KR20190053203A - Ｔ－세포 암을 표적화하는 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20190053203A
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스베토미르 엔. 마르코빅
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메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
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Abstract

결합제 및 담체 단백질, 및 하나 이상의 치료제의 조성물로서, 상기 결합제는 T-세포 상에 발현되는 항원을 결합할 수 있는 것인 조성물 및 이를, 구체적으로 T-세포 암 치료제로서 제조하고 사용하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 또한, 결합제 및 담체 단백질, 및 하나 이상의 치료제의 동결건조된 조성물, 및 이를 구체적으로 T-세포 암 치료제로서 제조하고 사용하는 방법이 기재된다.

Description

Ｔ－세포 암을 표적화하는 방법 및 조성물
본 출원은 결합제 및 담체 단백질의 신규한 조성물, 및 이를, 구체적으로 T 세포 암 치료제로서 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
화학요법이 흑색종을 포함한 다양한 종류의 암을 위한 전신 치료법(systemic therapy)의 주류로 남아있다. 대부분의 화학요법제는 단지 약하게 종양 세포에 대해 선택적이고, 건강한 증식 세포에 대한 독성이 높을 수 있어서(Allen TM. (2002) Cancer 2:750-763), 종종 용량 감소 및 심지어 치료의 중단이 요구된다. 이론적으로, 화학요법제 독성 이슈를 극복하고 약물 효능을 개선하는 한 가지 방법은 표적화된 약물을 종양으로 유도하기 위해 종양 세포에 의해 선택적으로 발현되는(과발현되는) 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 화학요법제를 종양으로 표적화하여, 화학요법제의 생체분포(biodistribution)를 변화시키고, 보다 많은 약물이 종양으로 가고, 건강한 조직에 덜 영향을 미치게 하는 것이다. 그러나, 30년의 연구에도 불구하고, 특이적 표적화는 치료제 분야에서 드물게 성공한다.
통상적인 항체 의존성 화학요법(ADC)은 합성 프로테아제에 의해 절단가능한 링커(synthetic protease-cleavable linker)를 통해 표적화 항체에 결합된 독성제로 설계된다. 그러한 ADC 치료제의 효능은 표적 세포가 항체에 결합하는 능력, 링커의 절단, 및 독성제의 표적 세포로의 흡수(uptake)에 의존적이다. Schrama, D. et al. (2006) Nature reviews. Drug discovery 5:147-159.
항체-표적화 화학요법(antibody-targeted chemotherapy)은 표적화 능력, 다수의 세포독성제, 및 잠재적으로 더 약한 독성을 동반한 개선된 치료 능력의 조합을 제공하기 때문에 통상적인 치료법 대비 이점을 기대하게 했다. 광범위한 연구에도 불구하고, 임상적으로 유효한 항체-표적화 화학요법은 달성하기 어려운 것으로 남아있다: 주요 장애(hurdle)는 항체와 화학요법 약물 간의 링커의 불안정성, 항체에 결합시 화학요법제의 감소된 종양 독성, 및 컨쥬게이트(conjugate)의 종양 세포 결합 및 진입(enter) 불능을 포함한다. 또한, 이러한 치료는 항체-약물 컨쥬게이트의 크기에 대한 제어를 가능하게 하지 않았다.
표적화된 약물 전달이 이전 치료(prior therapeutics) 대비 신뢰 가능하고 개선된 항-종양 효능을 제공하도록 세포독성 효과를 유지하는 항체-기반 암 치료제에 대한 요구가 당해 분야에 여전히 존재한다.
또한, 치료적 적용에 대해, 조성물이 그의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성에 있어서 안정적이어야 하는 것에 대한 요구가 남아있다.
T-세포 림프종("TCL")은 림프종의 약 15%를 차지하는 혈액암의 이질적 그룹이다. 매년, 미국에서 약 6,500건의 신규 TCL 케이스가 발생한다. TCL은 말초성 T-세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma), 성인 T-세포 백혈병/림프종(Adult T-cell Leukemia/Lymphoma)(ATLL), 림프모세포성 림프종(lymphoblastic lymphoma), 등을 포함한다. 연구는 TCL의 일부 서브타입, 예를 들면, 림프모성 림프종에서는, 주로 10대 청소년 및 아동이 이 혈액 질환에 의해 영향을 받으나, TCL은 아동 및 성인 모두에 영향을 미칠 수 있다는 것을 보여준다. TCL 환자들은 부은 림프절, 고-등급 병변(high-grade lesion), 및 전신 증상, 예를 들면, 중증 발진, 열, 및 피로를 보인다.
TCL 환자들은 전통적으로 B-세포 림프종 환자들에 대한 것과 동일한 화학요법제(예를 들면, 안트라사이클린)으로 치료되었다. 그러나, B-세포 림프종에 대한 효능 대비, 안트라사이클린-기반 처방(anthracycline-based regimen)은 TCL 환자의 생존율을 증가시키는데 있어서 효과적이지 않았다. Vose J, et al., J Clin Oncol . 2008; 26(25):4124-30. 안트라사이클린-기반 처방은 TCL 환자에 대해 더 낮은 반응율(response rate) 및 진행까지의 더 짧은 시간을 가져온다. 전통적인 화학요법에 의한 열등한 결과를 고려할 때, TCL 환자를 위해 비-안트라사이클린 기반 치료제 처방이 절실하게 요구된다.
따라서, 최소의 부작용으로 또는 부작용 없이 T-세포 암을 치료하기 위한 보다 효과적인 조성물 또는 면역요법에 대한 요구가 있다.
발명의 요약
본 개시는 외부 표면을 갖는 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물로서, 상기 나노입자의 각각은: 담체 단백질, T-세포 상에서 발현되는 항원을 표적화하는 항원-결합 부분(antigen-binding portion)을 갖는 결합제, 및 치료적 유효량의 치료제를 포함하는것인 나노입자 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서, 결합제는 T-세포 또는 T-세포 암에서 발현되는 항원에 결합할 수 있고(예를 들면, OKT3), 동시에 항체(예를 들면, OKT3)의 면역원성 및 유사분열 촉진성(mitogenic) 잠재력 한계와 연관된 심각한 부작용을 경감 또는 제거할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 나노입자는 심각한 부작용 및/또는 독성을 갖는 기존의 ADC에 비해 큰 개선이다.
항체-기반 치료법(antibody-based therapy)이 림프종 환자에게 새로운 치료 옵션으로 등장했다. 예를 들면, 단일클론 항체, 리툭시맙(Rituxan®)이 크게 개선된 임상적 성과를 가지고 B-세포 림프종을 치료하는데 사용되고 있다. T-세포 신생물(T-cell neoplasm)의 경우, 다수의 항체가 그들의 효능을 보였다. 그들 중에, 예를 들면, 무로모납-CD3 (Orthoclone®, "OK T3"), T-세포 상의 CD3 수용체에 대한 마우스 IgG2a 단일클론 항체는 말초 순환 및 림프 조직으로부터의 CD3+ T-세포의 보체-유도 용해(complement-induced lysis)를 유도할 수 있다. Chatenoud, L. et al, Nat. Rev. Immunoo. 3, 123-32 (2003). 그러나, OKT3의 면역원성 및 유사분열 촉진성 잠재력 한계와 연관된 심각한 부작용이 TCL 환자의 치료에서 그의 사용과 함께 널리 확산되고 있다. 예를 들면, OKT3의 치료적 잇점이 항체와 CD3 수용체의 작용(engagement)에 의해 유발된 사이토카인-기반 염증 반응에 의해 저해된다. Abramowicz D, et al., Transplantation, 1989;47:606-608. 또한, T-세포에 대한 OKT3의 강력한 유사분열 촉진성이 악성 면역 세포의 증식을 증가시켜, TCL 환자에서 T-세포 신생물을 악화시킬 수 있다. Landergren U, et al., Eur J Immunol. 1984 Apr;14(4):325-8.
이론에 의해 한정되지 않으면서, 결합제는 그 속성상 약한, 소수성 상호작용을 통해 담체 단백질에 의해 결합되는 것으로 사료된다. 그러나, 나노입자 중 개별적인 성분들의 활성, 및 그들의 상대적 관계는 하기에 기술된 바와 같이 조성물의 동결건조 및 재구성(reconstitution)에도 불구하고 보존된다. 또한, 담체 단백질로의 결합, 예를 들면, 결합제의 담체 단백질로의 복합체화(complexation)는 결합제 상의 알부민 결합 모티프, 및/또는 담체 단백질 상의 항체-결합 모티프를 통해 일어나는 것으로 고려된다. 일 구체예에서, 수용액에 의한 재구성시, 상기 결합제의 항원-결합 부분은 T-세포 암의 항원을 (인식하고) 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 나노입자의 약 50% 미만이 올리고머(oligomeric)이다.
나노입자가 치료에서 사용되기 때문에 추가적인 해결과제(challenge)가 부과된다.
나노입자 중 성분들의 재배열(rearrangement)이 성분들 간의 공유 결합을 통해 약화될 수 있으나, 그러한 공유 결합은 암 치료에서 나노입자의 치료적 용도를 위한 해결과제를 부과한다. 결합제, 담체 단백질, 및 추가적인 치료제는 통상적으로 종양에서 상이한 위치에서 상이한 메커니즘을 통해 작용한다. 비-공유 결합은 나노입자의 성분들이 종양에서 해리(dissociate)될 수 있게 한다. 따라서, 공유 결합이 동결건조를 위해 유리할 수 있으나, 치료적 용도를 위해 불리할 수 있다.
본 개시는 외부 표면을 갖는 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물로서, 상기 나노입자 각각은 담체 단백질, T-세포 상에서 발현되는 항원을 표적화하는 항원-결합 부분을 갖는 결합제, 및 선택적으로 치료적 유효량의 치료제를 포함하는 것인 나노입자 조성물에 관한 것이다.
나노입자의 크기, 및 크기의 분포도 중요하다. 나노입자는 그의 크기에 따라 상이하게 거동(behave)할 수 있다. 큰 크기에서, 나노입자 또는 입자의 응집(agglomeration)이 혈관을 차단할 수 있고, 이는 조성물의 성능(performance) 및안전성에 영향을 미칠 수 있다. 일 구체예에서, 나노입자의 평균 크기는 90 nm 내지 800 nm이다. 또 다른 구체예에서, 나노입자의 평균 크기는 300 nm 내지 500 nm이다. 또 다른 구체예에서, 나노입자의 평균 크기는 약 90 nm 내지 약 160 nm이다.
마지막으로, 동결보호제(cryoprotectant) 및 동결건조 과정에서 보조하는 작용제는 치료 용도를 위해 안전하고 내약(tolerate)되어야 한다.
일 양태에서, 결합제는 인 비보에서 T-세포 또는 T-세포 암에서 발현되는 항원에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 결합제의 항원-결합 부분은 T-세포 또는 T-세포 암에서 발현되는 항원에 결합한다. 일 구체예에서, 상기 항원은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD30, CD40, CD52, CD 122, 및 CCR4를 포함하나, 이에 한정되지 않는, T-세포 암에서 발현되는 단백질이다. 다른 구체예에서, 상기 항원은 T-세포 암(예를 들면, T-세포 림프종)에서 과발현되는 바이오마커이다. 상기 바이오마커는 PD-L1, Ly6E, HER3/EGFR DAF, ERBB-3 수용체, CSF-1R, HER2, STEAP1, CEA, OX40, Ang2-VEGF, 또는 VEGF를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 결합제의 결합 부분은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD30, CD40, CD52, CD122, 또는 CCR4에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 결합제의 결합 부분은 PD-L1, Ly6E, HER3/EGFR DAF, ERBB-3 수용체, CSF-1R, HER2, STEAP1, CEA, OX40, Ang2-VEGF, 또는 VEGF에 결합할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 T-세포 암은 T-세포 림프종이다. 또 다른 구체예에서, 상기 T-세포 암은 말초성 T-세포 림프종, 역형성 대세포 림프종, 혈관면역모세포성 림프종(angioimmunoblastic lymphoma), 피부 T-세포 림프종, 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATLL), 장병증-타입 T-세포 림프종, 간비장(hematosplenic) 감마-델타 T-세포 림프종, 림프모세포성 림프종, 비강 NK/T-세포 림프종, 치료-관련 T-세포 림프종, 또는 이들의 조합이다. 일 양태에서, 상기 항원은 본 명세서에 기재된 항원들 중 하나 이상을 배제할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 항원은 VEGF, HER2, 또는 EGFR이 아니다.
일 양태에서, 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물로서, 상기 나노입자 각각은 담체 단백질, T-세포 항원-결합 부분을 갖는 결합제, 및 선택적으로 하나 이상의 치료제를 포함하고, 수용액에 의한 재구성시, 상기 결합제의 항원-결합 부분은 인 비보에서 T-세포 상에서 발현되는 항원에 결합할 수 있는 것인 나노입자 조성물이 본 명세서에 제공된다.
정맥내로 투여시, 큰 입자(예를 들면, 1 ㎛보다 큰 입자)는 폐의 미세혈관계(microvasculature)에 박힐 수 있기 때문에 통상적으로 불리하다(disfavor). 동시에, 더 큰 입자들은 종양 또는 특정한 기관에 축적될 수 있다. 예를 들면, 방사선 색전술(radioembolization)로도 알려진, 방사성 요소의 전달을 위해 간의 종양으로 공급하는 간동맥에 주사된 THERASPHERE® 20-60 마이크론 유리 입자(glass particle)가 간암을 위해 임상적으로 사용되고 있다.
따라서, 정맥내 투여를 위해, 1 ㎛ 미만의 입자가 사용된다. l ㎛보다 큰 입자들은 보다 통상적으로, 종양에 ("직접 주사(direct injection)") 또는 종양 부위에 공급하는 동맥으로 직접 투여된다.
일 양태에서, 나노입자는 약 100개 내지 약 1000개의 결합제, 바람직하게는 약 400개 내지 약 800개의 결합제를 포함한다. 조성물 중 결합제의 개수는 또한 입자의 개수에 의존적이다. 나노입자가 다량체화될 때, 결합제의 개수는 비례적으로 증가한다. 예를 들면, 160 nm 나노입자가 400개의 결합제를 포함하는 경우, 320 nm 이량체는 약 800개의 결합제를 포함할 것으로 예상된다.
다른 구체예에서, 나노입자는 다량체화 또는 올리고머화, 예를 들면, 이량체화된다. 다량체화(multimerization)는 단위 분자(unit molecule)의 중량 또는 크기의 배수(multiple)로서 관찰될 수 있고, 예를 들면, 160 nm 입자는 약 320 nm, 480 nm, 640 nm, 등으로 다량체화된다. 일부 구체예에서, 집단 중 나노입자의 40% 미만이 올리고머화된다. 일부 구체예에서, 나노입자의 30% 미만이 올리고머화된다. 다른 구체예에서, 나노입자의 20% 미만이 올리고머화된다. 또 다른 구체예에서, 존재하는 나노입자의 10% 미만이 올리고머화된다. 바람직한 구체예에서, 나노입자의 5% 미만이 올리고머화된다.
일 구체예에서, 담체-결합 약물(carrier-bound drug) 대 결합제(예를 들면, 알부민-결합 파클리탁셀 대 OKT3)의 중량비는 약 5:1 내지 약 1:1이다. 일 구체예에서, 담체-결합 약물 대 결합제의 중량비는 약 10:4이다. 일 구체예에서, 결합제는 나노입자의 표면의 전체 또는 일부 상에서 실질적으로 단일층이다. 일 구체예에서, 조성물 중 0.01% 미만의 나노입자는 200 nm보다 큰 크기, 300 nm보다 큰 크기, 400 nm보다 큰 크기, 500 nm보다 큰 크기, 600 nm보다 큰 크기, 700 nm보다 큰 크기, 및 800 nm보다 큰 크기로 구성된 군으로부터 선택된 크기를 갖는다. 더 큰 크기는 수개의 나노입자의 다량체화(또는 올리고머화)의 결과로 사료된다.
본 발명은 또한 동결건조된 조성물을 포함하고, 상기 동결건조된 조성물은 신선하게 제조된 나노입자의 특성과 실질적으로 다르지 않거나 또는 그와 동일하다. 구체적으로, 수용액 중에 재구성시, 상기 동결건조된 조성물은 입자 크기, 입자 크기 분포, 암세포에 대한 독성, 결합제 친화도, 및 결합제 특이성 측면에서 신선한 조성물와 유사하거나 동일하다. 놀랍게도, 재현탁 후 동결건조 조성물은 이 입자들 중 두 개의 상이한 단백질 성분에도 불구하고, 신선하게 제조된 나노입자의 특성을 유지한다.
일 구체예에서, 평균 재구성된 나노입자 크기는 약 90 nm 내지 약 1 ㎛이다. 바람직한 구체예에서, 평균 재구성된 나노입자 크기는 약 90 nm 내지 약 200 nm이고, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 160 nm이다. 일 구체예에서, 평균 재구성된 나노입자 크기는 800 nm 초과 내지 약 3.5 ㎛이고, 더 작은 나노입자의 다량체, 예를 들면, 100-200 nm 나노입자의 다량체를 포함한다. 일 구체예에서, 코어 대 결합제의 중량비는 1:1 초과 내지 약 1:3이다. 일 구체예에서, 평균 재구성된 나노입자 크기는 약 160nm 내지 약 225nm이다.
일 양태에서, 본 발명은 나노입자를 포함하는, 동결건조된 나노입자 조성물로서, 상기 나노입자 각각은 담체-결합 약물 코어(carrier-bound drug core) 및 결합제를 포함하는 것인 동결건조된 나노입자 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에서, 결합제는 수용액에 의한 재구성시, 나노입자의 외부 표면과 그들의 결합(association)을 유지한다. 일 구체예에서, 재구성 후에, 결합제는 결합제의 결합 부분이 그 표면으로부터 외향으로 배향하도록 코어의 표면 위에 배열된다. 일 구체예에서, 동결건조된 조성물은 실온에서 약 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상, 12개월 이상, 또는 그 이상 동안 안정하다. 일 구체예에서, 동결건조된 조성물은 실온에서 3개월 이상 동안 안정하다. 일 구체예에서, 재구성된 나노입자는 치료제의 활성을 유지하고 인 비보에서 표적에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 최대 약 12개월 이상 동안 약 20℃ 내지 약 25℃에서 안정하다.
일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 치료제는 나노입자의 내부에 위치한다. 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 치료제는 나노입자의 외부 표면에 위치한다. 또 다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 치료제는 나노입자의 내부에 및 나노입자의 외부 표면에 위치한다. 추가적 구체예에서, 치료제는 암을 위한 치료제이다.
일부 구체예에서, 상기 나노입자는 2종 이상의 치료제를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 치료제는 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 게피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 이마티닙, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴, 또는 시클로포스파미드일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 치료제는 파클리탁셀이다.
또 다른 양태에서, 결합제는 슬리피주맙(Slipizumab), OKT3, Leu 1, 자놀리무맙(Zanolimumab), 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin), Mik-β1, KW-0761, 또한 이들의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 결합제는 무로모납-CD3 (OKT3)이다.
또 다른 구체예에서, 항원 결합 부분은 앱타머, 수용체 리간드, Fab 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 항원 결합 부분은 항체의 부분(antibody of portions thereof)이다.
일부 구체예에서, 담체 단백질은 젤라틴, 엘라스틴, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 유 단백질(milk protein), 및 유청 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 담체 단백질은 알부민, 예를 들면, 인간 혈청 알부민이다. 일부 구체예에서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 일부 구체예에서, 상기 알부민은 재조합 알부민, 예를 들면, 재조합 인간 혈청 알부민이다.
일부 구체예에서, 나노입자 조성물은 정맥내 전달을 위해 제제화된다.
일부 구체예에서, 나노입자는 약 1 x 10-11 M 내지 약 1 x 10-9 M의 해리 상수(dissociation constant)를 갖는다.
T-세포 암에서 암세포를 사멸시키는 방법으로서, 상기 세포를 본 명세서에 개시된 나노입자 조성물의 유효량과 암성 T 세포(cancerous T cell)를 사멸시키기 위한 충분한 시간 동안 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법이 또한 본 명세서에 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 나노입자 조성물은 정맥내로 투여된다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 a) 상기 나노입자 조성물을 3주 동안 주당 1회 투여하는 단계; b) 상기 나노입자 조성물의 투여를 1주 동안 중단하는 단계; 및 c) 종양을 치료하기 위해 필요한 만큼 단계 a) 및 b)를 반복하는 단계를 포함한다.
관련 구체예에서, 치료는 나노입자의 투여 전에 표적화 결합제(targeting binding agent)의 투여를 포함한다. 일 구체예에서, 표적화 결합제는 나노입자의 투여 전 약 6시간 내지 48시간, 또는 12시간 내지 48시간에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 표적화 결합제는 나노입자의 투여 전 6시간 내지 12시간에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 표적화 결합제는 나노입자의 투여 전 2시간 내지 8시간에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 표적화 결합제는 나노입자의 투여 1주 전에 투여된다. 예를 들면, 나노입자의 투여 24시간 전에 OKT3의 용량(dose)이 투여된다. 또 다른 예에서, OKT3은 나노입자의 투여 전에 투여된다. 나노입자의 투여 전에 투여된 결합제는 치료량 미만(subtherapeutic)인 용량, 예를 들면, 정상적으로 치료량으로 고려되는 양의 1/2, 1/10, 또는 1/20의 용량으로 투여될 수 있다. 따라서, 인간에서, OKT3에 의한 전치료(pretreatment)는 통상적인 용량의 1/10인 1 mg/kg OKT3의 투여를 포함하고, 나노입자의 투여로 이어진다.
일부 구체예에서, 치료적 유효량은 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2(즉, 환자의 m2당 밀리그램 담체 단백질)의 담체 단백질을 포함한다. 다른 구체예에서, 치료적 유효량은 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2의 치료제(예를 들면, 파클리탁셀)를 포함한다. 다른 구체예에서, 치료적 유효량은 약 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2의 결합제를 포함한다. 다른 구체예에서, 치료적 유효량은 약 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2의 OKT3을 포함한다.
특정 구체예에서, 동결건조된 조성물은 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2의 담체 단백질, 바람직하게는 알부민; 약 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2의 결합제, 바람직하게는 OKT3; 및 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2의 파클리탁셀을 포함한다.
본 발명의 구체예는 담체 단백질을 포함하는 나노입자 중 화학요법제를 투여하는 것에 의해 화학요법제의 암세포 흡수(uptake)의 지속시간(duration)을 증가시키는 방법으로서, 상기 화학요법제는 항체, 예를 들면, 암세포에 상에 있거나 또는 암세포에 의해 흘려지는 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 표면 복합체화(surface complexation)를 갖고, 상기 암세포는 T 세포인 것인 방법을 포함한다.
또한, 나노입자 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 담체 단백질 및 선택적으로, 하나 이상의 치료제를 5.0 내지 7.5의 pH 및 약 5℃ 내지 약 60℃, 약 23℃ 내지 약 60℃, 또는 약 55℃ 내지 약 60℃의 온도를 갖는 용액 중 항체와 원하는 나노입자의 형성을 가능하게 하는 조건 및 성분들의 비로 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법이 본 명세서에 제공된다. 일 구체예에서, 나노입자는 55℃ 내지 60℃ 및 pH 7.0에서 제조된다. 또 다른 양태에서, 나노입자 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 담체 단백질과 선택적으로, 하나 이상의 치료제를 접촉시켜 코어를 형성하는 단계, 및 (b) 상기 코어를 약 5.0 내지 약 7.5의 pH 및 약 5℃ 내지 약 60℃, 약 23℃ 내지 약 60℃, 또는 약 55℃ 내지 약 60℃의 온도를 갖는 용액 중 항체와 원하는 나노입자의 형성을 가능하게 하는 조건에서 및 성분들의 비로 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법이 본 명세서에 제공된다.
성분들(예를 들면, 담체 단백질, 항체, 치료제, 이들의 조합)의 양은 원하는 나노입자의 형성을 제공하기 위해 제어된다. 성분들의 양이 너무 희석된 조성물은 본 명세서에 기재된 나노입자를 형성하지 않을 것이다. 바람직한 구체예에서, 담체 단백질 대 결합제의 중량비는 10:4이다. 일부 구체예에서, 담체 단백질의 양은 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이다. 일부 구체예에서, 결합제의 양은 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL이다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 담체 단백질: 결합제: 용액의 비는 1 mL의 용액(예를 들면, 염수(saline)) 중 약 9 mg의 담체 단백질(예를 들면, 알부민) 대 4 mg의 결합제(예를 들면, OKT3)이다. 치료제, 예를 들면, 파클리탁셀의 상당한 양(an amount)이 또한 담체 단백질에, 예를 들면, 상기 항체와 접촉하기 전에 첨가될 수 있다.
하기 도면은 본 발명을 나타내는 것에 불과하고, 한정으로 의도되지 않는다. 일관성을 위해, ABRAXANE® 및 베바시주맙을 이용한 본 발명의 나노입자는 두문자어 "AB"을 이용하고, AB160과 같이, AB 다음의 숫자는 이 나노입자의 평균 입자 크기(나노미터)를 부여하도록 의도된다. 마찬가지로, 결합제가 리툭시맙인 경우, 두문자어는 "AR"이고 그 뒤에 오는 숫자는 동일하다.
도 1은 광 흡수 BLItz(Bio-layer interferometry) 기술에 의해 결정된 Abraxane 및 OKT3의 결합 친화도를 보여준다. 해리 상수(Kd)는 2.246 X 10-9이다.
상세한 설명
본 설명을 읽은 후, 다양한 대안적인 구체예 및 대안적인 적용에서 본 발명을 구현하는 방법이 본원발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명해질 것이다. 그러나, 본 발명의 모든 다양한 구체예가 본 명세서에 기재되지 않는다. 본 명세서에 제시된 구체예는 예시로만 제시되며, 한정이 아닌 것으로 이해될 것이다. 따라서, 이 다양한 대안적 구체예의 상세한 설명은 하기에 기재된 본 발명의 영역 또는 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명을 개시하고 기술하기 전에, 하기에 기재된 양태(aspect)는 특정한 조성물, 그러한 조성물의 제조 방법, 또는 그의 용도에 한정되지 않고, 따라서, 변할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 양태만을 설명하기 위한 목적이고, 한정하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 상세한 설명은 단지 독자의 편의를 위해 다양한 섹션으로 분리되고 임의의 섹션에서 발견되는 개시는 또 다른 섹션의 개시와 조합될 수 있다. 제목 또는 부제(subtitle)는 본 명세서에서 독자의 편의를 위해 사용될 수 있고, 이는 본 발명의 범위에 영향을 미치는 것으로 의도되지 않는다.
정의
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 뒤이은 청구항에서, 하기의 의미를 갖는 것으로 정의될 다수의 용어들에 대한 참조(reference)가 있을 것이다:
본 명세서에서 사용된 용어는 특정한 구체예를 기술하기 위한 목적만을 가지며, 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용된, 단수 형태 "하나(a, an)" 및 "그(the)"는, 문맥상 명확하게 달리 표시되지 않으면, 복수 형태도 포함하도록 의도된다.
"선택적(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 후속적으로 기술된 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 또는 일어나지 않을 수 있고, 그 기재는 사건 또는 상황이 일어난 경우 및 일어나지 않은 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 수치적 지정(numerical designation), 예를 들면, 범위를 포함한, 온도, 시간, 양, 농도, 등의 앞에 사용되는 경우 용어 "약(about)"은 (+) 또는 (-) 10%, 5%, 1%, 또는 그 사이의 부속 범위(subrange) 또는 부속 값(subvalue) 만큼 변할 수 있는 근사값을 나타낸다.
바람직하게는, 용량(dose amount)와 관련하여 사용될 때, 용어 "약"은 용량이 +/- 10% 변할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, "약 400 내지 800 개의 결합제(about 400 to about 800 binding agents)"는 나노입자의 외부 표면이 360개 내지 880개의 입자의 결합제의 양을 포함한다는 것을 나타낸다.
"포함하는(comprising)" 또는 "포함하다(comprises)"는 조성물 및 방법이 기재된 요소들을 포함하나, 다른 것들을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용된 경우, "필수적으로 구성된(consisting essentially of)"은 명시된 목적을 위한 조합에 대한 필수적 중요성(essential significance)의 다른 요소들을 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 정의된 요소들로 필수적으로 구성된 조성물은 청구된 발명의 기본적 및 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 기타 물질 또는 단계를 배제하지 않을 것이다. "구성된(consisting of)"은 기타 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량 요소를 초과하는 것들을 배제하는 것을 의미할 것이다. 이러한 전환 용어 각각에 의해 정의된 구체예가 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "나노입자(nanoparticle)"는 5 마이크론 미만인 하나 이상의 크기(dimension)를 갖는 입자를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 예를 들면, 정맥내 투여를 위한 것들의 경우, 나노입자는 1 마이크론 미만이다. 직접 투여의 경우, 나노입자는 더 클 것이다. 훨씬 더 큰 입자가 명확하게 본 발명에 의해 고려된다.
입자의 집단에서, 개별적인 입자의 크기는 평균의 주위에 분포된다. 따라서, 집단의 입자 크기는 평균에 의해, 및 또한, 백분위수(percentile)에 의해 나타낼 수 있다. D50은 입자의 50%가 그보다 작은 입자 크기이다. 입자의 10%는 D10 값보다 더 작고, 입자의 90%는 D90보다 더 작다. 불명확한 경우, "평균(average)" 크기는 D50과 동등하다.
용어 "나노입자(nanoparticle)"는 또한 보다 작은 단위 나노입자들의 별개의 다량체(discrete multimer)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 320 nm 입자는 단위 160 nm 나노입자의 이량체를 포함할 수 있다. 160 nm 나노입자의 경우, 따라서, 다량체는 대략적으로 320 nm, 480 nm, 640 nm, 800 nm, 960 nm, 1120 nm, 등일 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "담체 단백질(carrier protein)"은 결합제 및/또는 치료제를 수송하기 위해 기능하는 단백질을 의미한다. 본 개시의 결합제는 가역적으로 담체 단백질에 결합할 수 있다. 담체 단백질의 예는 하기에서 보다 상세하게 검토된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "코어(core)"는 담체 단백질, 담체 단백질과 치료제, 또는 기타 작용제, 또는 작용제들의 조합으로 구성될 수 있는 나노입자의 중심 부분 또는 속 부분(inner portion)을 의미한다. 일부 구체예에서, 결합제의 소수성 부분이 코어에 통합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료제(therapeutic agent)"는 치료적으로 유용한 작용제, 예를 들면, 질병 상태, 생리적 상태(physiological condition), 증상, 병인적 요인(etiological factor)의 치료, 진정(remission), 또는 약화(attenuation)을 위한 작용제, 또는 그의 평가 또는 진단을 위한 작용제를 의미한다. 치료제는 화학요법제(chemotherapeutic agent), 예를 들면, 유사분열 저해제(moitotic inhibitor), 토포이소머라아제 저해제(topoisomerase inhibitor), 스테로이드, 항-종양 항생제(anti-tumor antibiotic), 대사길항제(antimetabolite), 알킬화제(alkylating agent), 효소, 프로테오좀 저해제(proteasome inhibitor), 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "결합제(binding agent)", "특이적 결합제(binding agent specific for)" 또는 "특이적으로 결합하는 결합제(binding agent that specifically binds)"는 표적 항원에 결합하고, 관련없는 화합물에 유의성있게 결합하지 않는 작용제를 의미한다. 개시된 방법에서 효과적으로 사용될 수 있는 결합제의 예는 렉틴, 단백질, 및 항체, 예를 들면, 단일클론 항체, 예를 들면, 인간화 단일클론 항체, 키메라 항체(chimeric antibody), 또는 다중클론 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 및 앱타머(aptamer) 또는 융합 단백질을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 일 구체예에서, 결합제는 알부민-결합 모티프를 포함한다. 알부민-결합 모티프의 비-한정적 예는 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, 2017년 8월 4일자로 출원된 PCT 출원 PCT/US2017/045643에서 찾을 수 있다. 일 구체예에서, 결합제는 외생 항체(exogenous antibody)이다. 외생 항체는 포유동물, 예를 들면, 인간에서 포유동물 면역계에 의해 천연적으로 생성되지 않는 항체이다.
T본 명세서에서 사용된 용어 "항체(antibody)" 또는 "항체들(antibodies)"은 면역글로불린 분자(즉, 면역-특이적으로 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자) 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분(immunologically active portion)을 의미한다. 이 용어는 또한 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄로 구성된 항체 및 전장 항체(full length antibody) 및 그의 부분을 포함하는 다양한 형태를 의미하고; 예를 들면, 면역글로불린 분자, 단일클론 항체, 키메라 항체, CDR-그라프트 항체(CDR-grafted antibody), 인간화 항체(humanized antibody), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화결합-연결 Fv(disulfide linked Fv), scFv, 단일 도메인 항체(dAb), 디아바디(diabody), 다중특이성 항체(multispecific antibody), 이중 특이성 항체(dual specific antibody), 항-유전자형 항체(anti-idiotypic antibody), 이중 특이성 항체(bispecific antibody), 그의 기능적 활성 에피토프-결합 단편(functionally active epitope-binding fragment thereof), 이관능성 하이브리드 항체(bifunctional hybrid antibodies)(예를 들면, Lanzavecchia et al., Eur. J Immunol . 17, 105 (1987)) 및 단쇄 (예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Huston et al., Proc . Natl . Acad . Sci . US.A., 85, 5879-5883 (1988) and Bird et al., Science 242, 423-426 (1988))를 포함한다. (일반적으로, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2ND ed. (1984); Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986) 참조). 항체는 임의의 종류일 수 있다(예를 들면, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD). 바람직하게는, 항체는 IgG이다. 항체는 비-인간(non-human)(예를 들면, 마우스, 염소, 또는 임의의 다른 동물 유래) 항체, 완전 인간(fully human) 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다. 항체는 본 명세서에 개시된 항체의 바이오시밀러(biosimilar)를 포함한다. 본 명세서에서 사용된, 바이오시밀러는 혁신 기업(innovator company)에 의해 판매되는 기준 제품(reference product) 대비 특성, 안전성, 및 효능에서 비교할 만한 것으로 여겨지는 생물의약품(biopharmaceutical)을 의미한다(공중 보건 서비스 법(Public Health Service Act)(42 U.S.C. 262(i))의 섹션 351(i)).
"Kd"로도 지칭되는 용어 "해리 상수(dissociation constant)"는 특정 물질이 개별적인 성분(예를 들면, 단백질 담체, 항체, 및 치료제)으로 분리되는 정도를 표현하는 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "동결건조된(lyophilized)", "동결건조(lyophilization)", 등은 건조대상 물질(예를 들면, 나노입자)이 먼저 동결되고 그 후, 얼음 또는 동결된 용매가 진공 환경에서 승화에 의해 제거되는 것인 과정을 의미한다. 보관 시 동결건조된 제품의 안정성을 강화하기 위해 미리-동결건조된 제형에 선택적으로 부형제가 포함된다. 일부 구체예에서, 나노입자는 치료제로 사용되기 전에 동결건조된 성분들(담체 단백질, 항체, 및 선택적 치료제)로부터 형성될 수 있다. 다른 구체예에서, 담체 단백질, 결합제, 예를 들면, 항체, 및 선택적 치료제를 먼저 나노입자 내로 조합하고, 그 후, 동결건조시킨다. 동결건조된 시료는 추가적인 부형제를 더 포함할 수 있다.
용어 "벌킹제(bulking agent)"는 동결-건조된 제품의 구조를 제공하는 작용제를 포함한다. 벌킹제를 위해 사용되는 일반적인 예는 만니톨, 글리신, 락토오스, 및 수크로오스를 포함한다. 약제학적으로 유리한(pharmaceutically elegant) 케이크를 제공하는 것 외에, 벌킹제는 또한 붕괴(collapse) 온도의 변화, 동결-해동(freeze-thaw) 보호의 제공, 및 장기간 보관시 안정성 강화의 측면에서 유용한 특성을 부여할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 동결건조된 조성물은 벌킹제를 포함한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 동결건조된 조성물은 벌킹제를 포함하지 않는다.
용어 "완충제(buffer)"는 동결건조 전에 용액 pH를 허용가능한 범위에서 유지시키는 작용제들을 포함하고, 숙시네이트(소디움 또는 포타슘), 히스티딘, 포스페이트(소디움 또는 포타슘), 트리스(Tris)(트리스(히드록시메틸)아미노메탄), 디에탄올아민, 시트레이트(소디움), 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 완충제는 약 5.5 내지 약 6.5 범위의 pH를 갖고, 바람직하게는, 약 6.0의 pH를 갖는다. pH를 이 범위에서 조절할 완충제의 예는 숙시네이트(예를 들면, 소디움 숙시네이트), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트, 및 기타 유기산 완충제(organic acid buffer)를 포함한다.
용어 "동결 보호제(cryoprotectant)"는 추정하건대 단백질 표면으로부터 우선적으로(preferentially) 제거되는 것에 의해 동결-유도 스트레스에 대해 단백질의 안정성을 제공하는 작용제를 전반적으로 포함한다. 그들은 또한 일차 및 이차 건조 및 장기간 제품 보관 동안 보호를 제공할 수 있다. 예는 폴리머, 예를 들면, 덱스트란 및 폴리에틸렌 글리콜; 당, 예를 들면, 수크로오스, 글루코오스, 트레할로오스, 및 락토오스; 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트; 및 아미노산, 예를 들면, 글리신, 아르기닌, 및 세린이다.
용어 "동결건조 보호제(lyoprotectant)"는 추정하건대 무정형의 유리 같은 매트릭스(amorphous glassy matrix)를 제공하고 수소 결합을 통해 단백질과 결합하여, 건조 과정 동안 제거되는 물 분자를 대체하는 것에 의해, 건조 또는 '탈수(dehydration)' 과정(일차 및 이차 건조 사이클) 동안 단백질에 안정성을 제공하는 작용제를 포함한다. 이는 동결건조 사이클 동안 단백질 구조(protein conformation)를 유지하고, 단백질 분해를 최소화하며, 장기 제품(long-term product)을 개선시키는데 기여한다. 예는 폴리올 또는 당, 예를 들면, 수크로오스 및 트레할로오스를 포함한다.
용어 "약제학적 제형(pharmaceutical formulation)"은 활성 성분이 유효할 수 있게 하는 형태이고, 제형이 투여되는 개체에게 유독한 어떠한 추가적인 성분도 포함하지 않는 제제(preparation)를 의미한다.
"약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)" 부형제(비히클, 첨가제)는 사용된 활성 성분의 유효량을 제공하기 위해 대상 포유동물에 합리적으로 투여될 수 있는 것들이다.
"재구성 시간(reconstitution time)"은 동결건조된 제형을 용액으로 재수화시키기 위해 요구되는 시간이다.
"안정한(stable)" 제형은 보관시, 그 내부의 단백질이 필수적으로 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지하는 것인 제형이다. 예를 들면, 단백질 안정성을 측정하는 다양한 분석 기법들이 당해 기술 분야에서 이용가능하고, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993)에서 리뷰된다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "에피토프(epitope)"는 결합제, 예를 들면, 항체에 의해 인식되는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 단백질(예를 들면, 항체) 또는 리간드와 특이적 상호작용을 가능하게 하는, 짧은 아미노산 서열 또는 펩티드(선택적으로 글리코실화되거나 또는 달리 변형된 펩티드)를 포함하나, 그에 한정되지 않는다. 예를 들면, 에피토프는 결합제의 항원-결합 부위가 부착되는 분자의 부분일 수 있다.
용어 "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"는 개체, 예를 들면, 인간에서 질병 또는 질환(예를 들면, 암)의 치료를 의미하고, (i) 질병, 또는 질환의 억제, 즉, 그의 발달(development)의 정지; (ii) 질병 또는 질환의 완화, 즉, 질병 또는 질환의 경감(regression) 유발; (iii) 질병 또는 질환의 진행 둔화; 및/또는 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 억제, 완화, 또는 진행 둔화를 포함한다. 일부 구체예에서, "치료하는" 또는 "치료"는 암세포를 사멸시키는 것을 의미한다.
암 치료와 관련하여, 용어 "사멸(kill)" 또는 "사멸시키는(killing)"은 암세포, 또는 암세포의 집단의 적어도 일부의 사망을 초래할 임의의 종류의 조작(manipulation)을 포함하는 것으로 지시된다.
용어 "앱타머(aptamer)"는 표적 분자, 예를 들면, 폴리펩티드에 결합할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 앱타머는 T-세포 암에서 발현되는 항원, 예를 들면, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD20, CD38, CD25, CD30, CD40, CD52, CD 122, 또는 CCR4에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정한 결합 특이성을 갖는 항체의 생성 및 앱타머의 치료적 용도는 당해 기술 분야에서 잘 확립되어 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,475,096호, 미국특허 제5,270,163호, 제5,582,981호, 제5,840,867호, 제6,011,020호, 제6,051,698호, 제6,147,204호, 제6,180,348호, 및 제6,699,843호, 및 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration)의 치료를 위한 Macugen® (Eyetech, New York)의 치료 효능을 참조한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "올리고머(oligomer)" 또는 "올리고머성(oligomeric)" 또는 "올리고머화된(oligomerized)"은 둘 이상의 단량체로 구성된 올리고머를 의미한다.
융합 단백질은 원하는 구조-기능 특성 및 유의성 있는 치료 효능을 갖는 분자를 생성하기 위해 단백질의 일 부분(예를 들면, 항체의 결정성(crystallizable) 단편(Fc) 도메인; 또는 항체의 알부민-결합 모티프)을 또 다른 생물학적 활성제(biologically active agent), 예를 들면, 단백질 도메인, 펩티드, 또는 핵산 또는 펩티드 앱타머에 연결한 생물공학적으로 생성된(bioengineered) 폴리펩티드이다. 효과기(effector) 기능의 동원(recruitment) 및 증가된 혈장 반감기와 같은 유리한 특징 때문에, IgG(gamma immunoglobulin) 이소형이 종종 Fc-융합 단백질을 생성하기 위한 기반으로 이용된다. 융합 파트너로서 이용될 수 있는, 펩티드 및 핵산 앱타머의 범위를 고려할 때, 융합 단백질은 다수의 생물학적 및 약제학적 응용을 갖는다.
추가적으로, 본 명세서에서 사용된 일부 용어는 하기에서 보다 구체적으로 정의된다.
개요
본 발명은 부분적으로, 담체 단백질, T-세포 또는 T-세포 암에서 발현되는 항원에 결합할 수 있는 결합제, 예를 들면, 항체, 앱타머, 또는 알부민-결합 모티프 및 항원 결합 도메인을 갖는 융합 단백질, 예를 들면, 세포 수용체의 리간드, 또는 앱타머에 융합된 알부민-결합 모티프, 및 치료제를 포함하는 선택적으로 동결건조된 나노입자가 환자에 대한 독성을 최소화하면서, 종양에 대한 표적화 치료를 제공한다는 놀라운 발견에 근거한다. 일 양태에서, 결합제는 T-세포 또는 T-세포 암에서 발현되는 항원에 결합할 수 있고, 동시에 OKT3의 면역원성 및 유사세포 분열 촉진성 잠재력 한계(immunogenic and mitogenic potential limitation)와 연관된 심각한 부작용을 감소시키거나 제거할 수 있는 OKT3이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 나노입자는 심각한 부작용 및/또는 독성을 갖는 통상적인 ADC 대비 중요한 개선이다.
당해 분야의 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 통상적인 ADC가 효과적이기 위해서는, 링커가 전신 순환에서 해리되지 않도록 충분히 안정하나, 종양 부위에서 충분한 약물 방출을 가능하게 하는 것이 중요하다. Alley, S.C., et al. (2008) Bioconjug Chem 19:759-765. 이것이 효과적인 약물 컨쥬게이트의 개발에서 주요한 장애인 것으로 입증되었다(Julien, D.C., et al. (2011) MAbs 3:467-478; Alley, S.C., et al. (2008) Bioconjug Chem 19:759-765); 따라서, 나노-면역 컨쥬게이트(nano-immune conjugate)의 매력적인 특징은 생화학적 링커가 요구되지 않는다는 것이다.
기존 ADC의 또 다른 단점은 종양으로의 더 높은 약물 침투율(penetration)이 인간 종양에서 실질적으로 입증되지 않았다는 것이다. 마우스 모델에서 ADC의 초기 테스트는 항체를 이용한 종양 표적화(targeting)가 종양에서 활성제의 더 높은 농도를 가져올 것이라는 것을 시사했다(Deguchi, T. et al. (1986) Cancer Res 46: 3751-3755); 그러나, 아마도 인간 종양은 마우스 종양보다 투과율이 훨씬 더 이질적(heterogenous)이기 때문에, 이는 인간 질환의 치료에서 상관관계가 입증되지 않았다. Jain, R.K. et al. (2010) Nat Rev Clin Oncol 7:653-664. 또한, 나노입자의 크기가 혈관계(vasculature)로부터 종양으로의 혈관외 유출(extravasation)을 위해 중요하다. 인간 결장 선암종 이종이식 모델(human colon adenocarcinoma xenotransplant model)을 이용한 마우스 연구에서, 혈관 포어(vascular pore)는 최대 400 nm의 리포좀에 대해 투과성이 있었다. Yuan, F., et al. (1995) Cancer Res 55: 3752-3756. 종양 포어 크기 및 투과성의 또 다른 연구는 두 특징이 모두 종양 위치 및 성장 상태에 의존적이고, 퇴행성(regressing) 종양 및 두개 종양(cranial tumor)은 200 nm 미만의 입자에 대해 투과성이 있다는 것을 보여주었다. Hobbs, S.K., et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95:4607-4612. 본 명세서에 기재된 나노-면역 컨쥬게이트는 200 nm 미만의 온전한 큰 복합체가 전신 순환에서 종양 조직에 용이하게 침투할 수 있는 더 작은 기능적 단위로 부분적으로 해리된다는 사실에 의해 이 이슈를 극복한다. 또한, 컨쥬게이트가 종양 부위에 도달하면, 더 작은 독성 탑재물(payload)이 방출될 수 있고, 전체 컨쥬게이트가 아닌, 독성 부분만 종양 세포에 의해 흡수되면 된다.
치료제(즉, ABRAXANE®)를 포함하는 항체-(즉, AVASTIN®) 코팅 알부민 나노입자의 등장은 인 비보에서 2종 이상의 치료제의 예정된(predetermined) 부위로의 방향성 전달(directional delivery)의 새로운 패러다임을 가져왔다. 각각이 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, PCT 특허 공개 WO 2012/154861 및 WO 2014/055415를 참조한다.
알부민과 결합제, 예를 들면, 항체의 조성물이 특정 농도 및 비율로 수용액에서 함께 혼합되는 경우, 본 발명에서 유용한 결합제는 자발적으로 알부민 내부 및 그 위로 자가-조립되어 복수 카피의 결합제(최대 500개 또는 그 이상)를 갖는 나노입자를 형성한다.
단일 출처 단백질(single source protein)을 포함하는 단백질 조성물은 통상적으로 상당한 저장 수명을 보이는 동결건조된 형태로 보관되고, 그러한 동결건조 조성물은 소수성-소수성 상호작용에 의해 함께 통합된 2종의 상이한 단백질의 자가-조립 나노입자를 포함하지 않는다. 또한, 결합제의 결합 부분의 대부분이 나노입자의 표면에 노출된 것인 나노입자 구조(configuration)는 달리 양성(benign)인 것으로 간주될 상태에 의한 축출(dislodgement) 또는 구조변경(reconfiguration)에 민감하게 한다. 예를 들면, 동결건조 동안, 단백질 상의 이온 전하는 탈수되어 기저 전하(underlying charges)를 노출시킨다. 노출된 전하는 각 단백질의 나머지 단백질에 대한 결합 친화도를 변화시킬 수 있는, 2종의 단백질 간 전하-전하 상호작용을 가능하게 한다. 또한, 나노입자의 농도는 용매(예를 들면, 물)가 제거되면서 유의성 있게 증가한다. 그러한 나노입자의 증가된 농도는 비가역적 올리고머화를 초래할 수 있다. 올리고머화는 단량체 형태 대비 올리고머의 생물학적 특성을 감소시키고 입자의 크기를, 때로는 1 마이크론 초과하게 증가시키는 단백질의 공지된 특성이다.
반면에, 나노입자 조성물의 안정한 형태가 임상적 및/또는 상업용 용도를 위해 요구되고, 이때, 3개월 이상의 저장 수명이 요구되고, 6개월 또는 9개월 초과의 저장 수명이 바람직하다. 그러한 안정한 조성물은 정맥내 주사를 위해 용이하게 이용가능해야 하고, 인 비보에서 예정된 부위로 나노입자를 유도하기 위해 정맥내 투여시 그의 자가-조립된 형태를 유지하고, 혈류(blood stream)로 전달된 경우에도 허혈성 사건(ischemic event)을 피하기 위해 1 마이크론 미만의 최대 크기를 가져야 하고, 최종적으로 주사를 위해 사용된 수성 조성물과 양립가능해야 한다.
화합물
본 개시를 읽은 후 당업자에게 자명할 바와 같이, 본 개시는 담체 단백질, 결합제, 및 선택적으로, 하나 이상의 치료제를 포함하는 나노입자의 조성물로서, 상기 조성물은 동결건조되는 것인 조성물에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 담체 단백질은 알부민, 젤라틴, 엘라스틴(토포엘라스틴 포함) 또는 엘라스틴-유래 폴리펩티드(예를 들면, α-엘라스틴 및 엘라스틴-유사 폴리펩티드(elastin-like polypeptides)(ELPs)), 글리아딘(gliadin), 레구민(legumin), 제인(zein), 대두 단백질(예를 들면, 대두 단백질 단리물(SPI)), 유 단백질(milk protein) (예를 들면, β-락토글로불린(BLG) 및 카세인), 또는 유청 단백질 (예를 들면, 유청 단백질 농축물(WPC) 및 유청 단백질 단리물(whey protein isolate)(WPI))일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 담체 단백질은 알부민이다. 바람직한 구체예에서, 알부민은 난백(egg white)(오브알부민), 우혈청 알부민(BSA), 등이다. 훨씬 더 바람직한 구체예에서, 담체 단백질은 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 일부 구체예에서, 담체 단백질(예를 들면, 알부민)은 재조합 단백질(예를 들면, 재조합 HSA)이다. 일부 구체예에서, 담체 단백질은 미국 식품의약국(FDA)에 의해 허가된 GRAS(generally regarded as safe) 부형제이다. 일 구체예에서, 담체 단백질은 항체-결합 모티프를 포함한다. 항체-결합 모티프의 비-한정적 예는 참조에 의해 전체로 본 명세서에 포함된, 2017년 8월 4일자로 출원된 PCT 출원 PCT/US2017/045643에서 찾을 수 있다.
일부 구체예에서, 결합제는 아도-트라스트주맙 엠탄신(ado-trastuzumab emtansine), 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙(pertuzumab), 리툭시맙, 및 트라스투주맙으로부터 선택된 항체이다. 일부 구체예에서, 결합제는 슬리피주맙, OKT3, Leu 1, 자놀리누맙, 브렉툭시맙 베도틴, Mik-β1, KW-0761, 또는 이들의 조합을 포함한 항체이다. 일부 구체예에서, 이들 항체들 중 하나 이상이 명시적으로 배제된다. 일부 구체예에서, 항체는 나노입자의 표면 전체 또는 일부 상에 있는 항체의 실질적 단일층이다.
일 양태에서, 항체의 결합 부분은 T-세포 또는 T-세포 암에서 발현되는 항원에 결합할 수 있다. 일 구체예에서, 항원은 T-세포 암에서 발현되는 단백질이고, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD30, CD40, CD52, CD122, 및 CCR4를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가적인 구체예에서, 항원은 T-세포 암(예를 들면, T-세포 림프종)에서 과발현되는 바이오마커이다. T-세포 암에서 과발현되는 바이오마커는 PD-L1, Ly6E, HER3/EGFR DAF, ERBB-3 수용체, CSF-1R, HER2, STEAP1, CEA, OX40, Ang2-VEGF, 또는 VEGF를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항체의 결합 부분은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD30, CD40, CD52, CD 122, 또는 CCR4에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체의 결합 부분은 PD-L1, Ly6E, HER3/EGFR DAF, ERBB-3 수용체, CSF-1R, HER2, STEAP1, CEA, OX40, Ang2-VEGF, 또는 VEGF에 결합할 수 있다.
표 1은 T-세포 백혈병 및 림프종을 치료하기 위한 단일클론 항체의 비-한정적 목록을 나타낸다.
표 1. T-세포 암 치료용 단일클론 항체.
표적 항원 설명 단일클론 항체
CD2 LFA-3 (CD58) 슬리피주맙(MEDI-507)
CD3 (CD3ζ) TcR 신호전달 사슬(signaling chain) 무로모납-CD3 (Orthoclone®, OKT3)
CD4 TcR 공동-수용체(co-receptor) 자놀리무맙(HuMax-CD4®)
CD5 스캐빈저 수용체(scavenger receptor) 패밀리 일원 항-Leu1/ T101
CD25 IL-2 수용체 α-서브유닛 다클리주맙(Zenapax®)
CD30 TNF 수용체 패밀리 일원 브렌툭시맙 베도틴(Adcetris®)
CD52 GPI-고정-당단백질(GPI-anchored glycoprotein) 알렘투주맙(Campath®)
CD122 IL-2 및 IL-15 수용체의 β-서브유닛 Mik-β1
CCR4 케모카인 수용체(Chemokine receptor)-4 KW-0761
일부 구체예에서, 상기 하나 이상의 치료제, 또는 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 게피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 이마티닙, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴, 및 시클로포스파미드로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 치료제는 아드리아마이신(adriamycin), 블레오마이신(bleomycin), 빈블라스틴 술페이트, 빈크리스틴 술페이트, 에토포시드, 프레드니손, 시클로포스파미드 및 다카르바진 중 하나 이상을 포함한다. 일 구체예에서, 치료제는 아라논(넬라라빈(Nelarabine)), 아비트렉세이트(abitrexate), 아드리아마이신(독소루비신 히드로클로라이드), 암보클로린(ambochlorin)(클로람부실), 자이델릭(Zydelig)(이델라리십(Idelalisib)), 빈카사르(Vincasar) PFS(빈크리스틴 술페이트), 벨사르(Velsar)(빈블라스틴 술페이트), 벨케이드(보르테조밉), 벨반(Velban) (빈블라스틴 술페이트), 트레안다(Treanda)(벤다무스틴 히드로클로라이드), 로미뎁신, 류마트렉스(Rheumatrex)(메토트렉세이트), 레블리미드(Revlimid)(레날리도미드(Lenalidomide)), 프로카르바진 히드로클로라이드(Procarbazine Hydrochloride), 프레드니손, 프랄라트렉세이트(Pralatrexate), 플레릭사포르(Plerixafor), 네오사르(Neosar)(시클로포스파미드), 무스타르겐(Mustargen)(메클로르에타민 히드로클로라이드(Mechlorethamine Hydrochloride)), 메토트렉세이트, 메클로르에타민 히드로클로라이드, 마툴란(Matulane)(프로카르바진 히드로클로라이드), 로무스틴, 린폴리진(Linfolizin) 또는 류케란(Leukeran)(클로람부실), 이스토닥스(Istodax)(로미뎁신), 임브루비카(Imbruvica)(이브루티닙), DTIC-Dome(다카르바진), 독소루비신 히드로클로라이드, 데닐류킨 디프티톡스(Denileukin Diftitox), 시톡산(Cytoxan)(시클로포스파미드), 카르무스틴(Carmustine), 벨레오닥(Beleodaq)(벨리노스타트(Belinostat)), 또는 아라논(넬라라빈) 중 하나 이상을 포함한다. 일 구체예에서, 치료제는 머스타드 유도체(mustard derivative)(예를 들면, 시클로포스파미드, 메클로르에타민 또는 이포스파미드), 독소루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 및 프레드니손 중 하나 이상을 포함한다. 당해 기술분야의 당업자는 이들은 단지 예이며, 임의의 화학요법제 또는 암 치료제가 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
바람직하게는, 나노입자는 치료제로서 파클리탁셀을 포함한다.
치료제는 나노입자의 내부에, 나노입자의 외부 표면 상에, 또는 양자 모두에 위치할 수 있는 것으로 이해된다. 나노입자는 1종을 초과하는 치료제, 예를 들면, 2종의 치료제, 3종의 치료제, 4종의 치료제, 5종의 치료제, 등을 포함할 수 있다. 또한, 나노입자는 나노입자의 내부 및 외부에 동일하거나 또는 상이한 치료제를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유결합에 의해 결합된 100개 이상의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유결합에 의해 결합된 200개 이상의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유결합에 의해 결합된 300개 이상의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유결합에 의해 결합된 400개 이상의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유결합에 의해 결합된 500개 이상의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유결합에 의해 결합된 600개 이상의 결합제를 포함한다.
일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비공유결합에 의해 결합된 약 100개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비공유결합에 의해 결합된 약 200개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비공유결합에 의해 결합된 약 300개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비공유결합에 의해 결합된 약 400개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비공유결합에 의해 결합된 약 500개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비공유결합에 의해 결합된 약 600개 내지 약 1000개의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비공유결합에 의해 결합된 약 200개 내지 약 800개의 결합제를 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비공유결합에 의해 결합된 약 300개 내지 약 800개의 결합제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비공유결합에 의해 결합된 약 400개 내지 약 800개의 결합제를 포함한다. 고려되는 값들은 종말점을 포함한, 기재된 범위 내의 임의의 값 또는 부속 범위(subrange)를 포함한다.
일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 1 ㎛ 미만이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 90 nm 내지 약 1 ㎛이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 90 nm 내지 약 900 nm이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 90 nm 내지 약 800 nm이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 90 nm 내지 약 700 nm이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 90 nm 내지 약 600 nm이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 90 nm 내지 약 500 nm이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 90 nm 내지 약 400 nm이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 90 nm 내지 약 300 nm이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 90 nm 내지 약 200 nm이다. 바람직한 구체예에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 100 nm 내지 약 180 nm이다. 특히 바람직한 구체예에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 100 nm 또는 약 160 nm이다. 고려되는 값들은 종말점을 포함한, 본 명세서에 기재된 범위 내의 임의의 값, 부속 범위, 또는 범위를 포함한다.
일 양태에서, 나노입자 조성물은 정맥내 주사를 위해 제제화된다. 허혈 사건(ischemic event)를 피하기 위해, 정맥내 주사를 위해 제제화된 나노입자 조성물은 약 1 ㎛ 미만의 평균 입자 크기를 갖는 나노입자를 포함해야 한다.
일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 1 ㎛보다 크다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 1 ㎛ 내지 약 5 ㎛이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 1 ㎛ 내지 약 4 ㎛이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 1 ㎛ 내지 약 3 ㎛이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 1 ㎛ 내지 약 2 ㎛이다. 일 양태에서, 나노입자 조성물 중 평균 입자 크기는 약 1 ㎛ 내지 약 1.5 ㎛이다. 고려되는 값들은 종말점을 포함한, 본 명세서에 기재된 범위 내의 임의의 값, 부속 범위, 또는 범위를 포함한다.
일 양태에서, 나노입자 조성물은 종양으로의 직접 주사를 위해 제제화된다. 직접 주사는 종양 부위 또는 종양 근위부로의 주사, 종양으로의 관류, 등을 포함한다. 나노입자가 종양으로의 직접 주사를 위해 제제화되는 경우, 나노입자는 임의의 평균 입자 크기를 포함할 수 있다. 이론에 의해 한정되지 않으면서, 더 큰 입자(예를 들면, 500 nm 초과, 1 ㎛ 초과, 등)는 종양 내에 고정화(immobilized)될 가능성이 높아서, 그에 의해 유용한 효과를 제공할 것으로 사료된다. 더 큰 입자들은 종양 또는 특정한 기관에 축적될 수 있다. 예를 들면, "TheraSphere®"(간암을 위해 임상적으로 사용되고 있음)로 불리는, 간의 종양으로 공급하는 간동맥에 주사하기 위해 사용되는, 20-60 마이크론 유리 입자를 참조한다. 따라서, 정맥내 투여를 위해, 1 ㎛ 미만의 입자가 통상적으로 사용된다. 1 ㎛보다 큰 입자들은 보다 통상적으로 종양으로 직접 투여되거나("직접 주사") 또는 종양 부위로 공급하는 동맥에 직접 투여된다.
일 양태에서, 조성물 내 나노입자의 약 0.01% 미만이 200 nm보다 크거나, 300 nm보다 크거나, 400 nm보다 크거나, 500 nm보다 크거나, 600 nm보다 크거나, 700 nm보다 크거나, 또는 800 nm보다 큰 입자 크기를 갖는다. 일 양태에서, 조성물 내 나노입자의 약 0.001% 미만이 200 nm보다 크거나, 300 nm보다 크거나, 400 nm보다 크거나, 500 nm보다 크거나, 600 nm보다 크거나, 700 nm보다 크거나, 또는 800 nm보다 큰 입자 크기를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 조성물 내 나노입자의 약 0.01% 미만이 800 nm보다 큰 입자 크기를 갖는다. 보다 바람직한 구체예에서, 조성물 내 나노입자의 약 0.001% 미만이 800 nm보다 큰 입자 크기를 갖는다.
바람직한 양태에서, 본 명세서에 기재된 크기 및 크기 범위는 재구성된 동결건조 나노입자 조성물의 입자 크기에 관한 것이다. 즉, 동결건조된 나노입자가 수용액(예를 들면, 물, 기타 약제학적으로 허용가능한 부형제, 완충액, 등)에 재현탁된 후, 입자 크기 또는 평균 입자 크기는 본 명세서에 기재된 범위 내에 속한다.
일 양태에서, 나노입자의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%가 재구성된 조성물 중에 단일 나노입자로서 존재한다. 즉, 나노입자의 약 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만 등이 이량체화되거나 다량체화(올리고머화)된다.
일부 구체예에서, 조성물 중 나노입자는 개수 기준 20% 미만이 이량체화를 갖고(less than 20% by number dimerization), 개수 기준 10% 미만이 이량체화를 갖고, 바람직하게는 개수 기준 5% 미만이 이량체화를 갖는다.
일부 구체예에서, 나노입자의 크기는 담체 단백질 대 결합제의 양(예를 들면, 비)을 조정하는 것에 의해 조절될 수 있다. 나노입자의 크기, 및 크기 분포도 중요하다. 본 발명의 나노입자는 그들의 크기에 따라 다르게 거동할 수 있다. 큰 크기에서, 응집(agglomeration)은 혈관을 막을 수 있다. 따라서, 나노입자의 응집은 조성물의 성능(performance) 및 안전성에 영향을 미칠 수 있다. 반면에, 보다 큰 입자들은 특정한 조건(예를 들면, 정맥내로 투여되지 않는 경우)에서 보다 높은 치료 효과를 발휘할(therapeutic) 수 있다.
일 양태에서, 나노입자 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 나노입자의 외부 표면에 비-공유 결합에 의해 결합된다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 나노입자의 외부 표면에 배열된다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 겜시타빈, 게피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 이마티닙, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴, 및 시클로포스파미드로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료제는 항암 결합제, 예를 들면, 항암 항체이다.
나노입자의 제조 방법
일부 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 나노입자 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 나노입자는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 나노입자, 나노입자 조성물, 및 동결건조된 나노입자 조성물을 제조하는 방법의 비-한정적 예를 각각 참조에 의해 전체로 본 명세서에 포함된, PCT 공개 WO2014/055415 및 WO2016/057554에서 찾을 수 있다.
일 양태에서, 나노입자 조성물의 나노입자는 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자를 결합제와 약 10:1 내지 약 10:30의 담체 단백질 입자 또는 담체 단백질-치료제 입자 대 결합제 비율로 접촉시키는 것에 의해 형성된다. 일 구체예에서, 상기 비는 약 10:2 내지 약 10:25이다. 일 구체예에서, 상기 비는 약 10:2 내지 약 1:1이다. 바람직한 구체예에서, 상기 비는 약 10:2 내지 약 10:6이다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 비는 약 10:4이다. 고려되는 비는 종말점을 포함한, 기재된 범위 내의 임의의 값, 부속 범위, 또는 범위를 포함한다.
일 구체예에서, 나노입자를 형성하기 위해 사용되는 용액 또는 기타 액체 매질의 양이 특히 중요하다. 담체 단백질(또는 담체 단백질-치료제) 및 항체의 과도하게 희석된 용액에서는 나노입자가 형성되지 않는다. 과도하게 농축된 용액은 비구조화 응집체(unstructured aggregate)를 초래한다. 일부 구체예에서, 사용되는 용액(예를 들면, 멸균수, 염수, 인산염 완충 염수(PBS))의 양은 약 0.5 mL 용액 내지 약 20 mL 용액이다. 일부 구체예에서, 담체 단백질의 양은 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이다. 일부 구체예에서, 결합제의 양은 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL이다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 담체 단백질:결합제:용액의 비는 1 mL의 용액(예를 들면, 염수) 중 약 9 mg의 담체 단백질(예를 들면, 알부민) 대 4 mg의 결합제, 예를 들면, 항체(예를 들면, OKT3)이다. 상당한 양의 치료제(예를 들면, 탁솔)가 또한 담체 단백질에 더해질 수 있다. 예를 들면, 1 mg의 탁솔이 1 mL 용액 중 9 mg의 담체 단백질(10 mg 담체 단백질-치료제) 및 4 mg의 결합제, 예를 들면, 항체, Fc 융합 분자, 또는 앱타머에 첨가될 수 있다. 통상적인 i.v. 백, 예를 들면, 약 1 리터의 용액을 담은 i.v. 백을 사용하는 경우, 1 mL에서 사용된 양의 1000x 양의 담체 단백질/담체 단백질-치료제 및 항체를 사용해야 할 것이다. 따라서, 표준 i.v. 백에서 본 발명의 나노입자를 형성할 수 없다. 또한, 본 발명의 치료량(therapeutic amount)으로 성분들이 표준 i.v. 백에 첨가되는 경우, 성분들은 나노입자를 형성하기 위해 자가-조립되지 않는다.
일 구체예에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자가 약 4 내지 약 8의 pH를 갖는 용액 중 결합제와 접촉된다.
일 구체예에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자가 약 4의 pH를 갖는 용액 중 결합제와 접촉된다. 일 구체예에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자가 약 5의 pH를 갖는 용액 중 결합제와 접촉된다. 일 구체예에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자가 약 6의 pH를 갖는 용액 중 결합제와 접촉된다. 일 구체예에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자가 약 7의 pH를 갖는 용액 중 결합제와 접촉된다. 일 구체예에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자가 약 8의 pH를 갖는 용액 중 결합제와 접촉된다. 바람직한 구체예에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자가 약 5 내지 약 7의 pH를 갖는 용액 중 결합제와 접촉된다.
일 구체예에서, 담체 단백질 입자 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 5℃ 내지 약 60℃의 온도, 또는 종말점을 포함한 그 범위 내의 임의의 범위, 부속 범위, 또는 값의 온도에서 결합제와 인큐베이션된다. 바람직한 구체예에서, 상기 담체 단백질 입자 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 23℃ 내지 약 60℃의 온도에서 결합제와 인큐베이션된다.
이론에 의해 한정되지 않으면서, 나노입자 조성물 내의 나노입자의 안정성은 나노입자가 형성되는 온도 및/또는 pH, 및 용액 중 성분들(즉, 담체 단백질, 결합제, 및 선택적인 치료제)의 농도에 적어도 부분적으로 의존적이다. 일 구체예에서, 나노입자의 Kd는 약 1 x 10-11 M 내지 약 2 x 10-5 M이다. 일 구체예에서, 나노입자의 Kd는 약 1 x 10-11 M 내지 약 2 x 10-8 M이다. 일 구체예에서, 나노입자의 Kd는 약 1 x 10-11 M 내지 약 7 x 10-9 M이다. 바람직한 구체예에서, 나노입자의 Kd는 약 1 x 10-11 M 내지 약 3 x 10-8 M이다. 고려되는 값들은 종말점을 포함한, 본 명세서에 기재된 범위 내의 임의의 값, 부속 범위, 또는 범위를 포함한다.
동결건조
본 발명의 동결건조된 조성물은 안정화제, 완충제, 등의 존재 또는 부재 하에 표준 동결건조 기법에 의해 제조된다. 놀랍게도, 이러한 조건은 나노입자의 상대적으로 취약한(fragile) 구조를 변형시키지 않는다. 또한, 이러한 나노입자들은 동결건조시 그들의 크기 분포를 유지하고, 보다 중요하게, 신선하게 제조된 것과 실질적으로 동일한 형태 및 비로 인 비보 투여(예를 들면, 정맥내 전달)를 위해 재구성될 수 있다.
동결건조(lyophilization) 또는 냉동-건조(freeze-drying)은 조성물로부터 물을 제거한다. 그 과정에서, 건조 대상 물질이 먼저 동결되고 그 후, 얼음 또는 동결된 용매가 진공 환경에서 승화에 의해 제거된다. 동결-건조 과정 동안 안정성을 증진시키고 및/또는 보관시 동결건조된 제품의 안정성을 개선하기 위해 미리-동결건조된 제형에 부형제가 포함될 수 있다. Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) and Arakawa et al., Pharm. Res. 8(3):285- 291 (1991).
단백질이 동결건조될 수 있으나, 동결건조 및 재구성의 과정이 단백질의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 단백질은 전통적인 유기 및 무기 약물보다 더 크고 더 복잡하기 때문에(즉, 복잡한 3차 구조 외에, 복수의 관능기를 가짐), 그러한 단백질의 제형은 특별한 문제를 부과할 수 있다. 단백질이 생물학적 활성을 유지하기 위해, 제형은 단백질의 아미노산의 적어도 핵심 서열(core sequence)의 구조적 무결성(conformational integrity)을 보존하고, 동시에 단백질의 복수의 관능기를 분해로부터 보호해야 한다. 단백질의 분해 경로는 화학적 불안정성(즉, 새로운 화합물(new chemical entity)을 초래하는, 결합 형성 또는 절단(cleavage)에 의한 단백질의 변형을 포함하는 과정) 또는 물리적 불안정성(즉, 단백질의 고차원 구조(higher order structure)의 변화)을 포함한다. 화학적 불안정성은 탈아미드화(deamidation), 라세미화(racemization), 가수분해, 산화, 베타 제거(beta elimination) 또는 디술피드 교환(disulfide exchange)으로부터 초래될 수 있다. 물리적 불안정성은 예를 들면, 변성(denaturation), 응집(aggregation), 침전(precipitation) 또는 흡착(adsorption)으로부터 초래될 수 있다. 3개의 가장 일반적인 단백질 분해 경로는 단백질 응집, 탈아미드화 및 산화이다. Cleland, et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993).
제형(formulations)
일 양태에서, 나노입자 조성물은 전신 전달, 예를 들면, 정맥내 투여를 위해 제제화된다.
일 양태에서, 나노입자 조성물은 종양으로의 직접 주사를 위해 제제화된다. 직접 주사는 종양 부위 또는 종양 근위부로의 주사, 종양으로의 관류, 등을 포함한다. 나노입자 조성물은 전신으로 투여되지 않기 때문에, 나노입자 조성물은 종양으로의 직접 주사를 위해 제제화되고, 임의의 평균 입자 크기를 포함할 수 있다. 이론에 의해 한정되지 않으면서, 더 큰 입자(예를 들면, 500 nm 초과, 1 ㎛ 초과, 등)는 종양 내에 고정화될 가능성이 더 높아서, 보다 우수한 유익한 효과인 것으로 사료되는 것을 제공할 것으로 보인다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 화합물, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공된다.
일반적으로, 본 명세서에 제공된 화합물은 허용된 투여 모드에 의해 환자에게 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 다양한 제형 및 약물 전달 시스템이 당해 기술 분야에서 이용가능하다. 예를 들면, Gennaro, A.R., ed. (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.를 참조한다.
일반적으로, 본 명세서에서 제공되는 화합물은 하기 경로 중 하나에 의해 약제학적 조성물로서 투여될 것이다: 경구, 전신(systemic)(예를 들면, 경피, 비강내(intranasal) 또는 좌약에 의한 투여), 또는 비경구(예를 들면, 근육내, 정맥내, 또는 피하) 투여.
조성물은 일반적으로, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합된 본 발명의 화합물로 구성된다. 허용가능한 부형제는 무독성이고, 투여를 보조(aid)하며, 청구된 화합물의 치료적 잇점에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 그러한 부형제는 당해 분야에서 당업자에게 일반적으로 이용가능한, 고체, 액체, 반-고체(semi-solid), 또는 에어로졸 조성물의 경우, 기체 부형제일 수 있다.
고체 약제학적 부형제는 전분, 셀룰로오스, 탈크(talc), 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루(flour), 백악(chalk), 실리카 겔, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화 나트륨, 건조 탈지유(dried skim milk), 등을 포함한다. 액체 및 반고체 부형제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올, 및 페트롤리움, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 오일을 포함한 다양한 오일, 예를 들면, 땅콩유(peanut oil), 대두유, 광유(mineral oil), 참기름 등 으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 액체 담체, 특히, 주사용액용 액체 담체는 물, 염수, 덱스트로오스 수용액(aqueous dextrose), 및 글리콜을 포함한다. 기타 적합한 약제학적 부형제 및 그들의 제형이 E. W. Martin에 의해 편집된 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990)에 기재된다.
필요한 경우, 본 조성물은 활성 성분을 포함하는 하나 또는 그 이상의 단위 투여 제형(unit dosage form)을 포함하는 팩(pack) 또는 분배기 장치(dispenser device)로 제공될 수 있다. 그러한 팩 또는 장치는 예를 들면, 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들면, 블리스터 팩(blister pack), 또는 유리, 및 바이알에서와 같은 고무 마개(rubber stopper)를 포함할 수 있다. 팩 또는 분배기 장치는 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 적절한(compatible) 약제학적 담체 중에 제제화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물이 또한 제조되고, 적합한 용기에 배치되고, 표시된 질병의 치료를 위해 라벨링된다(labeled).
치료 방법
본 명세서에 기재된 나노입자 조성물은 포유동물에서 암세포 및/또는 종양을 치료하는데 유용하다. 바람직한 구체예에서, 포유동물은 인간(즉, 인간 환자)이다. 바람직하게는, 동결건조된 나노입자 조성물이 투여 전에 재구성(수성 부형제 중 현탁)된다.
일 양태에서, 암세포를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 암세포를 치료하기 위해 본 명세서에 기재된 유효량의 나노입자 조성물을 상기 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다. 암세포의 치료는 세포의 증식의 감소, 사멸, 세포의 전이 예방, 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 양태에서, 필요로 하는 환자에서 T-세포 또는 T-세포 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 T-세포 암을 치료하기 위해 본 명세서에 기재된 나노입자 조성물의 치료적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 T-세포 암은 말초성 T-세포 림프종, 역형성 대세포 림프종, 혈관면역모세포성 림프종, 피부 T-세포 림프종, 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATLL), 장병증-타입 T-세포 림프종, 간비장 감마-델타 T-세포 림프종, 모세포성 NK-세포 림프종, 림프모세포성 림프종, 비강 NK/T-세포 림프종, 치료-관련 T-세포 림프종, 또는 이들의 조합인 것인 방법이 제공된다.
일 양태에서, 치료를 필요로 하는 환자에서 종양을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 종양을 치료하기 위해 본 명세서에 기재된 나노입자 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다. 일 구체예에서, 종양 크기가 감소된다. 일 구체예에서, 종양 크기는 치료 동안 및/또는 치료 후 적어도 일정 기간 동안 증가(즉, 진행)하지 않는다.
일 구체예에서, 나노입자 조성물은 정맥내로 투여된다. 일 구체예에서, 나노입자 조성물은 종양으로 직접 투여된다. 일 구체예에서, 나노입자 조성물은 종양으로의 직접 주사 또는 관류에 의해 투여된다.
일 구체예에서, 상기 방법은 a) 상기 나노입자 조성물을 3주 동안 주당 1회 투여하는 단계; b) 상기 나노입자 조성물의 투여를 1주 동안 중단하는 단계; 및 종양을 치료하기 위해 필요한 만큼 단계 a) 및 b)를 반복하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 본 명세서에 기재된 나노입자의 치료적 유효량은 약 1 mg/m2 내지 약 200 mg/m2 항체, 약 2 mg/m2 내지 약 150 mg/m2, 약 5 mg/m2 내지 약 100 mg/m2, 약 10 mg/m2 내지 약 85 mg/m2, 약 15 mg/m2 내지 약 75 mg/m2, 약 20 mg/m2 내지 약 65 mg/m2, 약 25 mg/m2 내지 약 55 mg/m2, 약 30 mg/m2 내지 약 45 mg/m2, 또는 약 35 mg/m2 내지 약 40 mg/m2 항체를 포함한다. 다른 구체예에서, 치료적 유효량은 약 20 mg/m2 내지 약 90 mg/m2 항체를 포함한다. 일 구체예에서, 치료적 유효량은 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2 항체를 포함한다. 일 구체예에서, 본 명세서에 기재된 나노입자의 치료적 유효량은 약 50 mg/m2 내지 약 200 mg/m2 담체 단백질 또는 담체 단백질 및 치료제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 치료적 유효량은 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2 담체 단백질 또는 담체 단백질 및 치료제를 포함한다. 고려되는 값은 종말점을 포함한, 기재된 범위 중 하나 내에 속하는 임의의 값, 부속 범위, 또는 범위를 포함한다.
일 구체예에서, 치료적 유효량은 약 20 mg/m2 내지 약 90 mg/m2의 결합제, 예를 들면, 항체, 앱타머, 또는 융합 단백질을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 치료적 유효량은 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2의 결합제, 예를 들면, 항체, 앱타머, 또는 융합 단백질을 포함한다. 고려되는 값은 종말점을 포함한, 기재된 범위 중 하나 내에 속하는 임의의 값, 부속 범위, 또는 범위를 포함한다.
일 양태에서, 암은 T-세포 암이다. 일부 구체예에서, 암은 T-세포 림프종이다. 또 다른 구체예에서, 상기 암은 말초성 T-세포 림프종, 역형성 대세포 림프종, 혈관면역모세포성 림프종, 피부 T-세포 림프종, 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATLL), 장병증-타입 T-세포 림프종, 간비장 감마-델타 T-세포 림프종, 모세포성 NK-세포 림프종, 림프모세포성 림프종, 비강 NK/T-세포 림프종, 치료-관련 T-세포 림프종, 또는 이들의 조합이다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 유사한 유용성을 갖는 작용제에 대한 허용된 투여 모드에 의해 치료적 유효량으로 투여될 것이다. 본 발명의 화합물, 즉, 나노입자의 실제 양은 치료대상 질병의 중증도, 대상 개체의 연령 및 상대적 건강, 사용된 화합물의 효능(potency), 투여 경로 및 형태, 및 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 기타 인자와 같은 다수의 인자에 의존적일 것이다.
이러한 작용제의 유효량은 가장 효과적이고 편리한 투여 경로, 및 가장 적합한 제형이 그럴 수 있는 것처럼, 일상적인 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 다양한 제형 및 약물 전달 시스템이 당해 기술 분야에서 이용가능하다. 예를 들면, Gennaro, A.R., ed. (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.를 참조한다.
작용제, 예를 들면, 본 발명의 화합물의 유효량 또는 치료적 유효량은 개체에서 증상의 개선 또는 생존의 연장을 가져오는 작용제 또는 화합물의 양을 의미한다. 그러한 분자들의 독성 및 치료적 효능은 예를 들면, LD50 (집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하는 것에 의해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과 대 치료 효과의 용량비가 치료 지수(therapeutic index)이고, 이는 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 작용제가 바람직하다.
유효량 또는 치료적 유효량은 연구자, 수의사, 의사, 또는 기타 임상의에 의해 추구되는 조직, 계(system), 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 화합물 또는 약제학적 조성물의 양이다. 투여량(dosage)은 사용되는 투여 제형(dosage form) 및/또는 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로, 투여량, 및 투여 간격은 대상 개체의 상태의 구체적인 사항들을 고려하여, 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 선택되어야 한다.
투여량 및 간격은 원하는 효과를 달성하기 위해 충분한 활성 모이어티의 혈장 수준, 즉, 최소 유효 농도(minimal effective concentration)(MEC)를 제공하도록 개별적으로 조정되어야 한다. MEC는 각 화합물에 대해 변할 것이나, 예를 들면, 인 비트로 데이터 및 동물 실험으로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하기 위해 필요한 투여량은 개별적인 특징 및 투여 경로에 의존적일 것이다. 국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우에, 약물의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다.
실시예
본 개시가 코어로서 알부민-결합 파클리탁셀(즉, ABRAXANE®) 또는 시스플라틴과 암성 T 세포(cancerous T cell) 상의 항원 또는 그에 의해 발현되는 항원을 인식하는 항체(예를 들면, OKT3)로 이루어진 나노입자를 이용하여 예시된다.
당업자는 실시예의 나노입자를 제조하고 사용하는 것은 단지 예시의 목적을 위한 것이고, 본 개시는 이 예시에 의해 한정되지 않는 것으로 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용된 약자는 정상적인 과학적 의미를 갖는다. 달리 기재되지 않으면, 온도는 ℃이다. 본 명세서에서, 하기 용어는 달리 정의되지 않으면 다음의 의미를 갖는다:
ABX = ABRAXANE® (알부민-결합 파클리탁셀)
ACN = 아세토니트릴
ADC = 항체-의존성 화학요법(antibody dependent chemotherapy)
BEV = 베바시주맙(bevacizumab)
BSA = 우혈청 알부민(bovine serum albumin)
dH2O = 증류수(distilled water)
nM = 나노몰 농도(nanomolar)
EdU = 5-에티닐-2'-데옥시우리딘
FCB = 유동 세포분석 완충액(flow cytometry buffer)
FITC = 플루오레세인(Fluorescein)
kD = 킬로-달톤(kilo-dalton)
Kd = 해리 상수(dissociation constant)
kg = 킬로그램(kilogram)
KV = 킬로-볼트(kilo-volts)
L/hr = 리터/시(liter/hour)
M = 몰 농도(molar)
mCi = 밀리큐리(millicuries)
mg = 밀리그램(milligram)
ml 또는 mL = 밀리리터(milliliter)
m2 = 평방 미터(square meters)
mm3 = 입방 미터(cubic millimeter)
OKT3 = 무로모납-CD3(muromonab-CD3)
㎍ = 마이크로그램(microgram)
㎕ = 마이크로리터(microliter)
㎛ = 마이크로미터(micrometer)/마이크론(micron)
PBS = 인산염 완충 염수(Phosphate buffered saline)
pK = 약동학(pharmacokinetics)
RT = 실온(room temperate)
rpm = 분당 회전수(rotations per minute)
v = 볼트(volts)
x g = 중력 배수(times gravity)
실시예 1: 나노입자 제조
ABRAXANE®(ABX)을 0.9% 염수를 포함하는 무로모납-CD3(OKT3)에 현탁시킨다. 수득된 혼합물을 입자 형성이 가능하도록 실온(또는 표시된 온도)에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. ABX:OKT3 복합체의 입자 크기를 측정하기 위한 Mastersizer 실험을 위해, 10 mg의 ABX를 0 내지 25 mg/ml의 농도로 OKT3에 현탁시킨다.
인간에서 사용하기 위해, OKT3의 용량 적합 개수(dose appropriate number)를 수득하고, 하기 지시에 따라 각 바이알을 다양한 농도까지 희석시켜서 ABX:OKT3 복합체를 제조할 수 있다. ABX의 100 mg 바이알의 용량 적합 개수를 10 mg/mL ABX 나노입자를 포함하는 최종 농도까지 재구성시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 무균 3 mL 시린지를 사용하여, OKT3을 채취하고(withdraw), 최소 1분에 걸쳐 100 mg의 ABX를 담은 바이알 각각의 내벽에 서서히 주입한다. 포밍(foaming)을 초래할 것이므로, OKT3 용액을 동결건조된 케이크(lyophilized cake)에 직접 주입해서는 안 된다. 그 후, 12 mL 무균 시린지를 사용하여, 8.4 mL 0.9% Sodium Chloride Injection, USP를 채취하고, ABX 100 mg 및 OKT 0 내지 40 mg을 담은 각 바이알의 내벽에 최소 1분에 걸쳐서 8.4 mL를 서서히 주입한다. OKT3 및 0.9% Sodium Chloride Injection, USP 8.4 mL의 첨가가 완료되면, 각 바이알을 케이크/분말의 완전한 용해가 일어날 때까지 적어도 2분 동안 서서히 휘젓고(swirl) 및/또는 아래위로 뒤집어 섞어줄 수 있다(invert). 폼 생성을 피해야 한다. ABX 및 OKT3을 담은 바이알은 60분 동안 두어야 한다. 지속적으로 복합체를 혼합하기 위해 매 10분마다 바이알을 서서히 휘젓고 및/또는 아래위로 뒤집어 혼합해야 한다. 60분이흐른 후에, ABX 및 OKT3의 계산된 투여량(dosing volume)을 각 바이알로부터 취하여 빈 비아플렉스 백(viaflex bag)에 서서히 첨가해야 한다. 그 후, 동일한 양의 0.9% Sodium Chloride Injection, USP를 ABX와 OKT3의 혼합물에 첨가한다. 그 후, 혼합하기 위해 백을 1분 동안 서서히 휘젓고 및/또는 아래위로 천천히 뒤집어 혼합해야 한다. ABX:OKT3 나노입자는 최종 희석 후에 실온에서 최대 4시간 동안 보관될 수 있다.
실시예 2: ABX와 OKT3의 인 비트로 결합
ABX와 OKT3이 상호작용하는지 여부를 결정하기 위해, 실시예 1에서 형성된 나노입자를 유동 세포 분석 및 전자 현미경에 의해 분석한다.
방법
유동 세포 분석(Flow Cytometry ): 실시예 1에 기재된 바와 같이 ABX 및 OKT3을 포함하는 나노입자 조성물을 제조한다. OKT3의 ABX로의 결합을 결정하기 위해, Accuri C6 유동 세포분석기(BD Franklin Lakes, NJ)에서 조성물의 시각화(visualization)을 수행하고, Accuri C6 소프트웨어를 이용하여 데이터 분석을 수행한다. 비오티닐화(5㎍) 염소 항-마우스 IgG (Abeam, Cambridge, MA)를 5 ㎍의 스트렙타비딘 PE (Abeam, Cambridge, MA)로 표지한다. OKT3의 Fab 부분은 마우스 유래이므로, 조성물을 표지하기 위해 염소 항-마우스 IgG를 선택한다. ABX 및 상기 조성물을 실온에서 30분 동안 PE-표지 염소 항-마우스 IgG와 인큐베이션시키고, 세척하고 유동 세포분석에 의해 시각화시킨다.
전자 현미경: PBS에 용해된 ABX를 300-메쉬(mesh) 팔로디언-탄소(parlodian-carbon) 코팅 구리 그리드에 첨가하고 1분 동안 정치시킨다. 여과지의 뾰족한 조각(pointed piece)을 그 액적(drop)에 접촉(touch)시켜서, 과량의 액체를 제거하고, 그리드 상에 박막이 남게 한다. 그리드를 건조시킨다. 건조된 그리드 상에 남은 완충액 결정(buffer crystal)을 용해시키기 위해, 시료를 dH20로 3회 세척한다. 1% PTA(phosphotungstic acid), pH 7.2의 작은 액적(drop)을 그리드에 첨가한다. 그 후, 그리드를 다시 여과지의 뾰족한 조각으로 접촉시켜 과량의 액체를 제거하고, 그리드 상에 박막을 남기고 건조되게 한다. 0.9% 염화나트륨 용액 중 OKT3을 PBS로 1:10 비율로 희석시킨다. 니켈 포름바(nickel formvar)-코팅 그리드 상에 OKT3을 적재하고 30분 내지 1시간 동안 자연건조시킨다. 조성물을 위해, PBS에 용해시킨 ABX, 및 0.9% 염화나트륨 용액 중 OKT3을 혼합한다. 복합체를 PBS로 1:5로 희석시킨다. 복합체를 니켈 포름바-코팅 그리드 상에 적재하고 30분 내지 1시간 동안 자연건조시킨다. 두 시료를 모두 6 nm 금-접합 입자(Electron Microscopy Sciences)를 포함하는 염소 항-마우스 IgG와 1시간 동안 인큐베이션시키고, 10% FCB/PBS로 1:30 희석시키고, PBS로 6회(각각 2분씩), dH20로 6회 세척하고, 2% 메틸셀룰로오스와 4% UA의 혼합물(9:1)로 5분 동안 염색시킨다. 여과지를 사용하여 염색을 배수(drain)하고, 그리드를 1시간 동안 자연건조시킨다. 두 시료를 모두 금-접합 입자를 포함하는 망아지 항-마우스 IgG(Jackson ImmunoResearch) 중에 밤새 인큐베이션시키고, 10% FCB/PBS로 1:25 희석시키고, PBS로 6회(각각 2분씩), dH20로 6회 세척하고, 1% PTA로 5분 동안 염색시키고, 자연건조시키고, 2% 메틸셀룰로오스로 뒤덮고, 1시간 동안 자연건조시킨다. 80 KV에서 작동되는 JEOL1400에서 현미경 사진(micrograph)을 촬영한다.
실시예 3: 나노입자 조성물의 인 비트로 기능
본 실험은 복합체 중 2개의 주요 성분인 항체와 파클리탁셀이 복합체로 존재시 그들의 기능을 유지하는지 여부를 확인하는 것이다.
인 비트로 독성: HuT-78 인간 T-세포 림프종 세포주(ATCC Manassas, VA)를 4.5g/L 글루코오스, L-글루타민, 및 10% 우태혈청(MG-72, CLS order number 820702)이 보충된 RPMI1640 배지에서 배양한다. 세포를 수집하고 24 웰 플레이트에서 웰 당 106 개의 세포로 플레이팅한다. 세포를 37℃ 및 5% C02에서 밤새 0 내지 200 ㎍/ml 파클리탁셀 농도에서 조성물 또는 ABX에 노출시킨다. 증식을 측정하기 위해, Click-iT EdU (Molecular Probes, Eugene, OR) 키트를 이용한다. 요약하면, 10 mM EdU를 웰에 첨가하고, 세포 및 ABX 또는 나노입자 조성물과 인큐베이션한다. 세포를 1% 사포닌으로 투과화시키고(permeabilized) 개재된(intercalated) EdU를 FITC-접합 항체로 표지한다. 각 처리로부터의 FITC 양성 세포를 미처리 EdU 표지 세포(untreated EdU labeled cell)의 최대 증식(maximum proliferation)으로 나누는 것에 의해 증식 지수(proliferation index)를 결정한다.
VEGF ELISA: ABX에 결합되었을 때, OKT3이 여전히 그의 리간드, CD3에 결합할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 표준 CD3 ELISA를 이용한다. 전술된 바와 같이 조성물을 제조하고, CD3-Ig 융합 단백질을 복합체 또는 ABX 단독을 포함하는 조성물에 첨가한다. CD3-Ig 융합 단백질을 실온에서 2시간 동안 나노입자와 인큐베이션시킨다. 현탁액을 6000 rpm으로 15분 동안 스피닝시키고, 상층액을 수집하고, 유리(free) 융합 단백질을 ELISA에 의해 측정한다. 흡광도(absorbance)를 Versamax ELISA 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에 의해 측정한다. 미결합 VEGF의 농도를 0 내지 2000 pg/ml 표준 곡선을 이용하여 결정한다.
실시예 4: 입자 크기
OKT3가 ABX에 결합할 때 형성되는 나노입자의 특성을 이해하기 위해, ABX 대비 ABX:OKT3 복합체의 크기를 결정한다.
Mastersizer 및 Nanosight: ABX 및 항체-ABX 약물 복합체의 입자 크기를 Mastersizer 2000 (Malvern Instruments, Westborough, MA)에서 동적 광 산란(dynamic light scattering)에 의해 측정한다. 입자 크기를 측정하기 위해, 2 ml (5 mg/ml)의 ABRAXANE® 또는 복합체를 동일한 챔버에 첨가한다. Malvern 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하고, 입자 크기 분포를 부피로 표시한다. 그 후, Nanosight System (Malvern Instruments, Westborough, MA)을 이용하여, 입자 크기 및 안정성을 검증한다. 입자 크기를 정확하게 측정하기 위해, ABX 또는 복합체 입자를 적절한 범위까지 희석한다. 입자 크기 분포에 의해 데이터를 나타낸다; 그러나, 나노입자 추적 분석(nanoparticle tracking analysis)은 입자 크기를 결정하기 위해 브라운 운동(Brownian motion)을 이용한다.
실시예 5: 단백질 친화도
OKT3이 Abraxane에 결합했을 때 형성되는 나노입자의 특성을 이해하기 위해, 2개의 단백질의 결합 친화도를 결정하기 위해 백색광 반사(white light reflection)의 간섭을 이용하는 광학 기술인 BLItz(Bio-layer interferometry) 분석에 의해 복합체의 결합 친화도를 결정했다.
BLItz 분석에서, 2개의 단백질이 결합하는 경우, 반사된 광은 상기 2개의 단백질의 결합 친화도와 상관되는 방식으로 파장을 변화시킨다. 이때, 100 ㎍/ml의 비오티닐화 OKT3을 스트렙타비딘-함유 프로브 상에 고정화시키고, 2가지 농도―500㎍/ml (Run 2) 및 1000㎍/ml (Run 3)의 Abraxane에 노출시켰다.
항-인간 CD3 항체(OKT3) 및 Abraxane의 경우, 100 ㎍/ml의 비오티닐화 OKT3을 스트렙타비딘-함유 프로브 상에 고정화시켰다. 그 후, OKT3을 갖는 프로브를 2가지 농도―500㎍/ml (Run 2) 및 1000㎍/ml (Run 3)의 Abraxane에 침지시켰다. 이때, Abraxane은 농도 의존적 방식으로 OKT3에 결합했다. 단백질 상에서 결합(association) 상수 및 해리 상수를 BLItz 소프트웨어에 의해 계산했다. 도 18 참조.
결과는 OKT3과 Abraxane의 해리 상수가 2.246 X 109였다는 것을 보여주고, 이는 이 두 단백질 간의 강한 비-공유결합성 결합을 시사한다.
실시예 6: 마우스 중 ABX:OKT3 복합체의 효능
무흉선 누드 마우스에 이식된 HuT-78 인간 T-세포 림프종 세포의 이종이식(xenograft) 모델을 이용하여 인 비보에서 ABX:OKT3 복합체를 포함하는 조성물의 효능을 테스트한다.
인 비보 실험을 2회 이상 수행한다. 이 실험을 위해 요구되는 마우스의 개수는 검정력 분석(power analysis)에 의해 결정한다. 마우스 종양을 2-3회/주로 측정하고 종양이 중량 기준 10%일 때 마우스를 희생시킨다. 완전한 종양 반응(complete tumor response)을 갖는 마우스를 치료 후 60 내지 80일 동안 모니터링한다. 마우스 연구의 종말점(end point)은 생존력 중앙값(median survival)이다. Kaplan-Meier 곡선을 생성하고, 치료 그룹간 생존력 중앙값의 유의성을 결정하기 위해 Mantle-Cox 검정을 수행한다. 제시된 인 비트로 결과는 5회 이상 반복 실험을 대표한다. 기준선(baseline) 실험으로부터 인 비트로 및 인 비보 퍼센트 변화의 통계 분석은 스튜던트 t 검정(Student's t­test)을 이용하여 수행한다.
마우스 모델: 종양 효능을 테스트하기 위해, 무흉선 누드 마우스(Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN)의 우측 측복부에 1 x 106 개 HuT-78 인간 T-세포 림프종 세포를 이식한다. 종양이 약 700 mm3의 크기에 도달하면, 마우스를 무작위화하고, PBS, ABX, OKT3 (12 mg/kg), OKT3 및 뒤이어 ABX, 또는 본 명세서에서 전술된 조성물로 전술된 농도에서 처리한다. 더 큰 나노입자를 테스트하는 마우스 실험의 경우, OKT3-단독 처리 그룹에서 더 큰 입자를 생성하기 위해 필요한 OKT3의 최고 용량을 사용한다. 종양 크기를 3회/주로 모니터링하고, 종양 부피를 하기 식을 이용하여 계산한다:(길이 x 폭2)/2. 종양 크기가 마우스 체중의 10% 또는 약 2500 mm3.에 해당하는 경우, 마우스를 희생시킨다. 기준선 대비 7일차 변화를 하기와 같이 계산한다: [(처리일(treatment day) 종양 크기 - 7일차 종양 크기)/처리일 종양 크기] x 100.
실시예 7: 마우스 중 파클리탁셀 약동학
조성물과 ABX의 약동학(pk)을 비교하기 위해, 조성물 또는 ABX를 투여한 마우스에서 0, 4, 8, 12 및 24 시간차에 혈장 파클리탁셀 농도를 측정한다.
방법
파클리탁셀 약동학( Pharmacokinetics ): Agilent Poroshell 120 EC-C18 분석 컬럼(2.1 x 100 mm, 2.7 ㎛ Chrom Tech, Apple Valley, MN)에 부착된 Agilent Poroshell 120 EC-C18 프리컬럼(precolumn) (2.1 x 5 mm, 2.7 ㎛, Chrom Tech, Apple Valley, MN)을 이용하여 40℃에서 파클리탁셀과 d5 파클리타셀의 액체 크로마토그래피 분리를 달성하고, 0.5 ml/분의 일정한 유속에서 0.1% 포름산을 포함하는 물(A) 및 0.1% 포름산을 포함하는 ACN(B)으로 구성된 구배 이동상(gradient mobile phase)으로 용리시킨다. 용리는 0.5분의 60% A 및 40% B로 개시하고, 그 후, 4.5분 동안 B를 40-85%부터 선형적으로 증가시키고, 85% B에서 0.2분 동안 유지시키고, 다시 초기 조건으로 1.3분 동안 복귀시킨다. 오토샘플러(autosampler) 온도는 10 ℃이고 샘플 주입 부피는 2 ㎕이다. 모세관 전압(capillary voltage) 1.75 kV, 소스 온도 150℃, 탈용매화 온도(desolvation temp) 500℃, 콘 가스 유속(cone gas flow) 150 L/hr, 탈용매화 가스 유속 1000 L/hr의 포지티브 ESI 모드에서, 0.075 초 체류 시간(dwell time)의 MRM(multiple reaction monitoring) 스캔 모드를 이용하여, 질량 분석기에서 파클리탁셀과 내부 표준 d5-파클리탁셀의 검출을 수행한다. 콘 전압(cone voltage)과 충돌 에너지(collision energy)를 MassLynx-Intellistart, v4.1, 소프트웨어에 의해 결정하고, 각각 6-16 V 및 12-60 eV로 변화시킨다. MRM 전구체 및 산물 이온을 파클리탁셀의 경우, m/z 854.3> 105.2에서, d5 파클리탁셀의 경우, 859.3>291.2에서 모니터링한다. 파클리탁셀 (EtOH 중 1 mg/ml) 및 d5 파클리탁셀 (EtOH 중 1 mg/ml)의 일차 스톡 용액을 4 ml 갈색 실란화 유리 바이알(amber silanized glass vial)에서 제조하고 -20℃에 보관한다. 작업 표준(working standard)은 2 ml 갈색 실란화 유리 바이알에서 스톡 용액의 ACN에 의한 희석에 의해 제조하고 -20℃에 보관한다. 혈장 시료를 하기와 같이 추출한다: 100 ㎕의 혈장 시료를 d5 파클리탁셀(116.4 nM 또는 100 ng/ml) 및 300 ㎕ ACN을 담은 1.7 ml 마이크로원심분리 튜브에 첨가하고, 볼텍싱하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켜 단백질을 침전시키고, 3분 동안 원심분리(14,000 rpm)한다. 상층액을 Agilent Captiva NDlipids 플레이트(Chrom Tech, Apple Valley, MN) 상에서 여과시키고, 딥(deep) 96-웰 플레이트에 수집하고, 질소 기체를 이용하여 건조시킨다. 시료를 100 ㎕ ACN을 이용하여 재구성시키고 플레이트 진탕기(plate shaker)(고속)에서 5분 동안 진탕시킨다. 파클리탁셀 정량을 위해, 파클리탁셀 (0.59-5855 nM 또는 0.5-5000 ng/ml) 및 d5 파클리탁셀(116.4 nM)을 포함하는 혈장 표준 곡선을 매일 작성한다. 마우스 종양을 얼음 위에서 해동시키고, 칭량하고, 1x PBS 중에 2 부(parts)(중량 대 부피)로 희석한다. 그 후, 종양을 톱니 모양 프로브(saw tooth probe)(5 mm x 75 mm)를 이용하여 PRO200 조직 호모게나이저에서 균질화시킨다. 그 후, 종양 균질화물(tumor homogenate)을 인간 혈장 시료와 동일하게 처리한다.
마우스 이미징: 요약하면, Tris Buffer (0.125 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.15 M NaCl) 및 5 mCi Na125 I를 직접 요오드화 튜브(ThermoFischer Scientific, Waltham, MA)에 첨가한다. 요오드가 활성화되게 하고 실온에서 휘젓는다. 활성화된 요오드를 단백질 용액과 혼합한다. 50 ㎕의 Scavenging Buffer (PBS, pH 7.4 중 10 mg 티로신/mL)을 첨가하고 5분 동안 인큐베이션한다. Tris/BSA 완충액의 첨가 및 혼합 후, 시료를 4℃에서 미리-냉각된 PBS에 대한 10K MWCO 투석 카세트에 30분, 1시간, 2시간, 및 밤새 적용한다. 감마 카운터(Gamma counter)를 이용하여 방사성(radioactivity)을 측정하고, DPM(disintegrations per minute) 및 비활성(specific activity)을 계산한다. 마우스의 꼬리 정맥에 OKT3, ABX-OKT3, ABX-인간 IgG, 인간 IgG, 및 ABX 단독을 주사한다. 동물을 U-SPECT-II/CT 스캐너(MILabs, Utrecht, The Netherlands)를 이용한 SPECT-CT 이미징을 통해, 투여 후 3, 10, 24, 및 72시간차에 이미징한다. POSEM (pixelated ordered subsets by expectation maximization) 알고리즘을 이용하여 SPECT 재구축(reconstruction)을 수행한다. Feldkamp 알고리즘 동안 CT 데이터를 재구축한다. PMOD 소프트웨어(PMOD Technologies, Zurich, Switzerland)를 이용하여, 동시-등록된 이미지(co-registered image)를 더 제공하고 시각화시킨다. 주사 후 72시간에 동물을 희생시키고 해부한다. 방사성 동위원소 용량 교정기(radioisotope dose calibrator)(Capintec CRC-127R, Capintec Inc.)를 이용하여 선택된 목적 조직 및 기관을 측정한다.
실시예 8: 나노입자 조성물의 동결건조
OKT3을 ABRAXANE®에 첨가하는 것에 의해 나노입자 조성물을 제조한다. 그 후, 2 ml의 최종 부피를 위해 0.9% 염수를 첨가하고, 혼합물을 15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션시킨다.
30분의 실온 인큐베이션 후, 혼합물을 각각 0.9% 염수 중에 1:2로 희석시킨다. 환자로의 투여를 위해 약국에서 제조되는 경우, 이것이 이 두 약물의 농도이다.
나노입자 조성물을 1.5 ml 폴리프로필렌 에펜도르프 중 200 ㎕의 분량 20개로 분주하고 -80 ℃에서 동결시킨다.
일단 동결되면, 분량을 냉장이 켜진, Virtis 3L 벤치탑 동결건조기(benchtop lyophilizer)(SP Scientific, Warmister, PA)에서 분량을 밤새 동결건조시킨다. 동결건조된 제제가 생성된다.
건조된 분량을 동일한 1.5 ml 폴리프로필렌 에펜도르프에서 실온에 보관한다. 이 시료들을 실온에서 염수에 용이하게 재구성시키고, 뒤이어 2000x g로 7분 동안 원심분리시켰다. 결과적으로 수득된 시료는 그 후 필요한 경우 적절한 완충액에 재현탁시킨다.
비교하면, 열 및 고속 진공(speed vacuum)에 의해 건조된 시료는 재구성될 수 없다.
실시예 9: 동결건조된 제제(lyophilized preparation)의 테스트
시료를 동결건조 후 상이한 시점에 재구성시키고 ABX 및 신선하게 제조된 나노입자 조성물 대비 그들의 물리적 특성에 대해 테스트한다.
입자 크기 분포는 전술된 바와 같이 평가한다.
시료를 실온에서 2시간 동안 CD3-IgG 융합 단백질과 인큐베이션시키고 2000 x g로 7분 동안 원심분리하여 CD3 결합을 평가한다. 펠렛(나노입자에 해당함)에 결합되거나 또는 상층액에 남아있는 CD3의 양을 ELISA로 측정한다.
인 비트로에서 HuT-78 인간 T-세포 림프종 세포에 대한 세포독성에 의해 파클리탁셀 활성을 평가한다.
실시예 10: OKT3 전처리가 표적화를 개선하는지 여부를 조사하기 위한 추적(follow up) 연구
전술된 일반적 프로토콜에 따라, 무흉선 누드 마우스에 우측 측복부(right flank)에 1 x 106 개의 HuT-78 세포를 주사하고 PBS, OKT3, ABX, 나노입자 조성물로 처리하거나, 또는 OKT3으로 전처리하고, 24시간 뒤에 나노입자 조성물로 처리한다. 데이터는 처리후 7일차(day 7-post treatment) 및 처리후 10일차(day 10-post treatment)에 mm3으로 표시된 종양 부피(tumor volume)로 나타낸다.

Claims (54)

  1. 외부 표면을 갖는 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물로서, 상기 나노입자의 각각은:
    (a) 담체 단백질,
    (b) T-세포 항원-결합 부분(T-cell antigen-binding portion)을 갖는 결합제, 및
    (c) 치료적 유효량의 파클리탁셀을 포함하고,
    수용액에 의한 재구성(reconstitution) 시, 상기 결합제의 항원-결합 부분은 인 비보에서 T-세포 항원에 결합할 수 있는 것인 나노입자 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 약 100개 내지 약 1000개의 결합제를 포함하는 것인 나노입자 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항원-결합 부분은 T-세포 수용체에 결합할 수 있는 것인 나노입자 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 항원-결합 부분은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD30, CD40, CD52, CD 122, 또는 CCR4로부터 선택된 항원에 결합하는 것인 나노입자 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 나노입자는 동결건조된 것인 나노입자 조성물.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 20℃ 내지 약 25℃에서 약 12개월 또는 그 이상까지 안정한 것인 나노입자 조성물.
  7. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 슬리피주맙(Slipizumab), 무로모납(muromonab)-CD3(OKT3), Leu 1, 자놀리무맙(Zanolimumab), 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab vedotin), Mik-β1, KW-0761, 또는 이들의 조합인 것인 나노입자 조성물.
  8. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 무로모납-CD3 (OKT3)인 것인 나노입자 조성물.
  9. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 부분은 앱타머, 수용체 리간드, Fab 단편, 또는 이들의 조합인 것인 나노입자 조성물.
  10. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 추가적인 암 치료제를 포함하는 것인 나노입자 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 추가적인 암 치료제는 아비라테론(abiraterone), 벤다무스틴(bendamustine), 보르테조밉(bortezomib), 카르보플라틴(carboplatin), 카바지탁셀(cabazitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 클로람부실(chlorambucil), 다사티닙(dasatinib), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에를로티닙(erlotinib), 에토포시드(etoposide), 에베롤리무스(everolimus), 게피티닙(gefitinib), 이다루비신(idarubicin), 이마티닙(imatinib), 히드록시우레아(hydroxyurea), 라파티닙(lapatinib), 류프로렐린(leuprorelin), 멜팔란(melphalan), 메토트렉세이트(methotrexate), 미톡산트론(mitoxantrone), 네다플라틴(nedaplatin), 닐로티닙(nilotinib), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파조파닙(pazopanib), 페메트렉세드(pemetrexed), 피코플라틴(picoplatin), 로미뎁신(romidepsin), 사트라플라틴(satraplatin), 소라페닙(sorafenib), 베무라페닙(vemurafenib), 수니티닙(sunitinib), 테니포시드(teniposide), 트리플라틴(triplatin), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈크리스틴(vincristine), 또는 시클로포스파미드(cyclophosphamide)를 포함하는 것인 나노입자 조성물.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 약 50% 미만이 올리고머(oligomeric)인 것인 나노입자 조성물.
  13. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 나노입자의 40% 미만이 올리고머인 것인 나노입자 조성물.
  14. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 나노입자의 30% 미만이 올리고머인 것인 나노입자 조성물.
  15. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 나노입자의 20% 미만이 올리고머인 것인 나노입자 조성물.
  16. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 나노입자의 10% 미만이 올리고머인 것인 나노입자 조성물.
  17. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 나노입자의 5% 미만이 올리고머인 것인 나노입자 조성물.
  18. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 평균 크기는 약 90 nm 내지 800 nm인 것인 나노입자 조성물.
  19. 청구항 1에 있어서, 상기 담체 단백질은 알부민, 젤라틴, 엘라스틴, 글리아딘(gliadin), 레구민(legumine), 제인(zein), 대두 단백질, 유 단백질, 유청 단백질, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 나노입자 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 담체 단백질은 항체-결합 모티프를 포함하는 것인 나노입자 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 담체 단백질은 알부민인 것인 나노입자 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민인 것인 나노입자 조성물.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민인 것인 나노입자 조성물.
  24. 청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 전달을 위해 제제화되는 것인 나노입자 조성물.
  25. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 약 1 x10- 11 M 내지 약 1 x 10-8 M의 해리 상수를 갖는 것인 나노입자 조성물.
  26. T-세포 암세포를 치료하는 방법으로서, 상기 암세포를 유효량의 나노입자 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 나노입자 조성물은 상기 암세포를 치료하기 위해 충분한 시간 동안 상기 세포와 접촉되어 유지되고, 상기 나노입자 조성물은 외부 표면을 갖는 나노입자를 포함하고, 상기 나노입자 각각은:
    (a) 담체 단백질,
    (b) T-세포 항원-결합 부분을 갖는 결합제, 및
    (c) 치료적 유효량의 파클리탁셀을 포함하고,
    상기 결합제의 항원-결합 부분은 인 비보에서 T-세포 항원에 결합할 수 있는 것인 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 나노입자는 약 100개 내지 약 1000개의 결합제를 포함하는 것인 방법.
  28. 청구항 26에 있어서, 상기 항원-결합 부분은 T-세포 수용체(TCR)에 결합하는 것인 방법.
  29. 청구항 26에 있어서, 상기 항원-결합 부분은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD30, CD40, CD52, CD 122, 또는 CCR4로부터 선택된 항원에 결합하는 것인 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 항원은 CD2 또는 CD3인 것인 방법.
  31. 청구항 27에 있어서, 상기 나노입자 조성물은 투여 전에 수용액 중 재구성되는 동결건조된 나노입자 조성물인 것인 방법.
  32. 청구항 27에 있어서, 상기 조성물은 약 20℃ 내지 약 25℃에서 약 12개월 또는 그 이상까지 안정한 것인 방법.
  33. 청구항 27 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 슬리피주맙, OKT3, Leu 1, 자놀리무맙, 브렌툭시맙 베도틴, Mik-β1, KW-0761, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  34. 청구항 27 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합제는 무로모납-CD3 (OKT3)인 것인 방법.
  35. 청구항 27 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 부분은 앱타머, 수용체 리간드, 또는 Fab 단편인 것인 방법.
  36. 청구항 27 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 추가적인 암 치료제를 포함하는 것인 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 추가적인 암 치료제는 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 게피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴, 또는 시클로포스파미드로부터 선택되는 것인 방법.
  38. 청구항 27 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 약 50% 미만이 올리고머인 것인 방법.
  39. 청구항 27 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 나노입자의 40% 미만이 올리고머인 것인 방법.
  40. 청구항 27 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 나노입자의 30% 미만이 올리고머인 것인 방법.
  41. 청구항 27 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 나노입자의 20% 미만이 올리고머인 것인 방법.
  42. 청구항 27 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 나노입자의 10% 미만이 올리고머인 것인 방법.
  43. 청구항 27 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 나노입자의 5% 미만이 올리고머인 것인 방법.
  44. 청구항 27 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 평균 크기는 90 nm 내지 800 nm인 것인 방법.
  45. 청구항 27 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 평균 크기는 약 90 nm 내지 약 nm인 것인 방법.
  46. 청구항 27 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질은 알부민, 젤라틴, 엘라스틴, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 유 단백질, 유청 단백질, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 담체 단백질은 알부민인 것인 방법.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청 알부민인 것인 방법.
  49. 청구항 47에 있어서, 상기 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민인 것인 방법.
  50. 청구항 27 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 전달을 위해 제제화되는 것인 방법.
  51. 청구항 27 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자는 약 1 x10-11 M 내지 약 1 x 10-8 M의 해리 상수를 갖는 것인 방법.
  52. 청구항 27 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자의 치료적 유효량은 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2 파클리탁셀을 포함하는 것인 방법.
  53. 청구항 27 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T-세포 암은 말초성 T-세포 림프종(peripheral T-cell lymphoma), 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 혈관면역모세포성 림프종(angioimmunoblastic lymphoma), 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma), 성인 T-세포 백혈병/림프종(Adult T-cell Leukemia/Lymphoma)(ATLL), 장병증-타입 T-세포 림프종(enteropathy-type T-cell lymphoma), 간비장 감마-델타 T-세포 림프종(hematosplenic gamma-delta T-cell lymphoma), 모세포성 NK-세포 림프종(blastic NK-cell lymphoma), 림프모세포성 림프종(lymphoblastic lymphoma), 비강 NK/T-세포 림프종(nasal NK/T-cell lymphoma), 치료-관련 T-세포 림프종(treatment-related T-cell lymphoma), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  54. 청구항 27 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T-세포 암은 T-세포 림프종인 것인 방법.
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