CN1972706B - 含有去a肽纤维蛋白的恶性肿瘤抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有去A肽纤维蛋白的恶性肿瘤抑制剂，它通过抑制恶性肿瘤细胞的伸展和游走，从而能抑制恶性肿瘤。

Description

含有去A肽纤维蛋白的恶性肿瘤抑制剂
技术领域
本发明涉及以含有去A肽纤维蛋白为特征的恶性肿瘤抑制剂。
背景技术
近年来，由于外科手术、放疗或化疗的应用去除原发癌的成功率得到提高，从而恶性肿瘤的治疗取得了稳步的进展。但是，即使是完全去除了原发癌，因癌的转移引发死亡的情况也并不少见。
特别是黑色素瘤、肺癌、肝癌和胰腺癌等恶性程度高的恶性肿瘤很难在早期发现，当被诊断为恶性肿瘤时，原发癌和转移癌已经同时存在，导致无法接受手术治疗的病例很多。对于这些恶性肿瘤，放疗的效果也不好。而且，目前的实际情况是临床上使用的阿霉素等化疗制剂几乎都是通过直接攻击恶性肿瘤细胞而发挥药效，在其攻击肿瘤细胞的同时也攻击正常细胞，出现强的副作用，因此成为临床应用中的难题。所以，这几十年来，没有突破性的新药出现。为了打破这一局面，亟待新型的、用于恶性肿瘤的药品出现。
在这种背景下，最近，很多基础研究和临床研究结果表明，恶性肿瘤与凝血纤溶系统有密切的关系。例如，已知恶性肿瘤患者由于血浆纤维蛋白原增加、血浆粘度增加以及血液流变学的异常等凝血纤溶系统的异常引起微循环障碍。另外，有报道认为由于血浆纤维蛋白原的增加或恶性肿瘤细胞本身分泌纤维蛋白原，恶性肿瘤组织的细胞外基质中发生纤维蛋白原或纤维蛋白沉积，其作为细胞外基质的一员对恶性肿瘤细胞的增殖、浸润和转移起促进作用(参照例如Cancer Researh60：2033-2039(2000)，Ann N Y Acad Sci 936：406-425(2001)以及Blood96：3302-3309(2000))。
鉴于上述恶性肿瘤与凝血纤溶系统的关系，在体外用纤维蛋白处理恶性肿瘤细胞，发现恶性肿瘤细胞向肺脏的实验性转移增强(参照例如Clin Exp Metastasis17：723-730(1999))。纤维蛋白(又称为去AB肽纤维蛋白或纤维蛋白II)是凝血酶作用于纤维蛋白原，使纤维蛋白肽A(fibrinopeptide A，以下称为FPA)和纤维蛋白肽B(fibrinopeptide B，以下称为FPB)从纤维蛋白原游离而得到的物质(参照例如Nature 275：501-505(1978)和Biochemistry 35：4417-4426(1996))。
另外，鉴于血中纤维蛋白原浓度与恶性肿瘤增殖和转移的关系，有报道认为使用具有降低纤维蛋白原作用的类凝血酶——巴曲酶(Batroxobin)或安克洛酶(Ancrod)可使纤维蛋白原减少，从而抑制恶性肿瘤的增殖和转移(参照例如Eur J Cancer 16：919-923(1980)和日本血液学会杂志44：739-743(1981))。巴曲酶是来源于矛头蝮蛇(Bothrops atrox)moojeni亚种毒液的丝氨酸蛋白酶类的类凝血酶，仅使FPA从纤维蛋白原游离，产生去A肽纤维蛋白(也称为纤维蛋白I)的糖蛋白酶(参照例如Thromb Haemost 36：9-13(1976)和ThrombDiath Haemorrh 45(Suppl)：63-68(1971)。
这些文献公开的技术是，基于纤维蛋白原作为屏障起保护肿瘤细胞的作用，而不受免疫系统攻击的推定，认为类凝血酶通过减少纤维蛋白原，从而使免疫系统易于对恶性肿瘤细胞进行攻击，结果使恶性肿瘤的增殖和转移得到抑制。
另一方面，已知恶性肿瘤细胞具有伸展(spreading)和游走(migration)的特性。在此，恶性肿瘤细胞的伸展是指肿瘤细胞接受某种信号后，圆形的肿瘤细胞形成伪足的现象，其为肿瘤细胞的一种生物学行为，是肿瘤增殖、浸润和转移的基础。
另外，恶性肿瘤细胞的游走是指肿瘤细胞接受某种信号，细胞膜上的细胞粘附分子与配体之间产生不断的结合和解离，肿瘤细胞从原来的位置移动的现象，这是作为肿瘤浸润和转移基础的生物学行为。
因此，通过抑制恶性肿瘤细胞的伸展和游走，来抑制肿瘤的浸润和转移，由此可抑制恶性肿瘤。
但是，有关通过该机理有效抑制恶性肿瘤的药物并没有报道。
另外，也没有关于纤维蛋白原的分解产物去A肽纤维蛋白与恶性肿瘤细胞的伸展和游走的相关性报道。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种恶性肿瘤抑制剂，作为恶性肿瘤抑制剂其含有新的有效成分。
为了解决上述课题，本发明人考虑到去A肽纤维蛋白对恶性肿瘤细胞具有与纤维蛋白不同的作用，深入研究了去A肽纤维蛋白对恶性肿瘤细胞的伸展和游走的影响，发现去A肽纤维蛋白具有抑制恶性肿瘤细胞伸展和游走的作用。本发明是基于这一发现完成的。
即，本发明涉及以含有去A肽纤维蛋白为特征的恶性肿瘤抑制剂。
附图说明
图1纤维蛋白原、去A肽纤维蛋白以及纤维蛋白的电泳照片。
图2将图1的电泳图用图像分析系统定量化的曲线图。
图3在用PBS(A)、纤维蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纤维蛋白(E)和纤维蛋白(F)处理的孔中培养的黑色素瘤细胞的显微照片。
图4在用PBS(A)、纤维蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纤维蛋白(E)和纤维蛋白(F)处理的孔中培养的黑色素瘤细胞的伸展率的直方图。
图5在用PBS(A)、纤维蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纤维蛋白(E)和纤维蛋白(F)处理的孔中培养的乳癌细胞的显微照片。
图6在用PBS(A)、纤维蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纤维蛋白(E)和纤维蛋白(F)处理的孔中培养的乳癌细胞的伸展率的直方图。
图7在用PBS(A)、纤维蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纤维蛋白(E)和纤维蛋白(F)处理的孔中培养的纤维肉瘤细胞的显微照片。
图8在用PBS(A)、纤维蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)、去A肽纤维蛋白(E)和纤维蛋白(F)处理的孔中培养的纤维肉瘤细胞的伸展率的直方图。
图9去A肽纤维蛋白对黑色素瘤细胞伸展的影响的曲线图。
具体实施方式
以下详细说明本发明。
本发明的恶性肿瘤抑制剂的特征在于含有去A肽纤维蛋白作为有效成分。
去A肽纤维蛋白是使FPA从纤维蛋白原游离后得到的物质。
纤维蛋白原是通过二硫键(S-S)将下述的2个亚单位(AαBβγ)结合起来所形成的2倍体糖蛋白(AαBβγ)2。其中每个所述的亚单位包含通过二硫键结合的称为Aα链、Bβ链和γ链的3种链。因Aα链含有610个氨基酸(68kDa)、Bβ链含有461个氨基酸(54kDa)、γ链含有411个氨基酸(48kDa)，所以纤维蛋白原的分子量为340kDa(参照Thromb Res 83：1-75(1996)以及Blood Coagulation，Fibrinolysisand Kinin，Aoki A and Iwanaga S(Eds)Chugi Igaku Co.，Tokyo，1979，p59-71)。另外，还已知在Bβ链和γ链上有糖结合，而在Aα链上没有(参照Int J Biochem & Cell Biol 31：741-746(1999))。
FPA是相当于从纤维蛋白原的Aα链的NH2末端起的16个氨基酸(NH2-Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg)组成的肽。
因此，去A肽纤维蛋白是使FPA从纤维蛋白原游离后得到的剩余部分[(αBβγ)2](参照Thromb Haemost 36：9-13(1976)和ThrombDiath Haemorrh 45(Suppl)：63-68(1971))。FPA的分子量为1,536Da，所以可计算出去A肽纤维蛋白的分子量约为337kDa。
从纤维蛋白原游离FPA可应用类凝血酶进行。类凝血酶是丝氨酸蛋白酶的一种，大多来源于蛇毒。作为具体例子，可列举由矛头蝮蛇moojeni亚种的毒液中提取纯化的巴曲酶(东菱药品工业株式会社(日本东京)及其子会社北京托毕西药业有限公司(Beijing TobishiPharmaceutical Co.，Ltd.)，中国北京生产)、安克洛酶、以及其它来源于蛇毒的类凝血酶(例如Crotalase)等。这些类凝血酶可以是天然产物，也可以是基因重组产品。
使用纤维蛋白原和类凝血酶制备去A肽纤维蛋白可按照例如下述(1)～(6)的方法进行：
(1)使纤维蛋白原附着于塑料培养器皿、玻璃培养器皿、载玻片、不锈钢或合成固体物质EPTEE人工血管等的表面，并向其添加类凝血酶，从而制备去A肽纤维蛋白的方法；
(2)向上述固体物质同时添加纤维蛋白原和类凝血酶制备去A肽纤维蛋白的方法；
(3)在液体反应系统中，在0.1～15N的尿素和/或抗凝肽(Gly-Pro-Arg-Pro-amide，GPRP-NH2(序列号2))存在下，使纤维蛋白原与类凝血酶反应，并同时防止去A肽纤维蛋白之间凝集的制备方法(参照Clin Exp Metastasis 17：723-730(1999)；
(4)将纤维蛋白结合于柱子，使含有类凝血酶的溶液灌入，从而制备去A肽纤维蛋白的方法；
(5)将类凝血酶结合于柱子，用含有纤维蛋白原的溶液灌流，从而制备去A肽纤维蛋白的方法；
(6)将类凝血酶通过静脉、腹腔内、皮下和肌肉注射等给药方式，作用于体内的纤维蛋白原，从而在体内制备去A肽纤维蛋白的方法(参照Acta Haematol Jpn 44：706-711(1981))。
制备本发明的去A肽纤维蛋白所用的纤维蛋白原和类凝血酶本身均为公知的物质，可从市场上容易地买到或制备。去A肽纤维蛋白本身也是公知的物质，可由上述方法制备。
本发明的恶性肿瘤抑制剂的对象为恶性肿瘤。恶性肿瘤根据其来源组织可分为上皮性恶性肿瘤和非上皮性恶性肿瘤。据报导上皮性肿瘤占肿瘤总体的约9成。非上皮性恶性肿瘤又可分为来源于间叶组织的恶性肿瘤、来源于神经组织的恶性肿瘤和未分化细胞的恶性肿瘤。以下列举各种恶性肿瘤的具体例子。
上皮性恶性肿瘤
腺癌(来源于腺上皮的癌，发生于胃、肠、胰脏、气管、肺脏、乳腺、卵巢、子宫、前列腺等身体的各处，推测占人类癌症的70～80％)、鳞状上皮癌(来源于复层鳞状上皮，例如表皮、唇、舌、咽、食道、肛门、外阴、子宫颈部等上皮组织发生的癌、分类为非小细胞肺癌的肺鳞状上皮癌)、基底细胞癌(来源于皮肤和附件的基底细胞)、移行上皮细胞癌(来源于移行上皮、例如膀胱癌)、肝细胞癌(来源于肝实质细胞)、肾细胞癌(来源于肾上皮)、胆管癌(来源于胆管)、绒毛癌(来源于胎盘上皮)。
非上皮性恶性肿瘤
来源于间叶组织的恶性肿瘤
纤维肉瘤(来源于结缔组织和纤维组织)、脂肪肉瘤(来源于结缔组织和脂肪组织)、软骨肉瘤(来源于结缔组织和软骨组织)、骨肉瘤(来源于结缔组织和骨组织)、血管肉瘤(来源于血管)、淋巴管肉瘤(来源于淋巴管)、骨髓性白血病(来源于造血细胞)、单核细胞性白血病(来源于造血细胞)、恶性淋巴瘤(来源于淋巴组织)、淋巴性白血病(来源于淋巴组织)、浆细胞瘤(多发性骨髓瘤)(来源于淋巴组织)、霍奇金(Hodgkin)细胞(来源于淋巴组织)、平滑肌肉瘤(来源于平滑肌)、横纹肌肉瘤(来源于横纹肌)。
来源于神经组织的恶性肿瘤
神经母细胞瘤(来源于神经母细胞)、髓母细胞瘤(来源于髓母细胞)、恶性星形胶质细胞瘤(来源于星形胶质细胞)、视网膜母细胞瘤(来源于视网膜母细胞)、胶质母细胞瘤(来源于胶质母细胞)、恶性神经鞘瘤(来源于许旺细胞)、黑色素瘤(来源于神经外胚叶)。
未分化细胞的恶性肿瘤
恶性畸胎瘤(来源于全能干细胞)、肾母细胞瘤(来源于肾母细胞)、肝母细胞瘤(来源于肝母细胞)、混合肿瘤(来源于多种细胞)。
本发明的恶性肿瘤抑制剂对这些恶性肿瘤中的上皮性恶性肿瘤，以及作为非上皮性恶性肿瘤的、来源于神经组织的恶性肿瘤和来源于间叶组织的恶性肿瘤，特别是黑色素瘤、乳癌和纤维肉瘤可发挥出色的效果。
本发明的恶性肿瘤抑制剂通过抑制恶性肿瘤细胞的伸展和游走，来抑制肿瘤的浸润和转移，由此抑制恶性肿瘤。
在此，恶性肿瘤细胞的伸展是指肿瘤细胞接受某种信号后，圆形的肿瘤细胞形成伪足的现象，其为肿瘤细胞的一种生物学行为，是肿瘤细胞增殖、浸润和转移的基础。
另外，恶性肿瘤细胞的游走是指肿瘤细胞接受某种信号后，细胞膜上的细胞粘附分子与配体之间产生不断的结合和解离，细胞由原来的位置移动的现象，这是作为肿瘤浸润和转移基础的生物学行为。
本发明的恶性肿瘤抑制剂可以由去A肽纤维蛋白单体构成，也可以是与其它活性物质组合而成。
作为其它活性物质，可列举氟尿嘧啶等代谢拮抗剂、阿霉素等抗肿瘤抗生素、氮烯咪唑胺等烷化剂、紫杉醇等来源于植物的抗癌剂等。
作为本发明的恶性肿瘤抑制剂的剂型，可适用于日本药局方制剂总则中的任何剂型，可列举例如直接用于体内的注射剂(包括混悬剂、乳剂)；软膏剂(包括油脂性软膏、乳剂型软膏(霜)、水溶性软膏等)、吸入剂、液体制剂(包括滴眼剂、滴鼻剂等)、栓剂、贴剂、糊剂、洗剂等外用剂；或片剂(包括糖衣、薄膜、胶衣)、液体制剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂(包括细粒剂)、丸剂、糖浆剂、含片等内服剂等。这些制剂可按照日本药局方制剂总则等中记载的方法进行制备。
另外，本发明的恶性肿瘤抑制剂根据剂型可以含有可药用的固态或液态载体或介入治疗材料。作为可药用的固态或液态载体，可列举溶剂、稳定剂、防腐剂、助溶解剂、乳化剂、悬浊剂、缓冲剂、等渗剂、着色剂、基质、增稠剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、矫味剂等。
作为具体例子，可列举水、乳糖、白糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖醇等糖·糖醇；结晶纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、低取代羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素钠、羧基甲基乙基纤维素、乙酸邻苯二酸纤维素等纤维素及其相关衍生物；玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、糊精、预胶化淀粉、部分预胶化淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉钠、环糊精、支链淀粉等淀粉及其相关衍生物；琼脂、藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、胶原、虫胶、黄蓍胶、黄原胶等天然高分子(海藻类、植物粘质、蛋白质等)；聚乙烯吡咯烷酮、氨基烷基甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯醇、二甲基聚硅氧烷等合成高分子；橄榄油、可可油、巴西棕榈蜡、牛油、硬化油、大豆油、芝麻油、山茶油、石蜡、液体石蜡、黄蜂蜡、白色凡士林、椰子油、微晶蜡等油脂类；硬脂酸、硬脂酸铝、硬脂酸钙、硬脂酸镁、柠檬酸三乙酯、三乙酸甘油酯、中链脂肪酸三甘油酯、硬脂、肉豆蔻酸异丙酯等脂肪酸及其衍生物；甘油、硬脂醇、鲸蜡醇、丙二醇、聚乙二醇等醇和多元醇；氧化锌、磷酸氢钙、沉降碳酸钙、合成硅酸铝、硅酸酐、高岭土、干燥氢氧化铝凝胶、合成水滑石、氧化钛、滑石、膨润土、硅酸铝镁、硫酸铝钾、次没食子酸铋、次水杨酸铋、乳酸钙、碳酸氢钠等无机物质和金属盐化合物；蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸聚烃氧酯、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、倍半油酸脱水山梨醇酯、三油酸脱水山梨醇酯、单硬脂酸脱水山梨醇酯、单棕榈酸脱水山梨醇酯、单月桂酸脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、聚桂醇等表面活性剂；色素；香料等。
作为介入治疗材料，可列举支架(Stent)、人工血管等。
本发明的恶性肿瘤抑制剂中的去A肽纤维蛋白含量根据所采用的剂型而变化，例如，在为内服剂的情况下，每1g含0.01～900mg，为注射剂时，每1ml含0.01～500mg，为外用剂的情况下，每1g含0.01～500mg。
本发明的恶性肿瘤抑制剂的给药量通常因患者的体重、疾病的性质和状态而变化，用于成人时，每天以去A肽纤维蛋白量计为0.1～5000mg，最好为100～2500mg。
以下列举实施例进行具体说明，但本发明不受这些实施例所限定。
[实施例1]去A肽纤维蛋白的制备和确认
用类凝血酶使FPA从纤维蛋白原游离，制备去A肽纤维蛋白。为了进一步确认去A肽纤维蛋白的生成，与纤维蛋白原和纤维蛋白进行了对比研究。
(1)去A肽纤维蛋白的制备
在最终浓度为3.0mg/ml的人纤维蛋白原(F-4883，Sigma，MO，USA)的磷酸缓冲液(PBS)溶液中加入类凝血酶巴曲酶(注册商标：Tobarpin、中文为东菱迪芙，北京托毕西药业有限公司(Beijing TobishiPharmaceutical Co.，Ltd.，)中国北京生产)使巴曲酶的最终浓度为0.5BU/ml，然后在37℃下培养1小时，制备去A肽纤维蛋白。
(2)纤维蛋白的制备
在最终浓度为3.0mg/ml的人纤维蛋白原(F-4883，Sigma，MO，USA)的PBS溶液中加入人凝血酶(Sigma，MO，USA)的PBS溶液，使凝血酶的最终浓度为0.5U/ml，然后在37℃下培养1小时，制备纤维蛋白。
(3)纤维蛋白原的制备
作为无处理对照，使用人纤维蛋白原(F-4883，Sigma，MO，USA)制备最终浓度为3.0mg/ml的纤维蛋白原PBS溶液。
(4)去A肽纤维蛋白生成的确认
利用电泳确认通过上述步骤(1)是否生成了去A肽纤维蛋白。具体步骤为，通过下述处理，以纤维蛋白原还原为Aα链、Bβ链和γ链3种链为基准，将去A肽纤维蛋白还原为α链、Bβ链和γ链3种链，将纤维蛋白还原为α链、β链和γ链3种链后，用电泳来评价。
将步骤(1)得到的去A肽纤维蛋白和步骤(2)得到的纤维蛋白用无菌生理盐水洗涤3次后，在0.5ml 2％SDS-2％β巯基乙醇-5M尿素液中煮沸5～6分钟，使二硫键断开，溶解。
对于步骤(3)得到的纤维蛋白原省略上述洗涤工序，其后与上述操作一样，使二硫键断开，加热溶解。
在得到的各样品的150μl溶液中加入50μl电泳缓冲液(4X 2％SDS-0.1％溴甲酚兰)，进行7.5％SDS-PAGE(PAGEL(注册商标)，AttoCorp.，Tokyo，Japan)电泳。
结果如图1的电泳图所示。在图1中，泳道1和泳道4为纤维蛋白原，泳道2为去A肽纤维蛋白，泳道3为纤维蛋白。
在各泳道中，最下面的带为γ链，从下面数第二条带为Bβ链，从下面数第三条带为Aα链。
在此，以泳道1和泳道4(纤维蛋白原)为基准来评价泳道2(去A肽纤维蛋白)，泳道2从下面数第3条带(Aα链)的位置向下方(低分子量侧)偏移。这表明，由于类凝血酶巴曲酶的作用FPA被从纤维蛋白原的Aα链中游离出来。而其它带的位置与纤维蛋白原一致。由上可知，在步骤(1)中，FPA从纤维蛋白原游离，生成了去A肽纤维蛋白。
另外，以泳道1和泳道4(纤维蛋白原)为基准评价泳道3(纤维蛋白)，泳道3从下面数第2条带(Bβ链)和第3条带(Aα链)的位置均向下方(低分子量侧)偏移。这表明，由于凝血酶的作用FPA和FPB分别被从纤维蛋白原的Aα链和Bβ链中游离出来。由上可知，在步骤(2)中生成了纤维蛋白。
这些结果与已知数据一致(参照Acta Haematol Jpn 44：706-711(1981))。
再者，将上述电泳图用图像分析系统(Furi Science & TechnologyCo.，Ltd.，Shanghai，China)进行定量化，以曲线表示(图2)。
图2中的3个峰中，左侧的峰表示Aα链的带密度，中间的峰表示Bβ链的带密度，右侧的链表示γ链的带密度。
对左侧的峰(Aα链)进行评价的话，去A肽纤维蛋白和纤维蛋白的峰一致，而且与纤维蛋白原的峰相比，向低分子量侧偏移。这表明，去A肽纤维蛋白和纤维蛋白中的FPA被从纤维蛋白原的Aα链中游离出来。
对中间的峰(Bβ链)进行评价的话，纤维蛋白原和去A肽纤维蛋白原的峰一致，只是纤维蛋白的峰向低分子量侧偏移。这表明只有纤维蛋白中的FPB被从纤维蛋白原的Bβ链中游离出来。
由上可知，巴曲酶作用于纤维蛋白原((AαBβγ)2)生成的物质为去A肽纤维蛋白((αBβγ)2、凝血酶作用于纤维蛋白原生成的物质为纤维蛋白((αβγ)2)。
[实施例2]去A肽纤维蛋白对恶性肿瘤细胞伸展的影响
用Matrigel(注册商标)(BD Biosciences，NJ，USA)制备模拟体内细胞外基质的环境，用3种恶性肿瘤(黑色素瘤、乳癌和纤维肉瘤)细胞评价在该环境下去A肽纤维蛋白对恶性肿瘤细胞伸展的影响。
(1)所使用的恶性肿瘤细胞
将作为黑色素瘤细胞代表的B16-BL6小鼠恶性黑色素瘤细胞(Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，China)在含有10％胎牛血清(FBS，HyClone，Utah，USA)的RPMI-1640培养基(Gibco，MD，USA)中进行传代培养，用于本实验。
将作为乳癌细胞代表的MMT060562小鼠乳癌细胞(ATCC，VA，USA)在含有10％FBS和1％非必需氨基酸(Non-Essential Amino AcidsSolution，Gibco，MD，USA)的MEM培养基(Gibco，MD，USA)中进行传代培养，用于本实验。
将作为纤维肉瘤细胞代表的HT-1080人纤维肉瘤细胞(Academy ofChinese Medical Sciences，Beijing，China)在含有10％FBS的MEM培养基(Gibco，MD，USA)中进行传代培养，用于本实验。
(2)细胞伸展的测定方法
向8孔细胞培养板(Nunc，IL，USA)的各孔中加入0.25ml Matrigel(注册商标)7.5μg/ml(BD Biosciences，NJ，USA)，在室温下培养1小时，将培养板用Matrigel包被。接着向经Matrigel包被的各孔中添加下述A～F溶液(各0.25ml)，进行处理。
A：添加磷酸缓冲液(PBS)(溶剂对照)
B：添加纤维蛋白原(3mg/ml)
C：添加巴曲酶(0.5BU/ml)
D：添加凝血酶(0.5U/ml)
E：添加去A肽纤维蛋白(3mg/ml纤维蛋白原和0.5BU/ml巴曲酶)。
F：添加纤维蛋白(3mg/ml纤维蛋白原和0.5U/ml凝血酶)
以上处理使用的溶液均为PBS。
(在此，BU(巴曲酶单位)是表示巴曲酶的酶活性量的单位，在37℃的温度下，向0.3ml柠檬酸钠抗凝的标准人血浆中添加0.1ml巴曲酶溶液时，在19.0±0.2秒使其凝固的活性量规定为2BU)。
在A～D的处理中，根据所示最终浓度向孔中添加所示各成分，在室温下培养1小时，然后弃去液体，用PBS洗涤。
在E～F的处理中，根据所示最终浓度向孔中添加所示各成分，反应60秒，在生成物(处理E：去A肽纤维蛋白，处理F：纤维蛋白)还未凝固时弃去液体。然后，在室温下培养1小时，之后弃去液体，用PBS洗涤。在E的处理中通过使巴曲酶作用于纤维蛋白原生成去A肽纤维蛋白，在F的处理中，通过使凝血酶作用于纤维蛋白原生成纤维蛋白。
向各个经处理的孔中注入悬浮于无血清RPMI-1640培养基中的5600个B16-BL6黑色素瘤细胞，将培养板在CO2培养箱中培养2小时。然后，用相差显微镜对附着在处理后的孔上的约150个细胞中的伸展细胞(有伪足的细胞)进行计数，按照以下计算式计算伸展细胞数的比例。
伸展率(％)＝(伸展细胞数/附着细胞数)×100
用悬浮于无血清MEM+1％非必需氨基酸培养基中的5600个MMT060562乳癌细胞和悬浮于无血清MEM培养基中的5600个HT-1080纤维肉瘤细胞代替悬浮于无血清RPMI-1640培养基中的5600个B16-BL6黑色素瘤细胞，进行同样的步骤。
(3)黑色素瘤细胞的伸展抑制
图3为在各个经处理的孔中培养2小时后的黑色素瘤细胞的显微照片(×45倍)。图4为在各个经处理的孔中培养的黑色素瘤细胞的伸展率直方图。
在PBS(A)、纤维蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)和纤维蛋白(F)存在下，大部分黑色素瘤细胞长出伪足而伸展(图3)，伸展率均超过80％(图4)。
另一方面，在去A肽纤维蛋白(E)存在下，黑色素瘤细胞的大部分为圆形状态，即使有伪足，也较短(图3)，伸展率为12.53±6.69％(图4)。
因此，与其它成分比较，去A肽纤维蛋白显著抑制了Matrigel存在下的黑色素瘤细胞的伸展(图4，P＜0.01)。
由上可知，去A肽纤维蛋白能有效抑制黑色素瘤细胞的伸展。
(4)乳癌细胞的伸展抑制
图5为在各个经处理的孔中培养2小时后的乳癌细胞的显微照片(×45倍)。图6为在各个经处理的孔中培养的乳癌细胞的伸展率直方图。
在PBS(A)、纤维蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)和纤维蛋白(F)存在下，大部分乳癌细胞长出伪足而伸展(图5)，伸展率均超过60％(图6)。
另一方面，在去A肽纤维蛋白(E)存在下，乳癌细胞的大部分为圆形状态，即使有伪足，也较短(图5)，伸展率为8.87±3.06％(图6)。
因此，与其它成分比较，去A肽纤维蛋白显著抑制了Matrigel存在下的乳癌细胞的伸展(图6，P＜0.01)。
由上可知，去A肽纤维蛋白能有效抑制乳癌细胞的伸展。
(5)纤维肉瘤细胞的伸展抑制
图7为在各个经处理的孔中培养2小时的纤维肉瘤细胞的显微照片(×45倍)。图8为在各个经处理的孔中培养的纤维肉瘤细胞的伸展率直方图。
在PBS(A)、纤维蛋白原(B)、巴曲酶(C)、凝血酶(D)和纤维蛋白(F)存在下，大部分纤维肉瘤细胞长出伪足而伸展(图7)，伸展率均超过70％(图8)。
另一方面，在去A肽纤维蛋白(E)存在下，纤维肉瘤细胞的大部分为圆形状态，即使有伪足，也较短(图7)，伸展率为34.19±6.55％(图8)。
因此，与其它成分比较，去A肽纤维蛋白显著抑制了Matrigel存在下的纤维肉瘤细胞的伸展(图7，P＜0.01)。
由上可知，去A肽纤维蛋白能有效抑制纤维肉瘤细胞的伸展。
[实施例3]不同剂量去A肽纤维蛋白对恶性肿瘤细胞伸展的影响
一般认为，由巴曲酶作用于纤维蛋白原得到的去A肽纤维蛋白生成量随着纤维蛋白原量的增加和纤维蛋白原与巴曲酶反应时间的延长而增加。因此，用相同浓度的巴曲酶(0.5BU/ml)与不同浓度的纤维蛋白原(0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、6mg/ml、9mg/ml、12mg/ml和15mg/ml)分别反应30秒、60秒、90秒，制备各种剂量的去A肽纤维蛋白，评价它们对恶性肿瘤细胞伸展的影响。实验方法中除了所使用的纤维蛋白原的量和反应时间外，其它的处理与实施例2的(2)细胞伸展测定法的E处理相同。结果如图9所示。
反应时间为30秒(□)的情况下，即使增加纤维蛋白原的浓度也对伸展率减少没有影响，伸展率仅减少至76.23％。这被认为是在30秒的反应时间内没有生成足以对伸展产生影响剂量的去A肽纤维蛋白的缘故。
反应时间为60(○)和90秒(△)的情况下，纤维蛋白原浓度达到3mg/ml时伸展率大幅减少(60秒：12.53％；90秒：9.13％)。如果进一步增加纤维蛋白原的浓度，则几乎观察不到伸展细胞。这表明随着去A肽纤维蛋白生成量的增加，恶性肿瘤细胞的伸展被强烈地抑制。
另一方面，如果纤维蛋白原的浓度超过9mg/ml，反而伸展率增高，在浓度为15mg/ml时观察不到对伸展率抑制的效果。这被认为是在高浓度的纤维蛋白原存在下，在生成的去A肽纤维蛋白将孔包被之前，大量的纤维蛋白原先覆盖在孔上(没有包被孔的去A肽纤维蛋白在洗涤步骤中被洗去)，是纤维蛋白原自身的作用表现出来的缘故。
如上所述，可知去A肽纤维蛋白对黑色素瘤细胞的伸展抑制作用具有量效关系。
[实施例4]去A肽纤维蛋白对恶性肿瘤细胞游走的影响
恶性肿瘤细胞的游走这一生物学行为是肿瘤转移的基础。恶性程度高的恶性肿瘤游走能力也高。因此，在本实施例中，用“划痕试验(scratch wound assay)”(参照Gynecol Oncol 89：60-72(2003))，评价去A肽纤维蛋白对2种恶性肿瘤(黑色素瘤和乳癌)细胞游走的影响。
(1)所使用的恶性肿瘤细胞
将作为黑色素瘤细胞代表的B16-BL6小鼠恶性黑色素瘤细胞(Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，China)在含有10％胎牛血清(FBS，HyClone，Utah，USA)的RPMI-1640培养基(Gibco，MD，USA)中进行传代培养，用于本实验。
将作为乳癌细胞代表的MMT060562小鼠乳癌细胞(ATCC，VA，USA)在含有10％FBS和1％非必需氨基酸(Non-EssentialAmino Acids Solution，Gibco，MD，USA)的MEM培养基(Gibco，MD，USA)中进行传代培养，用于本实验。
(2)细胞游走的测定方法
在6孔板的孔(Corning，NY，USA)中铺上盖玻片，接入2ml悬浮于含有10％FBS的RPMI-1640培养基中的2.5×104个B16-BL6黑色素瘤细胞，或者2ml悬浮于含有10％FBS的MEM培养基中的2.5×104个MMT060562乳癌细胞，在CO2培养箱中培养24小时。
培养后，用塑料细胞刮棒在细胞增殖中的盖玻片上划出宽0.5mm的划痕，除去本来生长在划痕处的细胞，并用PBS洗涤留下的细胞断片。
向黑色素瘤细胞培养孔中分别加入用2ml含有10％FBS的RPMI-1640培养基稀释的0.05mg/ml纤维蛋白原，或去A肽纤维蛋白(通过添加0.05mg/ml纤维蛋白原和2BU/ml巴曲酶生成的)，在CO2培养箱中培养48小时。
向乳癌细胞培养孔中分别加入用2ml 10％FBS MEM培养基稀释的0.05mg/ml纤维蛋白原，或去A肽纤维蛋白(通过添加0.05mg/ml纤维蛋白原和2BU/ml巴曲酶生成的)，在CO2培养箱中培养48小时。
培养后，进行瑞氏染色，用相差显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)计数游走至划痕上的细胞数，以每平方毫米盖玻片的游走细胞数(细胞数/mm2)的形式表示。
要说明的是，将纤维蛋白原处理作为去A肽纤维蛋白处理的对照是由于生体内存在恶性肿瘤时，在恶性肿瘤细胞的周围存在纤维蛋白原的缘故。
(3)黑色素瘤细胞的游走抑制
结果如表1所示。
表1.黑色素瘤细胞的游走
 处理   游走细胞数(细胞数/mm2)
 纤维蛋白原   87±14
 去A肽纤维蛋白   14±4＊＊
＊＊P＜0.01与纤维蛋白原的比较
去A肽纤维蛋白处理时的游走细胞数(14±4个/mm2)比纤维蛋白原处理时的游走细胞数(87±14个/mm2)显著少(P＜0.01)。
由上可知，去A肽纤维蛋白能有效抑制黑色素瘤细胞的游走。
(4)乳癌细胞的游走抑制
结果如表2所示。
表2.乳癌细胞的游走
 处理   游走细胞数(细胞数/mm2)
 纤维蛋白原   29±10
 去A肽纤维蛋白   12±3＊＊
＊＊P＜0.01与纤维蛋白原的比较
去A肽纤维蛋白处理时的游走细胞数(12±3个/mm2)比纤维蛋白原处理时的游走细胞数(29±10个/mm2)显著少(P＜0.01)。
由上可知，去A肽纤维蛋白能有效抑制乳癌细胞的游走。
产业实用性
如上述实施例所示，本发明的恶性肿瘤抑制剂可抑制恶性肿瘤细胞的伸展和游走。因此，本发明能用于有效地抑制恶性肿瘤。

Claims (2)

1.去A肽纤维蛋白在制备恶性肿瘤抑制剂中的用途，其中，所述的恶性肿瘤抑制是抑制恶性肿瘤细胞的伸展，所述的恶性肿瘤选自黑色素瘤、乳癌和纤维肉瘤。
2.去A肽纤维蛋白在制备恶性肿瘤抑制剂中的用途，其中，所述的恶性肿瘤抑制是抑制恶性肿瘤细胞的游走，所述的恶性肿瘤选自黑色素瘤和乳癌。
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