ES2201296T3 - Escualmina en combinacion con otros farmacos anticancerigenos para el tratamiento de tumores. - Google Patents
Escualmina en combinacion con otros farmacos anticancerigenos para el tratamiento de tumores.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN PROCEDIMIENTO PARA EL TRATAMIENTO DE UN TUMOR QUE INCLUYE UN PRIMER PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO QUE UTILIZA UNA TECNICA DE TRATAMIENTO CONTRA EL CANCER CONVENCIONAL, Y UN SEGUNDO PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO QUE INCLUYE LA ADMINISTRACION DE UNA CANTIDAD EFECTIVA DE ESCUALAMINA. EL PRIMER PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO PUEDE SER UN TRATAMIENTO CON UNO O MAS COMPUESTOS QUIMICOS CITOTOXICOS CONVENCIONALES. COMO EJEMPLO, EL COMPUESTO QUIMICO CITOTOXICO PUEDE SER UNA NITROSOUREA (TAL COMO BCNU), CICLOFOSFAMIDA, ADRIAMICINA, 5-FLUOROURACILO, PACLITAXEL Y SUS DERIVADOS, CISPLATINA U ORTOS AGENTES PARA EL TRATAMIENTO CONTRA EL CANCER QUE CONTENGAN PLATINO. EL COMPUESTO QUIMICO CITOTOXICO Y LA ESCUALAMINA PUEDEN ADMINISTRARSE MEDIANTE UNA RUTA ADECUADA. EL PRIMER PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO PUEDE TENER LUGAR ANTES DEL SEGUNDO PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO, DESPUES DEL SEGUNDO PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO, O LOS DOS PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO PUEDEN TENER LUGAR SIMULTANEAMENTE. COMOEJEMPLO, EL PRIMER PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO (POR EJ. UNA DOSIFICACION INTRAVENOSA DE BCNU) SE COMPLETA ANTES DE QUE COMIENCE EL SEGUNDO PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO CON ESCUALAMINA. COMO ALTERNATIVA, EL PRIMER PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO PUEDE SER UN REGIMEN DE TRATAMIENTO POR IRRADIACION CONVENCIONAL.
Description
Escualamina en combinación con otros fármacos
anticancerígenos para el tratamiento de tumores.
Esta invención se refiere a varios métodos para
usar escualamina. La escualamina, que tiene su estructura ilustrada
en la figura 1, es un aminosterol, el cual se ha aislado del hígado
de la mielga, Squalus acanthias. Este aminosterol es el
objeto de la Patente de los Estados Unidos Nº 5.192.756, de
Zasloff, y col..
Se han ideado los métodos para sintetizar
escualamina tal como los métodos descritos en el documento WO
94/19366 (publicado el 1 de septiembre de 1994). Esta solicitud PCT
también se refiere a la solicitud de patente de los Estados Unidos
Nº 08/023.347 (presentada el 26 de febrero de 1993). Los métodos
adicionales para sintetizar escualamina también se describen en la
solicitud de patente provisional Nº 60/032.378, presentada el 6 de
diciembre de 1996.
Las solicitudes de patentes de los Estados Unidos
Números 08/416.883 (presentada el 20 de abril de 1995) y 08/478.763
(presentada el 7 de junio de 1995) describen el uso de escualamina
como un agente antiangiogénico. Los usos adicionales de escualamina
(por ejemplo, como un intercambiador sodio/protón (isoforma 3), o
NHE3, agente inhibidor y un agente para inhibir el crecimiento de
las células endoteliales) y las técnicas de síntesis de escualamina
se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos Nº
08/474.799 (presentada el 7 de junio de 1995).
El resumen Nº 17264 de la publicación Document
Chemical Abstract, vol. 111, Nº 3, describe que un extracto de
hígado de mielga disminuye los efectos secundarios tóxicos de los
fármacos antitumorales ciclofosfamida y rubomicina.
La solicitud de patente japonesa Nº 84 0153040
describe la combinación de extracto de hígado de tiburón con otros
fármacos anticancerígenos; el efecto anticáncer se incrementa y se
observa baja toxicidad.
El Documento P & T, vol. 21, Nº 3, marzo
1996, páginas 159-160, describe la angiogénesis y
la actividad inhibitoria del crecimiento de tumores sólidos del
cartílago de tiburón.
Sin embargo ninguno de estos documentos describe
o sugiere el uso de la escualamina en combinación con compuestos
químicos citotóxicos y/o terapia radiactiva para tratar un
tumor.
Aproximadamente 50.000 nuevos casos de tumores
del SNC (Sistema Nervioso Central) se diagnostican cada año. De
estos, aproximadamente 35.000 son tumores metastáticos (por ejemplo,
de pulmón, mama o melanomas) y aproximadamente 15.000 son tumores
primarios (mayoritariamente astrocitomas). Los astrocitomas, junto
con otros gliomas malignos (es decir, cánceres de cerebro), son la
tercera causa de muertes por cáncer en personas de edades
comprendidas entre los 15 y los 34 años.
Las opciones de tratamiento para un paciente con
un tumor del SNC son muy limitadas. Actualmente, la cirugía es el
tratamiento de elección. La cirugía proporciona un diagnóstico
definido, liberando de la inmensa masa del tumor, y aumentando la
supervivencia del paciente. El único tratamiento coadyuvante
postquirúrgico que se conoce para trabajar con tumores del SNC es
la radiación, y ello puede prolongar la supervivencia. Sin embargo,
el tratamiento con radiación tiene muchos efectos secundarios
desagradables. Puede dañar el tejido normal del paciente, incluyendo
el tejido cerebral. La radiación puede causar también que el
paciente vomite (por ejemplo, por náuseas) y/o la pérdida temporal
de su cabello.
El otro tratamiento común postquirúrgico
coadyuvante en el tratamiento del cáncer, la quimioterapia, es
relativamente ineficaz contra tumores del SNC. Específicamente, la
quimioterapia contra los tumores del SNC con nitrosoureas no es
curativa. Algunos otros agentes para tratar el cáncer han sido
estudiados y probados, pero generalmente han tenido un efecto
mínimo en aumentar la supervivencia.
En vista de estas limitadas opciones de
tratamiento, el pronóstico actual para personas con tumores del SNC
no es bueno. El término medio de supervivencia para pacientes con
astrocitomas malignos que han sido tratados con cirugía y ningún
tratamiento coadyuvante es aproximadamente de 14 semanas. La terapia
con radiación tras la cirugía extiende la media a aproximadamente
36 semanas. La actual tasa de supervivencia de dos años para todas
las formas de tratamiento es menor del 10%.
Para maximizar la supervivencia, es crítico
comenzar el tratamiento en los primeros estadios del desarrollo del
tumor del SNC. Típicamente, la extensión de la angiogénesis del
tumor (es decir, la formación de vasos sanguíneos) correlaciona con
la supervivencia en el paciente. Los tumores del SNC están entre
los más angiogénicos de todos los tumores humanos. Cuando el tumor
es pequeño, sin embargo, está en una fase "avascular", y su
crecimiento está restringido mediante un mecanismo de difusión (es
decir, las células reciben su nutrición, etc., por difusión dentro
de la célula). En esta fase, el tumor es viable, pero no crece, y
es incapaz de dispersarse. Con el tiempo, sin embargo, comienza la
angiogénesis, y el tumor pasa a una fase "vascular". En esta
fase, la perfusión desplaza a la difusión como el mecanismo de
crecimiento, y el crecimiento del tumor es exponencial (es decir,
el tumor tiene sus propios vasos sanguíneos para proporcionarle
nutrientes, etc.). Las células mitóticas se apiñan en torno a los
nuevos vasos sanguíneos y la metástasis tiene lugar en la fase
vascular (es decir, el tumor puede dispersarse por otras áreas del
cuerpo). Por lo tanto, mediante el tratamiento temprano del tumor
(antes de que alcance la fase vascular), se puede esperar inhibir
la dispersión metastático del mismo modo que controlar el tumor
primario.
Otros tipos de cáncer también son difíciles de
combatir por los tratamientos del cáncer conocidos. El cáncer de
pulmón mata anualmente más ciudadanos americanos que las cuatro
siguientes neoplasias más frecuentemente diagnosticadas combinadas.
Las estimaciones para 1994 indican más de 170.000 nuevos casos de
cáncer de pulmón y aproximadamente 150.000 muertes (Boring y col.;
CA Cancer J. Clin. 1994, 44; 7-26). Aproximadamente
el 80% de los tumores primarios de pulmón son de la variedad no
microcelular, lo cual incluye carcinomas de células escamosas y de
células grandes, de la misma manera que adenocarcinomas.
La modalidad de una sola terapia se considera
apropiada para la mayoría de los casos en los estadios temprano y
tardío del cáncer de pulmón no microcelular (CPNM). Los estadios
tempranos del tumor son potencialmente curables mediante cirugía,
quimioterapia o radioterapia, y los pacientes en un estadio tardío
de la enfermedad usualmente reciben quimioterapia o el mejor
tratamiento de soporte. El CPNM en un estadio intermedio o el CPNM
localmente avanzado, el cual incluye del 25% al 39% de todos los
casos de CPNM, es tratado más típicamente con una terapia
multimodalidad. Éste es un estado del desarrollo del tumor donde la
angiogénesis es un factor muy importante. Los nuevos vasos
sanguíneos son necesarios para proporcionar soporte al futuro
crecimiento del tumor y para el desarrollo de las metástasis. Por
lo tanto, este estado es flexible para su tratamiento con agentes
antiangiogénicos para prevenir el desarrollo de nuevos vasos
sanguíneos. La eficacia de esta terapia puede incrementarse aún más
mediante la combinación de la terapia antiangiogénica con la
quimioterapia citotóxica o terapia con radiación para eliminar el
tumor existente.
El cáncer de mama presenta también dificultades
de tratamiento usando los agentes conocidos. La incidencia del
cáncer de mama en los Estados Unidos ha ido aumentando en una tasa
de aproximadamente un 2% desde el año 1980, y la Asociación
Americana del Cáncer estima que 182.000 casos de cáncer de mama
invasivo se diagnosticaron en 1995. El cáncer de mama es usualmente
tratado con cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal,
o combinaciones de varios de los métodos. Como otros tumores
sólidos, el cáncer de mama requiere el desarrollo de nuevos vasos
sanguíneos que apoyen su desarrollo más allá de un cierto tamaño,
y, en ese estado de su desarrollo, será flexible al tratamiento con
agentes antiangiogénicos.
Una razón principal del fallo de la quimioterapia
en el cáncer de mama es el desarrollo de resistencia a los fármacos
citotóxicos. La combinación de terapia usando fármacos con
diferentes mecanismos de acción es un método aceptado de
tratamiento que previene el desarrollo de resistencia por el tumor
tratado. Los agentes antiangiogénicos son particularmente útiles en
la terapia combinada porque no es probable que provoquen el
desarrollo de resistencia ya que no actúan sobre el tumor, sino
sobre el tejido hospedador normal.
Un objeto de esta invención es proporcionar
productos para el tratamiento de tumores malignos y cancerosos
conteniendo escualamina, en combinación con otros agentes
convencionales de tratamiento del cáncer. En un aspecto de la
invención, se tratarán los tumores del SNC; en otro aspecto, se
tratarán los tumores pulmonares; y en otro más, se tratarán los
tumores de mama.
En un procedimiento acorde con la invención, se
usará la escualamina en combinación con agentes convencionales de
tratamiento del cáncer adaptados para el tratamiento de tumores. Se
tratará el tumor mediante la administración de una cantidad
efectiva de un compuesto químico citotóxico en un primer
procedimiento de administración, y se administra una cantidad
efectiva de escualamina en un segundo procedimiento de
administración.
En este procedimiento, el componente químico
citotóxico usado en el primer procedimiento de administración es un
agente convencional para el tratamiento del cáncer. Los agentes
preferibles incluyen una nitrosourea, ciclofosfamida, adriamicina,
5-fluorouracilo, paclitaxel y sus derivados, y
cisplatina y compuestos de platino relacionados. Estos agentes
convencionales de tratamiento del cáncer son bien conocidos para
aquellos expertos en esta técnica. Destacan M.C. Wiemann y Paul
Calabresi, "Pharmacology of Antineoplasic Agents", Medical
Oncology, capítulo 10, editado por Paul calabresi y col.,
McMillan Publishing (1985). Una nitrosourea particularmente
preferida es la BCNU, la cual se conoce también como carmustina.
Otro agente citotóxico preferido es la cisplatina, y otro más es la
ciclofosfamida. Otros compuestos químicos citotóxicos
convencionales, tales como aquellos que se describen en Medical
Oncology supra., pueden ser usados sin salir de la
invención.
Los compuestos químicos citotóxicos para
administrarse en el primer paso de administración pueden ser
administrados mediante cualquier tácnica convencional usada en la
técnica (por ejemplo, oralmente, subcutáneamente,
intralinfáticamente, intraperitonealmente, intravenosamente, o
intramuscularmente). En una realización de la invención, se
administrará la composición química citotóxica (preferiblemente
BCNU, cisplatina o ciclofosfamida) intravenosamente. Asimismo, la
escualamina puede ser administrada mediante cualquier método
convencional de administración conocido en la técnica, tal como
aquellos mencionados anteriormente. Se usarán las inyecciones
subcutáneas de escualamina una o dos veces al día en una realización
de esta invención. Se usará la administración intravenosa de
escualamina una o dos veces al día en otra realización de la
presente invención.
El primer procedimiento de administración con el
compuesto químico citotóxico puede tener lugar antes del segundo
procedimiento de administración (usando escualamina), después del
segundo procedimiento de administración, o al mismo tiempo que el
segundo procedimiento de administración. Además, el primer
procedimiento de administración puede completarse antes de que el
segundo procedimiento de administración se inicie (o viceversa). En
una realización de la invención, el primer procedimiento de
administración es una administración intravenosa de un compuesto
químico citotóxico (por ejemplo, BCNU, cisplatino o
ciclofosfamida), y el segundo procedimiento de administración
implica inyecciones subcutáneas diarias de escualamina.
En un segundo procedimiento para tratar un tumor
de acuerdo con la invención, el primer paso del procedimiento es
una exposición a radiación, la cual puede ser una o varias
modalidades convencionales de radiación, usando un régimen de
tratamiento convencional con radiación conocido para aquellos
expertos en la técnica. El tumor se expondrá a radiación en este
primer paso del procedimiento. En un segundo paso del
procedimiento, una cantidad efectiva de escualamina se administrará
para tratar el tumor. El momento apropiado para el procedimiento de
exposición a la radiación con respecto a la administración de
escualamina puede determinarse por aquellos expertos en la técnica
a través de la experimentación de rutina para proporcionar un
tratamiento tumoral efectivo.
Esta y otras características ventajosas de la
invención se apreciarán plenamente cuando se tengan en cuenta la
siguiente descripción detallada de la invención y los dibujos
anexos, en los cuales:
La figura 1 muestra la fórmula estructural
general de la escualamina;
la figura 2 muestra una vista general del proceso
angiogénico;
la figura 3 es un dibujo usado para ilustrar el
proceso del intercambiador sodio-hidrógeno;
la figura 4 ilustra los efectos de las amiloridas
convencionales en la inhibición de varias isoformas de los NHEs de
mamíferos;
las figuras 5a y 5b ilustran el efecto de la
escualamina sobre la isoforma 3 del NHE (NHE3) y sobre la
inhibición del NHE1, respectivamente;
las figuras 6a y 6c muestran los resultados de un
estudio farmacocinético relativo a la escualamina;
la figura 7 ilustra la distribución de la
escualamina en varios tejidos tras la administración
intravenosa;
la figura 8 muestra un índice de angiogénesis
utilizando escualamina como se ha determinado en el microensayo de
bolsillo en córnea de conejo;
la figura 9 muestra el efecto inhibitorio de la
escualamina en el crecimiento de las células endoteliales en
comparación con líneas celulares tumorales;
la figura 10 ilustra los resultados de las
pruebas de supervivencia utilizando escualamina en un estudio de la
letalidad de los gliomas con un glioma de rata 9L introducido en el
cerebro de ratas sanas;
la figura 11 muestra la supervivencia de ratones
portadores del tumor de mama humano MX-1 y tratados
con escualamina posteriormente a un tratamiento con
ciclofosfamida;
la figura 12 representa la inhibición de un
adenocarcinoma de pulmón humano (H460) en un estudio de terapia
combinanada con escualamina y cisplatino en un xenotransplante en
ratón;
la figura 13 ilustra el número de metástasis en
pulmón siguiendo varios procedimientos de tratamientos
quimioterapéuticos en ratones con carcinomas de pulmón de Lewis
implantados subcutáneamente.
Se ha reconocido que la escualamina tiene
actividad inhibidora de angiogénesis, es decir, inhibe la formación
de vasos sanguíneos. Por lo tanto, se cree que la escualamina, como
un agente antiangiogénico, será efectiva en el tratamiento de
ciertas enfermedades o achaques que dependen de neovascularización.
Por ejemplo, la escualamina puede usarse para tratar afecciones
dispares tales como tumores sólidos, degeneración macular,
retinopatía diabética, psoriasis, o artritis reumatoide, todo lo
cual requiere un flujo sanguíneo diferente y nuevo.
Además, la escualamina puede inhibir
selectivamente ciertos intercambiadores sodio/protón (también
llamados "NHEs" o "bombas de protones" en esta solicitud).
Se sabe que existen varias isoformas diferentes de NHE en mamíferos
(por ejemplo, NHE1, NHE2, NHE3, NHE4, y NHE5). Se ha hallado que la
escualamina inhibe específicamente NHE3 y no NHE1 o NHE2. Por
tanto, la escualamina puede usarse para tratar las afecciones
dependientes de proliferación o activación, las cuales dependen de
la función del NHE3, tales como cáncer, enfermedades virales, y el
daño por reperfusión isquémica.
Otros estudios con escualamina y NHE han
demostrado que la escualamina actúa sobre una porción muy
específica de NHE3, denominada los 76 aminoácidos carboxiterminales
de la molécula. Si esta porción de la molécula NH3 es removida, la
escualamina no tendrá virtualmente ningún efecto sobre la actividad
de la molécula, incluso si la molécula continúa activa como un
intercambiador sodio/protón.
Los solicitantes han descubierto aún más usos de
la escualamina. Los solicitantes han encontrado específicamente que
la escualamina, en combinación con agentes convencionales de
tratamiento de cáncer, por ejemplo, componentes químicoa
citotóxicos y tratamientos radiactivos, los cuales disminuyen el
tamaño y el crecimiento de los tumores. De forma incluso más
significativa, los solicitantes han encontrado que la combinación
disminuye la tasa de crecimiento de los tumores del SNC altamente
proliferativos, los tumores pulmonares, y los tumores de mama, y
pueden conferir ventajas de supervivencia.
En la práctica de este aspecto de la invención,
se usa un compuesto químico citotóxico en un primer procedimiento
de tratamiento del tumor, y la escualamina se usa en un segundo
procedimiento de tratamiento del tumor. Los pasos de administración
primero y segundo pueden llevarse a cabo en cualquier secuencia
temporal o incluso simultáneamente. En otra realización, dos o más
agentes químicos citotóxicos pueden ser administrados
simultáneamente o secuencialmente en el primer proceso de
tratamiento.
El(los) compuesto(s)
químico(s) citotóxico(s) que se usan en el primer
paso del procedimiento puede(n) ser
cualquier(cualesquiera) agente(s)
convencionale(s), pero es preferible uno de los siguientes
agentes; una nitrosourea, ciclofosfamida, adriamicina,
5-fluorouracilo, paclitaxel y sus derivados, y la
cisplatina y compuestos de platino relacionados. Estos materiales
son agentes convencionales de tratamiento del cáncer los cuales son
conocidos por todos aquellos expertos en esta técnica, como se
señala delante en Medical Oncology, supra. Una
nitrosourea particularmente preferida es BCNU, la cual también se
conoce como "carmustina" o
1,3-Bis(2-cloroetil)-l-nitrosourea.
La ciclofosfamida también se conoce como ácido
N,N-Bis-(2-cloroetil)-N'-(3-hidroxipropil)fósforodiamidico
cicloéster monohidrato. La adriamicina también se conoce como
doxorrubicina.
El Paclitaxel está disponible bajo el nombre
comercial "Taxol". Varios derivados del paclitaxel pueden
usarse de acuerdo con la invención, tales como taxotero u otros
taxanos relacionados. La cisplatina, otro de los compuestos químicos
citotóxicos que pueden usarse de acuerdo con la invención, también
es conocidacomo cis-Diaminodicloroplatino. Aquellos
que de ordinario son expertos en la técnica estarán familiarizados
con otros agentes citotóxicos específicos que pueden usarse en los
procedimientos de la invención.
No hay limitaciones sobre los agentes
quimioterapéuticos que pueden usarse en esta invención. Otros
agentes quimioterapéuticos convencionales que pueden usarse con
escualamina en los procedimientos de la invención incluyen
metotrexato, tiotepa, mitoxantrona, vincristina, vinblastina,
etopósido, ifosfamida, bleomicina, procarbacina, clorambucil,
fludarabina, mitomicina C, vinorelbina, y gemcitabina.
El primer paso de administración y/o el segundo
pueden llevarse a cabo mediante una técnica adecuada, tal como la
oral, "s.q.", "i.p.", "i.m.", o "i.v.". En esta
solicitud, los términos "s.q.", "i.p.", "i.m.",
"i.l.", e "i.v." pueden usarse para referirse a la
administración subcutánea de escualamina y otras sustancias, la
administración intraperitoneal de escualamina y otras sustancias,
la administración intramuscular de escualamina y otras sustancias,
la administración intralinfática de escualamina y otras sustancias,
y la administración intravenosa de escualamina y otras sustancias,,
respectivamente.
En una realización, se administra la BCNU a un
paciente, primero como una dosis intravenosa única, y a partir de
entonces se inyectará escualamina s.q. dos veces al día. En otra
realización, la ciclofosfamida es el agente citotóxico. En otra
realización, la cisplatina es el agente citotóxico. Si es apropiado,
el compuesto químico citotóxico y la escualamina se pueden llevar
simultáneamente por un portador farmacéutico común (por ejemplo,
una inyección que contenga tanto escualamina como el compuesto
químico citotóxico). Otras combinaciones apropiadas de técnicas de
administración pueden usarse sin desviarse de la invención.
Aquellos expertos en la técnica serán capaces de determinar los
regímenes de tratamiento apropiados, dependiendo de los productos
químicos citotóxicos usados, las dosis, etc., a través de
experimentación de rutina.
El procedimiento del tratamiento con escualamina
en concordancia con la invención también puede usarse con
tratamiento radiactivo (por ejemplo, tratamiento con cobalto o con
rayos X) como primer paso del procedimiento. En esta realización de
la invención, el primer paso del procedimiento es un exposición a
radiación, y el segundo paso del procedimiento es la administración
de escualamina. La exposición a radiación puede desarrollarse en un
programa en combinación con la administración de escualamina para
proporcionar resultados óptimos. Tal programación de los
procedimientos del tratamiento puede establecerse por los técnicos
expertos a través de la experimentación de rutina. Cualquier
exposición convencional a la radiación, tal como aquellas que se
describen en Medical Oncology, supra., puede ser
usada sin desviarse de la invención. Además de la radiación y la
administración de escualamina, el tumor también puede tratarse con
uno o más de los compuestos químicos citotóxicos en un tercer paso
del procedimiento.
La invención describirá más abajo en términos de
varios ejemplos específicos y realizaciones preferidas. Estos
ejemplos o realizaciones se consideraría que son ilustrativos de la
invención, y no como límite de la misma.
Se ha demostrado que la escualamina es útil como
un agente antiangiogénico, es decir, la escualamina inhibe la
angiogénesis. La angiogénesis, el proceso de formación de nuevos
vasos sanguíneos, ocurre en muchos procesos fisiológicos básicos,
tales como la embriogénesis, la ovulación, y la curación de
heridas. La angiogénesis también es esencial para la progresión de
muchísimos procesos patológicos, tales como la retinopatía
diabética, la inflamación, y la malignidad (desarrollo del tumor).
En vista de sus propiedades antiangiogénicas, la escualamina puede
usarse para tratar varios achaques y afecciones los cuales dependen
de angiogénesis, tales como aquellos identificados
anteriormente.
La angiogénesis es un proceso de múltiples pasos,
el cual se ilustra esquemáticamente en la figura 2. Primero, las
células endoteliales deben llegar a ser activadas, por ejemplo,
mediante el acoplamiento con un factor de crecimiento tal como un
factor de crecimiento endotelial vascular ("VEGF") o un factor
de crecimiento básico de fibroblastos
("b-FGF"). Entonces, las células se mueven, se
dividen y digieren su camino a través de la matriz extracelular
hacia dentro del tejido adyacente. Las células entonces vienen a
formar juntas capilares y establecen una nueva membrana basal. Estos
procesos de angiogénesis se ilustran en la parte superior de la
figura 2. Cada uno de esos estados de desarrollo durante la
angiogénesis es importante y puede afectarse mediante agentes
antiangiogénicos.
Ciertos compuestos de los cuales se cree que son
compuestos antiangiogénicos (por ejemplo, inhibidores de la matriz
metaloproteinasa, tales como minociclina, SU101 o marimistato)
actúan en los últimos estadios de este proceso de múltiples pasos
que es la angiogénesis. Nos referiremos a estos compuestos como
inhibidores "downstream" (corriente abajo) de la angiogénesis.
Para una discusión acerca de los inhibidores de la matriz
metaloproteinasa, acudan por favor a Teicher, Critical Reviews in
Oncology/Hematology, Vol. 20 (1995), páginas
9-39. En contraste con estos compuestos
antiangiogénicos conocidos, la escualamina actúa sobre el proceso en
un estadio muy temprano, mediante la inhibición de la acción
activadora de las células de los factores de crecimiento, es decir,
es un inhibidor "upstream" (corriente arriba) de la
angiogénesis. Como se muestra en la figura 2 (hacia el final), la
escualamina inhibe las bombas sodio-protón que
están normalmente activas y activadas por los factores de
crecimiento. La inhibición de las bombas de protones sitúa a la
célula en un estado quiescente, y, de esta formas, la formación de
capilares y la angiogénesis se impiden. En efecto, la señal del
factor de crecimiento se anula en presencia de escualamina.
Además de las características antiangiogénicas,
la escualamina ha mostrado tener un efecto de regresión capilar en
los capilares formados recientemente. Una única dosis (100 ng) de
escualamina se aplicó a los lechos capilares de embriones tempranos
de pollo que tenían 2 ó 3 días. Después de cinco minutos, esta dosis
de escualamina pareció tener un pequeño efecto en los lechos
capilares. En veinte minutos, sin embargo, el lecho capilar comenzó
a desaparecer (es decir, los vasos parecieron cerrarse). Después de
cuarenta minutos, se observó una regresión capilar original.
Se observó también el lecho capilar después de
sesenta minutos. En ese momento, se notó que algunos vasos
capilares comenzaban a reaparecer, pero sólo los vasos más
principales reaparecían. Los vasos pequeños no reaparecieron en ese
momento. Cuatro o cinco días después del tratamiento único con
escualamina, el efecto de la dosis de escualamina no fue aparente
por mástiempo, pero los capilares nuevamente formados en los
embriones permanecieron susceptibles a la regresión inducida por
escualamina por tiempo limitado mientras fueron de nueva
formación.
De esta prueba, los solicitantes concluyeron que
la regresión capilar inducida por la escualamina es reversible, al
menos con respecto a ciertos capilares. También concluyeron que la
escualamina es más efectiva contra pequeños vasos sanguíneos
microcapilares (es decir, el lecho microvascular) en comparación con
los vasos sanguíneos principales. Un examen histológico cercano de
los microvasos de pollo expuestos a escualamina reveló que la
oclusión de los vasos se debió a encogimiento de los volúmenes de
las células endoteliales en las células que envuelven alrededor la
luz de los vasos. Los solicitantes postulan que la oclusión o
regresión de los vasos sanguíneos pequeños mediante escualamina
contribuye significativamente a impedir el flujo de nutrientes y
factores de crecimiento dentro de los tumores y, de este modo,
detener o bloquear la tas de crecimiento de los tumores.
El crecimiento y la división celular son
necesarios para el crecimiento y la formación de los vasos
sanguíneos y capilares. La formación de los capilares requiere una
matriz extracelular específica. El sistema antitransportador NHE de
las células puede activarse por diferentes vías. Por ejemplo, la
fibronectina insoluble activa el antitransportador NHE apiñando e
inmovilizando la integrina \alpha_{v}\beta_{l},
independientemente de la forma de la célula (el crecimiento de las
células dependiente de anclaje requiere mitógenos solubles y
moléculas insolubles de la matriz). Además, la unión de los
estímulos a la matriz extracelular o los eventos de unión celulares
en los que están implicados a los virus activan también el
antitransportador NHE.
Cuando está activado, el antitransportador NHE
induce crecimiento celular mediante la regulación del pH celular.
Tal como se muestra en la figura 3, el intercambiador
cloruro-bicarbonato y el NHE son reguladores
complementarios de pH en las células. El intercambiador
cloruro-bicarbonato hace que la célula llegue a ser
más alcalina, mientras que el NHE contribuye al control de la
concentración del ión hidrógeno en la célula. Cuando el NHE está
inhibido, las células llegan a ser ácidas (menor pH) y el
crecimiento se detiene. Ello no significa que la célula muera;
significa sólo que las células entran en un estado de quiescencia
(es decir, no se dividen). Si las células vuelven a un pH normal,
el crecimiento puede reanudarse. Cuando el NHE está activado, las
células llegan a ser más alcalinas (mayor pH), él bombea los
protones hacia fuera, y se gana crecimiento. La interacción de
varios factores moduladores (por ejemplo, componentes del suero,
mensajeros secundarios, etc.) con una porción de la región
citoplásmica de NH3 activa al antitransportador, mientras que la
interacción con otra porción inhibe al antitransportador. Estas
porciones de NHE se describen en Tse, y col., "The Mammalian
Na^{+}/H^{+} Exchanger Gene Family - Inicial Structure/Function
Studies", J. Am. Soc. Nephr., Vol. 4 (1993), pg. 969,
et seq. Este artículo está enteramente incorporado en este
documento por referencia.
Las bombas sodio-protón (NHEs)
son responsables de diferentes estímulos de crecimiento los cuales
activasn la bomba. Como se ha destacado arriba en relación con la
figura 2, la bomba de protones puede activarse mediante la unión de
factores de crecimiento (por ejemplo, VEGF y b-FGF)
a la célula. Adicionalmente, como se muestra en la figura 3, otros
estímulos, como la unión de virus, la adición de varios mitógenos,
la unión del espermatozoide al óvulo, etc., también pueden causar
la activación del NHE y la alcalinización de la célula. La unión de
esos estímulos a la matriz extracelular activa el antitransportador
NHE de la célula e induce el crecimiento celular.
El efecto de la escualamina en la actividad de
NHE se midió para determinar cuáles isoformas de NHE eran afectadas
por la escualamina. La actividad NHE puede medirsecuando las células
están en un estado no estimulado, porque los antitransportadores,
incluso si no están estimulados, continúan funcionando a una tasa
lenta, pero no igual a cero. En cada una de estas condiciones
celulares, la actividad del NHE se mide usualmente en ausencia de
bicarbonato.
Las amiloridas, las cuales son los inhibidores
clásicos de los antitransportadores NHE activados y actúan como
competidoras directas de la unión del ión Na^{+} a NHE, no
desconectan la actividad antirtransportadora en células no
estimuladas. Como se ilustra en la figura 4, la amilorida y los
análogos de la amilorida actúan específicamente contra NHE1 por
encima de NHE2 o NHE3. El NHE3 en particular es relativamente
resistente a la inhibición mediante amiloridas, En contraste con las
amiloridas, cuando se midió la actividad del NHE1 en las células no
estimuladas de melanoma, los candidatos encontraron que la
escualamina regula a la baja sustancialmente la actividad del
antitransportador.
Lo siguiente describe la prueba usada para
determinar que la escualamina inhibe NHE3, pero no NHE1 o NHE2. Las
células fibroblásticas deficientes en NHE (PS120) transfectadas con
un gen humano individual NHE se cargaron con un tinte
2'7'-bis(2-carboxietil)-5,6-carboxifluoresceína
(BCECF) sensible a pH. La actividad de NHE se midió por métodos
espectrofluorimétricos usando este tinte y mediante el incremento en
la célula, sensible a amilorida, del isótopo ^{22}Na^{+}. Las
células se acidificaron mediante exposición a cloruro de amonio en
la ausencia de sodio para eliminar el sodio y desactivar las bombas
de protones. El cloruro de amonio fue lavado mediante la exposición
de las células a cloruro de tetrametilamonio en medio libre de
bicarbonato. La célula, consecuentemente, se acidificó, pero en la
ausencia de sodio, las bombas iónicas NHE no se activaron. Para
esta prueba, como se muestra en las figuras 5a y 5b, se añadieron a
las células en cada caso 7 \mug/ml de escualamina. El sodio se
volvió a añadir entonces a varias concentraciones (véase la abcisa
de las figuras 5a y 5b) para controlar los antitransportadores
(NHE3 humano en la figura 5a y NHE1 humano en la figura 5b). Los
antitransportadores se condujeron a diferentes tasas, como se
evidencia por el cambio en el nivel de pH celular, dependiendo de
la cantidad de sodio añadido. Como se muestra en la figura 5a,
cuando se miden los efectos de la escualamina en el
antitransportador humano NHE3, el cambio en el nivel de pH es menor
en las células tratadas con escualamina que el cambio de pH en el
grupo control (sin escualamina). Esto indica que la escualamina
inhibe el NHE3 humano. En la figura 5b, sin embargo, no hay una
diferencia efectiva en el cambio del nivel de pH entre las muestras
tratadas y las control cuando se mide el antitransportador humano
NHE1. Los solicitantes concluyeron, a partir de estas pruebas, que
la escualamina inhibe el NHE3 humano, pero no el NHE1 humano.
Adicionalmente, en pruebas similares, se encontró que el NHE1 y el
NHE2 de conejo no son afectados por la escualamina, pero el NHE3 de
conejo se inhibe mediante un tratamiento con escualamina.
En las células transfectadas usadas en esta
prueba, esto llevó al menos 30 minutos antes de que se observaran
efectos inducidos por escualamina de inhibición del NHE3. Así, la
escualamina no actúa como los inhibidores clásicos de NHE -amilorida
o análogos de amilorida- los cuales son inhibidores competitivos
directos para sodio, y, por lo tanto, actúan rápidamente como
inhibidores de NHE. Además, se ha observado que el efecto inhibidor
de NHE de la escualamina ocurre en la ausencia de filtración de
lactasa deshidrogenasa (LDH) desde la célula. Se concluyó que la
escualamina no tiene un efecto citotóxico general, porque la
filtración de LDH es un marcador inespecífico de citotoxicidad.
Esta actividad inhibidora de NHE3 de la
escualamina se ha acotado en el mapa de la proteína a los 76
aminoácidos carboxiterminales de la molécula de NHE3. Si los 76
aminoácidos carboxiterminales del NHE3 de conejo son eliminados de
la molécula, se ha hallado que la escualamina no tiene virtualmente
ningún efecto sobre la actividad de la molécula, mientras que la
molécula permanece activa como un intercambiador sodio/hidrñogeno.
Así, los 76 aminoácidos carboxiterminales de NHE3 son el sitio de
inhibición por escualamina. Se cree que el efecto de la escualamina
sobre estas proteínas accesorias de NHE3 está ligado a un efecto
inhibitorio sobre la actividad dependiente de tirosinquinasa,
aunque los solicitantes no desean estar unidos por ninguna teoría
específica de operación.
Como se destacó más arriba, se ha concluido que
la escualamina inhibe NHE3 y no NHE1. Sin embargo, se ha hallado
que este efecto inhibitorio de la escualamina trabaja de una manera
diferente a los inhibidores de NHE3 clásicos y conocidos. En
contraste con la escualamina, otros inhibidores de NHE3 (por
ejemplo, amilorida, análogos de amilorida, genesteína, calmodulina,
y proteínquinasa C) inhiben también NHE1. Tales inhibidores afectan
sólo el número absoluto de protones que son secretados por la célula
(es decir, "V_{máx}"), si uno mira a las características
cinéticas de la inhibición. La escualamina, en el otro extremo, no
sólo inhibe V_{máx}, sino que también fuerza a la célula a caer a
un pH más bajo, como se evidencia mediante la reducción del valor de
Km. Destaca la tabla 1 siguiente, la cual correlaciona con los
datos recogidos en la prueba de la figura 5a.
| Escualamina (7 \mug/ml) | Control | |
| Km | 0,338 | 0,595 |
| n | 1,88 | 1,22 |
| V_{máx} | 1282 | 2958 |
Así, la escualamina inhibe NHE con un cinetica no
alostérica (es decir, no es una inhibición alostérica clásica). En
pruebas adiciconales, también se encontró que la escualamina (a una
hora de pretratamiento) disminuía la V_{máx} del NHE3 de conejo
de una manera dependiente de concentración (13%, 47% y 57% con 1, 5
y 7 \mug de escualamina /ml, respectivamente). Esto observó que
el efecto sobre la V_{máx} de la escualamina era dependiente del
tiempo, con un efecto máximo que tiene lugar a una hora de
exposición. El efecto observado fue plenamente reversible dentro de
las tres horas siguientes a quitar las células del medio.
En vista de los resultados de la prueba relativos
al efecto de la escualamina en NHE3, los solicitantes creen que el
NHE3 es importante en el mantenimiento de la homeostasis en la
célula no estimulada. Los solicitantes creen además que la
prevención de la activación celular con escualamina, especialmente
la activación de las células epiteliales y las células precursoras
que participan en la formación de nuevos vasos sanguíneos durante
la vascularización patofisiológica (tal como durante el crecimiento
tumoral), es el mecanismo a través del cual la escualamina inhibe el
crecimiento del tumor).
Los solicitantes han observado además que la
escualamina cambia la forma de las células endoteliales. Esto
sugiere que las proteínas de transporte, las cuales controlan el
volumen y la forma de las células, pueden ser una diana de
escualamina.
Pruebas adicionales de escualamina han indicado
que la escualamina elimina las vesículas de membrana de borde en
cepillo (BBMV) NHE sólo cuando el tejido se pretrató con
escualamina (51% de inhibición a 30 minutos de exposición). La
adición directa de escualamina a los fibroblastos PS120 durante la
medida de la acción del intercambiador no tuvo efecto.
Un estudio farmacocinético de la escualamina fue
realizado para determinar el tiempo de residencia de la escualamina
en el cuerpo. Las figuras de la 6a a la 6c ilustran los resultados
de la prueba donde la escualamina fue administrada subcutáneamente
(50 mg/kg, figura 6a), intraperitonealmente (dosis 240 \mug; 10
mg/kg, figura 6b), e intravenosamente (10 mg/kg, figura 6c). La
vida media de la escualamina cuando se administra intravenosamente
(figura 6c) fue aceptable (35os), pero fue incluso mayor cuando se
administró intraperitonealmente (figura 6b, vida media=172 minutos)
y subcutáneamente (figura 6a, vida media = 5,6 horas).
Además de estas pruebas de vida media de
escualamina, los solicitantes han probado a establecer la
distribución de la escualamina en un ratón después de una
administración intravenosa. La figura 7 ilustra la distribución de
la escualamina en un ratón tras su administración intravenosa. La
figura 7 ilustra la distribución de la escualamina en tejido de
ratón dos horas tras su administración i.v. Hay algo de escualamina
contenida en la mayoría de los tejidos, pero la mayoría de la
escualamina se concentra en el hígado y en el intestino delgado.
Los resultados de la prueba mostrados en la figura 7 indican una
buena distribución de escualamina. Notablemente, sin embargo, no hay
mucha escualamina presente en el tejido cerebral. Por esto, los
solicitantes concluyen que la escualamina probablemente no cruza la
barrera cerebrovascular. En el tratamiento de tumores cerebrales,
se cree que la escualamina actúa sobre las células endoteliales en
el cerebro, y de esta manera, no necesita cruzar la barrera
cerebrovascular.
Los siguientes ejemplos describen experimentos
más detallados usados para probar las características angiogénicas
de la escualamina en el proceso de la invención.
En la determinación de si un compuesto es
antiangiogénico, el microensayo corneal de bolsillo en conejo es
una prueba estándar aceptada. En esta prueba, se realiza una
incisión en una córnea de conejo, y se sitúa un estímulo en la
incisión. El estímulo se usa para inducir la formación de vasos
sanguíneos en la región corneal, normalmente avascular. Como un
ejemplo, un tumor sólido en una matriz polimérica puede estar
situado en la córnea como el estímulo, porque el tumor liberará un
número de factores de crecimiento angiogénicos para estimular el
nuevo crecimiento capilar. Los factores de crecimiento angiogénicos
derivados del tumor estimulan las células endoteliales en la unión
escleral en el ojo para iniciar el crecimiento de los vasos
sanguíneos hacia el estímulo. Un segundo gránulo de polímero (por
ejemplo, un copolímero etilen/vinil acetato) se sitúa entre la
unión escleral y el estímulo. Éste gránulo de polímero está o bien
vacío (un gránulo control negativo de la prueba) o bien contiene un
compuesto cuyas características antiangiogénicas han de probarse.
El gránulo de polímero se usa para proporcionar una liberación
controlada del material a estudiarse. Debido a los antecedentes
avasculares de la córnea, en la córnea del conejo alguien puede
evaluar visualmente los resultados cualitativamente. Además, el
número de vasos sanguíneos puede contarse, y su longitud, etc.,
puede medirse para proporcionar una evaluación más cuantitativa de
los resultados.
El carcinoma de conejo VX2 se implantó en 26 ojos
de conejo, en la normalmente avascular región de la córnea, para
actuar como un estímulo de angiogénesis. La escualamina se incorporó
dentro de una liberación controlada de copolímero etilen/vinil
acetato (20% de escualamina y 80% de polímero -en peso-). Los
gránulos cargados de polímero se situaron en 13 de las córneas para
proporcionar una liberación de escualamina local sostenida. Los
polímeros en blanco se proporcionaron en los 13 ojos restantes como
un control. De esta manera, un ojo de cada conejo sirve como el ojo
de la prueba de escualamina, y el otro ojo del mismo conejo sirve
como ojo control. Los ojos se examinaron semanalmente usando un
estereomicroscopio de lámpara de hendidura por tres semanas después
de la implantación del tumor, y el Índice de Angiogénesis
("AI") se calculó (éste cálculo se describirá en más detalle
posteriormente, con referencia a la figura 8). Se encontró in
vitro que el polímero cargado de escualamina libera escualamina
activa durante todo el periodo de tratamiento. Después de la prueba,
las córneas se examinaron histológicamente.
Usando esta prueba, se encontró que la
escualamina es un potente inhibidor de la formación de capilares
inducida por tumores. Se observan pocos vasos sanguíneos en la
córnea tratada con escualamina en comparación con la córnea control,
y estos vasos eran generalmente más cortos que los vasos en la
córnea control.
Algunas de las córneas se seccionaron entonces
para observar el efecto de la escualamina en las mismas células
tumorales. Las córneas control no tratadas tenían más vasos en
ellas, y eran adyacentes al tumor. Los tumores en las córneas
tratadas con escualamina eran aún viables (es decir, los tumores no
morían), pero no había esencialmente ninguna vascularización
asociada con esos tumores. Así, los tumores tratados con
escualamina tienen grandemente disminuida la vascularidad
comparados con las correspondientes secciones de tumores control.
Estos hallazgos sugieren que la escualamina trabaja contra los
vasos sanguíneos, y no contra el tumor en sí mismo.
La figura 8 muestra una representación gráfica de
los resultados del microensayo corneal de bolsillo en conejo. Para
proporcionar una evaluación cuantitativa, se determinó el Índice de
angiogénesis ("AI") de cada ojo. Para determinar el Índice de
Angiogénesis, primero la densidad vascular ("D_{vascular}")
en un ojo se graduó en una escala de 0 a 3 como sigue:
| Determinación del valor de la D_{vascular} | |
| Valor de la D_{vascular} | Observación visual |
| 0 | No hay vasos presentes |
| 1 | De 1 a 10 vasos presentes |
| 2 | > 10 vasos presentes, pero pobremente agrupados |
| 3 | > 10 vasos presentes, pero densamente pobremente |
La longitud vascular ("L_{vascular}") se
midió entonces en cada córnea. La longitud vascular es la longitud
del vaso más largo medida desde la unión corneoescleral hasta el
límite más alejado de crecimiento del vaso más largo. El Índice de
Angiogénesis se determinó entonces a partir de esas medidas
mediante la siguiente ecuación:
AI = D_{vascular} \ x \
L_{vascular}.
La figura 8 muestra el principal Índice de
Angiogénesis para cada grupo de córnas (tratadas y no tratadas con
escualamina) en el microensayo corneal de bolsillo en conejo
después de 1,2 y tres semanas. Como se muestra en la la escualamina
fue muy inhibitoria del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Los
ojos tratados con escualamina mostraron un valor de AL
significativamente reducido si los comparamos con los ojos no
tratados (reducido un 37% en el día 14 (p = 0,05, rango Wilcoxon
total de la prueba) y reducida un 43% en el día 21 (p < 0,01).
Estos datos ilustran que la escualamina inhibe el crecimiento de
nuevos vasos sanguíneos o capilares inducido por tumor por un largo
periodo de tiempo. Más específicamente, la escualamina exhibe una
actividad antiangiogénica alta incluso después de tres semanas.
En el microensayo corneal de bolsillo en conejo,
si la córnea del conejo se inflama, esta inflamación puede conducir
a la formación de nuevos vasos sanguíneos en la córnea. Tal
inflamación sesgaría los resultados de la prueba. Por lo tanto, las
pruebas se condujeron a determinar si la escualamina, por si misma,
era responsable de alguna respuesta inflamatoria en la córnea.
Varios gránulos no bioresorbibles de copolímero etilen/vinil
acetato se cargaron con diferentes concentraciones de escualamina,
concretamente 2%, 10% y 20% de escualamina en peso. Estos gránulos
se situaron entonces en las córneas de conejo, lo cual no incluyó
un estímulo angiogénico. La escualamina no indujo inflamación a
ninguna de esas concentraciones. Así, la escualamina no condujo a la
generación de nuevos vasos sanguíneos por inflamación de la
córnea.
Los resultados del microensayo corneal de
bolsillo en conejo sugieren a los solicitantes que la escualamina
puede ser un potente agente antiangiogénico que inhibe la
neovascularización. Al reconocer que el crecimiento exponencial de
tumores sólidos en el cerebro depende de la neovascularización, los
solicitantes evaluaron la actividad de la escualamina en el
crecimiento de tumores sólidos en el cerebro en un modelo
animal.
De los tumores cerebrales sólidos, los gliomas
malignos son los más comunes de los tumores cancerosos. Estos
tumores son la tercera causa conducente a la muerte por cáncer en
adultos jóvenes entre las edades de 15 y 34 años. Los gliomas
malignos se caracterizan por su habilidad para inducir en el
normalmente quiescente cerebro y/o en las células endoteliales CNS,
un estado altamente proliferativo e invasivo. Los gliomas expresan
un factor de crecimiento del endotelio vascular (("VEGF") y
otros factores de crecimiento los cuales estimulan receptores
inducibles en las células endoteliales CNS de una manera paracrina
(es decir, los VEGF se originan por las células tumorales y
estimulan las células endoteliales). Las células endoteliales CNS
inician posteriormente una invasión angiogénica y así proporcionan
alimento al glioma. Los solicitantes probaron la actividad
antiangiogénica de la escualamina contra los gliomas probando (1) su
habilidad para inhibir selectivamente la estimulación de las
células endoteliales y (2) su efecto contra los tumores gliales
murinos experimentales.
Las pruebas in vitro se llevaron a cabo
primero para determinar que la escualamina actúa específicamente
sobre las células endoteliales. Los solicitantes usaron células
endoteliales porque tales células estám involucradas en los pasos
tempranos de la angiogénesis, como se describió anteriormente en
conjunción con la figura 2. Específicamente, la angiogénesis tumoral
es una serie de pasos secuenciales y coincidentes. Primero, las
células endoteliales se activan y proliferan. Entonces, se producen
las enzimas proteolíticas y las células migran. Los nuevos
basamentos membranosos deben de generarse entonces. De esta manera,
se generan nuevos vasos sanguíneos y el tamaño del tumor
aumenta.
Al llevar a cabo este análisis in vitro,
se probaron las siguientes líneas celulares: (a) células
endoteliales retinales bovinas; (b) 9L y C6 células de glioma de
rata; (c) células H80 de glioma humano; (d) cálulas VX2 de
carcinoma de conejo (el mismo tipo de tumores implantados en el
microensayo corneal de bolsillo en conejo descrito anteriormente).
El mitógeno endotelial que se usó en estos análisis fue VEGF a una
concentración de 20 ng/ml.
Se permitió a las células anclarse durante toda
una noche a placas de cultivo tisular que contienen un medio de
crecimiento optimizado. Tras el anclaje, las células se expusieron
al solvente sólo o a concentraciones incrementadas de escualamina
(0, 10, 20, 30, 60, y 90 \mug de escualamina/ml). El crecimiento
celular se contó diariamente durante tres días usando un Contador
Coulter. Un total de 10.000 células por pocillo se plaquearon y
cada concentración experimental se probó por cuadruplicado. Los
resultados fueron entonces promediados. Las células retinales
endoteliales bovinas se dejaron crecer y trataron de una manera
idéntica a las otras líneas celulares, excepto que el crecimiento
de estas células se midió después de la adición de 20 ng/mlde VEGF a
las células con anterioridad al tratamiento con escualamina.
La proliferación celular de todas las líneas
tumorales y de las células endoteliales no tratadas con VEGF no se
afectó estadísticamente tras una exposición de 24 a 48 horas a
concentraciones de escualamina superiores a 30 \mug/ml. El
crecimiento de las células endoteliales estimuladas con VEGF, sin
embargo, se redujo significativamente por la escualamina a estos
mismos tiempos en una forma dependiente de concentración. El
porcentaje inhibición del crecimiento celular endotelial (%l) se
determinó mediante la siguiente ecuación:
\frac{(n^{o} \ de \ células
\ en \ la \ muestra \ control-n^{o} \ de \ células
\ en \ la \ muestra \ experimental) \ x \ 100}{(n^{o} \ de \
células \ en \ la \ muestra \ control)} \ = \
%l
La siguiente tabla muestra los resultados a 48
horas para la línea celular estimulada por VEGF.
| Datos de inhibición en porcentaje. | |
| Concentración de escualamina | % de inhibición (promedio) |
| 10 \mug/ml | 38% (p < 0,01) |
| 20 \mug/ml | 57% (p < 0,001) |
| 30 \mug/ml | 83% (p < 0,001) |
Los datos adicionales se ilustran en la figura 9.
Esta figura muestra el crecimiento de las diversas líneas celulares
como un porcentaje del crecimiento en los grupos control para la
administración in vitro de escualamina a 30 \mug/ml después
de 1, 2, y 3 días. Como se muestra en la figura 9, el crecimiento
se reduce para las células endoteliales estimuladas con VEGF
específicamente, mientras que el crecimiento en las otras líneas
celulares (H80, C6, y VX2) no se afecta dramáticamente.
Basándose en esta información, los solicitantes
concluyen que la escualamina inhibe dramática y específicamente el
crecimiento de las células endoteliales estimulado por VEGF in
vitro. Así, la escualamina es un potente inhibidor de la
angiogénesis inducida por tumor, y su efecto parece desencadenarse a
través de la inhibición específica de la proliferación celular
endotelial inducida por VEGF. Así, se cree que la escualamina es
muy adecuada para reducir o disminuir la neovascularización inducida
por tumores, para usar en terapia específica antiangiogénica de
tumores.
Además de la inhibición del crecimiento de las
células endoteliales VEGF, también se ha encontrado que la
escualamina interfiere con la estimulación del crecimiento en las
células endoteliales de los capilares en el cerebro humano inducido
por b-FGF, PDGF_{bb}, factor de dispersión (HGF o
factor de crecimiento de hepatocitos), medio condicionador de
tumores, y quiste fluido del cerebro humano. Así, igual que el tumor
segrega una variedad de diferentes factores de crecimiento, la
escualamina tiene un efecto inhibidor en varios.
En vista de estos resultados, los solicitantes
probaron la escualamina en un modelo animal para el cáncer de
cerebro. Para probar el efecto de la escualamina sobre tumores
situados en el cerebro, pequeñas secciones (1 mm^{3}) de gliomas
de rata existentes se tomaron de ijares de rata donde se habían
mantenido y se implantaron dentro de los cerebros de rata en dos
grupos de ratas. Así, en este modelo, los tumores fueron viables
cuando se situaron en cerebro de rata. Tres días después de la
implantación, y después de que se haya desarrollado alguna
vascularización, el tratamiento con 20 mg/kg/día de escualamina
(i.p.) se inició en un grupo de ratas. Los animales control
("vehículo control", en la figura 10) proporcionaron sólo el
vehículo portador (sin escualamina), y los otros animales se
trataron con escualamina ("Escualamina", en la figura 10). Como
se muestra en la figura, los animales tratados con escualamina
tuvieron un incremento del 38% en tiempo medio de supervivencia
(
\tms= 24,9 días v.
\tms= 18,0 días). La figura 10 ilustra también que en ese modelo animal, las ratas tratadas con escualamina, en general, y tienen un tiempo de supervivencia incrementado.
Una prueba de toxicidad de escualamina fue
llevada a cabo en otro modelo animal. Los compuestos químicos
citotóxicos convencionales son bastante tóxicos. Por ejemplo, BCNU,
el cual es un agente convencional de quimioterapia, tiene un efecto
de toxicidad acumulativa. Por esta razón, es administrado sólo una
única vez a un paciente. El uso de BCNU se describe en las páginas
304 y 305 de Calabresi en el documento Medical Oncology,
supra. Con el fin de probar la toxicidad de la escualamina,
un grupo de ratas recibió una dosis diaria de escualamina de 20
mg/kg/día (i.p.) durante más de 30 días y se mantuvo por más de 200
días el seguir con la dosificación. Los animales, en este estudio,
permanecieron sanos. Los resultados indican que la escualamina tiene
ninguna toxicidad o muy poca toxicidad.
El uso de escualamina con tratamientos
convencionales del cáncer como se describió anteriormente, la
escualamina es un inhibidor temprano del proceso de angiogénesis
mediante la inhibición de la activación de las células endoteliales
después de la interacción con el factor de crecimiento. Dadas sus
propiedades inhibitorias de la angiogénesis, se ha demostrado que
la escualamina es efectiva en el tratamiento de tumores sólidos los
cuales dependen de la neovascualrización para proliferar. Los
solicitantes hicieron pruebas para determinar si los resultados
beneficiosos podían obtenerse cuando tratamos tumores combinando un
tratamiento con escualamina (un inhibidor de angiogénesis temprano)
con un tratamiento convencional de cáncer usando un agente
alquilante.
Cuatro grupos de ratas (en total 20 ratas Fisher
344, 200 g) recibieron transplantes s.q. de 1 mm^{3} de tumores
gliosarcoma 9L (9L glioma) en el día 0. Los tumores se implantaron
en los ijares de las ratas para evitar complicaciones relativas a
los adecuados niveles cerebrales de escualamina. La aleatorización y
el tratamiento comenzaron el día 5 de acuerdo con el siguiente
esquema:
| Condiciones de Tratamiento | |
| Grupo N^{o} | Tratamiento |
| 1 | Salino (grupo control) |
| 2 | Dosis única de 14 mg/kg BCNU dada i.p. en el día 5 |
| 3 | Escualamina - 20 mg/kg dados s.q. B.I.D.^{1} |
| 4 | Dosis única de 14 mg/kg BCNU dada i.p. en el |
| día 5 e inyección diaria de escualamina | |
| - 20 mg/kg dados s.q. B.I.D.-empezando el día 5. | |
| ^{1} El término "B.I.D." significa que el componente es administrado dos veces al día (10 mg/kg | |
| dados en dos veces diferentes cada día). |
En el día 25 ó 26 después de la implantación del
tumor, el tamaño del tumor se midió directamente. El tamaño del
tumor (es decir, su volumen "V") se estimó basándose en los
cálculos volumétricos determinados a partir de la longitud
("L"), anchura ("W"), y altura ("H") medidas del
tumor (V_{tumor \ esferoide} \approx 0,5 x L x W x H). La
tabla 5 resume los resultados. Los volúmenes tumorales que se
muestran en la tabla 5 representan la media de los volúmenes
tumorales para cada grupo de tratamiento para aquellos animales que
sobrevivieron al final del experimento.
| Volúmenes tumorales | |||
| Grupo N^{o} | N^{o} de animales | Volumen medio | % de reducción (basada |
| del tumor (mm^{3}) | en el control del volumen) | ||
| 1 | 5 | 18,324 | - |
| 2 | 6 | 2,547 | 86,1% |
| 3 | 5 | 3,347 | 81,7% |
| 4 | 4 | 38 | 99,8% |
La tabla 5 ilustra los resultados ventajosos
logrados cuando se tratan tumores con la combinación de la
escualamina y la nitrosourea BCNU (grupo 4). Una reducción media en
el tamaño tumoral del 99,8% se observó cuando se trató con ambas,
escualamina y BCNU, en este grupo. La tabla 5 muestra además que la
escualamina sola (grupo 3) fue efectiva en el tratamiento del
tumor. El tamaño del tumor se redujo un 81,7% en el grupo 3,
comparado con el grupo control.
Los solicitantes concluyen que el uso de la
escualamina en combinación con los compuestos químicos citotóxicos
convencionales puede ralentizar o parar la difusión de los cánceres
cerebrales. El propio tumor encoge y pasa a ser necrótico. Se espera
que la escualamina combinada con el tratamiento citotóxico químico
extenderá la supervivencia. Así, este tratamiento permitirá
potencialmente el manejo de los cánceres cerebrales.
La línea de cáncer pulmonar humano
MX-1 se ha usado previamente para documentar in
vivo la actividad de la ciclofosfamida y otros componentes
citotóxicos quimioterapéuticos tanto como agentes únicos o en
combinación (T. Kubota, y col., Gann 74,
437-444 (1983); E. Kobayashi, y col.,
Cancer Research 54, 2404-2410 (1994); M.-C.
Bissery, y col., Seminars in Oncology 22 (Nº 6, Suppl.
13), 3-16 (1995)). Cada uno de estos documentos
está enteramente incorporado aquí mediante referencia. La
escualamina fue examinada como una terapia adjunta que sigue a una
dosis única de 200 mg/kg de ciclofosfamida. La ciclofosfamida se
inyectó el día 14 que siguió a la implantación del tumor, en un
momento en que los tumores miden de 65 a 125 \mu\ell. La
ciclofosfamida causa la regresión parcial en todos los animales, y
la regresión total en una pequeña fracción de los animales. Los
animales se escogieron aleatoriamente para usar con ellos tres
armas de tratamiento (cada n = 27): dosis del vehículo únicamente
(Intralípido); escualamina dada a 10 mg/kg/día en Intralípido; y
escualamina dada a 20 mg/kg/día en Intralípido 5 días a la semana.
Los animales cuyos tumores excedieron de 2 gramosen cualquier
momento durante el experimento fueron sometidos a eutanasia. El
experimento se continuó durante 90 días después de iniciarse el
tratamiento con escualamina para asegurar que sólo los ratones que
experimentaban curas a largo plazo permanecían vivos. La alta dosis
de escualamina dejó de ser continua después de las cinco primeras
semanas de tratamiento debido a la pérdida de peso en los animales y
la toxicidad potencial relacionada, de manera que estos animales no
recibieron escualamina durante las ocho últimas semanas del
experimento. El tratamiento con escualamina a dosis bajas produjo
una inhibición significativa (P < 0,01) en el grado de progresión
de los tumores de pulmón examinados todas las veces (figura 11). El
tratamiento con escualamina a dosis bajas produjo un retraso
significativo (P < 0,05) en la progresión de los tumores de
pulmón sólo a 30 días de su iniciación (es decir, sólo mientras la
escualamina continuó administrándose), pero la dosis alta de
escualamina también dobló el grado de curación en estos animales
comparados con aquellos que recibieron ciclofosfamida, y la dosis
alta de escualamina reveló que los efectos aditivos de la
escualamina se manifestaron dentro de las dos semanas tras empezar
el tratamiento con escualamina.
Los estudios en un modelo de cáncer de pulmón en
un ratón desnudo xenotransplantado se han llevado a cabo utilizando
varias líneas humanas de cáncer que difieren en su grado de
crecimiento. Los datos recogidos muestran que la escualamina tiene
una actividad sinérgica en combinación con cisplatino (por ejemplo,
figura 12). El diseño del modelo experimental de cáncer de pulmón
implica una inyección subcutánea de 5 x 10^{6} células tumorales
seguida de una única inyección del fármaco quimioterapéutico en el
día 3 ó 4. Las inyecciones diarias intraperitoneales de escualamina,
con un 20% de Intralípido como un vehículo, comenzaron al día
siguiente para algunos grupos de ratones y continuaron hasta que se
terminó el experimento de 7 a 14 días después. Los grupos de
ratones que recibieron escualamina solo, empezaron a recibir el
aminosterol el mismo día en que los grupos de quimioterapias
combinadas recibieron tratamiento con aminosterol. Los volúmenes de
los tumores se determinaron entonces al final del experimento y se
compararon. Se encontró tanto para la línea de adenocarcinoma humano
de pulmón de crecimiento agresivo H460 como para la línea de
adenocarcinoma humano de pulmón de crecimiento más lento
Calu-6, que la escualamina, como agente
monoterapéutico, cuando comienza en el día 4 ó 5, tiene efectos
mínimos en el crecimiento del tumor, pero puede contribuir a la
inhibición del crecimiento si comienza en el día 1. Sin embargo,
cuando se usa comenzando el día 4 ó 5 en combinación con cisplatino,
dada a una dosis máxima tolerada o cerca de esa dosis, la
escualamina incrementa significativamente y reproduciblemente la
inhibición del crecimiento del tumor , por enzima de la cisplatina
sola administrada de un modo doso-dependiente para
ambas líneas celulares: la H460 y la Calu-6.
El adenocarcinoma de pulmón murino de Lewis se
implantó subcutáneamente en la pata trasera de un ratón macho
C57BL/6, y se le permitió crecer por una semana. Entonces, los
grupos de ratones se dejaron sin tratar o se trataron con
escualamina (20 mg/kg/día, s.c.), ciclofosfamida (125 mg/kg, i.p. en
los días 7, 9 y 11), cisplatino (10 mg/kg, i.p. en el día 7), la
combinación de escualamina y ciclofosfamida, o la combinación de
escualamina y cisplatina. En el día 20, los animales fueron
sacrificados, y el número medio de las metástasis pulmonares se
determinó para cada grupo. Todos los tratamientos redujeron el
número de metástasis; sin embargo, el tratamiento más efectivo fue
la combinación de la escualamina con otro de los agentes citotóxicos
(figura 13).
El modo de administración de la escualamina debe
seleccionarse para adecuarse al uso terapéutico particular. Los
modos de administración incluyen generalmente, pero no están
limitados a, el transdermal, el intramuscular, el intraperitoneal,
el intravenoso, el subcutáneo, el intranasal, la inhalación, el
intralinfático, el intralesional, y las vías orales. Los compuestos
de escualamina pueden administrarse mediante una ruta conveniente,
por ejemplo, mediante infusión o inyección en embolada, o mediante
absorción a través de la túnica interna epitelial o mucocutánea
(por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal, y mucosa intestinal,
etc.), y puede administrarse conjuntamente con otros agentes
biológicamente activos. La administración puede ser local o
sistémica.
La presente invención proporciona también
composiciones farmacéuticas, las cuales incluyen escualamina como
un ingrediente activo. Tales composiciones incluyen una cantidad
terapéuticamente efectiva de escualamina, y un portador o excipiente
farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tal portador incluyen,
pero no están limitados a, medio salino, tampón salino, dextrosa,
agua, microemulsiones de aceite en agua (tales como Intralipid),
glicerol, y etanol, y combinaciones de los mismos. La formulación
de la composición farmacéutica se seleccionaría para adecuarse al
modo de administración.
Si se desea, la composición farmacéutica puede
contener cantidades efectivas de agentes humidificantes y
emulsificantes, o agentes tamponadores del pH. La composición
farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada, tales como una
solución líquida, suspensión, emulsión, tableta, píldora, cápsula,
formulación de liberación continua o polvo. La composición puede
formularse también como un supositorio, con los tradicionales
agentes encapsuladores y portadores, tales como triglicéridos. Las
formulaciones orales pueden incluir portadores estándar, tales como
niveles farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de
magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio,
etc.
Varios sistemas desarrollados se conocen y pueden
usarse para administrar un componente terapéutico de la invención,
por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, sistemas
entéricos recubiertos, microcápsulas y similares.
En una realización, la composición farmacéutica
es formulada en concordancia con los procedimientos de rutina para
proporcionar una composición adaptada para la administración
intravenosa en humanos. Típicamente, las composiciones para la
administración intravenosa son soluciones al 5% de dextrosa y agua
estéril o Interlípido. Donde es necesario, la composición
farmacéutica puede incluir también un agente solubilizador y un
anestésico local para mejorar el dolor del sitio de la inyección.
Generalmente, los ingredientes de una composición farmacéutica se
suministran o separadamente o mezclados juntos en una unidad de
forma de dosificación, por ejemplo, como un polvo seco liofilizable
o un concentrado libre de agua en un recipiente sellado tal como
una ampolla o bolsilla indicando la cantidad de agente activo. Donde
la composición farmacéutica va a administrarse mediante infusión,
debe dispensarse con una botella de infusión conteniendo agua
estéril a un grado farmacéutico, dextrosa, medio salino, u otros
portadores farmacéuticos aceptables. Cuando la composición
farmacéutica es administrada mediante inyección, debe
proporcionarse una ampolla de agua estéril o medio salino para
inyección de forma que los ingredientes puedan mezclarse de forma
previa a su administración.
La cantidad de componente terapéutico (es decir,
ingrediente activo) que será efectiva en el tratamiento de un
desorden o condición patológica dependerá de la naturaleza del
desorden o condición patológica, y puede determinarse mediante
técnicas clínicas estándar conocidas para aquellos expertos en la
técnica. La dosis precisa a emplearse en la formulación también
dependerá de la ruta de administración y de la gravedad del
desorden o condición patológica, y se decidiría de acuerdo con el
juicio del practicante y de las circunstancias de cada paciente.
Las dosis terapéuticas efectivas se pueden estimar a partir de
extrapolaciones de las curvas de respuesta a dosis derivadas de
sistemas de prueba in vitro o en modelos animales.
Las dosis adecuadas para la administración
intravenosa están generalmente aproximadamente en el rango de 1
microgramo a 40 miligramos de componente activo por kilogramo de
peso del cuerpo. Los rangos de dosis adecuados para la
administración intranasal están generalmente aproximadamente en el
rango de 0,01 mg/kg de peso del cuerpo a 20 mg/kg de peso del
cuerpo. Las dosis adecuadas para la administración oral están
generalmente aproximadamente en el rango de 500 microgramos a 800
miligramos por kilogramo de peso del cuerpo, y preferiblemente
aproximadamente en el rango de 1 a 200 mg/kg de peso del cuerpo.
Los supositorios normalmente contienen, como ingrediente activo, de
0,5 a 10% en peso de escualamina. Las formulaciones orales contienen
preferiblemente de un 10% a un 95% de ingrediente activo.
Para el uso de la escualamina como un agente
antiangiogénico o citotóxico o en terapias de cáncer, las dosis a
tomar como ejemplo están en el rango de aproximadamente 0,01 mg/kg
de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Las
dosis preferidas son desde 0,1 hasta 40 mg/kg de peso corporal.
La invención también puede incluir un paquete o
equipo incluyendo uno o más recipientes llenos de las composiciones
farmacéuticas de acuerdo con la invención. Puede haber un aviso
asociado a los recipientes, en la forma prescrita por una agencia
gubernamental, regulando la fabricación, uso o venta de los
productos farmacéuticos o biológicos; aviso el cual refleja la
aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para la
administración a humanos.
Los compuestos químicos citotóxicos
convencionales usados de acuerdo con la invención, pueden estar
presentes en cualquier forma adecuada conocida por aquellos
expertos en la técnica. Estos compuestos químicos pueden también ser
administrados por cualquier medio adecuado conocido también por
aquellos expertos en la técnica, tales como oralmente,
subcutáneamente, intravenosamente, intraperitonealmente,
intralinfáticamente, e intramuscularmente.
En la descripción de la invención, los
solicitantes han indicado ciertas teorías en un esfuerzo por
revelar como y porqué la invención trabaja en la manera en la cual
trabaja. Estas teorías se señalan en adelante sólo para propósitos
informativos. Los solicitantes no se ciñen a ningún mecanismo
físico o químico específico, o a teorías de funcionamiento.
Mientras que la invención se describió en
términos de varias realizaciones específicas preferidas y ejemplos
específicos, aquellos expertos en el arte reconocerán que varios
cambios y modificaciones pueden hacerse saliendo del ámbito de la
invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Claims (17)
1. Productos que contienen escualamina y al menos
un compuesto químico citotóxico como una preparación combinada para
el uso simultáneo, separado o secuencial para tratar de un
tumor.
2. Productos de acuerdo con la reivindicación 1,
en los que el compuesto químico citotóxico es un miembro
seleccionado del grupo consistente en: una nitrosourea,
ciclofosfamida, adriamicina, 5-fluorouracilo,
paclitaxel y sus derivados, cisplatino, metotrexato, tiotepa,
mitoxantrona, vincristina, vinblastina, etopóxido, ifosfamida,
bleomicina, procarbacina, clorambucilo, fludarabina, mitomicina C,
vinorelbina, y gemcitabina.
3. Productos de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en los que el compuesto químico citotóxico
es un miembro seleccionado del grupo consistente en 1,
3-bis
(2-cloroetil)-1-nitrosourea,
ciclofosfamida y cisplatino.
4. Productos de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 3, en los que el compuesto químico
citotóxico está bajo una forma adaptada a la administración
intravenosa.
5. Productos de acuerdo con la reivindicación 4,
en los que la escualamina está bajo una forma adaptada a la
administración subcutánea.
6. Productos de acuerdo con la reivindicación 5,
en los que la escualamina se usa después del compuesto químico
citotóxico.
7. Productos de acuerdo con la reivindicación 1,
en los que el compuesto químico citotóxico se administra en un
primer procedimiento de administración y la escualamina se
administra después de que este primer proceso de administración se
ha completado.
8. Productos de acuerdo con la reivindicación 1,
en los que el compuesto químico citotóxico se administra mediante
una única inyección.
9. Productos de acuerdo con la reivindicación 8,
en los que el compuesto químico citotóxico es un miembro
seleccionado del grupo consistente en 1,3-bis
(2-cloroetil)-1-nitrosourea,
ciclofosfamida y cisplatino.
10. Productos de acuerdo con la reivindicación 9,
en los que la escualamina está bajo una forma adaptada a la
administración subcutánea y se usa después de la
1,3-bis
(2-cloroetil)-1-nitrosourea.
11. Productos de acuerdo con la reivindicación 1,
en los que la escualamina está bajo una forma adaptada a la
administración oral, o a la administración intravenosa o a la
administración subcutánea.
12. Productos de acuerdo con la reivindicación 1,
en los que el tumor es un tumor del sistema nervioso central, un
tumor de mama o un tumor de pulmón.
13. Uso de la escualamina para la fabricación de
un medicamento para tratar un tumor, en el que dicho medicamento se
administra después de que el tumor se haya expuesto a radiación.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en
el que la escualamina está bajo una forma adaptada a la
administración subcutánea, o a la administración oral, o a la
administración intravenosa.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en
el que el tumor es un tumor del sistema nervioso central, un tumor
de mama o un tumor de pulmón.
16. Productos de acuerdo con la reivindicación 1
que contienen escualamina y al menos otro compuesto químico
citotóxico como una preparación combinada para uso simultáneo,
separado o secuencial para tratar un tumor, en los que dicho
producto se usa después de que el tumor se haya expuesto a
radiación.
17. Productos de acuerdo con la reivindicación
16, en los que el compuesto químico citotóxico es un miembro
seleccionado del grupo consistente en: una nitrosourea,
ciclofosfamida, adriamicina, 5-fluorouracilo,
paclitaxel y sus derivados, cisplatino, metotrexato, tiotepa,
mitoxantrona, vincristina, vinblastina, etopóxido, ifosfamida,
bleomicina, procarbacina, clorambucilo, fludarabina, mitomicina C,
vinorelbina, y gemcitabina.
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