JPH02500805A - 組織プラズミノーゲン活性因子とプラズミノーゲン活性因子阻害因子の改良された評価方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 名称二′”組織ブラズミノーゲン活性因子とプラズミノーゲン活性、因子阻害因 子の改良された評価方法パ［技術分野］ 本発明は、組織プラズミノーゲン活性因子を測定する改良された方法、及びブラ ズミノーゲン活性因子阻害因子と可溶性フィブリンに関する。特に、本発明は、 ブラズミノーゲン活性因子阻害因子と遺伝子が変化した組織ブラズミノーゲン活 性因子蛋白質を試験体として利用する可溶性フィブリンを測定する方法に関する 。本発明は、更に、体内のブラズミノーゲン活性因子が働かない状態で採血を行 う改良された方法に関する。

［背景技術］ 略語”ｔ−ＦＡ“は”組織ブラズミノーゲン活性因子”を意味する。略語”ＰＡ Ｉ”はプラズミノーゲン活性因子阻害因子を意味する。’ＦＡＩＩ”はブラズミ ノーゲン活性因子阻害因子１であるが、時には体内プラズミノーゲン活性因子阻 害因子と呼ばれる。ＰＡＩ２’はブラズミノーゲン活性因子阻害因子２であり、 時に胎盤ブラズミノーゲン活性因子阻害因子と呼ばれる。略語”αｚＡＰ’はア ルファ２抗プラズミンであり、通常の人体から発見されプラスミン酵素を阻害す る蛋白質である。′フィブリノーゲンダイジェスト”は蛋白質加水分解酵素又は ブラズミンによるフィブリノーゲン又はフィブリンの消化生成物を含む。

血しよう中の組織ブラズミノーゲン活性因子阻害の検査は、その方法がまずかっ たのでうまくいかなかった。潜在する繊維素溶解阻害因子が適度に酸性化するこ とにより中和された血しようサンプル中でｔ−ＦＡを測定する成る微妙な方法が 、提案されている。０ｉｍａｎ、　Ｂ、、’　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃ ｈｉｍ　Ａｃｔａ、　１２７．２７９−ｓ、　２７．７４３−７４９．１９８２ ）この方法により、血しょう中のｔ−ＦＡに対する阻害作用を具体的に決定する ことも可能になり、血しょう中での高速ｔ−ＰＡの活動の証拠が提出された。

化学量論比１：１の複合体の形成を仮定すれば、約１１国際単位の阻害）と決定 された。ｔ−ＦＡ阻害要素もまた様々な患者の血しょう中で決定された。高い阻 害作用を持った要素は重度の静脈血栓症、出産間際の止血障害或は心臓病の患者 に頻繁に発見された（Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋａ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔ ｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、３１４２７−４３６　（１９８３））、観測されたＰＡ Ｉの作用は、今ではＰＡＩＩの作用の結果とあることが知られている。

黒色腫の細胞から引き離されている生体のｔ−ＦＡを用いたｔ−ＦＡとＦＡＩの 計測の為の幾つかの評価システムが出回っており利用することが出来る。しかし ながら、ｔ−ＰＡの蛋白質の二つの鎖へのへき開の為に、これらの評価から得ら れたＰＡｌレベルに関する結果は常に信項できるとは限らない。

生体の一１ｔ−ＰＡは、ｔ−ＰＡ蛋白質の一〇ｉｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ −Ｌｙｓ−の連鎖のＡｒｇの後で、プラスミン又トリプシンによりへき開される 。

これは、ｔ−ＰＡ作用の阻害によって、体液中でのＰＡＩＩレベルの計測を行う ときに同類となる。なぜなら、二１ｔ−ＰＡは、ＦＡＩ２とすぐに反応するし、 又α２ＡＰのような他のプロテアーゼ抑制剤を有する一９ｔ−ＰＡより早く反応 するからである。

従って、評価手続きの間、或は配合手続き中にｔ−ＦＡの二つの鎖の形成を防止 する蛋白質加水分解の酵素によるへき開に耐えうるｔ−ＦＡが必要である。この 様なｔ　−ＦＡを用いて、ＦＡＩの存在を正確に計測できた。

ｔ−ＰＡとＦＡＩを計測する従来の方法が抱えたもう一つの問題は、採血後にｔ −ＰＡとＰＡＩＩの活動が全く不安定となることと、採血後これら二つの蛋白質 の活動が急速に衰えることである。

血液中でｔ−ＰＡが評価される時、ポリリシンがｔ−ＦＡの有効な活性因子であ ることが知られている。しかしながら、血液や血しよう以外の体液中で、はポリ リシンはもはやｔ−ＦＡの有効な活性因子ではないことも知られている。従って 、血しよう以外の体液中でｔ−ＦＡレベルを決定できるｔ−ＦＡの有効な活性因 子を、ポリリシンと共に、構成する血しよう中のｙ４Ｈを確認、することが必要 である。

従来技術の別の問題は、評価を妨げる血しようサンプル中の阻害作用を壊す為に 、低し、１水素イオン濃度の状態で比較的長時間酸性化して定温処理しなければ ならないことである。阻害因子の為に、’ｔ　−Ｐ　Ａ作用は血液又は血しよう 中で不安定であり従って一般のクエン酸血しようサンプル中でこれを決定するこ とは出来ない。通常の手続きで血液のサンプルを採取し分析できる様な、ｔ−Ｆ Ａの作用を安定化する方法かもとめられる。従来の採血方法が用いられる場合、 血液分析の前にｔ−ＰＡの作用な失われる。

ｔ−ＦＡの作用を決定する従来の方法の更に他の問題は、ＰＡＩＩの作用をも含 んだ体液中で、ｔ−ＦＡの作用（よ過小評価されるということである。これは、 ＰＡＩＩは、評価システムにおり１て、生物和審竹を発揮するからである０体液 中でのｔ−ＦＡの作用）計測時に評価システムでのＰＡＩＩの作用を押さえる方 法力（必要である。

［発明の開示コ 本発明によれば、−Ａｒｇ−アミノ酸がＨｉｓ（Ａｒｇ　ｔｏ　Ｈｉｓ）又はＬ ’ｙｓ（Ａｒｇ　ｔｏ　Ｈｉｓ）又（よＴｈ　ｒ　（Ａｒｇ　ｔ　ｏ　Ｔｈ’ｒ ）で置き換えられた一１ｔ−ＦＡの変異型が生体ｔ−ＰＡ蛋白質の遺伝学的改良 を通じて形成され６・”き関しない（Ａｒｇ−Ｔｈｒ）突然変異体を含む突然変 異体を、血しょう更に、本発明は、血液中に存在するｔ−ＰＡが安定であり、血 液中に存在するＦＡＩによって容易に不活性化されない様に、採血する改良され た方法をも含む。この改良された採血方法は、生理学的ｐＨで約７．３から約４ ．０と６．ｏの間のｐＨまで血液を酸性化する工程を含む。ｔ−ＦＡを評価する 為に血液を酸性化する好ましい方法はクエン酸緩衝材を用いるものである。

勿論、他の緩衝材を用いて本発明を実施する事も可能である。酸性化の間血液の ホモリシスを抑制する為に、血液クエン酸性緩衝材混合物にＰｌｕｒｏｎｉｃ　 Ｆ−６８（商標）を加えることは効果的である。

本発明の他の様相は、フィブリノーゲンがポリリシンによるｔ−ＦＡの活性化に 必要な血しょう成分であることの発見である。フィブリノーゲン又はフィブリン のブラズミンダイジェストは、ポリリシンの存在でｔ−ＦＡの活性化も行う。従 って、血液、以外の体液中でｔ−ＦＡが計測されている時、ｔ−ＦＡ作用の最大 のシミュレーションを得る為にフィブリノーゲン（又はフィブリノーゲン消化生 成物）をポリリシンと共に加えなければならない。

従って、本発明の目的は、ブラズミノーゲン活性因子阻害作用の評価の為の改良 された方法を提供することである。

本発明の目的は、蛋白質溶解酵素によるへき開に堪え、ＰＡＩＩの評価に宵月な ｔ−ＦＡを提供することである。

本発明の他の目的は、最低のホモリシスで、血液のｐＨを直ちに下げる方法を提 供することである。

本発明の更に他の目的は、血液でない体液中でｔ−ＦＡの補足因子としての゛フ ィブリノーゲン又はフィブリノーゲンダイジェストとともにポリリシンを用いる 方法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、蛋白質溶解酵素によるへき開に耐える一ａｔ−ｐＡを 利用するサンプル中で、フィブリンを計測する改良きれた方法を提供することで ある。

本発明の別の目的は、ｔ−ＦＡ作用の評価を妨げるＰＡｌｌとα、の抗プラスミ ン作用を抑制する抗体を用いることにより、ｔ−ＦＡの評価を改良することであ る。

以上に述べた本発明の目的及びその他の目的、特徴、利点は、以下に述べる実施 例の詳細な説明及び請求の範囲をみれば明らかになるであろう。

［図面の簡単な説明コ 第１図は異なる緩衝材中での、採血されたｔ−ＦＡ作用を示す。

［開示する実施例の詳細な説明コ ｔ−ＦＡ蛋白質の−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ−の連鎖のＡ　 ｒ　ｇの後で、生体の一鎖ｔ−ＦＡはプラズミン又はトリプシンによってへき関 する。これは、ｔ−ＦＡ作用の阻害によって体液中でのＦＡＩレベルの計測を行 おうとする時に問題となる。例えば、ｔ−ＦＡ作用はフィブリンまたはフィブリ ン鎖で刺激されることが知られている。フィブリンの存在による一ａｔ−ＰＡの 刺激は、二鎖ｔ−ＦＡのそれに比較してかなり大きい。

ペプチド−〇　Ｉ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−に対するポリコーナル抗体へのｔ−ＦＡ変異体の作用は僅か であるが、生体蛋白質へは直ちに作用した。ＩｔＪ／μｇで表現された具体的な 作用は次の通りである。即ち、野生型の８１０及びＢｏｗｓ黒色腫ｔ−ＦＡの６ ６０との比較に於いて、８１０（Ａｒｇ　ｔｏ　Ｈｉｓ）、６４０（Ａｒｇ　ｔ ｏ　Ｌｙｓ）、２９（ｊ（Ａｒｇ　ｔｏ　Ｔｈｒ）である。酵素１μｇ／ｍ１で の一秒当たりのｍＯＤとして表現された３７℃、ｐＨ９，０での、Ｄ−Ｉ　１ｅ −Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡに対するアミド溶解作用は、二鎖黒色１ｔ−ＦＡの５ ５．２との比較に於いて、１５．８（Ａｒｇ　ｔｏ　Ｈｉｓ）、’　１３．６（ Ａｒｇ　ｔｏ　Ｌｙｓ）、８．３　ＣＡｒｇ　ｔｏ　Ｔｈｒ）。

ＰｒＡ１の決定に於ける理論的な有利さを代表する。ＣＡｒｇ組み替え技術に精 通した通°常の技術者が容易作成しうることは理解されるだろう。

フィブリンの存在した状態及び存在しない状態に於ける、０．５μｍのブラズミ ノーゲンのブラズミノーゲン作用比率は、３７℃で計測され刺激因子が計算され た。これは、ＣＡｒｇｔｏ　Ｔｈｒ）変異体に対して約９５０倍であり、黒色腫 −鎖ｔ−ＦＡ或は他の変異体で計測された約５５０倍に比較して極めて高い数字 である。二鎖黒色ｆｉｔ−Ｐλの刺激因子は約１２０倍である。Ｙｉｍａｎ−Ｒ ａｎｄＹの記録によれば、（Ａｒｇ　ｔｏ　Ｔｈ、ｒ）変異体のフィブリンの通 常のものを超えた感度は、可溶性フイブリンの評価を向上させた（貰ｉｍａｎ、 　Ｂ　ａｎｄ　Ｒａｎｄｙ、　Ｍ、　ＴｈｒｏＴｒＩｂ、　Ｈｅａｒｎ。

５ｔａｓ、　５５．１８９−１８３（１９８６））。従って、ブラズミン不感性 蛋白質操作ｔ−ＦＡ変異体は、ＰＡＩＩ作用及び可溶性フィブリンの評価に用い る場合、従来技術に比較して有利であることが示される。

本発明によって計測されたｔ−ＦＡ作用は、選択的に、分析すべき体液に存在す る抗プラズミン作用とＦＡＩ作用を抑制する抗体を含んだ試薬を用いて決定する ことが出来る。

本発明は、−９ｔ−ＦＡ、プラズミノーゲン及びブラズミン基質を含んだ試薬を 一定量のサンプルと混合する工程と、サンプル中の可溶性フィブリンの量とこの 比率を関係づけてブラズミン基質へき開を計測する工程からなる、サンプル中の 可溶性フィブリンの量を計測する方法も含んでいる。

もし、サンプル血液採取中に生理学的ｐＨを約７．３から約４．０と６．０の間 のｐＨまで直ちに降下させれば、採血に一般的に用いられ′て・いるＶａｃｕｔ ａｉｎｅｒ、　Ｖｅｎｏｊｅｃｔ　（共に商標）に比べて、フィブリン加水分解 を安定させる上で幾つかの効果が得られることが見いだされた。

本発明によれば、クエン酸１モル濃度でｐＨが約４のクエン酸緩衝材一部の入っ た容器に血液９部をいれる。血液サンプルのｐＨは好ましくは、最終的に４，５ から６．５の間になるべきである。このクエン酸緩衝材は、好ましくくはクエン 酸ナトリウムが０．５モル濃度と２モル濃度との間でｐＨ４，０〜ｐＨ５，０で あり、採取中に５〜１５部（容＠）の血液が加えられる。

血液サンプル中での、血小板作用と赤血球のホモリシスを防止するために、Ｐｌ ｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８（ＢＡＳＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐ ａｎｙ、　ＮＪ）　（商標）を、採血されている溶液の中に選択的に加えること ができる。このＰｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−８８の最適の最終濃度は、はぼ０．０１ Ｓ〜０．１ｊ；（０，１〜１　ｍｇ／ｍｌ）である。ホモリシス防止の為に、そ の他のＰｌｕｒｏｎｉｃ表面活性剤を本発明の中で用いることができることは言 うまでもない。

このＰｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８は、下記の一般式で表されるものである。

ＨＯ（０２Ｈ４０）ｂ（’Ｃ５Ｈ−０）（Ｌ　（ＣｔＨ−０）ｂＨココテ、整数 ａ　ｌｉ　（Ｃｚ　Ｈｔ　Ｏ）で代表されるこの疎水性物質が約９５０〜４００ ０．好ましくは約１７５０〜３５００゜の分子量を持つ様に選ばれ、整数すは（ Ｃ２Ｈ４ｏ　）で代表される親水性部分がこの化合物の重量の約５０％〜９０％ を占める様に選ばれる。

Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８は、具体的に下記の式で表されるものここで、疎水 性物質（Ｃｓ　Ｈｓ　Ｏ）の分子量は約１７５０であり、この化合物全体の分子 量は約８４００である。

この方法の利点は、ｔ−ＰＡとＰＡＩＩ間の作用比率の安定性を大幅に改善する 。これは最も重要なことである。なぜなら、従来の様に採取され保存された血液 サンプル中での低いｔ−ＰＡ作用ではなく、採血時のｔ−ＦＡ作用が関係してく るからである。従って、本発明は、血栓病の原因、ｔ−ＦＡ療法時に得られたｔ −ＦＡ作用或は血栓病の進行の危険を診断するｔ　−ＦＡ作用の計測の価値を向 上させるものである。

ｔ−ＦＡ作用を計測するために採血する好ましい方法は、クエン酸緩衝剤の入っ た容器に採血する工程を含む。この緩衝剤は、ｐＨ約４．０のクエン酸ナトリウ ム（０，５モル濃度）からなる。このクエン酸緩衝剤はカリウムの様な他の金属 陽イオンを有していてもよい。血液中でのｔ−ＰＡ作用を保ために、ｐＨ減少は 穏やかなもののみ要求される。最終のｐＨが約５．３〜５．８、好ましくは約５ ．５の時に、良好なｔ−ＦＡ安定性が見いだされる。この条件は緩やかであり、 この試みかフィブリノーゲン、ブラズミノーゲン、ＡＴＩ］ｌ、蛋白質ｃ等の分 析に価値が有ることを証明している。

従来の方法で採血された場合に比較して、本発明によって採血された血液サンプ ルではＦＡＩ作用の安定性が際立って向上する事が確認された。このことは、こ の種の評価にとっては重要である。なぜなら、ＰＡＩＩ作用はの不安定性は、こ の臨床的に重要な評価の利用を制限しているからである。

更に、本発明による方法は、血液及び血しょうサンプル中での可溶性フィブリン レベルを維持し、この重要な評価の診断の上での重要さを向上させている。高い レベルの可溶性フィブリンは、悪性腫よ渋危険妊娠又は重い外傷を持った患者の 血液中で発見された。高いレベルの可溶性フィブリンは、散在性脈管向凝固の兆 候である。

リン加水分解パラメータ即ちｔ−ＦＡ作用、ＰＡＩＩ作用及び可溶性フィブリン の安定性を大幅に向上させる。

ポリーＤ−リシンをもちいた場合、ｔ−ＦＡへの刺激はブラズミノーゲン作用を 向上させたことが確認されている。ポリー〇−リシンの刺激効果を増大する因子 を含んだ人体の血しょうが発見された。この発見で、この因子はフィブリノーゲ ンであることが分かり、更にフィブリンとフィブリノーゲンのプラズミン消化生 成物が同様の効果を持つことも確認された。この発見は重要である。なぜなら、 血しょう中でのｔ−ＰＡ作用と血しょう中でのＰＡＩＩ作用を決定する為の実際 的で安価な試薬のＩＥが可能となるからである。これは、臨床で最も重要なこと である。

例１ 以下に本発明によるｔ−ＰＡの計測の例を示す。

クエン酸−水和物（Ｍｒ＝２１０）及びクエン酸三ナトリウムニ水和物（Ｍｒ＝ ２９４）をＭｅｒｋ　ＤａｒＪｌｓｔａｄｔ、’ｆ、Ｇ、がら入手した。Ｐｌｕ ｒｏｎｉｃ　Ｆ−６８はＢＡＳＦ社（Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒ ｓｅｙ）から入手した。血液は、クエン酸三ナトリウム（０，１３３モル濃）と 共に、血液９部クエン酸ナトリウム】部の割合で、血管がら５ｉｌｉｃｏｎｉｚ ｅｄ　Ｖｅｎｏｊｅｃｔ　（商標）採取管へ導入された。クエン酸とクエン酸三 ナトリウムの０．５モル汲度溶液をまぜあわせて、ｐｌ−１４，０，４，５，５ ，０，５，５（７）０−５モル濃度ツク、：ｃ　：／酸ナトリウム溶液を得た。

夫々の溶液はアリコートされ、２５％Ｆ６８を加えて最終的に０．０．］及又は １重量％とじた。

−，０，０，１又は１％のＦ１ａを含む、］　、　Ｏｍｏｌ／ｅ及３６の異なる 緩衝剤の夫々３３μｌが加えられたアリコート３００μｍに、クエン酸の導入さ れた血液が分散され、混合され、室温（２２℃）で２０時間保持された。このサ ンプルは、１５００ｘｇで６分間遠心分離され、０．１５５モル濃の塩化ナトリ ウム溶液で６倍に薄められ、ｐＨと５３７ｎｍでの吸収率の計測を行った。この 吸収率の値（１ｃｍ行程での光学的密度）は、希釈因子６が積算された。一連の 血液サンプルアリコートに対して、様々なりエン酸緩衝剤が１：９の容積率で加 えられた。血しょうは、はぼ２０時間後に得られ、ｐＨと５３３　ｎｍ吸収率が 計測された。その結果を表１に示す。表１では、クエン酸緩衝剤（１：９容積率 ）が、色々な濃度、ｐＨそしてＦ６８含有量で加えられた血液サンプルから得た 血しょうのｐＨと５３７ｎｍでの吸収率が示されている。

表１ ＨＯ，５ｍｏｌ／Ｉ　エン１．Ｏｍｏｌハクエン　２．０　ｍａｔハク１ンＬす ｌ皮□加ＩＦすＩ皮□ｙ１　シ夏ｌ皮圓加Ｌ４．０ｐＨ５，６２５，５０５，５ ８４，８８４，９０４，９４４，６２’４．５８４．６０人〇、５４　０．５１ 　０．７５　４．６１　３．３２　２．２４１０．９２１０．５１１．６４．５ ｐＨ６，０７６，０４６，０９５，４Ｐｌ　５．４４５．４１５．０Ｂ　５．１ ０５．１ＯＡ　Ｏ，６２［１５６０，５５０，６１ＣＬ４９０．４６５．２４１ ．０９１．４０表１に見られる様に、採取された新鮮な血液へのＦ１ａの投入は 、５３７ｎｍでの吸収で示されている様に、赤血球のホモリシスを減少させた。

これは、ｐＨ４，０での１モル濃度のクエン酸の投入及びｐＨ４，５での２モル 濃度のクエン酸の投入によって特に明らかである。この両方の場合、５３７ｎｍ での吸収で示されている様に、ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ　６８の濃度が増えるに従 い、赤血球の膜組織の安定性の投入剤に依存する増加がみられる。この実験は、 明らかに健康な人の血液で行ったのであり、ホモリシスの問題は小さい。これら の問題は、サンプルの数が増えればもっと大きくなると予想される。

例２ Ｖｅｎｏｊｅｃｔ、丁ｅｒｕｎｏ、Ｅｕｒｏｐｅ、Ｌｅｗｅｎ、Ｂｅｌｇｕｉｍ 　は０゜１３モル濃度のクエン酸ナトリウム０．４５ｍ１を含む４．５ｍ１の排 気されたケイ素化（ｅｖａｃｕａｔｅｄ　５ｉｌｉｃｏｎｉｚｅｄ）チューブで あり、以下標準ベノジェクトと呼ぶ。幾つかの標準ベノジェクトは、本発明の実 施例として変形される。標準ベノジェクトチューブ丙のクエン酸緩衝剤は皮下注 射針で吸入によって除かれ、０．４５ｍ１のクエン酸緩衝剤（１，０モル濃度、 ｐＨ４，０）が弾性ストッパーを介して皮下注射針によって注入される。このよ うにして、クエン酸緩衝剤は、チューブ内を真空にすることなく分散する。　こ の変形チューブは以下変形ベノジエクトと呼ぶ。

血液は、明らかに健康な人から脈管注射によって、二つの標準ベノジェクトチュ ーブと二つの変形ベノジェクトチューブへ導入される。標準ベノジェクトチュー ブと変形ベノジェクトチューブの夫々の一つに対して、１．０モル濃度のＫ）（ Ｃｏ、に溶けた一鎖ｔ−ＰＡ　（５００ｒＵ／ｍｌ）の４μｌか加えられた。

これによって、０．４５のへマドクリットの血しょう中でｔ−ＰＡ作用は約８． ９１Ｕ／ｍｌだけ増えた。４つのチューブ、゛即ち、標準ベノジニクト、標準ベ ノジェクト＋ｔ−ＦＡ、変形ベノジェクト、変形ベノジェクト＋ｔ−ＦＡ、が室 温（２２℃）でぶ置され、０．２５，４．２．３時間経過後に１ｍｌのアリコー トが引き出される。このアリコートは１５００ｘｇで６分間遠心分離される。

そして、１００μｍの血しょうが１００μｍ　ｍｏｌ／ｌのクエン酸緩衝剤（ｐ Ｈ３，９）の添加で酸性化され、Ｖｉｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、　Ａｃｔ、　！２７；　２７Ｂ−２８８Ｃ１９８３）の記録に従って 、Ｂｉｏｐｏｏｌ　ＡＢ。

Ｕｍｅａ、　５９ｒｅｅｄｅｎのスペクトロライス／フィブリン（５ｐｅｃｔｒ ｏｌｙｓｅ／Ｔｉｂｒｉｎ）試薬を用いて分析される。結果は表２に示されてい る。

表２で、時間０の時、約９　ＩＵ／ｍＩのｔ−ＦＡを加えた場合と加えない場合 で標準ベノジェクトと変形ベノジエクト中での採血後に、血しょう中のｔ−ＦＡ 作用が測定される。血球の分離の前に、この血液は室温で０．２５．１．２．３ 時間ふ置された。

ｔ−ＦＡ作用は、ＩＵ／ｍｌで表現される。表２で、標準ベノジュクトはＶｅｎ ｏｊｅｃｔ　Ｒｅｇｕｌ’ａｒ、変形ベノジエクトはＹｅｎｏｊｅｃｔ　Ｍｏｄ ｉｆｉｅｄと表示しである。

表２ ３　０．０４　０．４　１．４　９．９表２から分かる様に、変形されていない ベノジェクトチューブでは、ｔ−ＰＡ作用は急速に減少したのに対して、変形ベ ノジェクトチューブの場合ｔ−ＦＡ作用は安定していた。

例３ 座して静止状態にある患者の前腕静脈から、４．５ｍｌの血液（ナトリウム）ク エン酸緩衝剤０．５ｍｌの入ったケイ素化ガラスチューブ中に採取する。２２の 異なるクエン酸緩衝剤（モル濃度０．１３〜０．８、ｐ）（３〜５．５）の各々 に５人から採取した血液を投入する。血液は、蓋付きのポリスチレンチューブに アリコート（３ｘ　１．５ｍ１）され、２２℃で０．０５．　ｌ及び４日間ふ置 される。そうすると、１０分間の遠心分！（３０００χｇ）で血しょうがえられ るので、これを凍結し一２０℃で保存する。ｔ−ＰＡ作用は、色原体基質で刺激 されたフィブリン評価（Ｂｉｏｐｏｏｌ　ＡＢ、　Ｕｎｅａ、　Ｓｗｅｄｅｎ） で確認される。そして、ｔ−ＰＡ作用の平均半減寿命（ｔｌ／２）がまる。］） Ｈは、標準的なガラス電極で測定される。ホモリシス、ホモリシス因子（Ｉ（Ｆ ）の相対的な程度は、０．１３モル濃度のクエン酸三ナトリウムへの採取の場合 との比較に於いて、５４０の波長での吸収の増加として測定される。

表３ 室温にて貯蔵された血液からの血しょう（ＬＵ／ｍｌ）中のｔ−ＰＡ活性体２　 １．２　１．０　０．９　０．４　０．１　０３　１．１　１．１　０．８　０ ．５　０　０４、　０．７　０．７　０．７　０　０　０５　１．０　１．０　 ０．８　０．４　０　０表４ 室温にて貯蔵された血勘）らの血しょう中の５４０ｎｍにおける吸収性０．５　 ｍｏｌ／１クエン酸ｐＨ４，００，１３ｍｏｌ／、クエン酸患者　０日　１日　 ４日　０日　１日　４日好ましい緩衝剤組成は、クエン酸で約０．５モル濃度、 約４．ｏｐＨであることが見いだされた。図１と表３は、クエン酸緩衝剤（０， ５モル濃度、４．０ｐＨ）上及び従来のクエン酸三ナトリウム緩衝剤（０，１３ モル濃度）への採取後０．０５．　ｌ。

４日間経過した段階での血液中でのｔ−ＦＡ作用を示している。

図１に示されている様に、０．５モル濃度の緩衝剤中でのｔ−ＦＡ作用は、従来 の緩衝剤のそれに比較して非常に安定であった。

最終の血液サンプルのｐＨは、従来のクエン酸三ナトリウム緩衝剤（０，１３モ ル濃度）の８．３に対して、約５．５であった。

］）８４．０で０．５モル濃度のクエン酸緩衝剤へ採取された時、室温で血液中 のｔ−ＰＡ作用の平均半減寿命は１７日であった。

第４表は、２つのｎシステムにおける溶血現象（ヒマリスイス：　ｔ＋ｅ＋１１ ０１ｙｓｉｓ）を示している。示されているように、好ましｕｑ街剤組成におけ るヒマリスイスは、受は入れ可能である。

以上述べ、或は図面に記された特徴は、その機能或は目的を達成する為の手段と して、特定の形式で表現されており、これらの特徴の個々又は組み合わせとして 様々な変形として利用することができる。

日　棗７ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ．評価すべきＰＡＩＩの量の分からない生理学的液体と作用量の分かって いる−領ｔ−ＰＡとを混合する工程と、ｂ．ｔ−ＰＡとＰＡＩＩとが作用するの に必要な十分の時間をおく工程と、 ｃ．ｔ−ＰＡ作用を確認する工程と ｄ．工程ｃで測定されたｔ−ＰＡ作用と投入されたｔ−ＰＡ作用との差としてサ ンプル中のＰＡＩ１作用量を決める工程とからなるプリズミノーゲン活性因子疎 外因子１の作用を確認する方法。 ２．前記一鎖ｔ−ＰＡは、通常存在するｔ−ＰＡよりも二鎖ｔ−ＰＡへのへき開 おこり難い、自然に存在するｔ−ＰＡの変位体である請求の範囲第１項記載の方 法 ３．【配列があります】 上記一鎖ｔ−ＰＡ連鎖のアルギニン残基は、トレオニン、中性荷電性アミノ酸又 は負荷電性アミノ酸の中から選ばれたアミノ酸と置き換えられている請求の範囲 第１項記載の方法４．【配列があります】 上記一鎖ｔ−ＰＡ連鎖のアルギニン残基は、蛋白質が二鎖ｔ−ＰＡヘへき開出来 ない様に化学的に変化している請求の範囲第１項記載の方法 ５．上記工程ｃでのｔ−ＰＡ残基は、プリズミノーゲン、プラスミン基質、ポリ リシン、フィブリノーゲン及びフィブリノーゲンとフィブリンのプラスミン消化 生成物から選ばれた試薬を用いて確認される請求の範囲第１項記載の方法６．工 程ｃで測定されたｔ−ＰＡ作用は、分析する生理学的液体中に存在する抗プラス ミンの作用を疎外する抗体を含む試薬を用いて確認される請求の範囲第１項記載 の方法７．上記工程ｃで測定されたｔ−ＰＡ作用は、分析すべき生理学的液体中 に存在するｐＡＩ１の作用を疎外する抗体を含む試薬を用いて確認される請求の 範囲第１項記載の方法８．ａ．一鎖ｔ−ＰＡ、プリズミノーゲン及びプラスミン 基質からなる試薬の一定量をサンプルの一定量と混ぜる工程と、ｂ．プラスミン へき開の程度を測定する工程と、ｃ．これをサンプル中の可溶性フィブリンと関 係付ける工程とからなるサンプル中の可溶性フィブリンの量を確認する方法９． 前記一鎖ｔ−ＰＡは、通常存在するｔ−ＰＡよりも二鎖ｔ−ＰＡへのへき開おこ り■い、自然に存在するｔ−ＰＡの変位体である請求の範囲第８項記載の方法 １０．【配列があります】 上記一鎖ｔ−ＰＡの連鎖のアルギニン残基は、トレオニン、中性荷電性アミノ酸 又は負荷電性アミノ酸の中から選ばれたアミノ酸と置き換えられている請求の範 囲第９項記載の方法１１．【配列があります】 上記一鎖ｔ−ＰＡ連鎖のアルギニン残基は、蛋白質が二鎖ｔ−ｐＡへへき開出来 ない様に化学的に変化している請求の範囲第９項記載の方法 １２．ａ．プリズミノーゲン、プラスミン基質及びｔ−ＰＡ）刺激剤からなる試 薬とｔ−ＰＡ作用の知られていない生理学的液体とを混合する工程と、 ｂ．プラスミン基質のへき開によって生理学的液体中でのｔ−ＰＡ作用の量を決 める工程、 とから成る組■プリズミノーゲン活性因子の生理学的液体中での作用（ｔ−ＰＡ 作用）を確認する方法 １３．上記ｔ−ＰＡ刺激剤は、ポリ−Ｄ−リシン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ −リシンの誘導体及びポリ−Ｌ−リシンの誘導体からなるグローブから選ばれた ものと、フィブリノーゲン、フィブリノーゲンのプリズミン消化生成物、フィブ リンのプラスミン消化生成物、及びフィブリノーゲン又はフィブリンのプリズミ ン消化生成物の要素からなるグローブから選ばれたものを組み合わせることによ って得られた請求の範囲第１２項記載の方法１４．上記試薬は、α−２−抗プリ ズミンの作用を阻害する抗体を含んでいる請求の範囲第１２項記載の方法１５． 上記試薬は、ＰＡＩ１の作用を阻害する抗体を含んでいる請求の範囲第１２項記 載の方法 １６．血液サンプルのｐＨを４．０〜６．０まで下げ、この血液サンプルのｔ− ＰＡ作用を安定させる血液サンプルの採取方法１７．上記血液サンプルのｐＨは 、この血液にクエン酸緩衝剤の効果的な量を加えることによって下げられる請求 の範囲第１６項記載の方法 １８．上記血液サンプルは、更にｐｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８の効果的な量と混ぜ られる請求の範囲第１６項記載の方法１９．約０．５モル濃度のクエン酸からな るｐＨ約４．０の緩衝剤の効果的な量が入った容器内に血液を採取する工程を有 する、血液中のｔ−ＰＡ作用が安定している血液サンプル採取方法２０．上記緩 衝剤と血液サンプルの容積比は、約９〜１である請求の範囲第１９項記載の方法 ２１．上記クエン酸はクエン酸ナトリウムである請求の範囲第１９項記載の方法 発明の詳細な説明