SE447579B - Solubiliserbar, fibrinbaserad komposition och anvendning av kompositionen vid bestemning av fibrinolysparametrar - Google Patents
Solubiliserbar, fibrinbaserad komposition och anvendning av kompositionen vid bestemning av fibrinolysparametrarInfo
- Publication number
- SE447579B SE447579B SE8501614A SE8501614A SE447579B SE 447579 B SE447579 B SE 447579B SE 8501614 A SE8501614 A SE 8501614A SE 8501614 A SE8501614 A SE 8501614A SE 447579 B SE447579 B SE 447579B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- fibrin
- composition
- composition according
- peptide
- plasminogen
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 39
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 92
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 91
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 91
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 91
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 41
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 28
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 claims description 19
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 claims description 19
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 12
- DSVOSLJAGTUKFB-SPAGYVKCSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-1-(2-aminoacetyl)pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN DSVOSLJAGTUKFB-SPAGYVKCSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 7
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 7
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 7
- 108010027612 Batroxobin Proteins 0.000 claims description 6
- 229960002210 batroxobin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 3
- JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N (4s)-4-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-3-carboxy-1-[[(2s)-1-[[1-[[(2s)-1-[[(2s)-4-carboxy-1-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N 0.000 claims description 2
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 claims description 2
- 102400000525 Fibrinopeptide A Human genes 0.000 claims description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 claims description 2
- 108010053364 glycyl-prolyl-arginyl-valyl-valyl-glutamic acid Proteins 0.000 claims 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 39
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 9
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 9
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 4
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 4
- 108010054964 H-hexahydrotyrosyl-alanyl-arginine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 3
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IXNRIBJPEOUGGB-DIKMWTQISA-N (2s)-6-amino-n-[(2r)-2-aminohexanoyl]-n-[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxycyclohexyl)propanoyl]-2-(4-nitroanilino)hexanamide Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N(C(=O)[C@H](N)CCCC)C(=O)[C@H](CCCCN)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1CCC(O)CC1 IXNRIBJPEOUGGB-DIKMWTQISA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000271506 Bothrops Species 0.000 description 2
- 108010027339 H-norleucyl-hexahydrotyrosyl-lysine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- -1 desAA fibrin Chemical class 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002806 plasmin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 5-ethylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound CCSC=1N=NNN=1 GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 235000002296 Ilex sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002294 Ilex volkensiana Nutrition 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940122791 Plasmin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000246 fibrin derivative Substances 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108010017446 glycyl-prolyl-arginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N hexane-1,2,3,4,5,6-hexol Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C(O)CO FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 208000030175 lameness Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 108010087750 lysyl-plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 108010059178 topostasin Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
- G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/972—Plasminogen activators
- G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
10
15
20
25
30
35
447 579 2
Ingen av dessa metoder har dock kommit till nÄgon mera vid-
strÀckt anvÀndning, vilket bekrÀftar att de inte Àr helt till-
fredsstÀflande. De beskrivna metoderna ger sÄlunda upphov till
denaturçring av fibrinet, vilket yttrar sig i en tendens hos
fibrinet.att, sedan det à terförts till fysiologiska betingelser,
bilda fÀllning i stÀllet för gel. Vidare tÄl de beskrivna pre-
paraten av lösligt fibrin ej att frysas/tinas eller frystorkas/
rekonstitueras med bibehĂ llna egenskaper.
BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN
Enligt föreliggande uppfinning har det överraskande
visat sig, att tillsats av en lÀgmolekylÀr peptid innehÄllan-
de den speciella aminosyrasekvensen -L-prolyl-L-arginyl- till
ett speciellt fibrinderivat, nÀmligen desAA-fibrin, ger ett
helt och hÄllet solubiliserbart preparat, och detta vid sÄ lÄg
koncentration av peptiden, att möjligheter till helt nya tillÀmpningar i
samband med bestÀmning av fibrinolyskomponenter öppnas eller
att noggrannheten och reproducerbarheten för i och för sig
kÀnda tillÀmpningar drastiskt förbÀttras, sÄ att sÄdana till-
lÀmpningar ocksÄ kan komma till verklig nytta i praktiken.
Dessa resultat var ej förutsÀgbara för en fackman pÄ
omrùdet. Visserligen beskrev Laudano och Doolittle Àr 1979
i Proceedings of the National Academy of Science 75: 3085-3089
att vissa peptider, speciellt glycyl-L-prolyl-L-argĂnyl-L-prolin,
har förmÄga att kraftigt minska polymerisationshastigheten för
fibrin, men baserat pÄ detta kunde de utomordentliga resultat,
som föreliggande uppfinning har visat sig ge, omöjligen förut-
sÀgas. SÄlunda har det t.ex. visat sig att desAA-fibrin solu-
biliseras fullstÀndigt i en komposition enligt uppfinningen
vid koncentrationsnivÀer dÀr samma peptid överhuvudtaget inte
har nÄgon pÄvisbar solubiliserande inverkan pÄ desAABB-fibrin.
I detta sammanhang kan nÀmnas att desAA-fibrin skiljer sig
frÄn "normalt" desAABB-fibrin dÀrigenom att endast det ena
paret fibrinopeptider (A-peptiderna) har avspjÀlkats. DesAA-
fibrin gÄr vanligen under benÀmningen fibrin I, medan desAABB-
fibrin benÀmnes fibrin Il, vilka benÀmningar för enkelhets
skull ocksÄ kommer att anvÀndas nedan.
UI
10
15
20
25
30
35
447 579
3
En annan vÀsentlig skillnad som har konstaterats mellan
fibrin I och fibrin II Àr att de i nÀrvaro av samma peptid
skiljer sig vÀsentligen frÄn varandra vad gÀller förmÄgan att
stimulera vÀvnadsaktivatorn vid aktivering av plasminogen. SÄ-
lunda har*en komposition enligt uppfinningen innehÄllande
fibrin I visat sig vara cirka 50 % effektivare Àn motsvarande
komposition innehÄllande fibrin II.
Dessa och andra egenskaper kommer att belysas mera nedan
i samband med definitionen av uppfinningen och i samband med
de konkreta utföringsexemplen.
Föreliggande uppfinning avser nÀrmare bestÀmt en solubi-
liserbar, fibrinbaserad komposition, vilken utmÀrkes av att
fibrinet Àr desAA-fibrin eller desAA-fibrin frÄn vilket de
C-terminala delarna av a-kedjorna har avlÀgsnats genom enzy-
matisk digestion, och att den innefattar en solubiliserande
mÀngd av peptiden glycyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolin.
Det i kompositionerna enligt uppfinningen anvÀnda desAA-
-fibrinet framstÀlles lÀmpligen genom selektivt avlÀgsnande av
enbart fibrinopeptid A frÄn fibrinogen medelst enzymer, t.ex.
batroxobin utvunnet ur gift frÄn ormar av slÀktet Bothrops.
Den solubiliserande mÀngden av den lÄgmolekylÀra peptiden
kan naturligtvis bestÀmmas av fackmannen pÄ omrÄdet frÄn fall
till fall med hjÀlp av rutinförsök. Vanligtvis gÀller dock att
den lĂ€gsta halten för praktisk anvĂ€ndning av kompositĂonen bör
vara cirka 0,4 mg per ml bruksfÀrdig komposition eller bruks-
fÀrdigt preparat. Den övre grÀnsen Àr svÄrare att generalisera
och pÄverkas av olika faktorer, sÄsom ekonomiska hÀnsynstagan-
den och avsedd anvÀndning av kompositionen. Ekonomin kan sÄ-
lunda komma att avgöra lÀmplig övre grÀns, dÄ man av kostnads-
skÀl givetvis inte anvÀnder högre koncentration Àn vad som Àr
erforderligt för avsett syfte. Vid tillÀmpningen som stimula-
tor vid bestÀmning av vÀvnadsaktivatorn finns dock en övre
grÀns för anvÀndbar slutkoncentration av peptid. Denna Àr
cirka 10 mg/ml och motiveras av att aktiveringsreaktionen hÀm-
mas vid peptidkoncentrationer överstigande cirka 0,03 mg/ml
och av att minst en trehundradelsvolym fibrinpreparat mÄste
tillsÀttas vid reaktionens start (0,033 x 300 = 10). Generellt
sett gÀller dÀrför att ett lÀmpligt intervall Àr 0,4 - 10 mg/ml
bruksfÀrdigt preparat, varvid ett speciellt intressant inter-
10
15
25
'30
35
447 579
4
vall kan vara 0,6 - 4 mg per ml. Optimalt resultat kan i mÄnga
fall uppnÄs vid en koncentration av cirka 2 mg/ml.
Kompssitionen enligt uppfinningen innefattande fibrĂn I
solubilisprat med den angivna peptiden föreligger lÀmpligen i
fysiologisk buffert, vilket exempelvis innebÀr att den utan
olÀgenhet kan införas i cirkulationssystemet, t.ex. medelst
intravenös injektion.
FramstÀllningen av kompositionen enligt uppfinningen Àr
ej förknippad med nÄgra speciella problem utan kan lÀmpligen
ske genom att fibrinogenet först digereras med enzym och att
den resulterande fibringelen upplöses genom tillsats av peptid.
Vid behov kan enzymet dÀrefter avlÀgsnas t.ex. med matris-
bundna antikroppar mot detsamma.
SÄsom omtalades ovan hÀnför sig uppfinningen Àven till
vissa speciella anvÀndningar av kompositionen, vilka har möj-
liggjorts eller vÀsentligt förbÀttrats i förhÄllande till kÀnd
teknik genom de utomordentliga egenskaper hos det lösliga fi-
brinpreparat som uppfinningen resulterar i. Dessa anvÀndningar
kan hÀnföras till bestÀmning av viktiga fibrinolysparametrar,
varvid som bakgrund gÀller följande.
FibrĂnavsĂ€ttningar i cirkulationssystemet nedbrytes
till lösliga komponenter av serinproteaset plasmin. Detta
enzym bildas av plasmaproteinet plasminogen genom inverkan av
plasminogenaktivatorer. De kÀnda plasminogenaktivatorerna Àr
serinproteaser, vilka spaltar en Arg-Val-peptidbindning i
plasminogenmolekylen till bildning av det aktiva tvÄkedje-
enzymet plasmin.
Plasmin uppvisar viss substratspecificitet och spjÀlkar
företrÀdesvis peptidbindningar i fibrinmatrisen och i fibrin-
prekursorn fibrinogen. Denna specificitet Àr lÄngt ifrÄn abso-
lut, och plasminkÀnsliga bindningar finns i de flesta protei-
nerna (mÄnga av de otaliga trypsinkÀnsliga bindningarna spjÀlkas
ocksÄ av plasmin). Plasmin bildat under fibrinolys kan dÀrför
skada plasmaproteiner och cellytproteiner. För att undvika
detta har organismen utvecklat mekanismer som lokaliserar
genereringen av plasmin och begrÀnsar dess verkan. TvÄ sÄdana
mekanismer Àr allmÀnt erkÀnda, nÀmligen:
10
15
20
25
30
447 579
1. VĂ€vnadsplasminogenaktivatorn (t-PA), en viktig plasminogen-
aktivator i blodet, Àr effektiv enbart i nÀrvaro av fibrin.
I frÄñvaro av fibrin Àr hastigheten för t-PA-katalyserad
plasminogenaktivering lĂ„g, men i nĂ€rvaro av fĂbrin ökar
reaktionshastigheten upp till 1000 gÄnger. Plasmingenere-
ringen Àr sÄlunda lokaliserad till fibrin, somdÀndd nedbrytes.
NÀr fibrinet vÀl har nedbrutits, ÄtergÄr hastigheten för
plasmingenereringen till lÄga vÀrden.
2. Genererat plasmin som ej Àr involverat i fibrinnedbrytningen
inhiberas snabbt av plasmĂninhibitorn n2-antiplasmin. Effek-
ten av genererat plasmin Àr sÄlunda begrÀnsad till nÀrheten
av koagulatet.
' Normalt har fibrinkoagulat en anvÀndbar funktion, och de
bör dÀrför ej utsÀttas för alltför tidig lysis. Naturen har av
denna anledning utvecklat mekanismer som gör att detta undvikes,
och dessa mekanismer börjar f.n. bli mera förstÄeliga. Den nu upp-
tĂ€ckta snabbverkande Ănhibitdrn gentemot plasminogenaktivatorer kan
utgöra basen för en sÄdan mekanism. FörÀndringar,under fibrino-
lys,av fibrinets stimulatoriska egenskaper kan utgöra en annan.
Föreliggande uppfinning hÀnför sig till vissa anvÀnd-
ningar, vilka har samband med ovanstÄende. En första anvÀndning
av kompositionen innebÀr nÀrmare bestÀmt att denna utnyttjas i
samband med pÄvisning eller kvantifiering av aktiviteten av en-
zymet vÀvnads-plasminogenaktivator (t-PA), varvid fibrinet
potentierar enzymets aktivitet gentemot det fysiologiska sub-
stratet plasminogen eller nÄgot syntetiskt substrat.
Metoden i sig, dvs. analys med avseende pÄ vÀvnads-
plasminogenaktivatorn, finns tidigare beskriven av RĂ nby et al
i Thrombosis Research (1982) 27: 743-749. Enligt uppfinningen
har det dock visat sig, att fibrinkombositionen enligt uppfin-
ningen Àr avsevÀrt mera effektiv Àn den komposition som beskrivs
i publikationen vad gÀller förmÄgan att stimulera vÀvnads-
10
15
20
25
30
35
447 579 g
aktivatorn vid aktivering av plasminogen. Vidare gÀller att
vid utspÀdning av fibrin I solubiliserat med ifrÄgavarande pep-
tid fibringel bildas lÄngsammare Àn vid utspÀdning av fibrin I
solubiliserat med karbamid. Detta Àr av avsevÀrd praktisk be-
tydelse dÀr solubiliserat fibrin I anvÀndes som "stimulator"
vid bestÀmning av t-PA enligt ovannÀmnda metod. Effekterna av
kompositiönen enligt uppfinningen i dessa sammanhang kommer
att belysas mera nedan.
En alternativ anvÀndning enligt uppfinningen av komposi-
tionen innebÀr att den utnyttjas för att pÄvisa spùrmÀngder
fibrin lösta i biologiska vÀtskor, t.ex. blodplasma, varvid kom-
positionen anvÀndes som standard. Denna anvÀndning möjliggöres
av bl.a. den gynnsamma gelbildningskinetik som uppvisas av
fibrinkompositionen enligt uppfinningen, och kompositionen upp-
finningen torde dÀrmed bli av stor praktisk betydelse. Halten
fibrin i blod eller i blodplasma förvÀntas nÀmligen bli en viktig
diagnostisk parameter för bl.a. tillstÄndet DIC (disseminerad
intravasal koagulation).
En andra alternativ anvÀndning enligt uppfinningen inne-
bÀr anvÀndning av kompositionen för att mÀta eller studera
fibrinolytisk aktivitet in vitro eller in vivo genom tillsats
av kompositionen och registrering av det dÀri ingÄende fibrinets
nedbrytning. I samband med denna anvÀndning bör framhÄllas det
unika att fibrinkompositionen enligt uppfinningen troligen Àr
atoxisk och föreligger i fysiologisk buffert, sÄ att komposi-
tionen utan olÀgenhet kan införas i cirkulationssystemet, t.ex.
medelst intravenös injektion. Fibrinet kommer, bl.a. pÄ grund
av sin gelbildningskinetik, att fördela sig i hela cirkulations-
systemet, dÀr det troligen ingÄr i komplex med fibrinogen. PÄ
grund av fibrinolytisk aktivitet i blodet och kÀrlbÀdden kommer
detta fibrin att brytas ned och försvinna ur cirkulation. Has-
tigheten varmed detta sker Àr ett mÄtt pÄ organismens totala
fibrinolytiska kapacitet. Denna parameter, som Àven kan mÀtas
in vitro, kan komma att fÄ stor diagnostisk betydelse, varvid
kompositionen enligt uppfinningen torde vara ett synnerligen
vÀrdefullt instrument vid en sÄdan diagnos. Kompositionen enligt
uppfinningen Àr exempelvis ett synnerligen lÀmpligt lösligt
fibrinpreparat för bruk in vivo, dÄ det föreligger i fysiologisk
10
15
20
25
30
35
447 579
7
buffertmiljö och peptiden troligen Àr oförarglig för organismen.
För att underlÀtta analysen kan fibrinet mÀrkas, t.ex. med ra-
dioaktiv jod eller biotin.
BXEMPEL '
Uppfinningen kommer nu att belysas ytterligare genom nÄgra
konkreta exempel, vilka enbart ges i illustrerande men ej be-
grÀnsande syfte.
I exemplen anvÀnds höggradigt renade preparationer av
proteiner samt nÄgra mindre vanliga kemikalier. Nedan följer en
beskrivning av dessa och var de kan erhÄllas. Komposition av
anvÀnda buffertar Àr ocksÄ angivna.
Glu-plasminogen frÄn humanplasma; frystorkat preparat
frĂ„n BioPool, UMEĂ
, som enligt specifikation innehÄller mindre
Àn 1% Lys-plasminogen, mindre Àn 10 ppm plasmin och mindre Àn
0,000l IU t-PA/mg. Vid anvÀndning rekonstituerades preparatet
i steril PBS (se nedan), till en slutlig koncentration av
5 mg/ml samt centrifugerades 2 min vid 110 000 x g. Rekonsti-
tuerat material förvarades vid +4°C dock högst i 48 timmar.
VĂ€vnads-plasmĂnogenaktivator, (t-PA), i dess en-kedjiga
form frÄn humana melanomceller; frystorkat preparat utan bÀrar-
substans frĂ„n BioPool AB, UMEĂ
. Enligt tillverkaren; specifik
aktivitet 500 000 IU/mg, mer Àn 95% aktivt, innehÄllande mindre
Ă€n 2% tvĂą-kedjĂg t-PA och mindre Ă€n 1% icke t-PA protein.
Preparatet rekonstituerades i 1 M KHC03 till en koncentration
av S0 000 IU/ml och förvarades vid +4°C högst 48 timmar. Ytter-
ligare spÀdning utfördes med Tris/Tween buffert, (se nedan). Som
referens för t-PA aktivitet har anvÀnts WHO first international
standard lot 83/S17 frÄn NIBSAC, Holly Hill, LONDON.
Fibrinogen frÄn humanplasma; frystorkat preparat frÄn
Imco Corporation Ltd AB, STOCKHOLM, enligt specifikation 97%
koagulerbart och fritt frÄn plasminogen. Preparatet rekonsti-
tuerades med H20 till en koncentration av 20 mg/ml och förva-
rades vid +4°C, dock högst i 4 timmar.
Batroxobin ur ormgiftet frÄn Bothrops atrox maranhao;
frystorkat preparat frÄn Pentapharm AG, BASEL (Schweiz). Enligt
specifikation minst 100 BU/mg. Preparatet rekonstituerades i
PBS till en koncentration av 20 BU/ml och förvarades i portio-
10
15
20
25
30
35
447 579 s
ner om 0,2 ml i flytande kvÀve (-196°C).
Trombin ur bovint plasma; steril lösning, Topostasin,
frÄn Hoffman-La Roche, BASEL (Schweiz).
GlZçro-Arg-Pro, (glycyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolin),
som acetaisalt frĂ„n BioPool AB, UMEĂ
. Saltet löstes i H20
till en koncentration av 100 mg/ml och förvarades vid -20°C.
Plasminsubstrat Spectrozyme PL, (H-D-norleucyl-L-hexa-
hydrotyrosyl-L-lysinyl-para-nitroanilid); frystorkat preparat
frÄn American Diagnostica Inc., Greenwich, CT, USA.
Buffertar: §§§, ("phosphate buffered saline"), med sam-
mansÀttningen 0,1 M NaCl, 0,02 M natriumfosfatbuffert pH 7,3.
Tris/Tween har sammansÀttningen 0,1 M Tris/Àttiksyra
buffert pH 8,3 (vid 37°C), innehÄllande 0,1 g/l Tween 80.
Exemgel 1
Fibrinogen S mg/ml löst i PBS portionerades i portioner
om 0,2 ml i 0 9 mm provrör av polystyren. Till dessa sattes
antingen 0,01 ml bovint trombin, 20 NIH/ml, eller 0,01 ml
batroxobin (frĂ n B A Maranhao), 20 BU/ml. HĂ€rvid bildades
i samtliga provrör ett koagel inom S minuter.
Till dessa smÄ fibrinkoagel sattes 0,02 ml glycyl-L-prolyl-
L-arginyl-prolin, (Gly-Pro-Arg-Pro), med koncentration mellan
0 och 115 mg/ml. Slutkoncentrationen av peptid i koagelvolymen
blev sÄledes mellan 0 och 10 mg/ml.
Rören skakades varsamt var 20:e minut, och efter 3 tim-
mar noterades koagelets utseende. Försöket utfördes vid rums-
temperatur, (ca 20°C]. Resultaten redovisas i nedanstÄende
tabell 1.
TABELL 1
Solubiliserbarhet för fibrin I respektive fibrin II
xÞne. »ng/mi o 0,1 0,2 0,4 0,6 1.0 2,o 4,0 'mJu
fibrin I (er- rigid lös lös svagt klar klar klar klar klar
hÄllet medelst gel gel gel grumlig lös- "lös- lös- lös- lös-
batroxobin) lösning ning ning ning ning ning
fibrin II rigid rigid rigid rigid rigid rigid rigid rĂgid lös
(erhÄllet gel gel gel gel gel gel opak opak gel
medelst gel gel
trombin)
10
15
20
25
30
35
447 579
Av ovanstÄende tabell 1 framgÄr att solubilisering av
fibrin I erhölls redan vid en koncentration av 0,4 mg/ml och
att fullstĂ€ndig solubilisering av ifrĂ„gavarande fĂbrĂŒlerhölls
vid en_pgptidkoncentratĂon av 0,6 mg/ml eller högre. DĂ€remot
kunde ingen solubilisering av fibrin II Ă„stadkommas inom det
undersökta koncentrationsomrùdet. DÀ 10 mg/ml kan utgöra övre
anvÀndbar grÀns för vissa tillÀmpningar, sÄsom antyddes ovan
och sÄsom belyses mera nedan, ser man att endast kombinationen
peptid och fibrin I Àr praktiskt anvÀndbar.
Exempel Z
FramstÀllning av peptidsolubiliserat fibrin I, (anvÀnds
à exempel 3, 4 och S). En volym 20 mg/ml fibrinogen spÀddes
med 1 volym PBS. Till detta sattes en Ă„ttimukls volym 20 BU/ml
batroxobin, (slutkoncentration 0,25 BU/ml), och inkuberades
i rumstemperatur (18°C). En lös gel bildades inom 15 minuter.
Efter 90 min solubĂliserades gelen genom tillsats av en fem-
tiondels volym 100 mg/ml Gly-Pro-Arg-Pro (slutkoncentration
i koagelvolymen2 mg/ml). Varsam skakning i 3 timmar.
Lösningen sterilfiltrerades (0,4S pm membranfilter,
portionerades i portioner om 100 pl (1 mg fibrin I, 0,2 mg
peptid). En del av dessa förvarades vid -20°C, (lot 12 A),
och en del frystorkades och förvarades under kvÀvgasatmosfÀr
via +4°c (re: 12 B).
Den t-PA stimulerande förmÄgan hos dessa preparationer
undersöktes och jÀmfördes med en tidigare frystorkad prepara-
tion (lot II B, se tabell 1). De frystorkade preparationer-
na, (lot 11 B och lot 12 B), rekonstituterades genom tillsats
av 100 ul Tris/Tween. Lot 12 B2d Àr rekonstituerat material
som förvarats vid +4°C i 2 dygn.
Tabell 2. Alivkoter om 0,5 ml av 0,05 mg/ml Glu-plasminogen,
0,5 mM Spectrozyme och 0,2 IU/ml en-kedjig t-PA lösta i
Tris/Tween dispenserades i 0 9 mm polystyren-rör. Till dessa
sattes 1, 3, S eller 7 pl solubiliserat fibrin I-derivat,
skakades omedelbart och placerades i ett 37°C vattenbad. Efter
1 h inkubation avbröts reaktionen genom tillsats av S0 pl
10% Àttiksyra och absorbansen vid 405 nm mÀttes. Absorbans-
ökningen berÀknades genom att subtrahera absorbansen i lösning
10
15
20
ZS
30
35
447 579
10'
dÀr reaktionen avbröts omedelbart efter fibrintillsats. Denna
absorbans var 0,083. I frÄnvaro av stimulator resulterade
4 timmarsiinkubation vid 37°C i en absorbansökning pÄ 0,017.
Tabell 2
Absorbansökning vid 405 nm erhÄllet med
Tillsats,mÀngd
olika preparationer solubiliserat fibrin I
fibrin I prep.
m) 10: nĂ 10: 12A io: 123 ie: 12320
1 0,635 0,621 0,512 0,562
s 0,755 0,714 0,705 0,688
s 0,800 0,781 0,116 0,750
1 0,009 0,804 0,195 0,178
Resultaten i tabell 2 visar, att lösliga fibrinkompositĂo-
ner, framstÀllda enligt uppfinningen, kan framstÀllas med re-
producerbar t-PA-stimulerande förmÄga. Vidare demonstreras att
denna i stort Àr oförÀndrad av frystorkning med Ätföljande re-
konstituering.
Slutligen visas att rekonstituerade preparat har prak-
tiskt godtagbar stabilitet (48 h). Taget tillsammans visar för-
söket att lösligt fĂbrĂn, framstĂ€llt enligt uppfinningen, har
egenskaper som gör det ytterst lÀmpat för bestÀmning av t-PA-
aktivitet.
Exempel 3
För att faststÀlla i vad utstrÀckning peptiden Gly-Pro-Arg-
Pro hÀmmar fibrinstimulerad t-PA-aktivering av plasminogen,
utfördes följande försök. Alikvoter om 0,49 ml Tris/Tween,
innehÄllande 0,025 mg Glu-plasminogen, 0,25 pmol Spectrozyme
och 0,1 IU t-PA, försattes med 0,01 ml peptid, koncentrationen
S, 2,5, 1,25, 0,63, 0,32 eller 0 mg/ml.
Reaktionen startades genom tillsats av S pl lösligt
fibrin enligt uppfinningen (se exempel 2) och dÄ fibrinprepa-
rationen innehÄller 2 mg/ml av peptiden blev slutkoncentra-
tionen av peptid 0,12, 0,07, 0,045, 0,032S, 0,0263 och 0,2 mg/ml.
60 minuter vid 37°C efter fĂbrintillsatsen avbröts reaktionen
genom tillsats av 50 ul 10% Àttiksyra och absorbansen vid
10
15
20
ZS
30
35
11 * 447 579
405 nm mÀttes. 4 experiment utfördes vid varje peptidkoncen-
tration och medelvÀrde av absorbansökning samt dess standard-
avvikelse redovisas i figur 1. I frÄnvaro av fibrin var absor-
bansökning cirka 0,006 vid samtliga undersökta peptidkoncen-
trationef.
Av försöket framgÄr att en slutkoncentration av 0,033 mg/ml
peptid reĆĄulterar i en signifikant minskning av t-PA medierad
aktivering av Glu-plasminogen. Detta ger sÄlunda en övre grÀns
för anvÀndbar :lutkoncentration av peptid i preparation av lös-
ligt fibrin enligt uppfinningen. Denna Àr 10 mg/ml och motive-
ras av att aktiveringsreaktionen hÀmmas vid peptidkoncentratio-
ner överstigande 0,033 mg/ml och av att minst en trehundradels
volym fibrinpreparat mÄste tillsÀttas vid reaktionens start
(0,033 X 300 = 10).
Exempel 4
MÀtning av t-PA-aktivitet under utnyttjande av lösligt
fibrin enligt uppfinningen kan tillgÄ pÄ följande sÀtt: S00 pl
TAR (tissue plasminogen activator reagent) bestÄende av 0,05
mg/ml av Glu-plasminogen och 0,5 mM Spectrozyme PL löst i
Tris/Tween portioneras i 0 9 mm polystyrenrör. Till dessa sÀtts
50 ul prov bestÄende av WHO:s t-PA standard spÀtt i Tris/Tween
(t-PA-halter mellan 0 och 3 IU ml). Till detta sÀttes (omedel-
bar omblandning) 5 ul lösligt fibrin I, sÄ som det beskrivs i
exempel 2. Efter 60 minuter vid 37°C avbryts reaktionen med
50 pl 10% Ättiksyra. Absorbansökningen vid 405 nm bestÀms som
i exempel 2 och avsÀtts mot t-PA-halten i provet, figur 2.
För att demonstrera mÀtning av t-PA i plasmaprover sat-
tes 10 pl t-PA löst i Tris/Tween till 200 pl t-PA-fattig plasma
sÄ att slutkoncentrationen t-PA blev 0 till 20 IU/ml. För att
förstöra plasmans innehÄll av plasminhÀmmare tillsattes
200 pl IM acetatbuffert pH 3,9, Ätföljt av 15 minuters inkuba-
tion vid 37°C. Sedan tillfördes 200 ml Tris/Tween, varigenom
t-PA-halten blev 0-2,5 IU/ml. Prover om 50 pl av detta analy-
serades för t-PA-aktivitet sÄsom beskrivs ovan. Resultatet
redovisas i figur 2. n
Av figur 2 framgÄr att lösligt fibrin enligt uppfin-
ningen Àr utomordentligt anvÀndbart vid-bestÀmning av aktivitet
10
15
20
25
30
35
447 579
12
med tillÀmpning i biologiska prover. Halten hÀmmare mot t-PA
faststÀlls genom att kÀnd mÀngd t-PA tillförs provet, varefter
kvarvarande överskott t-PA bestÀms. Fibrinpreparat enligt upp-
finningeñ Àr alltsÄ mycket anvÀndbara Àven för bestÀmning av
halten t-ĂĂ-hĂ€mmare i t.ex. blod eller blodplasma.
Vid t-PA-mÀtning i exempel 2 och 3 anvÀndes lösning inne-
hÄllande 0,05 mg/ml plasmogen. Under mÀtningen aktiveras mindre
Àn 1 % av detta. Den höga halten av plasminogen motiveras
alltsÄ inte av förbrukning utan av att hög aktiveringshastig-
het, dÀrmed kÀnslighet, krÀver sÄdana halter.
Emellertid framkom under uppfinningens utvecklande att
partiellt nedbrutet fibrin (fibrin med avspjÀlkande C-terminala
delar av a-kedjorna) kan stimulera t-PA till att aktivera plas-
mĂnogen effektivt vid plasminogen-halter av 0,005 mg/ml. Lösligt
fibrin enligt uppfinningen, men dÀr C-terminala delarna av
a-kedjorna avlÀgsnats frÄn fibrinet genom enzymatisk digestion,
t.ex. med matrisbundet plasmin, skulle tillÄta t-PA-mÀtning med
betydligt lÀgre ÄtgÄng av plasminogen. Plasminogen av nödvÀn-
digt hög kvalité Àr en dyr komponent i t-PA-mÀtning, varför
möjlighet till haltreduktion Àr av stor praktisk betydelse.
Exempel 5
Fibrin kan finnas i cirkulerande blod, dÀr det troligen
föreligger i form av komplex med andra plasmaproteĂner. NĂ€rvaro
av dylikt fibrin indikerar pÄgÄende koagulationsprocesser och
kvantifiering av cirkulerande fibrin har troligen stort kli-
niskt intresse.
VÀvnadsplasminogenaktivatorns förmÄga att aktivera plas-
minogen potentieras kraftigt av fibrin sÄsom beskrivet ovan.
Om halten fibrin Àr lÄg, Àr aktiveringshastigheten direkt be-
roende av denna, sÄsom visats av RÄnby M 1982, Biochimica et
Biophysica Acta 704: 461-469. I samband med arbete pÄ förelig-
gande uppfinning uppmÀrksammades att Àven fibrin i plasma
stimulerade förmÄgan hos t-PA att aktivera plasminogen och att
detta kunde utgöra en princip, varpÄ analytiska metoder för
firbrinbestÀmning kunde byggas. Vid sÄdana metoder kommer dock
att uppstÄ behov av en standard och lösligt fibrin enligt upp-
10
15
447 579
13.
finningen demonstreras hÀr vara en bra, kanske den enda prak-
tiskt möjliga, standard för detta ÀndamÄl. _
Till 1 ml humanblodplasma sattes 10 pl lösligt fibrin
enligt uppfinningen (se exempel 2). Denna plasma (innehÄllande
0,09 mg/ml tillsatt fĂbrin) spĂ€ddes med plasma, varvid plasma-
prover innehÄllande 0,09, 0,045, 0,023, 0,011 och 0,0056
mg/ml kom att iordningstÀllas. Av dessa prover blandades 50 pl
med S00 pl, 0,05 mg/ml plasminogen, 0,5 mM Spectrozyme och
S0 IU/ml t-PA. Efter 25 minuter vid 37°C stoppades reaktionerna
genom tillsats av S0 ul 10 $ Ă€ttiksyra. AbsorbansöknĂngen vid
405 nm bestÀmdes och avsattes som funktion av koncentrationen
tillsatt fibrin, figur 3.
HÀr redovisade resultat demonstrerar att lösligt fibrin
enligt uppfinningen lÀmpar sig vÀl som standard vid analyser
syftande att bestÀmma halten fibrin i cirkulerande blod eller
blodplasma.
Claims (7)
- G-kedjorna har avlÀgsnats genom enzymatisk digestion, och att den innefattar en solubiliserande mÀngd av peptiden glycyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolin, och företrÀdesvis Àven en fysiologisk buffert.
- 2. Komposition enligt krav 1, k À n n e t e c k - n a d av att desAA-fibrinst Àr erhallet genom selektivt avlÀgsnande av fibrinopeptid A fran fibrinogen medelst ett enzym, företrÀdesvis batroxobin.
- 3. Komposition enligt nagot av de föregÄende kraven, k À n n e t e o k n a d av att peptidhalten Àr minst 0,4, företrÀdesvis 0,4 - 10, mg per ml bruksfÀrdigt preparat.
- 4. Komposition enligt krav 3, k À n n e t e o k - nia d av att peptidhalten Àr 0,6 - 4, företrÀdesvis ca 2, mg per ml bruksfÀrdigt preparat.
- 5. AnvÀndning av en komposition enligt nagot av kraven 1 - 4 i samband med pavisning eller kvantifiering av aktiviteten hos enzymet vÀvnadsplasminogenaktivator, varvid fibrinet potsntierar enzymets aktivitet gentemot det fysiologiska substratet plasminogen eller nagot syn- tetiskt substrat.
- S. AnvÀndning av en komposition enligt nagot av kraven 1 - 4 för att pavisa lösligt fibrin i biologiska vÀtskor, t.ex. blodplasma, varvid kompositionen anvÀn- des som standard.
- 7. AnvÀndning sv en komposition enligt nagot av kraven 1 - 4 för att mÀta eller studera fibrinolytisk aktivitet in vitro eller in vivo genom tillsats av kom- positionen och registrering av det dÀri ingÄende fibri- nsts nedbrytning. w
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8501614A SE447579B (sv) | 1985-04-01 | 1985-04-01 | Solubiliserbar, fibrinbaserad komposition och anvendning av kompositionen vid bestemning av fibrinolysparametrar |
US06/936,347 US4957903A (en) | 1985-04-01 | 1986-03-27 | Pharmaceutical and clinical compositions of desAA fibrin monomers and the tetrapeptide gly-pro-arg-pro |
AT86902552T ATE50002T1 (de) | 1985-04-01 | 1986-03-27 | Loesbare auf fibrin basierte zusammensetzung und deren verwendung. |
DE8686902552T DE3668643D1 (de) | 1985-04-01 | 1986-03-27 | Loesbare auf fibrin basierte zusammensetzung und deren verwendung. |
PCT/SE1986/000144 WO1986005814A1 (en) | 1985-04-01 | 1986-03-27 | A solubilizable, fibrin based composition and its use, in determinations of fibrinolysis parameters |
EP86902552A EP0216891B1 (en) | 1985-04-01 | 1986-03-27 | A solubilizable, fibrin based composition and its use |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE8501614A SE447579B (sv) | 1985-04-01 | 1985-04-01 | Solubiliserbar, fibrinbaserad komposition och anvendning av kompositionen vid bestemning av fibrinolysparametrar |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE8501614D0 SE8501614D0 (sv) | 1985-04-01 |
SE8501614L SE8501614L (sv) | 1986-10-02 |
SE447579B true SE447579B (sv) | 1986-11-24 |
Family
ID=20359734
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE8501614A SE447579B (sv) | 1985-04-01 | 1985-04-01 | Solubiliserbar, fibrinbaserad komposition och anvendning av kompositionen vid bestemning av fibrinolysparametrar |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4957903A (sv) |
EP (1) | EP0216891B1 (sv) |
DE (1) | DE3668643D1 (sv) |
SE (1) | SE447579B (sv) |
WO (1) | WO1986005814A1 (sv) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3856367T2 (de) * | 1987-07-06 | 2000-05-11 | Biopool Int Inc | Verfahren zur Messung von Gewebeplasminogenaktivator, Antithrombin-III und lösliches Fibrin |
US5102787A (en) * | 1987-07-10 | 1992-04-07 | Miho Sasamata | Method, device and kit for measurement of tissue plasminogen activator activity |
US5320945A (en) * | 1989-07-14 | 1994-06-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and reagent for the determination of antithrombin III |
AU644205B2 (en) * | 1990-08-23 | 1993-12-02 | New York Blood Center, Inc., The | Assays using a soluble fibrin-like monomer |
US5968476A (en) * | 1992-05-21 | 1999-10-19 | Diatide, Inc. | Technetium-99m labeled peptides for thrombus imaging |
ES2150945T3 (es) * | 1992-05-21 | 2000-12-16 | Diatide Inc | Peptidos marcados con tecnecio-99m para obtencion de imagenes de trombos. |
CN1091315A (zh) * | 1992-10-08 | 1994-08-31 | E·R·æŻć„ćžç¶ćć Źćž | èĄçș€ç»Žèçœć°éćç»ćç©ćć ¶äœżçšæčæł |
AU6398596A (en) * | 1995-06-30 | 1997-02-05 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Method of producing fibrin-specific antibodies using soluble fibrin polymers as an immunogen |
EP1214293A1 (en) | 1999-09-08 | 2002-06-19 | Guilford Pharmaceuticals Inc. | Non-peptidic cyclophilin binding compounds and their use |
FR2813395B1 (fr) | 2000-08-28 | 2003-01-24 | Stago Diagnostica | Methode de dosage in vitro de la fibrine soluble par generation de produits de degradation specifiques |
US6656971B2 (en) | 2001-01-25 | 2003-12-02 | Guilford Pharmaceuticals Inc. | Trisubstituted carbocyclic cyclophilin binding compounds and their use |
US6593362B2 (en) | 2001-05-21 | 2003-07-15 | Guilford Pharmaceuticals Inc. | Non-peptidic cyclophilin binding compounds and their use |
JP4716994B2 (ja) | 2004-06-24 | 2011-07-06 | æ±è±èŹćć·„æ„æ ȘćŒäŒç€Ÿ | ïŒ€ïœ ïœïŒĄăăŁăăȘăłăć«æăăæȘæ§è «çæć¶ć€ |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3966701A (en) * | 1973-11-07 | 1976-06-29 | The Dow Chemical Company | Fibrinogen peptide derivatives |
US4455290A (en) * | 1981-04-02 | 1984-06-19 | Research Corporation | Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin Fragment D1 |
-
1985
- 1985-04-01 SE SE8501614A patent/SE447579B/sv not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-03-27 WO PCT/SE1986/000144 patent/WO1986005814A1/en not_active Application Discontinuation
- 1986-03-27 US US06/936,347 patent/US4957903A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-03-27 DE DE8686902552T patent/DE3668643D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-03-27 EP EP86902552A patent/EP0216891B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SE8501614L (sv) | 1986-10-02 |
DE3668643D1 (de) | 1990-03-08 |
SE8501614D0 (sv) | 1985-04-01 |
EP0216891A1 (en) | 1987-04-08 |
WO1986005814A1 (en) | 1986-10-09 |
EP0216891B1 (en) | 1990-01-31 |
US4957903A (en) | 1990-09-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sajevic et al. | Haemostatically active proteins in snake venoms | |
Esmon | Thrombomodulin as a model of molecular mechanisms that modulate protease specificity and function at the vessel surface | |
Ambrus et al. | Plasmin-antiplasmin complex as a reservoir of fibrinolytic enzyme | |
Iatridis et al. | Active Hageman factor: A plasma lysokinase of the human fibrinolytic system | |
Esmon | Possible involvement of cytokines in diffuse intravascular coagulation and thrombosis | |
Toombs | Alfimeprase: pharmacology of a novel fibrinolytic metalloproteinase for thrombolysis | |
Sherry et al. | Comparative activity of thrombin on substituted arginine and lysine esters | |
Than et al. | Haemostatic disturbances in patients bitten by Russell's viper (Vipera russelli siamensis) in Burma | |
SE447579B (sv) | Solubiliserbar, fibrinbaserad komposition och anvendning av kompositionen vid bestemning av fibrinolysparametrar | |
Esnouf et al. | Enzymology and the blood clotting mechanism | |
Ouyang et al. | Properties of fibrinogen degradation products produced by α-and ÎČ-fibrinogenases of Trimeresurus mucrosquamatus snake venom | |
JPH0365958B2 (sv) | ||
Damus et al. | A purified procoagulant enzyme from the venom of the eastern diamondback rattlesnake (Crotalus adamanteus): In vivo and in vitro studies | |
Aasen et al. | Plasma kallikrein activity and prekallikrein levels during endotoxin shock in dogs | |
Butkowski et al. | The preparation and activation of [sialyl-3H] prothrombin | |
Colucci et al. | Influence of the fast-acting inhibitor of plasminogen activator on in vivo thrombolysis induced by tissue-type plasminogen activator in rabbits. Interference of tissue-derived components. | |
Howes et al. | Effects of three novel metalloproteinases from the venom of the West African saw-scaled viper, Echis ocellatus on blood coagulation and platelets | |
Miller-Andersson et al. | Preparation and stability of a highly purified human thrombin standard | |
Meier et al. | Snake venom protein C activators | |
US20060281147A1 (en) | Thrombin-like recombinant baxtroxobin expressed by pichia sp.and production method thereof | |
Grotto et al. | Effect of purified Vipera palestinae hemorrhagin on blood coagulation and platelet function | |
Heimburger et al. | Blood coagulation and fibrinolysis | |
Stafford | The fibrinolytic mechanism in haemostasis: a review | |
La Gamma et al. | The stability of fibrinopeptide B immunoreactivity in blood | |
Qureshi et al. | Stability studies of human fibrinopeptide A as measured by radioimmunoassay |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8501614-5 Effective date: 19911108 Format of ref document f/p: F |