ES2231824T3 - Uso de halofuginona para la preparacion de un medicamento para atenuar la neovascularizacion y para tratar tumores malignos en seres humanos. - Google Patents
Uso de halofuginona para la preparacion de un medicamento para atenuar la neovascularizacion y para tratar tumores malignos en seres humanos.Info
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Abstract
LA INVENCION DESCRIBE UNA COMPOSICION PARA ATENUAR LA NEOVASCULARIZACION Y PARA TRATAR MALIGNIDADES HUMANAS, QUE INCLUYE UNA CANTIDAD FARMACEUTICAMENTE EFICAZ DE UN COMPUESTO DE FORMULA (I), EN LA CUAL R 1 ES UN MIEMBRO DEL GRUPO FORMADO P OR HIDROGENO, HALOGENO, NITRO, BENZO, ALQUILO INFERIOR, FENILO Y ALCOXI INFERIOR; R 2 ES UN MIEMBRO DEL GRUPO FORMADO POR HIDROXI, ACETOXI Y ALCOXI INFERIOR; Y R 3 ES UN MIEMBRO DEL GRUPO FORMADO POR HIDROGENO Y ALQUENOXI INFERIOR - CARBONILO; COMO PRINCIPIO ACTIVO DE LA MISMA, JUNTO CON UN VEHICULO FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE.
Description
Uso de halofuginona para la preparación de un
medicamento para atenuar la neovascularización y para tratar
tumores malignos en seres humanos.
La presente invención se refiere a composiciones
que contienen halofuginona. Más particularmente, la presente
invención se refiere a una composición, que comprende halofuginona
como ingrediente activo de la misma, para atenuar la proliferación
de células vasculares endoteliales y la formación de tubos, y por
tanto para atenuar las enfermedades angiogénicas asociadas, así como
para tratar enfermedades malignas en el ser humano, es decir,
inhibir el crecimiento primario de tumores, la progresión de tumores
y la metástasis.
En la patente de EE.UU. 3.320.124, expedida en
1967, se describe y reivindica un método para tratar la coccidiosis
con derivados de quinazolinona. La halofuginona, por lo demás
conocida como
7-bromo-6-cloro-3-[3-(3-hidroxi-2-piperidinil)-2-oxopropil]-4(3H)-quinazolinona,
fue descrita y reivindicada en primer lugar en dicha patente por la
American Cyanamid Company, y fue el compuesto preferido mostrado por
dicha patente y el comercializado de entre los derivados descritos y
reivindicados en la misma.
La patente reexpedida de EE.UU. subsiguiente
26.833 y las patentes de EE.UU. 4.824.847; 4.855.299; 4.861.758 y
5.215.993 se relacionan todas con las propiedades coccidioides de la
halofuginona. La patente de EE.UU. 4.340.596 enseña que la
halofuginona también se puede usar para combatir la teileriosis.
En 1991, uno de los presentes inventores publicó
un artículo en el que informaba que la reducción de la síntesis del
colágeno se observó e identificó como un importante factor causal
del desgarramiento y de la reducción de la resistencia de la piel de
aves de corral tratadas con halofuginona administrada en las
cantidades recomendadas para uso como agente coccidiostático.
También se encontró que, a nivel celular, la halofuginona suprimía
la síntesis del colágeno mediante los fibroblastos de la piel
aviaria [I. Granot et al., Poul. Sci., vol. 70, pp.
1559-1563 (1991)].
Sin embargo, en ese momento no se enseñó,
reconoció o sospechó que la halofuginona o los derivados de
quinazolinona relacionados mostrados en la patente de EE.UU. nº
3.320.124 se pudieran usar efectivamente para el tratamiento de las
enfermedades fibróticas, así como para el tratamiento de la
restenosis, glomerulosclerosis y de las enfermedades dependientes de
la angiogénesis.
Los estados y trastornos clínicos asociados con
la fibrosis primaria o secundaria, tales como la esclerosis
sistémica, la enfermedad del injerto contra el huésped (GVDH), la
fibrosis pulmonar y hepática y una gran variedad de trastornos
autoinmunes, se distinguen por una producción excesiva de tejido
conjuntivo, que da lugar a la destrucción de la arquitectura y de la
función de los tejidos normales. Estas enfermedades se pueden
interpretar mejor en términos de perturbaciones de las funciones
celulares, una manifestación principal de las cuales es una excesiva
deposición de colágeno.
Es generalmente reconocido que, actualmente, la
mayoría de los tratamientos de enfermedades fibróticas son
ineficaces y tienen poco efecto sobre su inexorable progresión
patológica. Con el fin de reducir la deposición de colágeno en el
espacio extracelular se han realizado varios intentos. Como se sabe,
las enfermedades fibroproliferativas progresivas exhiben una
producción progresiva de tejidos conjuntivos. El papel crucial del
colágeno en la fibrosis ha incitado intentos de desarrollar fármacos
que inhiban su acumulación [K.I. Kivirikko, Annals of
Medicine, vol. 25, pp. 113-126 (1993)].
Tales fármacos pueden actuar modulando la
síntesis de las cadenas polipeptídicas del procolágeno, o inhibir
algunos sucesos postranslacionales específicos, que conducirán a una
formación reducida de fibras de colágeno extracelulares o a una
acumulación de fibras con propiedades alteradas. A pesar de la
importancia de esta proteína en el sostenimiento de la integridad de
los tejidos y su involucración en varios trastornos sólo están
disponibles unos pocos agentes inhibidores de la síntesis de
colágeno.
En un intento de ralentizar la proliferación de
fibroblastos productores de colágeno se han usado fármacos
citotóxicos [J.A. Casas et al., Ann. Rhem. Dis., vol.
46, p. 763 (1987)], entre ellos la colquicina, que ralentiza la
secreción de colágeno en la matriz extracelular [D. Kershenobich
et al., N. Engl. J. Med., vol. 318, p. 1709 (1988)] y
agentes inhibidores de las enzimas clave en el metabolismo del
colágeno [K. Karvonen et al., J. Biol. Chem., vol.
265, p. 8414 (1990); C.J. Cunliffe et al., J. Med.
Chem., vol. 35, p. 2652 (1992)].
Desafortunadamente, ninguno de estos agentes
inhibidores es específico del colágeno. Asimismo, existen graves
preocupaciones acerca de las consecuencias tóxicas de interferir con
la biosíntesis de otras moléculas vitales de colágeno, tales como
Clq en la ruta clásica de complementos, la acetilcolina esterasa de
la placa terminal de la unión neuromuscular, la conglutinina y la
apoproteína pulmonar tensioactiva.
Otros fármacos que pueden inhibir la síntesis del
colágeno, tales como la nifedipina y la fenitoína, también inhiben
la síntesis de otras proteínas, bloqueando de este modo no
específicamente la ruta biosintética del colágeno [T. Salo et
al., J. Oral Pathol. Med., vol. 19, p. 404 (1990)].
Los agentes inhibidores de la reticulación del
colágeno, tales como el
\beta-amino-propionitrilo, también
son no específicos, aunque pueden servir como agentes antifibróticos
útiles. Su uso prolongado provoca el síndrome latrítico e interfiere
con la elastogénesis, ya que la elastina, otra proteína del tejido
conjuntivo fibroso, también es reticulada. Además, el efecto
inhibidor de la reticulación del colágeno es secundario, y la
sobreproducción del colágeno tiene que preceder su degradación por
la colagenasa.
En la patente de EE.UU. nº 5.449.678 se describe
y reivindica un método para el tratamiento de un paciente humano que
sufra de una enfermedad fibrótica, que comprende administrar al
paciente una composición que comprenda una cantidad terapéuticamente
efectiva de un compuesto farmacéuticamente activo, efectivo para
inhibir la síntesis del colágeno del tipo I, de fórmula I:
en la
que:
n = 1 ó 2;
R_{1} es un miembro del grupo que consta de un
átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo
benzo, un grupo alquilo inferior, un grupo fenilo y un grupo alcoxi
inferior;
R_{2} es un miembro del grupo que consta de un
grupo hidroxi, un grupo acetoxi y un grupo alcoxi inferior; y
R_{3} es un miembro del grupo que consta de un
átomo de hidrógeno y un grupo alquenoxi
inferior-carbonilo.
Después de una investigación y desarrollo
adicional se ha descubierto ahora que la halofuginona se puede usar
para atenuar la neovascularización, así como para tratar las
enfermedades malignas en el ser humano.
Según un primer aspecto de la invención, se
proporciona el uso de halofuginona para la fabricación de una
composición para atenuar la neovascularización y tratar tumores
malignos en el ser humano, composición que comprende un vehículo
farmacéuticamente aceptable y siendo la halofuginona un ingrediente
activo de la composición.
Según un segundo aspecto de la invención, se
proporciona el uso de halofuginona para la fabricación de un
medicamento para atenuar la neovascularización.
Según un tercer aspecto de la invención, se
proporciona el uso de halofuginona para la fabricación de un
medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales en el
ser humano.
Según un cuarto aspecto de la invención, se
proporciona el uso de halofuginona para la fabricación de un
medicamento para tratar un paciente humano que sufre de angiogénesis
prolongada.
En la patente de EE.UU. nº 5.449.678 se muestra y
se demuestra explícitamente que la halofuginona es efectiva para el
tratamiento de enfermedades fibróticas tales como el escleroderma y
el GVHD, así como la restenosis y la glomerulosclerosis. Tal muestra
obvía cualquier especulación infundada de que el compuesto pueda
estar inactivado antes de producir un efecto; que el compuesto no
pueda alcanzar el área diana, o que otras propiedades funcionales
puedan hacer al compuesto inadecuado para uso in vivo. Sin
embargo, estas posibilidades son enteramente controvertidas por el
hecho fehaciente de que se ha mostrado que la halofuginona es
efectiva en el tratamiento de dos enfermedades fibróticas
específicas asociadas con una deposición excesiva de colágeno, es
decir, el escleroderma y el GVDH, así como la restenosis y la
glomerulosclerosis.
Con referencia ahora al nuevo descubrimiento de
la presente invención, la angiogénesis es un proceso complejo en el
que los vasos sanguíneos capilares crecen en una secuencia ordenada
de sucesos (J. Folkman y M. Klagsbrun, "Angiogenic Factors",
Science, vol. 235, pp. 442-447 (1987); J.
Folkman e Y. Shing, "Angiogenesis", J. Biol. Chem., vol.
267, pp. 10931-10934 (1992)]. Cuando un nuevo brote
capilar crece desde el lado de un venilla, las células endoteliales
degradan la membrana basal, migran hacia una fuente angiogénica,
proliferan, forman un lumen, unen las puntas de dos brotes para
generar un bucle capilar, y fabrican una nueva membrana basal [J.
Folkman, "Toward an Understanding of Angiogenesis; Search and
Discovery", Perspective in Biology and Medicine, vol. 29,
pp. 1-36 (1985)].
La degradación y remodelación de la ECM son
procesos esenciales para la angiogénesis. Además, los componentes de
la ECM sintetizados por las células endoteliales (es decir,
colágenos, laminina, trombospondina, fibronectina y SPARC) funcionan
para regular el crecimiento, la migración y la forma de las células
endoteliales [J. Bischoff, "Approaches to Studying Cell Adhesion
Molecules in Angiogenesis", Trends Cell Biol., nº 5, pp.
69-74 (1995)]. Se informó que las células
endoteliales aórticas bovinas (BAE) que sufren la formación de
brotes y de tubos sintetizan colágeno del tipo I y SPARC. Se propuso
que el colágeno del tipo I puede estar involucrado en dirigir la
migración y ensamblaje de las células BAE [M.L.
Iruela-Arispe et al., Lab. Invest., nº
64, pp. 174-186 (1991)]. También se encontró que el
colágeno exógeno del tipo I promovía la formación rápida de tubos
mediante las células endoteliales microvasculares dérmicas
confluentes de ser humano [C.J. Jackson y K.L. Jenkins, Exp. Cell
Res., nº 192, pp. 319-323 (1991)]. Los tubos
contenían fibrillas de colágeno en los espacios luminares,
sugiriendo que las células endoteliales usan los fíbridos para
plegarse y alinearse en estructuras tubulares.
Mientras que una extensiva neovascularización
acompaña el desarrollo embrionario, en el adulto saludable la
notable capacidad de los vasos sanguíneos existentes de producir
brotes y reproducirse está en su mayor parte reprimida [J. Folkman e
Y. Shing, ibid. (1992)].
Existen situaciones patológicas en las que los
mecanismos de control que normalmente operan para restringir la
angiogénesis se desmoronan y se desata un crecimiento descontrolado
de los depósitos sanguíneos. La neovascularización resultante,
excesiva, es la razón fundamental de varias de las denominadas
"enfermedades angiogénicas" [J. Folkman, "Angiogenesis in
Cancer, Vascular, Rheumatoid and Other Diseases", Nature
Medicine, vol. 1, pp. 27-31 (1995)]. Un grupo de
enfermedades angiogénicas comprende retinopatías distinguidas por un
encarnamiento excesivo de vasos sanguíneos en la retina, que conduce
a la obstrucción de la visión y finalmente a la ceguera [J. Folkman,
ibid. (1995)].
Sin embargo, la enfermedad más devastadora en la
que la angiogénesis injustificada juega un papel crucial es la
progresión y extensión de los tumores sólidos. Ahora es bien
aceptado que una vez que se ha producido un tumor cada aumento de la
población de células tumorales tiene que ser precedido por un
aumento de nuevos capilares que convergen sobre el tumor y
suministran a las células oxígeno y nutrientes [J. Folkman,
ibid. (1985), "What Is the Evidence that Tumors Are
Angiogenesis Dependent?", J. Natl. Cancer Inst., vol. 82,
pp. 4-6 (1989); N. Weidner et al., "Tumor
Angiogenesis Correlatos with Metastasis in Invasive Prostate
Carcinoma". Amer. J. Phatol., vol. 143, pp.
401-409 (1993)]. Por tanto, los tumores permanecen
inocuos y confinados en su tejido de origen en tanto y cuanto se
impida que se active un programa angiogénico acompañante.
Puesto que en la progresión de un tumor la etapa
dependiente de la angiogénesis es compartida por los tumores sólidos
de todas las etiologías, la capacidad para inhibir la angiogénesis
asociada con los tumores es el enfoque más prometedor para combatir
el cáncer [M.S. O'Reilly et al., "A Novel Angiogenesis
Inhibitor that Mediates the Supression of Metastases by a Lewis Lung
Carcinoma", Cell, vol. 79, pp. 316-328
(1994)].
Una masa sustancial de evidencia experimental
soporta la hipótesis de que la angiogénesis tumoral es fundamental
para el crecimiento y metástasis de tumores sólidos [J. Folkman,
ibid. (1989); N. Weidner et al., ibid. (1993); M.S.
O'Reilly et al., Ibid. (1994); N. Weidner et al.,
"Tumor Angiogenesis and Metastasis - Correlation in Invasive
Breast Carcinoma", N. Eng. J. Med., Vol. 324, pp.
1-8 (1991)]. Realmente, la mayoría de los tumores
sólidos no son incluso clínicamente detectables hasta después de que
se produzca la neovascularización, cuya inducción en tumores sólidos
está mediada por uno o más factores angiogénicos [J. Folkman,
ibid. (1987); J. Folkman and Y. Shing, ibid. (1992)].
Por otra parte, la capacidad para inhibir la proliferación y
penetración de vasos sanguíneos en un órgano dado conlleva el
potencial de tratar otra enfermedades, lo cual es de importancia
médica capital.
La angiogénesis prolongada se observa en una
diversidad de estados patológicos, tales como la artritis,
psoriasis, retinopatía diabética, inflamación crónica, escleroderma,
hemangioma, fibroplasia retrolental y proliferación capilar anormal
en articulaciones hemofílicas, menstruación y hemorragias
prolongadas, y otros trastornos del sistema reproductor femenino [J.
Folkman, ibid. (1995); J.W. Miller et al., "Vascular
Endotelial Growth Factor/Vascular Permeability Factor Is Temporarily
and Partially Correlated with Ocular Angiogenesis in a Primate
Model", J. Pathol., vol. 145, pp. 574-584
(1994); A.P. Adamis et al., "Increased Vascular Endotelial
Growth Factor Levels in the Vitreous of Eyes with Proliferative
Diabetic Retinopathy", Amer. J. Ophthal., vol. 118, pp.
445-450 (1994); K. Takahashi et al.,
"Cellular Markers that Distinguish the Phases of Hemangioma during
Infancy and Childhood", J. Clin. Invest., vol. 93, pp.
2357-2364 (1994); D.J. Peacock et al.,
"Angiogenesis Inhibition Suppresses Collagen Artritis", J.
Exp. Med., vol. 175, pp. 1135-1138 (1992); B.J.
Nickoloff et al., "Aberrant Production of
Interleukin-8 and Thrombospondin-1
by Psoriatic Keratinocytes Mediates Angiogenesis", Amer. J.
Pathol., vol. 44, pp. 820-828 (1994); J.
Folkman "Angiogenesis in Female Reproductive Organs", in:
``Steroid Hormones and Uterine Bleeding, N.J. Alexander and
C. d'Arcangues, Eds., American Association for the Advancement of
Science Press, Washington, D.C., EE.UU., pp. 144-158
(1992)].
En muchas de las anormalidades anteriormente
mencionadas, el crecimiento no restringido de nuevos capilares
contribuye en sí mismo al proceso de la enfermedad. Por ejemplo, en
la artritis nuevos capilares pueden invadir y destruir el cartílago
de las articulaciones. En la diabetes, nuevos capilares en el ojo
pueden dar lugar a hemorragias y provocar ceguera. También es
posible que ciertos trastornos del desarrollo, tales como la atresia
intestinal, malformaciones vasculares y atrofia unilateral fasial,
pueden deberse a una anormalidad angiogénica [J. Folkman,
ibid. (1995)].
Se han estudiado varios agentes inhibidores de la
angiogénesis; entre ellos están el factor 4 de las plaquetas, el
derivado de la fumagillina AGH 1470, interferón \alpha2ª,
trombospondina, esteroides angiostáticos y angiostatina [J. Folkman,
ibid. (1995); M.S. O'Reilly et al., ibid.
(1994); V. Castle et al.,
"Antisence-Mediated Reduction in Thrombospondin
Reverses the Malignant Pheotype of a Human Squamous Carcinoma",
J. Clin. Invest., vol. 87, pp. 1883-1888; D.
Ingber et al., "Synthetic Analogues of Fumagillin that
Inhibit Angiogenesis and Suppress Tumor Growth", Nature,
vol. 348, pp. 555-557].
Ahora la invención se describirá en conexión con
ciertas realizaciones preferidas en las siguientes figuras y
ejemplos, para que sus aspectos se puedan comprender y apreciar más
completamente. Así, las siguientes figuras y ejemplos que incluyen
las realizaciones preferidas servirán para ilustrar la práctica de
esta invención, entendiéndose que las realizaciones particulares
mostradas son sólo a modo de ejemplo y para fines de discusión
ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente
invención, y se presentan con el fin de proporcionar lo que se cree
que es la descripción de los procedimientos de formulación más útil
y fácilmente entendible así como de los principios y aspectos
conceptuales de la invención.
Los resultados de los experimentos llevados a
cabo se describen más adelante con referencia a las figuras
adjuntas, en las que:
Las figs. 1A y 1B son curvas características
dosis - respuesta, que muestran el efecto de la halofuginona sobre
la incorporación de ^{3}H-timidina en células
endoteliales aórticas bovinas mantenidas en cultivo, en ausencia
(fig. 1A) o ausencia (fig. 1B) de 1 ng/ml de factor de crecimiento
básico de fibroblastos.
La fig. 2A es una ilustración característica de
la organización de las células endoteliales aórticas bovinas en
redes semejantes a capilares. La monocapa celular está cubierta con
un gel de colágeno y expuesta a 1 ng/ml de bFGF más 1 \mug/ml de
heparina. Después de 2 días de cultivo se tomaron micrografías de
contraste de fases. Las células se reorganizaron en una red de tubos
ramificados y anastomóticos semejantes a capilares.
La fig. 2B muestra los cultivos de células
endoteliales de la fig. 2A tras la incubación con 0,1 \mug/ml de
halofuginona. Las células mantuvieron una agrupación de monocapas no
solapadas y no lograron formar los típicos tubos ramificados y
anastomóticos semejantes a capilares.
La fig. 3A es una ilustración característica de
microvasos recientemente formados (día 10) ramificándose desde
anillos aórticos de rata inmersos en gel de colágeno del tipo I, que
dan lugar a bucles y redes.
La fig. 3B muestra los anillos aórticos de rata
de la fig. 3A, tras la incubación con 0,1 \mug/ml de halofuginona,
que fue reemplazada cada dos días. Las células individuales migraron
desde el anillo aórtico hacia la periferia, pero no lograron
alinearse en tubos de microvasos.
La fig. 4 es una curva característica que muestra
el tiempo y la respuesta a la dosis del efecto inhibidor de la
halofuginona sobre la formación de microvasos, usando el ensayo de
anillos aórticos de rata inmersos en colágeno del tipo I de la fig.
3.
La fig. 5 es un gráfico de barras característico
que muestra que la eliminación de halofuginona (250 ng/ml) el día 2
(1) ó 6 (2) dio lugar a la formación de microvasos (evaluados el día
14), similar a la observada con anillos aórticos sin tratar (sin
tratar). La inhibición completa de la formación de microvasos se
obtuvo cuando la halofuginona estuvo presente a lo largo de un
período de incubación de 14 días (3).
La fig. 6 es una curva característica que
demuestra el efecto de la halofuginona sobre la incorporación de
sulfato en la ECM endotelial. Se sembraron células endoteliales
bovinas de córnea a una densidad celular confluente y se expusieron
a 1 \mug/ml de halofuginona (\Box) en presencia de
Na_{2}[^{35}S]O_{4}. Las células testigo
(\blacksquare) se mantuvieron en ausencia de halofuginona. En
diferentes momentos de tiempo, la capa celular se solubilizó para
exponer la ECM subyacente, se digirió con tripsina y el material
solubilizado se recontó en un contador de centelleo de partículas
\beta.
La fig. 7A es una curva característica que
muestra el efecto de la halofuginona sobre la incorporación de
^{3}H-timidina en células tumorales de
liomiosarcoma de ser humano, subconfluentes y en crecimiento.
La fig. 7B compara la detención del crecimiento
de células de liomiosarcoma estimuladas para proliferar en respuesta
a FCA al 10% (\blacksquare) ó 10 ng/ml de HB-EGF
1000 en ausencia o presencia de 10 ng/ml de
halofuginona.
Se establecieron cultivos de células endoteliales
vasculares de aorta bovina como se describió previamente [D.
Gospodarowicz et al., "Clonal Growth of Bovine Endotelial
Cells: Fibroblast Growth Factor as a Survival Agent", Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 73, p. 4120 (1979)]. Los cultivos
madre se mantuvieron en DMEM (1 g de glucosa/litro) suplementada con
suero de ternero al 10%, 50 U/ml de penicilina, y 50 \mug/ml de
estreptomicina a 37ºC en incubadores humidificados con CO_{2} al
10%. Cada dos días se añadió bFGF parcialmente purificado derivado
de cerebro (100 ng/ml) durante la fase de crecimiento celular activo
[D. Gospodarowicz et al., ibid. (1979); I. Vlodavsky
et al., "Vascular Endothelial Cells Maintained in the
Absence of Fibroblast Growth Factor Undergo Structural and
Functional Alterations that Are Incompatible with Their in
vivo Differentiated Properties", J. Cell. Biol., vol.
83, pp. 468-486 (1979)].
Se depositaron en placas células endoteliales
aórticas bovinas (4 x 10^{4} células/pocillo de 16 mm) en DMEM
suplementada con suero de ternero al 10%. Cuatro días después de la
siembra, las células se expusieron a concentraciones crecientes de
halofuginona (100-500 ng/ml) en ausencia o presencia
de 1 ng/ml de bFGF. A continuación, se añadió
^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) durante 48
horas adicionales, y se analizó la síntesis de DNA midiendo la
radioactividad incorporada en el material insoluble en ácido
tricloroacético [M. Benezra et al., "Reversal of bFGF
Autocrine Cell Transformation by Aromatic Anionic Compounds",
Cancer Res., vol. 52, pp. 5656-5662 (1992);
I. Vlodavsky et al., "Endotelial
Cell-Derived Basic Fibroblast Factor: Synthesis and
Deposition into Subendothelial Extracellular Matrix", Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 84, pp. 2292-2296
(1987)].
Se establecieron cultivos de células endoteliales
bovinas de córnea de ojos de novillo y se mantuvieron como se
describió previamente [D. Gospodarowicz et al.,
"Stimulation of Corneal Endothelial Cell Proliferation in
Vitro by Fibroblast and Epidermal Growth Factors", Exp.
Eye Res., nº 25, pp. 75-89 (1977)]. Las células
se cultivaron a 37ºC en incubadores humidificados con CO_{2} al
10% y los experimentos se realizaron con los primeros pases de
células (3-8).
Para la preparación de ECM marcada con sulfato,
las células endoteliales de córnea se sembraron en placas de 4
pocillos a una densidad confluente que formó, en 4-6
h, una monocapa celular de contacto inhibido compuesta de células
estrechamente yuxtapuestas y de crecimiento detenido. En estas
condiciones, las células permanecieron viables y retuvieron su
configuración de monocapas y aspecto morfológico normales hasta una
concentración de 2 \mug/ml de halofuginona. Uno y cinco días
después de la siembra se añadió
Na_{2}[^{35}S]O_{4}(540-590
mCi/mmoles) (40 \muCi/ml) y los cultivos se incubaron sin cambiar
el medio. A varios intervalos después de la siembra se expuso la ECM
subendotelial disolviendo (5 min, temperatura ambiente) la capa de
células con PBS que contenía tritón X-100 al 0,5% y
NH_{4}OH 20 mM, seguido por cuatro lavados en PBS [I. Vlodavsky
et al., "Lymphoma Cell Mediated Degradation of Sulfated
Proteoglycans in the Subendothelial Extracellular Matrix:
Relationship to Tumor Cell Metastasis", Cancer Res., vol.
43, pp. 2704-2711 (1983); I. Vlodavsky et
al., "Endothelial Cell-Derived Basic
Fibroblast Growth Factor: Synthesis and Deposition into
Subendothelial Extracellular Matrix", Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, vol. 84, pp. 2292-2296 (1987)]. Para
determinar la cantidad total de material marcado con sulfato, la ECM
se digirió con tripsina (25 \mug/ml, 24 h, 37ºC) y el material
solubilizado se recontó en un contador de partículas \beta.
El colágeno del tipo I se preparó a partir de
tendones de cola de ratas Sprague-Dawley adultas.
Brevemente, las fibras de colágeno se solubilizaron mediante una
lenta agitación durante 48 h a 4ºC en una disolución estéril de
ácido acético 1/10.000 (v/v) (300 ml para 1 un grupo de colágeno).
La disolución resultante se filtró a través de una gasa triple
estéril y se centrifugó a 16.000 g durante 1 h a 4ºC. A
continuación, el sobrenadante se dializó extensivamente frente a
DMEM 1/10 y se almacenó a 4ºC. El gel de matriz de colágeno se
obtuvo elevando simultáneamente el pH y la fuerza iónica de la
disolución de colágeno. Para este fin, se mezclaron rápidamente 7
volúmenes de disolución de colágeno con 1 volumen de 10 x medio
esencial mínimo y 2 volúmenes de bicarbonato de sodio (0,15 M).
Se obtuvieron aortas torácicas de ratas SD de 1 a
2 meses de edad sacrificadas por decapitación [R.F. Nicosia y A.
Ottinetti, "Growth of Microvessels in Serum-Free
Matrix Culture of Rat Aorta", Lab. Invest., vol. 63, pp.
115-122 (1990)]. Las aortas se transfirieron
inmediatamente a una placa Petri con PBS. El tejido fibroadiposo
alrededor de la aorta se separó cuidadosamente en un microscopio de
disección, y se seccionaron anillos aórticos de 1 mm de longitud y
se lavaron extensivamente en PBS.
La disolución de colágeno (0,2 ml) se añadió a
cada pocillo de 16 mm y se permitió que se produjera gelificación
durante 15 min a 37ºC. Cada anillo de aorta se transfirió y se
posicionó en el centro del gel y se vertieron cuidadosamente sobre
la superficie del anillo otros 0,4 ml de la disolución de colágeno.
Después de que se formara el gel se añadieron 0,4 ml de medio de
crecimiento endotelial exento de suero, con o sin 0,1 \mug/ml de
halofuginona, y el medio se cambió cada dos días.
Se sembraron células endoteliales aórticas
bovinas en pocillos de 16 mm de una placa de 24 pocillos y se
permitió que crecieran durante 24 h para obtener una monocapa
subconfluente. A continuación, el medio de cultivo se separó y se
vertieron sobre la superficie de la monocapa de células 0,4 ml de la
mezcla fría de colágeno anteriormente descrita y se permitió
polimerizar durante 10 min a 37ºC. Después de que el colágeno hubo
gelificado se añadió medio reciente (0,6 ml) con o sin halofuginona
en diversas concentraciones. La reorganización de la monocapa de
células endoteliales se monitorizó y fotografió con un
fotomicroscopio invertido de contaste de fases Zeiss [R. Montesano
et al., "In Vitro Rapid Organization of Endotelial
Cells into Capillary-like Networks Is Promoted by
Collagen Matrices", J. Cell Biol., vol. 97, pp.
1648-1652 (1983)].
Se obtuvieron muestras de tumores de
liomiosarcoma de ser humano de mujeres que sufrieron histerectomía
quirúrgica como describieron [R.S. Mangrulker et al.,
ibid.]. Se colocaron tejidos picados en 20 ml de disolución
amortiguadora de homogeneización fría: NaCl 1 M, Tris 10 mM (pH
7,4), EDTA 1 mM, benzamidina 1 mM, CHAPS al 0,1%, aprotinina (Sigma)
al 0,01%, leupeptina 10 \mug/ml, AEBSF 1 mM [R.S. Mangrulker et
al., ibid.]. Las muestras se homogeneizaron durante 2 min
y se centrifugaron a 12000 x g durante 60 min a 4ºC. Los
sobrenadantes se diluyeron 1:5 con Tris 10 mM (pH 7,4) hasta un
volumen final de 100 ml y se filtraron a través de filtros de nilón
de 0,45 \mum. Las células se depositaron en placas y se
mantuvieron en DMEM más suero de ternero al 10%. Las células
permanecieron viables durante varios pases pero se usaron en los
pases 2 ó 3. Para los ensayos de proliferación, las células se
depositaron en placas en placas de 96 pocillos a 10.000
células/pocillo en 200 \mul de medio (DMEM con 4,5 g/l de glucosa,
suero de ternero al 10%, glutamina al 1%, penicilina/estreptomicina
al 1%) y se incubaron 2 días hasta lograr confluencia. El medio se
cambió a DMEM con suero de ternero al 0,5%, insulina 1 \muM y
transferrina 5 \muM. Después de 24 h se añadieron las muestras
(5-10 \mul) y después de 24 adicionales se añadió
a cada pocillo [^{3}H]-timidina (1
\muCi/pocillo). Después de 36-48 h de incubación
las células se fijaron con metanol y el DNA se precipitó con ácido
tricloroacético al 5%. Las células se lisaron con 150 \mul/pocillo
de NaOH 3 N, se transfirieron a viales de centelleo y se contaron en
un contador de partículas \beta.
Células endoteliales aórticas bovinas
subconfluentes se mantuvieron en medio que contenía suero de ternero
al 10% en ausencia y presencia de 1 ng/ml de bFGF, con o sin
concentraciones crecientes de halofuginona. 4 días después de la
siembra se añadió ^{3}H-timidina (1
\muCi/pocillo) y la síntesis de DNA se midió 48 h después. Como se
demuestra en la fig. 1 se obtuvo una inhibición de la incorporación
de la ^{3}H-timidina del 50% a una concentración
de halofuginona de 100 ng/ml, independientemente de si se añadió o
no bFGF (1 ng/ml) al medio de cultivo (fig. 1).
Se ha mostrado que la ECM subendotelial promueve
la migración y la proliferación de células endoteliales vasculares
[D. Gospodarowicz et al., "The Extracellular Matrix and the
Control of Proliferation of Vascular Endothelial and Vascular Smooth
Muscle Cells", J. Supramol. Struc., nº 13, pp.
339-372 (1980)]. Esta actividad se atribuyó tanto a
constituyentes macromoleculares de la ECM como a factores de
crecimiento que enlazan heparina tales como bFGF que están asociados
con las cadenas laterales GAG de heparan sulfatos proteoglicanos en
la ECM [I. Vlodavsky et al., "Endotelial
Cell-Derived Basic Fibroblast Factor: Synthesis and
Deposition into Subendothelial Extracellular Matrix", Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, pp. 2292-2296
(1987)]. Para evaluar el efecto de la halofuginona sobre la
deposición de ECM se añadieron sulfato marcado
(Na_{2}[^{35}S]O_{4}) y halofuginona a monocapas
de células endoteliales confluentes 24 h después de sembrar. En
diferentes períodos de tiempo (días 5, 10 y 14) la capa celular se
disolvió con el fin de exponer la ECM subyacente. A continuación, la
ECM se tripsinizó y se sometió a recuento de centelleo de partículas
\beta. Se observó una inhibición de la incorporación de sulfato
casi completa a una concentración de 1 \mug/ml de halofuginona,
mientras que en presencia de 0,2 \mug/ml del fármaco se obtuvo una
inhibición de 50%.
Se sembraron células endoteliales aórticas
bovinas en pocillos de 16 mm de una placa de 24 pocillos y se
permitió que crecieran sobre la superficie de los geles durante 24
h, para obtener una monocapa subconfluente. A continuación, se
separó el medio de cultivo y sobre la superficie de la monocapa
celular se vertieron 0,4 ml de colágeno frío y se permitió
polimerizar. Después de que el colágeno hubo gelificado se añadió
medio reciente que contenía bFGF (1 ng/ml) y heparina (1 \mug/ml),
con (fig. 2B) o sin (fig. 2A) 0,1 \mug/ml de halofuginona [R.F.
Nicosia y A. Ottinetti, "Growth of Microvessels in Serum Free
Matrix Culture of Rat Aorta", Lab. Invest., vol. 63, pp.
115-122 (1990)]. Como se demuestra en la fig. 2B, la
halofuginona inhibió completamente la invasión de las células
endoteliales en el gel de colágeno y su subsiguiente organización en
una red de tubos ramificados y anastomóticos semejantes a
capilares.
Se obtuvieron aortas torácicas de ratas SD de 1 a
2 meses de edad sacrificadas por decapitación [R.F. Nicosia et
al., ibid. (1990)]. Las aortas se transfirieron a una placa
Petri y se seccionaron anillos aórticos de 1 mm de longitud y se
lavaron extensivamente en PBS. A cada pocillo de 16 mm se añadió una
disolución de colágeno del tipo I, y se permitió que se produjera
gelificación durante 15 min a 37ºC. Otros 0,4 ml de la disolución de
colágeno se vertió sobre la superficie del anillo. Después de que se
hubo formado el gel se añadió medio de crecimiento endotelial exento
de suero, con o son 0,1 \mug/ml de halofuginona, y el medio se
cambió cada dos días. La fig. 3A muestra el cultivo en el día 10,
cuando los microvasos ramificados recientemente formados se
desarrollaron desde el extremo de resección de la aorta, dando lugar
a bucles y redes. La fig. 3B muestra el mismo cultivo tratado con
0,1 \mug/ml de halofuginona, reemplazado cada dos días. En estas
condiciones, las células individuales fueron migrando desde el
anillo aórtico hacia la periferia, pero no lograron alinearse en
tubos de microvasos. La fig. 4 es una cuantificación dosis -
respuesta de este efecto.
A 100 ng/ml de halofuginona (fig. 4) se obtuvo
una inhibición casi completa de la formación de microvasos. Una
inhibición completa se observó en presencia de 250 ng/l de
halofuginona, pero la eliminación del fármaco en el día 2 ó el 6 dio
lugar a la formación de microvasos, similar a la vista con anillos
aórticos sin tratar (fig. 5).
Se investigó el efecto de la halofuginona sobre
la proliferación de células tumorales de liomiosarcoma de ser
humano. Los tumores de liomiosarcoma tienen una abundante matriz
extracelular y también están bien vascularizados [A. Ferenczy et
al., "A Comparative Ultrastructural Study of Leiomyosarcoma,
Cellular Leiomyoma and Leiomoma of the Uterus", Cancer, nº
28, pp. 1004-1018 (1971)]. Se piensa que su
crecimiento depende de los factores de crecimiento (es decir, bFGF,
HB-EGF) producidos por células miometriales normales
y malignas [A. Zhang et al.,
"Heparin-Binding Epidermal Growth
Factor-Like Growth Factor is Differentially
Regulated by Progesterone and Estradiol in Rat Uterine Epithelial
and Stromal Cells", Endocrinology, nº 134, pp.
1089-1094 (1994); R.S. Mangrulker et al.,
"Isolation and Characterization of Heparin-Binding
Growth Factors in Human Leiomyomas and Normal Myometrium",
Biology of Reproduction, nº 53, pp. 636-646
(1995)] y localmente inmersos en la ECM circundante [I. Vlodavsky
et al., "Extracellular Matrix-Bound Growth
Factors, Enzymes and Plasma Proteins", en: Basement Membranes:
Cellular and Molecular Aspects, D.H. Rohrbach y R. Timpl, Eds.,
Academic Press, Inc., Orlando, Florida, EE.UU., pp.
327-343 (1993)].
Se sembraron células tumorales subconfluentes de
liomioma de ser humano en medio que contenía suero de ternero fetal
(FCS) al 10%. 24 h después de sembrar, se añadieron concentraciones
crecientes de halofuginona (10-100 ng/ml) y 24 h más
tarde las células se expusieron a ^{3}H-timidina
(1 \muCi/pocillo). La síntesis de DNA se midió 48 h después. Como
se demuestra en la fig. 7A, a una concentración de 2,5 ng/ml de
halofuginona se obtuvo una inhibición del 60-70% de
incorporación de ^{3}H-timidina.
A las restantes células tumorales de liomioma de
ser humano se las indujo a proliferar en respuesta a FCS o al factor
de crecimiento epidérmico que se enlaza a la heparina
(HB-EGF). El crecimiento de las células tumorales de
liomiosarcoma se paró mediante incubación durante 48 h en un medio
que contenía FCS al 0,5%. A continuación, las células se expusieron
(24 h) a FCS al 10% o 10 ng/ml de HB-EGF en ausencia
o presencia de 10 ng/ml de halofuginona. A continuación, se añadió
^{3}H-timidina y 36 h más tarde se midió la
síntesis de DNA. En presencia de halofuginona se observó una
completa inhibición de la proliferación celular inducida tanto por
el suero como por el HB-EGF (fig. 7B).
En su realización más preferida, la presente
invención utiliza un compuesto no tóxico, barato, y altamente
potente que inhibe a varios componentes que participan en la
neovascularización. Por ejemplo, la halofuginona inhibe la
proliferación tanto de células endoteliales vasculares como de
células del músculo liso [E.F. Choi et al., "Halofuginona,
A Specific Collagen Type I Inhibitor, Reduces Anastomotic Intimal
Hyperplasia", Arch. Surg., vol. 130, pp.
257-261 (1995)], así como la síntesis de colágeno
[I. Granot et al., "Halofuginona: An Inhibitor of Collagen
Type I Synthesis", Biochem. Byophys. Acta, vol. 1156, pp.
107-112 (1993)] y el ensamblaje de la ECM
subendotelial, que son todos esenciales para la formación de tubos
de microvasos [J. Folkman y M. Klagsbrun, ibid. (1987); J.
Folkman e Y. Shing, ibid. (1992); J. Folkman, ibid.
(1985)]. Algunos de los enfoques actuales para inhibir la
angiogénesis utilizan agentes tales como anticuerpos
anti-integrina o agentes inhibidores de la
transducción de señales que probablemente están para ejercer un
amplio espectro de efectos [J. Folkman, ibid. (1995); P.C.
Brooks et al., "Integrin \alpha\nu\beta_{3}
Antagonists Promote Tumor Regression by Inducing Apoptosis of
Angiogenic Blood Vessels", Cell, vol. 79, pp.
1157-1164 (1994)] y por lo tanto pueden tener
efectos secundarios potenciales. Por otra parte, la halofuginona
tiene un modo de acción más específico y relativamente más estrecho.
Además, muchos de los compuestos que ahora se están evaluando como
agentes antiangiogénicos son proteínas, por ejemplo, anticuerpos,
trombospondina, angiostatina, factor IV de las plaquetas [J.
Folkman, ibid. (1995); M.S. O'Reilly et al.,
ibid. (1994); V. Castle et al., ibid.; P.C.
Brooks et al., ibid. (1994)], que se degradan
fácilmente en el cuerpo y por lo tanto se deben administrar en altas
dosis y frecuencias.
El enfoque de la presente invención utiliza un
compuesto altamente potente, no tóxico y barato. Por otra parte, la
halofuginona es un compuesto de bajo peso molecular que muy
probablemente se puede administrar oralmente. El compuesto ha sido
aprobado por la F.D.A. para uso en el tratamiento de animales de
granja. Estas características hacen de la halofuginona el fármaco
más prometedor y clínicamente útil para inhibir la
neovascularización y la angiogénesis de tumores.
Se espera que el uso de halofuginona como
compuesto no tóxico que inhibe eficientemente la formación de vasos
sanguíneos proporcione una estrategia efectiva para inhibir el
crecimiento y la extensión de tumores, así como para tratar varios
trastornos clínicos con angiogénesis prolongada, como se describió
anteriormente.
En lo que precede también se ha demostrado que la
halofuginona en concentraciones sumamente bajas (2,5 ng/ml) ejerce
una inhibición casi completa de la síntesis de DNA en células
tumorales de liomiosarcoma de ser humano, independientemente de si
las células son estimuladas por suero o por un potente factor
promotor del crecimiento tal como HB-EGF. Esta
concentración de halofuginona es 40 veces menor que la concentración
requerida para inhibir la proliferación de células endoteliales
vasculares normales, lo que indica un efecto antiproliferativo
directo y altamente potente de la halofuginona sobre las células
tumorales de liomiosarcoma.
Claims (4)
1. El uso de halofuginona para la fabricación de
una composición para atenuar la neovascularización y tratar tumores
malignos en seres humanos, composición que comprende un vehículo
farmacéuticamente aceptable y siendo la halofuginona un ingrediente
activo de la composición.
2. El uso de halofuginona, para la fabricación de
un medicamento para atenuar la neovascularización.
3. El uso de halofuginona, para la fabricación de
un medicamento para inhibir la proliferación de células tumorales en
seres humanos.
4. El uso de halofuginona, para la fabricación de
un medicamento para tratar a un paciente humano que sufre de
angiogénesis prolongada.
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