JP4716994B2

JP4716994B2 - ＤｅｓＡフィブリンを含有する悪性腫瘍抑制剤

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Publication number: JP4716994B2
Application number: JP2006528841A
Authority: JP
Inventors: 博文千賀; 彩霞李; 永玲万; 立水常
Original assignee: 東菱薬品工業株式会社
Priority date: 2004-06-24
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2025-06-24
Also published as: CN1972706B; RU2006145902A; WO2006001523A1; CN1972706A; EP1762242A1; HK1105091A1; AU2005257508A1; KR20070026846A; JPWO2006001523A1; CA2566991A1; HK1100359A1; KR101032249B1; US8481047B2; EP1762242A4; RU2358754C2; US20060088519A1; US20090018062A1; EP1762242B1

Description

本発明はＤｅｓＡフィブリンを含有することを特徴とする、悪性腫瘍抑制剤に関する。

近年、悪性腫瘍治療は、外科的手術、放射線治療あるいは化学療法による原発癌の除去の成功率の向上によって、着実に進歩している。しかしながら、原発癌の除去が完全になされても癌の転移により死亡する場合が少なくない。
特に、黒色腫、肺癌、肝癌及び膵臓癌などの悪性度が高い悪性腫瘍は早期発見が難しく、悪性腫瘍と診断された時点では、既に原発癌と転移癌とが同時に存在し、手術治療を受けられないケースが非常に多い。これらの悪性腫瘍に対して、放射線治療は良好な結果を示していない。また、現在、臨床で使用されているアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）等の化学療法剤は、そのほとんどが悪性腫瘍細胞を直接攻撃して薬効を発揮するものであるが、同時に正常細胞をもターゲットとするので、副作用が強く、臨床上の問題点になっているのが現実である。したがって、ここ数十年間、画期的な新薬が生まれていない状況にある。このような状況を打開するために、新しいタイプの悪性腫瘍用医薬品が待望されている。
かかる状況の下、最近、数多くの基礎研究及び臨床研究により悪性腫瘍と凝固線溶系との密接な関係が示唆されている。例えば、悪性腫瘍患者では、血漿フィブリノーゲンの増加、血液粘度の増加及び血液レオロジーの異常等の凝固線溶系の異常により微小循環障害を引き起こすことが知られている。また、血漿フィブリノーゲンの増加又は悪性腫瘍細胞が自らフィブリノーゲンを分泌することにより、悪性腫瘍組織の細胞外マトリクスにフィブリノーゲン又はフィブリンの沈着が発生し、これが細胞外マトリクスの一員として悪性腫瘍細胞の増殖、浸潤及び転移に促進的な作用を果たしていることが報告されている（例えば、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ６０：２０３３−２０３９（２０００）、ＡｎｎＮＹＡｃａｄＳｃｉ９３６：４０６−４２５（２００１）及びＢｌｏｏｄ９６：３３０２−３３０９（２０００）を参照）。
前述の悪性腫瘍と凝固線溶系との関係に着目し、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）において悪性腫瘍細胞をフィブリンで処理すると、悪性腫瘍細胞の肺臓への実験的転移性が増強されることが確認されている（例えば、ＣｌｉｎＥｘｐＭｅｔａｓｔａｓｉｓ１７：７２３−７３０（１９９９）を参照）。フィブリン（ＤｅｓＡＢフィブリン又はフィブリンＩＩともいう）は、トロンビンがフィブリノーゲンに作用して、フィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡ（ｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅＡ、以下ＦＰＡという）及びフィブリノペプチドＢ（ｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅＢ、以下ＦＰＢという）を遊離させて得られる物質である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ２７５：５０１−５０５（１９７８）及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：４４１７−４４２６（１９９６）を参照）。
また、血中フィブリノーゲン濃度と悪性腫瘍の増殖及び転移との関係に着目し、脱フィブリノーゲン作用を有するトロンビン様酵素であるバトロキソビン（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ）やアンクロッド（Ａｎｃｒｏｄ）を投与してフィブリノーゲンを減少させ、悪性腫瘍の増殖及び転移を抑制することが報告されている（例えば、ＥｕｒＪＣａｎｃｅｒ１６：９１９−９２３（１９８０）及び日本血液学会雑誌４４：７３９−７４３（１９８１）を参照）。バトロキソビンは、Ｂｏｔｈｒｏｐｓａｔｒｏｘｍｏｏｊｅｎｉの毒液に由来するトロンビン様セリンプロテアーゼであり、フィブリノーゲンからＦＰＡのみを遊離し、ＤｅｓＡフィブリン（フィブリンＩともいう）を産生する糖蛋白酵素である（例えば、ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ３６：９−１３（１９７６）及びＴｈｒｏｍｂＤｉａｔｈＨａｅｍｏｒｒｈ４５（Ｓｕｐｐｌ）：６３−６８（１９７１）を参照）。
これらの文献に開示される技術は、悪性腫瘍細胞を攻撃する免疫系から当該細胞を保護するバリヤーとしてフィブリノーゲンが機能しているとの推定に基づいて、トロンビン様酵素によりフィブリノーゲンを減少させて、免疫系による悪性腫瘍細胞に対する攻撃を容易にし、結果として悪性腫瘍の増殖及び転移を抑制しようとするものである。
一方、悪性腫瘍細胞は伸展及び遊走することが知られている。ここで、悪性腫瘍細胞の伸展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）とは、腫瘍細胞が何らかの信号を受け、円形の腫瘍細胞が偽足を形成することであり、これは腫瘍の増殖、浸潤及び転移の基礎となる腫瘍細胞の生物学的行為である。
また、悪性腫瘍細胞の遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）とは、腫瘍細胞が何らかの信号を受け、細胞膜にある細胞接着分子とリガントとの間で結合及び解離を繰り返すことにより、腫瘍細胞が元の場所から移動することであり、これは腫瘍の浸潤と転移の基礎となる生物学的行為である。
したがって、悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走を抑制することにより、腫瘍の浸潤及び転移を抑制し、ひいては悪性腫瘍を抑制することができる。
しかしながら、かかる機序により悪性腫瘍を効果的に抑制することができる薬剤は報告されていない。
また、フィブリノーゲンの分解産物であるＤｅｓＡフィブリンと悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走との関連性についての報告例も存在していない。

したがって、本発明は、悪性腫瘍抑制剤として新規な有効成分を含有する、悪性腫瘍抑制剤を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明者等は、ＤｅｓＡフィブリンが悪性腫瘍細胞に対してフィブリンとは異なる作用を与えるのではないかと考え、悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走に及ぼすＤｅｓＡフィブリンの影響について鋭意研究を行ったところ、ＤｅｓＡフィブリンが悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走を抑制する作用を有することを見出した。本発明は、この知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、ＤｅｓＡフィブリンを含有することを特徴とする悪性腫瘍抑制剤に関するものである。

図１は、フィブリノーゲン、ＤｅｓＡフィブリン及びフィブリンの電気泳動像を示す写真である。
図２は、図１の電気泳動像を、画像分析システムを用い定量化して図示したグラフである。
図３は、ＰＢＳ（Ａ）、フィブリノーゲン（Ｂ）、バトロキソビン（Ｃ）、トロンビン（Ｄ）、ＤｅｓＡフィブリン（Ｅ）及びフィブリン（Ｆ）で処理したウエル中で培養した黒色腫細胞の顕微鏡写真である。
図４は、ＰＢＳ（Ａ）、フィブリノーゲン（Ｂ）、バトロキソビン（Ｃ）、トロンビン（Ｄ）、ＤｅｓＡフィブリン（Ｅ）及びフィブリン（Ｆ）で処理したウエル中で培養した黒色腫細胞の伸展率のグラフである。
図５は、ＰＢＳ（Ａ）、フィブリノーゲン（Ｂ）、バトロキソビン（Ｃ）、トロンビン（Ｄ）、ＤｅｓＡフィブリン（Ｅ）及びフィブリン（Ｆ）で処理したウエル中で培養した乳癌細胞の顕微鏡写真である。
図６は、ＰＢＳ（Ａ）、フィブリノーゲン（Ｂ）、バトロキソビン（Ｃ）、トロンビン（Ｄ）、ＤｅｓＡフィブリン（Ｅ）及びフィブリン（Ｆ）で処理したウエル中で培養した乳癌細胞の伸展率のグラフである。
図７は、ＰＢＳ（Ａ）、フィブリノーゲン（Ｂ）、バトロキソビン（Ｃ）、トロンビン（Ｄ）、ＤｅｓＡフィブリン（Ｅ）及びフィブリン（Ｆ）で処理したウエル中で培養した線維肉腫細胞の顕微鏡写真である。
図８は、ＰＢＳ（Ａ）、フィブリノーゲン（Ｂ）、バトロキソビン（Ｃ）、トロンビン（Ｄ）、ＤｅｓＡフィブリン（Ｅ）及びフィブリン（Ｆ）で処理したウエル中で培養した線維肉腫細胞の伸展率のグラフである。
図９は、黒色腫細胞の伸展に対するＤｅｓＡフィブリン量の影響を示すグラフである。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の悪性腫瘍抑制剤は、ＤｅｓＡフィブリンを有効成分として含有することを特徴とする。
ＤｅｓＡフィブリンは、フィブリノーゲンからＦＰＡを遊離させて得られる物質である。
フィブリノーゲンは、３種のＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖がＳ−Ｓ結合で結合してなるサブユニット（ＡαＢβγ）の２つが、更にＳ−Ｓ結合により結合してなる２量体糖蛋白（ＡαＢβγ）_２である。Ａα鎖は６１０個のアミノ酸（６８ｋＤａ）、Ｂβ鎖は４６１個のアミノ酸（５４ｋＤａ）、γ鎖は４１１個のアミノ酸（４８ｋＤａ）からなるので、フィブリノーゲンの分子量は３４０ｋＤａである（ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ８３：１−７５（１９９６）及びＢｌｏｏｄＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，ＦｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓａｎｄＫｉｎｉｎ，ＡｏｋｉＡａｎｄＩｗａｎａｇａＳ（Ｅｄｓ）ＣｈｕｇａｉＩｇａｋｕＣｏ．，Ｔｏｋｙｏ，１９７９，ｐ５９−７１を参照）。また、Ｂβ鎖とγ鎖には糖が結合しているが、Ａα鎖にはないことが知られている（ＩｎｔＪＢｉｏｃｈｅｍ＆ＣｅｌｌＢｉｏｌ３１：７４１−７４６（１９９９）を参照）。
ＦＰＡは、フィブリノーゲンのＡα鎖のＮＨ_２末端から１６個のアミノ酸（ＮＨ_２−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ）（配列番号１）に該当するペプチドである。
したがって、ＤｅｓＡフィブリンは、フィブリノーゲンからＦＰＡを遊離して得られる残部［（αＢβγ）_２］である（ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ３６：９−１３（１９７６）及びＴｈｒｏｍｂＤｉａｔｈＨａｅｍｏｒｒｈ４５（Ｓｕｐｐｌ）：６３−６８（１９７１）を参照）。ＦＰＡの分子量は１，５３６Ｄａであるので、ＤｅｓＡフィブリンの分子量は約３３７ｋＤａと計算できる。
フィブリノーゲンからのＦＰＡの遊離は、トロンビン様酵素を用いて行うことができる。トロンビン様酵素は、セリンプロテアーゼの一種である。一般的には、蛇毒由来のものが多い。具体例としては、Ｂｏｔｈｒｏｐｓａｔｒｏｘｍｏｏｊｅｎｉの毒液から抽出・精製したバトロキソビン（東菱薬品工業株式会社及びその子会社であるＢｅｉｊｉｎｇＴｏｂｉｓｈｉＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ製）、アンクロッド及びその他の蛇毒由来のトロンビン様酵素（例えばＣｒｏｔａｌａｓｅ）等が挙げられる。これらのトロンビン様酵素は、天然物であってもよく、遺伝子組み換え製品であってもよい。
フィブリノーゲン及びトロンビン様酵素を用いたＤｅｓＡフィブリンの製造は、例えば下記（１）〜（６）の方法により行うことができる。
（１）プラスチック培養器具、ガラス培養器具、スライドガラス、ステンレス又は合成固形物質であるＥＰＴＦＥ人工血管等の表面にフィブリノーゲンを付着させ、そこへトロンビン様酵素を添加してＤｅｓＡフィブリンを製造する方法；
（２）前記の固形物質へフィブリノーゲン及びトロンビン様酵素を同時に添加してＤｅｓＡフィブリンを製造する方法；
（３）液体反応系において０．１〜１５Ｎの尿素及び／又は抗凝集ペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ａｍｉｄｅ，ＧＰＲＰ−ＮＨ_２（配列番号２））の存在下で、フィブリノーゲンとトロンビン様酵素とを反応させ、ＤｅｓＡフィブリン同士の凝集を防止しつつ作成する方法（ＣｌｉｎＥｘｐＭｅｔａｓｔａｓｉｓ１７：７２３−７３０（１９９９）を参照）；
（４）カラムにフィブリノーゲンを結合し、トロンビン様酵素を含む溶液を流してＤｅｓＡフィブリンを製造する方法；
（５）トロンビン様酵素をカラムに結合し、フィブリノーゲンを含む溶液を流してＤｅｓＡフィブリンを製造する方法；
（６）トロンビン様酵素を静脈、腹腔内、皮下及び筋肉注射等により投与し、体内のフィブリノーゲンに作用させてインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）でＤｅｓＡフィブリンを製造する方法（ＡｃｔａＨａｅｍａｔｏｌＪｐｎ４４：７０６−７１１（１９８１）を参照）。
本発明のＤｅｓＡフィブリンの製造に用いるフィブリノーゲン及びトロンビン様酵素はそれ自体公知物質であり、市場において容易に入手可能であるか、又は、調製可能である。ＤｅｓＡフィブリンもそれ自体公知物質であり、上記の方法により調製可能である。
本発明の悪性腫瘍抑制剤の対象となるのは悪性腫瘍である。悪性腫瘍は発生母組織により上皮性の悪性腫瘍と非上皮性の悪性腫瘍とに大別することができる。上皮性の腫瘍は腫瘍全体の約９割を占めていると言われている。非上皮性の悪性腫瘍は更に、間葉系組織由来の悪性腫瘍、神経組織由来の悪性腫瘍及び未分化細胞の悪性腫瘍とに分類することができる。以下に、各悪性腫瘍の具体例を例示する。
上皮性の悪性腫瘍
腺癌（腺上皮由来の癌腫であり、胃、腸、膵、気管、肺、乳腺、卵巣、子宮体、前立腺など、体の各所に発生するもので、ヒトの癌の７０〜８０％を占めると推測される）、扁平上皮癌（重層扁平上皮由来、例えば表皮、口唇、舌、咽頭、食道、肛門、外陰、子宮頚部などの上皮組織に発生する癌、非小細胞肺癌に分類される肺扁平上皮癌）、基底細胞癌（皮膚及び付属器の基底細胞由来）、移行上皮癌（移行上皮由来、例えば膀胱癌）、肝細胞癌（肝実質細胞由来）、腎細胞癌（腎上皮由来）、胆管癌（胆管由来）、絨毛癌（胎盤上皮由来）
非上皮性の悪性腫瘍
間葉系組織由来の悪性腫瘍
線維肉腫（結合組織及び線維組織由来）、脂肪肉腫（結合組織及び脂肪組織由来）、軟骨肉腫（結合組織及び軟骨組織由来）、骨肉腫（結合組織及び骨組織由来）、血管肉腫（血管由来）、リンパ管肉腫（リンパ管由来）、骨髄性白血病（造血細胞由来）、単球性白血病（造血細胞由来）、悪性リンパ腫（リンパ組織由来）、リンパ性白血病（リンパ組織由来）、形質細胞種（多発性骨髄腫）（リンパ組織由来）、ホジキン細胞（リンパ組織由来）、平滑筋肉腫（平滑筋由来）、横紋筋肉腫（横紋筋由来）
神経組織由来の悪性腫瘍
神経芽腫（神経芽由来）、髄芽細胞腫（髄芽細胞由来）、悪性星状膠細胞腫（星状膠細胞由来）、網膜芽腫（網膜芽細胞由来）、膠芽細胞腫（膠芽細胞由来）、悪性神経鞘腫（シュワン細胞由来）、黒色腫（神経外胚葉由来）
未分化細胞の悪性腫瘍
悪性奇形腫（全能細胞由来）、腎芽腫（腎芽細胞由来）、肝芽腫（肝芽細胞由来）、混合腫瘍（複数種の細胞由来）
本発明の悪性腫瘍抑制剤は、これらの悪性腫瘍の中で、上皮性の悪性腫瘍、並びに、非上皮性の悪性腫瘍である神経組織由来の悪性腫瘍及び間葉系組織由来の悪性腫瘍、特に黒色腫、乳癌又は線維肉腫に対して優れた効果を発揮することができる。
本発明の悪性腫瘍抑制剤は、悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走を抑制することにより、腫瘍の浸潤及び転移を抑制し、ひいては悪性腫瘍を抑制することができる。
ここで、悪性腫瘍細胞の伸展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）とは、腫瘍細胞が何らかの信号を受け、円形の腫瘍細胞が偽足を形成することであり、これは腫瘍細胞の増殖、浸潤及び転移の基礎となる腫瘍細胞の生物学的行為である。
また、悪性腫瘍細胞の遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）とは、腫瘍細胞が何らかの信号を受け、細胞膜にある細胞接着分子とリガントとの間で結合及び解離を繰り返すことにより、腫瘍細胞が元の場所から移動することであり、これは腫瘍の浸潤と転移の基礎となる生物学的行為である。
本発明の悪性腫瘍抑制剤は、ＤｅｓＡフィブリン単体からなるものであってもよく、その他の活性物質と組み合わせたものであってもよい。
その他の活性物質としては、フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）のような代謝拮抗剤、アドリアマイシンのような抗腫瘍抗生物質製剤、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）のようなアルキル化剤、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）のような植物由来の制癌剤等が挙げられる。
本発明の悪性腫瘍抑制剤の剤型としては、日局製剤総則にある剤型を適用でき、例えば直接体内に適用する注射剤（懸濁剤、乳剤を含む）；軟膏剤（油脂性軟膏、乳剤性軟膏（クリーム）、水溶性軟膏等を含む）、吸入剤、液剤（点眼剤、点鼻剤等を含む）、坐剤、貼付剤、パップ剤、ローション剤等の外用剤；又は、錠剤（糖衣、フィルム、膠衣を含む）、液剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤（細粒を含む）、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等の内用剤等が挙げられる。これらの製剤は、日局製剤総則等に記載された方法で製剤化することができる。
また、本発明の悪性腫瘍抑制剤は、剤型に応じて医薬的に許容しうる固体状若しくは液体状の担体又は介入治療基材を含んでいてもよい。医薬的に許容しうる固体状若しくは液体状の担体としては、溶剤、安定化剤、保存剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、緩衝剤、等張化剤、着色剤、基剤、増粘剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、矯味剤等が挙げられる。
具体例としては、水及び、乳糖、白糖、果糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトールなどの糖・糖アルコール類、結晶セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース及びその関連誘導体、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、シクロデキストリン、プルランなどのデンプン及びその関連誘導体、カンテン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、セラック、トラガント、キサンタンガムなどの天然高分子（海草類、植物粘質物、タンパク質など）、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタアクリレートコポリマー、メタアクリル酸コポリマー、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ジメチルポリシロキサンなどの合成高分子、オリーブ油、カカオ脂、カルナウバロウ、牛脂、硬化油、ダイズ油、ゴマ油、ツバキ油、パラフィン、流動パラフィン、ミツロウ、白色ワセリン、ヤシ油、マイクロクリスタリンワックスなどの油脂類、ステアリン酸、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、クエン酸トリエチル、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ハードファット、ミリスチン酸イソプロピルなどの脂肪酸及びその誘導体、グリセリン、ステアリルアルコール、セタノール、プロピレングリコール、マクロゴールなどのアルコール及び多価アルコール、酸化亜鉛リン酸水素カルシウム、沈降炭酸カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、無水ケイ酸、カオリン、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ヒドロタルサイト、酸化チタン、タルク、ベントナイト、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、硫酸アルミニウムカリウム、次没食子酸ビスマス、次サリチル酸ビスマス、乳酸カルシウム、重炭酸ナトリウムなどの無機性物質及び金属塩化合物、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴールなどの界面活性物質、色素、香料等が挙げられる。
介入治療基材としてはステント、人工血管等が挙げられる。
本発明の悪性腫瘍抑制剤中のＤｅｓＡフィブリンの含有量は、採用する剤型に依存して変化するが、例えば、内用剤の場合は１ｇあたり０．０１〜９００ｍｇであり、注射剤の場合は１ｍｌあたり０．０１〜５００ｍｇであり、外用剤の場合は１ｇあたり０．０１〜５００ｍｇである。
本発明の悪性腫瘍抑制剤の投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変化するが、成人に使用する場合、１日あたりのＤｅｓＡフィブリン量で０．１〜５０００ｍｇ、より好ましくは１００〜２５００ｍｇである。
以下に実施例を示して具体的に説明するが、本発明は実施例により限定されるものではない。

ＤｅｓＡフィブリンの調製及び確認
トロンビン様酵素を用いてフィブリノーゲンからＦＰＡを遊離してＤｅｓＡフィブリンを調製した。更に、ＤｅｓＡフィブリンの生成を確認するためにフィブリノーゲン及びフィブリンとの対比を行った。
（１）ＤｅｓＡフィブリンの調製
フィブリノーゲンの最終濃度が３．０ｍｇ／ｍｌ、バトロキソビンの最終濃度が０．５ＢＵ／ｍｌになるように、ヒトフィブリノーゲン（Ｆ−４８８３，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）溶液にトロンビン様酵素であるバトロキソビン（Ｔｏｂａｒｐｉｎ（登録商標），ＢｅｉｊｉｎｇＴｏｂｉｓｈｉＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ製）を加えた後、３７℃で１時間インキュベートして、ＤｅｓＡフィブリンを調製した。
（２）フィブリンの調製
フィブリノーゲンの最終濃度が３．０ｍｇ／ｍｌ、トロンビンの最終濃度が０．５Ｕ／ｍｌになるように、ヒトフィブリノーゲン（Ｆ−４８８３，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）のＰＢＳ溶液にトロンビン（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）のＰＢＳ溶液を加えた後、３７℃で１時間インキュベートして、フィブリンを作製した。
（３）フィブリノーゲンの調製
無処理対照として、ヒトフィブリノーゲン（Ｆ−４８８３，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて最終濃度が３．０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンのＰＢＳ溶液を調製した。
（４）ＤｅｓＡフィブリン生成の確認
上記（１）の工程によりＤｅｓＡフィブリンが生成したことを電気泳動により確認した。具体的には、下記の処理によりフィブリノーゲンが３種のＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖に還元されることを基準として、ＤｅｓＡフィブリンを３種のα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖に、フィブリンを３種のα鎖、β鎖及びγ鎖に還元した後に電気泳動に付して評価した。
工程（１）で得られたＤｅｓＡフィブリン及び工程（２）で得られたフィブリンを無菌生理食塩水で３回洗浄した後、２％ＳＤＳ−２％ βメルカプトエタノール−５Ｍ尿素液０．５ｍｌにて、５〜６分煮沸して、Ｓ−Ｓ結合を解除し、溶解した。
工程（３）で得られたフィブリノーゲンでは、上記の洗浄工程を省略し、その後は前記と同じ操作にてＳ−Ｓ結合を解除し、加熱溶解した。
得られたサンプルの各溶液１５０μｌに、５０μｌの電気泳動緩衝液（４Ｘ２％ＳＤＳ−０．１％ブロムクレゾールブルー）を加え、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＰＡＧＥＬ（登録商標），ＡｔｔｏＣｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）電気泳動を行った。
結果を電気泳動図として図１に示す。図１において、Ｌａｎｅ１及び４はフィブリノーゲン、Ｌａｎｅ２はＤｅｓＡフィブリン、Ｌａｎｅ３はフィブリンを示す。
各Ｌａｎｅにおいて、一番下のバンドはγ鎖、下から２番目のバンドはＢβ鎖、下から３番目のバンドはＡα鎖を示す。
ここで、Ｌａｎｅ１及びＬａｎｅ４（フィブリノーゲン）を基準として、Ｌａｎｅ２（ＤｅｓＡフィブリン）を評価すると、Ｌａｎｅ２の下から３番目のバンド（Ａα鎖）の位置が下方（低分子量側）にシフトした。これは、トロンビン様酵素であるバトロキソビンの作用によりフィブリノーゲンのＡα鎖からＦＰＡが遊離したことを示している。一方、その他のバンドの位置はフィブリノーゲンと一致していた。以上より、工程（１）によりフィブリノーゲンからＦＰＡが遊離してＤｅｓＡフィブリンが生成したことが理解される。
また、Ｌａｎｅ１及びＬａｎｅ４（フィブリノーゲン）を基準として、Ｌａｎｅ３（フィブリン）を評価すると、Ｌａｎｅ３の下から２番目のバンド（Ｂβ鎖）及び３番目のバンド（Ａα鎖）の位置が共に下方（低分子量側）にシフトした。これは、トロンビンの作用によりフィブリノーゲンのＡα鎖及びＢβ鎖からそれぞれＦＰＡ及びＦＰＢが遊離したことを示している。以上より、工程（２）では、フィブリンが生成したことが理解される。
尚、これらの結果は、既知のデータと一致していた（ＡｃｔａＨａｅｍａｔｏｌＪｐｎ４４：７０６−７１１（１９８１）を参照）。
更に、前記の電気泳動像を、画像分析システム（ＦｕｒｉＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を用いて定量化し、グラフとして表した（図２）。
図２中の３つのピークにおいて、左側のピークはＡα鎖のバンド密度を、中央のピークはＢβ鎖のバンド密度を、右側のピークはγ鎖のバンド密度を示す。
左側のピーク（Ａα鎖）を評価すると、ＤｅｓＡフィブリンとフィブリンのピークは一致し、かつ、フィブリノーゲンのピークよりも低分子量側にシフトした。これは、ＤｅｓＡフィブリン及びフィブリンでは、フィブリノーゲンのＡα鎖からＦＰＡが遊離していることを示している。
中間のピーク（Ｂβ鎖）を評価すると、フィブリノーゲンとＤｅｓＡフィブリンのピークは一致しているが、フィブリンのピークのみが低分子量側にシフトした。これは、フィブリンにおいてのみフィブリノーゲンのＢβ鎖からＦＰＢが遊離したことを示している。
以上より、バトロキソビンがフィブリノーゲン（（ＡαＢβγ）_２）に作用して生成した物質は、ＤｅｓＡフィブリン（（αＢβγ）_２）であり、トロンビンがフィブリノーゲンに作用して生成した物質はフィブリン（（αβγ）_２）であることが確認された。

ＤｅｓＡフィブリンの悪性腫瘍細胞の伸展に対する影響
マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標），ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて擬似的な体内の細胞外マトリクス環境を作製し、かかる環境下での悪性腫瘍細胞の伸展に対するＤｅｓＡフィブリンの影響を、３種類の悪性腫瘍（黒色腫、乳癌及び線維肉腫）細胞を用いて評価した。
（１）使用した悪性腫瘍細胞
黒色腫細胞としてのＢ１６−ＢＬ６マウス悪性黒色腫細胞（ＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ，ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で継代培養して、本実験に供した。
乳癌細胞としてのＭＭＴ０６０５６２マウス乳癌細胞（ＡＴＣＣ，ＶＡ，ＵＳＡ）は、１０％ＦＢＳ及び１％非必須アミノ酸溶液（Ｎｏｎ−ＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＳｏｌｕｔｉｏｎ，Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ））を含有するＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で継代培養して、本実験に供した。
線維肉腫細胞としてのＨＴ−１０８０ヒト線維肉腫細胞（ＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）は、１０％ＦＢＳを含有するＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で継代培養して、本実験に供した。
（２）細胞伸展の測定法
８穴スライド・チャンバー（Ｎｕｎｃ，ＩＬ，ＵＳＡ）の各ウエルに０．２５ｍｌのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）７．５μｇ／ｍｌ，ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を添加し、室温下で１時間インキュベートしてマトリゲルをスライドにコーティングした。次いで、マトリゲルをコーティングしたウエルへ下記のＡ〜Ｆの溶液（各０．２５ｍｌ）を添加して処理を施した。
Ａ：リン酸緩衝液（ＰＢＳ）の添加（溶媒対照）
Ｂ：フィブリノーゲン（３ｍｇ／ｍｌ）の添加
Ｃ：バトロキソビン（０．５ＢＵ／ｍｌ）の添加
Ｄ：トロンビン（０．５Ｕ／ｍｌ）の添加
Ｅ：ＤｅｓＡフィブリン（３ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン及び０．５ＢＵ／ｍｌバトロキソビン）の添加
Ｆ：フィブリン（３ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン及び０．５Ｕ／ｍｌトロンビン）の添加
以上の処理に用いた溶媒はすべてＰＢＳであった。
（ここで、ＢＵ（バトロキソビン単位）とはバトロキソビンの酵素活性量を示す単位をいい、３７℃で、標準ヒトクエン酸加血漿０．３ｍｌに、バトロキソビン溶液０．１ｍｌを加えるとき、１９．０±０．２秒で凝固する活性量を２ＢＵとするものである。）
Ａ〜Ｄの処理では、示した各成分を示された最終濃度でウエルへ添加し、室温下で１時間インキュベートし、その後液体を捨て、ＰＢＳで洗浄した。
Ｅ〜Ｆの処理では、示した各成分を示された最終濃度でウエルへ添加し、６０秒間反応させ、生成物（処理Ｅ：ＤｅｓＡフィブリン、処理Ｆ：フィブリン）の凝固が起こらないうちに液体を捨てた。その後、室温下で１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。Ｅの処理ではバトロキソビンをフィブリノーゲンへ作用させることによりＤｅｓＡフィブリンが生成し、Ｆの処理ではトロンビンをフィブリノーゲンへ作用させることによりフィブリンが生成した。
各処理ウエルへ、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地中に懸濁した５６００個のＢ１６−ＢＬ６黒色腫細胞を撒き、スライド・チャンバーをＣＯ_２インキュベーター中で２時間培養した。その後、処理済のウエルへ付着した約１５０個の細胞につき、伸展細胞（偽足を出している細胞）数を位相差顕微鏡を用いて計数し、その伸展細胞数の割合を下記の計算式にしたがい伸展率として算出した。
伸展率（％）＝（伸展細胞数／付着細胞数）×１００
同様の手順を、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地中に懸濁した５６００個のＢ１６−ＢＬ６黒色腫細胞に替えて、無血清ＭＥＭ＋１％非必須アミノ酸溶液培地中に懸濁した５６００個のＭＭＴ０６０５６２乳癌細胞、又は、無血清ＭＥＭ培地中に懸濁した５６００個のＨＴ−１０８０線維肉腫細胞について行った。
（３）黒色腫細胞の伸展抑制
図３に、各処理ウエル中で２時間培養した黒色腫細胞の顕微鏡写真（Ｘ４５倍）を示す。図４に、各処理ウエル中で培養した黒色腫細胞の伸展率のグラフを示す。
ＰＢＳ（Ａ）、フィブリノーゲン（Ｂ）、バトロキソビン（Ｃ）、トロンビン（Ｄ）及びフィブリン（Ｆ）の存在下では、黒色腫細胞の大部分が偽足を出して伸展し（図３）、いずれも伸展率が８０％を超えた（図４）。
一方、ＤｅｓＡフィブリン（Ｅ）の存在下では、黒色腫細胞はその大部分が丸い状態で、偽足を出しても短く（図３）、伸展率は１２．５３±６．６９％であった（図４）。
したがって、ＤｅｓＡフィブリンは、他の成分と比較して、マトリゲル存在下の黒色腫細胞の伸展を有意に抑制したことが認められた（図４、Ｐ＜０．０１）。
以上より、ＤｅｓＡフィブリンが、黒色腫細胞の伸展を効果的に抑制することが理解される。
（４）乳癌細胞の伸展抑制
図５に、各処理ウエル中で２時間培養した乳癌細胞の顕微鏡写真（Ｘ４５倍）を示す。図６に、各処理ウエル中で培養した乳癌細胞の伸展率のグラフを示す。
ＰＢＳ（Ａ）、フィブリノーゲン（Ｂ）、バトロキソビン（Ｃ）、トロンビン（Ｄ）及びフィブリン（Ｆ）の存在下では、乳癌細胞の大部分が偽足を出して伸展し（図５）、いずれも伸展率が６０％を超えた（図６）。
一方、ＤｅｓＡフィブリン（Ｅ）の存在下では、乳癌細胞はその大部分が丸い状態で、偽足を出しても短く（図５）、伸展率は８．８７±３．０６％であった（図６）。
したがって、ＤｅｓＡフィブリンは、他の成分と比較して、マトリゲル存在下の乳癌細胞の伸展を有意に抑制したことが認められた（図６、Ｐ＜０．０１）。
以上より、ＤｅｓＡフィブリンが、乳癌細胞の伸展を効果的に抑制することが理解される。
（５）線維肉腫細胞の伸展抑制
図７に、各処理ウエル中で２時間培養した線維肉腫細胞の顕微鏡写真（Ｘ４５倍）を示す。図８に、各処理ウエル中で培養した線維肉腫細胞の伸展率のグラフを示す。
ＰＢＳ（Ａ）、フィブリノーゲン（Ｂ）、バトロキソビン（Ｃ）、トロンビン（Ｄ）及びフィブリン（Ｆ）の存在下では、線維肉腫細胞の大部分が偽足を出して伸展し（図７）、いずれも伸展率が７０％を超えた（図８）。
一方、ＤｅｓＡフィブリン（Ｅ）の存在下では、線維肉腫細胞はその大部分が丸い状態で、偽足を出しても短く（図７）、伸展率は３４．１９±６．５５％であった（図８）。
したがって、ＤｅｓＡフィブリンは、他の成分と比較して、マトリゲル存在下の線維肉腫細胞の伸展を有意に抑制したことが認められた（図７、Ｐ＜０．０１）。
以上より、ＤｅｓＡフィブリンが、線維肉腫細胞の伸展を効果的に抑制することが理解される。

悪性腫瘍細胞の伸展に対するＤｅｓＡフィブリン量の影響
バトロキソビンをフィブリノーゲンに作用させて得られるＤｅｓＡフィブリンの生成量は、フィブリノーゲン量の増加及びフィブリノーゲンとバトロキソビンとの反応時間の延長に応じて増加すると考えられる。そこで、同一濃度のバトロキソビン（０．５ＢＵ／ｍｌ）と異なる濃度のフィブリノーゲン（０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ及び１５ｍｇ／ｍｌ）とを、それぞれ３０秒間、６０秒間及び９０秒間反応させて種々の量のＤｅｓＡフィブリンを調製し、これらの悪性腫瘍細胞の伸展に対する影響を評価した。実験方法は、使用したフィブリノーゲンの量及び反応時間を除いて、実施例２の（２）細胞伸展の測定法のＥ処理と同様であった。結果を図９に示す。
反応時間が３０秒（□）の場合、フィブリノーゲン濃度を上昇させても伸展率減少への影響は見られず、伸展率は７６．２３％までしか減少しなかった。これは、伸展へ影響を及ぼすことができる十分な量のＤｅｓＡフィブリンが３０秒の反応時間では生成しなかったためであると考えられる。
反応時間が６０秒（○）及び９０秒（△）の場合、フィブリノーゲン濃度が３ｍｇ／ｍｌとなったときに伸展率の大幅な減少が見られた（６０秒：１２．５３％、９０秒：９．１３％）。フィブリノーゲン濃度を更に上昇させると、伸展細胞がほとんど見られなくなった。これは、ＤｅｓＡフィブリン生成量の増加に応じて悪性腫瘍細胞の伸展がより強く抑制されたことを示している。
一方、フィブリノーゲン濃度が９ｍｇ／ｍｌを超えると伸展率が上昇し、濃度１５ｍｇ／ｍｌでは伸展率の減少効果が見られなかった。これは、高濃度のフィブリノーゲンの存在下では、生成したＤｅｓＡフィブリンがウエルへコーティングされる前にウエル上を多量のフィブリノーゲンが覆ってしまう（ウエルへコーティングされないＤｅｓＡフィブリンは洗浄工程において洗い出されてしまう）ため、フィブリノーゲンそのものの作用が現れているためであると考えられる。
以上より、ＤｅｓＡフィブリンは黒色腫細胞の伸展を用量依存的に抑制することが理解される。

ＤｅｓＡフィブリンの悪性腫瘍細胞の遊走に対する影響
悪性腫瘍細胞の遊走は腫瘍転移の基礎となる生物学的行為である。悪性度の高い悪性腫瘍は遊走能力も高い。そこで、本実施例では、「かき傷アッセイ法（ｓｃｒａｔｃｈｗｏｕｎｄａｓｓａｙ）」（ＧｙｎｅｃｏｌＯｎｃｏｌ８９：６０−７２（２００３）を参照）を用いて、２種類の悪性腫瘍（黒色腫及び乳癌）細胞の遊走に対するＤｅｓＡフィブリンの影響を評価した。
（１）使用した悪性腫瘍細胞
黒色腫細胞としてのＢ１６−ＢＬ６マウス悪性黒色腫細胞（ＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ，ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で継代培養して、本実験に供した。
乳癌細胞としてのＭＭＴ０６０５６２マウス乳癌細胞（ＡＴＣＣ，ＶＡ，ＵＳＡ）は、１０％ＦＢＳ及び１％非必須アミノ酸溶液（Ｎｏｎ−ＥｓｓｅｎｔｉａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＳｏｌｕｔｉｏｎ，Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ））を含有するＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で継代培養して、本実験に供した。
（２）細胞遊走の測定法
６穴プレートのウエル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）にカバーガラスを敷き、そこへ、２ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で懸濁した２．５Ｘ１０^４個のＢ１６−ＢＬ６黒色腫細胞、又は、２ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地で懸濁した２．５Ｘ１０^４個のＭＭＴ０６０５６２乳癌細胞を撒き、ＣＯ_２インキュベーター中で２４時間培養した。
培養後、プラスチック製のセルスクレーパー（ｃｅｌｌｓｃｒａｐｅｒ）を用いて、細胞が増殖しているカバーグラスへ幅が０．５ｍｍの傷ラインを付け、元々その傷ラインに増殖していた細胞を取り除いて、さらに残りの細胞断片をＰＢＳで洗浄した。
黒色腫細胞培養ウェルに対して、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈した０．０５ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン、又は、ＤｅｓＡフィブリン（０．０５ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン及び２ＢＵ／ｍｌバトロキソビンの添加により生成させた）をそれぞれ２ｍｌ添加し、ＣＯ_２インキュベーター中で４８時間培養した。
乳癌細胞培養ウェルに対して、１０％ＦＢＳＭＥＭ培地で希釈した０．０５ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン、又は、ＤｅｓＡフィブリン（０．０５ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン及び２ＢＵ／ｍｌバトロキソビンの添加により生成させた）をそれぞれ２ｍｌ添加し、ＣＯ_２インキュベーター中で４８時間培養した。
培養後、ライト染色（Ｗｒｉｇｈｔｓｔａｉｎｉｎｇ）を行い、光学差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて傷ライン上へ遊走した細胞数を計数し、カバーガラス平方ミリメートルあたりの遊走細胞数（細胞数／ｍｍ^２）として表した。
尚、フィブリノーゲン処理をＤｅｓＡフィブリン処理の対照としたのは、悪性腫瘍が生体内に存在している場合、悪性腫瘍細胞の周囲にはフィブリノーゲンが存在しているからである。
（３）黒色腫細胞の遊走抑制
結果を表１に示す。

ＤｅｓＡフィブリン処理時の遊走細胞数（１４±４個／ｍｍ^２）は、フィブリノーゲン処理時の遊走細胞数（８７±１４個／ｍｍ^２）よりも有意に少なかった（Ｐ＜０．０１）。
以上より、ＤｅｓＡフィブリンが、黒色腫細胞の遊走を効果的に抑制することが理解される。
（４）乳癌細胞の遊走抑制
結果を表２に示す。

ＤｅｓＡフィブリン処理時の遊走細胞数（１２±３個／ｍｍ^２）は、フィブリノーゲン処理時の遊走細胞数（２９±１０個／ｍｍ^２）よりも有意に少なかった（Ｐ＜０．０１）。
以上より、ＤｅｓＡフィブリンが、乳癌細胞の遊走を効果的に抑制することが理解される。

本発明の悪性腫瘍抑制剤は、上述の実施例で示されるように、悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は悪性腫瘍の抑制に有利に使用することができる。

Claims

Des A フィブリンを含有することを特徴とする、悪性腫瘍抑制剤。
Des A フィブリンが、フィブリノーゲンにトロンビン様酵素を作用させて得られるものである、請求項１に記載の悪性腫瘍抑制剤。
トロンビン様酵素が天然物又は遺伝子組み換え製品である、請求項２に記載の悪性腫瘍抑制剤。
トロンビン様酵素がバトロキソビンである、請求項２又は３に記載の悪性腫瘍抑制剤。
悪性腫瘍が上皮性悪性腫瘍である、請求項１〜４のいずれかに記載の悪性腫瘍抑制剤。
悪性腫瘍が非上皮性悪性腫瘍である、請求項１〜４のいずれかに記載の悪性腫瘍抑制剤。
悪性腫瘍が神経組織由来の悪性腫瘍又は間葉系組織由来の悪性腫瘍である、請求項１〜４のいずれかに記載の悪性腫瘍抑制剤。
悪性腫瘍が、黒色腫、乳癌又は線維肉腫である、請求項１〜４のいずれかに記載の悪性腫瘍抑制剤。