ES2290983T3 - Composiciones farmaceuticas que contienen quinazolinona para prevenir neovascularizacion y para tratar malignidades. - Google Patents

Abstract

El uso de Halofuginona y de sales farmacéuticamente aceptables de la misma para preparar un medicamento para tratar un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, adenocarcinoma de colon, próstata o páncreas, carcinoma de célula escamosa de la cerviz, cáncer de ovario, histiocitoma fibroso maligno, cáncer de piel, astrocitoma, glioma y carcinoma hepatocelular.

Description

Composiciones farmacéuticas que contienen quinazolinona para prevenir neovascularización y para tratar malignidades.

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al uso de Halofuginona y de sales farmacéuticamente aceptables de la misma para preparar un medicamento para tratar un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, adenocarcinoma de colon, próstata o páncreas, carcinoma de células escamosas de cerviz, cáncer de ovario, histiocitoma fibroso maligno, astrocitoma de cáncer de piel, glioma y carcinoma hepatocelular.

Las malignidades se caracterizan por el crecimiento y la expansión de tumores. En la progresión de esta enfermedad son importantes una serie de factores. Dichos factores incluyen la capacidad de las células tumorales para evadir los mecanismos de apoptosis (muerte celular programada), angiogénesis, y la capacidad de las células tumorales malignas de metastatizar. Cualquiera de estos factores es una diana potencial para una intervención terapéutica. Serían especialmente deseables los tratamientos que son capaces de afectar a dos o más de estos factores.

La angiogénesis es un proceso complejo en el que los capilares sanguíneos crecen en una secuencia ordenada de eventos [J. Folkman y M. Klagsbrun, Science, Vol. 235, pág. 442-447 (1987); J. Folkman e Y. Shing, J. Biol. Chem., Vol. 267, pág. 10931-10934 (1992)]. La angiogénesis está relacionada con el desarrollo y la progresión de malignidades como se indica a continuación. Una vez que el tumor se ha iniciado, cada incremento de la población de células tumorales debe estar precedido de un incremento de nuevos capilares que convergen en el tumor y que suministran a las células oxígeno y nutrientes [J. Folkman, Perspect. in Biol. and Med., Vol. 29, pág. 10-36 (1985); J. Folkman, J. Natl. Cancer Inst., Vol. 82, pág. 4-6 (1989); N. Weidner, y col., Amer. J. Pathol., Vol. 143, pág. 401-409 (1993)]. Por tanto, los tumores pueden permanecer inofensivos y confinados en sus tejidos originarios mientras se evite la activación de un programa angiogénico acompañante. Puesto que la etapa dependiente de angiogénesis en la progresión tumoral es compartida por todas las etiologías tumorales, la capacidad de inhibir la angiogénesis asociada a tumores es la estrategia más prometedora para combatir el cáncer [M.S. O'Reilly, y col., Cell, Vol. 79, pág. 316-328 (1994)].

Un cuerpo sustancial de evidencia experimental apoya la hipótesis de que la angiogénesis tumoral es fundamental para el crecimiento y la metástasis de tumores sólidos [J. Folkman, ver anterior (1989); N. Weidner, y col., ver anterior (1993); M.S. O'Reilly, y col., ver anterior (1994); N. Weidner, y col., N. Eng. J. Med., Vol. 324, pág. 1-8 (1991)]. De hecho, la mayoría de los tumores sólidos ni siquiera son clínicamente detectables hasta después de la formación de neovascularización, cuya inducción en tumores sólidos está mediada por uno o más factores angiogénicos [J. Folkman, ver anterior (1987); J. Folkman e Y. Shing, ver anterior (1992)].

Adicionalmente, la angiogénesis también es importante en una serie de procesos patológicos adicionales, que incluyen artritis, soriasis, retinopatía diabética, inflamación crónica, escleroderma, hemangioma, fibroplasia retrolental y proliferación capilar anormal en articulaciones hemofiliacas, menstruación y hemorragia prolongada, y otros trastornos del sistema reproductor femenino [J. Folkman, Nature Medicine, Vol. 1, pág. 27-31 (1995); J.W. Millar, y col., J. Pathol., Vol. 145, pág. 574-584 (1994); A.P. Adamid, y col., Amer. J. Ophthal., Vol. 118, pág. 445-450 (1994); K. Takahashi, y col., J. Clin. Invest., Vol. 93, pág. 2357-2364 (1994); D.J. Peacock, y col., J. Exp. Med., Vol. 175, pág. 1135-1138 (1992); B.J. Nickoloff, y col., Amer. J. Pathol., Vol. 44, pág. 820-828 (1994); J. Folkman, Steroid Hormones and Uterine Bleeding, N.J. Alexander y C. d'Arcangues, Eds., American Association for the Advancement of Science Press, Washington, D.C., EE.UU., pág. 144-158 (1992)].

Por tanto, es evidente que nuevos medicamentos que bloqueen específicamente el mecanismo de angiogénesis serían médicamente útiles para el tratamiento de una serie de enfermedades diferentes. El mecanismo básico de la angiogénesis es el siguiente. En resumen, cuando surge un nuevo brote capilar del lateral de una vénula, células endoteliales degradan la membrana base, migran hacia la fuente angiogénica, proliferan, forman un lúmen, unen los extremos de dos brotes para generar un lazo capilar y fabrican nueva membrana base [J. Folkman, Perspectives in Biology and Medicine, Vol. 29, pág. 1-36 (1985)].

La degradación y remodelación de ECM son procesos esenciales para el mecanismo de angiogénesis. Adicionalmente, los componentes de ECM sintetizados por células endoteliales tales como colágenos, laminita, trombospondina, fibronectina y SPARC, actúan para regular el crecimiento celular endotelial, la migración y la forma [J. Bischoff, Trends Cell Biol., Nº 5, pág. 69-74 (1995)]. Las células endoteliales aórticas bovinas (BAE) sometidas a formación de brotes y tubos sintetizan colágeno de tipo I y SPARC. El colágeno de tipo I puede dirigir la migración y la formación de las células BAE [M.L. Iruela-Arispe, y col., Lab. Invest., Nº 64, pág. 174-186 (1991)]. Además, se descubrió que el colágeno exógeno de tipo I promueve la formación rápida de tubos mediante células endoteliales microvasculares dermales humanas [C.J. Jackson y K.L. Jenkins, Exp. Cell Res., Nº 192, pág. 319-323 (1991)]. Los tubos formados de este modo contenían fibrilos de colágeno en los espacios luminales, lo que sugiere que las células endoteliales usan los fibrilos para plegarse y alinearse en estructuras tubulares.

\newpage

El papel de los colágenos en la angiogénesis ha sido investigado por varios grupos. La inhibición metabólica de la síntesis de colágenos de tipo I y IV inhibe la formación capilar en el ensayo de membrana corioalantónica (CAM) (Maragoudakis, M.E. y col., Int. J. Radiat. Biol., Vol. 60, 54-9, 1991). Adicionalmente, se descubrió que la angiogénesis inducida experimentalmente sobre la CAM está asociada a la deposición de grandes cantidades de colágeno. La migración de células endoteliales desde explantes aórticos dentro de geles de colágeno está inhibida si se produce en presencia del análogo de prolina cis-hidroxiprolina, lo que indica una vez más la necesidad de síntesis de colágeno normal (Nicosia, R.F. y col., In Vitro Cell Dev. Biol., Vol. 27A, 961-6, 1991).

Estudios in vitro sugieren que la co-expresión de colágeno de tipo I y de proteína SPARC de unión a calcio (proteína segregada, ácida y rica en cisteína) se inicia cuando las células endoteliales aórticas bovinas BAEC sufren angiogénesis de formación de brotes (Iruela-Arispe, M.L. y col., Arterioscler. Thromb., Vol. 11, pág. 805-15, 1991). El colágeno de tipo VIII también es sintetizado durante la formación de brotes y se ha localizado en células endoteliales en proliferación dentro de cordones endoteliales. El examen histológico de angiogénesis normal, tumoral e inducida experimentalmente ha extendido la demostración de que los colágenos de tipo I y de tipo VIII se localizan dentro de cordones y tubos endoteliales (Kittelberger, R. y col., Connect. Tissue Res., Vol. 24, pág. 303-18, 1990). Se ha publicado que cuando las BAEC son expuestas a oligosacáridos de ácido hialurónico (HA) angiogénico, la síntesis de colágeno de tipo I se ve regulada al alza hasta en 4,5 veces, y la síntesis de colágeno de tipo VIII se ve aumentada en 5,8 veces en menos de 12 horas. Se cree que el colágeno de tipo I ayuda a la migración celular endotelial, mientras que se considera que el colágeno de tipo VIII está involucrado en la migración de células endoteliales y en la formación de tubos.

Además de la producción de colágeno, con el fin de extender un vaso sanguíneo capilar, deben producirse interacciones entre los componentes de ECM y las moléculas de la matriz del entorno, que proporcionan una estructura para los componentes de ECM del nuevo vaso [Brooks, P.C. y col., Cell, Vol. 79, pág. 1157-1164, (1994)]. La rotura de estas interacciones célula-matriz indujo apoptosis en células endoteliales humanas. También se encontró que la integrina \alpha_{2}\beta_{3}, que presentan una expresión potenciada en células vasculares angiogénicas, promueve una señal de supervivencia, ya que inhibidores de esta integrina provocaron la apoptosis no prefijada y la desintegración de vasos sanguíneos recién formados.

Con el fin de tratar las enfermedades relacionadas con la angiogénesis se están estudiando varios inhibidores del mecanismo de angiogénesis mencionado anteriormente, incluyendo el factor 4 de plaquetas, el derivado AGM 1470 de fumagilina, el Interferón \alpha_{2}a, la trombospondina, los esteroides angiostáticos y la angiostatina [J. Folkman, ver anterior, (1995); M.S. O'Reilly, y col., ver anterior (1994); V. Castle, y col., J. Clin. Invest., Vol. 87, pág. 1883-1888; D. Ingber, y col., Nature, Vol. 348, pág. 555-557]. Todos estos compuestos evaluados en la técnica anterior presentan desventajas. Por ejemplo, la endostatina y la angiostatina son proteínas, de tal modo que presentan todas las desventajas de las proteínas, incluyendo el requisito de ser administradas parenteralmente. Por lo tanto, un inhibidor no proteico que bloqueara selectivamente el mecanismo subyacente en la angiogénesis sin afectar adversamente a otras funciones fisiológicas, y que pudiera ser administrado por muchas rutas diferentes, sería extremadamente útil. Dichos inhibidores serían útiles para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades, tales como malignidades, que incluyen la angiogénesis como parte del proceso patológico.

Como se indicado previamente, la degradación y la remodelación de ECM son procesos esenciales para el mecanismo de angiogénesis. Dichos procesos incluyen las síntesis de una serie de componentes de ECM, tales como el colágeno. Se han examinado los efectos sobre la angiogénesis de una serie de moduladores del metabolismo de colágeno [Nakajima M. y col., Cancer Res., Vol. 9, pág. 1698-1706, 1989; Turpeenniemi-Hujanen, T. y col., J. Natl. Cancer Inst., Vol. 75, pág. 99-103, 1985; Monteagudo, C. y col., Amer. J. Pathol., Vol. 136, pág. 585-592, 1990]. Se indujo la regresión de capilares en crecimiento en embriones de pollo mediante análogos de prolina tales como el ácido L-azetidina-2-carboxílico, la cis-hidroxiprolina, la dL-3,4-deshidroxiprolina y la tioprolina. Estos compuestos y el a,a-dipiridilo, un inhibidor de la prolil hidroxilasa, interfieren todos en la formación de la triple hélice y previenen la deposición de colágeno. El \beta-amino-propionitrilo, un inhibidor del reticulamiento de colágeno, también fue anti-angiogénico, aunque el \beta-metil-d-xilósido, un inhibidor de la deposición de glicosaminoglicano, no presentó actividad anti-angiogénica [Herron, G.S. y col., J. Biol. Chem., Vol. 261, pág. 2814-2818, 1986; Reich, R. y col., Clin. and Exp. Metastasis, Vol. 13, pág. 134-140, 1995]. La administración conjunta de dosis sub-óptimas de moduladores de colágeno con esteroides angiostáticos y/o con heparina potenció la inhibición de la angiogénesis.

Además, los propios tumores, y en particular los tumores sólidos, dependen de la síntesis y deposición de colágeno para mantener un crecimiento y una progresión continuada, además del requisito de colágeno para angiogénesis para sostener el crecimiento tumoral. Los tumores sólidos están compuestos de dos compartimientos interdependientes: las propias células malignas y el estroma, que apoya el crecimiento tumoral mediante un aumento de la síntesis de ECM y de colágeno de tipo I (Folkman, J., Seminars in Cancer Biology, Vol. 3, pág. 56-71, 1992). El estroma es esencial para el crecimiento tumoral ya que apoya el suministro vascular requerido por los tumores para obtener nutrientes, para intercambiar gases y para eliminar desechos. La gran masa de estroma tumoral, en hasta un 90% de los casos, está compuesta por tejido conectivo intersticial. Este tejido incluye proteínas texturales tales como los colágenos intersticiales, que incluyen los tipos I y III de colágenos, fibrina, fibronectina, tenascina, elastina y proteoglicanos sulfatados (Dvorak, H.F., N. Eng. J. Med., Vol. 315, pág. 1650-1659, 1986; Yeo, T.K., "Tumor Stroma" en Diagnostic Immunopathology, editado por Colvin, R.B. y col., Raven Press, Nueva York, pág. 985-996). Se examinó el efecto sobre el crecimiento tumoral de los inhibidores generales de la formación de colágeno, y se descubrió que inhibían el crecimiento tumoral en ratones pero demostraron ser demasiado tóxicos para una administración segura a largo plazo. Por tanto, los inhibidores de síntesis y deposición de colágeno disponibles actualmente no son adecuados para el tratamiento de malignidades.

Adicionalmente, muchos otros inhibidores disponibles de la síntesis y deposición de colágeno, aunque no se han examinado sus efectos sobre la angiogénesis o sobre el crecimiento tumoral, generalmente no son deseables debido a que carecen de especificidad para el mecanismo metabólico del colágeno. Por tanto, muchos fármacos disponibles actualmente presentan efectos secundarios nocivos.

Por ejemplo, se han usado fármacos citotóxicos en un intento de frenar la proliferación de fibroplastos productores de colágeno [J.A. Casas, y col., Ann. Rhem. Dis., Vol. 46, pág. 763 (1987)], tales como la colquicina, que frena la secreción de colágeno a la matriz extracelular [D. Kershenobich, y col., N. Engl. J. Med., Vol. 318, pág. 1709 (1988)]. Otros fármacos actúan como inhibidores de enzimas clave en el metabolismo del colágeno [K. Karvonen, y col., J. Biol. Chem., Vol. 265, pág. 8414 (1990); C.J. Cunliffe, y col., J. Med. Chem., Vol. 35, pág. 2652 (1992)]. Sin embargo, ninguno de estos inhibidores presenta efectos específicos para el metabolismo y deposición de tipos específicos de colágeno. Asimismo, estos fármacos pueden interferir con la biosíntesis de otras moléculas colaginosas vitales, tales como Clq en el mecanismo clásico de complemento, acetilcolina esterasa de la placa final de la unión nuero-muscular, conglutinina y apoproteína tensioactiva pulmonar. Dicha interferencia y falta de especificidad podría tener efectos adversos potencialmente graves.

Otros fármacos que pueden inhibir la síntesis de colágeno, tales como la nifedipina o la fenitoína, inhiben también la síntesis de otras proteínas, bloqueando no específicamente de ese modo el mecanismo biosintético del colágeno [T. Salo, y col., J. Oral Pathol. Med., Vol. 19, pág. 404 (1990)]. Nuevamente, la falta de especificad reduce significativamente el uso clínico de estos fármacos, debido a que la inhibición no específica de la síntesis de proteínas puede dar como resultado efectos secundarios cuando se administra el fármaco al paciente.

De hecho, los fármacos anti-fibróticos disponibles clínicamente, que incluyen inhibidores de reticulamiento de colágeno tales como el \beta-amino-propionitrilo discutido previamente, tampoco son específicos. Desafortunadamente, la falta de especificidad de estos inhibidores de reticulamiento de colágeno finalmente da como resultado efectos secundarios severos después de un uso prolongado. Estos efectos secundarios incluyen el síndrome laterítico, así como una elastogénesis perjudicada. Este último efecto secundario es un resultado de la disrupción del reticulamiento de la elastina, otra proteína fibrosa de tejido conectivo. Adicionalmente, el efecto inhibidor de reticulamiento de colágeno de estos fármacos es secundario, de tal modo que el colágeno primero debe ser sobreproducido antes de la degradación por colagenasa. Por tanto, es evidente que se requiere un inhibidor de la síntesis del propio colágeno específico de un tipo.

Dicho inhibidor de la síntesis de colágeno específico de un tipo se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.449.678 para el tratamiento de determinadas afecciones fibróticas tales como el escleroderma y la Enfermedad de Implante contra Hospedante. Ambas afecciones están asociadas a una deposición excesiva de colágeno, que puede ser inhibida mediante Halofuginona. Este inhibidor específico es una composición con una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto farmacéuticamente activo de fórmula:

100

en el que:

n = 1 ó 2

R_{1} es un miembro del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, nitro, benzo, alquilo inferior, fenilo y alcoxi inferior;

R_{2} es un miembro del grupo que consiste en hidroxi, acetoxi y alcoxi inferior; y

R_{3} es un miembro del grupo que consiste en hidrógeno y alquenoxi-carbonilo inferior. De este grupo de compuestos, se ha descubierto que la Halofuginona es particularmente eficaz para dicho tratamiento.

La Solicitud de Patente Internacional Nº WO-96/06.616 describe además que estos compuestos son capaces de tratar eficazmente la restenosis previniendo la proliferación de células vasculares de músculo liso. La restenosis se caracteriza por la proliferación de células de músculo liso y por la acumulación de matriz extracelular dentro del lúmen de los vasos sanguíneos afectados en respuesta a una lesión vascular [Choi y col., Arch. Surg., Vol. 130, pág. 257-261 (1995)]. Un indicio de dicha proliferación de células de músculo liso es una alteración fenotípica, desde un fenotipo contráctil normal a uno sintético. Se ha demostrado que el colágeno de tipo I apoya dicha alteración fenotípica, que se puede bloquear mediante Halofuginona [Choi y col., Arch. Surg., Vol. 130, pág. 257-261 (1995); Solicitud de Patente PCT Nº 96/06.616]. Por tanto, la Halofuginona puede evitar que dicha rediferenciación anormal de células de músculo liso altere una lesión vascular mediante el bloqueo de la síntesis de colágeno de tipo I. Otros estudios in vitro muestran que la Halofuginona también puede inhibir la proliferación de células de fibroblasto 3T3 [Patente de EE.UU. Nº 5.449.678].

La Solicitud de Patente Internacional Nº WO-97/06.805 describe que las composiciones que comprenden quinazolinona de la fórmula general I, incluyendo halofuginona, inhiben varias enzimas que participan en la neovascularización, mostrando en estudios in vitro que la halfuginona inhibe la proliferación de células vasculares endoteliales y de células de músculo liso, así como la síntesis de colágeno y la formación de ECM sub-endotelial, que son esenciales para la formación de tubos en microvasos.

Sin embargo, la acción in vitro de la Halofuginona no siempre predice sus efectos in vivo. Por ejemplo, la Halofuginona inhibe la síntesis de colágeno de tipo I en condrocitos de hueso in vitro, tal como se demuestra en la Patente de EE.UU. Nº 5.449.678. Sin embargo, no se observó que los pollos tratados con Halofuginona tuvieran una tasa aumentada de rotura ósea, lo que indica que el efecto no se observa in vivo. Por tanto, el comportamiento exacto de la Halofuginona in vivo no siempre puede predecirse a partir de estudios in vitro.

Adicionalmente, en la técnica anterior se desconoce la capacidad de la Halofuginona o de otras quinolinonas relacionadas para bloquear o para inhibir los procesos fisiológicos relacionados con el crecimiento y la progresión tumorales. Aunque se ha demostrado que la Halofuginona tiene un efecto inhibidor específico sobre la síntesis de colágeno de tipo I, no se ha demostrado previamente que dicha inhibición frene o detenga la progresión tumoral, particularmente in vivo. De hecho, la inhibición específica del mecanismo únicamente de la angiogénesis no se ha empleado clínicamente de forma habitual para el tratamiento de malignidades.

La mayoría de las estrategias clínicamente disponibles para el tratamiento de malignidades se centran en las terapias citotóxicas, tales como los tratamientos de quimioterapia o de radiación, con el fin de matar células activamente en proliferación. Desafortunadamente, estas terapias no son capaces de inducir específicamente la apoptosis en células tumorales, sino simplemente matando todas las células que se encuentran activamente en proliferación. Sin embargo, la inducción específica de la apoptosis es claramente un importante mecanismo para matar selectivamente células cancerosas sin provocar una toxicidad celular indiscriminada. Por tanto, es evidente que para el tratamiento de malignidades serían muy útiles las medicaciones que provoquen apoptosis.

El tratamiento de malignidades, que incluye la inhibición del crecimiento tumoral primario, la progresión tumoral y la metástasis, podría por tanto actuar potencialmente inhibiendo, o afectando, a una serie de mecanismos diferentes requeridos para el crecimiento tumoral y la metástasis. Estos mecanismos, tal como se ha descrito previamente, incluyen la angiogénesis, la deposición de colágeno y la ausencia de apoptosis normal. Desafortunadamente, los tratamientos actualmente disponibles para las malignidades se centran en la citotoxicidad, más que en la inhibición de uno cualquiera de dichos mecanismos. Desde luego, ninguno de los tratamientos actualmente disponibles es capaz de inhibir todos estos mecanismos.

Por tanto, existe una necesidad no cubierta ampliamente reconocida por obtener un inhibidor del crecimiento, progresión y metástasis de tumores, que sea particularmente eficaz in vivo, sustancialmente sin afectar de forma negativa a otros procesos fisiológicos, y que sea capaz de inhibir la angiogénesis.

Resumen de la invención

Inesperadamente, se ha descubierto, tal como se describe en los ejemplos mostrados más adelante, que la Halofuginona también puede frenar o detener la progresión tumoral in vivo. Sin querer limitarnos a una hipótesis particular, la Halofuginona puede actuar a través de una serie de mecanismos diferentes. Por ejemplo, la Halofuginona puede actuar inhibiendo la angiogénesis, mediante el bloqueo de la deposición de ECM, inhibiendo la actividad de colagenasa de tipo IV, induciendo la apoptosis o inhibiendo la expresión de gen H19, o posiblemente a través de una combinación de estos mecanismos, aunque también podría ser responsable otro/s mecanismo/s. Sin embargo, no es deseable que se limite a un único mecanismo, ni es necesario ya que los datos in vivo presentados a continuación demuestran con claridad la eficacia de la Halofuginona como inhibidor de la progresión tumoral in vivo.

De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona el uso de Halofuginona y de sales farmacéuticamente aceptables de la misma para preparar un medicamento para tratar un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, adenocarcinoma de colon, próstata o páncreas, carcinoma de células escamosas de la cerviz, cáncer de ovario, histiocitoma fibroso maligno, cáncer de piel, astrocitoma, glioma y carcinoma hepatocelular.

De acuerdo con otra realización de la presente invención, se proporciona el uso de Halofuginona y de sales farmacéuticamente aceptables de la misma para preparar un medicamento para inhibir la proliferación celular posibilitada por una deposición de una matriz extracelular en un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, adenocarcinoma de colon, próstata o páncreas, carcinoma de células escamosas de cerviz, cáncer de ovario, histiocitoma fibroso maligno, cáncer de piel, astrocitoma, glioma y carcinoma hepatocelular.

De acuerdo con otra realización adicional de la presente invención, se proporciona el uso de Halofuginona y de sales farmacéuticamente aceptables de la misma para preparar un medicamento para inhibir la metástasis en un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, adenocarcinoma de colon, próstata o páncreas, carcinoma de células escamosas de cerviz, cáncer de ovario, histiocitoma fibroso maligno, cáncer de piel, astrocitoma, glioma y carcinoma hepatocelular.

Más preferiblemente, dicho cáncer de mama es carcinoma infiltrante de conducto de mama. Alternativa y más preferiblemente, dicho cáncer de vejiga es carcinoma de vejiga. También alternativa y más preferiblemente, dicho cáncer de piel es melanoma maligno.

Para todas las anteriores realizaciones, preferiblemente dicho compuesto es Halofuginona y sales farmacéuticamente aceptables de la misma.

De aquí en adelante, el término "Halofuginona" se define como un compuesto que presenta la fórmula:

1

y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. La composición incluye preferiblemente un vehículo farmacéuticamente aceptable para el compuesto.

Preferiblemente, todos los compuestos referidos anteriormente pueden ser el propio compuesto descrito por la fórmula, y/o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Breve descripción de las figuras

La invención se describe, únicamente a modo de ejemplo, haciendo referencia a las figuras anexas, en las que:

Las Figuras 1A-1L ilustran la inhibición del crecimiento tumoral in vivo, de cinco tumores diferentes en siete modelos diferentes de cáncer en ratones o ratas, mediante el uso de Halofuginona;

Las Figuras 2A y 2B ilustran el efecto de la Halofuginona en la incorporación de ^{3}H-timidina y en la proliferación de células tumorales de leiomiosarcoma humano;

La Figura 3 ilustra la inhibición dependiente de dosis de la actividad de colagenasa de tipo IV en cultivos de células de carcinoma de vejiga T50 en presencia de Halofuginona;

La Figura 4 ilustra la inhibición de la expresión del gen H19 en las líneas celulares RT112 y 5376 de carcinoma de vejiga por la Halofuginona;

Las Figuras 5A y 5B ilustran la inducción de apoptosis en secciones derivadas de la periferia de tumores de vejiga después de la administración de Halofuginona;

Las Figuras 6A-6D muestran la inducción de apoptosis en secciones tomadas del centro de tumores después de la administración de Halofuginona;

Las Figuras 7A-7D ilustran la inhibición de la proliferación de células tumorales mediante Halofuginona;

Las Figuras 8A y 8B muestran el efecto de la Halofuginona sobre la incorporación de ^{3}H-timidina en células endoteliales aórticas bovinas mantenidas en cultivo, en ausencia o en presencia de factor de crecimiento de fibroblasto bovino (vFGF);

Las Figuras 9A y 9B ilustran el efecto inhibidor de la Halofuginona sobre la organización de células endoteliales aórticas bovinas para formar entramados capilares;

Las Figuras 10A y 10B ilustran gráficamente el efecto inhibidor de la Halofuginona sobre la formación de microvasos a partir de anillos aórticos de rata empapados en gel de colágeno de tipo I;

La Figura 11 es una curva dosis-respuesta del efecto inhibidor de la Halofuginona sobre la formación de microvasos, usando los anillos aórticos de rata empapados en colágeno de tipo I de las Figuras 10A y 10B;

La Figura 12 demuestra la reversibilidad del efecto inhibidor de la Halofuginona;

La Figura 13 muestra el efecto de la Halofuginona sobre la incorporación de sulfato en ECM endotelial con células endoteliales corneales bovinas;

Las Figuras 14A-14D comparan el efecto de la Halofuginona sobre la incorporación sulfato, prolina, lisina y glicina en ECM mediante células endoteliales corneales bovinas;

Las Figuras 15A-15D ilustran el efecto de la Halofuginona sobre la incorporación de sulfato y de glicina en ECM de células mensengiales de rata;

Las Figuras 16A-16F ilustran el efecto inhibidor de la Halofuginona sobre la neovascularización in vivo en los ojos de ratones;

La Figura 17 muestra un análisis de transferencia Northern con el efecto de la Halofuginona sobre la expresión en cadena de Integrina \alpha_{v}; y

La Figura 18 muestra el efecto de la Halofuginona sobre la expresión de subunidad \beta determinada mediante RT-PCR.

Breve descripción de la invención

La Halofuginona, y por extensión los derivados de quinazolinona relacionados descritos y reivindicados en la Patente de EE.UU. 3.320.124, inhiben el crecimiento, la progresión y la metástasis de tumores a través de una serie de mecanismos inhibidores distintos, denominados de aquí en adelante "panstasis". Estos mecanismos incluyen, aunque sin limitación, la inhibición de la angiogénesis, la prevención de la deposición de ECM, la inhibición de la actividad de colagenasa de tipo IV, la inhibición de la expresión de integrina, la inducción de apoptosis y la inhibición de la expresión de gen H19.

Con respecto a las dianas específicas de estos mecanismos, la angiogénesis y la deposición de ECM han sido descritas previamente. La colagenasa de tipo IV es un enzima metaloproteasa pivotal implicada en la metástasis y en la invasión celular. La apoptosis en la muerte celular programada que, como se ha indicado previamente, está bloqueada en las células malignas, que por lo tanto también se describen como "inmortales". El gen H19 es un gen marcador de tumor asociado a las etapas tempranas del carcinoma de vejiga. Más específicamente, el gen H19 es un gen regulado por desarrollo cuya expresión alcanza el máximo durante el desarrollo fetal cuando se produce la diferenciación de tejidos. Las anormalidades cromosomales en la región que contiene al H19 están asociadas a las etapas tempranas de malignidades tales como el tumor de Wilm, el carcinoma adrenocortical, el hepatoblastoma, el rabdomiosarcoma, los tumores de pulmón, los tumores trofoblásticos y el carcinoma de vejiga [B. Tycko, Am. J. Path., Vol. 144, pág. 431-439, 1994; de Groot, N. y col., Trophoblast Res., Vol. 8, pág. 2285-2302, 1994; Rachmilewitz, J. y col., Oncogene, Vol. 11, pág. 863-870, 1995].

La importancia de la panstasis es que el mecanismo de acción de la Halofuginona incluye muchas actividades citostáticas diferentes, sin ser activamente citotóxica. Es menos probable que dichas actividades citostáticas induzcan resistencia a fármaco y también es menos probable que produzcan efectos secundarios adversos afectando a células no cancerosas. Por tanto, la Halofuginona se puede diferenciar de las terapias actualmente disponibles para el cáncer, que son activamente citotóxicas.

Descripción de las realizaciones preferidas

Inesperadamente se ha descubierto, tal como se describe en los ejemplos mostrados más adelante, que la Halofuginona también puede frenar o detener la progresión tumoral in vivo. Independientemente del mecanismo específico, los datos presentados a continuación demuestran claramente la eficacia de la Halofuginona in vivo en la inhibición de la progresión tumoral.

Dicho descubrimiento es inesperado por tres razones. En primer lugar, el comportamiento de la Halofuginona in vitro no se corresponde exactamente con su comportamiento in vivo. Esto puede demostrarse mediante el efecto diferencial de la Halofuginona observado en condrocitos óseos in vivo e in vitro. La Halofuginona inhibe la síntesis de colágeno de tipo I en condrocitos in vitro, tal como se demuestra en la Patente de EE.UU. Nº 5.449.678. Sin embargo, en pollos tratados con Halofuginona no se observó que hubiera un aumento en la tasa de roturas óseas, lo que indica que el efecto no se da in vivo. Por tanto, el comportamiento exacto de la Halofuginona in vivo no siempre puede predecirse a partir de estudios in vitro.

En segundo lugar, los únicos ejemplos conocidos previamente de la inhibición de la proliferación celular por Halofuginona implican células de músculo liso que habían sido alteradas fenotípicamente en respuesta a una lesión vascular, o fibroblastos 3T3 [Solicitud PCT Nº 96/06.616 y Choi y col., Arch. Surg., Vol. 130, pág. 257-261 (1995)]. Dichas células simplemente proliferaron sin organización. Por el contrario, la angiogénesis implica la formación estructuras vasculares altamente organizadas. Por tanto, el descubrimiento de que la Halofuginona puede inhibir dicha angiogénesis es tanto novedoso como no obvio.

Además, los ejemplos presentados más adelante demuestran claramente que la Halofuginona también es efectiva en la inhibición de la proliferación celular posibilitada por la deposición de una matriz extracelular, tanto in vivo como in vitro. La inhibición específica de la deposición de colágeno no se ha demostrado con anterioridad, particularmente in vivo.

Además, los datos presentados en la presente memoria también demuestran que la Halofuginona es un inhibidor eficaz de la actividad de colagenasa de tipo IV, de la expresión de gen marcador de tumor y de la inhibición de la expresión de integrina. Los datos también demuestran que la Halofuginona es capaz de inducir la apoptosis de células tumorales. Estos efectos de la Halofuginona no habían sido demostrados antes.

Por tanto, nada en la técnica anterior enseñaba o sugería que la Halofuginona sería útil en el tratamiento de malignidades in vivo. Además, la capacidad de la Halofuginona, y de compuestos relacionados, para frenar o detener la progresión tumoral, para inhibir la proliferación celular posibilitada por la deposición de una matriz extracelular, para inhibir la actividad de colagenasa de tipo IV, para inhibir la expresión de integrina y para inducir apoptosis, es a la vez novedosa y no obvia. La demostración de dicha capacidad in vivo es particularmente inesperada, dadas las respuestas diferenciales observadas in vitro e in vivo para la Halofuginona.

Aunque la invención se describirá ahora en relación a determinadas realizaciones preferidas en las siguientes figuras y ejemplos de tal modo que los aspectos de la misma puedan ser comprendidos y apreciados con mayor plenitud, la invención no pretende quedar limitada a dichas realizaciones particulares. Al contrario, todas las alternativas, modificaciones y equivalentes quedan incluidos dentro del alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones anexas. De este modo, las siguientes figuras y ejemplos que incluyen realizaciones preferidas servirán para ilustrar la práctica de esta invención, entendiéndose que los particulares mostrados son únicamente a modo de ejemplo y para propósito de una discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente invención, y se presentan para proporcionar la que se considera la descripción más útil y fácilmente entendible de procedimientos de formulación, así como de principios y aspectos conceptuales de la invención.

La presente invención puede ser comprendida con mayor facilidad en referencia a los siguientes ejemplos y figuras ilustrativos. Cabe resaltar que aunque se haga referencia exclusivamente a la Halofuginona, se cree que los demás derivados de quinazolinona descritos y reivindicados en la Patente de EE.UU. 3.320.124, cuyo contenido se incorpora a la presente memoria a modo de referencia, presentan propiedades similares.

Ejemplo 1 Inhibición del Crecimiento Tumoral in vivo en Ratones o Ratas mediante Halofuginona

La inhibición del crecimiento de cinco tipos diferentes de tumores, de origen de ratón, de rata y humano, se examinó in vivo en tres cepas diferentes de ratones, C3H, CD1-un atímicos y ratones C57BL/6, y en la cepa Fischer de ratas. Se administró carcinoma T50 de vejiga a ratones C3H. Además, se indujo carcinoma de vejiga in situ en ratones C3H mediante la adición de N-butil-N-4-hidroxibutil nitrosamina al agua de bebida de estos ratones. Se inocularon ratones C57BL/6 con células de sarcoma EHS. Los ratones nude fueron inoculados con MDA435, que es una variante agresiva del carcinoma de mama MCF-7; o melanoma. Las ratas Fischer fueron inyectadas estereotácticamente en el cerebro con una suspensión de 1x10^{5} células de histocitoma fibroso maligno. Inesperadamente, se demostró que la Halofuginona tenía un significativo efecto inhibidor sobre el crecimiento y la progresión de los tumores en estos tres modelos in vivo.

Inhibición de Carcinoma T50 de Vejiga mediante Halofuginona

Para el primer experimento, en que se inocularon ratones C3H con células de carcinoma T50 de vejiga, los ratones C3H fueron divididos en dos grupos de 6 ratones cada uno. El grupo experimental recibió una dieta que contenía 10 mg/Kg ó 5 mg/Kg de Halofuginona 3 días antes de la inyección de las células de carcinoma T50 de vejiga y durante 2 semanas después. Las células T50 cultivadas, una variante más agresiva del carcinoma MBT2 de vejiga de ratón inducido químicamente, fueron disociadas con tripsina/EDTA en una única suspensión celular (10^{6} células/mL) en medio de crecimiento e inoculadas s.c. en dos zonas de los dorsos de los ratones. El costado derecho recibió 0,4x10^{5} células, y el costado izquierdo recibió 2x10^{5} células. Se estimó el tamaño del tumor midiendo la longitud tumoral en dos direcciones, usando la fórmula V = LW^{2}/2, en donde V es el volumen, L es la longitud y W es la anchura. Al final del experimento en la jornada 17, los ratones fueron pesados, se extrajeron los tumores y se fijó y procesó una muestra de tejido tumoral para examen histológico. Los resultados cuantitativos del experimento se muestran en las Figuras 1A y 1B, y en la Tabla 1 para la dosis de 5 mg/Kg. En la Figura 11 se muestra una fotografía de ejemplos de ratones con carcinoma de vejiga que no fueron tratados (parte superior) y que fueron tratados (parte inferior) con Halofuginona. En la Figura 1C se muestran tumores representativos para las dosis de 5 mg/Kg y 10 mg/Kg. La Tabla 2 muestra una comparación entre la dosis de 5 mg/Kg y la dosis de 10 mg/Kg de Halofuginona.

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El tamaño de tumor de T50 en ratones C3H que fueron alimentados con 5 mg/Kg de Halofuginona se vio reducido significativamente, aproximadamente en un 70-80%, en comparación con los ratones de control mantenidos con una dieta normal, tal como se muestra en las Figuras 1A y 1B. El efecto antitumoral de la Halofuginona se observó tanto para la dosis alta de células tumorales, con un volumen de 5,0 \pm 3,07 cm^{3} para los ratones de control y de 1,0 \pm 0,92 cm^{3} para la dieta que contenía Halofuginona, como para la dosis baja de células tumorales, con un volumen de 1,63 \pm 0,98 cm^{3} para los ratones de control y de 0,29 \pm 0,28 cm^{3} para los ratones alimentados con Halofuginona. Además, el peso global de los ratones C3H tratados con Halofuginona fue inferior al peso de los ratones no tratados, 24 \pm 3,1 g y 40 \pm 3,8 g, respectivamente, debido a la menor carga tumoral. En la Tabla 1 se muestran los datos correspondientes a todos los ratones para 5 mg/Kg.

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Se produjo un mayor efecto inhibidor cuando la Halofuginona se administró en una dosis de 10 mg/Kg de la dieta, tal como se muestra en la Tabla 2 y en la Figura 1C.

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Se obtuvieron resultados similares cuando los tumores fueron extraídos y pesados. Estos resultados ilustran claramente la dependencia con la dosis del efecto de Halofuginona contra malignidades.

La Halofuginona se administró a continuación después de la inoculación del tumor de carcinoma T50 de vejiga primario, para determinar si la Halofuginona todavía es capaz de inhibir el crecimiento y la progresión del tumor. Para este fin, se inyectaron 1 x 10^{5} células de carcinoma de vejiga s.c. (subcutáneamente) y los ratones se mantuvieron con una dieta normal hasta que apareció el tumor y alcanzó un tamaño de aproximadamente 0,3 cm de diámetro, que requirió aproximadamente 8-10 días. A continuación los ratones fueron alimentados con una dieta que contenía 5 mg/Kg de Halofuginona y se midió el tamaño del tumor en los días 18 y 24 después de la inoculación tumoral. Como se demuestra en las Figuras 1D y 1E, el crecimiento tumoral se suprimió por efecto de la Halofuginona incluso cuando se administró 8-10 días después de la inyección de las células tumorales. De hecho, la inhibición del crecimiento tumoral en este grupo fue similar a la obtenida cuando la Halofuginona se administró 2 días antes de la inoculación de células tumorales (0,99 \pm 0,55 cm^{3} y 0,59 \pm 0,43 cm^{3}, respectivamente, n = 8). El tamaño tumoral del grupo sin tratar fue de 4,78 \pm 1,87 cm^{3} (Figura 1E).

Además, la Halofuginona se administró i.p. en la cantidad de 1 \mug por ratón y día, comenzando el día de la inyección de células tumorales. Se obtuvo una profunda inhibición del crecimiento tumoral en la jornada 18 (0,55 \pm 0,28 cm^{3} frente a 2,09 \pm 0,86 cm^{3}, en los ratones tratados frente a los de control, n = 8) (Figura 1D), mientras que sólo se observó aproximadamente un 50% de reducción en el tamaño tumoral en la jornada 24 (Figura 1E). El experimento finalizó en la jornada 27 tras la inoculación de células tumorales. En ese momento, únicamente el 25% de los ratones de control permaneció vivo en comparación con el 63% y el 71% de los ratones que fueron tratados con Halofuginona administrada oralmente ó i.p., respectivamente. El efecto de supervivencia de la Halofuginona administrada en la dieta que comenzó después de la aparición del tumor fue menos pronunciado (únicamente el 38% de los ratones permaneció viable).

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Inhibición de Cáncer de Vejiga in situ mediante Halofuginona

En el segundo experimento, en el que se indujo carcinoma de vejiga in situ en ratones C3H, los ratones C3H fueron divididos en dos grupos de seis ratones cada uno. Ambos grupos recibieron BHBN al 0,05% (N-butil-N-4-hidroxibutil nitrosamina) a través de su agua de bebida para inducir el carcinoma, imitando con ello el desarrollo de cáncer de vejiga en humanos. El grupo experimental de ratones recibió una dieta que contenía 5 mg/Kg de Halofuginona, mientras que el grupo de control (n = 6) recibió un 0,05% de BHBN y fueron alimentados con una dieta normal. Después de 26 semanas, los ratones fueron pesados, los tumores fueron extraídos y se fijó y procesó una muestra de tejido tumoral para examen histológico. Los resultados del experimento se muestran en las Figuras 1F y 1G.

La diferencia de tamaño entre los tumores se demuestra en las secciones histológicas teñidas con hematoxilina y eosina, y presentadas en las Figuras 1Fa (ratones de control) y 1Fb (ratones tratados con Halofuginona). En el grupo de control, en todos los ratones se observaron todas las etapas características de la progresión de tumor de vejiga (displasia, carcinoma in situ, carcinoma invasivo), con una invasión masiva de células tumorales a través de la capa epitelial, de la membrana de base y de la cápsula de la vejiga (Figura 1G, A1 y A2). Por el contrario, en los ratones tratados con Halofuginona sólo fueron evidentes las primeras etapas de la tumorigénesis (es decir, la displasia). La invasión de células locales a través de la membrana base sólo se observó en un caso sin penetración de la cápsula de la vejiga (Figura 1G, B1 y B2). El peso de los ratones tratados con Halofuginona durante las 26 semanas fue un 20-30% inferior al peso de los ratones del grupo de control, posiblemente debido al exceso de peso del propio tumor en el grupo de control.

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Inhibición de Tumores EHS mediante Halofuginona

Para el tercer experimento, se inocularon ratones C57BL/6 con tumores Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). El método experimental fue el siguiente. En primer lugar, se sacrificaron otros animales que portaban tumores EHS y el tejido tumoral fue extraído y picado en condiciones asépticas. El tumor EHS se caracteriza por una gran cantidad de componentes de membrana de base. Se inyectó subcutáneamente una suspensión del tejido tumoral en 0,2 mL de PBS en la región dorsal posterior de ratones C57BL/6 macho. Los ratones fueron divididos en dos grupos de 10 ratones cada uno. Los animales del grupo experimental fueron alimentados con una dieta que contenía 5 mg/Kg de Halofuginona durante 3 días antes de la inyección tumoral y durante 3 semanas después. Se estimó el tamaño tumoral midiendo la longitud tumoral en dos direcciones, usando la fórmula V = LW^{2}/2. En el último día del experimento, es decir, 20 días después de la inyección de tumor, los ratones fueron pesados, los tumores fueron extraídos y una muestra del tejido tumoral se fijó y se procesó para examen histológico. Los resultados cuantitativos del experimento se muestran en la Figura 1H y en la Tabla 3.

El tamaño tumoral en ratones C57BL/6 que fueron alimentados con Halofuginona se redujo en aproximadamente un 75% en comparación con los ratones de control, con volúmenes de 1,72 \pm 1,85 cm^{3} y de 8,15 \pm 4,88 cm^{3}, respectivamente, tal como se muestra en la Figura 1H. El efecto antitumoral de la Halofuginona se reflejó en el peso casi normal de los ratones alimentados con Halofuginona, 19,7 \pm 0,47 g, en contraposición al peso aproximadamente 1,6 veces superior de los ratones de control, 33,3 \pm 2,49 g, debido a la carga del tumor. Los datos correspondientes a todos los ratones se muestran en la Tabla 3.

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Inhibición de Carcinoma de Mama por Halofuginona

Para el cuarto experimento, se inocularon s.c. 1x10^{6} células de carcinoma de mama humanas altamente agresivas (MDA435, una variante agresiva de la línea celular no metastática MCF-7 de carcinoma de mama) por ratón a ratones nude. El grupo de estudio (n = 4) recibió 5 mg/Kg de Halofuginona en la dieta mientras que el grupo de control (n = 4) se mantuvo con una dieta regular. En 4-5 semanas aparecieron tumores visibles, los ratones fueron sacrificados después de 15 semanas y los tumores fueron extraídos y pesados. A pesar de la alta variabilidad dentro de cada grupo, había una reducción significativa (p < 0,024) en el peso tumoral en los ratones tratados con Halofuginona (0,14 \pm 0,11 g) frente a los ratones de control no tratados (0,65 \pm 0,45 g).

En otro experimento, se administró Halofuginona i.p. en una cantidad de 1 \mug por ratón, cada dos días. En este experimento se inyectaron ratones CD1-un atímicos hembra con la línea celular no metastática madre MCF-7 dependiente de estrógeno de carcinoma de mama humano. Las células fueron implantadas en las almohadillas mamarias de los ratones con una concentración de 1 x 10^{7} células/0,5 mL. Todos los animales fueron implantados con partículas de liberación lenta de 17 \beta-estradiol (0,72 mg/partícula, liberación en 60 días; Innovation Research of America). Cuando los tumores de los ratones de control alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 1 cm^{3} (aproximadamente 10 semanas después de la implantación), los tumores fueron extraídos (Figura 1J). La apariencia de los ratones de control y de los ratones tratados con Halofuginona oral se presenta en la Figura 1K.

Inhibición de Tumores de Melanoma por Halofuginona

Para el quinto experimento, se inocularon ratones nude con tumores de melanoma. El método experimental fue el siguiente. En primer lugar, se inyectó subcutáneamente una suspensión de 10^{6} células tumorales en la región dorsal posterior de ratones nude. Los ratones fueron divididos en dos grupos de cinco ratones cada uno. Los animales del grupo experimental fueron inyectados i.p. con 1 \mug de Halofuginona por ratón cada dos días, comenzando una semana antes de la inoculación con el tumor y durante las siguientes cuatro semanas después de la inoculación. Los ratones de control fueron inyectados con disolución salina. Los resultados se muestran como una fotografía en la Figura 1L.

Se observaron grandes tumores negros superficiales de melanoma en todos los ratones del grupo de control (-H). En el grupo tratado con Halofuginona (+H), todos los ratones presentaron tumores significativamente más pequeños que no habían alcanzado la etapa de tumor negro superficial de melanoma. Por tanto, se logró una inhibición significativa del crecimiento tumoral en ratones tratados con Halofuginona en comparación con los ratones de control, que no recibieron Halofuginona.

Inhibición de Tumores Cerebrales mediante Halofuginona

Para el sexto experimento, se inocularon ratas Fischer con tumores cerebrales. Puesto que el peso molecular de la Halofuginona es bajo, y la Halofuginona es hidrofóbica, era de esperar que la molécula fuera capaz de penetrar en la barrera cerebro sangre (BBB), suposición que quedó confirmada por los resultados experimentales. A pesar de la preocupación de que la BBB perjudicara a la entrada de la quimioterapia, esta barrera se ve afectada selectivamente en la zona de la lesión maligna, y por lo tanto el tumor recibirá mayores dosis de la quimioterapia administrada sistémicamente que el cerebro normal adyacente. Sin embargo, tanto en estudios con animales como con humanos, la mayoría de los agentes son más eficaces contra tumores sistémicos que contra metástasis en el cerebro. Probablemente esto está relacionado con un influjo inadecuado y lento de los compuestos hacia los tumores cerebrales, con una salida de flujo sanguíneo reducida y una presión intersticial aumentada como resultado de la formación de edemas y de un aumento en la presión intracraneal.

El tumor cerebral evaluado fue una línea tumoral de rata no seleccionada de un histocitoma fibroso maligno inducido por metilcolantreno, mantenido en ratas Fischer singénicas mediante transplantes subcutáneos en serie. Para la inoculación cerebral estereotáctica, se inyectó la suspensión celular en el hemisferio cerebral derecho de ratas Fischer hembra adultas (que pesaban 180-200 g), usando un pequeño aparato estereotáctico para animales. Tomando bregma como punto de referencia cero, las coordenadas estereotácticas fueron: P = 3,5; L = 2; H = -4 mm. La cabeza se sujetó en posición horizontal y el volumen de inyección fue de 2 \muL. El número de células tumorales inyectadas por rata fue 10^{5}.

Diez ratas recibieron una inyección diaria intraperitoneal de Halofuginona (16 \mug/rata) comenzando dos días antes de la inoculación de las células tumorales. Empezando en la jornada 4 después de la inoculación, se administraron 5 mg/Kg de Halofuginona en la dieta en lugar de i.p. Los animales de control recibieron inyecciones i.p. de disolución salina y dieta normal. En las jornadas 9, 11, 13 y 15 después de la inyección estereotáctica de las células tumorales, dos de los animales de cada grupo fueron sacrificados mediante una sobredosis de pentobarbital. La masa tumoral visible fue pesada y el cerebro fue rápidamente extraído, colocado en una cámara de corte y cortado en secciones coronales de 3 mm de espesor. La masa tumoral visible fue pesada y medida en tres dimensiones. Los tumores de dos animales de cada grupo fueron procesados para examen patológico.

Se observó una disminución más pronunciada del tamaño tumoral en todas las ratas tratadas con Halofuginona en comparación con los animales no tratados. De hecho, en 4 de cada 8 ratas tratadas con Halofuginona casi no había tumor visible (1-8 mm^{3}) en comparación con todos los diez animales de control que presentaban tumores que oscilaban en tamaño entre 80 mm^{3} (día 9) y 260 mm^{3} (día 13) (Tabla 4). El efecto antitumoral de la Halofuginona también se reflejó en la muerte de las dos ratas no tratadas durante 15 días en comparación con las ratas tratadas, que permanecieron viables.

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Estos seis experimentos separados, llevados a cabo tanto en ratas como en ratones, muestran que la Halofuginona es capaz de inhibir el crecimiento y la progresión de tumores in vivo para una amplia variedad de malignidades, que incluyen el carcinoma de vejiga, el cáncer de mama, el melanoma, el sarcoma EHS y los tumores cerebrales. La capacidad de la Halofuginona para inhibir el crecimiento y la progresión de tumores cerebrales es particularmente prometedora, puesto que la barrera sangre-cerebro limita la penetración de muchos fármacos anti-neoplásticos en el cerebro. La administración de Halofuginona durante periodos de tiempo relativamente largos, tal como 26 semanas para el experimento de cáncer de vejiga in situ en ratones, no provocó un aumento de la mortandad. Por tanto, la Halofuginona representa un tratamiento eficaz y seguro para una amplia variedad de cánceres, un resultado que no se conocía ni se sugería en la técnica anterior.

Ejemplo 2 Efecto de la Halofuginona sobre la Proliferación de Células Tumorales de Leiomiosarcoma Humano

Se investigó el efecto de la Halofuginona sobre la proliferación de células tumorales de leiomiosarcoma humano. Los tumores de leiomiosarcoma tienen una matriz extracelular abundante y también se encuentran bien vascularizados [A. Ferenczy, y col., Cancer, Nº 28, pág. 1004-1018 (1971)]. Se cree que su crecimiento es dependiente de factores de crecimiento (es decir, bFGF, HB-EGF) producidos en células normales y miometriales malignas [A. Zhang, y col., Endocrinology, Nº 134, pág. 1089-1094 (1994); R.S. Mangrulker, y col., Biology of Reproduction, Nº 53, pág. 636-646 (1995)] y localmente embebidas en ECM del entorno [I. Vlodavsky, y col., Basement Membranes: Cellular and Molecular Aspects, D.H. Rohrbach y R. Timpl, Editores, Academic Press, Inc., Orlando, Florida, EE.UU., pág. 327-343 (1993)].

Se obtuvieron muestras de tumores de leiomiosarcoma humano de mujeres que habían sido sometidas a histerectomía quirúrgica, tal como se ha descrito [R.S. Mangrulker, y col., ver anterior]. Se colocó tejido picado en 20 mL de tampón de homogeneización frío: NaCl 1 M, Tris 10 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM, benzamidina 1 mM, CHAPS al 0,1%, Aprotinina al 0,01% (Sigma), 10 \mug/mL de leupeptina, AEBSF 1 mM [R.S. Mangrulker, y col., ver anterior]. Las muestras se homogeneizaron durante 2 minutos y se centrifugaron a 12.000 x g durante 60 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes fueron diluidos 1:5 con Tris 10 mM (pH 7,4) hasta un volumen final de 100 mL y fueron filtrados con filtros de nylon de 0,45 \mum. Las células se dispusieron en placas y se mantuvieron en DMEM más un 10% de suero de ternero. Las células permanecieron viables por encima de un número de pasajes, pero fueron usadas en los pasajes 2 ó 3.

Para los ensayos de proliferación, las células fueron colocadas en placas de 96 pocillos a 10.000 células/pocillo en 200 \muL de medio (DMEM con 4,5 g/L de glucosa, 10% de suero de ternero, 1% de glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina) y se incubaron 2 días hasta confluencia. 24 horas después de la siembra, se añadieron concentraciones crecientes de Halofuginona (10-100 ng/mL). El medio se cambió a DMEM con un 0,5% de suero de ternero, insulina 1 \muM y transferina 5 \muM. Después de 24 horas, las muestras (5-10 \muL) fueron añadidas y después de otras 24 h adicionales, se añadió [^{3}H]-timidina a cada pocillo (1 \muCi/pocillo). Después de 36-48 h de incubación, las células se fijaron con metanol, y se precipitó el ADN con ácido tricloroacético al 5%. Las células fueron sometidas a lisis con 150 \muL/pocillo de NaOH 0,3 N, fueron transferidas a viales de centelleo y fueron contabilizadas con un contador \beta. Tal como se demuestra en la Figura 2A, se obtuvo un 60-70% de inhibición de la incorporación de [^{3}H]-timidina a 2,5 ng/mL de Halofuginona.

Entonces se examinó el efecto de la Halofuginona sobre la proliferación de HB-EGF (Factor de Crecimiento Epidermal de Unión a Heparina) y de células de leiomiosarcoma estimuladas por suero. Las células tumorales de leiomiosarcoma fueron cultivadas arrestadas mediante incubación de 48 h en medio que contenía un 0,5% de FCS. A continuación las células fueron expuestas (24 h) a FCS al 10% ó a 10 ng/mL de HB-EGF en ausencia o en presencia de 10 ng/mL de Halofuginona. Entonces se añadió [^{3}H]-timidina y se midió la síntesis de ADN 36 h después. Se observó una inhibición completa de la proliferación celular inducida por suero o por HB-EGF en presencia de Halofuginona, tal como se muestra en la Figura 2B.

Ejemplo 3 Inhibición de Expresión Génica de Colágeno de Tipo I por Halofuginona

Se tomaron células miometriales y de leiomiosarcoma del mismo paciente y se colocaron en placas de 10 cm en DMEM suplementado con FCS al 10%. Cuando las células alcanzaron el 80% de la confluencia, el medio se reemplazó con DMEM libre de suero más BSA al 0,1% durante 48 horas, se lavó y se expuso a concentraciones crecientes de Halofuginona en el mismo medio durante aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37ºC. A continuación las células fueron cosechadas y sometidas a extracción de ARN y análisis de transferencia Northern para la expresión génica de colágeno de tipo I. La Halofuginona inhibió la expresión génica de colágeno de tipo I (productos a 5,4 y 4,8 kb) de un modo dependiente de la dosis.

Ejemplo 4 Inhibición de la Actividad de Colagenasa de Tipo IV por Halofuginona in vitro

Las células tumorales segregan enzimas que digieren ECM, permitiendo que las células excaven a través del tejido del entorno e invadan otros tejidos. Numerosos estudios han relacionado las metaloproteasas de matriz (MMP), especialmente la colagenasa de tipo IV, al proceso de invasión tumoral y metástasis. La colagenasa de tipo IV aparece como dos proteínas de 72 y 92 kDa codificadas por un único mARN.

Tal como se demuestra en la Figura 3, se ejerció una profunda inhibición de la actividad de MMP2 (colagenasa de tipo IV de 72 kDa) en cultivos de células T50 de carcinoma de vejiga en presencia de 25 ng/mL de Halofuginona, mientras que se obtuvo una inhibición casi completa a 100 ng/mL de Halofuginona. Los cultivos celulares sub-confluentes fueron incubados durante 6 - 24 h en DMEM libre de suero. La actividad colagenolítica se determinó en un gel SDS-PAGE al 8% impregnado con gelatina (1 mg/mL, Disco, Detroit, MI). En resumen, las muestras de medios de cultivo se separaron sobre geles impregnados de sustrato en condiciones no reductoras, seguidas de 30 minutos de incubación en Triton X-100 al 2,5% (BDH, Inglaterra). A continuación los geles fueron incubados durante 16 horas a 37ºC en Tris 50 mM, NaCl 0,2 M, CaCl_{2} 5 mM, Brij 35 al 0,02% (peso/volumen) a pH 7,5. Al final del periodo de incubación, los geles fueron teñidos con un 0,5% de Coomassie G250 (Bio-Rad Richmond, CA) en metanol/ácido acético/H_{2}O (30:10:60). La intensidad de las diversas bandas se determinó en un densitómetro computerizado (Molecular Dynamics tipo 300A).

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También se descubrió que la Halofuginona inhibe la invasión celular a través de ECM matrigel, usando el ensayo de invasión de cámara Borden (datos no mostrados). Dicha inhibición apoya la inclusión de inhibición de colagenasa de tipo IV como parte del mecanismo de panstasis, en el que la Halofuginona inhibe el crecimiento, la progresión y la metástasis de tumores a través de actividades citostáticas, como se ha descrito previamente.

Ejemplo 5 Inhibición de la Expresión Génica de Marcador Tumoral por Halofuginona in vitro

El gen H19 es un gen regulado por desarrollo cuya expresión alcanza un máximo durante el desarrollo fetal cuando se está produciendo la diferenciación de tejidos. El gen H19 está imprentado parentalmente, expresado únicamente por el alelo maternal. El H19 también es un gen marcador de tumores, asociado a las etapas tempranas de malignidades tales como el tumor de Wilms, el carcinoma adrenocortical, el hepatoblastoma, el rabdomiosarcoma, los tumores de pulmón, los tumores trofoblásticos y el carcinoma de vejiga. El método experimental fue el siguiente.

Se cultivaron las líneas celulares RT112 y 5376 de carcinoma de vejiga humano en ausencia y en presencia de Halofuginona (130 ng/mL, añadida 24 h ó 72 h después de la siembra), y la expresión del gen H19 se evaluó mediante análisis de transferencia Northern (Nagler, A. y col., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., Vol. 17, pág. 194-202, 1997). La exposición a Halofuginona dio como resultado una reducción sustancial de la expresión del gen H19 en las líneas celulares RT112 y 5376 de carcinoma de vejiga que fueron evaluadas, tal como se muestra en la Figura 4. Este resultado corrobora los estudios in vivo del Ejemplo 1 sobre el efecto anti-tumorigénico de la Halofuginona en el carcinoma de vejiga.

Dicha inhibición también apoya la inclusión de la inhibición de la expresión génica de H19 como parte del mecanismo de panstasis, en el que la Halofuginona inhibe el crecimiento, la progresión y la metástasis de tumores a través de actividades citostáticas, tal como se ha descrito previamente.

Ejemplo 6 Inducción de Apoptosis por Halofuginona in vivo

La apoptosis, o muerte celular programada, está determinada por un mecanismo dentro de las células normales, que es eliminado por las células malignas. A menudo las células malignas son descritas como "inmortales" debido a la ausencia de apoptosis. Se demostró que la Halofuginona induce apoptosis de tumores in vivo. El método experimental fue como se indica a continuación.

Se tomaron secciones histológicas de las áreas periféricas y centrales de tumores de carcinoma de vejiga inducidos in situ en ratones del Ejemplo 1. Dichas secciones fueron sometidas a continuación a marcación in situ de ADN fragmentado usando la técnica de marcación de desoxinucleotidilo transferasa terminal (TdT) [Holmgren, L. y col., Nat. Med., Vol. 1, pág. 149-153, 1995]. Tal como se demuestra en la Figura 5B, se observó un número mucho mayor de células apoptóticas en secciones derivadas de tumores de vejiga de ratones C3H tratados con Halofuginona oral (10 mg/Kg), en comparación con tumores derivados de ratones de control no tratados (Figura 5A). También se observó una profunda diferencia en la extensión de la tinción en las secciones de tejido derivadas del centro del tumor que sufrían necrosis. Las Figuras 6A y 6C muestran los tumores de ratones sin tratar, mientras que las Figuras 6B y 6D muestran tumores de ratones tratados con Halofuginona. La apoptosis difiere de la necrosis en que la apoptosis se caracteriza por la muerte de una única célula en medio de varias células vivas, tal como se muestra en la Figura 5B. El aumento del índice apoptótico observado como respuesta a la Halofuginona puede deberse al efecto anti-angiogénico anteriormente descrito, tal como se observa con varios agentes anti-angiogénicos desarrollados recientemente.

Globalmente, se observó un aumento del índice apoptótico de aproximadamente 10 veces en magnitud en las muestras de tejido tomadas de ratones a los que se había administrado Halofuginona, en comparación con los ratones de control que no recibieron Halofuginona. Dicha inhibición también apoya la inclusión de la inducción de apoptosis como parte del mecanismo de panstasis, en el que la Halofuginona inhibe el crecimiento, la progresión y la metástasis de tumores a través de mecanismos citostáticos, tal como se ha descrito previamente.

Ejemplo 7 Inhibición de la Proliferación Celular por Halofuginona

El efecto anticancerígeno de la Halofuginona puede atribuirse a un efecto sobre i) la síntesis de colágeno y la deposición de matriz (apoyo estromal); ii) la angiogénesis tumoral; e iii) la inhibición directa de la proliferación de células tumorales. Por lo tanto, se evaluó el efecto de la Halofuginona sobre carcinoma T50 de vejiga y sobre otras líneas celulares tumorales mantenidas in vitro. Las células fueron sembradas (2.000 células por pocillo de 16 mm de una placa de 24 pocillos) en DMEM que contenía un 10% de FCS. Se añadieron concentraciones crecientes de Halofuginona 24 h después y las células fueron disociadas y contadas en un contador Coulter a varios días después de la siembra. Los resultados fueron los siguientes.

\newpage

Se obtuvo una inhibición completa de las células de carcinoma T50 de vejiga con una concentración 30 ng/mL de Halofuginona, con pocos o ningún efecto a concentraciones de 25 y 10 ng/mL (Figura 7A). La proliferación de células de melanoma humano (A375), de carcinoma de próstata (PC3) y de mama (MDA 231, MDA 435) no se vio afectada por la Halofuginona hasta una concentración de 25 ng/mL, y se vio particularmente inhibida únicamente en presencia de 100 ng/mL de Halofuginona (Figuras 7B y 7C). Del mismo modo, sólo se produjo un pequeño efecto inhibidor sobre células leucémicas mieloides humanas (HL60) y sobre células de linfoma B de ratón (F32) (Figura 7D). El efecto antitumoral de la Halofuginona en el carcinoma T50 de vejiga puede deberse al efecto combinado sobre la deposición de matriz, sobre la angiogénesis y sobre la proliferación de células tumorales.

Ejemplo 8 Inhibición inducida por Halofuginona de la incorporación de ^{3}H-timidina en células endoteliales vasculares

Se establecieron cultivos de células endoteliales vasculares procedentes de aorta de bovino tal como se ha descrito previamente [D. Gospodarowicz, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., Vol. 73, pág. 4120 (1979)]. Se colocaron en placa células endoteliales aórticas bovinas (4x10^{4} células/pocillo de 16 mm) en DMEM (1 g de glucosa/litro) suplementado con un 10% de suero de ternero, 50 U/mL de penicilina y 50 \mug/mL de estreptomicina a 37ºC en incubadoras humidificadas con un 10% de CO_{2}.

Cuatro días después de preparar las placas, las células subconfluentes fueron expuestas a concentraciones crecientes de Halofuginona (25-500 ng/mL), en ausencia o en presencia de 1 ng/mL de bFGF. A continuación se añadió ^{3}H- timidina (1 \muCi/pocillo) durante otras 48 horas, y se evaluó la síntesis de ADN midiendo la radioactividad incorporada en el material insoluble en ácido tricloroacético [M. Benezra, y col., Cancer Res., Vol. 52, pág. 5656-5662 (1992); I. Vlodavsky, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 84, pág. 2292-2296 (1987)].

La Figura 8A muestra los resultados obtenidos en ausencia de bFGF, mientras que la Figura 8B muestra los resultados obtenidos en presencia de bFGF. Tal como se demuestra en las Figuras 8A y 8B, se obtuvo un 50% de inhibición de la incorporación de ^{3}H-timidina con una concentración de 100 ng/mL de Halofuginona, independientemente de si se añadía bFGF (1 ng/mL) o no al medio de cultivo.

Ejemplo 9 Organización de Células Endoteliales en Entramados de tipo Capilar

Se descubrió que la Halofuginona previene la organización de células endoteliales en una estructura definida, y que inhibe específicamente la organización de dichas células en entramados de tipo capilar. Los resultados se muestran en las Figuras 9A y 9B.

Se preparó colágeno de tipo I a partir de tendones de cola de ratas Sprague-Dawley adultas. En resumen, las fibras de colágeno fueron solubilizadas mediante una lenta agitación durante 48 h a 4ºC en una disolución esterilizada 1/1.000 (v/v) de ácido acético (300 mL para 1 g de colágeno). La disolución resultante fue filtrada a través de una triple gasa y centrifugada a 16.000 g durante 1 h a 4ºC. A continuación el sobrenadante se sometió extensivamente a diálisis contra DMEM 1/10 y se almacenó a 4ºC. El gel de matriz de colágeno se obtuvo elevando simultáneamente el pH y la fuerza iónica de la disolución de colágeno. Para este propósito, se mezclaron rápidamente 7 volúmenes de disolución de colágeno con 1 volumen de 10X Medio Esencial Mínimo y con 2 volúmenes de bicarbonato sódico (0,15 M) [R.F. Nicosa y A. Ottinetti, Lab. Invest., Vol. 63, pág. 115-122 (1990)].

Se sembraron células endoteliales aórticas bovinas en pocillos de 16 mm de una placa de 24 pocillos, y se dejaron crecer durante 24 h, para obtener una monocapa subconfluente. Entonces se retiró el medio de cultivo y se vertieron 0,4 mL de la mezcla de colágeno fría descrita antes en la parte superior de la monocopa de células, y se dejó polimerizar durante 10 minutos a 37ºC. Después de que el colágeno hubiera gelificado, se añadió medio fresco (0,6 mL), que contenía bFGF (1 ng/mL) y heparina (1 \mug/mL), con (Figura 9B) y sin (Figura 9A) 0,1 \mug/mL de Halofuginona. Se monitorizó la reorganización de la monocapa de células endoteliales y se fotografió con un fotomicroscopio de contraste de fases invertidas Zeiss [R. Monesano, y col., J. Cell Biol., Vol. 97, pág. 1648-1652 (1983)].

La Figura 9A ilustra la organización de células endoteliales en entramados de tipo capilar. Dicha organización es inhibida por la Halofuginona, tal como demuestra la Figura 9B. La Halofuginona inhibió completamente la invasión de las células endoteliales en el gel de colágeno y su posterior organización en un entramado de tubos de tipo capilar ramificantes y anastomosantes.

Ejemplo 10 Formación de Microvasos

Se demostró que la Halofuginona inhibe la formación de microvasos a partir de anillos de tejidos aórticos tomados de ratas. También se demostró que este efecto es reversible al eliminarse la Halofuginona. Los resultados se muestran en las Figuras 10A, 10B, 11 y 12.

Se obtuvieron aortas torácicas de ratas SD (Sprague-Dawley) de 1 ó 2 meses de edad, sacrificadas mediante decapitación [R.F. Nicosia y A. Ottinetti, Lab. Invest., Vol. 63, pág. 115-122 (1990)]. Las aortas fueron transferidas inmediatamente a una placa Petri con PBS. El tejido fibro-adiposo alrededor de la aorta fue eliminado cuidadosamente con un microscopio de disección, y se seccionaron anillos aórticos de 1 mm de longitud que fueron enjuagados intensivamente con PBS.

Se añadió disolución de colágeno de tipo I (0,2 mL) a cada pocillo de 16 mm y se permitió que se produjera la gelificación durante 15 minutos a 37ºC. Cada anillo de aorta fue transferido y posicionado en el centro del gel, y se vertieron cuidadosamente otros 0,4 mL de la disolución de colágeno en la parte superior del anillo. Después de que el gel se formara, se añadieron 0,4 mL de medio de crecimiento endotelial libre de suero, con o sin 0,1 \mug/mL de Halofuginona, y el medio se cambió cada dos días.

La Figura 10A muestra el cultivo en la jornada 10, cuando se desarrollaron microvasos ramificantes recién formados a partir del extremo de resección de la aorta, dando lugar a lazos y entramados. La Figura 10B muestra el mismo cultivo tratado con 0,1 \mug/mL de Halofuginona, sustituido cada dos días. En estas condiciones, células individuales fueron migrando desde el anillo aórtico hasta la periferia, pero no pudieron alinearse para formar tubos de microvasos.

La Figura 11 muestra este efecto cuantitativamente, con dosis crecientes de Halofuginona. Se obtuvo una casi completa inhibición de la formación de microvasos a 100 ng/mL de Halofuginona. La inhibición completa se observó en presencia de 250 ng/mL de Halofuginona. Este efecto revirtió al eliminar el fármaco en el día 2, tal como muestra la Figura 12. Dicha eliminación dio como resultado la formación de microvasos, similar a la observada en los anillos aórticos no tratados.

Ejemplo 11 Inhibición por Halofuginona de la Incorporación de Sulfato en ECM de Células Endoteliales Cultivadas

Se demostró que la Halofuginona tiene un efecto inhibidor sobre la deposición de ECM (componentes de matriz extracelular), tal como se muestra en la Figura 13 y en otros ejemplos presentados a continuación.

Se establecieron cultivos de células endoteliales corneales bovinas a partir de ojos de buey y se mantuvieron como se ha descrito previamente [D. Gospodarowicz, y col., Exp. Eye Res., Nº 25, pág. 75-89 (1977)]. Las células fueron cultivadas a 37ºC en incubadoras humidificadas con un 10% de CO_{2} y los experimentos fueron realizados con pasajes celulares tempranos (3-8).

Para la preparación de ECM (matriz extra-celular) marcada con sulfato, se sembraron células endoteliales corneales en placas de 4 pocillos con una densidad confluente que formó, en 4-6 h, una monocapa celular inhibida por contacto compuesta de células arrestadas de crecimiento íntimamente dispuestas. En estas condiciones, las células permanecieron viables y retuvieron su configuración de monocapa y su apariencia morfológica normales hasta una concentración de 2 \mug/mL de Halofuginona. Se añadió Na_{2}[^{35}S]O_{4} (540-590 mCi/mmol) (40 \muCi/mL) de uno a cinco días después de la siembra y los cultivos fueron incubados sin cambiar el medio. A diferentes intervalos después de la siembra, la ECM subendotelial fue expuesta disolviendo (5 minutos, temperatura ambiente) la capa celular con PBS que contenía Triton X-100 al 0,5% y NH_{4}OH 20 mM, seguido de cuatro lavados en PBS [I. Vlodavsky, y col., Cancer Res., Vol. 43, pág. 2704-2711 (1983); I. Vlodavsky, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84, pág. 2292-2296 (1987)]. Para determinar la cantidad total de material marcado con sulfato, se digirió la ECM con tripsina (25 \mug/mL, 24 h, 37ºC) y el material solubilizado se contabilizó en un contador \beta.

La Figura 13 muestra la casi completa inhibición de la incorporación de sulfato por 1 \mug/mL de Halofuginona. Se obtuvo un 50% de inhibición en presencia de 0,2 \mug/mL del fármaco (no mostrado).

Ejemplo 12 Inhibición de la Incorporación de Sulfato, Prolina, Lisina y Glicina en ECM de Células Endoteliales Corneales Bovinas

Se sembraron células endoteliales corneales a una densidad confluente y se cultivaron tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo 11. Las células fueron cultivadas con o sin Halofuginona en presencia de Na_{2}^{35}SO_{4} (Figura 14A), ^{3}H-prolina (Figura 14B), ^{14}C-lisina (Figura 14C) ó ^{14}C-glicina (Figura 14D). Ocho días después de la siembra, la capa de células se disolvió sustancialmente tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo 11. La ECM subyacente fue sometida entonces a tripsina para determinar el efecto de la Halofuginona sobre la incorporación de material marcado en la proteína total, sustancialmente como se ha descrito en el anterior Ejemplo 11, o fue sometida a digestiones secuenciales con colagenasa y tripsina para evaluar el efecto de la Halofuginona sobre las proteínas digeribles mediante colagenasa (CDP) y las proteínas no digeribles mediante colagenasa (NCDP).

Como muestran las Figuras 14A-14D, la Halofuginona inhibió la incorporación de sulfato, prolina, lisina y glicina tanto en CDP como en NCDP, lo que refleja una profunda inhibición de la deposición de matriz. El efecto inhibidor de la Halofuginona sobre la deposición de componentes de ECM distintos del colágeno se debe probablemente a la implicación del colágeno en la formación de otros constituyentes de la estructura supramolecular de la ECM. Alternativamente, la Halofuginona puede afectar a la síntesis de componentes de ECM distintos del colágeno, posiblemente a través de un factor de transcripción común o de una citoquina tal como TGF\beta, que afecta a la síntesis y a la deposición de varios componentes de la ECM.

Ejemplo 13 Inhibición de la Incorporación de Sulfato y de Glicina en ECM de Células Mesengiales de Rata

Se cultivaron células mesengiales de rata hasta confluencia, 24 h después de la siembra. A continuación las células fueron cultivadas con o sin Halofuginona en presencia de Na_{2}^{35}SO_{4} (Figuras 15A y 15B) o de ^{14}C-glicina (Figuras 15C y 15D). Ocho días después de la siembra, la capa de células se disolvió para exponer la ECM subyacente, se lavó y se digirió con colagenasa para determinar el efecto de la Halofuginona sobre las proteínas CDP, tal como se muestra en las Figuras 15A y 15C. El material restante fue digerido con tripsina y sometido a conteo de centelleos \beta para determinar el efecto de la Halofuginona sobre las proteínas NCDP, tal como se muestra en las Figuras 15B y 15D.

Se observó aproximadamente un 30% de inhibición de la incorporación de sulfato para las proteínas CDP, mientras que para las proteínas NCDP se observó aproximadamente un 70% de inhibición en presencia de 200 ng/mL de Halofuginona. Cabe destacar que la inhibición de la deposición de ECM por Halofuginona no se debió a su actividad anti-proliferativa ya que el fármaco fue añadido a células altamente confluentes que no estaban dividiéndose. Puesto que el sulfato inorgánico se incorpora principalmente en glicosaminoglicanos sulfatados y no en colágeno, es posible que inhibiendo la síntesis de colágeno de tipo I, la Halofuginona interfiera en la formación de otras macromoléculas de ECM, tales como los proteoglicanos de sulfato de heparina, que son conocidos por interactuar específicamente con colágeno para formar ECM.

Se observó aproximadamente un 80% de inhibición de la incorporación de glicina tanto para proteínas CDP como NCDP en presencia de 50 ng/mL de Halofuginona. El efecto inhibidor de la Halofuginona sobre la deposición de proteínas de ECM digeribles mediante colagenasa fue más pronunciado con matriz marcada con glicina que con sulfato, puesto que, al contrario que la glicina, el sulfato se incorpora principalmente en glucosaminoglicanos que no se degradan mediante colagenasa. Una profunda inhibición de la deposición de ECM queda confirmada con un examen microscópico de los platos de cultivo desnaturalizados, lo que revela una delgada o no existente capa de ECM producida en presencia de Halofuginona.

Ejemplo 14 Efecto Inhibidor de la Halofuginona sobre la Neovascularización In Vivo

Se demostró que la Halofuginona inhibe la angiogénesis en un modelo in vivo. Un efecto inhibidor de este tipo también demuestra la capacidad de la Halofuginona para inhibir la proliferación celular que es posibilitada por la deposición de componentes de ECM. Los resultados se muestran en las Figuras 16A y 16B, y en otros ejemplos presentados más adelante.

Se usó un modelo de angiogénesis corneal de murina para evaluar el efecto inhibidor de Halofuginona in vivo. El factor angiogénico bFGF se aplicó en un bolsillo corneal de ratones C57B1/6, en una partícula hecha de un polímero de liberación lenta, y se administró Halofuginona (2 \mug/ratón\cdotdía) i.p. durante 5 días consecutivos (Kenyon, B.M., y col., Invest. Ophthal. Visual Sci., Vol. 37, pág. 1625-1632, 1996).

En el 5º día post-operativo, los ratones fueron anestesiados con metoxiflurano, los ojos se sometieron a proptosis, y se midió la longitud máxima de vaso (VL) de la zona de neovascularización que se extiende desde la base del plexo vascular limbal hacia la partícula con una retícula lineal a través de la lámpara de corte. La zona de neovascularización circunferencial contigua (CH) se midió como horas de reloj con una retícula de 360 grados. Al quinto día los ojos fueron fotografiados y las láminas fueron usadas para determinar el área de neovascularización, en mm cuadrados (Kenyon, B.M. y col., Invest. Ophthal. Visual Sci., Vol. 37, pág. 1625-1632, 1996).

El área de neovascularización se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

A = \frac{(CH \cdot 0.8) \cdot 0.5 \cdot VL \cdot \pi}{2}

En donde A es el área, CH es la zona de neovascularización circunferencial contigua y VL es la longitud máxima de vaso.

La Halofuginona se administró en la comida (5 mg/Kg) o de forma tópica con gotas oculares (100 y 200 ng/mL, aplicados tres veces al día). Los ratones de control recibieron una dieta regular. Cada grupo contenía 5 ratones. En el 7º día post-operatorio las córneas fueron examinadas con biomicroscopía de lámpara de corte para determinar la respuesta neovascular, y se fotografiaron. Se midió la angiogénesis en mm como la longitud máxima de vaso (VL) de la zona de neovascularización de la vasculatura limbal, y la partícula como la zona de neovascularización circunferencial contigua (CH).

Tal como se demuestra en la Figura 16, en los ojos de los ratones de control se produjo neovascularización desde el limbo corneal a la partícula (Figura 16A). En los ratones que recibieron Halofuginona oral se observó una profunda inhibición de la respuesta neovascular hacia la partícula (Figura 16B). El área media de neovascuralización en el grupo de control fue de 1,59 \pm 0,25 mm^{2}, en comparación con 0,15 \pm 0,2 mm^{2} en los ratones que recibieron Halofuginona oral (Figura 16C).

Tal como se demuestra en las Figuras 16C y 16D, la aplicación tópica de Halofuginona 3 veces al día dio como resultado una inhibición significativa de la neovascularización tanto a 100 ng/mL (0,93 \pm 0,62 mm^{2}, p < 0,001) como a 200 ng/mL (0,56 \pm 0,6 mm^{2}; p < 0,001; aproximadamente el 95%). La zona neovascularizada medida al décima día en el grupo no tratado fue 4,92 \pm 1,96 mm^{2}, en comparación con 0,23 \pm 0,47 mm^{2} (aproximadamente un 95% de inhibición; p < 0,001) en ratones que recibieron Halofuginona en la dieta (5 mg/Kg) (Figura 16D).

La concentración de la Halofuginona aplicada tópicamente fue aumentada hasta 500 y 1.000 ng/mL, administrada 3 veces al día. La neovascularización se determinó en las jornadas 4, 7 y 10 después de la implantación de las partículas de pFGF. De forma similar a los experimentos previos, la Halofuginona oral fue más eficaz (aproximadamente un 70% de inhibición) que la Halofuginona aplicada tópicamente incluso a 1.000 ng/mL) (inhibición del 40-50%). Asimismo, incluso a esta alta concentración de Halofuginona no se produjo induración o irradiación del ojo. Se observó una regresión de los vasos sanguíneos recién formados en el día 10 (Figura 16E).

El efecto anti-angiogénico de la Halofuginona administrada i.p. (1 \mug/ratón\cdotdía) se comparó con el efecto de los modos oral y tópico de administración. La Halofuginona (i.p., día 7) inhibió la neovascularización desde 1,75 mm^{2} en el grupo no tratado hasta 0,63 mm^{2} (p < 0,05), similar al efecto de la Halofuginona oral (0,65 mm^{2}) en el mismo experimento. Las gotas de Halofuginona (500 ng/mL, x3 al día) fueron menos eficaces (0,98 mm^{2}) (Figura 16F). Asimismo, en un experimento el efecto anti-angiogénico de la Halofuginona fue evaluado en ratones C3H y los resultados fueron similares a los obtenidos con ratones C57BL.

Por tanto, los resultados muestran que la Halofuginona es un compuesto anti-angiogénico potente y no tóxico, eficaz tanto cuando se administra oralmente como i.p. La Halofuginona fue menos eficaz cuando se aplicó tópicamente como gotas oculares, probablemente por ser lavada sin alcanzar la concentración constante deseada. La Halofuginona parece ser el primer compuesto descrito en la bibliografía que ejerce un efecto anti-angiogénico cuando se administra oralmente.

Ejemplo 15 Inhibición de la Expresión de Integrina

Se ha demostrado que las integrinas funcionan in vivo en la vasculogénesis y en la angiogénesis. La inyección de anticuerpo neutralizante contra la subunidad \beta1 bloqueó la formación de un lúmen aórtico en embriones de codorniz (Drake, C.J. y col., in vivo. Dev. Dyn. Vol. 193, pág. 83-91, 1992). Cheresh y colaboradores han proporcionado evidencias de que se requiere \alpha_{v}\beta_{3} para el crecimiento de vasos sanguíneos (Brooks, P.C. y col., Science, Vol. 264, pág. 569-571, 1994). Un anticuerpo (LM609) contra el complejo de integrina \alpha_{v}\beta_{3} inhibió el crecimiento de vasos normal y también la angiogénesis estimulada por FGF-2 o inducida por tumor en el ensayo CAM, pero no afectó a los vasos pre-existentes. El mecanismo mediante el cual el mAb anti-\alpha_{v}\beta_{3} interrumpe la angiogénesis parece implicar apoptosis. Una inyección intravascular sencilla de un antagonista de péptido RGD cíclico de integrina \alpha_{v}\beta_{3} o del anticuerpo monoclonal LM609 conduce a la rápida regresión de tumores humanos transplantados en el CAM. Las células tumorales que no expresan el gen \alpha_{v} y por tanto la integrina \alpha_{v}\beta_{3}, pierden su capacidad de adhesión y exhiben una tumorigenicidad significativamente reducida después del transplante en ratones nude atímicos. La transfección estable del cADN de \alpha_{v} a estas células dio como resultado la restauración completa de su potencial tumorigénico (Felding-Habermann, B. y col., J. Clin. Invest., Vol. 89, pág. 2018-2022, 1992). Además, se había descubierto que la Halofuginona inhibe la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

Por lo tanto, se investigó el efecto de la Halofuginona sobre la expresión de las subunidades de integrina \alpha_{v},_{ }\beta_{3} y \beta_{5} en la línea celular altamente agresiva de carcinoma de mama humano MDA 435. Las células fueron cultivadas en ausencia (Figura 17, bandas A y B) o en presencia de concentraciones crecientes (10-400 ng/mL) de Halofuginona durante 24 h (banda C: 400 ng/mL), 48 h (bandas D-G: 10, 50, 200 y 400 ng/mL, respectivamente) o 72 h (Figura 17, banda H: 400 ng/mL). Se extrajo el ARN total, se sometió a electroforesis de gel de agarosa-formaldehído (1,1%), se transfirió a una membrana de nylon y se hibridó con una sonda PCR marcada con ^{32}P correspondiente a \alpha_{v}. Tal como demuestra la Figura 17, la exposición de las células de carcinoma de mama durante 48 h a 10 y 50 ng/mL de Halofuginona dio como resultado la regulación al alza del mARN de \alpha_{v} (Figura 17, bandas D y E). Este efecto fue mínimo a mayores concentraciones (200-400 ng/mL) de Halofuginona (Figura 17, bandas F-H). A continuación, se usó RT-PCR para analizar el efecto de la Halofuginona sobre la expresión de las cadenas de integrina \beta_{3} y \beta_{5} por las células de carcinoma de mama MDA 435. Tal como se muestra en la Figura 18, la Halofuginona inhibió la expresión del mARN de \beta_{3} de un modo dependiente de la dosis, dando lugar a una inhibición casi completa a 200 ng/mL (Figura 18, banda 1: control; bandas 2-5: 24 h de exposición a 10, 50, 200 y 400 ng/mL de Halofuginona, respectivamente). Por el contrario, no hubo efecto sobre la expresión del mARN de \beta_{5}. Como el complejo de integrina \alpha_{v}\beta_{3} desempeña un papel importante en la angiogénesis tumoral, el efecto anti-angiogénico de la Halofuginona puede estar mediado en parte por su inhibición de la expresión del gen \beta_{3}.

Ejemplo 16 Formulaciones Adecuadas para la Administración de Halofuginona

La Halofuginona se puede administrar a un sujeto de varias formas, que son bien conocidas en la técnica. De aquí en adelante, el término "sujeto" se refiere al humano o animal inferior al cual se administra la Halofuginona. Por ejemplo, la administración se puede hacer tópicamente (que incluye oftálmicamente, vaginalmente, rectalmente, intranasalmente), oralmente o parenteralmente, por ejemplo mediante goteo intravenoso o inyección intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.

Las formulaciones para administración tópica pueden incluir, aunque sin limitación, lociones, pomadas, geles, cremas, supositorios, gotas, líquidos, aerosoles y polvos. Puede ser necesario o deseable el uso de vehículos farmacéuticos convencionales, de bases acuosas, en polvo u oleaginosas, de espesantes y otros similares.

Las composiciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o disoluciones, en medio acuoso o no acuoso, sobres, cápsulas o comprimidos. Puede ser deseable el uso de espesantes, diluyentes, aromatizantes, aditivos de dispersión, emulgentes o aglomerantes.

Las formulaciones para administración parenteral pueden incluir, aunque sin limitación, disoluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados.

La dosificación es dependiente de la gravedad de los síntomas y de la respuesta del sujeto a la Halofuginona. Las personas especialistas pueden determinar fácilmente las dosis, metodologías de dosificación y las tasas de repetición óptimas.

Ejemplo 17 Método de Tratamiento de Malignidades

Como se ha indicado antes, se ha demostrado que la Halofuginona es un inhibidor eficaz de la progresión tumoral mediante la inhibición de la angiogénesis. El siguiente ejemplo es únicamente una ilustración de un método para el tratamiento de malignidades con Halofuginona, y no pretende ser limitante.

El método incluye la etapa de administrar Halofuginona, en un vehículo farmacéuticamente aceptable como el descrito en el anterior Ejemplo 16, a un sujeto que va a ser tratado. La Halofuginona se administra de acuerdo a una metodología de dosificación eficaz, preferiblemente hasta que se alcanza un punto final predefinido, tal como la ausencia de un marcador tumoral particular en una muestra tomada del sujeto.

Ejemplos de tumores para los que un tratamiento sería eficaz incluyen, aunque sin limitación, cánceres de mama tales como el carcinoma de mama de conducto infiltrante, cánceres de pulmón tales como el carcinoma de pulmón de célula pequeña, cánceres óseos, cánceres de vejiga tales como carcinoma de vejiga, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, adenocarcinoma de colon, próstata o páncreas, carcinoma de célula escamosa de la cerviz, cáncer de ovario, histiocitoma fibroso maligno, cánceres de piel tales como el melanoma maligno, leiomiosarcoma, astrocitoma, glioma y carcinoma hepatocelular.

Ejemplo 18 Método de Fabricación de un Medicamento que Contiene Halofuginona

El siguiente es un ejemplo de un método de fabricación de Halofuginona. En primer lugar, la Halofuginona se sintetiza de acuerdo con una buena práctica de fabricación farmacéutica. Ejemplos de métodos para sintetizar Halofuginona, y derivados de quinazolinona relacionados, se proporcionan en la Patente de EE.UU. Nº 3.338.909. A continuación, la Halofuginona se coloca en un vehículo farmacéuticamente adecuado, tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo 16, nuevamente de acuerdo con la buena práctica de fabricación farmacéutica.

Aunque la invención ha sido descrita con respecto a un número limitado de realizaciones, debe apreciarse que se pueden realizar muchas variaciones, modificaciones y otras aplicaciones de la invención.

Claims (6)

1. El uso de Halofuginona y de sales farmacéuticamente aceptables de la misma para preparar un medicamento para tratar un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, adenocarcinoma de colon, próstata o páncreas, carcinoma de célula escamosa de la cerviz, cáncer de ovario, histiocitoma fibroso maligno, cáncer de piel, astrocitoma, glioma y carcinoma hepatocelular.

2. El uso de Halofuginona y de sales farmacéuticamente aceptables de la misma para preparar un medicamento para inhibir la proliferación celular posibilitada por una deposición de una matriz extracelular en un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, adenocarcinoma de colon, próstata o páncreas, carcinoma de célula escamosa de la cerviz, cáncer de ovario, histiocitoma fibroso maligno, cáncer de piel, astrocitoma, glioma y carcinoma hepatocelular.

3. El uso de Halofuginona y de sales farmacéuticamente aceptables de la misma para preparar un medicamento para inhibir la metástasis en un tumor seleccionado del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, adenocarcinoma de colon, próstata o páncreas, carcinoma de célula escamosa de la cerviz, cáncer de ovario, histiocitoma fibroso maligno, cáncer de piel, astrocitoma, glioma y carcinoma hepatocelular.

4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho cáncer de mama es carcinoma de mama de conducto infiltrante.

5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho cáncer de vejiga es carcinoma de vejiga.

6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho cáncer de piel es melanoma maligno.