을 허용하는 검사법이 계속적으로 요망되고 있으며, 이러한 진단은 부가적인 조사를 더 이상 할 필요없는 질환을 배제할 수 있게 하는 것을 포함한다.

응고와 관련된 질환의 진단 분야에서, D-다이머는 그 수준이 정상인 경우 혈전증이 없다는 것을 나타내는 지시자로서 역할하는 것으로 알려져 있는데, 혈전의 형성이 응고 활성화 및 섬유소 용해 모두에 관련되어 있다는 원리가 인식되어 있기 때문이다.

그러나 지금까지 해온 D-다이머의 계수 측정만으로는 특이성이 부족하며 혈관내 혈전이 형성되었는지 여부를 확실하게 결론지을 수 없는데, 혈관내 존재하는 D-다이머는 혈관 외 피브린 침적의 분해에서 유래할 수 있기 때문이다. 인 시투에서 형성된 D-다이머는 이후 순환혈로 들어나 고수준의 순환 D-다이머를 생성한다. 본 발명의 맥락에서 본 발명자들은 혈관내 응고 활성화를 대표하는 가용성 피브린을 측정하는 신속한 검사에 연계된 D-다이머 검사에 기초한 진단의 적합성을 평가하였다. 이러한 두 분석의 조합은 심부정맥혈전증(DVT) 및/또는 폐색전(PE), 파종혈관내응고(DIVC)의 진단에 매우 유용한 것으로 밝혀졌다. 가용성 피브린(가용성의 분해가능한 피브린으로서 SDF로 명명)테스트에서, 샘플내 외인성으로 공급된 조직 플라스미노겐 활성자(또는 피브린의 특이적 플라스미노겐 활성자와 같은 다른 혈전용해제)에 의해 분해되는 동안 생성되는 분해 산물을 측정함으로써 가용성 피브린을 분석할 수 있다.

따라서 본 발명은 환자로부터 분리한 혈액 시료에서 시작하는 응고 활성화 진단을 위한 생체외 방법에 관한 것으로서, 본 방법은

i) 검사 시료내에 존재하는 D-다이머의 양을 측정하고 이를 D-다이머의 기저수준(base level)으로 하는 것으로 이루어지는, 시료내에 포함된 피브린 분해 산물의 량을 측정하는 단계;

ii) 시료를 피브린에 대해 높은 친화성을 갖는 플라스미노겐 활성제(Pa-Fb sp)와 함께, 시료내 함유된 가용성 피브린은 분해되어 분해 산물로 되고 피브리노겐은 분해되지 않는 조건하에서 인큐베이션 처리하고, 처리된 시료내 함유된 D-다이머의 양을 측정하는 단계;

iii) 상기 ii) 단계에서 Pa-Fb sp 활성제에 의해 활성화된 후 측정된 D-다이머의 양과 상기 i) 단계에서 활성화전에 측정된 D-다이머의 양의 차이를 산출하고, 이 차이를 가용성 피브린(SDF)의 분해 정도로 하는 단계;

iv) 상기 i) 단계에서 측정된 D-다이머 수준과 상기 분해 산물에 대해 결정된 정상 역가를 비교하고, 상기 iii)단계에서 산출된 SDF 수준과 SDF에 대해 결정된 정상 역가를 비교하는 단계;를 포함한다.

시료에서 출발하여 상기 분석 방법이 수행되는 경우, 혈전색전 질환의 위험의 결정이 가능하다: 이 위험은 상기 피브린 분해 산물 또는 SDF(D-다이머)의 산출 수준 중 하나 이상이 정상값보다 더 높은 경우 존재하고, 상기 피브린 분해 산물의 산출된 수준 및 SDF 수준이 각각의 정상 역가보다 더 낮으면 상기 위험이 배제된다.

본 발명의 진단 방법은 응고 과정이 국재화된 것인지(심부정맥혈전증과 같이), 아니면 일반화된 것인지(DIVC의 경우와 같이) 여부를 진단하는데도 사용될 수 있다.

적절한 경우, 상기 ii)단계에서 플라스미노겐 활성제를 첨가하기 전에, 시트르산 및 소듐시트레이트 혼합물을 상기 가용성 피브린 분해 산물이 결정될 시료 부분에 첨가한다.

분해 산물을 분석하는데 사용되는 시약은 주어진 군의 분해산물을 측정하도록 선택된다. 예를 들면 특정 타입의 피브린 분해 산물에 특이성을 갖는 항체가 사용된다.

i) 단계에서 측정되는 기저 D-다이머 농도가 역가인 500 ng/ml 이상의 값을 갖는 경우, D-다이머 수준은 상승된 것으로 간주된다. 가용성 피브린 분해에 상응하는 상기 iii)단계에서 산출되는 D-다이머 농도는 건강한 개체로부터 결정된 역가인 300 ng/ml 보다 더 높은 값을 갖는 경우 상승된 것으로 간주된다.

상기 역가는 Diagnostica Stago사의 "Lia-test" 또는 Bio-Merieux사의 VIDAS 테스트의 항체로 구성되는 시약에 의해 결정된다. 다른 시약에 대해서는 그 시약에 대해 수득한 결과를 비교하여 역가를 결정하여야 한다.

D-다이머 측정 및 가용성 분해가능한 피브린 측정이 수행된 경우, 환자의 혈액 시료를 테스트하고, 그 결과 기저 피브린의 분해에서 생성된 D-다이머 수준이 500 ng/ml 이상이거나 또는 특정 피브린 플라스미노겐 활성제를 처리한 혈장에 존재하는 D-다이머 수준과 상기 기저 D-다이머 수준과의 차에서 결정된 가용성 피브린 수준이 역가, 예컨대 300 ng/ml 이상인 경우 혈전색전질환의 위험이 존재한다고 추정된다.

생물학적 시료는 바람직하게 생물학적 액체, 예를 들면 혈장 또는 혈액시료, 또는 천자 용액(puncture liquid)이며, 단 이들 용액내 플라스미노겐의 수준은 혈장내 수준과 동일하여야 한다. 플라스미노겐을 거의 포함하고 있지 않는 천자 용액의 경우, Glu-플라스미노겐의 첨가를 고려하여야 하며, 이렇게 함으로써 혈장과 거의 동일한 플라스미노겐 농도를 갖도록 하여야 한다.

본 발명에서 특정 분해 산물을 생성함으로써 가용성 피브린을 분석하는데 사용되는 피브린에 대해 높은 친화성을 갖는 플라스미노겐 활성제(즉 피브린내의 플라스미노겐만을 활성화하는 것)는 플라스미노겐 활성제로서 알려져 있는 많은 화합물중에서 선택될 수 있다. 그러나 이들중 일부 예를 들어 스트렙토키나제 및 유로키나아제는 피브리노겐 및 피브린 양자를 분해한다. 이러한 화합물은 본 발명의 방법에 사용되기에 적합하지 않은데, 피브린 분해에서 오는 산물을 저해할 수 있는 피브리노겐 분해 산물을 생성하는 피브린의 분해를 초래하기 때문이다.

피브리노겐에 비해 피브린을 분해하는데 높은 특이성을 갖는 화합물로 구성되는 플라스미노겐 활성제 군이 있다. 본 발명의 방법은 유용하게 이 군의 화합물의 특이성을 이용하며, 예를 들면 하기와 같다:

- 조직 플라스미노겐 활성제(t-PA) 또는 피브린에 대해 높은 특이성을 갖는 t-PA 돌연변이인 TNK-tPA와 같은 유도체(Cannon C P 등, "TNK tissue plasminogen activator compared with front loaded altephase in acute myocardial infarction results of the TIMI 10B trial", Thrombolysis in Myocardial Infarction (TIMI) 10B Investigators, Circulation 98 (25), 2805-14, 1998);

- 데스모두스 로턴두스에서 유래되는 활성제(bat-tpa 또는 vPA = 뱀파이어 박쥐 타액 플라스미노겐 활성제;vampire bat salivary plasminogen activator) 또는 그 유도체: DSPAs = 데스모두스 로턴두스 타액 PAs, FEKP = DSPA 알파 1 및 알파 2, EKP = DSPA 베타, KP = DSPA 감마 (Bringmann 등: "Structural features mediating fibrin selectivity of vampire bat plasminogen activators", J Biol Chem 270, 25596-603, 1995), 스타필로코코스 아우레우스에 의해 분비되는 폴리펩타이드인 스타필로키나제(SAK)(Collen D: "Staphylokinase: a potent, uniquely fibrin-selective thrombolytic agent", Nat Med, 4-279-84, 1998; Sakharov D V et al: "Fibrin specificity of a plasminogen activator affects the efficiency of fibrinolysis and responsiveness to ultrasound: comparison of nine plasminogen activators in vitro". Thromb Haemos, 81, 605-12, 1999) 또는 이들의 돌연변이체 (Collen D et al, "Recombinant staphylokinase variants with altered immunoreactivity. I: Construction and characterization." Circulation 94, 197-206, 1996).

전술된 진단 방법을 수행하기 위해, 항 D-다이머 항체들이 본 발명의 방법의 두개의 분석(기저 D- 다이머 및 특정 피브린 플라스미노겐 활성제의 작동후 D-다이머)을 수행하도록 사용된다. 상기 항체는 선행기술에 기술된 바 있으며, 상업적으로 입수가능한데, 예를 들면 Diagnostica Stago사에 의해 "Lia-test" 또는 Bio-Merieux사에 의해 "Vidas"라는 상품명으로 시판되고 있다.

수득된 값들은 서로 비교되어야하기 때문에, 상기 단계 i) 및 ii)의 분석에서 동일한 D-다이머 항체가 사용된다.

Pa-Fb sp 존재하 가용성 피브린 분해에서 생성되는 D-다이머는 ELISA 타입의 방법, 민감성 라텍스 비드 응집 방법(Lia-테스트에서 사용되는 타입의 것), 면역크로마토그라피 방법 등의 통상의 검체 분석 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 그 외 인용될 수 있는 다양한 시판 D-다이머 분석 테스트의 예로서, Diagnostica Stago사에 의해 시판되고 있는 ASSERACHROM D-Di 또는 STA LIATEST D-Di를 들 수 있다. 본 발명의 맥락에서 ASSERACHROM D-Di의 ELISA 테스트의 사용조건은 테스트를 간략하게 하도록 변형될 수 있다(고정 항체와의 15분 인큐베이션 및 퍼옥시다제 라벨된 항체와의 15분 인큐베이션).

바람직하게 본 발명의 생체외 진단 방법은 또한 양성 대조 시료, 특히 양성 대조 혈장의 처리를 포함한다.

양성 대조 혈장을 얻기 위해, 혈장을 먼저 소량의 트롬빈과 미리 정해진 시간동안 인큐베이션하여 피브린 응괴(fibrin clot)의 형성없이 가용성 피브린을 형성한다. 유발된 응고 과정은 이후 트롬빈 억제제를 첨가하여 반응이 계속되는 것을 차단한다. 예를 들면 히루딘(Hirudin) 또는 헤파린(heparin)이 억제제로서 사용될 수 있다.

혈장 인큐베이션 시간 및 트롬빈 및 차단용 억제제의 농도는 바람직하게 응고 활성화에 의해 피브린 응괴(clot of fibrin)의 형성없이 가용성 피브린을 형성될 수 있도록 결정된다.

응고 활성제(트롬빈) 존재하 인큐베이션은 바람직하게 실온에서 2분의 인큐베이션 시간동안 수행된다. 이후 상기 억제제를 과량으로 첨가하여 응고가 확실히 차단되도록 한다.

- 히루딘을 사용하는 경우, 트롬빈 최종 농도 0.18 U/ml에 대해 최종 농도 100㎍/ml이 되도록 사용한다;

- 헤파린을 사용하는 경우, 트롬빈 최종 농도 0.18 U/ml에 대해 최종 농도 500 U/ml이 되도록 사용한다.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 인 비트로 진단 방법은 음성 대조 시료, 특히 음성 대조 혈장을 포함한다. 이 대조에 대한 제조는 실시예에서 자세히 개시된다.

본 발명에 따른 가용성 피브린의 평가는 Pa-Fb sp에 의한 가용성 피브린의 분해의 1단계와 Pa-Fb sp의 작용에 따른 특정 분해 산물의 측정으로 이루어진다.

본 발명의 방법의 결과는 시료내 존재하는 가용성 피브린의 양을 표시하면서, 가능한한 신속하게 얻어져야 한다. 이를 위해, Pa-Fb sp를 사용하는 조건은 가용성 피브린의 분해가 신속하게 일어나고, 분석에서 가용성 피브린의 분해산물과 혼동될 수 있는 분해산물을 생성할 수 있는 순환 혈장 피브리노겐의 "오염적" 분해(contaminating degradation)가 수반되지 않도록 정해져야 한다.

사용되는 Pa-Fb sp의 양과 혈장과의 인큐베이션 시간은 따라서 피브린 분해 산물의 수준의 상승이 양성 대조에서 최고값을 갖도록 그리고 음성 대조에서는 실질적으로 0 증가(즉 응고 활성화제를 처치하지 않은 것)가 유도되도록 선택된다.

가용성 피브린을 특이적으로 분해하는 다양한 섬유소 용해 활성제가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 바람직하게 Pa-Fb sp는 상기 언급된 활성제들로 구성되는 군에서 선택된다:t-PA 또는 이들의 유도체, VPA 또는 이들의 유도체 및 스타필로키나제 또는 이들의 돌연변이체. 바람직하게, t-PA 또는 스타필로키나제가 사용되고, 특히 바람직하게 t-PA가 사용된다.

시료가 37℃에서 15분간 인큐베이션되는 조건에서, 테스트된 스타필로키나제의 최종 농도는 1 내지 12 ㎍/ml이다. 최종 보유 농도는 바람직하게 10 ㎍/ml이다. 인큐베이션 시간은 변경될 수 있으며, 그 변경은 사용된 Pa-Fb sp의 종류 및 농도에 따라 결정된다.

t-PA는 바람직하게 1 내지 2.5 ㎍/ml 범위의 최종농도로 사용된다. 바람직하게 37℃에서 15분간 인큐베이션되는 조건에서 2 ㎍/ml으로 사용된다.

본 발명의 특정 실시형태에서, 피브리노겐의 분해없이 플라스미노겐 활성제에 의한 가용성 피브린의 분해는 가용성 피브린의 분해 후에 플라스민 억제제, 예를 들면 아프로티닌을 첨가하여 차단할 수 있다. 아프로티닌 또는 동등한 방식의 다른 플라스민 억제제 사용에 관한 자세한 사항은 실시예에서 개시되었다. 예를 들면 사용된 아프로티닌의 양은 사용된 플라스미노겐 활성제 양과 동량이다. 플라스민 억제제는 플라스미노겐 활성제와의 37℃에서의 15분간의 인큐베이션후 첨가된다.

본 발명의 일 실시형태에서, 플라스미노겐 활성제를 첨가하기 전에, 시트르산 및 소듐 시트레이트 함유 용액과 같은 항응고제를 분석대상 시료 및 대조 시료에 첨가할 수 있다. 시트르산 및 소듐 시트레이트의 양과 첨가 양식은 실시예에 개시되어 있다.

본 발명에서, 전술한 진단 방법은 정맥 혈전의 형성을 조사하는데 적용된다.

본 발명 진단 방법의 특정 응용예에서, 본 진단 방법은 심부정맥혈전증의 진단적 배제를 위해 수행된다.

본 발명의 특정 응용예에서, 본 방법은 폐색전의 진단적 배제를 위해 수행된다.

본 발명의 일 실시예에서 본 발명의 방법은 항응고 치료를 받기전인 환자에서 분리한 혈액시료에 대해 수행된다.

원칙적으로 정맥 혈전의 진단적 배제를 위한 가용성 피브린의 분석은 항응고 치료를 받기전에 수행되어야 한다. 만약 환자가 항-응고제로 치료를 받는 중인 경우, 가용성 피브린의 농도는 매우 빠르게 감소하여 정상치에 도달한다. 상기 치료를 받은 환자에서 혈장내 가용성 피브린의 농도 측정은 단지 항-응고제가 효과적인지 여부를 결정할 뿐이다.

본 발명의 방법의 특정 실시예에서, 가용성 피브린 분석은 플라스미노겐 활성제로서 t-PA를 사용하여 수행한다.

기타 본 발명의 특징은 하기 실시예와 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.

도 1 및 2는 각각 폐색전 또는 심정맥혈전증이 의심되는 환자에서 D-다이머 및 SDF를 비교하여 도시한 것이며, 각 경우에서 검은원은 환자들을 표시하며, 흰색원은 정상환자에 상응하며, 라인은 정상치의 상한을 표시한다.

실시예 1: 가용성 피브린을 포함하는 양성 혈장 대조를 얻는데 사용되는 트롬빈 농도의 결정:

양성 대조 혈장은 하기 프로토콜에 의해 제조되었다:

정상 혈장 200 ㎕

인간 트롬빈(Stago, 참조번호 00896), 0.5 내지 1 U/ml (사용된 혈장에 따라) 20 ㎕

실험실 온도에서 2분간 인큐베이션.

히루딘 (Knoll) 100 ㎍/ml (최종농도)

또는

헤파린 (Choay) 5000 IU/ml (최종농도) 20 ㎕

검증:

- 튜브내 응괴 형성이 없음;

- 시판 가용성 피브린 검출 테스트가 양성(예를 들면 Stago Laboratories사의 FS 테스트에 대해).

[표 1]

	양성 대조	음성 대조
혈장	200 ㎕	200 ㎕
트롬빈 1 U/ml 또는 0.5 U/ml	20 ㎕	-
생리적 혈청	-	20 ㎕
실온에서 2 분 (±10 초)
헤파린, 5000 IU/ml	20 ㎕	-
생리적 혈청	-	20 ㎕

실시예 2: 설정된 인큐베이션 조건에서 사용될 Pa-Fb sp 양의 결정

본 발명의 방법을 수행하기 위하여, 테스트 시료에 첨가될 활성제의 양은 음성 대조 혈장(트롬빈 처리하지 않은 대조)에서는 거의 D-다이머가 생성되지 않고, 반면 실시예 1에서 수득된 양성 대조 혈장내에서 다량의 D-다이머가 생성되게 유도 하는 양이어야 한다.

따라서 대조 혈장 및 양성 대조 혈장(n = 21)은 상이한 양의 Pa-Fb sp를 사용하여 37℃에서 15분간 인큐베이션 되었다. 인큐베이션이 끝나갈 즈음에 Lia-테스트 또는 신속 ELISA (D-Di Stago)에 의해 D-다이머의 량을 정량하였다(포획 항체와 37℃에서 15분간 인큐베이션하고, 노출항체와 37℃에서 15분간 인큐베이션).

ELISA 테스트로 수득된 결과를 표 2에 나타내었다.

실질적으로 동일한 결과가 Lia-테스트에서 수득되었다(n = 5).

[표 2] t-PA 및 SAK의 양을 상승시켰을 때 가용성 피브린의 분해

	D-다이머 (ng/ml)	가용성 피브린* (ng/ml)	D-다이머 (ng/ml)	가용성 피브린* (ng/ml)
	음성 대조		양성 대조
Pa-Fb sp 미첨가	375		375
스타필로키나제 첨가후
10	400	< 50	1750	1375
2	390	< 50	1615	1240
1.5	375	< 50	1700	1325
1	350	< 50	1657	1282
0.5	410	< 50	1125	750
t-PA 첨가후 (㎍/ml)
2	350	< 50	1790	1415
1	360	< 50	1420	1045
0.5	360	< 50	1210	835

*가용성 피브린 = t-PA 또는 스타필로키나제 첨가후 D-다이머 수준 - t-PA 또는 스타필로키나제 첨가전의 기저 D-다이머 수준.

선택된 양의 Pa-Fb sp는 아래와 같은 결과를 나타내었다:

- 미처리 대조 혈장(음성 대조)에서 < 300 ㎍/ml의 상승;

- 양성 대조 혈장에서는 최대의 상승을 나타내었다.

이러한 결과로부터, 사용될 바람직한 최종 Pa-Fb sp는 아래와 같이 결정되었다.

- t-PA의 경우 2 ㎍/ml: 이러한 조건하에서, 플라스미노겐 활성제 억제제(POI)에 의해 중화될 수 있는 t-PA양은 무시할 정도이다;

- SAK의 경우 10 ㎍/ml: 이 보다 더 작은 양의 SAK는 포도상 구균(staphylococci)에 의한 후속감염에 의해 나타나는 시료내 항-스타필로키나제의 존재 때문에 어떤 환자 또는 어떤 양성 대조에서는 가용성 피브린의 분해를 불량하게 유도하였다.

실시예 3: D-다이머 및 가용성 피브린의 분석

본 실시예에서는 응급 센터에 이송된 환자 중 정맥성 혈전증 및/또는 폐색전이 의심되고, 아무런 치료를 받지 않은 87명의 환자들을 대상으로 D-다이머 및 가용성 피브린의 양을 분석하였다. 이들 환자들은 심부정맥혈전증을 진단하기 위해 초음파 검사를 수행하고, 폐색전을 진단하기 위해 신티그래피 또는 폐혈관조영술을 시행하였다. D-다이머 및 가용성 분해가능한 피브린(SDF) 수준은 항-응고제 처치를 시작하기 전에 분석하였다. 가용성 분해가능한 피브린의 분석 민감도는 D-다이머 분석 민감도와 유사한 것으로 나타났다(D-다이머 및 가용성 분해가능한 피브린에 대한 민감도 96%). 흥미롭게도 D-다이머 및 가용성 분해가능한 피브린 수준에 대한 "위음성"은 상이한 환자들에서 관찰되었다. 따라서 두 테스트를 조합함으로써 혈전증의 진단 민감도를 상승시킬 수 있었다(100%). 또한 혈전색전성 정맥 질환의 진단 에 있어서 가용성 분해가능한 피브린의 특이성(폐색전 및 심부정맥혈전증에 대해 각각 86% 및 87%)은 D-다이머의 특이성보다 더 높았다(폐색전 및 심부정맥혈전증에 대해 각각 36% 및 42%).

치료 용량으로 항-응고제 처리를 받은 환자들에서 가용성 분해가능한 피브린의 신속 정규화가 관찰되었다. 항-응고제 처리를 시행하는 경우, 가용성 피브린 수준이 감소되었다. 따라서 가용성 분해가능한 피브린은 이미 항-응고제 처리를 받은 환자에 있어서는 진단 테스트로서 사용될 수 없다. 그러나 가용성 분해가능한 피브린은 항-응고제 처리를 모니터하는데 유용하다. 결론적으로, 가용성 분해가능한 피브린의 수준은 D-다이머 수준과 연합하여 폐색전 및/또는 심부정맥 혈전증을 예측하거나 배제하는데 유용한 임상적 툴로서 사용될 수 있다.

가용성 피브린은 응고 활성화 과정 중에 존재한다. 가용성 피브린의 상승은 활성화 초기 단계에서 관찰된다.

선행 기술에서, 혈전증을 나타내는 환자에서 가용성 피브린을 평가하는 몇가지 테스트가 이미 개발되었으나, 이러한 사용가능한 테스트 결과는 편차가 심하기 때문에 혈전색전성 정맥 질환을 배제하는 진단에서 가용성 피브린 정량의 중요성이 수립될 수 없었다(1-21).

본 연구의 목적은 간단하고 신속하며 민감성이 높고 혈장 가용성 피브린 폴리머에 대해 높은 특이성을 갖는 가용성 분해가능한 피브린 수준을 정량하는 것에 기초한 새로운 테스트의 유용성을 평가하는 것이다.

이 테스트는 가용성 피브린의 분해는 유도하지만 혈장 피브리노겐의 분해는 유도하지 않는 조건하에서 혈장과 t-PA을 인큐베이션한 후에 생성되는 D-다이머를 평가하는 것에 기초한다. 따라서 본 테스트는 가용성 분해가능한 피브린 테스트(SDF)로 명명된다. 실제, 가용성 피브린내 소수의 피브린 모노머가 존재하나 이들 피브린 모노머는 서로 교차-결합되어 있는데, XIII 인자 활성화가 피브리노펩타이드 A 방출과 동시에 일어나며, 부가하여 트롬빈에 의한 XIII 인자의 활성화가 피브린의 존재에 의해 가속화되기 때문이다(22). 가용성 분해가능한 피브린은 피브리노펩타이드 A(FPA, 반감기 3분(23)) 또는 트롬빈 항 트롬빈 복합체(TAT, 반감기 15분(24))와 같은 트롬빈의 인 비보 생성에 대한 마커들에서 선택되었는데, 그 이유는 측정 변칙에 덜 민감하기 때문에 더욱 민감한 정량이 가능하기 때문이다.

본 연구는 3개의 응급센터에 이송된 폐색전(n = 38) 또는 정맥성 혈전증(n = 49)이 임상적으로 의심되는 미처치 환자들에서 D-다이머 및 가용성 분해가능한 피브린의 수준의 조합에 기초한 진단 테스트의 효율을 평가하기 위해 수행되었다. 심부정맥혈전증이 의심되는 경우에는 초음파 압박을 검사하여 진단을 확인하였으며; 폐색전의 진단은 신티그래피 또는 폐혈관조영술에 의해 확인하였다. 양성으로 간주되는 테스트에서 가용성 분해가능한 피브린의 역가는 300ng/ml이었다.

본 연구에서는 또한 항-응고 효과를 분석하기 위한 목적으로 폐색전 및/또는 정맥성 혈전증을 겪고 있는 환자들에 대하여 항-응고제 처치를 시작한 후에 혈전색전성 질환의 치료 효율성을 테스트하기 위해 가용성 분해가능한 피브린 및 D-다이머의 변화 프로파일을 조사하였다.

방법 및 장치

혈장 시료: 혈액은 0.13 M 시트레이트(혈액 9 중량부에 대해 시트레이트 1 중량부)에 수집하였다. 2500 g에서 15분간 원심분리하고 혈장을 수거하여 사용할때 까지 -20℃에 냉동 보관하였다.

혈관내 응고(DIVC)의 경우와 같이 가용성 분해가능한 피브린 수준이 너무 높은 경우에는, 동결 및 해동단계에서 가용성 분해가능한 피브린이 불용성 복합체를 형성할 수 있으므로, 이 때는 막 수거한 혈장으로 테스트를 수행하는 것이 좋다.

건강한 자원자 또는 응급센터에 이송되어온 외래 환자에서 혈액을 채취하였다. 항-응고제 처치를 받은 환자들에서 수거된 혈액은 오직 모니터링용으로만 사용되었다. 환자 집단은 폐색전 또는 심부정맥혈전정의 임상적 징후를 나타내고 다리 근위 정맥 압박에 대한 초음파 분석, 폐 신티그래피 또는 폐 혈관조영술에 의해 진단이 검증된 환자들로 구성되었다.

생물학적 검사

D-다이머 정량

D-다이머는 STA 장치를 사용하는 Lia-테스트(Diagnostica Stago) 또는VIDAS(bio-Merieux)를 사용하는 ELISA에 의해 D-다이머에 대한 단클론 항체로 코팅된 라텍스 마이크로-입자의 응집에 의해 측정되었다.

가용성 분해가능한 피브린의 정량: 하기 3단계로 수행되었다.

1- 피브린 분해: 20 ㎕의 t-PA, 20 ㎍/ml (처리된 혈장) 또는 20 ㎕의 생리 학적 혈청(미처리된 혈장)을 200 ㎕의 혈장에 첨가하였다. 37℃에서 15분간 인큐베이션한 후 생성되는 플라스민은 20 ㎕의 아프로티닌(Pentapharm) 12.5 TIU/ml을 첨가하여 차단하였다.

2- 이후 Diagnostica Stago사의 Lia-테스트 D-다이머를 사용하여 D-다이머 농도를 정량하였다.

3- 가용성 분해가능한 피브린 수준은 처리된 혈장내 D-다이머 농도와 미처리된 혈장내 존재하는 D-다이머 농도간의 차이로 산출되었다.

혈장내 D-다이머 수준이 4000 ng/ml 이상인 경우에는 분해 단계후 시료를 희석하였다.

양성 대조로서 사용된 가용성 피브린은 정상 혈장을 소량의 트롬빈과 짧은 기간동안 인큐메이션하고 끝날 즈음 헤파린으로 트롬빈을 차단하여 수득하였다.

테스트될 시료에서 온 혈장, 및 가용성 피브린 분석을 위한 양성 대조 및 음성 대조를 분석하여 표 3에 나타내었다.

[표 3]

	기저 D-다이머	SDF + 기저 D-다이머
혈장	200 ㎕	200 ㎕
순수 AC	20 ㎕	20 ㎕
Tpa	-	20 ㎕
생리학적 혈청	40 ㎕	-
37℃에서 15분
아프로티닌	-	20 ㎕

예정된 시간에 아프로티닌을 가하여 플라스민을 차단하여 피브리노겐은 분해되지 않고 피브린만 분해되도록 하였다.

- 양성 및 음성 대조는 ACd 즉 1:5로 희석된 AC로 재구성하였다.

AC의 제조:

시트르산, H₂O MWt = 210.14 0.16 g

트리소듐시트레이트, 2 H₂O MWt = 294.10 0.44 g

H₂O 20 ml

결과

측정 특이성

- 건강한 정상 자원자(n = 180)에서 가용성 피브린 수준은 300 ng/ml 이하로 매우 작았다.

- 또한 환자들에게 헤파린을 처치한 후에는 가용성 피브린과 D-다이머의 혈장 수준간에 아무런 상관성이 없었으며, 피브린 농도는 매우 신속하게 하강된 반면 D-다이머의 농도는 훨씬 느리게 하강하였고, 이는 응고 활성화를 차단한 후에도 지속되는 응괴(clot)의 분해를 반영하기 때문이다.

혈전색전성 정맥 질환 또는 폐색전이 의심되는 환자에서의 D-다이머 및 가용성 피브린 수준

정상 건강 자원자에서 (n = 180):

평균치는 80　±106 ng/ml이었으며, 테스트된 180명의 자원자 중에 140명은 검출불가능한 정도의 용해성 분해가능한 피브린 수준을 나타내었다. 양성 테스트에 대한 역가는 300 ng/ml이었다.

폐색전 또는 심부정맥 혈전증이 의심되는 환자에서:

폐색전이 의심되는 38명의 환자 중 23명이 이미지 분석에 따라 양성이었으며, 심부정맥 혈전증이 의심되는 49명의 환자 중 25명이 다리의 근위정맥압박에 대한 초음파 관찰에 따라 양성임이 확인되었다.

폐색전(n = 23) 또는 심부정맥 혈전증(25)을 나타내는 두 그룹의 환자에서, 2명이 위음성 용해성 피브린 카운트를 나타내었는데, 하나는 폐색전(혈관조영술에 의해 확인)을 나타내는 그룹에 속하고, 다른 하나는 심부정맥혈전증을 나타내는 환자 그룹(초음파로 확인)에 속하였다; 그러나, 이들 두 환자는 역치인 500 ng/ml보다 더 높은 D-다이머 수준을 나타내었다. 반면, 두 환자(폐색전을 갖는 그룹 중 한명과 심부정맥혈전증을 나타내는 환자 그룹 중 하나)의 D-다이머 수준은 정상인데(< 500 ng/ml), 가용성 분해가능한 피브린 수준은 > 300 ng/ml이었다. 이러한 위음성 D-다이머 수준은 Lia 테스트^® 또는 Vidas^®테스트에 의해 D-다이머를 측정하였을때 관찰되었다.

D-다이머와 가용성 피브린을 조합한 경우, 생물학적 수치에서 어떠한 위음성도 검출되지 않았다.

D-다이머 및 가용성 분해가능한 피브린에 대한 관련지수(민감도, 특이성, 양성 및 음성 예측치)가 산출되었다.

[표 4]

D-다이머 및 가용성 분해가능한 피브린에 대한 민감도, 특이성, 양성 및 음성 예측도

	SDF+		D-다이머 + 가용성 피브린
	EP	DVT	EP	DVT
PPV	92%	88%	71%	60%
NPV	92%	95%	83%	90%
민감도	96%	96%	96%	96%
민감도	86%	87%	36%	37%

PPV = 양성 예측도, NPV = 음성 예측도,

EP = 폐색전, DVT = 심부정맥 혈전증, SDF = 가용성 분해가능한 피브린

항-응고 처치하 환자에서의 D-다이머 및 가용성 분해가능한 피브린 수준의 변화

비분획 헤파린 또는 저분자량 헤파린이 치료양으로 투여된 환자들에서 가용성 분해가능한 피브린의 신속 정규화가 관찰되었다. 1일 후, 가용성 분해가능한 피브린 수준은 정상치 또는 정상치의 상한에 존재하였다. 매일 수준을 분석한 결과 가용성 분해가능한 피브린은 헤파린을 처리하는 동안 정상 파라미터 범위내 존재하는 것으로 보여졌다. 반면, D-다이머는 천천히 감소하였으며, 헤파린을 처치하는 동안 정상 수준에 도달하지 않았다. 한 환자에서, 가용성 피브린은 치료적 처치 중에 증가되었으며, 이는 치료효과가 불충분한 것을 의미하였다.

논의

폐색전 및/또는 심부정맥 혈전증 진단에 적합하며, 대부분의 케이스에서 주어지는 처치에 관해 즉각적인 결정을 허용할 수 있는 비침습적 진단 툴이 요망된다.

본 연구는 D-다이머와 가용성 분해가능한 피브린의 조합이 폐색전 및/또는 심부정맥 혈전증의 진단에 유용한지 여부 및 혈전발생 저해에 대한 항-응고 처치의 효능을 평가하는데 유용한지 여부를 조사하기 위한 것이다.

폐 색전 및 심부정맥혈전증에서 측정 민감도에 대해:

D-다이머 수준에 관해 위음성결과를 보이는 2명의 환자(하나는 폐색전 그룹에서 다른 한명은 심부정맥혈전을 나타내는 환자 그룹에서)는 역가의 상한보다 더 높은 가용성 분해가능한 피브린 수준을 나타내었다. 이는 비정상 피브린 응괴구조(선천적이거나 후천적)을 가져 응괴가 섬유소 용해에 비정상적으로 저항성을 나타내기 때문일 수 있다. 이러한 비정상은 혈전용해결손으로 인한 혈전증 위험 상승에 직접적으로 기여한다.

이러한 저섬유소용해는 구성 혈전증(constituted thrombosis)을 나타내는 환자에서의 D-다이머 "위음성"을 나타내는 케이스의 3% 내지 5%를 차지한다. 가용성 분해가능한 피브린 정량에 있어서, 피브린은 섬유소용해 효소에 용이하게 접근한다. 반면, 혈전내 피브린은 매우 미세하고 매우 단단하게 형성되어 섬유소용해 효소에 거의 접근하기 어려우며, 이는 혈전환자에서 관찰되는 D-다이머에 대한 3% 내지 5%의 위음성을 설명한다. 가용성 분해가능한 피브린에 대한 음성 수준은 2명의 환자에서 검출되었는데(하나는 폐색전을 나타내는 그룹에서 다른 한명은 심부정맥혈전을 나타내는 환자 그룹에서), 반면 이들 2 환자에서 D-다이머의 수준은 500 ng/ml 이상이었다. 이는 트롬빈의 활성이 일시적이므로 혈전원성(thrombogenicity)이 비진화적 과정임을 시사한다.

본 발명자는 두 테스트(가용성 분해가능한 피브린 및 D-다이머)의 조합이 환 자에서 심부정맥혈전증과 폐색전 진단을 구분하는데 사용될 수 있음을 입증하였다.

대부분의 경우, 혈장 D-다이머는 혈전에 대한 민감성 마커이기 때문에 폐색전 및 심부정맥 혈전증의 진단에 필요한 기준을 만족하나 특이성이 부족하다(26-35).

현재 D-다이머가 혈전색전성 정맥 질환의 양성 진단을 수행하는데 사용될 수 없다는 것이 확립되어 있는데, 테스트가 충분히 특이적이지 않기 때문이다. D-다이머 수준이 정상인 경우에도 95%의 환자에서 혈전색전성 질환의 진단이 이루어질 수 있다.

본 연구에서 가용성 피브린의 특이성이 D-다이머 보다 훨씬 더 높음이 확인되었다. 혈전색전 정맥성 질환을 진단하는데 있어 D-다이머 측정의 낮은 특이성은 조직에 존재하는 피브린의 국소 피브린용해 효소에 의한 분해에 기인한다. 조직내 국소적으로 형성되는 가용성 피브린 분해 산물은 이들의 비교적 낮은 분자량으로 인해 혈액내로 확산된다. 이는 염증 질환 환자에서 D-다이머 수준이 자주 높게 나타난다는 관찰에 의해 지지된다.

본 연구에서, 가용성 분해가능한 피브린의 수준은 혈전이 일어날때 증가되는 것이 보여졌다; 그러나 항-응고제가 처치되자마자 가용성 분해가능한 피브린의 농도는 단지 몇시간내에 정상치로 감소한다. 이는 항-응고제 약물이 효과적으로 혈전 과정을 차단할 수 있음을 제안한다. D-다이머 수준의 지속적인 상승은 항-응고제 처치전에 형성된 혈전의 분해 때문이다. 결과적으로 항-응고제 처치의 효과를 팔로 압하는데 또는 새로운 항-혈전 약물의 효능을 테스트함에 있어서 가용성 분해가능한 피브린을 정량하는 것이 매우 중요하다.

결론적으로 본 연구 결과는 D-다이머 측정과 함께 가용성 분해가능한 피브린을 측정함으로써 심부정맥 혈전증 및 폐색전 및 다른 혈전 질환의 진단에 유용한 임상적 수단을 제공할 수 있음을 보여준다. 또한 가용성 분해가능한 피브린은 항-응고 처리(처치)의 효과를 모니터하는데 유용함을 보여준다.

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Claims (17)

1. 환자로부터 분리한 혈액 시료에서 시작하는 응고 활성화 진단을 위한 생체외 방법으로서

   i) 시료내에 존재하는 D-다이머의 양을 측정하고 이를 D-다이머의 기저수준으로 하는 것으로 이루어지는, 테스트 시료내에 포함된 피브린 분해 산물의 량을 측정하는 단계,

   ii) 시료를 피브린에 대해 높은 친화성을 갖는 플라스미노겐 활성제(Pa-Fb sp)와 함께, 시료내 함유된 가용성 피브린은 분해되어 분해 산물로 되고 피브리노겐은 분해되지 않는 조건하에서 인큐베이션 처리하고, 처리된 시료내 함유된 D-다이머의 양을 측정하는 단계;

   iii) 상기 ii) 단계에서 Pa-Fb sp 활성제에 의해 활성화된 후 측정된 D-다이머의 양과 상기 i) 단계에서 활성화전에 측정된 D-다이머의 양의 차이를 산출하고, 이 차이를 가용성 피브린(SDF)의 분해 정도로 하는 단계;

   iv) 상기 i) 단계에서 측정된 D-다이머 수준을 상기 분해 산물에 대해 정해진 정상 역가와 비교하고, 상기 iii)단계에서 산출된 SDF 수준을 SDF에 대해 정해진 정상 역가와 비교하는 단계;를 포함하며,

   상기 i) 단계에서 측정된 D-다이머의 수준 또는 산출된 SDF의 수준 중 하나 이상이 상기 정해진 각각의 정상값보다 더 높으면 혈전색전 질환의 위험이 존재하고, i) 단계에서 측정된 D-다이머의 수준과 iii)단계에서 산출된 SDF 수준이 상기 정해진 각각의 정상값보다 더 낮으면 상기 위험이 배제되는 것인 생체외 진단 방법.
2. 제1항에 있어서, 혈전색전성 정맥질환의 조사를 위한 것인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정맥 혈전 형성의 조사에 적용되는 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 심부정맥혈전증의 진단을 위한 것인 방법.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색전의 진단을 위한 것인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액시료가 혈장시료인 진단 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액시료가 항-응고치료를 받는 환자의 혈액시료인 방법.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Pa-Fb sp 활성제가 t-PA인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스민 억제제의 첨가에 의해 피브리노겐의 분해가 방지되는 것인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 플라스민 억제제가 아프로티닌이고, 상기 아프로티닌을 Pa-Fb sp 플라스미노겐 활성제와 시료를 37℃에서 15분간 인큐베이션한 후 첨가하는 것인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 시료를 Pa-Fb sp 플라스미노겐 활성제와 인큐베이션하기전에, 시트르산 및 트리소듐시트레이트 조성물과 같은 항-응고제를 시료에 가하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 음성 대조 시료 및 양성 대조 시료 내의 가용성 피브린 분해 산물을 검사하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 D-다이머는 항-D-다이머 모노클론항체를 사용하여 측정하는 것인 방법.
14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계들을 수행함으로써 정 상 혈장 시료로 구성된 양성 대조 시료내 존재하는 SDF 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법:

    i) 혈장 시료를 응고 활성제와 인큐베이션하여, 피브린 응괴의 형성없이 가용성 피브린을 형성시키는 단계로, 이때 상기 활성제는 예를 들면 가용성 피브린의 형성을 유도하는 소량의 트롬빈인 단계;

    ii) 상기 처리된 시료를 응고를 차단하기에 충분한 양의 응고 억제제와 인큐베이션하는 단계로, 이때 상기 억제제는 예를 들면 헤파린 또는 히루딘인 단계;

    iii) 시료내 함유된 가용성 피브린은 분해되어 분해 산물, 특히 D-다이머로 되고 피브리노겐은 분해되지 않는 조건하에서, 상기 가용성 피브린 모노머를 포함하는 제조된 시료를 피브린에 대해 고 친화성을 갖는 플라스미노겐 활성제(Pa-Fb sp), 특히 t-PA와 접촉시키는 단계.
15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, D-다이머에 대한 정상 역가가 500 ng/ml이고, SDF에 대한 정상 역가가 300 ng/ml이며, 테스트 대상 시료의 측정값들이 상기 두개의 정상 역가들보다 낮은 경우 혈전색전 질환이 배제되는 것인 진단 방법.
16. - 항 D-다이머 모노클론 항체;

    - 피브린에 대해 높은 친화성을 갖는 플라스미노겐 활성제(Pa-Fb sp);

    - 가용성 피브린용 양성 대조 시료 및 적절한 경우 음성 대조 시료로 구성되 는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 혈전색전 질환을 진단하는데 사용되는 키트.
17. 제16항에 있어서, 플라스민 억제제를 추가적으로 포함하는 키트.

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