JP7133050B2 - キャリア結合剤組成物およびそれを作製および使用する方法 - Google Patents

キャリア結合剤組成物およびそれを作製および使用する方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月６日出願のＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５４２９５号、２０１４年１０月６日出願の米国特許仮出願第６２／０６０，４８４号、２０１５年８月１８日出願の米国特許仮出願第６２／２０６，７７０号；および同第６２／２０６，７７１号、ならびに２０１５年８月１８日出願の米国特許仮出願第６２／２０６，７７２号の恩典を主張する、２０１６年４月６日出願の米国特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２６２７０号の恩典を主張するものである。
発明の分野
本出願は、結合剤およびキャリアタンパク質の新規な組成物、ならびにそれを、特に癌治療薬として、作製および使用する方法に関する。
背景
化学療法は依然として、黒色腫などの多くのタイプの癌の全身治療の頼みの綱である。ほとんどの化学療法は、腫瘍細胞に対する選択性がごくわずかであり、健康な増殖細胞に対する毒性が、高くなり得（Ａｌｌｅｎ ＴＭ． （２００２） Ｃａｎｃｅｒ ２：７５０－７６３）、多くの場合、用量の低減と、処置の中断さえも必要となる。理論的には、化学療法毒性の問題を克服して、薬物の有効性を改善する一方法は、標的薬物を腫瘍に誘引するために、腫瘍細胞によって選択的に発現される（または過剰発現される）タンパク質に対して特異的な抗体を利用して、化学療法剤を腫瘍に標的化させ、それにより化学療法剤の生体分布を改変し、腫瘍により多くの薬物を向かわせ、健康な組織への影響を少なくすることである。しかし３０年間の研究にもかかわらず、特異的標的化が、治療環境で成功することはまれである。
従来の抗体依存性化学療法（ＡＤＣ）は、合成のプロテアーゼ切断可能リンカーを介して標的化抗体に結合された毒性剤を用いて設計される。そのようなＡＤＣ治療の有効性は、標的細胞が抗体に結合する能力、切断されるリンカー、および毒性剤の標的細胞への取込みに依存する。Ｓｃｈｒａｍａ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：１４７－１５９。
抗体標的化学療法は、標的化能力と、複数の細胞毒性薬と、潜在的に低い毒性を有する改善された治療能力と、の組み合わせを提供するため、従来の治療法よりも利点を有することが見込まれた。広範な研究にも関わらず、臨床的に有効な抗体標的化学療法は、依然としてとらえどころがなく、主な障害としては、抗体と化学療法剤の間のリンカーの不安定性、抗体に結合させた際の化学療法剤の腫瘍毒性の低減、およびコンジュゲートが腫瘍細胞に結合および進入できないことが挙げられる。加えて、これらの治療は、抗体－薬物コンジュゲートの粒子径を制御することができなかった。
当該技術分野では、標的薬物送達のために細胞毒性作用を保持して、過去の治療薬よりも信頼性があり、かつ改善された抗腫瘍効果を与える抗体ベースの癌治療薬が、依然として必要とされている。
加えて、任意の治療応用に関し、その物理的、化学的および生物学的特性が安定である組成物も依然として必要とされている。
凍結乾燥またはフリーズドライは、組成物から水を除去する。この工程において、乾燥させる材料を最初に凍結させ、その後、真空環境での昇華により氷または凍結溶媒を除去する。事前に凍結乾燥された製剤に賦形剤を含めて、凍結乾燥工程時の安定性を高め、そして／または貯蔵時の凍結乾燥製品の安定性を改善してもよい。Ｐｉｋａｌ， Ｍ． Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ３（９）２６－３０ （１９９０） ａｎｄ Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ８（３）：２８５－２９１ （１９９１）。
タンパク質は、凍結乾燥され得るが、凍結乾燥および再構成の工程は、タンパク質の特性に影響を与えることがある。タンパク質は、従来の有機および無機薬物よりも大きくかつ複雑である（即ち、複雑な３次元構造に加えて複数の官能基を有する）ため、そのようなタンパク質の製剤は、特殊な問題をもたらす。タンパク質を生物学的に活性なままにするために、製剤は、タンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列の構造完全性をインタクトで保持すると同時に、タンパク質の複数の官能基を分解から保護するものでなければならない。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（即ち、結合形成または切断によるタンパク質の修飾により新しい化学物質を生じさせる任意の工程）または物理的不安定性（即ち、タンパク質のより高次構造の変化）を伴い得る。化学的不安定性は、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、β脱離またはジスルフィド交換に起因し得る。物理的不安定性は、例えば変性、凝集、沈殿または吸着に起因し得る。３つの最も一般的なタンパク質分解経路は、タンパク質の凝集、脱アミド化および酸化である。Ｃｌｅｌａｎｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０（４）： ３０７－３７７ （１９９３）。
発明の概要
本発明において、組成物は、（ａ）キャリアタンパク質、と（ｂ）結合剤と、（ｃ）任意選択で治療薬と、を含有するナノ粒子を含む。結合剤は、その性質上弱い疎水性相互作用を通してキャリアタンパク質に結合すると考えられる。それでも、個々の成分の活性ならびにナノ粒子中の相対的関係性が、組成物の凍結乾燥および再構成にもかかわらず保持される。さらに、キャリアタンパク質に対する結合、例えば結合剤とキャリアタンパク質との複合体形成は、結合剤、例えばＦｃ成分の疎水性部分の一部または全てを通して起こり、それによって疎水性タンパク質の全てまたは一部がキャリアタンパク質コアに組み込まれるが、抗体の標的結合部分（領域）（例えば、ＦａおよびＦｂ部分）は、依然としてキャリアタンパク質コアの外側にあり、それにより標的特異性結合能力を保持することが企図される。幾つかの実施形態において、結合剤は、非治療性で、かつ非内在性のヒト抗体、融合タンパク質、例えば標的抗原またはアプタマーに結合するペプチドに対する抗体Ｆｃドメインとの融合体である。
ナノ粒子は治療に使用されることから、さらなる難題が課される。
ナノ粒子中の疎水性成分の再配列は、成分間の共有結合を通して軽減され得るが、癌治療にナノ粒子を治療的に使用する場合には、そのような共有結合が難題をもたらす。結合剤、キャリアタンパク質およびさらなる治療薬は典型的に、腫瘍内の異なる位置で異なるメカニズムにより作用する。非共有結合により、ナノ粒子の成分は腫瘍において分離することが可能となる。したがって、共有結合は凍結乾燥にとっては有利になり得るが、治療的使用にとっては欠点になり得る。
ナノ粒子の粒子径および粒度分布もまた、重要である。ナノ粒子はそれらの粒子径に応じて異なるように挙動し得る。大きい粒子径では、ナノ粒子または粒子の凝集体が、血管を遮断する場合があり、そのいずれかが組成物の性能および安全性に影響を与える可能性がある。
最後に、凍結保護剤、および凍結乾燥工程を補助する薬剤は、治療的使用にとって安全で、かつ忍容されなければならない。
本発明において、本発明の組成物は、（ａ）キャリアタンパク質、と（ｂ）結合剤と、（ｃ）任意選択で治療薬と、を含有するナノ粒子を含む。理論に束縛されるのを望むものではないが、結合剤は、その性質上弱い疎水性相互作用を通してキャリアタンパク質に結合すると考えられる。それでも、個々の成分の活性、およびナノ粒子中の相対的関係性は、組成物の凍結乾燥および再構成にもかかわらず保持される。
一態様において、本明細書において、ナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、ナノ粒子のそれぞれがキャリアタンパク質と、約１００～約１０００個の結合剤と、任意選択で少なくとも１種の治療薬と、を含み、結合剤がナノ粒子の表面から外向きに配置されており、ナノ粒子がインビボで既定のエピトープに結合することができる、ナノ粒子組成物が提供される。
静脈内に投与する場合、大きな粒子（例えば、１μｍを超える）は、肺の微小血管構造に詰まった状態になり得るため、典型的に好適でない。同時に、より大きな粒子は、腫瘍または特定臓器に蓄積し得る。「ＴｈｅｒａＳｐｈｅｒｅ」と呼ばれる肝臓の腫瘍に栄養供給する肝動脈に注射するために使用される、例えば２０～６０ミクロンのガラス粒子（肝臓癌のために臨床で使用される）を参照されたい。
それゆえ静脈内投与では、１μｍ未満の粒子が用いられる。１μｍを超える粒子は、より典型的には、腫瘍に（「直接注射」）、または腫瘍部位に栄養供給する動脈に直接投与する。
別の態様において、本明細書において、ナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、ナノ粒子のそれぞれが、アルブミンではないキャリアタンパク質と、約１００～約１０００個の結合剤、好ましくは約４００～約８００個の結合剤と、任意選択で少なくとも１種の治療薬と、を含み、結合剤がナノ粒子の外部表面に配置されており、ナノ粒子がインビボで既定のエピトープに結合することができる、ナノ粒子組成物が提供される。ナノ粒子が、多量体化する場合、結合剤の数は、それに比例して増加する。例えば、１６０ｎｍのナノ粒子が、４００個の結合剤を含む場合、３２０ｎｍの二量体は、約８００個の結合剤を含む。
別の態様において、本明細書において、ナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、ナノ粒子がそれぞれ、キャリアタンパク質と、約４００～約８００個の結合剤と、任意選択でパクリタキセルではない少なくとも１種の治療薬と、を含み、結合剤の結合部分がその表面から外向きとなるようにナノ粒子の表面に配置されており、ナノ粒子がインビボで既定のエピトープに結合することができる、ナノ粒子組成物が提供される。
他の実施形態において、該ナノ粒子は、多量体化、例えば二量体化する。多量体化は、単位分子の重量または粒子径の倍数として観察され得、例えば１６０ｎｍの粒子は、約３２０ｎｍ、４８０ｎｍ、６４０ｎｍなどに多量体化する。幾つかの実施形態において、集団中のナノ粒子の２０％未満が、多量体である。幾つかの実施形態において、集団中のナノ粒子の８０％超が、多量体である。
一実施形態において、キャリア結合薬物の結合剤に対する（例えば、アルブミン結合パクリタキセルのベバシズマブに対する）重量比は、約５：１～約１：１である。一実施形態において、キャリア結合薬物の結合剤に対する重量比は、約１０：４である。一実施形態において、結合剤は、ナノ粒子の表面の全体または一部の上にある実質的に単層である。一実施形態において、組成物中のナノ粒子の０．０１％未満が、２００ｎｍ超、３００ｎｍ超、４００ｎｍ超、５００ｎｍ超、６００ｎｍ超、７００ｎｍ超、および８００ｎｍ超からなる群から選択される粒子径を有する。より大きな粒子径は、それぞれがコアと、各ナノ粒子の表面の全体または一部の上にある結合剤コーティングと、を含む複数のナノ粒子の多量体化の結果であると考えられる。
本発明は、凍結乾燥組成物、および新たに調製されたナノ粒子の特性と実質的に異ならない、または同一である凍結乾燥組成物をさらに含む。特に、凍結乾燥組成物は、水溶液中に再懸濁すると、粒子径、粒度分布、癌細胞に対する毒性、結合剤親和性、および結合剤特異性の点で、新たな組成物と類似または同一である。本発明は、凍結乾燥ナノ粒子が、これらの粒子中に２つの異なるタンパク質成分が存在しているにも関わらず、再懸濁後に新たに調製されたナノ粒子の特性を保持しているという驚くべき発見に関する。
一態様において、本発明は、ナノ粒子を含む凍結乾燥ナノ粒子組成物であって、ナノ粒子のそれぞれが、キャリア結合薬物コアと、結合剤の結合部分がその表面から外向きとなるようにコアの表面に配置された一定量の結合剤と、を含み、結合剤が、水溶液で再構成した際にナノ粒子の外部表面との結合を保持する、ナノ粒子組成物に関する。一実施形態において、凍結乾燥組成物は、室温で少なくとも約３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、またはそれを超える期間、安定である。一実施形態において、凍結乾燥組成物は、室温で少なくとも３ヶ月間安定である。一実施形態において、再構成されたナノ粒子は、治療薬の活性を保持し、インビボで標的に結合することができる。
一実施形態において、再構成されたナノ粒子の平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約１μｍである。好ましい実施形態において、再構成されたナノ粒子の平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約２００ｎｍ、より好ましくは約１６０ｎｍである。一実施形態において、再構成されたナノ粒子の平均粒子径は、８００ｎｍ超～約３．５μｍであり、より小さなナノ粒子の多量体、例えば１００～２００ｎｍのナノ粒子の多量体を含む。一実施形態において、コアの結合剤に対する重量比は、１：１超～約１：３である。一実施形態において、再構成されたナノ粒子の平均粒子径は、約１６０ｎｍ～約２２５μｍである。
一態様において、本開示は、ナノ粒子を含む凍結乾燥ナノ粒子組成物であって、ナノ粒子のそれぞれが、（ａ）アルブミン結合パクリタキセルコアと、（ｂ）結合剤の結合部分がその表面から外向きとなるようにアルブミン結合パクリタキセルコアの表面に配置された約４００～約８００分子のベバシズマブと、を含み、前記凍結乾燥組成物が約２０℃～約２５℃で少なくとも３ヶ月間安定であること、および再構成されたナノ粒子がインビボでＶＥＧＦに結合することができることを条件に、結合剤が、水溶液で再構成した際にナノ粒子の表面との結合を保持する、ナノ粒子組成物に関する。
他の態様において、本開示は、ナノ粒子を含む凍結乾燥ナノ粒子組成物であって、ナノ粒子のそれぞれが、（ａ）アルブミン結合パクリタキセルコアと、（ｂ）結合剤の結合部分がその表面から外向きとなるようにアルブミン結合パクリタキセルコアの表面に配置された一定量のベバシズマブと、を含み、前記凍結乾燥組成物が約２０℃～約２５℃で少なくとも３ヶ月間安定であること、および再構成されたナノ粒子がインビボでＶＥＧＦに結合することができることを条件に、結合剤が、水溶液で再構成した際にナノ粒子の表面との結合を保持し、さらに再構成されたナノ粒子の平均粒子径が、新たに調製されたナノ粒子の粒子径と実質的に異ならない、ナノ粒子組成物に関する。幾つかの実施形態において、平均粒子径は、２００～８００ｎｍ、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００または８００ｎｍである。他の実施形態において、平均粒子径は、より大きく、例えば８００ｎｍ超～約３．５μｍである。幾つかの実施形態において、粒子は、ナノ粒子の多量体である。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、新たに調製されて、または凍結乾燥して、注射に適する水溶液で再構成された後、約１６０ｎｍ～約２２５ｎｍの平均粒子径を有する。
幾つかの実施形態において、アルブミン結合パクリタキセルのベバシズマブに対する重量比は、約５：１～約１：１である。他の実施形態において、アルブミン結合パクリタキセルのベバシズマブに対する重量比は、約１０：４である。さらなる実施形態において、アルブミン結合パクリタキセルのベバシズマブに対する重量比は、１：１超～約１：３である。
幾つかの実施形態において、コアは、アルブミン結合パクリタキセルであり、結合剤は、ＶＥＧＦを選択的に認識する結合剤（例えば、ベバシズマブ／Ａｖａｓｔｉｎ）、ＣＤ２０を選択的に認識する結合剤（例えば、リツキシマブ／Ｒｉｔｕｘｉｎ）、およびＨｅｒ２を選択的に認識する結合剤（トラスツズマブ／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）から選択される。
幾つかの実施形態において、少なくとも１種の治療薬は、ナノ粒子の内側に位置する。他の実施形態において、少なくとも１種の治療薬は、ナノ粒子の外部表面上に位置する。さらに他の実施形態において、少なくとも１種の治療薬は、ナノ粒子の内側およびナノ粒子の外部表面上に位置する。
幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、１種よりも多くの治療薬を含有する。例えばタキサンおよびプラチナ剤、例えばパクリタキセルおよびシスプラチン。
幾つかの実施形態において、結合剤は、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブおよびトラスツズマブからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、結合剤は、ナノ粒子の表面の全体または一部の上にある実質的に単層の結合剤である。
さらなる実施形態において、抗体は、天然のヒト抗体に通常見出される抗体よりもグリコシル化されていない。そのようなグリコシル化は、例えば発現系により、または発現時のグリコシル化阻害剤の存在により影響を受け得る。幾つかの実施形態において、抗体または他の結合剤のグリコシル化状態は、酵素作用または化学的作用により変化する。
幾つかの実施形態において、少なくとも１種の治療薬は、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシウレア、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチンおよびシクロホスファミドからなる群から選択される。
幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、パクリタキセルまたはベバシズマブではない少なくとも１種のさらなる治療薬をさらに含む。
幾つかの実施形態において、結合剤、キャリアタンパク質および存在すれば治療薬は、非共有結合により結合されている。
幾つかの実施形態において、キャリアタンパク質は、ゼラチン、エラスチン、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、乳タンパク質およびホエータンパク質からなる群から選択される。他の実施形態において、キャリアタンパク質は、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンである。
幾つかの実施形態において、組成物は、静脈内送達用に処方される。他の実施形態において、組成物は、直接注射または腫瘍への灌流用に処方される。
幾つかの実施形態において、組成物中の平均ナノ粒子径は、８００ｎｍ超～約３．５μｍである。
幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、約１×１０－１１Ｍ～約１×１０－９Ｍの解離定数を有する。
別の態様において、本明細書において、ナノ粒子組成物を作製する方法であって、所望のナノ粒子の形成を可能にする条件下および成分比で、５．０～７．５のｐＨおよび約５℃～約６０℃、約２３℃～約６０℃または約５５℃～約６０℃の温度を有する溶液中で、キャリアタンパク質および任意選択の少なくとも１種の治療薬を抗体と接触させることを含む、ナノ粒子組成物を作製する方法が提供される。一実施形態において、ナノ粒子は、５５～６００℃およびｐＨ７．０で作製される。別の態様において、本明細書において、（ａ）キャリアタンパク質および任意選択の少なくとも１種の治療薬を接触させてコアを形成させること、ならびに（ｂ）所望のナノ粒子の形成を可能にする条件下および成分比で、約５．０～約７．５のｐＨおよび約５℃～約６０℃、約２３℃～約６０℃または約５５℃～約６０℃の温度を有する溶液中でコアを抗体と接触させること、を含む、方法が提供される。
所望のナノ粒子の形成をもたらすために、成分（例えば、キャリアタンパク質、抗体、治療薬、それらの組み合わせ）の量が制御される。成分の量が非常に希薄である組成物は、本明細書中に記載されたナノ粒子を形成しない。好ましい実施形態において、キャリアタンパク質の結合剤に対する重量比は１０：４である。幾つかの実施形態において、キャリアタンパク質の量は、約１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、結合剤の量は、約１ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬである。例えば、幾つかの実施形態において、キャリアタンパク質：結合剤：溶液の比は、およそ９ｍｇのキャリアタンパク質（例えば、アルブミン）：４ｍｇの結合剤（例えば、ＢＥＶ）：１ｍＬの溶液（例えば、生理食塩水）である。ある量の治療薬（例えば、パクリタキセル）もまた、キャリアタンパク質に添加され得る。
さらなる実施形態において、ナノ粒子は上記の通り作製され、その後、凍結乾燥される。
別の態様において、本明細書において、癌細胞を処置する方法であって、細胞を本明細書に開示されたナノ粒子組成物の有効量と接触させて、癌細胞を処置することを含む、方法が提供される。
別の態様において、本明細書において、必要とする患者において腫瘍を処置する方法であって、細胞を本明細書に開示されたナノ粒子組成物の有効量と接触させて、腫瘍を処置することを含む、方法が提供される。幾つかの実施形態において、腫瘍のサイズは減少される。他の実施形態において、ナノ粒子組成物は、静脈内へ投与される。さらに他の実施形態において、ナノ粒子組成物は、直接注射または腫瘍への灌流により投与される。
幾つかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、ａ）ナノ粒子組成物を３週間にわたって週１回投与するステップ、ｂ）ナノ粒子組成物の投与を１週間中止するステップ、およびｃ）必要に応じてステップａ）およびｂ）を繰り返して腫瘍を処置するステップ、を含む。
関連する実施形態において、処置は、ナノ粒子の投与前に標的化結合剤の投与を含む。一実施形態において、ナノ粒子の投与の約６～４８時間、または１２～４８時間前に、標的化結合剤が投与される。別の実施形態において、ナノ粒子の投与の６～１２時間前に、標的化結合剤が投与される。さらに別の実施形態において、ナノ粒子の投与の２～８時間前に、標的化結合剤が投与される。さらに他の実施形態において、ナノ粒子の投与の１週間前に、標的化結合剤が投与される。例えば、ある用量のＢＥＶの投与は、ＡＢ１６０の投与の２４時間前である。別の例において、リツキシマブの先行投与は、ＡＲナノ粒子の投与前である。ナノ粒子の前に投与される結合剤は、通常治療的と考えられる量の１／２、１／１０または１／２０などの治療量以下の用量として投与され得る。したがってヒトにおいて、ＢＥＶによる前処置は、通常の用量の１／１０である１ｍｇ／ｋｇのＢＥＶの投与を含み、その後にＡＢ１６０が投与され得る。
幾つかの実施形態において、治療有効量は、約７５ｍｇ／ｍ２～約１７５ｍｇ／ｍ２のキャリアタンパク質（即ち、患者のｍ２あたりミリグラム量のキャリアタンパク質）を含む。他の実施形態において、治療有効量は、約７５ｍｇ／ｍ２～約１７５ｍｇ／ｍ２の治療薬（例えば、パクリタキセル）を含む。他の実施形態において、治療有効量は、約３０ｍｇ／ｍ２～約７０ｍｇ／ｍ２の結合剤を含む。さらに他の実施形態において、治療有効量は、約３０ｍｇ／ｍ２～約７０ｍｇ／ｍ２のベバシズマブを含む。
特定の一実施形態において、凍結乾燥組成物は、好ましくはアルブミンである約７５ｍｇ／ｍ２～約１７５ｍｇ／ｍ２のキャリアタンパク質、好ましくはベバシズマブである約３０ｍｇ／ｍ２～約７０ｍｇ／ｍ２の結合剤、および約７５ｍｇ／ｍ２～約１７５ｍｇ／ｍ２のパクリタキセルを含む。
本発明の実施形態は、抗体、例えば腫瘍上の抗原または腫瘍から放出された抗原に特異的に結合する抗体と表面で複合体を形成した、キャリアタンパク質と化学療法剤とを含むナノ粒子中で化学療法剤を投与することにより、化学療法剤の腫瘍取込みの期間を増加させる方法を含む。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
外部表面を有するナノ粒子を含む凍結乾燥ナノ粒子組成物であって、前記ナノ粒子のそれぞれが、
ａ）キャリアタンパク質と、
ｂ）約１００～約１０００個の結合剤および抗原結合部分と、
ｃ）パクリタキセルの治療有効量と、
を含み、
前記ナノ粒子が、凍結乾燥されており、水溶液での再構成の際に、前記結合剤の抗原結合部分が、インビボで選択された抗原に結合することが可能で、前記ナノ粒子の約５０％未満が、オリゴマーである、凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目２）
前記抗原結合部分が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＰＤ－Ｌ１、Ｌｙ６Ｅ、ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ ＤＡＦ、ＥＲＢＢ－３受容体、ＣＳＦ－１Ｒ、ＨＥＲ２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ３、ＣＥＡ、ＣＤ４０、ＯＸ４０、Ａｎｇ２－ＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦに結合する、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目３）
約２０℃～約２５℃で最長約１２ヶ月またはそれを超える期間、安定である、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目４）
前記抗原結合部分が、アプタマー、受容体リガンド、またはＦａｂ断片である、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目５）
前記組成物中に存在する前記ナノ粒子の４０％未満が、オリゴマー化されている、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目６）
前記組成物中に存在する前記ナノ粒子の３０％未満が、オリゴマー化されている、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目７）
前記組成物中に存在する前記ナノ粒子の２０％未満が、オリゴマー化されている、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目８）
前記組成物中に存在する前記ナノ粒子の１０％未満が、オリゴマー化されている、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目９）
前記組成物中に存在する前記ナノ粒子の５％未満が、オリゴマー化されている、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目１０）
前記ナノ粒子の平均粒子径が、１３０ｎｍ～８００ｎｍである、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目１１）
前記キャリアタンパク質が、アルブミンであり、前記ナノ粒子が、およそ１６０ｎｍの平均粒子径を有する、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目１２）
前記結合剤が、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブ、およびトラスツズマブからなる群から選択される、項目１から１１のいずれか１項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目１３）
前記キャリアタンパク質が、アルブミン、ゼラチン、エラスチン、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、乳タンパク質、およびホエータンパク質からなる群から選択される、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目１４）
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、項目１から１３のいずれか１項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目１５）
前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミンである、項目１から１４のいずれか１項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目１６）
静脈内送達用に処方される、項目１から１５のいずれか１項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目１７）
直接注射または腫瘍への灌流用に処方される、項目１６に記載の凍結乾燥されたナノ粒子組成物。
（項目１８）
前記ナノ粒子が、およそ１６０ｎｍの平均粒子径および約１×１０ －１１ Ｍ～約１×１０ －９ の解離定数を有する、項目１に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
（項目１９）
癌細胞をナノ粒子組成物の有効量と接触させることを含む、癌細胞の集団において生存可能な癌細胞を死滅させる方法であって、前記組成物が、生存可能な癌細胞を死滅させるのに十分な期間、前記細胞との接触を維持され、前記ナノ粒子組成物が、外部表面を有するナノ粒子を含み、前記ナノ粒子のそれぞれが
ａ）キャリアタンパク質と、
ｂ）約１００～約１０００個の、抗原結合部分を有する結合剤と、
ｃ）パクリタキセルの有効量と、
を含み、
前記ナノ粒子が、凍結乾燥され、水溶液で再構成され、前記結合剤の抗原結合部分が、前記癌細胞の抗原に結合することが可能で、前記ナノ粒子の約５０％未満が、オリゴマーである、方法。
（項目２０）
前記抗原結合部分が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＰＤ－Ｌ１、Ｌｙ６Ｅ、ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ ＤＡＦ、ＥＲＢＢ－３受容体、ＣＳＦ－１Ｒ、ＨＥＲ２、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ３、ＣＥＡ、ＣＤ４０、ＯＸ４０、Ａｎｇ２－ＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦに結合する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記組成物が、約２０℃～約２５℃で最長約１２ヶ月またはそれを超える期間、安定である、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記抗原結合部分が、アプタマー、受容体リガンド、またはＦａｂ断片である、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記組成物中に存在する前記ナノ粒子の４０％未満が、オリゴマー化されている、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記組成物中に存在する前記ナノ粒子の３０％未満が、オリゴマー化されている、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記組成物中に存在する前記ナノ粒子の２０％未満が、オリゴマー化されている、項目１９に記載の方法。
（項目２６）
前記組成物中に存在する前記ナノ粒子の１０％未満が、オリゴマー化されている、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
前記組成物中に存在する前記ナノ粒子の５％未満が、オリゴマー化されている、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
前記ナノ粒子の平均粒子径が、１３０ｎｍ～８００ｎｍである、項目１９に記載の方法。
（項目２９）
前記キャリアタンパク質が、アルブミンであり、前記ナノ粒子が、およそ１６０ｎｍの平均粒子径を有する、項目１９に記載の方法。
（項目３０）
前記結合剤が、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブ、およびトラスツズマブからなる群から選択される、項目１９から２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記キャリアタンパク質が、アルブミン、ゼラチン、エラスチン、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、乳タンパク質、およびホエータンパク質からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目３２）
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、項目１９から３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記アルブミンが、組換えヒト血清アルブミンである、項目１９から３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記ナノ粒子組成物が、静脈内送達用に処方される、項目１９から３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記ナノ粒子組成物が、直接注射または腫瘍への灌流用に処方される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ナノ粒子が、およそ１６０ｎｍの平均粒子径および約１×１０ －１１ Ｍ～約１×１０ －９ の解離定数を有する、項目１９に記載の方法。
（項目３７）
前記ナノ粒子組成物の治療有効量が、約７５ｍｇ／ｍ ２ ～約１７５ｍｇ／ｍ ２ のパクリタキセルを含む、項目１９から３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記ナノ粒子組成物の治療有効量が、約３０ｍｇ／ｍ ２ ～約７０ｍｇ／ｍ ２ のベバシズマブを含む、項目１９から３７のいずれか１項に記載の方法。
図面の簡単な説明
以下の図は単に本発明の代表に過ぎず、本発明を限定するものではない。一貫性のために、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）およびベバシズマブを用いる本発明のナノ粒子は、頭字語「ＡＢ」を用い、ＡＢ１６０などのＡＢの後の数字は、これらのナノ粒子の平均粒子径（単位：ナノメートル）を付与することを意味する。同様に、結合剤がリツキシマブである場合、頭字語は「ＡＲ」であり、その後の番号は同じである。
二次抗体のみで染色されたＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢＸ；ニュージャージー州サミット、０７９０１所在のＣｅｌｇｅｎｅから市販される）（左上のパネル）、ヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ｆａｂ＋二次抗体で染色されたＡＢＸ（右上のパネル）、二次抗体のみで染色されたＡＢ１６０（アルブミン結合パクリタキセル：ベバシズマブの約１０：４の比のナノ粒子であり、１６０ｎｍの平均粒子径を有する）（左下のパネル）、またはヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ｆａｂ＋二次抗体で染色されたＡＢ１６０（右下のパネル）を含む、フローサイトメトリー散布図を示す。 ＡＢ１６０を、金粒子で標識した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと共にインキュベートした後の代表的な電子顕微鏡写真を示す。 ＡＢ１６０画分（微粒子、１００ｋＤ超のタンパク質および１００ｋＤ未満のタンパク質）中の総パクリタキセルの割合を示す円グラフ（上）、および同時局在を確証するためにマウスＩｇＧ Ｆａｂ（ＢＥＶ）およびパクリタキセルに対する抗体を用いたウエスタンブロット（下）を示す。 ＡＢＸ単独と比較した場合のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を用いたインビトロ毒性アッセイにおけるパクリタキセルの活性を表す。その結果を、非処置細胞の総増殖率％である増殖指数の平均値（＋／－ＳＥＭ）により表す。このデータは、３回の実験を表し、差は有意でなかった。 抗体によるリガンド（ＶＥＧＦ）の結合を決定するためにＶＥＧＦをＡＢＸおよびＡＢ１６０と共にインキュベートした後の上清のＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡの結果を表す。その結果を、２つの複合体により結合されなかったＶＥＧＦの平均割合％＋／－ＳＥＭとして示す。データは、３回の実験を表す（＊＊Ｐ＜０．００５）。 ナノ粒子およびより大きな粒子が形成される条件下でＢＥＶ（ベバシズマブ）をＡＢＸに添加することにより形成された複合体の粒子径（光散乱技術により決定）を示す。濃度を増加させたＢＥＶ（０～２５ｍｇ）をＡＢＸ １０ｍｇに添加し、形成された複合体の粒子径を決定した。複合体の平均粒子径（１４６ｎｍ～２，１６６ｎｍ）はＢＥＶの濃度が上昇するにつれて増加した。データを、試料の体積／粒子径として表示し、グラフは粒度分布を示す。このデータは、５つの別個の薬物調製物の代表である。比較として、ＡＢＸそのものは、約１３０ｎｍの平均粒子径を有する。 ＡＢＸおよびＢＥＶの結合親和性（吸光（ＢＬＩｔｚ）技術により測定）を示す。データを、解離定数（Ｋｄ）として表示する。４つのｐＨレベル（３、５、７、９）および３つの温度（室温、３７℃および５８℃）で作製した粒子の結合親和性を評価し、データは５回の実験の代表を示す。 Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ３００（ＮＳ３００）でのナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）により決定した血清中での図２Ｂからのナノ粒子複合体の安定性を示す。データは、ＡＢＸ １ｍｇあたりの粒子数として表示し、各条件下で、室温およびｐＨ７（ＡＢ１６００７：粒子径、ｐＨ）、５８℃およびｐＨ７（ＡＢ１６００７５８：粒子径、ｐＨ、温度）、ならびに５８℃およびｐＨ５（ＡＢ１６００５５８：粒子径、ｐＨ、温度）で調製されたＡＢ１６０を、ＡＢＸ単独と比較する。粒子の調製後、それらをヒトＡＢ血清に１５、３０および６０分間添加して、血清中での経時的安定性を決定した。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、およそ６００ｍｍ３～９００ｍｍ３の腫瘍サイズで、ＰＢＳ、１２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶ、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸ、１２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶ＋３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸ、またはＡＢ１６０（約１２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶおよび約３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸを有する）で処置した胸腺欠損ヌードマウスにおけるＡＢナノ粒子のインビボ試験を示す。データを、ベースライン（処置日の腫瘍サイズ）からの腫瘍サイズの変化率％として処置後７日目で表す。スチューデントｔ検定を使用して、有意性を決定した。ＡＢ粒子のｐ値は全て、ＰＢＳ、個々の薬物単独および連続投与された２つの薬物とは有意に異なっていた。 図３Ａで分析したマウスの生存期間中央値に関して作成したカプラン・マイヤー曲線を示す。生存曲線を比較するマンテル・コックス検定を用いて有意性を決定した。 腫瘍サイズがＡＢＸ単独群およびＡＢ１６０群の腫瘍反応に影響を与えたか否かを確認するために腫瘍が７００ｍｍ３未満または７００ｍｍ３を超える場合に処置したマウスのベースラインからの変化率％を示す。スチューデントｔ検定を使用して有意性を決定し、ＡＢＸ単独群は腫瘍サイズに基づく有意差を示さなかったが（ｐ＝０．７５２）、ＡＢ１６０群は有意に異なっていた（ｐ＝０．００５７）。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、約６００ｍｍ３～９００ｍｍ３の腫瘍サイズにおいて、ＰＢＳ、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸまたは４５ｍｇ／ｋｇのＢＥＶ＋ＡＢ１６０、ＡＢ５８０（５８０ｎｍの平均粒子径を有するアルブミン結合パクリタキセル：ベバシズマブからなるナノ粒子）またはＡＢ１１３０（１１３０ｎｍの平均粒子径を有するアルブミン結合パクリタキセル：ベバシズマブからなるナノ粒子）で処置した胸腺欠損ヌードマウスにおけるＡＢナノ粒子のインビボ試験を示す。データを、ベースライン（処置日の腫瘍サイズ）からの腫瘍サイズの変化率％として処置後７日目で表す。スチューデントｔ検定を使用して有意性を決定した。ＡＢ粒子の投与後の腫瘍サイズ変化は全て、ＰＢＳ、個々の薬物単独および連続投与された２つの薬物群と比較して有意に異なっていた。異なる粒子径を有するＡＢ粒子間の差は、有意でなかった。 図３Ｄで分析されたマウスの生存率中央値に関して作成したカプラン・マイヤー曲線を示す。生存曲線を比較するマンテル・コックス検体を用いて、有意性を決定した。 ＡＢＸまたはＡＢ１６０の状況で３０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルをＩＶ注射して０～２４時間後に腫瘍を担持しないマウスおよび腫瘍担持マウスから採取し、ＬＣ－ＭＳで測定した血液および腫瘍試料に基づいて、ｙ軸を対数目盛にした線グラフで表示した血中パクリタキセル濃度を示す。０時の時点でマウスにＩＶ注射し、０、４、８、１２および２４時間の時点で血液試料を採取してマウスを屠殺した。１時点あたり少なくとも３匹のマウスを使用した。スチューデントｔ検定を利用して、ＡＢＸとＡＢ１６０との任意の濃度差が有意であるか否かを決定した。 ｙ軸を数字目盛にした線グラフで表示する、図４Ａの血中パクリタキセル濃度を示す。 図４Ａおよび図４Ｂに示す血中濃度データから計算したＣｍａｘ、半減期およびＡＵＣ値を示す。 より早い時点（２～８時間）を用いる第２の薬物動態実験から得た、ｙ軸を対数目盛にした線グラフで表示する血中パクリタキセル濃度を示す。 ｙ軸を数字目盛にした線グラフで表示する、図４Ｄの血中パクリタキセル濃度を示す。 ＡＢＸおよびＡＢ１６０の注射前に腫瘍をより大きなサイズまで成長させたマウスにおける血中パクリタキセル濃度を示す。 図４Ｆのデータから計算したＣｍａｘおよびＡＵＣを示す。 ＬＣ－ＭＳで測定した第２のマウス実験の腫瘍におけるパクリタキセル濃度を示す。データを、パクリタキセル（μｇ）／腫瘍組織（ｍｇ）として表示する。スチューデントｔ検定を利用して、差が有意であるか否かを決定した。 ＡＢＸ単独と比較した、ＡＢ１６０で処置したマウスにおけるＩ－１２５放射活性レベルを示す。 図４Ｉに示すＩ－１２５放射活性レベルのグラフ表示を示す。 リツキシマブと共に作製したナノ粒子の粒子径測定値および親和性を示す。１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＸを０～１０ｍｇ／ｍｌのリツキシマブ（ＲＩＴ）と共にインキュベートし、光散乱技術（Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００）を使用して、得られた粒子径を決定した。データは、各粒子径における粒子の体積率として表示し、曲線は、粒度分布を表す（上）。表（下）は、抗体の各濃度で得られた粒子径を示す。 トラスツズマブと共に調製されたナノ粒子の粒子径測定値および親和性を示す。１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＸを０～２２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブ（ＨＥＲ）と共にインキュベートし、光散乱技術（Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００）を使用して、得られた粒子の粒子径を測定した。データは、各粒子径における粒子の体積率として表示されており、曲線は、粒度分布を表している（上）。表（下）は、抗体の各濃度で得られた粒子径を示す。 バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩｔｚ）技術によって決定した、ｐＨ３、５、７および９でＡＢＸと比較したリツキシマブおよびトラスツズマブの結合親和性を示す。解離定数を、相互作用ごとに表示する。 ＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉヒトリンパ腫細胞株を用いて試験したＡＲ１６０のインビトロ毒性を示す。データを、非処置ウェル中のＦＩＴＣ陽性細胞（最高レベルの増殖）に対する処置ウェル中のＦＩＴＣ陽性細胞の割合％である増殖指数のグラフで表示する。 ５×１０６個のＤａｕｄｉヒトリンパ腫細胞を右脇腹に注射した胸腺欠損ヌードマウスにおけるインビボ腫瘍有効性を示す。腫瘍を６００ｍｍ３～９００ｍｍ３まで成長させて、マウスをＰＢＳ、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸ、１２ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ、１２ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ＋３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸまたはＡＲ１６０で処置した。処置後７日目に、処置１日目からの腫瘍サイズの変化率％により腫瘍反応を決定した。スチューデントｔ検定により有意性を決定し、ベースラインからの変化率％は、ＡＲ１６０処置マウスと他の全ての群の間で有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１）。 図６Ｂに示した実験から作成したカプラン・マイヤー生存曲線を示す。各処置群の生存率中央値を示す。マンテル・コックス検定を使用して、生存曲線の差が有意であるか否かを決定した。 別の化学療法剤（シスプラチン）のＡＢ１６０への添加を示す。ＡＢＸ（５ｍｇ／ｍｌ）をシスプラチン（０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に室温で３０分間インキュベートし、ＡＢＸ微粒子を除去した後の上清における遊離シスプラチンをＨＰＬＣにより測定した。遊離シスプラチンの量を開始濃度から差し引いて、ＡＢＸに結合したシスプラチンの量を決定した。データを、開始濃度（シスプラチン）と共に棒グラフで表示する。 Ａ３７５ヒト黒色腫細胞の増殖アッセイにおけるシスプラチン結合ＡＢＸ（ＡＣ）の毒性を示す。薬物の暴露およびＥｄＵの取込みの２４時間後に、細胞を固定し、透過性にして、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＥｄＵ抗体で標識した。データは、非処置ウェル中のＦＩＴＣ陽性細胞（最高レベルの増殖）と比較した処置ウェル中のＦＩＴＣ陽性細胞の割合％である増殖指数のグラフで表示する。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射した胸腺欠損ヌードマウスにおけるＡＣ（ＡＢＣ複合体、シスプラチン結合ＡＢＸ）のインビボ腫瘍有効性を示す。腫瘍を６００ｍｍ３～９００ｍｍ３まで成長させて、マウスをＰＢＳ、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸ、２ｍｇ／ｋｇのシスプラチン、ＡＢ１６０、２ｍｇ／ｋｇのシスプラチン＋ＡＢ１６０またはＡＢＣ１６０で処置した。処置後７日目に、処置日からの腫瘍サイズの変化率％により腫瘍反応を決定した。スチューデントｔ検定により有意性を決定したところ、ベースラインからの変化率％は、ＡＢＣ１６０処置マウスとＰＢＳ、シスプラチンまたはＡＢＸ処置マウスの間で有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１）。処置後７日目のベースラインからの変化率％について、ＡＢ１６０、ＡＢ１６０＋シスプラチンおよびＡＢＣ１６０処置群の間には有意差は認められなかった。 図７Ｃに示す実験に基づき作成したカプラン・マイヤー生存曲線を示し、各処置群の生存率中央値を示す。マンテル・コックス検定を使用して、生存曲線の差が有意であるか否かを決定した。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較した、凍結乾燥し、室温で１ヶ月間貯蔵し、再構成したＡＢ１６０ナノ粒子の粒度分布を示す。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較した、凍結乾燥し、室温で１ヶ月間貯蔵し、再構成したＡＢ１６０ナノ粒子のリガンド（ＶＥＧＦ）結合能を示す。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較した、凍結乾燥し、室温で１ヶ月間貯蔵し、再構成したＡＢ１６０ナノ粒子のインビトロ癌細胞毒性を示す。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較した、凍結乾燥し、室温で１０ヶ月間貯蔵し、再構成したＡＢ１６０ナノ粒子の粒度分布を示す。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較した、凍結乾燥し、室温で１０ヶ月間貯蔵し、再構成したＡＢ１６０ナノ粒子のリガンド（ＶＥＧＦ）結合能力を示す。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較した、凍結乾燥し、室温で１０ヶ月間貯蔵し、かつ再構成したＡＢ１６０ナノ粒子のインビトロ癌細胞毒性を示す。 室温の生理食塩水中で最長２４時間インキュベートした、静脈内注入条件下でのＡＢＸ－ＢＥＶ複合体（ＡＢＸ最終濃度：５ｍｇ／ｍＬ）の粒度分布を示す（図９Ａおよび図９Ｂ）。室温で４時間までに、ＥＬＩＳＡにより複合体の分解の証拠が若干認められる（２０％、図９Ｃ）。 室温の生理食塩水中で最長２４時間インキュベートした、静脈内注入条件下でのＡＢＸ－ＢＥＶ複合体（ＡＢＸ最終濃度：５ｍｇ／ｍＬ）の粒度分布を示す（図９Ａおよび図９Ｂ）。室温で４時間までに、ＥＬＩＳＡにより複合体の分解の証拠が若干認められる（２０％、図９Ｃ）。 室温の生理食塩水中で最長２４時間インキュベートした、静脈内注入条件下でのＡＢＸ－ＢＥＶ複合体（ＡＢＸ最終濃度：５ｍｇ／ｍＬ）の粒度分布を示す（図９Ａおよび図９Ｂ）。室温で４時間までに、ＥＬＩＳＡにより複合体の分解の証拠が若干認められる（２０％、図９Ｃ）。 ＡＢＸ（上のパネル）またはＡＢ１６０（下のパネル）の生理食塩水またはヘパリン添加ヒト血漿中、９：１または１：１の相対体積比で３０秒間のインビトロインキュベーションを示す。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、ＰＢＳ（図１１Ａ）、１２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶ（図１１Ｂ）、３０ｍｇ／ｋｇ ＡＢＸ（図１１Ｃ）、ＡＢ１６０で処置した（図１１Ｄ）、または０１．２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶで前処置して２４時間後にＡＢ（図１１Ｂ）で処置した、胸腺欠損ヌードマウスのインビボ試験を示す。データは、処置後７日目および１０日目の腫瘍体積（ｍｍ３）として表す。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、ＰＢＳ（図１１Ａ）、１２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶ（図１１Ｂ）、３０ｍｇ／ｋｇ ＡＢＸ（図１１Ｃ）、ＡＢ１６０で処置した（図１１Ｄ）、または０１．２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶで前処置して２４時間後にＡＢ（図１１Ｂ）で処置した、胸腺欠損ヌードマウスのインビボ試験を示す。データは、処置後７日目および１０日目の腫瘍体積（ｍｍ３）として表す。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、ＰＢＳ（図１１Ａ）、１２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶ（図１１Ｂ）、３０ｍｇ／ｋｇ ＡＢＸ（図１１Ｃ）、ＡＢ１６０で処置した（図１１Ｄ）、または０１．２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶで前処置して２４時間後にＡＢ（図１１Ｂ）で処置した、胸腺欠損ヌードマウスのインビボ試験を示す。データは、処置後７日目および１０日目の腫瘍体積（ｍｍ３）として表す。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、ＰＢＳ（図１１Ａ）、１２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶ（図１１Ｂ）、３０ｍｇ／ｋｇ ＡＢＸ（図１１Ｃ）、ＡＢ１６０で処置した（図１１Ｄ）、または０１．２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶで前処置して２４時間後にＡＢ（図１１Ｂ）で処置した、胸腺欠損ヌードマウスのインビボ試験を示す。データは、処置後７日目および１０日目の腫瘍体積（ｍｍ３）として表す。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、ＰＢＳ（図１１Ａ）、１２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶ（図１１Ｂ）、３０ｍｇ／ｋｇ ＡＢＸ（図１１Ｃ）、ＡＢ１６０で処置した（図１１Ｄ）、または０１．２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶで前処置して２４時間後にＡＢ（図１１Ｂ）で処置した、胸腺欠損ヌードマウスのインビボ試験を示す。データは、処置後７日目および１０日目の腫瘍体積（ｍｍ３）として表す。 図１１Ａ～Ｅの処置７日後のデータを要約する。 図１１Ａ～Ｅの処置１０日後のデータを要約する。 ＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉリンパ球細胞を蛍光タグ抗ヒトＣＤ２０またはアイソタイプマッチ対照で標識して、フローサイトメトリーで分析した実験の結果をパネルＦおよびＡに、それぞれ示す。他のパネルでは、Ｄａｕｄｉ細胞をＣＤ２０標識の前にＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢＸ）、ＡＲ１６０、ＡＲ１６０Ｌ、またはＲｉｔｕｘａｎで前処置した。理解される通り、ＣＤ２０結合は、ＡＲ粒子およびＲｉｔｕｘａｎにより特異的に遮断されたが、ＡＢＸ単独では遮断されなかったため、ＡＲ１６０およびＡＲ１６０Ｌがこれらの細胞上のＣＤ２０リガンドに結合し、蛍光抗ＣＤ２０の結合を遮断することが示唆された。 図１２の散布図にヒストグラムを重ねたものである。 新しく作製して凍結乾燥したＡＲ（図１４Ａ）およびＡＴ（図１４Ｂ）に対するＡＢＸ単独の粒子径比較を表す。 新しく作製して凍結乾燥したＡＲ（図１４Ａ）およびＡＴ（図１４Ｂ）に対するＡＢＸ単独の粒子径比較を表す。 Ｄａｕｄｉ細胞増殖アッセイにおいてＡＢＸおよびＡＲ粒子の毒性を比較する。 標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）、非特異的抗体でコーティングした標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢ ＩｇＧ）、またはリツキシマブでコーティングした標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＲ１６０）のいずれかで処置したマウスで得られた結果を表す。図１６Ａは、腫瘍における目的の領域（ＲＯＩ）（ＲＯＩ２、３、および４）およびバックグラウンド領域（ＲＯＩ１、５、および６）における蛍光蓄積を表す。ＲＯＩ１、５、および６は、バックグラウンド参照としての役割を有する。図１６Ｂは、大まかな腫瘍への送達を提供するために決定した、３つの処置群全てのマウスの単位腫瘍面積あたりの平均蛍光量の棒グラフである。図１６Ｃは、腫瘍へ送達された薬物と身体へ送達された薬物との割合を得るためにバックグラウンドＲＯＩによって正規化した単位腫瘍面積あたりの平均蛍光量の棒グラフである。データから、ＡＲ１６０ナノ粒子の投与が、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）単独または非特異的抗体をコーティングしたＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）と比較して蛍光の増加をもたらすことが実証される。 標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）、非特異的抗体でコーティングした標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢ ＩｇＧ）、またはリツキシマブでコーティングした標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＲ１６０）のいずれかで処置したマウスで得られた結果を表す。図１６Ａは、腫瘍における目的の領域（ＲＯＩ）（ＲＯＩ２、３、および４）およびバックグラウンド領域（ＲＯＩ１、５、および６）における蛍光蓄積を表す。ＲＯＩ１、５、および６は、バックグラウンド参照としての役割を有する。図１６Ｂは、大まかな腫瘍への送達を提供するために決定した、３つの処置群全てのマウスの単位腫瘍面積あたりの平均蛍光量の棒グラフである。図１６Ｃは、腫瘍へ送達された薬物と身体へ送達された薬物との割合を得るためにバックグラウンドＲＯＩによって正規化した単位腫瘍面積あたりの平均蛍光量の棒グラフである。データから、ＡＲ１６０ナノ粒子の投与が、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）単独または非特異的抗体をコーティングしたＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）と比較して蛍光の増加をもたらすことが実証される。 標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）、非特異的抗体でコーティングした標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢ ＩｇＧ）、またはリツキシマブでコーティングした標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＲ１６０）のいずれかで処置したマウスで得られた結果を表す。図１６Ａは、腫瘍における目的の領域（ＲＯＩ）（ＲＯＩ２、３、および４）およびバックグラウンド領域（ＲＯＩ１、５、および６）における蛍光蓄積を表す。ＲＯＩ１、５、および６は、バックグラウンド参照としての役割を有する。図１６Ｂは、大まかな腫瘍への送達を提供するために決定した、３つの処置群全てのマウスの単位腫瘍面積あたりの平均蛍光量の棒グラフである。図１６Ｃは、腫瘍へ送達された薬物と身体へ送達された薬物との割合を得るためにバックグラウンドＲＯＩによって正規化した単位腫瘍面積あたりの平均蛍光量の棒グラフである。データから、ＡＲ１６０ナノ粒子の投与が、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）単独または非特異的抗体をコーティングしたＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）と比較して蛍光の増加をもたらすことが実証される。 生理食塩水、ＢＥＶ２４（２４ｍｇ／ｋｇ）、ＡＢＸ３０（３０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＢ１６０（１２ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶおよび３０ｍｇ／ｋｇ ＡＢＸ）およびＡＢ２２５（２４ｍｇ／ｋｇ ＢＥＶおよび３０ｍｇ／ｋｇ ＡＢＳ）の単回用量で処置したマウスの生存率を表す。投与後３０日目に、ＡＢ２２５およびＡＢ１６０で処置したマウスの生存は、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）単独のＢＥＶ単独で処置したマウスの生存をはるかに超えている。
本説明を読んだ後、様々な代替の実施形態および代替の応用において本発明を実施する方法が、当業者に明らかになるであろう。しかし、本発明の様々な実施形態の全てを本明細書で説明するわけではない。本明細書に示された実施形態が単に例示であり、本発明を限定するものではないことは、理解されよう。したがって、様々な代替の実施形態の詳細な説明は、以下に記載する本発明の範囲または広さを限定しないと解釈すべきである。
本発明を開示および説明する前に、以下に説明する態様は、特定の組成物、そのような組成物の調製方法またはその使用が、当然変更可能であることから、それらに限定されないと理解すべきである。同じく、本明細書で用いられる用語は、単に特定の態様を説明する目的のためであり、本発明を限定しないと意図されることも、理解すべきである。
単に読者の利便性のために、本発明の詳細な説明を様々な節に分けているが、いずれの節に含まれる開示内容も別の節の開示内容と組み合わせることができる。読者の利便性のために、本明細書においてタイトルまたはサブタイトルが使用されている場合もあるが、それらは本発明の範囲に影響を及ぼさないと意図される。
定義
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書および後続の特許請求の範囲では複数の用語に言及するが、それらの用語は以下の意味を有すると定義される。
本明細書で用いられる用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、本発明を限定しないと意図される。本明細書で用いられる単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（前記）（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示していない限り、複数形も含むものとする。
「任意選択の」または「任意選択で」は、その後に記載された事象または状況が起こり得る、または起こり得ないことを意味し、その記載は、事象または状況が起こる場合およびそれらが起こらない場合を含む。
用語「約」は、範囲を含む数字表示、例えば温度、時間、量、濃度などの前に使用されている場合、（＋）または（－）１０％、５％、１％またはそれらの間に含まれる任意の部分範囲または部分値（ｓｕｂｖａｌｕｅ）だけ変動し得る近似値を示す。好ましくは、用語「約」は、用量に関して使用されている場合、用量が＋／－１０％だけ変動し得ることを意味する。例えば、「約４００～約８００個の結合剤」は、ナノ粒子の外部表面が３６０～８８０個の量の結合剤を含むことを示す。
「含んでいる」または「含む」は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、それ以外の要素を排除しないことを意味すると意図される。「本質的に～からなる」は、組成物および方法を定義するために使用されている場合、明記された目的のための組み合わせに対して任意の本質的に重要な他の要素を排除することを意味する。したがって、本質的に本明細書に定義された要素からなる組成物は、特許請求される本発明の基本的かつ新規な特性（複数可）に実質的に影響を与えない他の材料またはステップを除外しない。「～からなる」は、他の成分の微量より多くの要素および実質的な方法ステップを排除することを意味する。これらの各移行語により定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
本明細書で用いられる用語「ナノ粒子」は、少なくとも１つの寸法が５ミクロン未満である粒子を指す。好ましい実施形態において、例えば静脈内投与では、ナノ粒子は１ミクロン未満である。直接投与では、ナノ粒子はより大きい。さらに大きな粒子でも、本発明によって明示的に企図される。
粒子の集団において、個々の粒子の粒子径は、平均値の周囲に分布している。それゆえ、集団の粒子径は、平均または百分位数によっても表すことができる。Ｄ５０は、粒子の５０％以下が含まれる粒子径である。粒子の１０％は、Ｄ１０値よりも小さく、かつ粒子の９０％は、Ｄ９０よりも小さい。明らかでない場合、「平均」粒子径は、Ｄ５０に等しい。したがって、例えば、ＡＢ１６０およびＡＲ１６０は、１６０ナノメートルの平均粒子径を有するナノ粒子を指す。
用語「ナノ粒子」は、より小さいナノ粒子単位の不連続な多量体も包含し得る。例えば、３２０ｎｍの粒子は、１６０ｎｍのナノ粒子単位の二量体を含む。それゆえ１６０ｎｍのナノ粒子では、多量体はおよそ３２０ｎｍ、４８０ｎｍ、６４０ｎｍ、８００ｎｍ、９６０ｎｍ、１１２０ｎｍなどである。
本明細書で用いられる用語「キャリアタンパク質」は、結合剤および／または治療薬を輸送するように機能するタンパク質を指す。本開示の結合剤は、キャリアタンパク質に可逆的に結合することができる。キャリアタンパク質の例を、以下により詳細に考察する。
本明細書で用いられる用語「コア」は、キャリアタンパク質、キャリアタンパク質と治療薬または他の薬剤、あるいは薬剤の組み合わせで構成され得るナノ粒子の中心または内部を指す。幾つかの実施形態において、結合剤の疎水性部分は、コアの中に組み込まれ得る。
本明細書で用いられる用語「治療薬」は、治療的に有用な薬剤、例えば疾患状態、生理学的状態、症状もしくは病因因子の処置、寛解もしくは減弱のため、またはその評価もしくは診断のための薬剤を意味する。治療薬は、化学療法剤、例えば、分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ステロイド、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、アルキル化剤、酵素、プロテアソーム阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
本明細書で用いられる用語「結合剤」、「～に特異的な結合剤」または「特異的に結合する結合剤」は、標的抗原に結合するが、無関係な化合物には有意に結合しない薬剤を指す。本開示の方法において有効に使用され得る結合剤の例としては、レクチン、タンパク質、およびモノクローナル抗体などの抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体もしくはポリクローナル抗体、または抗原結合断片、ならびにアプタマー、Ｆｃドメイン融合タンパク質、および疎水性タンパク質ドメイン、例えばＦｃドメインを有するもしくはそれに融合されたアプタマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、結合剤は、外因性抗体である。外因性抗体は、哺乳動物免疫系により哺乳動物、例えばヒトにおいて自然に産生されない抗体である。
本明細書で用いられる用語「抗体」または「（複数の）抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（即ち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）を指す。この用語はまた、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖で構成された抗体、ならびに全長抗体およびその部分を含む種々の形態、例えば、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディー、多重特異性抗体、二重特異性抗体（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗イディオタイプ抗体、二特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、その機能的に活性なエピトープ結合断片、二官能性ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７， １０５ （１９８７））および単鎖（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８５， ５８７９－５８８３ （１９８８）およびＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２， ４２３－４２６ （１９８８））などを指す。（一般に、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｎｊａｍｉｎ， Ｎ．Ｙ．， ２ＮＤ ｅｄ． （１９８４），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ， Ｎａｔｕｒｅ， ３２３， １５－１６ （１９８６）を参照されたい）。抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ）の抗体であり得る。好ましくは抗体は、ＩｇＧである。抗体は、非ヒト抗体（例えば、マウス、ヤギまたは任意の他の動物由来）、完全ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。抗体または（複数の）抗体は、本明細書に開示された抗体の任意のバイオ後続品を包含する。本明細書で用いられるバイオ後続品は、量、安全性、および有効性がイノベーターカンパニーから販売される参照製品に匹敵すると思われる生物製剤を指す（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ａｃｔ （４２ Ｕ．Ｓ．Ｃ． ２６２（ｉ）のＳｅｃｔｉｏｎ ３５１（ｉ））。
「Ｋｄ」とも称される用語「解離定数」は、特定の物質が個々の成分（例えば、タンパク質キャリア、抗体および任意選択の治療薬）に分離する程度を表す量を指す。
本明細書で用いられる用語「凍結乾燥された」、「凍結乾燥」などは、乾燥させる材料（例えば、ナノ粒子）を最初に凍結した後、氷または凍結溶媒を真空環境において昇華により除去する工程を指す。貯蔵時の凍結乾燥製品の安定性を高めるために、事前に凍結乾燥した製剤に任意選択で賦形剤を含める。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、治療薬として使用する前に、凍結乾燥成分（キャリアタンパク質、抗体および任意の治療薬）から形成することができる。他の実施形態において、キャリアタンパク質、結合剤、例えば抗体、および任意選択の治療薬を最初に混和してナノ粒子にし、その後、凍結乾燥する。凍結乾燥試料は、さらなる賦形剤をさらに含み得る。
用語「増量剤」は、凍結乾燥製品の構造を与える薬剤を含む。増量剤のために使用される一般的な例としては、マンニトール、グリシン、ラクトースおよびスクロースが挙げられる。薬学的に優れたケークを提供するだけでなく、増量剤は、崩壊温度を変更すること、凍結融解保護を与えること、および長期間の貯蔵時のタンパク質安定性を高めることに関して有用な品質も付与し得る。これらの薬剤は張度調整剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍｏｄｉｆｅｒ）としても機能することができる。
用語「緩衝液」は、凍結乾燥前に溶液のｐＨを許容される範囲内に維持する薬剤を包含し、コハク酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、ヒスチジン、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ジエタノールアミン、クエン酸塩（ナトリウム）などを挙げることができる。本発明の緩衝液は、約５．５～約６．５の範囲のｐＨを有し、好ましくは約６．０のｐＨを有する。ｐＨをこの範囲に制御する緩衝液の例としては、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が挙げられる。
用語「凍結保護剤」は一般に、おそらくタンパク質表面から優先的に排除することにより、凍結誘発性ストレスに対する安定性をタンパク質に与える薬剤を含む。この薬剤は、一次および二次乾燥ならびに長期間の製品貯蔵中に保護を与えることもできる。この例は、デキストランおよびポリエチレングリコールなどのポリマー；スクロース、グルコース、トレハロースおよびラクトースなどの糖類；ポリソルベートなどの界面活性剤；ならびにグリシン、アルギニンおよびセリンなどのアミノ酸である。
用語「分解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」は、おそらく非晶質ガラス状マトリックスを提供すること、水素結合によりタンパク質に結合すること、および乾燥工程の際に除去される水分子を置換することにより、乾燥または「脱水」工程（一次および二次乾燥サイクル）中にタンパク質に安定性を与える薬剤を包含する。これは、タンパク質のコンフォメーションを維持し、凍結乾燥サイクル中のタンパク質分解を最小限に抑えて、長期間の製品貯蔵を改善させるために役立つ。例としては、ポリオール、またはスクロースおよびトレハロースなどの糖類が挙げられる。
用語「医薬製剤」は、有効成分を効果的にすることができる形態であり、製剤が投与される対象に対して毒性であるさらなる成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容し得る」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、用いられる有効成分の有効用量を与えるために対象哺乳動物に適正に投与され得る賦形剤である。
「再構成時間」は、凍結乾燥された製剤を溶液に再水和させるのに必要な時間である。
「安定な」製剤は、貯蔵時にその中のタンパク質がその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物活性を本質的に保持する製剤である。例えば、タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技術が、当該技術分野で利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ２４７－３０１， Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｐｕｂｓ． （１９９１）、およびＪｏｎｅｓ， Ａ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． １０：２９－９０ （１９９３）で論評されている。安定性は、選択された期間に選択された温度で測定され得る。
本明細書で用いられる用語「エピトープ」は、結合剤、例えば抗体によって認識される抗原の部分を指す。エピトープとしては、タンパク質（例えば、抗体）またはリガンドとの特異的相互作用を可能にする短いアミノ酸配列またはペプチド（任意選択でグリコシル化されているかまたはそうでなければ修飾されている）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、エピトープは、結合剤の抗原結合部位が結合する分子の部分であり得る。
用語「処置すること」または「処置」は、ヒトなどの対象における疾患または障害（例えば、癌）の処置を包含し、（ｉ）疾患または障害を阻害する、即ち、その発症を停止させること、（ｉｉ）疾患もしくは障害を軽減する、即ち、それらの後退を引き起こすこと、（ｉｉｉ）障害の進行を遅らせること、および／または（ｉｖ）疾患もしくは障害の１つまたは複数の症状を阻害する、軽減する、またはその進行を遅らせることを含む。幾つかの実施形態において「処置すること」または「処置」は、癌細胞を死滅させることを指す。
癌処置に関する用語「死滅させる」または「死滅させること」は、癌細胞または癌細胞集団の少なくとも一部を死滅に導く任意のタイプの操作を含むことを対象とする。
用語「アプタマー」は、ポリペプチドなどの標的分子に結合することが可能な核酸分子を指す。例えば本発明のアプタマーは、例えばＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＰＤ－Ｌ１、Ｌｙ６Ｅ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ ＤＡＦ、ＥＲＢＢ－３受容体、ＣＳＦ－１Ｒ、ＳＴＥＡＰ１、ＣＤ３、ＣＥＡ、ＣＤ４０、ＯＸ４０、Ａｎｇ２－ＶＥＧＦ、およびＶＥＧＦに特異的に結合し得る。特定の結合特異性を有する抗体の作製およびアプタマーの治療的使用は、当該技術分野で十分に確立されている。例えば米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，２７０，１６３号、同第５，５８２，９８１号、同第５，８４０，８６７号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０５１，６９８号、同第６，１４７，２０４号、同第６，１８０，３４８号、および同第６，６９９，８４３号、ならびに加齢黄斑変性の処置に関するＭａｃｕｇｅｎ（登録商標）（Ｅｙｅｔｅｃｈ、ニューヨーク所在）の治療有効性を参照されたい。
本明細書で用いられる用語「オリゴマー」または「オリゴマー性」または「オリゴマー化された」は、２つまたはそれ超のモノマーで構成されたオリゴマーを指す。
Ｆｃ融合タンパク質は、抗体の結晶化可能断片（Ｆｃ）ドメインを別の生物活性剤、例えばタンパク質ドメイン、ペプチド、または核酸もしくはペプチドアプタマーと連結させて、所望の構造－機能特性および顕著な治療能を有する分子を作製する生物工学によって作製されたポリペプチドである。γ免疫グロブリン（ＩｇＧ）アイソタイプは、エフェクター機能の動員および血漿中半減期の増加などの好適な特性を有するため、Ｆｃ融合タンパク質を作製するための基礎として用いられることが多い。ペプチドおよび核酸の両方を融合パートナーとして使用することができるアプタマーの範囲を考慮すると、Ｆｃ融合タンパク質は、数多くの生物学的および医薬的応用を有する。
加えて、本明細書で用いられる幾つかの用語を、以下により具体的に定義する。
概要
本発明は一部として、キャリアタンパク質と、結合剤、例えば抗体、アプタマー、または疎水性ドメインと結合ドメインを有する融合タンパク質、例えばアプタマーまたは細胞受容体のリガンドに融合したＦｃドメインと、治療薬と、を含む、任意選択で凍結乾燥されたナノ粒子が、患者への毒性を最小限に抑えながら腫瘍への標的化治療を提供する、という驚くべき発見に基づいている。したがって、本明細書に記載されたナノ粒子は、従来のＡＤＣに対する顕著な改良である。
従来のＡＤＣが有効であるためには、リンカーが全身循環内で解離しないが腫瘍部位で十分な薬物放出を可能にするのに十分、安定であることが肝要である。Ａｌｌｅｙ， Ｓ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９：７５９－７６５。これは、有効な薬物コンジュゲートを開発する際の主要な障害になることが立証されており（Ｊｕｌｉｅｎ， Ｄ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２０１１） ＭＡｂｓ ３：４６７－４７８、Ａｌｌｅｙ， Ｓ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９：７５９－７６５）、それゆえナノ免疫コンジュゲートの魅力的な特徴は、生化学的リンカーを必要としないことである。
現在のＡＤＣの別の欠点は、腫瘍へのより高い薬物浸透がヒト腫瘍において実質的に立証されていないことである。マウスモデルにおけるＡＤＣの初期の試験では、抗体を用いた腫瘍標的化により腫瘍中で活性剤のより高濃度が得られることが示唆された（Ｄｅｇｕｃｈｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４６： ３７５１－３７５５）が、おそらくヒトの腫瘍はマウス腫瘍よりも透過性が非常に不均質であるため、これはヒトの疾患の処置においては相関がなかった。Ｊａｉｎ， Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ７：６５３－６６４。同様に、ナノ粒子の粒子径も、脈管構造から腫瘍への血管外遊出にとって肝要である。ヒトの結腸腺癌異種移植モデルを用いたマウス試験では、血管の孔は最大４００ｎｍのリポソームに対して透過性であった。Ｙｕａｎ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５： ３７５２－３７５６。腫瘍の孔径および透過性に関する別の研究では、両特性が腫瘍の位置および成長状態に依存しており、退縮している腫瘍および頭蓋腫瘍が透過性であるのは２００ｎｍ未満の粒子であることが実証された。Ｈｏｂｂｓ， Ｓ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：４６０７－４６１２。本明細書に記載されたナノ免疫複合体は、２００ｎｍ未満のインタクトの大きな複合体が、全身循環において腫瘍組織に容易に透過することができるより小さい機能単位へと部分的に解離するという事実によって、この問題を克服する。さらに、コンジュゲートが腫瘍部位に到達すると、より小さい毒性のペイロードを放出させることができ、腫瘍細胞に取り込まれる必要があるのはコンジュゲート全体ではなく毒性部分のみである。
治療薬（即ち、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））を含む抗体（即ち、ＡＶＡＳＴＩＮＥ（登録商標））コーティングアルブミンナノ粒子の出現により、２つまたはそれ超の治療薬をインビボで所定の部位に指向性に送達する新しいパラダイムが形成された。それぞれが全体として参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１２／１５４８６１号およびＷＯ２０１４／０５５４１５号を参照されたい。
アルブミンと、結合剤、例えば抗体と、の組成物特定の濃度および比で水溶液中で一緒に混和した場合、結合剤は、アルブミンの中におよびアルブミン上で自然に自己集合して結合剤の複数のコピー（最大５００個またはそれ超）を有するナノ粒子を形成する。いずれの理論にも限定されないが、結合剤、例えば抗原またはアプタマーまたはＦｃ融合タンパク質、の抗原（またはリガンド）受容体部分は、ナノ粒子から外向きに配置され、結合剤の疎水性のテール部は、疎水性－疎水性相互作用によってアルブミンに組み込まれると企図される。
単一供給源のタンパク質を含むタンパク質組成物は、一般に顕著な貯蔵寿命を示す凍結乾燥形態で貯蔵されるが、そのような凍結乾燥組成物は、疎水性－疎水性相互作用によって一緒に組み込まれた２つの異なるタンパク質の自己集合ナノ粒子を含まない。さらに、結合剤の結合部分の大部分がナノ粒子の表面で露出されるナノ粒子構成により、そうでなければ穏やかと考えられる条件でも移動または再構成を受け易くなる。例えば、凍結乾燥中に、タンパク質上のイオン電荷は脱水され、それにより下にある電荷を露出する。露出された電荷により、２つのタンパク質間の電荷－電荷相互作用が可能となり、各タンパク質の他のタンパク質との結合親和性を改変し得る。加えて、溶媒（例えば、水）が除去されるにつれて、ナノ粒子の濃度は顕著に上昇する。ナノ粒子のそのような濃度の上昇は、不可逆的なオリゴマー化を生じさせ得る。オリゴマー化は、単量体型と比較してオリゴマーの生物学的特性を低減させて、時として粒子径を１ミクロン超に増加させるタンパク質の公知の特性である。
一方で、少なくとも３ヶ月間の貯蔵寿命が必要であり、かつ６ヶ月または９ヶ月を超える貯蔵寿命が好ましい臨床的および／または商業的使用では、ナノ粒子組成物の安定型が必要である。そのような安定組成物は、静脈内注射のために容易に利用可能でなければならず、ナノ粒子をインビボで既定の部位へ向かわせるために静脈内注射した際にその自己集合形態を保持しなければならず、血流に送達された際でも、いかなる虚血事象も回避するために１ミクロン未満の最大粒子径を有していなければならず、最後に、注射に使用する水性組成物と適合可能でなければならない。
化合物
本開示を読むことによって当業者に明白であるように、本開示は、キャリアタンパク質と、結合剤と、任意選択で少なくとも１種の治療薬と、を含み、任意選択で凍結乾燥されるナノ粒子組成物に関する。
幾つかの実施形態において、キャリアタンパク質は、アルブミン、ゼラチン、エラスチン（トポエラスチン（ｔｏｐｏｅｌａｓｔｉｎ）を含む）またはエラスチン由来ポリペプチド（例えば、α－エラスチンおよびエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ））、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質（例えば、分離大豆タンパク質（ＳＰＩ））、乳タンパク質（例えば、β－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）およびカゼイン）、またはホエータンパク質（例えば、濃縮ホエータンパク質（ＷＰＣ）および分離ホエータンパク質（ＷＰＩ））であり得る。好ましい実施形態において、キャリアタンパク質は、アルブミンである。好ましい実施形態において、アルブミンは、卵白（オボアルブミン）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などである。さらにより好ましい実施形態において、キャリアタンパク質は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。幾つかの実施形態において、キャリアタンパク質は一般に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された安全な（ＧＲＡＳ）賦形剤と見なされる。
幾つかの実施形態において、結合剤は、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブ、およびトラスツズマブからなる群から選択される抗体である。幾つかの実施形態において、抗体は、ナノ粒子の表面の全体または一部の上の実質的に単層の抗体である。表１は、抗体の非限定的な列挙を示す。
Figure 0007133050000001
Figure 0007133050000002
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの治療薬は、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシウレア、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチンおよびシクロホスファミドからなる群から選択される。
表２は、癌治療薬の非限定的列挙を表す。
Figure 0007133050000003
Figure 0007133050000004
Figure 0007133050000005
Figure 0007133050000006
Figure 0007133050000007
Figure 0007133050000008
Figure 0007133050000009
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Figure 0007133050000011
Figure 0007133050000012
治療薬は、ナノ粒子の内側、ナノ粒子の外部表面上またはその両方に位置し得ると理解すべきである。ナノ粒子は、１種類超の治療薬、例えば、２種類の治療薬、３種類の治療薬、４種類の治療薬、５種類の治療薬またはそれ超の治療薬を含み得る。さらにナノ粒子は、ナノ粒子の内側および外側に同じまたは異なる治療薬を含み得る。
幾つかの実施形態において、ＡＢＲＡＸＡＮＥおよびベバシズマブを含むナノ粒子は、除外される。
一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも１００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも２００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも３００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも４００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも５００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも６００個の結合剤を含む。
一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された約１００～約１０００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された約２００～約１０００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された約３００～約１０００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された約４００～約１０００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された約５００～約１０００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された約６００～約１０００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された約２００～約８００個の結合剤を含む。一態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された約３００～約８００個の結合剤を含む。好ましい実施形態において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に非共有結合された約４００～約８００個の結合剤を含む。企図される値は、端点を含む列挙された範囲のいずれかに含まれる任意の値または部分範囲を包含する。
一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ未満である。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約１μｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約９００ｎｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約８００ｎｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約７００ｎｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約６００ｎｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約５００ｎｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約４００ｎｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約３００ｎｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約２００ｎｍである。好ましい実施形態において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１５０ｎｍ～約１８０ｎｍである。特に好ましい実施形態において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１６０ｎｍである。企図される値は、端点を含む列挙された範囲のいずれかに含まれる任意の値、部分範囲または範囲を包含する。
一態様において、ナノ粒子組成物は、静脈内注射用に処方される。虚血事象を回避するために、静脈内注射用に処方されたナノ粒子組成物は、約１μｍ未満の平均粒子径を有するナノ粒子を含まなければならない。
一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍを超える。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ～約５μｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ～約４μｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ～約３μｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ～約２μｍである。一態様において、ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ～約１．５μｍである。企図される値は、端点を含む列挙された範囲のいずれかに含まれる任意の値、部分範囲または範囲を包含する。
一態様において、ナノ粒子組成物は、腫瘍への直接注射用に処方されている。直接注射としては、腫瘍部位内またはその付近への注射、および腫瘍への灌流などが挙げられる。腫瘍への直接注射用に処方する場合、ナノ粒子は、任意の平均粒子径を含み得る。理論に束縛されるものはないが、より大きな粒子（例えば、５００ｎｍ超、１μｍ超など）は腫瘍内に固定化される可能性がより高く、それにより有益な効果が得られると考えられる。より大きな粒子は、腫瘍または特定臓器内に蓄積することができる。例えば、「ＴｈｅｒａＳｐｈｅｒｅ（登録商標）」（肝臓癌用に臨床的に使用されている）と呼ばれる、肝臓の腫瘍に栄養供給する肝動脈内への注射のために使用される２０～６０ミクロンのガラス粒子を参照されたい。それゆえ、静脈内投与では、１μｍ未満の粒子が、典型的に使用される。１μｍ超の粒子は、より典型的には腫瘍に直接（「直接注射」）されるか、または腫瘍部位に栄養供給する動脈に投与される。
一態様において、組成物中のナノ粒子の約０．０１％未満は、２００ｎｍ超、３００ｎｍ超、４００ｎｍ超、５００ｎｍ超、６００ｎｍ超、７００ｎｍ超または８００ｎｍ超の粒子径を有する。一態様において、組成物中のナノ粒子の約０．００１％未満は、２００ｎｍ超、３００ｎｍ超、４００ｎｍ超、５００ｎｍ超、６００ｎｍ超、７００ｎｍ超、または８００ｎｍ超の粒子径を有する。好ましい実施形態において、組成物中のナノ粒子の約０．０１％未満は、８００ｎｍ超の粒子径を有する。より好ましい実施形態において、組成物中のナノ粒子の約０．００１％未満は、８００ｎｍ超の粒子径を有する。
好ましい態様において、本明細書に列挙された粒子径および粒子径範囲は、再構成された凍結乾燥ナノ粒子組成物の粒子径に関する。即ち、凍結乾燥ナノ粒子を水溶液（例えば、水、他の医学的に許容し得る賦形剤、緩衝液など）に再懸濁した後、粒子径または平均粒子径が、本明細書に列挙された範囲内になる。
一態様において、ナノ粒子の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％が、単一のナノ粒子として、再構成組成物中に存在する。即ち、ナノ粒子の約５０％、４０％、３０％未満が、二量体化または多量体化（オリゴマー化）されている。
幾つかの実施形態において、組成物中のナノ粒子は、数値で２０％未満の二量体、数値で１０％未満の二量体、そして好ましくは５％未満の二量体を有する。
幾つかの実施形態において、ナノ粒子の粒子径は、キャリアタンパク質の結合剤に対する量（例えば、比）を調整することにより制御することができる。ナノ粒子の粒子径および粒度分布も、重要である。本発明のナノ粒子は、それらの粒子径により異なるように挙動し得る。大きな粒子径では、凝集が、血管を遮断し得る。それゆえ、ナノ粒子の凝集は、組成物の性能および安全性に影響を及ぼし得る。その一方で、より大きな粒子は、特定の条件下で（例えば、静脈内投与されない場合）はより治療的であり得る。
一態様において、ナノ粒子組成物は、少なくとも１種のさらなる治療薬を含む。一実施形態において、少なくとも１種のさらなる治療薬は、ナノ粒子の外部表面に非共有結合的に結合されている。一実施形態において、少なくとも１種のさらなる治療薬は、ナノ粒子の外部表面に配置されている。一実施形態において、少なくとも１種のさらなる治療薬は、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシウレア、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチンおよびシクロホスファミドからなる群から選択される。一実施形態において、少なくとも１種のさらなる治療薬は、抗癌結合剤、例えば抗癌抗体である。
ナノ粒子を作製する方法
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に記載されるナノ粒子組成物を製造する方法に関する。
一態様において、ナノ粒子組成物のナノ粒子は、キャリアタンパク質粒子またはキャリアタンパク質－治療薬粒子の結合剤に対する比が約１０：１～約１０：３０で、キャリアタンパク質またはキャリアタンパク質－治療薬粒子を結合剤と接触させることにより形成する。一実施形態において、比は、約１０：２～約１０：２５である。一実施形態において、比は、約１０：２～約１：１である。好ましい実施形態において、比は、約１０：２～約１０：６である。特に好ましい実施形態において、比は、約１０：４である。企図される比は、端点を含む列挙された範囲のいずれかに含まれる任意の値、部分範囲または範囲を包含する。
一実施形態において、ナノ粒子を形成するために用いられる溶液または他の液体媒体の量は、特に重要である。キャリアタンパク質（またはキャリアタンパク質－治療薬）および抗体の過度に希薄な溶液中では、ナノ粒子は形成されない。過度に濃縮された溶液では、構造化されていない凝集物を生じる。幾つかの実施形態において、用いられる溶液（例えば、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水）の量は、約０．５ｍＬの溶液～約２０ｍＬの溶液である。幾つかの実施形態において、キャリアタンパク質の量は、約１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、結合剤の量は約１ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬである。例えば、幾つかの実施形態において、キャリアタンパク質：結合剤：溶液の比は、およそ９ｍｇのキャリアタンパク質（例えば、アルブミン）：４ｍｇの結合剤、例えば抗体（例えば、ＢＥＶ）：１ｍＬの溶液（例えば、生理食塩水）である。ある量の治療薬（例えば、Ｔａｘｏｌ）を、キャリアタンパク質に添加することもできる。例えば、１ｍｇのＴａｘｏｌを、９ｍｇのキャリアタンパク質（１０ｍｇのキャリアタンパク質－治療薬）：４ｍｇの結合剤、例えば抗体、Ｆｃ融合分子、またはアプタマー：１ｍＬの溶液に添加することもできる。典型的な静注バッグを用いる場合に、例えばおよそ１リットルの溶液では、１ｍＬで使用する場合と比較して１０００倍量のキャリアタンパク質／キャリアタンパク質－治療薬および抗体を使用する必要がある。したがって、標準的な静注バッグの中では本発明のナノ粒子を形成することができない。さらに、それらの成分を、本発明の治療量で標準的な静注バッグに添加しても、それらの成分は、自己集合してナノ粒子を形成することはない。
一実施形態において、キャリアタンパク質またはキャリアタンパク質－治療薬粒子を、ｐＨ約４～約８の溶液中で結合剤と接触させる。一実施形態において、キャリアタンパク質またはキャリアタンパク質－治療薬粒子を、ｐＨ約４の溶液中で結合剤と接触させる。一実施形態において、キャリアタンパク質またはキャリアタンパク質－治療薬粒子を、ｐＨ約５の溶液中で結合剤と接触させる。一実施形態において、キャリアタンパク質またはキャリアタンパク質－治療薬粒子を、ｐＨ約６の溶液中で結合剤と接触させる。一実施形態において、ｐＨ約７の溶液中でキャリアタンパク質またはキャリアタンパク質－治療薬粒子を結合剤と接触させる。一実施形態において、キャリアタンパク質またはキャリアタンパク質－治療薬粒子を、ｐＨ約８の溶液中で結合剤と接触させる。好ましい実施形態において、キャリアタンパク質またはキャリアタンパク質－治療薬粒子を、ｐＨ約５～約７の溶液中で結合剤と接触させる。
一実施形態において、キャリアタンパク質粒子またはキャリアタンパク質－治療薬粒子を、約５℃～約６０℃の温度、または任意の範囲、部分範囲もしくは端点を含むその範囲に含まれる値の温度で結合剤と共にインキュベートする。好ましい実施形態において、キャリアタンパク質粒子またはキャリアタンパク質－治療薬粒子を、約２３℃～約６０℃の温度で結合剤と共にインキュベートする。
理論に束縛されるものはないが、ナノ粒子組成物におけるナノ粒子の安定性は、少なくとも部分的に、ナノ粒子が形成される温度および／またはｐＨ、ならびに溶液中の成分（即ち、キャリアタンパク質、結合剤、および任意選択で治療薬）の濃度に依存すると考えられる。一実施形態において、ナノ粒子のＫｄは、約１×１０－１１Ｍ～約２×１０－５Ｍである。一実施形態において、ナノ粒子のＫｄは、約１×１０－１１Ｍ～約２×１０－８Ｍである。一実施形態において、ナノ粒子のＫｄは、約１×１０－１１Ｍ～約７×１０－９Ｍである。好ましい実施形態において、ナノ粒子のＫｄは、約１×１０－１１Ｍ～約３×１０－８Ｍである。企図される値は、端点を含む列挙された範囲のいずれかに含まれる任意の値、部分範囲または範囲を包含する。
凍結乾燥
本発明の凍結乾燥組成物は、安定化剤、緩衝液などの存在下または非存在下で、標準的な凍結乾燥技術により調製される。驚くべきことに、これらの条件は、ナノ粒子の比較的脆弱な構造を改変しない。さらに、少なくともこれらのナノ粒子は、凍結乾燥の際にそれらの粒度分布を保持し、さらに重要なこととして新たに作製された場合と実質的に同じ形態および比でインビボ投与（例えば、静脈内送達）のために再構成することができる。
製剤
一態様において、ナノ粒子組成物は、全身送達、例えば静脈内投与のために処方される。
一態様において、ナノ粒子組成物は、腫瘍への直接注射用に処方される。直接注射としては、腫瘍部位内またはその付近への注射および腫瘍への灌流などが挙げられる。ナノ粒子組成物は、全身に投与されないため、腫瘍への直接注射用に処方されたナノ粒子組成物は、任意の平均粒子径を含み得る。理論により束縛されるものではないが、より大きな粒子（例えば、５００ｎｍ超、１μｍ超など）は、腫瘍内に固定化される可能性がより高く、それにより良好な有益な効果が得られると考えられる。
別の態様において、本明細書において、本明細書で提供される化合物と、少なくとも１種の医学的に許容し得る賦形剤と、を含む組成物が提供される。
一般に、本明細書に示された化合物は、許容される投与様式のいずれかにより患者に投与するように処方することができる。様々な製剤および薬物送達システムが、当該技術分野において入手可能である。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ， Ａ．Ｒ．， ｅｄ． （１９９５） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏを参照されたい。
一般に、本明細書に示された化合物は、医薬組成物として、以下の経路：経口、全身（例えば、経皮、鼻腔内または坐剤）、または非経口（例えば、筋肉内、静脈内または皮下）投与、のいずれか１つにより投与される。
組成物は一般に、少なくとも１種の医学的に許容し得る賦形剤と組み合わせた本発明の化合物で構成される。許容され得る賦形剤は、非毒性であり、投与を支援し、かつ特許請求された化合物の治療利益に有害な影響を与えない。そのような賦形剤は、一般に当業者に入手可能な任意の固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合は気体状の賦形剤であり得る。
固体の医薬品賦形剤としては、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム乾燥スキムミルクなどが挙げられる。液体および半固体賦形剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールおよび様々な油、例えば石油、動物、植物または合成由来の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などから選択され得る。特に注射溶液のための好ましい液体キャリアとしては、水、生理食塩水、水性デキストロースおよびグリコールが挙げられる。他の適切な医薬品賦形剤およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １８ｔｈ ｅｄ．， １９９０）に記載されている。
本発明の組成物は、望ましければ、有効成分を含む１つまたは複数の単位投与剤形を含むパックまたはディスペンサーデバイス中に存在し得る。そのようなパックまたはデバイスは、例えば、金属もしくはプラスチック箔、例えばブリスターパック、またはバイアルなどのガラスおよびゴム栓を含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスに、投与のための説明書を添付してもよい。適合可能な医薬キャリア中で処方された本発明の化合物を含む組成物を調製し、適当な容器に入れ、指示された条件の処置に関するラベルを貼付してもよい。
処置方法
本明細書に記載されたナノ粒子組成物は、哺乳動物における癌細胞および／または腫瘍の処置において有用である。好ましい実施形態において、哺乳動物は、ヒト（即ち、ヒトの患者）である。好ましくは、凍結乾燥ナノ粒子組成物は、投与前に再構成される（水性賦形剤に懸濁される）。
一態様において、癌細胞を処置する方法であって、細胞を本明細書に記載されたナノ粒子組成物の有効量と接触させて、癌細胞を処置することを含む、方法が提供される。癌細胞の処置としては、増殖の低減、細胞の死滅、細胞の転移の予防などが挙げられるが、これらに限定されない。
一態様において、必要とする患者において腫瘍を処置する方法であって、本明細書に記載されたナノ粒子組成物の治療有効量を患者に投与して腫瘍を処置することを含む、方法が提供される。一実施形態において、腫瘍のサイズは、低減される。一実施形態において、腫瘍サイズは、少なくとも処置中および／または処置後の期間に増加（即ち、進行）しない。
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、静脈内に投与される。一実施形態において、ナノ粒子組成物は、腫瘍に直接投与される。一実施形態において、ナノ粒子組成物は、直接注射または腫瘍への灌流により投与する。
一実施形態において、方法は、
ａ）ナノ粒子組成物を３週間にわたって週１回投与すること、
ｂ）ナノ粒子組成物の投与を１週間中止すること、ならびに
ｃ）任意選択で、必要に応じて工程ａ）およびｂ）を繰り返して腫瘍を治療すること
を含む。
一実施形態において、本明細書に記載されたナノ粒子の治療有効量は、約１ｍｇ／ｍ２～約２００ｍｇ／ｍ２の抗体、約２ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２、約５ｍｇ／ｍ２～約１００ｍｇ／ｍ２、約１０ｍｇ／ｍ２～約８５ｍｇ／ｍ２、約１５ｍｇ／ｍ２～約７５ｍｇ／ｍ２、約２０ｍｇ／ｍ２～約６５ｍｇ／ｍ２、約２５ｍｇ／ｍ２～約５５ｍｇ／ｍ２、約３０ｍｇ／ｍ２～約４５ｍｇ／ｍ２、または約３５ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２の抗体を含む。他の実施形態において、治療有効量は、約２０ｍｇ／ｍ２～約９０ｍｇ／ｍ２の抗体を含む。一実施形態において、治療有効量は、約３０ｍｇ／ｍ２～約７０ｍｇ／ｍ２の抗体を含む。一実施形態において、本明細書に記載されたナノ粒子の治療有効量は、約５０ｍｇ／ｍ２～約２００ｍｇ／ｍ２のキャリアタンパク質、またはキャリアタンパク質と治療薬を含む。好ましい実施形態において、治療有効量は、約７５ｍｇ／ｍ２～約１７５ｍｇ／ｍ２のキャリアタンパク質、またはキャリアタンパク質と治療薬を含む。企図される値は、端点を含む列挙された範囲のいずれかに含まれる任意の値、部分範囲または範囲を包含する。
一実施形態において、治療有効量は、約２０ｍｇ／ｍ２～約９０ｍｇ／ｍ２の結合剤、例えば抗体、アプタマーまたはＦｃ融合物を含む。好ましい実施形態において、治療有効量は、３０ｍｇ／ｍ２～約７０ｍｇ／ｍ２の結合剤、例えば抗体、アプタマーまたはＦｃ融合物を含む。企図される値は、端点を含む列挙された範囲のいずれかに含まれる任意の値、部分範囲または範囲を包含する。
本明細書に記載された組成物および方法によって処置され得る癌または腫瘍としては、胆道癌；膠芽腫および髄芽腫などの脳癌；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性および骨髄性白血病などの血液腫瘍；多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；ボーエン病およびパジェット病などの上皮内腫瘍；肝臓癌（肝細胞癌）；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫などのリンパ腫；神経芽細胞腫；扁平上皮癌などの口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じる癌などの卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫などの肉腫；黒色腫、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮癌などの皮膚癌；胚腫瘍（精上皮腫、非精上皮腫［奇形腫、絨毛癌］）、間質性腫瘍および胚細胞腫瘍などの精巣癌；甲状腺腺癌および髄様癌などの甲状腺癌；ならびに腺癌およびウィルムス腫瘍などの腎臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。重要な実施形態において、癌または腫瘍として、乳癌、リンパ腫、多発性骨髄腫および黒色腫が挙げられる。
一般に、本発明の化合物は、類似の有用性を与える薬剤の許容される投与様式のいずれかにより治療有効量で投与される。本発明の化合物、即ちナノ粒子の実際の量は、処置される疾患の重症度、対象の年齢および相対的健康状態、使用される化合物の効力、投与経路および形態、ならびに当業者に周知の他の要因などの数多くの要因に依存する。
そのような薬剤の有効量は、最も有効かつ簡便な投与経路および最も適当な製剤と同様に、日常的な実験法により容易に決定することができる。様々な製剤および薬物送達システムが、当該技術分野で入手可能である。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ， Ａ．Ｒ．， ｅｄ．（１９９５） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄ Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．を参照されたい。
薬剤、例えば本発明の化合物の有効量または治療有効量もしくは用量は、対象において症状の改善または生存期間の延長をもたらす薬剤または化合物のそのような量を指す。そのような分子の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定することにより、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果の治療効果に対する用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す薬剤が、好ましい。
有効量または治療有効量は、研究者、獣医、医師または他の臨床医によって求められる、組織、システム、動物またはヒトの生物学的または医学的反応を誘発する化合物または医薬組成物の量である。投薬量は、用いられる投与剤形および／または利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。厳密な製剤、投与経路、投薬量および投薬間隔は、対象の状態の詳細を考慮して当技術分野で公知の方法に従って選択されなければならない。
所望の効果を実現するのに十分な活性部分の血漿中レベル、即ち最小有効濃度（ＭＥＣ）を得るために、投薬量および投薬間隔を個々に調整することができる。ＭＥＣは、各化合物で異なるが、例えばインビトロデータおよび動物実験から推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個々の特徴および投与経路に依存する。局所投与または選択的取込みの場合、薬物の有効な局所濃度は血漿中濃度と関連しない。
実施例
本開示を、コアとしてのアルブミン結合パクリタキセル（即ち、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））またはシスプラチンと、抗体としてのベバシズマブ（即ち、Ａｖａｓｔｉｎｅ（登録商標））またはリツキシマブ（即ち、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））と、で構成されたナノ粒子を用いて例示する。
当業者は、実施例のナノ粒子の製造および使用が単に例示を目的とするものであり、本開示がこの例示によって限定されないことを、理解するであろう。
本明細書で用いられる任意の略語は、通常の科学的意味を有する。他に断りがなければ、温度は全て℃である。本明細書では、以下の用語は、他に定義されない限り以下の意味を有する。
Figure 0007133050000013
実施例１：ナノ粒子の調製
ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢＸ）（１０ｍｇ）をベバシズマブ（ＢＥＶ）（他に明記されない限り４ｍｇ［１６０μｌ］）に懸濁させ、０．９％生理食塩水８４０μｌを添加して、それぞれＡＢＸおよびＢＥＶの最終濃度１０ｍｇ／ｍｌおよび２ｍｇ／ｍＬを得た。混合物を室温（または指示された温度）で３０分間インキュベートして粒子を形成させた。ＡＢＸ：ＢＥＶ複合体の粒子径を測定するＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ実験のために、ＡＢＸ １０ｍｇを０～２５ｍｇ／ｍｌ濃度のＢＥＶに懸濁させた。類似の条件下で、ＡＢＸとリツキシマブ（０～１０ｍｇ／ｍｌ）またはトラスツズマブ（０～２２ｍｇ／ｍｌ）との複合体を形成させた。
ヒトでの使用のために、２５ｍｇ／ｍＬ ＢＥＶを含む４ｍＬバイアルを投与適当数だけ得て、各バイアルを以下の指示に従って４ｍｇ／ｍＬに希釈することにより、ＡＢＸ：ＢＥＶ複合体を調製し得る。１０ｍｇ／ｍＬ ＡＢＸナノ粒子を含む最終濃度に再構成することにより、１００ｍｇのＡＢＸを含む投与適当数のバイアルを調製することができる。滅菌３ｍＬシリンジを用いて、ベバシズマブ１．６ｍＬ（４０ｍｇ）（２５ｍｇ／ｍＬ）を抜き取り、最低１分間かけてＡＢＸ １００ｍｇを含む各バイアルの内壁に緩やかに注入した。泡が生じるため、ベバシズマブ溶液を凍結乾燥ケークの上に直接注入してはならない。その後、１２ｍＬ滅菌シリンジを用いて、０．９％塩化ナトリウム注射液（ＵＳＰ）８．４ｍＬを抜き取り、８．４ｍＬを、ＡＢＸ １００ｍｇおよびＢＥＶ ４０ｍｇを含む各バイアルの内壁に最低１分間かけて緩やかに注入することができる。ＢＥＶ１．６ｍＬおよび０．９％塩化ナトリウム注射液（ＵＳＰ）８．４ｍＬの添加の完了後、任意のケーク／粉末の完全溶解が生じるまで、各バイアルを少なくとも２分間穏やかに回転および／または上下させることができる。泡の生成を回避しなければならない。この時点で、各バイアルの濃度は、１００ｍｇ／１０ｍＬのＡＢＸおよび４０ｍｇ／１０ｍＬのＢＥＶでなければならない。ＡＢＸおよびＢＥＶを含むバイアルを６０分間放置しなければならない。バイアル（複数可）を１０分ごとに穏やかに回転および／または上下させて、複合体を混合し続けなければならない。６０分が経過した後、計算したＡＢＸおよびＢＥＶの投与体積を、各バイアルから抜き取って空のＶＩＡＦＬＥＸ静注バッグに緩やかに添加しなければならない。その後、等量の０．９％塩化ナトリウム注射液（ＵＳＰ）を添加して、５ｍｇ／ｍＬ ＡＢＸおよび２ｍｇ／ｍＬ ＢＥＶの最終濃度となるようにする。その後、この静注バッグを１分間穏やかに回転および／または上下させて混合しなければならない。ＡＢＸ：ＢＥＶナノ粒子は、最終希釈後に室温で最長４時間、貯蔵することができる。
実施例２：インビトロでのＡＢＸおよびＢＥＶの結合
ＡＢＸおよびＢＥＶが相互作用するか否かを判定するために、実施例１で形成されたナノ粒子を、フローサイトメトリーおよび電子顕微鏡法により分析した。
方法
フローサイトメトリー：上記実施例１に記載された通り、ＡＢ１６０を生成させた。ＢＥＶのＡＢＸへの結合を決定するために、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ、ニュージャージー州フランクリンレイクス所在）でＡＢ１６０の可視化を行い、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ソフトウェアを用いてデータ解析を行った。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａｂｅａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）５μｇをストレプトアビジン－ＰＥ（Ａｂｅａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）５μｇで標識した。ＢＥＶのＦａｂ部分がマウス由来であるという理由から、ＡＢ１６０を標識するためにヤギ抗マウスＩｇＧを選択した。ＡＢＸおよびＡＢ１６０をＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に３０分間室温でインキュベートし、洗浄して、フローサイトメトリーにより可視化した。
電子顕微鏡法：６ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに溶解したＡＢＸ ５μｌを、３００メッシュのパーロディアン（ｐａｒｌｏｄｉａｎ）－炭素コーティング銅グリッドに添加し、１分間放置した。濾紙片の尖った先端を液滴と接触させて、過剰な液体を除去し、グリッド上に薄膜を得た。グリッドを乾燥させた。乾燥させたグリッド上に残った緩衝液結晶を溶解するために、試料をｄＨ２Ｏ中で３回洗浄した。１％リンタングステン酸（ＰＴＡ）の小滴（ｐＨ７．２）を、グリッドに添加した。その後、グリッドを濾紙片の尖った先端に再度接触させて過剰な液体を除去し、グリッド上に薄膜を得、乾燥させた。０．９％塩化ナトリウム溶液中の２５ｍｇ／ｍｌのＢＥＶ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、１：１０の比でＰＢＳで希釈した。ＢＥＶ ５μｌをニッケルホルムバール・コーティンググリッド上に加えて、３０分～１時間風乾させた。ＡＢ１６０では、ＰＢＳに溶解した１０ｍｇ／ｍｌのＡＢＸおよび０．９％塩化ナトリウム溶液に溶解した４ｍｇ／ｍｌのＢＥＶを、２．５：１の比で混合した。複合体をＰＢＳで１：５にさらに希釈した。複合体５μｌをニッケルホルムバール・コーティンググリッド上に載せ、３０分～１時間風乾させた。両試料を６ｎｍの金コンジュゲート粒子（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にヤギ抗マウスＩｇＧ中で１時間インキュベートし、１０％ＦＣＢ／ＰＢＳで１：３０に希釈し、ＰＢＳで６回（それぞれ２分）、ｄＨ２Ｏで６回洗浄し、その後２％メチルセルロースと４％ＵＡ（９：１）の混合物で５分間染色した。濾紙を使用して染色を流し出し、グリッドを１時間風乾させた。両試料をロバ抗マウスＩｇＧ中で６ｎｍの金コンジュゲート粒子（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に一晩インキュベートし、１０％ＦＣＢ／ＰＢＳで１：２５に希釈し、ＰＢＳで６回（それぞれ２分）、ｄＨ２Ｏ水で６回洗浄し、１％ＰＴＡで５分間染色し、風乾させ、２％メチルセルロースで覆い、１時間風乾させた。ＪＥＯＬ１４００を８０ＫＶで作動させて、顕微鏡写真を撮影した。
結果
インビトロでＡＢＸ（１０ｍｇ／ｍｌ）を４ｍｇ／ｍｌのＢＥＶと共にインキュベートし、それらが１６０ｎｍのナノ粒子（本明細書ではＡＢ１６０と称する）を形成することを見い出した。ＩｇＧ１（ＢＥＶ）のＦａｂ部分はマウス由来であるため、ＢＥＶを含む粒子を精製ヤギ抗マウスＩｇＧで選択的に標識し、その後二次抗体としての抗ヤギＰＥで標識した。陰性対照として、試料を抗ヤギＰＥのみで染色した。粒子をフローサイトメトリーにより可視化し、抗マウスＩｇＧ１がＡＢＸ単独（６．７％陽性）と比較してＡＢ１６０（４１．２％陽性）に結合することを示す明るいシグナルが証明された（図１Ａ）。ＢＥＶのＡＢＸへの結合を確証するために、ＢＥＶを金標識マウス抗ヒトＩｇＧで標識し、粒子を電子顕微鏡法で可視化した（図１Ｂ）。驚くべきことに、ＥＭ写真から、ＡＢＸナノ粒子を取り囲むＢＥＶの単層が示唆される。
複合体が分解した際にパクリタキセルがどのタンパク質（アルブミンまたはＢＥＶ）に結合したままであるかを決定するために、ＡＢ１６０を作製し、微粒子（ナノＡＢ１６０）、１００ｋＤ超のタンパク質、および１００ｋＤ未満のタンパク質の画分を回収した。液体クロマトグラフィ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により、各画分中のパクリタキセルを測定した。約７５％のパクリタキセルが微粒子中に残留し、残留パクリタキセルの大部分が１００ｋＤまたはそれ超のタンパク質を含む画分と会合しており（図１Ｃ、上）、微粒子が解離すると、パクリタキセルがＢＥＶ単独またはＢＥＶとアルブミンとのヘテロ二量体に結合することが示唆される。このことは、解離した複合体が抗体と共に化学療法剤を含み、高ＶＥＧＦの腫瘍微小環境になおも移動することを示している。これらの知見を、ＡＢ１６０からの上清のウエスタンブロット分析によって確認し、ＢＥＶおよびパクリタキセルがパクリタキセル－ＢＥＶ－アルブミンタンパク質複合体と一致するサイズであるおよそ２００ｋＤで共局在化することが示された（図１Ｃ、下）。
実施例３：インビトロでのＡＢ１６０の機能
複合体中の２つの主要な要素である抗体およびパクリタキセルが、複合体中に存在している場合にそれらの機能を保持しているという確認を実証した。
方法
インビトロ毒性：Ａ３７５ヒト黒色腫細胞株（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス所在）およびＤａｕｄｉＢ細胞リンパ腫株（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス所在）を、１％ＰＳＧおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞を回収し、１つのウェルあたり０．７５×１０６個の細胞で２４ウェルプレートに播種した。細胞を０～２００μｇ／ｍｌのパクリタキセル濃度でＡＢＸまたはＡＢ１６０に３７℃および５％ＣＯ２で一晩暴露した。増殖を測定するために、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン所在）キットを利用した。手短に述べると、１０ｍＭのＥｄＵをウェルに添加し、細胞およびＡＢＸまたはＡＢ１６０と共に一晩インキュベートした。細胞を１％サポニンで透過処理し、インターカレートしたＥｄＵをＦＩＴＣコンジュゲート抗体で標識した。各処理からのＦＩＴＣ陽性細胞を非処置のＥｄＵ標識細胞の最大増殖で除算することにより、増殖指数を決定した。
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ：ＢＥＶがＡＢＸに結合していても、なおもそのリガンドであるＶＥＧＦに結合することができるか否かを決定するために、標準的なＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス所在）を用いた。ＡＢ１６０を記載の通り調製し、２０００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦをＡＢ１６０複合体またはＡＢＸ単独に添加した。ＶＥＧＦをナノ粒子と共に室温で２時間インキュベートした。懸濁液を６０００ｒｐｍで１５分間回転させ、上清を回収し、遊離ＶＥＧＦをＥＬＩＳＡで測定した。手短に述べると、ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩、捕獲抗体でコーティングした。プレートを洗浄し、ブロックして、標準物質および試料を添加した。洗浄後、検出抗体を添加し、プレートを基質（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス所在）で発色させた。吸光度を、Ｖｅｒｓａｍａｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーヴェール所在）を用いて４５０ｎｍで測定した。０～２０００ｐｇ／ｍｌの標準曲線を用いて、非結合ＶＥＧＦの濃度を決定した。
結果
ＡＢ１６０は、ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５を用いたインビトロ毒性アッセイにおいてＡＢＸ単独と比較して類似の毒性を有し、パクリタキセルがいずれの製剤においても等しく機能することが示唆される（図１Ｄ）。
ＡＢ１６０複合体中のＢＥＶに対するＶＥＧＦの結合を試験するために、ＡＢ１６０またはＡＢＸをＶＥＧＦと共にインキュベートし、微粒子を除去し、上清をＶＥＧＦ含有量について試験した。ＡＢ１６０から測定された上清にＶＥＧＦが存在しなかったこと（１０％未満のＶＥＧＦが非結合）は、ＶＥＧＦがＡＢ１６０複合体中ではＢＥＶに結合しているが、ＡＢＸ単独と共にインキュベートした場合は遊離のままである（８０％超のＶＥＧＦが非結合）ことを示した（図１Ｅ）。
重要なこととして、これらのアッセイにより、ＡＢ１６０中のパクリタキセルが腫瘍細胞に対するその毒性を保持し、結合されたＢＥＶがそのリガンドＶＥＧＦに結合する能力を維持することが実証された。
実施例４：粒子径およびタンパク質の親和性
ＢＥＶがＡＢＸに結合した際に形成されるナノ粒子の特徴を理解するために、ＡＢＸ：ＢＥＶ複合体の粒子径を、ＡＢＸと比較して決定した。
方法
ＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒおよびＮａｎｏｓｉｇｈｔ：ＡＢＸおよび抗体－ＡＢＸ薬物複合体の粒子径を、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州ウエストボロ所在）での動的光散乱により測定した。粒子径を測定するために、２ｍｌ（５ｍｇ／ｍｌ）のＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）または複合体を試料チャンバーに添加した。Ｍａｌｖｅｒｎソフトウェアを用いてデータを解析し、粒度分布を体積で表示した。粒子径および安定性を、後にＮａｎｏｓｉｇｈｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州ウエストボロ所在）を用いて確証した。ＡＢＸまたは複合体粒子を適当な範囲まで希釈して、粒子径を正確に測定した。データを粒度分布で表示した。しかし、ナノ粒子追跡分析ではブラウン運動を利用して、粒子径を決定した。
結合アッセイ：１００μｇ／ｍｌのビオチン化ＢＥＶ、リツキシマブまたはトラスツズマブを、ストレプトアビジンプローブ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カリフォルニア州メンローパーク所在）に結合させた。ＡＢＸの結合を、１０００、５００および１００ｍｇ／ｍｌで、ＢＬＩｔｚシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カリフォルニア州メンローパーク所在）で吸光度により測定した。ＢＬＩｔｚソフトウェアを用いて、結合定数および解離定数を計算した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩｔｚ）技術を利用して、ＡＢＸに対するＢＥＶの結合親和性を評価した。ビオチン化ＢＥＶをストレプトアビジンプローブに結合させ、ＡＢＸ（１０００、５００および１００μｇ／ｍｌ）に暴露した。ＢＥＶおよびＡＢＸの解離定数（Ｋｄ）は、室温およびｐＨ７では２．２×１０－８Ｍであり、強い非共有結合性相互作用と一致する。ＢＥＶおよびＡＢＸの結合親和性は、アルブミンと、幾つかの細菌タンパク質の天然もしくは遺伝子操作されたアルブミン結合ドメインとの間で観察される解離定数の範囲内である。Ｎｉｌｖｅｂｒａｎｔ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ ６：ｅ２０１３０３００９。
結果
ＡＢＸ：ＢＥＶナノ粒子は、一貫して１３０ｎｍのＡＢＸ単独よりも大きかった（およそ１６０ｎｍ）（図２Ａ）。形成されたナノ粒子の粒子径は、使用したＢＥＶの濃度と直接相関しており、粒子径の中央値は０．１５７～２．１６６μｍの範囲内であった（図２Ａ）。これらの研究の目標は第１相臨床試験であることから、最小のＡＢＸ：ＢＥＶ粒子（ＡＢ１６０）が１３０ｎｍのＡＢＸに最も類似しているため、それに焦点を合わせた。ＡＢ１６０粒子の粒子径は、ＡＢＸ＋それを取り囲む単層のＢＥＶと一致し、そして粒子のＥＭ画像と一致した（図１Ｂを参照）。
静脈内投与条件が、ナノ粒子の粒度分布に影響を与えるか否かを決定するために、室温の生理食塩水中で最長２４時間インキュベートしたＡＢ１６０（またはＡＢＸ）の粒度分布を評価した。ＡＢ１６０の粒度分布は、２４時間まで有意に変化しない（図９Ａおよび図９Ｂ）。しかし、室温で４時間後までの間に、ＥＬＩＳＡにより、ＡＢ１６０の分解を示す幾つかの証拠が認められる（図９Ｃ）。
血漿中でのＡＢ１６０の安定性を決定するために、ＡＢＸまたはＡＢ１６０を、生理食塩水またはヘパリン添加ヒト血漿中、９：１または１：１の相対体積比でインキュベートした。注目すべきこととして、ＡＢＸ（図１０、上のパネル）またはＡＢ１６０（図１０、下のパネル）のいずれかを等体積（１：１）で血清中でインキュベートした場合には、粒子（０．０１～１μｍ）は検出されなかった。
ウエスタンブロット（データは示さず）から、生理食塩水またはヘパリン添加ヒト血漿中で、ＡＢ１６０が腫瘍標的化抗体、アルブミンおよび細胞毒性薬パクリタキセルを依然として含むより小さいタンパク質コンジュゲートに解離することが示された。これらのタンパク質コンジュゲートは、腫瘍を標的化する能力を保持し、腫瘍部位に送達されると、急速に溶解して細胞毒性ペイロードを放出し、腫瘍細胞によってナノ粒子全体がインターナライズされなくとも腫瘍の退縮を有効に開始することが可能である。
次に、結合親和性がｐＨおよび／または温度依存性であるか否かを試験するために、ＡＢＸをＢＥＶに懸濁させ、その混合物を３、５、７または９のｐＨの生理食塩水で希釈した後、様々な温度（室温、３７℃および５８℃）でインキュベートして、粒子を形成させた。ＡＢＸおよびＢＥＶの結合親和性は、ｐＨおよび温度の両方に依存性であり、ｐＨ５および５８℃で粒子を形成した際に最も高い結合親和性が観察された（図２Ｂ）。
５８℃およびｐＨ５でのＢＥＶおよびＡＢＸのより高い親和性結合が複合体の安定性に置き換えられるか否かを判定するために、様々な調製物をナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）で比較した。ヒトＡＢ血清中で０、１５、３０または６０分間インキュベートした後、５８℃およびｐＨ５（ＡＢ１６００５５８）、室温およびｐＨ７（ＡＢ１６００７）、または５８℃およびｐＨ７（ＡＢ１６００７５８）で調製されたＡＢ１６０の安定性を、同じ条件に暴露されたＡＢＸ（それぞれＡＢＸ０５５８、ＡＢＸ０７およびＡＢＸ０７５８）と比較した。
ヒトＡＢ血清への暴露後にＡＢＸ １ｍｇあたりに存在する粒子の数によって示される通り、より高い親和性条件（ｐＨ７および５８℃）下で作製された粒子もまた、より安定であった。ＡＢ１６０粒子は、それらの結合親和性と相関するヒト血清中での安定性の上昇を示した。特に、ＡＢ１６００７およびＡＢ１６００５５８は、ＡＢＸ １ｍｇあたりで測定した粒子の粒子径および数によって決定すると、ＡＢＸ単独よりも生理食塩水およびヒト血清中の両方において安定であった（図２Ｃおよび表３）。このことは、ＡＢ１６０粒子を形成する条件を変動させることにより、ＡＢ１６０粒子の安定性を操作することができることを示している。
Figure 0007133050000014
粒子／ＡＢＸ １ｍｇ×１０－８
これらのデータにより、強い非共有結合を示すピコモル範囲の親和性でＢＥＶがＡＢＸに結合することが実証され、かつ抗体分子の単層によって取り囲まれたＡＢＸと一致する粒度分布、即ち形成された粒子の粒子径が抗体濃度に依存することが実証された。
実施例５：マウスにおけるＡＢ１６０の有効性
胸腺欠損ヌードマウスに移植されたＡ３７５ヒト黒色腫細胞の異種移植モデルを用いて、インビボでのＡＢ１６０の有効性を試験した。
方法
インビボ実験を、少なくとも２回実施した。検定力分析により、この実験に必要なマウスの数を決定した。マウスの腫瘍を週に２～３回測定し、腫瘍が体重の１０％になればマウスを屠殺した。腫瘍の完全奏功を有したマウスを、処置後６０～８０日間モニタリングした。マウス試験の評価項目は、生存率中央値であった。カプラン・マイヤー曲線を作成し、マンテル・コックス検定を実施して、処置群間の生存率中央値の有意性を決定した。表されたインビトロの結果は、少なくとも５回の反復実験の代表である。スチューデントｔ検定を用いて、ベースライン実験からのインビトロおよびインビボ変化率の統計分析を実施した。
マウスモデル：腫瘍の有効性を試験するために、１×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を、胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、インディアナ州インディアナポリス所在）の右脇腹に移植した。腫瘍が約７００ｍｍ３のサイズに達すると、マウスを無作為化し、ＰＢＳ、ＡＢＸ（３０ｍｇ／ｋｇ）、ＢＥＶ（１２ｍｇ／ｋｇ）、ＢＥＶ後にＡＢＸ、またはＡＢ１６０の上記濃度で処置した。より大きなＡＢ粒子を試験するマウス実験では、より大きな粒子を形成するのに必要な最高用量のＢＥＶ（４５ｍｇ／ｋｇ）を、ＢＥＶ単独処置群で使用した。腫瘍サイズを週に３回／モニタリングし、腫瘍体積を、以下の式：（長さ×幅２）／２で計算した。腫瘍サイズがマウス体重の１０％または約２５００ｍｍ３と等しくなれば、マウスを屠殺した。ベースラインから７日目の変化率を、以下の式：［（処置日の腫瘍サイズ－７日目の腫瘍サイズ）／処置日の腫瘍サイズ］×１００により計算した。ＡＲ１６０のインビボ試験は、５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞を胸腺欠損ヌードマウスの右脇腹に注射したこと以外は同様であった。
結果
ＡＢ１６０を、ＰＢＳ、単剤単独および連続投与された薬物と比較して試験した。処置後７日目に、ＡＢ１６０で処置したマウスでは、全ての他の処置群と比較してベースラインと比較して腫瘍サイズが有意に低減された（ｐ＝０．０００１～０．００８９）（図３Ａ）。ＡＢ１６０で処置した全てのマウスにおいて、７日目に腫瘍が退縮し、この腫瘍反応は、全ての他の群と比較してＡＢ１６０群の生存率中央値の有意な増加に置き換えられ（図３Ｂ）、ＰＢＳ（ｐ＜０．０００１）、ＢＥＶ（ｐ＝０．００３）、ＡＢＸ（ｐ＝０．０００３）、ＢＥＶ＋ＡＢＸ（ｐ＝０．０００６）およびＡＢ１６０群でそれぞれ、７、１４、１４、１８および３３日間の生存であった。
腫瘍が大きいほど、高い局所ＶＥＧＦ濃度を有する可能性が高い。処置日の腫瘍サイズ（７００ｍｍ３未満および７００ｍｍ３より大きい）に基づいてデータを解析すると、大きな腫瘍ほどＡＢ１６０に対してより大きな反応を有することが示されており、高い腫瘍ＶＥＧＦ濃度が、腫瘍により多くのＢＥＶ標的化ＡＢＸを誘引することが示唆される。ベースラインからの変化率の差は、ＡＢ１６０群では有意であった（ｐ＝０．００５７）。この観察は、ＡＢＸ単独群（ｐ＝０．７５２）では認められず、ＡＢＸは標的化能力を有さない（図３Ｃ）。
図２Ａに示される通り、増加するＢＥＶ：ＡＢＸ比を用いて、増加する粒子径を有する粒子を調製した。腫瘍退縮および生存率中央値は、粒子径の増加と正の相関性があり、より大きな粒子の生体内分布がより小さい粒子と比べて変化し得ることが示される（図３Ｄおよび図３Ｅ）。マウスに対して完全な毒性試験を実施したが、毒性は認められなかった。
実施例６：マウスにおけるパクリタキセルの薬物動態
ＡＢ１６０およびＡＢＸの薬物動態（ｐｋ）を比較するために、ＡＢ１６０またはＡＢＸを投与したマウスにおいて、０、４、８、１２および２４時間後の血漿パクリタキセル濃度を測定した。
方法
パクリタキセルの薬物動態：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８分析カラム（２．１×１００ｍｍ、２．７μｍ、Ｃｈｒｏｍ Ｔｅｃｈ、ミネソタ州アップルバレー所在）に取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８プレカラム（２．１×５ｍｍ、２．７μｍ、Ｃｈｒｏｍ Ｔｅｃｈ、ミネソタ州アップルバレー所在）を用いて、４０℃で（Ａ）０．１％ギ酸を含む水と、（Ｂ）０．１％ギ酸を含むＡＣＮと、で構成された勾配移動相を用いる０．５ｍｌ／分の一定の流速での溶離により、パクリタキセルおよびｄ５パクリタキセルの液体クロマトグラフ分離を行った。溶離を０．５分間の６０％のＡおよび４０％のＢで開始し、その後、Ｂを４．５分間かけて４０％から８５％に直線的に増加させ、８５％のＢを０．２分間維持して、１．３分間最初の条件に戻した。オートサンプラー温度は１０℃であり、試料注入体積は２μｌであった。ＥＳＩポジティブモードの質量分析計を用い、１．７５ｋＶのキャピラリー電圧、１５０℃のソース温度、５００℃の脱溶媒和温度、１５０Ｌ／ｈｒのコーンガス流速、１０００Ｌ／ｈｒの脱溶媒和ガス流速を用い、０．０７５秒間のデータ取込時間を有する多重反応モニタリング（ＭＲＭ）スキャンモードを用いて、パクリタキセルおよび内部標準ｄ５－パクリタキセルの検出を行った。ＭａｓｓＬｙｎｘ－Ｉｎｔｅｌｌｉｓｔａｒｔ（ｖ４．１）ソフトウェアにより、コーン電圧および衝突エネルギーを決定し、それぞれ６～１６Ｖおよび１２～６０ｅＶの間で変動した。パクリタキセルに関して８５４．３＞１０５．２、ｄ５パクリタキセルに関して８５９．３＞２９１．２のｍ／ｚで、ＭＲＭ前駆体および生成イオンをモニタリングした。４ｍｌの琥珀色のシラン処理ガラス製バイアル中で、パクリタキセル（ＥｔＯＨ中の１ｍｇ／ｍｌ）およびｄ５パクリタキセル（ＥｔＯＨ中の１ｍｇ／ｍｌ）の一次原液を調製し、－２０℃で貯蔵した。２ｍｌの琥珀色のシラン処理ガラス製バイアル中で原液をＡＣＮで希釈して希釈標準液を調製し、－２０℃で貯蔵した。血漿試料を以下の通り抽出した：１００μｌの血漿試料をｄ５パクリタキセル（１１６．４ｎＭまたは１００ｎｇ／ｍｌ）および３００μｌのＡＣＮを含む１．７ｍｌの微量遠心管に添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、室温で１０分間インキュベートしてタンパク質を沈殿させ、３分間遠心分離（１４，０００ｒｐｍ）した。上清をＡｇｉｌｅｎｔ Ｃａｐｔｉｖａ ＮＤｌｉｐｉｄｓプレート（Ｃｈｒｏｍ Ｔｅｃｈ、ミネソタ州アップルバレー所在）で濾過し、深型９６ウェルプレートに回収して、窒素ガスを用いて乾燥させた。１００μｌのＡＣＮを用いて試料を再構成し、プレートシェーカー（高速）で５分間振盪させた。パクリタキセルの定量化のために、パクリタキセル（０．５９～５８５５ｎＭまたは０．５～５０００ｎｇ／ｍｌ）およびｄ５パクリタキセル（１１６．４ｎＭ）を含む血漿標準曲線を毎日作成した。マウス腫瘍を氷上で解凍し、重量を測り、１×ＰＢＳで２倍（体積に対する重量）希釈した。その後、鋸歯状プローブ（５ｍｍ×７５ｍｍ）を用いるＰＲＯ２００組織ホモジナイザーを用いて、腫瘍をホモジナイズした。その後、ヒトの血漿試料と同様に、腫瘍ホモジネートを処理した。
マウスイメージング：ＡｖａｓｔｉｎｅおよびＩｇＧ対照溶液を調製し、プロトコル（Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってＩ－１２５で標識した。手短に述べると、トリス緩衝液（０．１２５ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．１５ＭのＮａＣｌ）および５ｍＣｉのＮａ１２５Ｉをヨウ素標識管（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム所在）に直接添加した。ヨウ化物を活性化させ、室温で回転させた。活性化されたヨウ化物を、タンパク質溶液と混合した。捕捉緩衝液（ＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍＬのチロシン、ｐＨ７．４）５０μｌを添加し、５分間インキュベートした。Ｔｒｉｓ／ＢＳＡ緩衝液を添加して混合した後、試料を１０Ｋ ＭＷＣＯ透析カセットで、事前に冷却したＰＢＳに対して４℃で３０分間、１時間、２時間および一晩透析した。放射活性をガンマカウンターで決定し、その後、１分間あたりの壊変数（ＤＰＭ）および比活性を計算した。マウスの尾静脈に、ＡｖａｓｔｉｎｅＩ－１２５、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）－ＡＶＡＳＴＩＮＥ（登録商標）Ｉ－１２５、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）－ヒトＩｇＧ Ｉ－１２５またはＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）単独を注射した。投与の３、１０、２４および７２時間後に、Ｕ－ＳＰＥＣＴ－ＩＩ／ＣＴスキャナー（ＭＩＬａｂｓ、オランダのユトレヒト所在）を用いたＳＰＥＣＴ－ＣＴイメージングにより、動物を撮像した。ＰＯＳＥＭ（期待値最大化による画素化順序部分集合）アルゴリズムを用いて、ＳＰＥＣＴ再構成を実施した。フェルドカンプアルゴリズムの間に、ＣＴデータを再構成した。同時登録された画像を、ＰＭＯＤソフトウェア（ＰＭＯＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、スイスのチューリッヒ所在）を用いてさらにレンダリングおよび可視化した。動物を屠殺し、注射の７２時間後に解剖した。選択された目的の組織および臓器を放射性同位体線量キャリブレーター（Ｃａｐｉｎｔｅｃ ＣＲＣ－１２７Ｒ、Ｃａｐｉｎｔｅｃ Ｉｎｃ）を用いて測定した。
結果
第１のｐｋ実験の結果を、図４Ａおよび図４Ｂに提供する。Ａ３７５腫瘍担持マウスおよび非腫瘍担持マウスにおいて、曲線下面積（ＡＵＣ）および最大血清中濃度（Ｃｍａｘ）を計算した。第１のｐｋ実験では、ＡＢ１６０およびＡＢＸのＣｍａｘおよびＡＵＣは、非腫瘍担持マウスにおいて非常に類似していた（それぞれ６３．３＋／－３９．４対６５．５＋／－１４．４および１２９対１３３μｇ／ｍｌ）。しかし、腫瘍担持マウスでは、処置群のＣｍａｘおよびＡＵＣは異なっていた（それぞれ５５．７＋／－２１．２対６３．３＋／－１７．３および１１２対１２８μｇ／ｍｌ）（図４Ｃ）。この差は、統計学的に有意ではなかったが、ＡＢＸと比較してＡＢ１６０による優れた標的化と一致していた。
さらに早い時点、ならびに小さい腫瘍サイズと大きな腫瘍サイズとを比較する、第２のｐｋ実験を行った（図４Ｄ～図４Ｆ）。この実験の結果から、小さい腫瘍のマウスと比較して大きな腫瘍のマウスにおけるパクリタキセルの血中値は最も低く（ＡＢＸで処置した腫瘍を有さないマウス、小さい腫瘍を有するマウス、および大きな腫瘍を有するマウスにおいてそれぞれ８０．４＋／－２．７、４８．４＋／－１２．３および３０．７＋／－５．２、ＡＢ１６０で処置した場合６６．１＋／－１９．８、４４．４＋／－１２．１および２２．８＋／－６．９）、腫瘍を有さないマウスと比べて腫瘍を有するマウスにおけるよる小さいＡＵＣが実証された。同様に、Ｃｍａｘは、より大きな腫瘍を有するマウスでは両処置群において低下した（ＡＢＸでは４７．２、２８．９および１９．７μｇ／ｍｌ、ＡＢ１６０では４０．１、２６．９および１５．３μｇ／ｍｌ）（図４Ｇ）。血中パクリタキセルのＡＵＣおよびＣｍａｘは、ＡＢＸ処置マウスと比較してＡＢ１６０処置マウスにおいてより低かった。統計学的に有意ではないが、このデータはさらに、ＡＢ１６０で処置した腫瘍にパクリタキセルがより多く沈着していることと一致している。
この仮説を直接試験するために、ＬＣ－ＭＳにより腫瘍パクリタキセル濃度を測定した。腫瘍パクリタキセル濃度は、４時間目（３４７３μｇ／ｍｇ組織＋／－３４０対２１２７μｇ／ｍｇ組織＋／－３．５、ｐ＝０．０２）および８時間目（３００５μｇ／ｍｇ組織＋／－１４６対１６８８μｇ／ｍｇ組織＋／－１４６、ｐ＝０．０１）に、ＡＢＸと比べてＡＢ１６０で処置した腫瘍において有意により高くなっており、パクリタキセルが抗体によって標的化された場合に腫瘍中により長く留まることが示唆される（図４Ｈ）。これは、血中のｐｋを説明しており、腫瘍を含む組織への薬物の再分布と一致している。
Ｉ－１２５標識ＡＢ１６０（Ａｂｘ－ＡｖｔＩ１２５）およびＡＢＸ結合ＩｇＧアイソタイプ（Ａｂｘ－ＩｇＧＩ１２５）のインビボライブ撮像により、注射後３時間（３２．２ｕＣｉ／ｇ＋／－９．１対１８．５ｕＣｉ／ｇ＋／－１．６５、ｐ＝０．０６）および１０時間（４１．５ｕＣｉ／ｇ＋／－６．４対２８．７ｕＣｉ／ｇ＋／－２．６６、ｐ＝０．０３）で、ＩｇＧ－ＡＢＸと比較してＡＢ１６０で処置したマウスの腫瘍中により高いレベルのＩ－１２５が存在するＬＣ－ＭＳ結果を確認した（図４Ｉおよび図４Ｊ）。まとめると、これらのデータにより、ＢＥＶがＡＢＸに結合すると、血中のｐｋが変化し、この変化はアイソタイプマッチＩｇＧ１と比較してパクリタキセルのＬＣ－ＭＳおよびＢＥＶのＩ－１２５標識の両方によって示される腫瘍組織への薬物の再分布に起因することが実証される。
理論によって束縛されるものではないが、腫瘍標的化抗体をＡＢＸへ結合させることによりｐｋがＡＢＸ単独よりも劇的に変化し、腫瘍組織へのＡＢ１６０の再分布により血中ＣｍａｘおよびＡＵＣが低下すると考えられる。ＡＢＸ単独と比較したＡＢ１６０処置マウスにおける、マウスの血中パクリタキセルのｐｋ、パクリタキセルの腫瘍組織レベル、およびＩ－１２５放射性レベルから得たこれらの結果から、ＡＢＸの抗体標的化がパクリタキセルの生体内分布を改変して、その結果、高レベルのパクリタキセルが腫瘍に到達してそこにより長期間保持され、それにより腫瘍退縮が高められることが示唆される。
実施例７：他の治療抗体の結合
抗ヒトＣＤ２０抗体（リツキシマブ）および抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体抗体（トラスツズマブ）のＡＢＸに対する結合を試験して、エクスビボで組み合わせた場合に他のＩｇＧ治療抗体もＡＢＸに対する結合を示すか否かを決定した。
方法
リツキシマブまたはトラスツズマブを含むナノ粒子を調製し、上記実施例に記載された通り試験した。
結果
ＢＥＶとの複合体およびトラスツズマブ（ＨＥＲ）との複合体の粒子径はどちらも非常に類似であり、それぞれ０．１５７～２．１６６μｍ（図２Ａ）および０．１４８～２．８６８μｍ（図５Ｂ）の範囲の平均粒子径を有した。対照的に、リツキシマブで形成された粒子は、より低い抗体：ＡＢＸ比でかなり大きく、粒子径は０．１５９～８．２８６μｍの範囲であった（図５Ａ）。
リツキシマブおよびトラスツズマブとＡＢＸとの結合親和性を、様々なｐＨの下でＢＬＩｔｚにより決定した。両抗体は、ピコモル範囲内の比較的高い親和性で結合する（図５Ｃ）。リツキシマブのＡＢＸとの親和性は、ｐＨが高いほど低下するが、トラスツズマブのＡＢＸとの親和性は、ｐＨによる影響を受けなかった（図５Ｃ）。
リツキシマブ（ＡＲ１６０）で調製した１６０ｎｍ粒子の有効性を、インビトロおよびインビボで試験した。インビトロで、Ｄａｕｄｉ細胞（Ｂ細胞リンパ腫細胞株）を、パクリタキセルの濃度を増加させて（０～２００μｇ／ｍｌ）、ＡＲ１６０、ＡＢＸまたはリツキシマブ単独で処置した。ＡＲ１６０（ＩＣ５０＝１０μｇ／ｍｌ）は、ＡＢＸ（ＩＣ５０＞２００μｇ／ｍｌ）またはリツキシマブ（ＩＣ５０＞２００μｇ／ｍｌ）単独のいずれかと比較した場合、２４時間処置したＤａｕｄｉ細胞の増殖を有意に阻害した（ｐ＝０．０２４）（図６Ａ）。
インビボでは、Ｄａｕｄｉ細胞の異種移植モデルを、胸腺欠損ヌードマウスにおいて確立した。腫瘍が確立された後、マウスをＰＢＳ、ＡＢＸ、リツキシマブ、ＡＢＸ＋リツキシマブの連続投与、またはＡＲ１６０で処置した。処置後７日目に腫瘍を測定し、ベースラインからの腫瘍サイズの変化率を計算した。ＡＲ１６０で処置した腫瘍は退縮したか、または安定したままであったが、他の全ての処置群の腫瘍は進行した（図６Ｂ）。他の全ての群と比較したＡＲ１６０群におけるベースラインからの腫瘍サイズの変化率は、有意であった（ｐ＜０．０００１）。ＡＲ１６０で処置したマウスは、６０日超の有意に長い生存期間中央値を有したのに対し、ＰＢＳ（ｐ＜０．０００１）、ＡＢＸ（ｐ＜０．０００１）またはリツキシマブ（ｐ＝０．０００２）でそれぞれ処置したマウスでは１２日、１６日および１２日であったた（図６Ｃ）。しかし、生存期間中央値の差は、ＡＲ１６０群と連続処置群の間で有意ではなかった（ｐ＝０．３６）。これは、リツキシマブが腫瘍細胞に結合して細胞表面に残存したままであり、続いて投与されるＡＢＸが、可溶性の標的に結合して細胞表面マーカーに結合しないＢＥＶとは異なり、腫瘍部位に進入する際に抗体に結合することが根拠の可能性がある。
実施例８：ＡＢ１６０に対する他の化学療法剤の結合
機能的ナノ粒子を形成するための他の化学療法剤の有効性を評価した。
方法
シスプラチンを含むナノ粒子を調製し、上記実施例に記載された通り試験した。
結果
別の化学療法剤が、ＡＢ１６０粒子に結合することができるか否かを試験するために、シスプラチンおよびＡＢＸを、共にインキュベートし、上清に残留する遊離シスプラチンの量を、ＨＰＬＣで測定した。シスプラチンのおよそ６０％（即ち、４０％のみが上清に残留する）が、ＡＢＸに結合した（図７Ａ）。
次に、ＡＢＸおよびシスプラチン単独と比較したＡＣの腫瘍毒性を、Ａ３７５細胞を用いて試験した。複合体を遠心分離して、非常に毒性の高い非結合シスプラチンを除去し、培地で再構成させて、ＡＢＸと比較してＡＣの任意のさらなる毒性が確実にＡＢＸ結合シスプラチンのみに起因するようにした。等価となるように、ＡＢＸ単独を、類似の手法で遠心分離した。ＡＣ（ＩＣ５０＝９０μｇ／ｍｌ）はＡＢＸ単独（ＩＣ５０＞１０００μｇ／ｍｌ）よりも大きい程度にＡ３７５細胞の増殖を阻害した（図７Ｂ）。他の毒性実験と比較してこの実験で毒性が減少したことは、遠心分離ステップで薬物が若干失われたことが原因であるが、ＡＢＸとＡＣとの比較は依然として関連性がある。
シスプラチンを含むＡＢ１６０複合体の腫瘍毒性を決定するために、ＡＢ１６０をシスプラチンと共にインキュベートして、シスプラチンを含む粒子（ＡＢＣ複合体）を形成させた。ＡＢＣ複合体を各薬物単独およびＡＢ１６０と比較してＡ３７５黒色腫異種移植モデルにおいて試験した。ＡＢ１６０、ＡＢ１６０＋シスプラチンの連続投与、およびＡＢＣ複合体で処置した腫瘍は全て、処置後７日目に腫瘍サイズの退縮を示した（図７Ｃ）が、ＡＢＣ複合体は、最も長い生存期間中央値（それぞれ２４日および２６日のＡＢ１６０およびＡＢ１６０＋シスプラチンと比較して３５日）が得られた。その差は統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．８２および０．７９）（図７Ｄ）が、データは長期間の生存率に対するＡＢＣ複合体の利点と一致している。
これらのデータにより、ＡＢＸのアルブミン部分が、インビトロおよびインビボで全てＡＢ１６０と類似の有効性を有する、例えばリツキシマブおよびトラスツズマブなどの他の治療抗体ならびに他の化学療法剤（例えば、シスプラチン）が結合するための基盤を提供することが実証された。
まとめると、これらのデータは、複数のタンパク質または細胞毒性薬を単一のアルブミン骨格に結合させることができる汎用性のナノ免疫複合体を構築するための単純な方法を実証する。単剤単独と比較した標的薬物の高い有効性がマウスモデルにおいて実証され、これは少なくとも一部として、抗体－標的化薬物のｐｋの変化に起因する。さらに、理論に束縛されるものではないが、リンカーまたは標的細胞のインターナリゼーションを必要としない本開示のナノ免疫複合体の汎用性により、マウスからの結果をヒトに置き換える際に他のナノ医薬品が直面する障害が克服されると考えられる。
実施例９：ＡＢ１６０の凍結乾燥
ベバシズマブ８ｍｇ（３２０μｌ）をＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）２０ｍｇに添加してＡＢ１６０を合成した。その後、４ｍｇ／ｍｌのベバシズマブおよび１０ｍｇ／ｍｌのＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）の最終濃度になるように、０．９％生理食塩水１．６６ｍＬを添加して最終容量２ｍｌにし、混合物を１５ｍｌポリプロピレン円錐管において室温で３０分間インキュベートした。
室温で３０分間のインキュベート後に、混合物をそれぞれ２ｍｇ／ｍｌおよび５ｍｇ／ｍｌのベバシズマブおよびＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）になるように、０．９％生理食塩水中で１：２に希釈した。これらは、患者に投与するために薬局により調製される２剤の濃度である。
ＡＢ１６０を、１．５ｍｌポリプロピレンエッペンドルフ管中の２００μｌアリコート２０本に分け、－８０℃で凍結した。
凍結後、アリコートを、上部に冷凍部が備えられた３ＬのＶｉｒｔｉｓ卓上凍結乾燥器（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルベニア州ウォーミンスター所在）で一晩凍結乾燥した。凍結乾燥調製物が、作製された。
乾燥したアリコートを同じ１．５ｍｌポリプロピレンエッペンドルフ管中、室温で貯蔵した。これらの試料は、室温の生理食塩水中、３０分間で容易に再構成され、その後２０００×ｇで７分間遠心分離した。その後、得られた試料を、必要に応じて適当な緩衝液に再懸濁させた。
比較のために、熱および高速真空で乾燥した試料は再構成することができなかった。
実施例１０：凍結乾燥調製物の試験
凍結乾燥後の異なる時点で試料を再構成し、ＡＢＸ、新たに作製したＡＢ１６０に対してそれらの物理的特性を試験した。
上記の通り、粒度分布を評価した。
試料をＶＥＧＦと共に室温で２時間インキュベートし、２０００×ｇで７分間遠心分離することにより、ＶＥＧＦ結合を評価した。ペレット（ナノ粒子に対応する）に結合したＶＥＧＦまたは上清に残留するＶＥＧＦの量を、ＥＬＩＳＡで測定した。
インビトロでのＡ３７５細胞に対する細胞毒性により、パクリタキセル活性を評価した。
驚くべきことに、癌細胞増殖の阻害能によって示される通り、凍結乾燥は、粒子径、ＶＥＧＦ結合、またはパクリタキセルの活性のいずれにも有意に影響を与えなかった。この結果は、１ヶ月間（図８Ａ～図８Ｃ）または１０ヶ月間（図８Ｄ～図８Ｆ）貯蔵された凍結乾燥試料に対しても保持された。
これらの結果が、凍結保護剤またはヒトの治療的使用に有害な影響を及ぼし得る他の薬剤を使用することなく凍結乾燥されたナノ粒子について観察されたことはさらに驚くべきことであった。
実施例１１：ヒトにおけるＡＢ１６０の有効性
これまで治療が成功していない転移性悪性黒色腫の患者に投与されるＡＢ１６０の安全性を試験する第１相ヒト初回投与臨床試験において、ＡＢ１６０を試験した。この試験は、古典的な３＋３の第１相臨床試験設計を利用し、以下のスキームで３つの異なる用量のＡＢ１６０を試験する。
Figure 0007133050000015
＊用量レベル１は、開始用量を指す。
臨床診療で現在使用されているＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）の用量に関連して用量を選択した。各処置薬の投与前に、ＡＢ１６０を作製した。２８日間の処置サイクルの１日目、８日目および１５日目に３０分間の静脈内注入として処置薬を投与した。忍容されない毒性、腫瘍の進行、または患者の拒絶が生じるまで、処置を継続した。各処置サイクルの前に、患者を毒性について評価し、腫瘍評価を１サイクルおきに実施した（ＲＥＣＩＳＴ）。
試験では、治療のサイクル１および２の用量１に関連する正式な（入院患者）薬物動態研究も同時に行った。
患者５名に１００ｍｇ／ｍ２のＡＢＸおよび４０ｍｇ／ｍ２のＢＥＶでＡＢ１６０を投与し、そのうちの４名を分析した。
Figure 0007133050000016
ＰＦＳは、無増悪生存期間の中央値、即ち癌が再発するまでの処置日数を指す。有害事象を以下に列挙する。用量制限毒性（ＤＬＴ）はなく、即ち有害事象は、ＡＢ１６０の用量とは関連していなかった。さらなる詳細を、表６に示す。
Figure 0007133050000017
Figure 0007133050000018
平均ＰＦＳは７．６ヶ月間であり、中央値は７．０ヶ月であった。
他の臨床試験との比較
以下の表は、転移性黒色腫のためのタキサン療法に関する他に公開された臨床試験を示す。
Figure 0007133050000019
現在の治験では、ＡＢ１６０粒子の投与は１００ｍｇ／ｍ２のＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）および４０ｍｇ／ｍ２のベバシズマブの用量と等しい。ＢＥＶおよびＡＢＸ単独を使用した唯一の試験は、Ｓｐｉｔｌｅｒの試験であった。しかしＳｐｉｔｌｅｒは、より高用量のＡＢＸを使用した。また、本試験は、用量を平均的な患者（１．９ｍ２の表面積および９０ｋｇの体重を有すると仮定）に対して調整すると、過去の研究で報告されたＢＥＶの用量の１０％未満を使用した。
Ｓｐｉｌｔｅｒは、これまで処置を受けていなかった患者を調べたが、本発明者らの試験は、これまで処置が成功していない患者を調べた。過去の処置が無効であったことは、予期されるＰＦＳを得るために時間を要するのみならず、処置に対してより抵抗性のある癌細胞を選択し、典型的に患者をより厳しい身体条件下に置く。したがって、「レスキュー」療法（ここではＡＢ１６０を用いる場合）を受けている患者の集団のＰＦＳは、治療未経験集団よりも低いＰＦＳを有すると予期される。このことは、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）単独によってレスキュー患者および治療未経験患者の両方を調べた第２相臨床試験（Ｈｅｒｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ， Ｊａｎｕａｒｙ ２０１０， １１６：１５５）において確認することができる。以前にＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）単独で処置された患者では、ＰＦＳは、３．５ヶ月であった。Ｈｅｒｓｈ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ ２０１５ （ｅｐｕｂ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２６， ２０１５）は、ＡＢＸ単独で処置した治療未経験患者のＰＦＳは４．８ヶ月であると報告した。
Figure 0007133050000020
したがって、ＡＢ１６０を用いた第１相臨床試験の初期の結果は、過去に処置された患者における後期転移性悪性黒色腫のＰＦＳの増加を示している。Ｓｐｉｔｌｅｒの患者は、化学療法未経験であり、かつより高用量のＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）およびほぼ１２倍高用量のベバシズマブを投与されたことから、ＰＦＳがＳｐｉｔｌｅｒの患者よりも高いことを鑑みると、この増加は特に驚くべきものである。ＡＢ１６０中で使用されたＢＥＶの用量は、他のいかなる試験よりもかなり低いため、ＳｐｉｔｌｅｒではなくＨｅｒｓｈと比較することが最善である。
したがって、ＡＢＸ／ＢＥＶ複合体（ＡＢ１６０）は、ＡＢＸおよびＢＥＶの連続投与またはＡＢＸ単独よりも優れており、非常に低い有効用量のＢＥＶを用いてこの優れた結果を実現している。それゆえデータは、ＢＥＶにより媒介される腫瘍に対する化学療法剤の標的化が改善されたＡＢ１６０と一致している。アルブミンは腫瘍によって選択的に取り込まれることから、ＡＢＸナノ粒子は、ＢＥＶを腫瘍に標的化するのを支援することができる。同じくＢＥＶ／ＡＢＸ複合体の存在は、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）よりも高いインビボ安定性を示すことも可能である。
実施例１２：ＢＥＶを用いた前処置により標的化が改善するか否かを調査するための追跡試験
上記の一般的なプロトコルに従って、胸腺欠損ヌードマウスの右脇腹に１×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を注射し、その後ＰＢＳ、１２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶ、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸ、ＡＢ１６０で処置するか、または１．２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶで前処置して２４時間後にＡＢ１６０で処置した。データを、処置後７日目および１０日目の腫瘍体積（単位：ｍｍ３）として表す。図１１Ａ～図１１Ｅは、１０日間にわたって腫瘍サイズを追跡したものである。ＡＢ１６０で処置したマウス（ＢＥＶによる前処置を行った、または行わなかった）のみが、平均腫瘍体積の低減を示した。図１１Ｆおよび図１１Ｇも参照されたい。
図１１Ｆに要約された処置後７日目のデータは、ＢＥＶによる前処置が対照またはＢＥＶ単独（ｐ≦０．０００１）またはＡＢＸ単独（ｐ≦０．０００１）よりも統計学的に有意な腫瘍体積の低減に関連したことを示している。
図１１Ｇに要約した治療後１０日目のデータも、ＢＥＶによる前処置が対照またはＢＥＶ単独（ｐ≦０．０００１）またはＡＢＸ単独（ｐ≦０．０００１）よりも統計学的に有意な腫瘍体積の低減に関連したことを示している。また、ＡＢ１６０の前のＢＥＶによる前処置は、ＡＢ１６０単独（ｐ＝０．０２）よりも腫瘍体積の低減に関連しており、２匹のマウスにおいて完全奏功が認められた。
この実験では、１２ｍｇ／ｋｇの用量のＢＥＶは治療的ではなかった。前処置群に添加したＢＥＶの量は、マウスにおける通常用量の１／１０であるわずか１．２ｍｇ／ｋｇであった。しかしながら、治療量以下の用量による前処置が、ＡＢ１６０ナノ粒子の有効性の改善を示すように見える。このデータは、治療量以下の量のＢＥＶによる前処置が全身レベルのＶＥＧＦを取り除いて、より高い相対濃度を腫瘍に残存させることにより、ＡＢ１６０ナノ粒子による腫瘍関連ＶＥＧＦ標的化がより有効になる、という考えを裏づけている。
実施例１３：ナノ粒子を送達する代替手段
本発明のナノ粒子は、腫瘍に直接送達され得ると企図される。例えば、動脈内カニューレを介して、または腫瘍内への直接注射により、ナノ粒子を送達することができる。そのような実施形態において、腫瘍内または腫瘍付近への直接注射により大きなナノ粒子（例えば、５８０ｎｍまたは１１３０ｎｍ）を送達することができると企図される。
実施例１４：凍結乾燥ＡＲ１６０の抗原結合
ＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞を、それぞれパネルＦおよびＡの蛍光タグ抗ヒトＣＤ２０またはアイソタイプマッチ対照で標識して、フローサイトメトリーにより分析した。他のパネルでは、Ｄａｕｄｉ細胞を、ＣＤ２０標識前にＡＢＸ、ＡＲ１６０、ＡＲ１６０Ｌ（凍結乾燥されて、注射に適する溶液に再懸濁されたＡＲ１６０）、またはリツキサンで前処置した。図１２は、ＣＤ２０結合がＡＲ粒子およびリツキサンにより特異的に遮断されたが、ＡＢＸ単独では特異的に遮断されなかったことを実証している。これらの結果から、ＡＲがこれらの細胞上のＣＤリガンドに結合して、蛍光抗ＣＤ２０の結合を遮断することが示唆される。
図１３は、図１２に表されたものと同じデータにヒストグラムを重ねたものである。
図１４Ａおよび１４Ｂは、新しく作製して凍結乾燥したＡＲ（図１４Ａ）およびＡＴ（図１４Ｂ）に対するＡＢＸ単独の粒子径の比較を表す。
図１５は、ＡＢＸおよびＡＲ粒子の毒性を比較するＤａｕｄｉ細胞増殖アッセイの結果を表す。データから、凍結乾燥および非凍結乾燥ナノ粒子が、Ｄａｕｄｉアッセイにおいて本質的に同じ毒性を有することが実証される。実施例１５：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０標識ナノ粒子の腫瘍蓄積の蛍光分析。
マウスに、標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）、非特異的抗体でコーティングされた標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＢ ＩｇＧ）、またはリツキシマブでコーティングされた標識ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（ＡＲ１６０）のいずれかの等量を静脈（ＩＶ）注射した。目的の領域（ＲＯＩ）２、３、および４（図１６Ａ）は、蛍光閾値に基づいて腫瘍蓄積を追跡し、ＲＯＩ１、５、および６（図１６Ａ）は、バックグラウンド参照としての役割を有する。蛍光を、注射後２４時間のＲＯＩで測した。図１６Ｂは、大まかな腫瘍への送達を提供するために決定された、３つの処置群全てのマウスの単位腫瘍面積あたりの平均蛍光量の棒グラフである。図１６Ｃは、腫瘍へ送達された薬物と身体へ送達された薬物との割合を得るために、バックグラウンドＲＯＩによって正規化した単位腫瘍面積あたりの平均蛍光量の棒グラフである。データは、ＡＲ１６０ナノ粒子の投与が、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）単独または非特異的抗体をコーティングしたＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）と比較して蛍光の増加をもたらすことを実証する。
実施例１６：２２５ｎｍのサイズを有するナノ粒子
２２５ｎｍのサイズを有するナノ粒子を作製するために、粒子を、実施例１により調製したが、ＢＥＶとＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）との比は、４：５、即ちＢＥＶ４に対してＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）５であった。この比率は、２２５ｎｍ（ＡＢ２２５）のサイズを有するナノ粒子を生成した。ＡＢ２２５の効果を、先に示された通り動物においてアッセイした。図１７は、生理食塩水、ＢＥＶ、ＡＢＸ、ＡＢ１６０およびＡＢ２２５の単回用量、ならびにＢＥＶで前処置したＡＢ１６０で処置したマウスの生存率を表している。投与後３０日目に、ＡＢ２２５処置、ならびにＢＥＶの前処置を行った、または行わなかったＡＢ１６０処置のマウスの生存率は、ＢＥＶ単独またはＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）単独で処置したマウスの生存率をはるかに超えている。

Claims (20)

  1. 外部表面を有するナノ粒子複合体を含む凍結乾燥組成物であって、該ナノ粒子複合体の各々が、
    ａ．アルブミンと；
    ｂ．約１００～約１０００個の抗体であって、各抗体が、疎水性Ｆｃ部分と抗原結合部分とを有し、該抗原結合部分が、該複合体の該外部表面上に配置されている、抗体と；
    ｃ．パクリタキセルと
    を含み、該ナノ粒子複合体は、凍結乾燥されており、水溶液で再構成した際に、該Ｆｃ部分が、非共有結合性の疎水性結合により該アルブミンと会合し、該抗体の該抗原結合部分が、該ナノ粒子複合体の該外部表面上に配置されたままであり、かつ、インビボで抗原に結合することが可能なままである、該ナノ粒子複合体の約５０％未満がオリゴマーである、
    凍結乾燥組成物。
  2. 前記ナノ粒子複合体の各々が約４００～約８００個の抗体を含む、請求項１に記載の凍結乾燥組成物。
  3. 前記ナノ粒子複合体が、約１３０ｎｍ～約８００ｎｍの間の平均サイズを有する、請求項１または２に記載の凍結乾燥組成物。
  4. 前記ナノ粒子複合体が約１６０ｎｍの平均サイズを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物。
  5. パクリタキセルに結合したアルブミンと抗体の重量比が約５：１～約１：１である、請求項１～４のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物。
  6. 前記パクリタキセルが、前記ナノ粒子複合体の内側に位置するか、該ナノ粒子複合体の前記外部表面上に配置されるか、またはその両方である、請求項１～５のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物。
  7. 前記凍結乾燥組成物が、約２０℃～約２５℃で３ヶ月～１２ヶ月間安定である、請求項１～６のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物。
  8. 前記抗体が、前記ナノ粒子複合体の前記外部表面の全体または一部の上にある抗体の実質的に単層に配置される、請求項１～７のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物。
  9. 前記ナノ粒子複合体が約１×１０－１１～約１×１０－９Ｍの解離定数を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物。
  10. 前記パクリタキセルが、非共有結合により前記アルブミンと会合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物。
  11. 前記抗原がインビボで癌細胞によって発現される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の凍結乾燥組成物。
  12. 前記ナノ粒子複合体の４０％未満がオリゴマーである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
  13. 前記ナノ粒子複合体の３０％未満がオリゴマーである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
  14. 前記ナノ粒子複合体の２０％未満がオリゴマーである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
  15. 前記ナノ粒子複合体の１０％未満がオリゴマーである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
  16. 前記ナノ粒子複合体の５％未満がオリゴマーである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
  17. 前記アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
  18. 前記アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
  19. 前記組成物が静脈内送達のために処方される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
  20. 前記組成物が腫瘍内への直接注射または灌流のために処方される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の凍結乾燥ナノ粒子組成物。
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