JP2022107690A - 担体および抗体からなる組成物およびその製造および使用方法 - Google Patents

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N Markovic Svetomir
ケー． ネヴァラ，ウェンディ
K Nevala Wendy
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Abstract

【課題】抗体および担体タンパク質からなる新規な組成物ならびに特に癌治療薬としてのその製造および使用方法を提供する。【解決手段】一態様では、ナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、ナノ粒子はそれぞれ担体タンパク質、約１００～約１０００個の抗体、および任意の少なくとも１種の治療薬を含み、当該抗体はナノ粒子の表面から外向きに配置されており、当該ナノ粒子は生体内で所定のエピトープに結合することができることを特徴とするナノ粒子組成物が本明細書において提供される。【選択図】図１Ｂ

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６２／０６０，４８４号ならびに２０１５年８月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／２０６，７７０号、第６２／２０６，７７１号および第６２／２０６，７７２号の出願日の利益を主張するものである。上記出願の開示内容全体が参照により組み込まれる。
本開示は、抗体および担体タンパク質からなる新規な組成物ならびに特に癌治療薬としてのその製造および使用方法に関する。
化学療法は、黒色腫を含む多くの種類の癌の全身治療にとって依然として頼みの綱である。大部分の化学療法剤は腫瘍細胞に対して僅かにのみ選択的であり、健康な増殖細胞に対する毒性が高くなる可能性があり(Allen TM. (2002) Cancer 2:750-763)、用量の減少およびさらには治療の中断が必要となることが多い。理論上、化学療法の毒性問題を克服し、かつ薬効を高める１つの方法は、腫瘍細胞により選択的に発現される（または過剰発現される）タンパク質に特異的な抗体を用いて化学療法剤を腫瘍に標的化し、標的薬物を腫瘍に引き寄せ、それにより化学療法剤の生体内分布を変え、その結果、より多くの薬物を腫瘍に送達させて、健康な組織への影響を減らすことである。しかし、３０年もの研究にも関わらず、治療背景において特異的標的化が成功することは稀である。
従来の抗体依存性化学療法（ＡＤＣ）は、合成のプロテアーゼ切断可能リンカーを介して標的化抗体に結合された毒剤を用いて設計される。そのようなＡＤＣ治療法の有効性は、標的細胞が抗体に結合する能力、切断されるリンカー、および毒剤の標的細胞への取込みに依存している。Schrama, D. et al. (2006) Nature reviews. Drug discovery 5:147-159。
抗体標的化学療法は、標的化能力、複数の細胞毒性薬、および潜在的に低い毒性を有する改善された治療能力の組み合わせを提供するため、従来の治療法よりも利点を有することが見込まれた。広範囲な研究にも関わらず、臨床的に有効な抗体標的化学療法は達成されないままであり、主な障害としては、抗体と化学療法剤との間のリンカーの不安定性、抗体に結合させた際の化学療法剤の腫瘍毒性の低さ、およびその複合体が腫瘍細胞に結合および進入できないことが挙げられる。さらに、これらの治療法は、抗体－薬物複合体のサイズを制御することができなかった。
当該技術分野では、標的薬物送達のために細胞毒性作用を保持して、従来の治療薬よりも信頼性があり、かつ改良された抗腫瘍効果を与える抗体系癌治療薬が依然として必要とされている。
また、あらゆる治療適用に関し、その物理的、化学的および生物学的特性において安定である組成物も依然として必要とされている。
凍結乾燥またはフリーズドライは組成物から水を除去する。このプロセスにおいて、乾燥させる材料を最初に凍結させ、次いで、真空環境での昇華により氷または凍結溶媒を除去する。事前に凍結乾燥した製剤に賦形剤を含めて、凍結乾燥プロセス中の安定性を高め、かつ／または貯蔵時の凍結乾燥製品の安定性を高めてもよい。Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) and Arakawa et al., Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)。
タンパク質を凍結乾燥してもよいが、凍結乾燥および再構成のプロセスはタンパク質の特性に影響を与えることがある。タンパク質は従来の有機および無機薬物よりも大きくかつ複雑である（すなわち複雑な３次元構造に加えて複数の官能基を有する）ため、そのようなタンパク質の製剤は特殊な問題を提起する。タンパク質を生物学的に活性なままにするために、製剤は、タンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列の構造完全性をそのまま保持すると同時に、タンパク質の複数の官能基を分解から保護するものでなければならない。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（すなわち、結合形成または切断によるタンパク質の修飾により新しい化学物質を生じさせるあらゆるプロセス）または物理的不安定性（すなわち、タンパク質のより高次構造における変化）を伴い得る。化学的不安定性は、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、β脱離またはジスルフィド交換に起因し得る。物理的不安定性は、例えば、変性、凝集、沈殿または吸着に起因し得る。３つの最も一般的なタンパク質分解経路は、タンパク質の凝集、脱アミド化および酸化である。Cleland, et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)。
本発明では、本組成物は、（ａ）担体タンパク質、（ｂ）抗体および（ｃ）任意の治療薬を含むナノ粒子を含む。当該抗体はそれらの性質による弱い疎水性相互作用を介して担体タンパク質に結合されると考えられる。従って、そのような組成物の凍結乾燥および再構成は、個々の成分の活性だけでなくナノ粒子におけるそれらの相対的関係も保存するものでなければならない。
治療法においてナノ粒子を使用するため、さらなる課題が課される。
例えば、ナノ粒子中の疎水性成分の再配列は、成分間の共有結合により軽減することができる。しかし、そのような共有結合は、癌治療におけるナノ粒子の治療的使用に対して課題を提起する。当該抗体、担体タンパク質およびさらなる治療薬は典型的に、腫瘍内の異なる位置で異なる機序により作用する。非共有結合によりナノ粒子の成分は腫瘍において分離することが可能となる。従って、共有結合は凍結乾燥にとっては有利になり得るが、治療的使用にとっては欠点になり得る。
ナノ粒子の粒子径および粒度分布も重要である。本発明のナノ粒子はそれらの粒子径に応じて異なって挙動し得る。大きい粒子径では、ナノ粒子またはこれらの粒子の塊は血管を塞ぐことがあり、そのいずれかが本組成物の性能および安全性に影響を与える可能性がある。
最後に、凍結保護剤および凍結乾燥プロセスを支援する薬剤は、安全であり、かつ治療的使用に耐えられるものでなければならない。
一態様では、ナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、ナノ粒子はそれぞれ担体タンパク質、約１００～約１０００個の抗体、および任意の少なくとも１種の治療薬を含み、当該抗体はナノ粒子の表面から外向きに配置されており、当該ナノ粒子は生体内で所定のエピトープに結合することができることを特徴とするナノ粒子組成物が本明細書において提供される。
静脈内に投与する場合、大きな粒子（例えば１μｍ超）は肺の微小血管構造に詰まった状態になることがあるため、典型的に嫌われる。同時に、より大きな粒子は腫瘍または特定臓器に蓄積することができる。「ＴｈｅｒａＳｐｈｅｒｅ」と呼ばれる肝臓の腫瘍に栄養を与える肝動脈への注射に使用される、例えば２０～６０ミクロンのガラス粒子（肝癌のために臨床的に使用される）を参照されたい。
従って、静脈内投与のために、１μｍ未満の粒子を使用する。１μｍ超の粒子は、より典型的には、腫瘍（「直接注射」）または腫瘍部位に栄養を与える動脈に直接投与する。
別の態様では、ナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、ナノ粒子はそれぞれ、アルブミンではない担体タンパク質、約１００～約１００個の抗体、好ましくは約４００～約８００個の抗体、および任意の少なくとも１種の治療薬を含み、当該抗体は当該ナノ粒子の外面に配置されており、当該ナノ粒子は生体内で所定のエピトープに結合することができるナノ粒子組成物が本明細書において提供される。ナノ粒子が多量体化する場合、抗体の数は比例的に増加する。例えば、１６０ｎｍのナノ粒子が４００個の抗体を含む場合、３２０ｎｍの二量体は約８００個の抗体を含む。
別の態様では、ナノ粒子を含むナノ粒子組成物であって、ナノ粒子はそれぞれ、担体タンパク質、約４００～約８００個の抗体および任意のパクリタキセルではない少なくとも１種の治療薬を含み、当該抗体は、当該抗体の結合部分がその表面から外に向けられるように当該ナノ粒子の表面に配置されており、当該ナノ粒子は生体内で所定のエピトープに結合することができるナノ粒子組成物が本明細書において提供される。
他の実施形態では、当該ナノ粒子は多量体化、例えば二量体化する。単位分子、例えば１６０ｎｍの粒子の重量またはサイズの倍数が約３２０ｎｍ、４８０ｎｍ、６４０ｎｍなどに多量体化する際に多量体化が観察されることがある。いくつかの実施形態では、２０％未満の集団が多量体である。いくつかの実施形態では、８０％超の集団が多量体である。
一実施形態では、担体結合薬物：抗体（例えば、アルブミン結合パクリタキセル：ベバシズマブ）の重量比は、約５：１～約１：１である。一実施形態では、担体結合薬物：抗体の重量比は約１０：４である。一実施形態では、当該抗体は、当該ナノ粒子の表面の全体または一部の上にある実質的に単層の抗体である。一実施形態では、本組成物中に０．０１％未満のナノ粒子は、２００ｎｍ超、３００ｎｍ超、４００ｎｍ超、５００ｎｍ超、６００ｎｍ超、７００ｎｍ超および８００ｎｍ超からなる群から選択される粒子径を有する。より大きな粒子径は、それぞれがコアおよび各ナノ粒子の表面の全体または一部の上にある抗体被覆を含むいくつかのナノ粒子の多量体化の結果であると考えられる。
本発明は凍結乾燥した組成物をさらに含み、凍結乾燥した組成物は新たに調製したナノ粒子の特性と実質的に異ならない、すなわち同じである。特に、凍結乾燥した組成物は、水溶液中に再懸濁すると、粒子径、粒度分布、癌細胞に対する毒性、抗体親和性および抗体特異性の点で、新しい組成物と同様または同一である。本発明は、凍結乾燥したナノ粒子が、これらの粒子中に２つの異なるタンパク質成分が存在しているにも関わらず、新たに調製したナノ粒子の特性を保持しているという驚くべき発見に関する。
一態様では、本発明は、当該ナノ粒子はそれぞれ、担体結合薬物コアおよび当該抗体の結合部分がその表面から外に向けられるようにコアの表面に配置されたある量の抗体を含み、当該抗体は、水溶液で再構成した際にそれらの当該ナノ粒子の外面との結合を保持することを特徴とする、ナノ粒子を含む凍結乾燥したナノ粒子組成物に関する。一実施形態では、本凍結乾燥した組成物は少なくとも３ヶ月間室温で安定である。一実施形態では、再構成されたナノ粒子は治療薬の活性を保持し、かつ生体内で標的に結合することができる。
一実施形態では、平均的な再構成されたナノ粒子の粒子径は、約１３０ｎｍ～約１μｍである。好ましい実施形態では、平均的な再構成されたナノ粒子の粒子径は、約１３０ｎｍ～約２００ｎｍ、より好ましくは約１６０ｎｍである。一実施形態では、平均的な再構成されたナノ粒子の粒子径は８００ｎｍ超～約３．５μｍであり、より小さいナノ粒子の多量体、例えば１００～２００ｎｍのナノ粒子の多量体を含む。一実施形態では、コア：抗体の重量比は、１：１超～約１：３である。
一態様では、本開示は、ナノ粒子を含む凍結乾燥したナノ粒子組成物であって、当該ナノ粒子はそれぞれ、（ａ）アルブミン結合パクリタキセルコア、および（ｂ）抗体の結合部分がその表面から外に向けられるようにアルブミン結合パクリタキセルコアの表面に配置された約４００～約８００分子のベバシズマブを含み、当該抗体は、前記凍結乾燥した組成物が約２０℃～約２５℃で少なくとも３ヶ月間安定であり、かつ再構成されたナノ粒子が生体内でＶＥＧＦに結合することができる限り水溶液で再構成した際にそれらの当該ナノ粒子の表面との結合を保持することを特徴とする、凍結乾燥したナノ粒子組成物に関する。
他の態様では、本開示は、ナノ粒子を含む凍結乾燥したナノ粒子組成物であって、当該ナノ粒子はそれぞれ、（ａ）アルブミン結合パクリタキセルコア、および（ｂ）抗体の結合部分がその表面から外に向けられるようにアルブミン結合パクリタキセルコアの表面に配置されたある量のベバシズマブを含み、当該抗体は、前記凍結乾燥した組成物が約２０℃～約２５℃で少なくとも３ヶ月間安定であり、かつ再構成されたナノ粒子が生体内でＶＥＧＦに結合することができる限り水溶液で再構成した際にそれらの当該ナノ粒子の表面との結合を保持し、さらに、平均的な再構成されたナノ粒子の粒子径は新たに調製したナノ粒子の粒子径とは実質的に異ならないことを特徴とする、凍結乾燥したナノ粒子組成物に関する。いくつかの実施形態では、その粒子径は２００～８００ｎｍ、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００または８００ｎｍである。他の実施形態では、その粒子はより大きく、例えば８００ｎｍ超～約３．５μｍである。いくつかの実施形態では、その粒子はナノ粒子の多量体である。
いくつかの実施形態では、アルブミン結合パクリタキセル：ベバシズマブの重量比は、約５：１～約１：１である。他の実施形態では、アルブミン結合パクリタキセル：ベバシズマブの重量比は、約１０：４である。さらなる実施形態では、アルブミン結合パクリタキセル：ベバシズマブの重量比は、１：１超～約１：３である。
いくつかの実施形態では、当該コアはアルブミン結合パクリタキセルであり、当該抗体は、ＶＥＧＦを選択的に認識する抗体（例えば、ベバシズマブ／アバスチン）、ＣＤ２０を選択的に認識する抗体（例えば、リツキシマブ／リツキシン（Ｒｉｔｕｘｉｎ））、およびＨｅｒ２を選択的に認識する抗体（トラスツズマブ／ハーセプチン）から選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の治療薬は当該ナノ粒子の内部に位置する。他の実施形態では、少なくとも１種の治療薬は当該ナノ粒子の外面に位置する。さらに他の実施形態では、少なくとも１種の治療薬は、当該ナノ粒子の内部および当該ナノ粒子の外面に位置する。
いくつかの実施形態では、当該ナノ粒子は２種類以上の治療薬、例えばタキサンおよびプラチナ製剤、例えばパクリタキセルおよびシスプラチンを含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブおよびトラスツズマブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、当該抗体は、当該ナノ粒子の表面の全体または一部の上にある実質的に単層の抗体である。
さらなる実施形態では、当該抗体は、天然のヒトの抗体中に通常存在するものよりもグリコシル化されていない。そのようなグリコシル化は、例えば発現系により、あるいは発現中のグリコシル化阻害剤の存在により影響を受ける可能性がある。いくつかの実施形態では、抗体のグリコシル化状態は、酵素作用または化学的作用により変化する。
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の治療薬は、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシ尿素、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチンおよびシクロホスファミドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、当該ナノ粒子は、パクリタキセルまたはベバシズマブではない少なくとも１種のさらなる治療薬をさらに含む。
いくつかの実施形態では、当該抗体、担体タンパク質および存在すれば治療薬は、非共有結合により結合されている。
いくつかの実施形態では、当該担体タンパク質は、ゼラチン、エラスチン、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質、乳タンパク質および乳漿タンパク質からなる群から選択される。他の実施形態では、当該担体タンパク質はアルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンである。
いくつかの実施形態では、本組成物は静脈内送達のために製剤化されている。他の実施形態では、本組成物は直接注射または腫瘍への潅流のために製剤化されている。
いくつかの実施形態では、本組成物中の平均ナノ粒子径は８００ｎｍ超～約３．５μｍである。
いくつかの実施形態では、当該ナノ粒子は、約１×１０－１１Ｍ～約１×１０－９Ｍの解離定数を有する。
別の態様では、所望のナノ粒子の形成を可能にする条件下および成分比で、５．０～７．５のｐＨおよび約５℃～約６０℃、約２３℃～約６０℃または約５５℃～約６０℃の温度を有する溶液中で当該担体タンパク質および任意の少なくとも１種の治療薬を当該抗体と接触させる工程を含む、ナノ粒子組成物の製造方法が本明細書において提供される。一実施形態では、当該ナノ粒子を５５～６０℃およびｐＨ７．０で製造する。別の態様では、（ａ）当該担体タンパク質および任意の少なくとも１種の治療薬を接触させてコアを形成する工程、および（ｂ）所望のナノ粒子の形成を可能にする条件下および成分比で、約５．０～約７．５のｐＨおよび約５℃～約６０℃、約２３℃～約６０℃または約５５℃～約６０℃の温度を有する溶液中で当該コアを当該抗体と接触させる工程を含む、ナノ粒子組成物の製造方法が本明細書において提供される。
所望のナノ粒子の形成を行うために、成分（例えば、担体タンパク質、抗体、治療薬、それらの組み合わせ）の量を制御する。成分の量があまりに薄い組成物は、本明細書中に記載されているナノ粒子を形成しない。好ましい実施形態では、担体タンパク質：抗体の重量比は１０：４である。いくつかの実施形態では、担体タンパク質の量は約１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、抗体の量は約１ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬである。例えば、いくつかの実施形態では、担体タンパク質：抗体：溶液の比は、約９ｍｇの担体タンパク質（例えば、アルブミン）：４ｍｇの抗体（例えば、ＢＥＶ）：１ｍＬの溶液（例えば、生理食塩水）である。ある量の治療薬（例えば、タキソール）も当該担体タンパク質に添加することができる。
さらなる実施形態では、当該ナノ粒子を上記のとおりに製造し、次いで凍結乾燥する。
別の態様では、癌細胞を本明細書に開示されている有効量のナノ粒子組成物と接触させて癌細胞を治療する工程を含む、癌細胞の治療方法が本明細書において提供される。
別の態様では、腫瘍細胞を本明細書に開示されている有効量のナノ粒子組成物と接触させて腫瘍を治療する工程を含む、それを必要とする患者における腫瘍の治療方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、腫瘍のサイズを減少させる。他の実施形態では、本ナノ粒子組成物を静脈内に投与する。さらに他の実施形態では、本ナノ粒子組成物を直接注射または腫瘍への潅流により投与する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ａ）本ナノ粒子組成物を３週間にわたって１週間に１回投与する工程、ｂ）本ナノ粒子組成物の投与を１週間中止する工程、およびｃ）必要に応じて工程ａ）およびｂ）を繰り返して腫瘍を治療する工程を含む。
関連する実施形態では、当該治療は、当該ナノ粒子の投与前に標的化抗体の投与を含む。一実施形態では、当該ナノ粒子の投与の約６～４８時間または１２～４８時間前に標的化抗体を投与する。別の実施形態では、当該ナノ粒子の投与の６～１２時間前に標的化抗体を投与する。さらに別の実施形態では、当該ナノ粒子の投与の２～８時間前に標的化抗体を投与する。さらに他の実施形態では、当該ナノ粒子の投与の１週間前に標的化抗体を投与する。例えば、ある用量のＢＥＶの投与はＡＢ１６０の投与の２４時間前である。別の例では、リツキシマブの投与はＡＲナノ粒子の投与前である。当該ナノ粒子の前に投与される抗体を、通常治療効果があるとみなされる量の１／２、１／１０または１／２０などの治療量以下の用量として投与してもよい。従って、ヒトにおいて、ＢＥＶによる予備治療は、通常の用量の１／１０である１ｍｇ／ｋｇのＢＥＶの投与およびその後のＡＢ１６０の投与を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、治療的有効量は、約７５ｍｇ／ｍ２～約１７５ｍｇ／ｍ２の当該担体タンパク質（すなわち、患者のｍ２当たりミリグラム量の担体タンパク質）を含む。他の実施形態では、治療的有効量は、約７５ｍｇ／ｍ２～約１７５ｍｇ／ｍ２の治療薬（例えば、パクリタキセル）を含む。他の実施形態では、治療的有効量は、約３０ｍｇ／ｍ２～約７０ｍｇ／ｍ２の当該抗体を含む。さらに他の実施形態では、治療的有効量は、約３０ｍｇ／ｍ２～約７０ｍｇ／ｍ２のベバシズマブを含む。
特定の一実施形態では、本凍結乾燥した組成物は、約７５ｍｇ／ｍ２～約１７５ｍｇ／ｍ２の好ましくはアルブミンである担体タンパク質、約３０ｍｇ／ｍ２～約７０ｍｇ／ｍ２の好ましくはベバシズマブである抗体、および約７５ｍｇ／ｍ２～約１７５ｍｇ／ｍ２のパクリタキセルを含む。
以下の図は単に本発明の例示であって、本発明を限定するものではない。一貫性のために、アブラキサン（登録商標）およびベバシズマブを用いる本発明のナノ粒子は頭字語「ＡＢ」を用い、ＡＢ１６０などのＡＢの後の数字はこれらのナノ粒子の平均粒子径（単位：ナノメートル）を付与するものである。同様に、当該抗体がリツキシマブである場合、頭字語は「ＡＲ」であり、その後の番号は同じ意味である。
二次抗体のみで染色されたアブラキサン（登録商標）（ＡＢＸ、Ｃｅｌｇｅｎｅ社（ニュージャージー州サミット、０７９０１）から市販されている）（左上のパネル）、ヤギ抗マウスIgG1 Fab＋二次抗体で染色されたＡＢＸ（右上のパネル）、二次抗体のみで染色されたＡＢ１６０（約１０：４の比のアルブミン結合パクリタキセル：ベバシズマブからなるナノ粒子であり、１６０ｎｍの平均粒子径を有する）（左下のパネル）、またはヤギ抗マウスIgG1 Fab＋二次抗体で染色されたＡＢ１６０（右下のパネル）を含む、フローサイトメトリー散布図を示す。 ＡＢ１６０を金粒子で標識した抗ヒトIgG Fcと共にインキュベートした後の代表的な電子顕微鏡写真を示す。 ＡＢ１６０画分（微粒子、１００ｋＤ超のタンパク質および１００ｋＤ未満のタンパク質）中の総パクリタキセルの割合を示す円グラフ（上）、および共局在化を確認するためにマウスIgGFab（ＢＥＶ）およびパクリタキセルに対する抗体を用いたウエスタンブロット（下）を示す。 ＡＢＸ単独と比較した場合のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を用いた生体外毒性アッセイにおけるパクリタキセルの活性を表す。その結果を、未処理細胞の総増殖率に対する平均（＋／－ＳＥＭ）増殖指数により表す。データは３回の実験を示し、差は有意でなかった。 当該抗体によるリガンド（ＶＥＧＦ）の結合を決定するためにＶＥＧＦをＡＢＸおよびＡＢ１６０と共にインキュベートした後の上澄みのVEGF ELISAによる結果を表す。その結果を２種類の複合体により結合されなかったＶＥＧＦの平均割合＋／－ＳＥＭとして示す。データは３回の実験を示す（＊＊Ｐ＜０．００５）。 ナノ粒子およびそれよりも大きい粒子が形成される条件下でＢＥＶ（ベバシズマブ）をＡＢＸに添加して形成された複合体の粒子径（光散乱技術により決定）を示す。増加する濃度のＢＥＶ（０～２５ｍｇ）を１０ｍｇのＡＢＸに添加し、形成された複合体の粒子径を決定した。その複合体の平均粒子径（１４６ｎｍ～２，１６６ｎｍ）はＢＥＶの濃度が上昇するにつれて増加した。データは試料の体積／粒子径として表示されており、グラフは粒度分布を示す。データは５種類の別個の薬物製剤を示す。比較として、ＡＢＸそれ自体は約１３０ｎｍの平均粒子径を有する。 ＡＢＸおよびＢＥＶの結合親和性（光吸収（ＢＬＩｔｚ）技術により決定）を示す。データは解離定数（Ｋｄ）として表示されている。４種類のｐＨレベル（３、５、７、９）および３種類の温度（室温、３７℃および５８℃）で調製された粒子の結合親和性を評価し、データは５回の実験を示す。 ナノサイト（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）３０0（ＮＳ３００）を用いたナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）により決定される血清中での図２Ｂからのナノ粒子複合体の安定性を示す。データは１ｍｇのＡＢＸ当たりの粒子数として表示されており、各条件下でＡＢＸ単独に対して、室温およびｐＨ７（ＡＢ１６００７：粒子径、ｐＨ）、５８℃およびｐＨ７（ＡＢ１６００７５８：粒子径、ｐＨ、温度）、ならびに５８℃およびｐＨ５（ＡＢ１６００５５８：粒子径、ｐＨ、温度）で調製したＡＢ１６０を比較する。粒子を調製したら、それらをヒトＡＢ血清に１５、３０および６０分間添加して、血清中での経時的安定性を決定した。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、約６００ｍｍ３～９００ｍｍ３の腫瘍サイズにおいて、ＰＢＳ、１２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶ、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸ、１２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶ＋３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸまたはＡＢ１６０（約１２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶおよび約３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸを有する）で治療した胸腺欠損ヌードマウスにおけるＡＢナノ粒子の生体内試験を示す。データは、治療後７日目のベースライン（治療日の腫瘍サイズ）からの腫瘍サイズの変化率として表されている。スチューデントｔ検定を使用して有意性を決定した。ＡＢ粒子のｐ値は全て、ＰＢＳ、個々の薬物単独および連続投与される２種類の薬物とは有意に異なっていた。 図３Ａで分析したマウスの生存期間中央値のために生成されたカプラン・マイヤー曲線を示す。生存曲線を比較するＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を用いて有意性を決定した。 腫瘍サイズがＡＢＸ単独群およびＡＢ１６０群の腫瘍反応に影響を与えたか否かを確認するために腫瘍が７００ｍｍ３未満または７００ｍｍ３超である場合に治療したマウスのベースラインからの変化率を示す。スチューデントｔ検定を使用して有意性を決定し、ＡＢＸ単独群は腫瘍サイズに基づく有意差を示さず（ｐ＝０．７５２）、ＡＢ１６０群は有意に異なっていた（ｐ＝０．００５７）。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹注射して、約６００ｍｍ３～９００ｍｍ３の腫瘍サイズにおいて、ＰＢＳ、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸまたは４５ｍｇ／ｋｇのＢＥＶ＋ＡＢ１６０、ＡＢ５８０（５８０ｎｍの平均粒子径を有するアルブミン結合パクリタキセル：ベバシズマブからなるナノ粒子）またはＡＢ１１３０（１１３０ｎｍの平均粒子径を有するアルブミン結合パクリタキセル：ベバシズマブからなるナノ粒子）で治療した胸腺欠損ヌードマウスにおけるＡＢナノ粒子の生体内試験を示す。データは、治療から７日後のベースライン（治療日の腫瘍サイズ）からの腫瘍サイズの変化率として表されている。スチューデントｔ検定を使用して有意性を決定した。ＡＢ粒子のｐ値は全て、ＰＢＳ、個々の薬物単独および連続投与される２種類の薬物とは有意に異なっていた。異なる粒子径を有するＡＢ粒子間の差は有意でなかった。 図３Ｄで分析したマウスの生存期間中央値のために生成されたカプラン・マイヤー曲線を示す。生存曲線を比較するＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を用いて有意性を決定した。 ＡＢＸまたはＡＢ１６０と関連する３０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルをＩＶ注射してから０～２４時間後にＬＣ－ＭＳで測定した、腫瘍を有しないマウスおよび腫瘍を有するマウスから採取した血液および腫瘍試料に基づき、ｙ軸を対数目盛にした線グラフで表示される血中パクリタキセル濃度を示す。０時の時点でマウスにＩＶ注射し、０、４、８、１２および２４時間の時点で血液試料を採取してマウスを屠殺した。１時点当たり少なくとも３匹のマウスが存在した。スチューデントｔ検定を利用して、ＡＢＸとＡＢ１６０とのあらゆる濃度差が有意であるか否かを決定した。 ｙ軸を数字目盛にした線グラフで表示される、図４Ａの血中パクリタキセル濃度を示す。 図４Ａおよび図４Ｂに示されている血中濃度データから計算したＣｍａｘ、半減期およびＡＵＣ値を示す。 より早い時点（２～８時間）を用いた第２の薬物動態実験から得られた、ｙ軸を対数目盛にした線グラフで表示される血中パクリタキセル濃度を示す。 ｙ軸を数字目盛にした線グラフで表示される、図４Ｄの血中パクリタキセル濃度を示す。 ＡＢＸおよびＡＢ１６０の注射前に腫瘍をより大きなサイズまで成長させたマウスにおける血中パクリタキセル濃度を示す。 図４Ｆのデータから計算したＣｍａｘおよびＡＵＣを示す。 ＬＣ－ＭＳで測定した第２のマウス実験から得られた腫瘍におけるパクリタキセル濃度を示す。データはパクリタキセル（μｇ）／腫瘍組織（ｍｇ）として表示されている。スチューデントｔ検定を利用して差が有意であるか否かを決定した。 ＡＢＸ単独と比べたＡＢ１６０で治療したマウスにおけるＩ－１２５放射活性レベルを示す。 図４Ｉに示すＩ－１２５放射活性レベルのグラフ表示を示す。 リツキシマブと共に製造されたナノ粒子の粒子径測定値および親和性を示す。１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＸを０～１０ｍｇ／ｍｌのリツキシマブ（ＲＩＴ）と共にインキュベートし、光散乱技術（マスターサイザー（Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ）２０００）を使用して、得られた粒子の粒子径を測定した。データは各粒子径における粒子の体積率として表示されており、曲線は粒度分布を表している（上）。表（下）は、各濃度の抗体において得られた粒子の粒子径を示す。 トラスツズマブと共に調製したナノ粒子の粒子径測定値および親和性を示す。１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＸを０～２２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブ（ＨＥＲ）と共にインキュベートし、光散乱技術（マスターサイザー２０００）を使用して、得られた粒子の粒子径を測定した。データは各粒子径における粒子の体積率として表示されており、曲線は粒度分布を表している（上）。表（下）は、各濃度の抗体において得られた粒子の粒子径を示す。 バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩｔｚ）技術によって決定した、ｐＨ３、５、７および９でＡＢＸと比較したリツキシマブおよびトラスツズマブの結合親和性を示す。解離定数は相互作用ごとに表示されている。 ＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉヒトリンパ腫細胞株を用いて試験したＡＲ１６０の生体外毒性を示す。データは、未処理ウェル中のＦＩＴＣ陽性細胞（最高レベルの増殖）に対する処理済ウェル中のＦＩＴＣ陽性細胞の割合である増殖指数のグラフで表示されている。 ５×１０６個のＤａｕｄｉヒトリンパ腫細胞を右脇腹に注射した胸腺欠損ヌードマウスにおける生体内腫瘍効果を示す。腫瘍を６００ｍｍ３～９００ｍｍ３まで成長させて、マウスをＰＢＳ、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸ、１２ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ、１２ｍｇ／ｋｇのリツキシマブ＋３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸまたはＡＲ１６０で治療した。治療後７日目に、治療の１日目からの腫瘍サイズの変化率により腫瘍反応を決定した。スチューデントｔ検定により有意性を決定し、ベースラインからの変化率はＡＲ１６０で治療したマウスと全ての他の群との間で有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１）。 図６Ｂに示す実験から生成されたカプラン・マイヤー生存曲線を示す。各治療群の生存期間中央値が示されている。Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を使用して生存曲線の差が有意であるか否かを決定した。 別の化学療法剤（シスプラチン）のＡＢ１６０への添加を示す。ＡＢＸ（５ｍｇ／ｍｌ）をシスプラチン（０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に室温で３０分間インキュベートし、ＡＢＸ微粒子を除去した後の上澄みにおいてＨＰＬＣにより遊離シスプラチンを測定した。遊離シスプラチンの量を開始濃度から差し引いてＡＢＸ結合シスプラチンの量を決定した。データは、開始濃度（シスプラチン）に沿って棒グラフで表示されている。 Ａ３７５ヒト黒色腫細胞の増殖アッセイにおけるシスプラチン結合ＡＢＸ（ＡＣ）の毒性を示す。薬物の曝露およびＥｄＵの組み込みから２４時間後に、これらの細胞を固定し、透過処理し、ＦＩＴＣ結合抗ＥｄＵ抗体で標識した。データは、未処理ウェル中のＦＩＴＣ陽性細胞（最高レベルの増殖）と比較した処理済ウェル中のＦＩＴＣ陽性細胞の割合である増殖指数のグラフで表示されている。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射した胸腺欠損ヌードマウスにおけるＡＣ（ＡＢＣ複合体、シスプラチン結合ＡＢＸ）の生体内腫瘍効果を示す。腫瘍を６００ｍｍ３～９００ｍｍ３まで成長させて、マウスをＰＢＳ、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸ、２ｍｇ／ｋｇのシスプラチン、ＡＢ１６０、２ｍｇ／ｋｇのシスプラチン＋ＡＢ１６０またはＡＢＣ１６０で治療した。治療後７日目に、治療日からの腫瘍サイズの変化率により腫瘍反応を決定した。スチューデントｔ検定により有意性を決定し、ベースラインからの変化率は、ＡＢＣ１６０治療マウスとＰＢＳ、シスプラチンまたはＡＢＸ治療マウスとの間で有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１）。治療後７日目のベースラインからの変化率について、ＡＢ１６０、ＡＢ１６０＋シスプラチンおよびＡＢＣ１６０治療群間で有意差は認められなかった。 図７Ｃに示す実験に基づき生成されたカプラン・マイヤー生存曲線を示し、各治療群の生存期間中央値が示されている。Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を使用して生存曲線の差が有意であるか否かを決定した。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較して、凍結乾燥し、室温で１ヶ月間貯蔵し、かつ再構成したＡＢ１６０ナノ粒子の粒度分布を示す。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較して、凍結乾燥し、室温で１ヶ月間貯蔵し、かつ再構成したＡＢ１６０ナノ粒子のリガンド（ＶＥＧＦ）結合能力を示す。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較して、凍結乾燥し、室温で１ヶ月間貯蔵し、かつ再構成したＡＢ１６０ナノ粒子の生体外癌細胞毒性を示す。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較して、凍結乾燥し、室温で１０ヶ月間貯蔵し、かつ再構成したＡＢ１６０ナノ粒子の粒度分布を示す。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較して、凍結乾燥し、室温で１０ヶ月間貯蔵し、かつ再構成したＡＢ１６０ナノ粒子のリガンド（ＶＥＧＦ）結合能力を示す。 新しいＡＢ１６０またはＡＢＸ単独と比較して、凍結乾燥し、室温で１０ヶ月間貯蔵し、かつ再構成したＡＢ１６０ナノ粒子の生体外癌細胞毒性を示す。 図９Ａ～図９Ｃは、室温の生理食塩水中で最長２４時間インキュベートした、静脈内注入条件下でのＡＢＸ－ＢＥＶ複合体（ＡＢＸ最終濃度：５ｍｇ／ｍＬ）の粒度分布を示す（図９Ａおよび図９Ｂ）。室温で４時間までの間に、ＥＬＩＳＡによる複合体の解離の証拠が若干認められる（２０％、図９Ｃ）。 ９：１または１：１の相対体積比における、生理食塩水またはヘパリン添加ヒト血漿中でのＡＢＸ（上のパネル）またはＡＢ１６０（下のパネル）の３０秒間の生体外でのインキュベーションを示す。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、ＰＢＳで治療した胸腺欠損ヌードマウスの生体内試験を示す。データは、治療後７日目および１０日目における腫瘍体積（単位：ｍｍ３）として表わされている。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、１２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶで治療した胸腺欠損ヌードマウスの生体内試験を示す。データは、治療後７日目および１０日目における腫瘍体積（単位：ｍｍ３）として表わされている。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸで治療した胸腺欠損ヌードマウスの生体内試験を示す。データは、治療後７日目および１０日目における腫瘍体積（単位：ｍｍ３）として表わされている。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、ＡＢ１６０で治療した胸腺欠損ヌードマウスの生体内試験を示す。データは、治療後７日目および１０日目における腫瘍体積（単位：ｍｍ３）として表わされている。 １×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を右脇腹に注射して、１．２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶおよび２４時間後にＡＢ１６０で予備治療した胸腺欠損ヌードマウスの生体内試験を示す。データは、治療後７日目および１０日目における腫瘍体積（単位：ｍｍ３）として表わされている。 図１１Ａ～図１１Ｅからの治療後７日目のデータを要約したものである。 図１１Ａ～図１１Ｅからの治療後１０日目のデータを要約したものである。
本説明を読んだ後に、各種他の実施形態および他の用途において本発明を実施する方法は当業者に明らかになるであろう。但し、本発明の各種実施形態の全てについて本明細書では説明しない。当然のことながら、本明細書に示されている実施形態は単に例として示されており、本発明を限定するものではない。従って、各種他の実施形態のこの詳細な説明は、以下に記載する本発明の範囲または広さを限定するものとして解釈されるべきではない。
本発明を開示および説明する前に、以下に説明する態様は、特定の組成物、そのような組成物の調製方法またはその使用に限定されず、従って、当然ながら変更可能であることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の態様を記述するためのものであって、本発明を限定するものではないことも理解されたい。
読者の利便性のためにのみ、本発明の詳細な説明は各種節に分けられており、どの節に含まれる開示内容も別の節の開示内容と組み合わせることができる。本明細書では読者の便宜上、タイトルまたはサブタイトルが使用されている場合もあるが、それらは本発明の範囲に影響を与えるものではない。
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書および後続の特許請求の範囲では多くの用語に言及するが、それらの用語は以下の意味を有するものとする。
本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態について記述するためのものであり、本発明を限定するものではない。本明細書で使用される単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（前記）（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別の意を示していない限り、複数形も含むものとする。
「任意の」または「任意で」とは、その後に記載されている事象または状況が生じても生じなくてもよいことを意味し、その記載は、事象または状況が生じる場合およびそれらが生じない場合を含む。
「約」という用語は、範囲を含む数字表示、例えば、温度、時間、量、濃度などの前に使用されている場合、（＋）または（－）１０％、５％、１％またはそれらの間に含まれるあらゆる部分範囲または部分的値（ｓｕｂｖａｌｕｅ）だけ異なり得る近似値を示す。好ましくは、「約」という用語は、用量に関して使用されている場合、その用量が＋／－１０％だけ異なり得ることを意味する。例えば、「約４００～約８００個の抗体」とは、ナノ粒子の外面が３６０～８８０個の量の抗体を含むことを示す。
「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、本組成物および方法が列挙されている要素を含むが、それ以外の要素を排除しないことを意味するものとする。「本質的に～からなる（consisting essentially of）」は、組成物および方法を定義するために使用されている場合、明記されている目的のための組み合わせに対してあらゆる本質的に重要な他の要素を排除することを意味するものとする。従って、本質的に本明細書に定義されている要素からなる組成物は、特許請求されている本発明の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を与えない他の材料または工程を除外しない。「～からなる（consisting of）」は、他の成分の微量を超える元素および実質的な方法工程を排除することを意味するものとする。これらの各移行語により定められる実施形態は、本発明の範囲内である。
本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、５ミクロン未満の少なくとも１つの次元を有する粒子を指す。好ましい実施形態では、例えば静脈内投与のための当該ナノ粒子は１ミクロン未満である。直接投与のための当該ナノ粒子はより大きい。さらにより大きな粒子は本発明によって明示的に想定される。
粒子の集団において、個々の粒子の粒子径はほぼ平均して分布されている。従って、その集団の粒子径は、平均または百分位数によっても表すことができる。Ｄ５０は粒子の５０％以下が含まれる粒子径である。１０％の粒子はＤ１０値よりも小さく、かつ９０％の粒子はＤ９０よりも小さい。明らかでない場合、「平均」粒子径はＤ５０に等しい。従って、例えば、ＡＢ１６０は１６０ナノメートルの平均粒子径を有するナノ粒子を指す。
「ナノ粒子」という用語は、より小さいナノ粒子単位の不連続な多量体も包含してもよい。例えば、３２０ｎｍの粒子は、１６０ｎｍのナノ粒子単位の二量体を含む。従って１６０ｎｍのナノ粒子では、多量体は約３２０ｎｍ、４８０ｎｍ、６４０ｎｍ、８００ｎｍ、９６０ｎｍ、１１２０ｎｍなどである。
本明細書で使用される「担体タンパク質」という用語は、抗体および／または治療薬を輸送するように機能するタンパク質を指す。本開示の抗体は当該担体タンパク質に可逆的に結合することができる。例示的な担体タンパク質については以下により詳細に説明する。
本明細書で使用される「コア」という用語は、担体タンパク質、担体タンパク質＋治療薬または他の薬剤あるいは薬剤の組み合わせからなり得る当該ナノ粒子の中心または内部を指す。いくつかの実施形態では、当該抗体の疎水性部分はコアの中に組み込まれていてもよい。
本明細書で使用される「治療薬」という用語は、治療的に有用な薬剤、例えば、疾患状態、生理学的状態、症状または病因因子の治療、寛解または減弱のため、あるいはその評価または診断のための薬剤を意味する。治療薬は、化学療法剤、例えば、分裂抑制剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ステロイド、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、アルキル化剤、酵素、プロテアソーム阻害剤またはそれらのあらゆる組み合わせであってもよい。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）を指す。この用語は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖からなる抗体ならびに全長抗体およびその部分を含む様々な形態、例えば、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、多特異性抗体、二重特異性抗体（dual specific antibody）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体（bispecific antibody）、その機能的に活性なエピトープ結合断片、二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)）および単鎖（例えば、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988)およびBird et al., Science 242, 423-426 (1988)、これらは参照により本明細書に組み込まれる）などを指す。（一般に、Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2ND ed. (1984)、Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)を参照されたく、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。当該抗体はあらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ）であってもよい。当該抗体はＩｇＧであることが好ましい。抗体は非ヒト抗体（例えば、マウス、ヤギまたはあらゆる他の動物由来）、完全ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。
「Ｋｄ」ともいう「解離定数」という用語は、特定の物質が個々の成分（例えば、タンパク質担体、抗体および任意の治療薬）に分離する程度を表す量を指す。
本明細書で使用される「凍結乾燥した」「凍結乾燥」などの用語は、乾燥させる材料（例えば、ナノ粒子）を最初に凍結させ、次いで氷または凍結溶媒を真空環境において昇華により除去するプロセスを指す。事前に凍結乾燥した製剤に任意で賦形剤を含めて貯蔵時の凍結乾燥製品の安定性を高める。いくつかの実施形態では、当該ナノ粒子は、治療薬として使用する前に、凍結乾燥成分（担体タンパク質、抗体および任意の治療薬）から形成することができる。他の実施形態では、当該担体タンパク質、抗体および任意の治療薬を最初に組み合わせてナノ粒子にし、次いで凍結乾燥する。凍結乾燥試料はさらなる賦形剤をさらに含んでいてもよい。
「増量剤」という用語は、凍結乾燥製品の構造を与える薬剤を含む。増量剤のために使用される一般的な例としては、マンニトール、グリシン、ラクトースおよびスクロースが挙げられる。薬学的に優れた塊を与えるだけでなく、増量剤は、崩壊温度を変更すること、凍結融解保護を与えること、および長期間の貯蔵におけるタンパク質安定性を高めることに関して有用な品質も与えることができる。これらの薬剤は張度調整剤（tonicity modifier）としても機能することができる。
「緩衝液」という用語は、凍結乾燥前に溶液のｐＨを許容される範囲内に維持する薬剤を包含し、コハク酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、ヒスチジン、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ジエタノールアミン、クエン酸塩（ナトリウム）などを挙げることができる。本発明の緩衝液は約５．５～約６．５の範囲のｐＨを有し、好ましくは約６．０のｐＨを有する。ｐＨをこの範囲に制御する緩衝液の例としては、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が挙げられる。
「凍結保護剤」という用語は一般に、恐らくタンパク質表面から優先的に排除されることにより、タンパク質に凍結誘発応力に対する安定性を与える薬剤を含む。この薬剤は、一次および二次乾燥ならびに長期間の製品貯蔵中に保護を与えることもできる。この例は、デキストランおよびポリエチレングリコールなどのポリマー、スクロース、グルコース、トレハロースおよびラクトースなどの糖類、ポリソルベートなどの界面活性剤、およびグリシン、アルギニンおよびセリンなどのアミノ酸である。
「凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」という用語は、恐らく非晶質ガラス状マトリックスを提供すること、水素結合によりタンパク質と結合させること、および乾燥プロセス中に除去される水分子を置換することにより、乾燥または「脱水」プロセス（一次および二次乾燥サイクル）中にタンパク質に安定性を与える薬剤を含む。これは、タンパク質構造を維持し、凍結乾燥サイクル中にタンパク質分解を最小限に抑え、かつ長期間の製品貯蔵を向上させるのを助ける。例としては、ポリオールまたはスクロースおよびトレハロースなどの糖類が挙げられる。
「医薬製剤」という用語は、有効成分を有効にすることができる形態であり、かつその製剤が投与される対象に毒性のあるさらなる成分を含まない製剤を指す。
「薬学的に許容される」賦形剤（媒体、添加剤）は、用いられる有効成分の有効な用量を対象哺乳類に与えるために適正に投与することができるものである。
「再構成時間」は、凍結乾燥した製剤を溶液で再水和させて粒子を含まない澄んだ溶液にするために必要な時間である。
「安定な」製剤とは、貯蔵時にその中のタンパク質がその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物活性を本質的に保持する製剤である。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体によって認識される抗原の部分を指す。エピトープとしては、限定されるものではないが、タンパク質（例えば、抗体）またはリガンドとの特異的相互作用を可能にする短いアミノ酸配列、すなわちペプチド（任意でグリコシル化されているかそれ以外の方法で修飾されている）が挙げられる。例えば、エピトープは、抗体の抗原結合部位が結合する分子の一部であってもよい。
「治療すること」または「治療」という用語は、ヒトなどの対象における疾患または障害（例えば、癌）の治療を包含し、かつ（ｉ）疾患または障害を阻害する、すなわち、その発症を阻止すること、（ｉｉ）疾患または障害を軽減する、すなわち、それらの緩解を引き起こすこと、（ｉｉｉ）障害の進行を遅くすること、および／または（ｉｖ）疾患または障害の１つ以上の症状の進行を阻害、軽減または遅くすることを含む。いくつかの実施形態では「治療すること」または「治療」とは、癌細胞を死滅させることを指す。
癌治療に関して「死滅させる」という用語は、癌細胞または癌細胞の集団の少なくとも一部の死滅に繋がるあらゆる種類の操作に関する。
さらに、本明細書で使用されるいくつかの用語については、以下により具体的に定義する。
概略
本発明は１つには、担体タンパク質、抗体および治療薬を含む任意で凍結乾燥したナノ粒子が、患者への毒性を最小限に抑えながら腫瘍への標的治療を行うという驚くべき発見に基づいている。従って、本明細書に記載されているナノ粒子は、従来のＡＤＣ対して顕著に改良されたものである。
従来のＡＤＣを有効なものとするためには、リンカーが体循環中に解離しないが腫瘍部位において十分な薬物放出を可能にするのに十分な程に安定であることが重要である。Alley, S.C., et al. (2008) Bioconjug Chem 19:759-765。これは、有効な薬物複合体を開発する際の主要な障害であることが分かっており(Julien, D.C., et al. (2011) MAbs 3:467-478、Alley, S.C., et al. (2008) Bioconjug Chem 19:759-765)、従って、ナノ免疫複合体（nano-immune conjugate）の魅力的な特徴は、生化学的リンカーが必要でないという点である。
現在のＡＤＣの別の欠点は、ヒトの腫瘍において腫瘍へのより高い薬物透過が実質的に証明されていない点である。マウスモデルにおけるＡＤＣの初期の試験では、抗体を用いた腫瘍標的により腫瘍中により高い濃度の活性剤が送達されることが示唆された(Deguchi, T. et al. (1986) Cancer Res 46: 3751-3755)が、恐らくヒトの腫瘍はマウス腫瘍よりも透過が非常に不均質であるという理由から、これはヒトの疾患の治療においては相関がなかった。Jain, R.K. et al. (2010) Nat Rev Clin Oncol 7:653-664。また、当該ナノ粒子の粒子径は、脈管構造から腫瘍への血管外遊出のために重要である。ヒトの結腸腺癌異種移植モデルを用いたマウス研究では、血管の孔は最大４００ｎｍのリポソームを透過させることができた。Yuan, F., et al. (1995) Cancer Res 55: 3752-3756。腫瘍の細孔径および透過の別の研究では、両特性が腫瘍位置および成長状態に依存しており、退行性腫瘍および頭蓋腫瘍は２００ｎｍ未満の粒子を透過させることができることが実証された。Hobbs, S.K., et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95:4607-4612。本明細書に記載されているナノ免疫複合体は、２００ｎｍ未満のそのままの大きな複合体が体循環において腫瘍組織に容易に透過することができるより小さい機能単位に部分的に解離するという事実によって、この問題を克服する。さらに、その複合体が腫瘍部位に到達すると、より小さい毒性ペイロードを放出させることができ、複合体全体ではなく毒性部分のみが腫瘍細胞によって取り込まれる必要がある。
治療薬（すなわち、アブラキサン（登録商標））を含む、抗体（すなわち、アバスチン（登録商標））被覆されたアルブミンナノ粒子の出現により、２種類以上の治療薬を生体内の所定の部位に指向性送達する新しいパラダイムが形成された。ＰＣＴ特許公報の国際公開第２０１２／１５４８６１号および国際公開第２０１４／０５５４１５号を参照されたく、それらの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
アルブミンおよび抗体からなる組成物を特定の濃度および比で水溶液中で一緒に混合した場合、当該抗体はアルブミンの中および上に自然に自己集合して当該抗体の複数のコピー（最大５００個以上）を有するナノ粒子を形成する。どんな理論にも限定されないが、当該抗体の抗原受容体部分は当該ナノ粒子から外向きに配置され、疎水性末端部は疎水性－疎水性相互作用によってアルブミンに組み込まれていると考えられる。
単一源タンパク質を含むタンパク質組成物は一般に凍結乾燥した形態で貯蔵され、その場合に有意な貯蔵寿命を示すが、そのような凍結乾燥した組成物は、疎水性－疎水性相互作用によって一緒に組み込まれた２種類の異なるタンパク質の自己集合したナノ粒子を含んでいない。さらに、抗体結合部分の大部分が当該ナノ粒子の表面で露出されている当該ナノ粒子構成により、そうでなければ穏やかとみなされる条件により移動または再構成しやすくなる。例えば、凍結乾燥中に、タンパク質上のイオン電荷は脱水され、それにより下にある電荷は露出される。露出された電荷により各タンパク質の他との結合親和性を変更することができる２つのタンパク質間の電荷－電荷相互作用が可能になる。さらに、溶媒（例えば、水）が除去されるにつれて当該ナノ粒子の濃度は顕著に増加する。ナノ粒子のそのような濃度の増加は、不可逆的なオリゴマー化を生じさせることができる。オリゴマー化は、単量体型と比較してオリゴマーの生物学的特性を減少させ、かつ時として１ミクロンを超える粒子の粒子径を増加させるタンパク質の公知の特性である。
他方、ナノ粒子組成物の安定な形態は、少なくとも３ヶ月間の貯蔵寿命が必要であり、かつ６ヶ月または９ヶ月超の貯蔵寿命が好ましい臨床的および／または商業的使用に必要である。そのような安定な組成物は静脈内注射のために容易に利用可能でなければならず、当該ナノ粒子を生体内の所定の部位に方向付けるために静脈内注射した際にその自己集合した形態を保持しなければならず、血流内に送達された際にあらゆる虚血性イベントを回避するために１ミクロン未満の最大粒子径を有していなければならず、かつ最後に、注射のために使用される水性組成物と適合可能なものでなければならない。
化合物
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本開示は、担体タンパク質、抗体、および任意の少なくとも１種の治療薬を含み、かつ任意で凍結乾燥したナノ粒子組成物に関する。
いくつかの実施形態では、当該担体タンパク質は、アルブミン、ゼラチン、エラスチン（トポエラスチン（ｔｏｐｏｅｌａｓｔｉｎ）を含む）またはエラスチン由来ポリペプチド（例えば、α－エラスチンおよびエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ））、グリアジン、レグミン、ゼイン、大豆タンパク質（例えば、分離大豆タンパク質（ＳＰＩ））、乳タンパク質（例えば、β－ラクトグロブリン（ＢＬＧ）およびカゼイン）、または乳漿タンパク質（例えば、濃縮乳漿タンパク質（ＷＰＣ）および分離乳漿タンパク質（ＷＰＩ））であってもよい。好ましい実施形態では、当該担体タンパク質はアルブミンである。好ましい実施形態では、アルブミンは卵白（卵白アルブミン）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などである。さらにより好ましい実施形態では、当該担体タンパク質はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。いくつかの実施形態では、当該担体タンパク質は一般に、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されている安全な（ＧＲＡＳ）賦形剤と見なされている。
いくつかの実施形態では、当該抗体は、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブおよびトラスツズマブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、当該抗体は、当該ナノ粒子の表面の全体または一部の上にある実質的に単層の抗体である。
表１は、非限定的な抗体の一覧を示す。
Figure 2022107690000002
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の治療薬は、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシ尿素、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチンおよびシクロホスファミドからなる群から選択される。
表２は、非限定的な癌治療薬の一覧を示す。
Figure 2022107690000003
Figure 2022107690000004
Figure 2022107690000005
Figure 2022107690000006
Figure 2022107690000007
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Figure 2022107690000009
Figure 2022107690000010
Figure 2022107690000011
当然のことながら、当該治療薬は、当該ナノ粒子の内部、当該ナノ粒子の外面またはその両方に位置していてもよい。当該ナノ粒子は、２種類以上の治療薬、例えば、２種類の治療薬、３種類の治療薬、４種類の治療薬、５種類の治療薬またはそれ以上を含んでいてもよい。さらに、ナノ粒子は、当該ナノ粒子の内部および外部に同じまたは異なる治療薬を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、いずれかの担体タンパク質、抗体、治療薬またはそれらのいずれかの組み合わせが明示的に除外される。例えばいくつかの実施形態では、組成物は、任意の担体タンパク質、およびアブラキサン（登録商標）以外の化学療法剤および／またはベバシズマブ以外のあらゆる標的化抗体を含んでいてもよい。
一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも１００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも２００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも３００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも４００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも５００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された少なくとも６００個の抗体を含む。
一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された約１００～約１０００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された約２００～約１０００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された約３００～約１０００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された約４００～約１０００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された約５００～約１０００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された約６００～約１０００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された約２００～約８００個の抗体を含む。一態様では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された約３００～約８００個の抗体を含む。好ましい実施形態では、当該ナノ粒子は、当該ナノ粒子の表面に非共有結合された約４００～約８００個の抗体を含む。想定される値としては、端点を含む列挙されている範囲のいずれかに含まれるあらゆる値または部分範囲が挙げられる。
一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は約１μｍ未満である。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約１μｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約９００ｎｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約８００ｎｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約７００ｎｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約６００ｎｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約５００ｎｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約４００ｎｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約３００ｎｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１３０ｎｍ～約２００ｎｍである。好ましい実施形態では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１５０ｎｍ～約１８０ｎｍである。特に好ましい実施形態では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は約１６０ｎｍである。想定される値としては、端点を含む列挙されている範囲のいずれかに含まれるあらゆる値または部分範囲または範囲が挙げられる。
一態様では、本ナノ粒子組成物は、静脈内注射のために製剤化されている。虚血性イベントを回避するために、静脈内注射のために製剤化された本ナノ粒子組成物は、約１μｍ未満の平均粒子径を含むナノ粒子を含むものでなければならない。
一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は約１μｍ超である。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ～約５μｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ～約４μｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ～約３μｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ～約２μｍである。一態様では、本ナノ粒子組成物における平均粒子径は、約１μｍ～約１．５μｍである。想定される値としては、端点を含む列挙されている範囲のいずれかに含まれるあらゆる値または部分範囲または範囲が挙げられる。
一態様では、本ナノ粒子組成物は、腫瘍への直接注射のために製剤化されている。直接注射としては、腫瘍部位内またはその近くへの注射および腫瘍への潅流などが挙げられる。腫瘍への直接注射のために製剤化する場合、当該ナノ粒子は、あらゆる平均粒子径を含んでいてもよい。理論によって縛られるものはないが、より大きな粒子（例えば、５００ｎｍ超および１μｍ超など）は腫瘍内に固定化される可能性がより高く、それにより有益な効果が得られると考えられる。より大きな粒子は腫瘍または特定臓器内に蓄積することができる。例えば、「ＴｈｅｒａＳｐｈｅｒｅ（登録商標）」（肝癌のために臨床的に使用されている）と呼ばれる肝臓の腫瘍に栄養を与える肝動脈内への注射のために使用される２０～６０ミクロンのガラス粒子を参照されたい。従って、静脈内投与では、１μｍ未満の粒子が典型的に使用される。１μｍ超の粒子は、より典型的には、腫瘍に直接投与される（「直接注射」）か、腫瘍部位に栄養を与える動脈に投与される。
一態様では、本組成物中の約０．０１％未満の当該ナノ粒子は、２００ｎｍ超、３００ｎｍ超、４００ｎｍ超、５００ｎｍ超、６００ｎｍ超、７００ｎｍ超または８００ｎｍ超の粒子径を有する。一態様では、本組成物中の約０．００１％未満の当該ナノ粒子は、２００ｎｍ超、３００ｎｍ超、４００ｎｍ超、５００ｎｍ超、６００ｎｍ超、７００ｎｍ超または８００ｎｍ超の粒子径を有する。好ましい実施形態では、本組成物中の約０．０１％未満の当該ナノ粒子は、８００ｎｍ超の粒子径を有する。より好ましい実施形態では、本組成物中の約０．００１％未満の当該ナノ粒子は、８００ｎｍ超の粒子径を有する。
好ましい態様では、本明細書に列挙されている粒子径および粒子径範囲は、再構成された凍結乾燥したナノ粒子組成物の粒子径に関する。すなわち、凍結乾燥したナノ粒子を水溶液（例えば、水、他の薬学的に許容される賦形剤、緩衝液など）に再懸濁した後、粒子径または平均粒子径は本明細書に列挙されている範囲内にある。
一態様では、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の当該ナノ粒子が、単一のナノ粒子として再構成された組成物中に存在する。すなわち、約５０％、４０％、３０％未満の当該ナノ粒子は二量体化または多量体化（オリゴマー化）されている。
いくつかの実施形態では、当該ナノ粒子の粒子径は、担体タンパク質：抗体の量（例えば、比）を調整することにより制御することができる。当該ナノ粒子の粒子径および粒度分布も重要である。本発明のナノ粒子は、それらの粒子径によって異なった挙動をすることがある。大きな粒子径では、塊が血管を塞ぐことがある。従って、ナノ粒子の塊は本組成物の性能および安全性に影響を与える可能性がある。他方、より大きな粒子は特定の条件下で（例えば、静脈内投与されない場合）、より治療効果を有することがある。
一態様では、本ナノ粒子組成物は、少なくとも１種のさらなる治療薬を含む。一実施形態では、少なくとも１種のさらなる治療薬は、当該ナノ粒子の外面に非共有結合的に結合されている。一実施形態では、少なくとも１種のさらなる治療薬は、当該ナノ粒子の外面に配置されている。一実施形態では、少なくとも１種のさらなる治療薬は、アビラテロン、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カバジタキセル、シスプラチン、クロラムブシル、ダサチニブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、エベロリムス、ゲムシタビン、ゲフィチニブ、イダルビシン、イマチニブ、ヒドロキシ尿素、イマチニブ、ラパチニブ、リュープロレリン、メルファラン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニロチニブ、オキサリプラチン、パゾパニブ、ペメトレキセド、ピコプラチン、ロミデプシン、サトラプラチン、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、スニチニブ、テニポシド、トリプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチンおよびシクロホスファミドからなる群から選択される。一実施形態では、少なくとも１種のさらなる治療薬は抗癌抗体である。
ナノ粒子の製造方法
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載されているナノ粒子組成物の製造方法に関する。
一態様では、約１０：１～約１０：３０の担体タンパク質粒子または担体タンパク質－治療薬粒子：抗体の比で当該担体タンパク質または担体タンパク質－治療薬粒子を当該抗体と接触させる工程によって、本ナノ粒子組成物のナノ粒子を形成する。一実施形態では、その比は約１０：２～約１０：２５である。一実施形態では、その比は約１０：２～約１：１である。好ましい実施形態では、その比は約１０：２～約１０：６である。特に好ましい実施形態では、その比は約１０：４である。想定される比としては、端点を含む列挙されている範囲のいずれに含まれるあらゆる値、部分範囲または範囲が挙げられる。
一実施形態では、当該ナノ粒子を形成するために用いられる溶液または他の液体媒体の量は特に重要である。当該担体タンパク質（または担体タンパク質－治療薬）および当該抗体の過度に薄い溶液中ではナノ粒子は形成されない。過度に濃縮された溶液により非構造化凝集物が生じる。いくつかの実施形態では、用いられる溶液（例えば、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水）の量は、約０．５ｍＬの溶液～約２０ｍＬの溶液である。いくつかの実施形態では、担体タンパク質の量は約１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、抗体の量は約１ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬである。例えば、いくつかの実施形態では、担体タンパク質：抗体：溶液の比は、約９ｍｇの担体タンパク質（例えば、アルブミン）：４ｍｇの抗体（例えば、ＢＥＶ）：１ｍＬの溶液（例えば、生理食塩水）である。ある量の治療薬（例えば、タキソール）を当該担体タンパク質に添加することもできる。例えば、１ｍｇのタキソールを、９ｍｇの担体タンパク質（１０ｍｇの担体タンパク質－治療薬）：４ｍｇの抗体：１ｍＬの溶液に添加することもできる。典型的な点滴袋を用いる場合に、例えば約１リットルの溶液を用いる場合、１ｍＬで使用する場合と比較して１０００倍量の担体タンパク質／担体タンパク質－治療薬および抗体を使用する必要がある。従って、標準的な点滴袋の中で当該ナノ粒子を形成することができない。さらに、それらの成分を本発明の治療量で標準的な点滴袋に添加する場合、それらの成分は自己集合してナノ粒子を形成しない。
一実施形態では、約４～約８のｐＨを有する溶液中で当該担体タンパク質または担体タンパク質－治療薬粒子を当該抗体と接触させる。一実施形態では、約４のｐＨを有する溶液中で当該担体タンパク質または担体タンパク質－治療薬粒子を当該抗体と接触させる。一実施形態では、約５のｐＨを有する溶液中で当該担体タンパク質または担体タンパク質－治療薬粒子を当該抗体と接触させる。一実施形態では、約６のｐＨを有する溶液中で当該担体タンパク質または担体タンパク質－治療薬粒子を当該抗体と接触させる。一実施形態では、約７のｐＨを有する溶液中で当該担体タンパク質または担体タンパク質－治療薬粒子を当該抗体と接触させる。一実施形態では、約８のｐＨを有する溶液中で当該担体タンパク質または担体タンパク質－治療薬粒子を当該抗体と接触させる。好ましい実施形態では、約５～約７のｐＨを有する溶液中で当該担体タンパク質または担体タンパク質－治療薬粒子を当該抗体と接触させる。
一実施形態では、当該担体タンパク質粒子または担体タンパク質－治療薬粒子を約５℃～約６０℃の温度あるいは任意の範囲、部分範囲または端点を含むその範囲に含まれる値において当該抗体と共にインキュベートする。好ましい実施形態では、当該担体タンパク質粒子または担体タンパク質－治療薬粒子を約２３℃～約６０℃の温度で当該抗体と共にインキュベートする。
理論によって縛られるものはないが、本ナノ粒子組成物における当該ナノ粒子の安定性は、少なくとも一つとして、当該ナノ粒子が形成される温度および／またはｐＨならびに溶液中の成分（すなわち、担体タンパク質、抗体および任意で治療薬）の濃度に依存すると考えられる。一実施形態では、当該ナノ粒子のＫｄは約１×１０－１１Ｍ～約２×１０－５Ｍである。一実施形態では、当該ナノ粒子のＫｄは約１×１０－１１Ｍ～約２×１０－８Ｍである。一実施形態では、当該ナノ粒子のＫｄは約１×１０－１１Ｍ～約７×１０－９Ｍである。好ましい実施形態では、当該ナノ粒子のＫｄは約１×１０－１１Ｍ～約３×１０－８Ｍである。想定される値としては、端点を含む列挙されている範囲のいずれかに含まれるあらゆる値または部分範囲または範囲が挙げられる。
凍結乾燥
安定化剤、緩衝液などの存在下または非存在下での標準的な凍結乾燥技術により、本発明の凍結乾燥した組成物を調製する。驚くべきことに、これらの条件は当該ナノ粒子の比較的脆弱な構造を変化させない。さらに、少なくとも、これらのナノ粒子は、凍結乾燥した際にそれらの粒度分布を保持し、さらに重要なことに、新たに調製した場合と実質的に同じ形態および比で生体内投与（例えば、静脈内送達）のために再構成することができる。
製剤
一態様では、本ナノ粒子組成物は、腫瘍への直接注射のために製剤化されている。直接注射としては、腫瘍部位内またはその近くへの注射および腫瘍への潅流などが挙げられる。本ナノ粒子組成物は全身に投与されないため、腫瘍への直接注射のために製剤化されたナノ粒子組成物はあらゆる平均粒子径を含んでいてもよい。理論によって縛られるものはないが、より大きな粒子（例えば、５００ｎｍ超および１μｍ超など）は腫瘍内に固定化される可能性がより高く、それにより有益な効果が得られると考えられる。
別の態様では、本明細書に示されている化合物および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物が本明細書において提供される。
一般に、本明細書に示されている化合物は、許容される投与様式のいずれかにより患者に投与するために製剤化することができる。各種製剤および薬物送達システムは当該技術分野において入手可能である。例えば、Gennaro, A.R., ed. (1995) Remington’s Pharmaceutical Sciences（レミントンの製薬科学）, 18th ed., Mack Publishing Coを参照されたい。
一般に、本明細書に示されている化合物は、医薬組成物として、経口、全身（例えば、経皮、鼻腔内または坐薬）あるいは非経口（例えば、筋肉内、静脈内または皮下）投与経路のいずれか１つにより投与される。
本組成物は一般に、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた本発明の化合物からなる。許容される賦形剤は、有害でなく、投与を支援し、かつ本特許請求されている化合物の治療効果に悪影響を与えない。そのような賦形剤は、一般に当業者に入手可能なあらゆる固体、液体、半固体または、エアロゾル組成物の場合は気体の賦形剤であってもよい。
固体の医薬品賦形剤としては、澱粉、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、塩化ナトリウムおよび乾燥スキムミルクなどが挙げられる。液体および半固体賦形剤は、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノールおよび各種油、例えば石油、動物、植物または合成由来の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油などから選択してもよい。特に注射溶液のための好ましい液体担体としては、水、生理食塩水、水性デキストロースおよびグリコールが挙げられる。他の好適な医薬品賦形剤およびそれらの製剤についてはRemington's Pharmaceutical Sciences（レミントンの製薬科学）, edited by E. W. Martin (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990)に記載されている。
本組成物を、所望であれば、有効成分を含む１つ以上の単位剤形を含むパックまたはディスペンサー装置として提供してもよい。そのようなパックまたは装置は、例えば、金属もしくはプラスチック箔、例えばブリスターパックまたはガラスおよびバイアルなどに使用されるゴム栓を含んでいてもよい。このパックまたはディスペンサー装置には投与のための説明書が添付されていてもよい。適合可能な医薬用担体に入れて製剤化された本発明の化合物を含む組成物を調製し、適当な容器に入れ、指示された条件の治療に関するラベルを貼ってもよい。
治療方法
本明細書に記載されているナノ粒子組成物は、哺乳類における癌細胞および／または腫瘍の治療において有用である。好ましい実施形態では、哺乳類はヒト（すなわち、ヒトの患者）である。好ましくは、投与前に凍結乾燥したナノ粒子組成物を再構成する（水性賦形剤に懸濁する）。
一態様では、癌細胞を有効量の本明細書に記載されているナノ粒子組成物と接触させて癌細胞を治療する工程を含む、癌細胞の治療方法が提供される。癌細胞の治療としては、限定されるものではないが、増殖の減少、癌細胞の死滅および癌細胞の転移の防止などが挙げられる。
一態様では、患者に治療的有効量の本明細書に記載されているナノ粒子組成物を投与して腫瘍を治療する工程を含む、それを必要とする患者における腫瘍の治療方法が提供される。一実施形態では、腫瘍サイズを減少させる。一実施形態では、少なくとも治療中および／または治療後の期間に腫瘍サイズは増加（すなわち進行）しない。
一実施形態では、本ナノ粒子組成物を静脈内に投与する。一実施形態では、本ナノ粒子組成物を腫瘍に直接投与する。一実施形態では、本ナノ粒子組成物を直接注射または腫瘍への潅流により投与する。
一実施形態では、本方法は、
ａ）本ナノ粒子組成物を３週間にわたって１週間に１回投与する工程、
ｂ）本ナノ粒子組成物の投与を１週間中止する工程、および
ｃ）任意で、必要に応じて工程ａ）およびｂ）を繰り返して腫瘍を治療する工程
を含む。
一実施形態では、治療的有効量の本明細書に記載されているナノ粒子は、約５０ｍｇ／ｍ２～約２００ｍｇ／ｍ２の担体タンパク質または担体タンパク質＋治療薬を含む。好ましい実施形態では、治療的有効量は、約７５ｍｇ／ｍ２～約１７５ｍｇ／ｍ２の担体タンパク質または担体タンパク質＋治療薬を含む。想定される値としては、端点を含む列挙されている範囲のいずれかに含まれるあらゆる値または部分範囲または範囲が挙げられる。
一実施形態では、治療的有効量は、約２０ｍｇ／ｍ２～約９０ｍｇ／ｍ２の抗体を含む。好ましい実施形態では、治療的有効量は、３０ｍｇ／ｍ２～約７０ｍｇ／ｍ２の抗体を含む。想定される値としては、端点を含む列挙されている範囲のいずれかに含まれるあらゆる値または部分範囲または範囲が挙げられる。
本明細書に記載されている組成物および方法によって治療することができる癌または腫瘍としては、限定されるものではないが、胆道癌、脳癌（膠芽腫および髄芽腫など）、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、血液学的腫瘍（急性リンパ性および骨髄性白血病など）、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、上皮内腫瘍（ボーエン病およびパジェット病など）、肝癌（肝細胞癌）、肺癌、リンパ腫（ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫など）、神経芽細胞腫、口腔癌（扁平上皮癌など）、卵巣癌（上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じるもの）、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫（平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫など）、皮膚癌（黒色腫、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌など）、精巣癌（胚腫瘍（germinal tumor）（精上皮腫、非精上皮腫［奇形腫、絨毛癌］）、間質性腫瘍および胚細胞腫瘍など）、甲状腺癌（thyroid cancer）（甲状腺癌（thyroid adenocarcinoma）および髄様癌など）ならびに腎癌（腺癌およびウィルムス腫瘍など）が挙げられる。重要な実施形態では、癌または腫瘍として、乳癌、リンパ腫、多発性骨髄腫および黒色腫が挙げられる。
一般に、本発明の化合物は、同様の有用性を与える薬剤の許容される投与様式のうちのいずれかにより治療的有効量で投与される。本発明の化合物、すなわち当該ナノ粒子の実際の量は、治療される疾患の重症度、対象の年齢および相対的健康状態、使用される化合物の効力、投与経路および形態ならびに当業者によく知られている他の因子などの数多くの因子によって決まる。
そのような薬剤の有効量は日常的な実験法により容易に決定することができ、最も有効かつ好都合な投与経路および最も適当な製剤も同様に決定することができる。各種製剤および薬物送達システムが当該技術分野において入手可能である。例えば、Gennaro, A.R., ed. (1995) Remington’s Pharmaceutical Sciences（レミントンの製薬科学）, 18th ed.を参照されたい。
薬剤、例えば本発明の化合物の有効量または治療的有効量もしくは用量とは、対象における症状の寛解または生存期間の延長を生じる薬剤または化合物のそのような量を指す。そのような分子の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（母集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（母集団の５０％治療有効量）を決定することにより、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定することができる。毒性作用：治療効果の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる治療指数である。高い治療指数を示す薬剤が好ましい。
有効量または治療的有効量は、研究者、獣医、医師または他の臨床医によって探究されている組織、システム、動物またはヒトの生物学的または医学的反応を引き起こす化合物または医薬組成物の量である。投与量は、用いられる剤形および／または利用される投与経路に応じてこの範囲内で異なってもよい。正確な製剤、投与経路、投与量および投与間隔は、対象の状態の性質を考慮して当該技術分野で知られている方法に従って選択しなければならない。
所望の効果を達成するのに十分な活性部分の血漿中濃度すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を得るために、投与量および投与間隔を個々に調整することができる。ＭＥＣは化合物ごとに異なり、例えば生体外データおよび動物実験から推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は個々の特性および投与経路によって決まる。局所投与または選択的取込みの場合、薬物の有効な局所濃度を血漿中濃度と関連づけることはできない。
コアとしてアルブミン結合パクリタキセル（すなわち、アブラキサン（登録商標））またはシスプラチンおよび抗体としてベバシズマブ（すなわち、アバスチン（登録商標））またはリツキシマブ（すなわち、リツキサン（登録商標））からなるナノ粒子を用いて、本開示を説明する。
当業者であれば、実施例のナノ粒子の製造および使用方法は単に例示のためのものであり、本開示はこの例示によって限定されないことが分かるであろう。
本明細書で使用されるあらゆる略語は通常の科学的意味を有する。特に明記しない限り全ての温度は℃である。本明細書では、以下の用語は特に定義しない限り以下の意味を有する。
ＡＢＸ ＝アブラキサン（登録商標）／（アルブミン結合パクリタキセル）
ＡＣ ＝シスプラチン結合ＡＢＸ
ＡＣＮ ＝アセトニトリル
ＡＤＣ ＝抗体依存性化学療法
ＢＥＶ ＝ベバシズマブ
ＢＳＡ ＝ウシ血清アルブミン
ｄＨ２Ｏ ＝蒸留水
ＤＭＥＭ ＝ダルベッコ変法イーグル培地
ｎＭ ＝ナノモル
ＥｄＵ ＝５－エチニル－２’－デオキシウリジン
ＥＭ ＝電子顕微鏡法
ＦＣＢ ＝フローサイトメトリー緩衝液
ＦＩＴＣ ＝フルオレセイン
ｋＤ ＝キロダルトン
Ｋｄ ＝解離定数
ｋｇ ＝キログラム
ＫＶ ＝キロボルト
Ｌ／ｈｒ ＝リットル／時間
ＬＣ－ＭＳ ＝液体クロマトグラフィ－質量分析
Ｍ ＝モル
ｍＣｉ ＝ミリキューリー
ｍｇ ＝ミリグラム
ｍｌまたはｍＬ ＝ミリリットル
ｍ２ ＝平方メートル
ｍｍ３ ＝立方ミリメートル
μｇ ＝マイクログラム
μｌ ＝マイクロリットル
μｍ ＝マイクロメートル／ミクロン
ＰＢＳ ＝リン酸緩衝生理食塩水
ｐＫ ＝薬物動態
ＲＴ ＝室温
ｒｐｍ ＝毎分回転数
Ｖ ＝ボルト
×ｇ ＝×重力加速度
実施例１：ナノ粒子の調製
アブラキサン（ＡＢＸ）（１０ｍｇ）をベバシズマブ（ＢＥＶ）（特に明記しない限り４ｍｇ［１６０μｌ］）に懸濁し、８４０μｌの０．９％生理食塩水を添加して、１０ｍｇ／ｍｌのＡＢＸおよび２ｍｇ／ｍＬのＢＥＶの最終濃度を得た。混合物を室温（または指示された温度）で３０分間インキュベートして粒子を形成した。ＡＢＸ：ＢＥＶ複合体の粒子径を測定するためのマスターサイザー実験のために、１０ｍｇのＡＢＸを０～２５ｍｇ／ｍｌの濃度のＢＥＶに懸濁した。同様の条件下で、ＡＢＸとリツキシマブ（０～１０ｍｇ／ｍｌ）またはトラスツズマブ（０～２２ｍｇ／ｍｌ）との複合体を形成した。
ヒトでの使用のために、２５ｍｇ／ｍＬのＢＥＶを含む用量に適した数の４ｍＬバイアルを得て、各バイアルを以下の指示に従って４ｍｇ／ｍＬに希釈することにより、ＡＢＸ：ＢＥＶ複合体を調製してもよい。１０ｍｇ／ｍＬのＡＢＸナノ粒子を含む最終濃度に再構成することにより、１００ｍｇのＡＢＸを含む用量に適当した数のバイアルを調製することができる。無菌の３ｍＬ注射器を用いて、１．６ｍＬ（４０ｍｇ）のベバシズマブ（２５ｍｇ／ｍＬ）を抜き出して、最低１分かけて１００ｍｇのＡＢＸを含む各バイアルの内壁にゆっくりと注入した。泡が生じるため、ベバシズマブ溶液を凍結乾燥した塊の上に直接注入してはいけない。次いで、１２ｍＬ無菌注射器を用いて、８．４ｍＬの０．９％塩化ナトリウム注射液（ＵＳＰ）を抜き出して、８．４ｍＬを１００ｍｇのＡＢＸおよび４０ｍｇのＢＥＶを含む各バイアルの内壁に最低１分かけてゆっくりと注入することができる。１．６ｍＬのＢＥＶおよび８．４ｍＬの０．９％塩化ナトリウム注射液（ＵＳＰ）の添加が完了したら、あらゆる塊／粉末の完全溶解が生じるまで、各バイアルを穏やかに回転させ、かつ／または少なくとも２分間ゆっくりと反転させることができる。泡の生成を回避しなければならない。この時点で、各バイアルの濃度を１００ｍｇ／１０ｍＬのＡＢＸおよび４０ｍｇ／１０ｍＬのＢＥＶにしなければならない。ＡＢＸおよびＢＥＶを含むバイアルを６０分間放置しなければならない。バイアルを１０分ごとに穏やかに回転および／または反転させて複合体を混合し続けなければならない。６０分が経過した後、ＡＢＸおよびＢＥＶの計算した用量体積を各バイアルから抜き出して空のＶＩＡＦＬＥＸ点滴袋にゆっくりと添加しなければならない。次いで、等体積の０．９％塩化ナトリウム注射液（ＵＳＰ）を添加して５ｍｇ／ｍＬのＡＢＸおよび２ｍｇ／ｍＬのＢＥＶの最終濃度を調製する。次いで、この点滴袋を穏やかに回転させ、かつ／またはゆっくりと１分間反転させて混合しなければならない。ＡＢＸ：ＢＥＶナノ粒子を最終希釈後に最長４時間室温で貯蔵することができる。
実施例２：生体外でのＡＢＸおよびＢＥＶの結合
ＡＢＸおよびＢＥＶが相互作用するか否かを判定するために、実施例１で形成したナノ粒子をフローサイトメトリーおよび電子顕微鏡法により分析した。
方法
［フローサイトメトリー］：上記実施例１に記載されているとおりにＡＢ１６０を生成した。ＢＥＶのＡＢＸへの結合を判定するために、Accuri C6フローサイトメーター(ＢＤ社、ニュージャージー州フランクリンレイクス）でＡＢ１６０の可視化を行い、Accuri C6ソフトウェアを用いてデータ分析を行った。ビオチン化した５μｇのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を５μｇのストレプトアビジン－ＰＥ（Ａｂｃａｍ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）で標識した。ＢＥＶのＦａｂ部分がマウス由来であるという理由から、ＡＢ１６０を標識するためにヤギ抗マウスＩｇＧを選択した。ＡＢＸおよびＡＢ１６０をＰＥで標識したヤギ抗マウスＩｇＧと共に３０分間室温でインキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリーにより可視化した。
［電子顕微鏡法］：６ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに溶解した５μｌのＡＢＸをパーロディアン（ｐａｒｌｏｄｉａｎ）－炭素で被覆した３００メッシュ銅グリッドに添加し、１分間放置した。先尖状の濾紙片を液滴と接触させて過剰な液体を除去し、グリッド上に薄膜を得た。グリッドを乾燥させた。乾燥させたグリッド上に残った緩衝液結晶を溶解するために、試料をｄＨ２Ｏ中で３回洗浄した。１％リンタングステン酸（ＰＴＡ）の小滴（ｐＨ７．２）をグリッドに添加した。次いで、グリッドを先尖状の濾紙片に再度接触させて過剰な液体を除去し、グリッド上に薄膜を得、乾燥させた。０．９％塩化ナトリウム溶液中に２５ｍｇ／ｍｌのＢＥＶ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）を１：１０の比でＰＢＳで希釈した。５μｌのＢＥＶをニッケルホルムバールで被覆したグリッド上に載せ、３０分間から１時間空気乾燥させた。ＡＢ１６０のために、ＰＢＳに溶解した１０ｍｇ／ｍｌのＡＢＸおよび０．９％塩化ナトリウム溶液に溶解した４ｍｇ／ｍｌのＢＥＶを２．５：１の比で混合した。この複合体を１：５でＰＢＳでさらに希釈した。５μｌの複合体をニッケルホルムバールで被覆したグリッド上に載せ、３０分から１時間空気乾燥させた。両試料を６ｎｍの金結合粒子（Electron Microscopy Sciences社）と共にヤギ抗マウスＩｇＧ中で１時間インキュベートし、１０％ＦＣＢ／ＰＢＳで１：３０で希釈し、ＰＢＳで６回（それぞれ２分）、ｄＨ２Ｏで６回洗浄し、次いで２％メチルセルロースおよび４％ＵＡ（９：１）の混合物で５分間染色した。濾紙を使用して染色を流し出し、グリッドを１時間空気乾燥させた。両試料をロバ抗マウスＩｇＧ中で６ｎｍの金結合粒子（Jackson ImmunoResearch社）と共に一晩インキュベートし、１０％ＦＣＢ／ＰＢＳで１：２５で希釈し、ＰＢＳで６回（それぞれ２分）、ｄＨ２Ｏ水で６回洗浄し、１％ＰＴＡで５分間染色し、空気乾燥させ、２％メチルセルロースで覆い、１時間空気乾燥させた。８０ＫＶで動作するＪＥＯＬ１４００で顕微鏡写真を撮影した。
結果
生体外でＡＢＸ（１０ｍｇ／ｍｌ）を４ｍｇ／ｍｌのＢＥＶと共にインキュベートし、それらが１６０ｎｍのナノ粒子（本明細書ではＡＢ１６０という）を形成したことを見い出した。ＩｇＧ１（ＢＥＶ）のＦａｂ部分はマウス由来であるため、ＢＥＶを含む粒子を精製したヤギ抗マウスＩｇＧで、次いで二次抗体として抗ヤギＰＥで選択的に標識した。陰性対照として、試料を抗ヤギＰＥのみで染色した。粒子をフローサイトメトリーにより可視化し、ＡＢＸ単独（６．７％陽性）と比べて抗マウスＩｇＧ１がＡＢ１６０に結合しているという明るいシグナル（４１．２％陽性）が実証された（図１Ａ）。ＢＥＶのＡＢＸとの結合を確認するために、ＢＥＶを金で標識したマウス抗ヒトＩｇＧで標識し、その粒子を電子顕微鏡法を用いて可視化した（図１Ｂ）。驚くべきことに、ＥＭ画像はＡＢＸナノ粒子を取り囲むＢＥＶの単層を示唆している。
複合体が解離した際にパクリタキセルがどのタンパク質（アルブミンまたはＢＥＶ）に結合したままであるかを判定するために、ＡＢ１６０を調製し、画分すなわち微粒子（ナノＡＢ１６０）、１００ｋＤ超のタンパク質および１００ｋＤ未満のタンパク質を回収した。液体クロマトグラフィ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により、各画分中のパクリタキセルを測定した。約７５％のパクリタキセルが微粒子中に残り、残っているパクリタキセルの大部分が１００ｋＤ以上のタンパク質を含む画分と結合しており（図１Ｃ、上）、これは、その微粒子が解離した際に、パクリタキセルがＢＥＶ単独またはＢＥＶとアルブミンとのヘテロ二量体に結合されることを示唆している。これは解離した複合体が、高いＶＥＧＦ腫瘍微小環境になお移動する抗体と共に化学療法剤を含むことを示している。これらの発見をＡＢ１６０からの上澄みのウエスタンブロット分析によって確認し、これにより、ＢＥＶおよびパクリタキセルがパクリタキセル－ＢＥＶ－アルブミンタンパク質複合体と一致した大きさである約２００ｋＤで共局在化することが分かった（図１Ｃ、下）。
実施例３：生体外でのＡＢ１６０の機能
複合体中の２つの主要な要素である抗体およびパクリタキセルが複合体中に存在している場合にそれらの機能を保持しているという確認を行った。
方法
［生体外毒性］：Ａ３７５ヒト黒色腫細胞株（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）およびＤａｕｄｉ（Ｂ細胞リンパ腫株）（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）を、１％ＰＳＧおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞を回収し、１つのウェル当たり０．７５×１０６個の細胞で２４ウェルプレートに播種した。細胞を０～２００μｇ／ｍｌのパクリタキセル濃度でＡＢＸまたはＡＢ１６０に３７℃および５％ＣＯ２で一晩曝露した。増殖を測定するために、Click-iT EdU（Molecular Probes社、オレゴン州ユージーン）キットを利用した。簡単に言うと、１０ｍＭのＥｄＵをウェルに添加し、細胞およびＡＢＸまたはＡＢ１６０と共に一晩インキュベートした。細胞を１％サポニンで透過処理し、介在ＥｄＵをＦＩＴＣ結合抗体で標識した。各処理からのＦＩＴＣ陽性細胞を未処理のＥｄＵ標識細胞の最大増殖で割って、増殖指数を決定した。
［VEGF ELISA］：ＢＥＶがＡＢＸに結合されている場合に、そのリガンドであるＶＥＧＦになお結合することができるか否かを判定するために、標準的なVEGF ELISA（R and D Systems社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いた。ＡＢ１６０を記載のとおりに調製し、２０００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦをＡＢ１６０複合体またはＡＢＸ単独に添加した。ＶＥＧＦを当該ナノ粒子と共に室温で２時間インキュベートした。懸濁液を６０００ｒｐｍで１５分間回転させ、上澄みを回収し、遊離ＶＥＧＦをＥＬＩＳＡで測定した。簡単に言うと、ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩、捕獲抗体で被覆した。プレートを洗浄し、ブロックし、標準物質および試料を添加した。洗浄後、検出抗体を添加し、プレートを基質（R and D Systems社、ミネソタ州ミネアポリス）で発色させた。吸光度をVersamax ELISAプレートリーダー（Molecular Devices社、カリフォルニア州ニーヴェール）を用いて４５０ｎｍで測定した。０～２０００ｐｇ／ｍｌの標準曲線を用いて未結合ＶＥＧＦの濃度を決定した。
結果
ＡＢ１６０は、ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５を用いた生体外毒性アッセイにおいてＡＢＸ単独と比べて同様の毒性を有し、これは、パクリタキセルがいずれの製剤においても同様に機能することを示唆している（図１Ｄ）。
ＶＥＧＦのＡＢ１６０複合体中のＢＥＶへの結合を試験するために、ＡＢ１６０またはＡＢＸをＶＥＧＦと共にインキュベートし、微粒子を除去し、上澄みをＶＥＧＦ含有量について試験した。ＡＢ１６０から測定した上澄みにおけるＶＥＧＦの欠如（１０％未満の未結合ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦがＡＢ１６０複合体中のＢＥＶによって結合されているが、ＡＢＸ単独と共にインキュベートした場合は遊離したままである（８０％超の未結合ＶＥＧＦ）ことを示していた（図１Ｅ）。
重要なことに、これらのアッセイにより、ＡＢ１６０中のパクリタキセルが腫瘍細胞に対するその毒性を保持し、かつ結合されたＢＥＶはそのリガンドＶＥＧＦに結合する能力を維持することが実証された。
実施例４：粒子径およびタンパク質の親和性
ＢＥＶがＡＢＸに結合した際に形成されるナノ粒子の特性を理解するために、ＡＢＸ：ＢＥＶ複合体の粒子径をＡＢＸに対して測定した。
方法
［マスターサイザーおよびナノサイト（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）］：マスターサイザー２０００（Malvern Instruments社、マサチューセッツ州ウエストボロ）での動的光散乱により、ＡＢＸおよび抗体－ＡＢＸ薬物複合体の粒子径を測定した。粒子径を測定するために、２ｍｌ（５ｍｇ／ｍｌ）のアブラキサンまたは複合体を試料室に添加した。Ｍａｌｖｅｒｎソフトウェアを用いてデータを分析し、粒度分布を体積で表示した。粒子径および安定性は後にナノサイトシステム（Malvern Instruments社、マサチューセッツ州ウエストボロ）を用いて確認した。ＡＢＸまたは複合体粒子を適当な範囲まで希釈して粒子径を正確に測定した。データを粒度分布で表示した。但し、ナノ粒子追跡分析ではブラウン運動を使用して粒子径を測定した。
［結合アッセイ］：ビオチン化したＢＥＶ、リツキシマブまたはトラスツズマブを１００μｇ／ｍｌでストレプトアビジンプローブ（ForteBio社、カリフォルニア州メンローパーク）に結合させた。ＡＢＸの結合を１０００、５００および１００ｍｇ／ｍｌで、ＢＬＩｔｚシステム（ForteBio社、カリフォルニア州メンローパーク）で吸光度により測定した。ＢＬＩｔｚソフトウェアを用いて結合および解離定数を計算した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩｔｚ）技術を利用して、ＢＥＶのＡＢＸへの結合親和性を評価した。ビオチン化したＢＥＶをストレプトアビジンプローブに結合させ、ＡＢＸ（１０００、５００および１００μｇ／ｍｌ）に曝露した。ＢＥＶおよびＡＢＸの解離定数（Ｋｄ）は室温およびｐＨ７では２．２×１０－８Ｍであり、これは強い非共有結合性相互作用と一致している。ＢＥＶおよびＡＢＸの結合親和性は、アルブミンといくつかの細菌タンパク質の天然もしくは人工アルブミン結合ドメインとの間で観察される解離定数の範囲内である。Nilvebrant, J. et al. (2013) Comput Struct Biotechnol J 6:e201303009。
結果
ＡＢＸ：ＢＥＶナノ粒子は、一貫して１３０ｎｍのＡＢＸ単独よりも大きかった（約１６０ｎｍ）（図２Ａ）。形成されたナノ粒子の粒子径は、使用したＢＥＶの濃度と直接相関しており、メジアン径は０．１５７～２．１６６μｍの範囲であった（図２Ａ）。これらの研究の目標は第１相臨床試験であり、最小のＡＢＸ：ＢＥＶ粒子（ＡＢ１６０）が１３０ｎｍのＡＢＸに最も類似しているため、それに焦点を合わせた。ＡＢ１６０粒子の粒子径は、ＡＢＸ＋それを取り囲んでいる単層のＢＥＶおよび粒子のＥＭ画像と一致していた（図１Ｂを参照）。
静脈内投与条件がナノ粒子の粒度分布に影響を与えるか否かを判定するために、室温の生理食塩水中で最長２４時間インキュベートしたＡＢ１６０（またはＡＢＸ）の粒度分布を評価した。ＡＢ１６０の粒度分布は最長２４時間有意に変化しない（図９Ａおよび図９Ｂ）。しかし、室温で４時間後までの間に、ＥＬＩＳＡにより、ＡＢ１６０の解離の若干の証拠が認められる（図９Ｃ）。
血漿中でのＡＢ１６０の安定性を決定するために、ＡＢＸまたはＡＢ１６０を９：１または１：１の相対体積比で生理食塩水またはヘパリン添加ヒト血漿中でインキュベートした。ＡＢＸ（図１０、上のパネル）またはＡＢ１６０（図１０、下のパネル）のいずれかを血漿中で等体積（１：１）でインキュベートした場合、粒子（０．０１～１μｍ）は検出されなかったことに特に注目されたい。
ウエスタンブロット（データは示さず）は、生理食塩水またはヘパリン添加ヒト血漿においてＡＢ１６０が腫瘍標的抗体、アルブミンおよび細胞毒性薬パクリタキセルをなお含むより小さいタンパク質複合体に解離したことを示した。これらのタンパク質複合体は腫瘍を標的にし、腫瘍部位に送達されると素早く溶解して細胞毒性ペイロードを放出し、腫瘍細胞によるナノ粒子全体の取込みなしに腫瘍退縮を有効に開始することができるそれらの能力を保持している。
次に、結合親和性がｐＨおよび／または温度依存性であるか否かを試験するために、ＡＢＸをＢＥＶに懸濁し、その混合物を各種温度（室温、３７℃および５８℃）でインキュベートする前に、３、５、７または９のｐＨの生理食塩水で希釈して粒子を形成した。ＡＢＸおよびＢＥＶの結合親和性はｐＨおよび温度依存性であり、ｐＨ５および５８℃で粒子が形成された際に最も高い結合親和性が観察された（図２Ｂ）。
５８℃およびｐＨ５でのＢＥＶおよびＡＢＸのより高い親和性結合が複合体の安定性に置き換えられるか否かを判定するために、ナノ粒子追跡分析（ナノサイト）により各種製剤を比較した。ヒトＡＢ血清中で０、１５、３０または６０分間インキュベートした後に、５８℃およびｐＨ５（ＡＢ１６００５５８）、室温およびｐＨ７（ＡＢ１６００７）または５８℃およびｐＨ７（ＡＢ１６００７５８）で調製したＡＢ１６０の安定性を、同じ条件に曝露したＡＢＸ（それぞれＡＢＸ０５５８、ＡＢＸ０７およびＡＢＸ０７５８）と比較した。
ヒトＡＢ血清への曝露後に１ｍｇのＡＢＸ当たりに存在する粒子の数によって示されるように、より高い親和性条件（ｐＨ７および５８℃）下で調製した粒子はより安定でもあった。ＡＢ１６０粒子は、それらの結合親和性と相関するヒト血清中での安定性の上昇を示した。特に、ＡＢ１６００７およびＡＢ１６００５５８は、１ｍｇのＡＢＸ当たりで測定した粒子の粒子径および数によって決定されるように、ＡＢＸ単独よりも生理食塩水およびヒト血清の両方において安定であった（図２Ｃおよび表３）。これは、ＡＢ１６０粒子を形成する条件を変えることにより、ＡＢ１６０粒子の安定性を操作することができることを示している。
Figure 2022107690000012
これらのデータにより、強い非共有結合を示すピコモル範囲の親和性によりＢＥＶがＡＢＸに結合することが実証され、かつ抗体分子の単層によって取り囲まれたＡＢＸと一致した粒度分布、すなわち形成された粒子の粒子径が抗体濃度に依存していることが実証された。
実施例５：マウスにおけるＡＢ１６０の有効性
胸腺欠損ヌードマウスに移植されたＡ３７５ヒト黒色腫細胞の異種移植モデルを用いて生体内でのＡＢ１６０の有効性を試験した。
方法
生体内実験を少なくとも２回行った。検定力分析により、この実験に必要なマウスの数を決定した。マウスの腫瘍を週に２～３回測定し、腫瘍が１０重量％になったらマウスを屠殺した。腫瘍反応を完了したマウスを治療後６０～８０日間監視した。マウス研究の評価項目は生存期間中央値であった。カプラン・マイヤー曲線を生成し、Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ試験を行って、治療群間の生存期間中央値の有意性を決定した。生体外で示された結果は、少なくとも５回繰り返した実験を示す。スチューデントｔ検定を用いて、ベースライン実験からの生体外および生体内での変化率の統計学的分析を行った。
［マウスモデル］：腫瘍効果を試験するために、１×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を胸腺欠損ヌードマウス（Harlan Sprague Dawley社、インディアナ州インディアナポリス）の右脇腹に移植した。腫瘍が約７００ｍｍ３のサイズに到達したらマウスを無作為化し、ＰＢＳ、ＡＢＸ（３０ｍｇ／ｋｇ）、ＢＥＶ（１２ｍｇ／ｋｇ）（ＢＥＶの後にＡＢＸ）または上記濃度のＡＢ１６０で治療した。より大きなＡＢ粒子を試験するマウス実験では、ＢＥＶ単独治療群において、より大きな粒子を形成するために必要な最も高い用量のＢＥＶ（４５ｍｇ／ｋｇ）を使用した。腫瘍サイズを週に３回／監視し、腫瘍体積を方程式：（長さ×幅２）／２を用いて計算した。腫瘍サイズがマウス体重の１０％すなわち約２５００ｍｍ３と等しくなったらマウスを屠殺した。［（治療日の腫瘍サイズ－７日目の腫瘍サイズ）／治療日の腫瘍サイズ］×１００により、ベースラインから７日目の変化率を計算した。ＡＲ１６０の生体内試験は、５×１０６個のＤａｕｄｉ細胞を胸腺欠損ヌードマウスの右脇腹に注射したこと以外は同様であった。
結果
ＡＢ１６０をＰＢＳ、単剤単独および連続投与される薬物に対して試験した。治療後７日目に、ＡＢ１６０で治療したマウスでは全ての他の治療群と比較してベースラインに対して腫瘍サイズが有意に減少した（ｐ＝０．０００１～０．００８９）（図３Ａ）。ＡＢ１６０で治療した全てのマウスにおいて７日目に腫瘍が退縮し、この腫瘍反応は、全ての他の群と比べてＡＢ１６０群の生存期間中央値の有意な増加に置き換えられ（図３Ｂ）、ＰＢＳ（ｐ＜０．０００１）、ＢＥＶ（ｐ＝０．００３）、ＡＢＸ（ｐ＝０．０００３）、ＢＥＶ＋ＡＢＸ（ｐ＝０．０００６）およびＡＢ１６０群でそれぞれ、７、１４、１４、１８および３３日間の生存であった。
より大きな腫瘍はより高い局所ＶＥＧＦ濃度を有する可能性が高い。治療日の腫瘍サイズ（７００ｍｍ３未満および７００ｍｍ３超）に基づいてデータを分析すると、より大きな腫瘍はＡＢ１６０に対してより大きな反応を有することが分かり、これは、より高い腫瘍ＶＥＧＦ濃度により腫瘍により多くのＢＥＶ標的化ＡＢＸが引き寄せられることを示唆している。ベースラインからの変化率の差はＡＢ１６０群では有意であった（ｐ＝０．００５７）。この観察はＡＢＸ単独群（ｐ＝０．７５２）では認められず、ＡＢＸは標的化能力を有していなかった（図３Ｃ）。
図２Ａに示すように、増加するＢＥＶ：ＡＢＸ比を用いて増加する粒子径を有する粒子を調製した。腫瘍退縮および生存期間中央値は粒子径の増加と確実に相関性があり、これは、より大きな粒子の生体内分布がより小さい粒子と比べて変化し得ることを示している（図３Ｄおよび図３Ｅ）。マウスに対して完全な毒性試験を行い、毒性は認められなかった。
実施例６：マウスにおけるパクリタキセルの薬物動態
ＡＢ１６０およびＡＢＸの薬物動態（ｐｋ）を比較するために、ＡＢ１６０またはＡＢＸが投与されたマウスにおいて０、４、８、１２および２４時間後の血漿パクリタキセル濃度を測定した。
方法
［パクリタキセルの薬物動態］：Agilent Poroshell 120 EC-C18分析カラム（２．１×１００ｍｍ、２．７μｍ、Chrom Tech社、ミネソタ州アップルバレー）に取り付けられたAgilent Poroshell 120 EC-C18プレカラム（２．１×５ｍｍ、２．７μｍ、Chrom Tech社、ミネソタ州アップルバレー）を用いて、４０℃で（Ａ）０．１％ギ酸を含む水および（Ｂ）０．１％ギ酸を含むＡＣＮからなる勾配移動相を用いる０．５ｍｌ／分の一定の流速での溶離により、パクリタキセルおよびｄ５パクリタキセルの液体クロマトグラフ分離を達成した。溶離を６０％のＡおよび４０％のＢで０．５分間で開始し、次いでＢを４．５分かけて４０％から８５％に直線的に増加させ、８５％のＢを０．２分間維持して、最初の条件に１．３分間戻した。オートサンプラー温度は１０℃であり、試料注入体積は２μｌであった。ＥＳＩポジティブモードの質量分析計を用い、１．７５ｋＶのキャピラリー電圧、１５０℃の供給源温度、５００℃の脱溶媒和温度、１５０Ｌ／ｈｒのコーンガス流量、１０００Ｌ／ｈｒの脱溶媒和ガス流量を用い、０．０７５秒間のデータ取込時間を有する多重反応モニタリング（ＭＲＭ）スキャンモードを用いて、パクリタキセルおよび内部標準ｄ５－パクリタキセルの検出を達成した。ＭａｓｓＬｙｎｘ－Ｉｎｔｅｌｌｉｓｔａｒｔ（ｖ４．１）ソフトウェアにより、コーン電圧および衝突エネルギーを測定し、それぞれ６～１６Ｖおよび１２～６０ｅＶの間で変えた。パクリタキセルでは８５４．３＞１０５．２、ｄ５パクリタキセルでは８５９．３＞２９１．２のｍ／ｚでＭＲＭ前駆体および生成イオンを監視した。４ｍｌの琥珀色のシラン処理したガラス製バイアル中でパクリタキセル（ＥｔＯＨ中に１ｍｇ／ｍｌ）およびｄ５パクリタキセル（ＥｔＯＨ中に１ｍｇ／ｍｌ）からなる一次原液を調製し、－２０℃で貯蔵した。２ｍｌの琥珀色のシラン処理したガラス製バイアル中で原液をＡＣＮで希釈して希釈標準液を調製し、－２０℃で貯蔵した。１００μｌの血漿試料をｄ５パクリタキセル（１１６．４ｎＭまたは１００ｎｇ／ｍｌ）および３００μｌのＡＣＮを含む１．７ｍｌの極小遠心管に添加し、ボルテックスで撹拌し、室温で１０分間インキュベートしてタンパク質を沈殿させ、３分間遠心分離（１４，０００ｒｐｍ）することにより、血漿試料を抽出した。上澄みをAgilent Captiva NDlipidsプレート（Chrom Tech社、ミネソタ州アップルバレー）で濾過し、深い９６ウェルプレートに回収し、窒素ガスを用いて乾燥した。１００μｌのＡＣＮを用いて試料を再構成し、プレートシェーカー（高速）で５分間振盪させた。パクリタキセルの定量化のために、パクリタキセル（０．５９～５８５５ｎＭまたは０．５～５０００ｎｇ／ｍｌ）およびｄ５パクリタキセル（１１６．４ｎＭ）を含む血漿標準曲線を毎日作成した。マウス腫瘍を氷上で解凍し、重量を測り、１×ＰＢＳで２部（体積に対する重量）希釈した。次いで、鋸歯状プローブ（５ｍｍ×７５ｍｍ）を用いるＰＲＯ２００組織ホモジナイザーを用いて腫瘍を均質化した。次いで、ヒトの血漿試料と同様に腫瘍ホモジネートを処理した。
［マウスイメージング」：アバスチンおよびＩｇＧ対照溶液を調製し、プロトコル（Imanis Life Sciences社）に従ってＩ－１２５で標識した。簡単に言うと、トリス緩衝液（０．１２５ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．１５ＭのＮａＣｌ）および５ｍＣｉのＮａ１２５Ｉをヨウ素化管（ThermoFischer Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム）に直接添加した。ヨウ化物を活性化させ、室温で回転させた。活性化されたヨウ化物をタンパク質溶液と混合した。５０μｌの捕捉緩衝液（ＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍＬのチロシン、ｐＨ７．４）を添加し、５分間インキュベートした。Ｔｒｉｓ／ＢＳＡ緩衝液を添加して混合した後、試料を10K MWCO透析カセットで、事前に冷却したＰＢＳに対して４℃で３０分間、１時間、２時間および一晩透析した。放射活性をガンマカウンターで測定し、次いで壊変毎分（ＤＰＭ）および特異的活性を計算した。マウスの尾静脈に、アバスチンＩ－１２５、アブラキサン－アバスチンＩ－１２５、アブラキサン－ヒトIgG I-125またはアブラキサン単独を注射した。投与から３、１０、２４および７２時間後に、Ｕ－ＳＰＥＣＴ－ＩＩ／ＣＴスキャナー（ＭＩＬａｂｓ社、オランダのユトレヒト）を用いるＳＰＥＣＴ－ＣＴイメージングにより動物の画像を撮影した。ＰＯＳＥＭ（pixelated ordered subsets by expectation maximization）（期待値最大化による画素順序部分集合）アルゴリズムを用いてＳＰＥＣＴ再構成を行った。フェルドカンプ（Ｆｅｌｄｋａｍｐ）アルゴリズムの間にＣＴデータを再構成した。同時記録された画像をＰＭＯＤソフトウェア（PMOD Technologies社、スイスのチューリッヒ）を用いてさらにレンダリングおよび可視化した。動物を屠殺し、注射から７２時間後に解剖した。選択した目的の組織および臓器を放射性同位体用量キャリブレーター（Capintec CRC-127R、Capintec社）を用いて測定した。
結果
第１のｐｋ実験の結果は図４Ａおよび図４Ｂに示されている。Ａ３７５腫瘍を有するマウスおよび腫瘍を有しないマウスにおいて曲線下面積（ＡＵＣ）および最大血清濃度（Ｃｍａｘ）を計算した。第１のｐｋ実験では、ＣｍａｘおよびＡＵＣは、ＡＢ１６０およびＡＢＸでは腫瘍を有しないマウスにおいて非常に類似していた（それぞれ６３．３＋／－３９．４対６５．５＋／－１４．４および１２９対１３３μｇ／ｍｌ）。しかし、腫瘍を有するマウスでは、治療群のＣｍａｘおよびＡＵＣは異なっていた（それぞれ５５．７＋／－２１．２対６３．３＋／－１７．３および１１２対１２８μｇ／ｍｌ）（図４Ｃ）。この差は統計的に有意ではなかったが、ＡＢＸと比べてＡＢ１６０による優れた標的化と一致していた。
さらに早い時点ならびに小さい腫瘍サイズに対して大きな腫瘍サイズを用いて、第２のｐｋ実験を行った（図４Ｄ～図４Ｆ）。この実験の結果から、小さい腫瘍のマウスと比べて大きな腫瘍のマウスにおけるパクリタキセルの最も低い血中値（ＡＢＸで治療した腫瘍を有しないマウス、小さい腫瘍および大きな腫瘍を有するマウスにおいてそれぞれ８０．４＋／－２．７、４８．４＋／－１２．３および３０．７＋／－５．２、ＡＢ１６０で治療した場合６６．１＋／－１９．８、４４．４＋／－１２．１および２２．８＋／－６．９）により、腫瘍を有しないマウスと比べて腫瘍を有するマウスにおけるよる小さいＡＵＣが実証された。同様に、Ｃｍａｘは、より大きな腫瘍を有するマウスでは両治療群において低下した（ＡＢＸでは４７．２、２８．９および１９．７μｇ／ｍｌ、ＡＢ１６０では４０．１、２６．９および１５．３μｇ／ｍｌ）（図４Ｇ）。血中パクリタキセルのＡＵＣおよびＣｍａｘは、ＡＢＸ治療マウスと比べてＡＢ１６０治療マウスにおいてより低かった。統計的に有意ではないが、データは、ＡＢ１６０で治療した腫瘍におけるパクリタキセルのより高い堆積とさらに一致している。
この仮定を直接試験するために、ＬＣ－ＭＳにより腫瘍パクリタキセル濃度を測定した。腫瘍パクリタキセル濃度は、４時間（３４７３μｇ／ｍｇ＋／－３４０の組織対２１２７＋／－３．５μｇ／ｍｇの組織、ｐ＝０．０２）および８時間（３００５μｇ／ｍｇ＋／－１４６の組織対１６８８＋／－１４６μｇ／ｍｇの組織、ｐ＝０．０１）の時点で、ＡＢＸと比べてＡＢ１６０で治療した腫瘍において有意により高く、これはパクリタキセルが当該抗体によって標的化された場合に腫瘍中により長く留まることを示唆している（図４Ｈ）。これは血液ｐｋについて説明しており、腫瘍を含む組織への薬物の再分布と一致している。
Ｉ－１２５で標識したＡＢ１６０（Ａｂｘ－ＡｖｔＩ１２５）およびＡＢＸ結合ＩｇＧアイソタイプ（Ａｂｘ－ＩｇＧＩ１２５）の生体内ライブイメージングにより、注射後３時間（３２．２ｕＣｉ／ｇ＋／－９．１対１８．５ｕＣｉ／ｇ＋／－１．６５、ｐ＝０．０６）および１０時間（４１．５ｕＣｉ／ｇ＋／－６．４対２８．７ｕＣｉ／ｇ＋／－２．６６、ｐ＝０．０３）の時点において、ＩｇＧ－ＡＢＸと比べてＡＢ１６０で治療したマウスの腫瘍中により高いレベルのＩ－１２５を有するＬＣ－ＭＳ結果を確認した（図４Ｉおよび図４Ｊ）。総合すれば、これらのデータにより、ＢＥＶとＡＢＸとの結合により血液ｐｋが変化し、かつこの変化はイソタイプ一致ＩｇＧ１と比べてパクリタキセルのＬＣ－ＭＳおよびＢＥＶのＩ－１２５標識の両方によって示される腫瘍組織への薬物の再分布に起因していることが実証される。
理論によって縛られるものはないが、腫瘍標的化抗体のＡＢＸへの結合によりｐｋがＡＢＸ単独よりも劇的に変化し、腫瘍組織へのＡＢ１６０の再分布により血中ＣｍａｘおよびＡＵＣが低下すると考えられる。マウスの血中パクリタキセルのｐｋ、パクリタキセルの腫瘍組織レベルおよびＡＢＸ単独と比べたＡＢ１６０で治療したマウスにおけるＩ－１２５放射活性レベルのこれらの結果は、上昇したレベルのパクリタキセルが腫瘍に到達し、かつそこにより長期間保持され、それにより腫瘍退縮が高められるような、ＡＢＸの抗体標的によるパクリタキセルの生体内分布の変化を示唆している。
実施例７：他の治療抗体の結合
抗ヒトＣＤ２０抗体（リツキシマブ）および抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体抗体（トラスツズマブ）のＡＢＸへの結合を試験して、生体外で組み合わせた場合に他のＩｇＧ治療抗体もＡＢＸへの結合を示すか否かを判定した。
方法
リツキシマブまたはトラスツズマブを含むナノ粒子を調製し、上記実施例に記載されているとおりに試験した。
結果
それぞれ０．１５７～２．１６６μｍ（図２Ａ）および０．１４８～２．８６８μｍ（図５Ｂ）の範囲の平均粒子径を有するＢＥＶとの複合体およびトラスツズマブ（ＨＥＲ）との複合体の粒子径はどちらも非常に類似していた。対照的に、リツキシマブと共に形成された粒子は、より低い抗体：ＡＢＸ比において非常により大きくなり、粒子径は０．１５９～８．２８６μｍの範囲であった（図５Ａ）。
リツキシマブおよびトラスツズマブのＡＢＸとの結合親和性を、可変ｐＨの下でＢＬＩｔｚにより決定した。両抗体はピコモル範囲の比較的高い親和性で結合する（図５Ｃ）。リツキシマブのＡＢＸとの親和性はｐＨがより高くなるにつれて低下するが、トラスツズマブのＡＢＸとの親和性はｐＨによる影響を受けなかった（図５Ｃ）。
リツキシマブ（ＡＲ１６０）と共に調製した１６０ｎｍの粒子の有効性を生体外および生体内を試験した。生体外では、Ｄａｕｄｉ（Ｂ細胞リンパ腫細胞株）を増加する濃度（０～２００μｇ／ｍｌ）のパクリタキセルにおいて、ＡＲ１６０、ＡＢＸまたはリツキシマブ単独で治療した。ＡＲ１６０（ＩＣ５０＝１０μｇ／ｍｌ）は、ＡＢＸ（ＩＣ５０＞２００μｇ／ｍｌ）またはリツキシマブ（ＩＣ５０＞２００μｇ／ｍｌ）単独のいずれかと比較した場合、２４時間治療したＤａｕｄｉ細胞の増殖を有意に阻害した（ｐ＝０．０２４）（図６Ａ）。
生体内では、Ｄａｕｄｉ細胞の異種移植モデルを胸腺欠損ヌードマウスにおいて確立した。腫瘍を確立したら、マウスをＰＢＳ、ＡＢＸ、リツキシマブ、連続投与されるＡＢＸ＋リツキシマブまたはＡＲ１６０で治療した。治療後７日目に腫瘍を測定し、ベースラインからの腫瘍サイズの変化率を計算した。ＡＲ１６０で治療した腫瘍は退縮したか安定なままであり、全ての他の治療群における腫瘍は進行した（図６Ｂ）。全ての他の群と比較したＡＲ１６０群におけるベースラインからの腫瘍サイズの変化率は有意であった（ｐ＜０．０００１）。ＡＲ１６０で治療したマウスは、ＰＢＳ（ｐ＜０．０００１）、ＡＢＸ（ｐ＜０．０００１）またはリツキシマブ（ｐ＝０．０００２）でそれぞれ治療したマウスの１２日、１６日および１２日と比較して６０日超の有意により長い生存期間中央値を有していた（図６Ｃ）。但し、生存期間中央値における差は、ＡＲ１６０群と連続治療群との間で有意ではなかった（ｐ＝０．３６）。これは恐らく、リツキシマブが腫瘍細胞に結合して細胞表面に残存したままであり、その後に投与されるＡＢＸが、可溶性の標的に結合し、かつ細胞表面マーカーに結合しないＢＥＶとは異なり、腫瘍部位に進入した場合に抗体に結合することができるからである。
実施例８：他の化学療法剤のＡＢ１６０への結合
機能性ナノ粒子を形成するための他の化学療法剤の有効性を評価した。
方法
シスプラチンを含むナノ粒子を調製し、上記実施例に記載されているとおりに試験した。
結果
別の化学療法剤がＡＢ１６０粒子に結合することができるか否かを試験するために、シスプラチンをＡＢＸと共にインキュベートし、上澄みに残っている遊離シスプラチンの量をＨＰＬＣで測定した。シスプラチンの約６０％（すなわち、４０％のみが上澄みに残っている）がＡＢＸに結合していた（図７Ａ）。
次に、ＡＢＸおよびシスプラチン単独と比べたＡＣの腫瘍毒性を、Ａ３７５細胞を用いて試験した。その複合体を遠心分離して非常に毒性の高い未結合シスプラチンを除去し、ＡＢＸと比べたＡＣのあらゆるさらなる毒性がＡＢＸに結合したシスプラチンにのみ起因するようにするために、培地中で再構成した。パリティのために、ＡＢＸ単独を同様の方法で遠心分離した。ＡＣ（ＩＣ５０＝９０μｇ／ｍｌ）はＡＢＸ単独よりも高い程度までＡ３７５細胞の増殖を阻害した（ＩＣ５０＞１０００μｇ／ｍｌ）（図７Ｂ）。他の毒性実験と比べたこの実験での毒性の減少は、遠心分離工程で薬物が若干失われたことが原因であるが、ＡＢＸとＡＣとの比較はなお関連性がある。
シスプラチンを含むＡＢ１６０複合体の腫瘍毒性を決定するために、ＡＢ１６０をシスプラチンと共にインキュベートして、シスプラチンを含む粒子（ＡＢＣ複合体）を形成した。ＡＢＣ複合体を各薬物単独およびＡＢ１６０に対してＡ３７５黒色腫異種移植モデルにおいて試験した。ＡＢ１６０、連続投与されるＡＢ１６０＋シスプラチンおよびＡＢＣ複合体で治療した腫瘍は全て、治療後７日目に腫瘍サイズの退縮を示した（図７Ｃ）が、ＡＢＣ複合体は最も長い生存期間中央値（それぞれ２４日および２６日のＡＢ１６０およびＡＢ１６０＋シスプラチンに対して３５日）が得られた。その差は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．８２および０．７９）（図７Ｄ）が、データは長期間の生存率に対するＡＢＣ複合体の利点と一致している。
これらのデータにより、ＡＢＸのアルブミン部分が、他の治療抗体が生体外および生体内でＡＢ１６０と同様の有効性を有する例えばリツキシマブおよびトラスツズマブならびに他の化学療法剤（例えば、シスプラチン）に結合するための基盤を提供することが実証された。
全体としてこれらのデータは、複数のタンパク質または細胞毒性薬を単一のアルブミン骨格に結合させることができる汎用性のナノ免疫複合体を構築するための単純な方法を実証している。マウスモデルにおいて単剤単独と比べて標的薬物の高い有効性が実証され、これは少なくとも一つとして、抗体－標的薬物のｐｋの変化に起因する。さらに、理論によって縛られるものはないが、リンカーまたは標的細胞の取込みを必要としない本開示のナノ免疫複合体の汎用性により、マウスからの結果をヒトに置き換える際に他のナノ医薬品が直面する障害が克服されると考えられる。
実施例９：ＡＢ１６０の凍結乾燥
８ｍｇ（３２０μｌ）のベバシズマブを２０ｍｇのアブラキサンに添加してＡＢ１６０を合成した。次いで、４ｍｇ／ｍｌのベバシズマブおよび１０ｍｇ／ｍｌのアブラキサンの最終濃度のために、２ｍｌの最終体積に１．６６ｍＬの０．９％生理食塩水を添加し、この混合物を１５ｍｌポリプロピレン円錐管において室温で３０分間インキュベートした。
室温で３０分間のインキュベート後に、混合物を２ｍｇ／ｍｌのベバシズマブおよび５ｍｇ／ｍｌのアブラキサンになるまで、０．９％生理食塩水中で１：２で希釈した。これらは、患者に投与するために薬局により調製された場合のその２種類の薬物の濃度である。
ＡＢ１６０を、１．５ｍｌポリプロピレンエッペンドルフ型ピペットに入れた２０個の２００μｌ分割量に分け、－８０℃で凍結した。
凍結したら、その分割量を、冷凍部がその上に備えられた３ＬのＶｉｒｔｉｓ卓上凍結乾燥器（SP Scientific社、ペンシルベニア州ウォーミンスター）で一晩凍結乾燥した。凍結乾燥した製剤を生成した。
乾燥した分割量を同じ１．５ｍｌポリプロピレンエッペンドルフ型ピペットに入れて室温で貯蔵した。これらの試料を容易に室温の生理食塩水中で３０分間再構成した後、２０００×ｇで７分間遠心分離した。次いで、得られた試料を必要に応じて適当な緩衝液に再懸濁した。
比較によれば、熱および高速真空で乾燥した試料は再構成することができなかった。
実施例１０：凍結乾燥した製剤の試験
凍結乾燥後の異なる時点で試料を再構成し、ＡＢＸ、新たに調製したＡＢ１６０に対してそれらの物理的特性を試験した。
上記のとおり粒度分布を評価した。
この試料をＶＥＧＦと共に室温で２時間インキュベートし、２０００×ｇで７分間遠心分離することにより、ＶＥＧＦ結合を評価した。そのペレット（当該ナノ粒子に対応する）に結合したＶＥＧＦまたは上澄みに残っているＶＥＧＦの量をＥＬＩＳＡで測定した。
生体外でのＡ３７５細胞に対する細胞毒性により、パクリタキセル活性を評価した。
驚くべきことに、癌細胞増殖を阻害する能力によって示されているように、凍結乾燥は、粒子径、ＶＥＧＦ結合またはパクリタキセルの活性のいずれにも有意に影響を与えなかった。この結果は、１ヶ月間（図８Ａ～図８Ｃ）または１０ヶ月間（図８Ｄ～図８Ｆ）貯蔵した凍結乾燥試料に対しても保持された。
さらに驚くべきことに、凍結保護剤またはヒトの治療的使用に悪影響を与え得る他の薬剤を使用することなく凍結乾燥したナノ粒子を用いた場合にこれらの結果が観察された。
実施例１１：ヒトにおけるＡＢ１６０の有効性
以前の治療法が失敗した転移性悪性黒色腫を有する患者に投与されるＡＢ１６０の安全性を試験する第１相ヒト初回投与臨床試験においてＡＢ１６０を試験した。この研究は古典的な３＋３の第１相臨床試験設計を利用し、以下の計画で３種類の異なる用量のＡＢ１６０を試験する。
Figure 2022107690000013
臨床診療で現在使用されているアブラキサンの用量との関連でこれらの用量を選択した。各治療薬の投与前にＡＢ１６０を調製した。２８日間の治療サイクルの１日目、８日目および１５日目に３０分間の静脈内注入として治療薬を投与した。耐えられない毒性が生じるか、腫瘍が進行するか、あるいは患者が拒否するまで治療を続けた。全ての治療サイクルの前に毒性について患者を評価し、２回のサイクルごとに１回腫瘍評価を行った（ＲＥＣＩＳＴ）。
この研究では、治療法のサイクル１および２の投与１に関連する正式な（入院患者）薬物動態調査も同時に行った。
５人の患者に１００ｍｇ／ｍ２のＡＢＸおよび４０ｍｇ／ｍ２のＢＥＶでＡＢ１６０を投与し、そのうちの４人を分析した。
Figure 2022107690000014
ＰＦＳとは、無進行生存率すなわち癌が再発するまでの治療日数を指す。有害事象を以下に列挙する。用量規制毒性（ＤＬＴ）は存在しなかった。すなわち、有害事象はＡＢ１６０の用量とは関連していなかった。さらなる詳細は表６に示されている。
Figure 2022107690000015
Figure 2022107690000016
平均ＰＦＳは７．６ヶ月間であり、中央値は７．０ヶ月であった。
他の臨床試験との比較
以下の表は、転移性黒色腫のためのタキサン療法のその他に公開されている臨床試験を示す。
Figure 2022107690000017
現在の治験では、ＡＢ１６０粒子の投与は１００ｍｇ／ｍ２のアブラキサンおよび４０ｍｇ／ｍ２のベバシズマブの用量と等しい。ＢＥＶおよびＡＢＸ単独を使用した唯一の研究はＳｐｉｔｌｅｒであった。但し、Ｓｐｉｔｌｅｒは、より高い用量のＡＢＸを使用した。また、本研究は、その用量を平均的な患者（１．９ｍ２の表面積および９０ｋｇの質量を有すると仮定）に対して調整した場合、以前の研究で報告されたＢＥＶの用量の１０％未満を使用した。
現在の研究は以前の治療に失敗した患者を調査したが、Ｓｐｉｌｔｅｒは以前に治療されたことない患者も調査した。有効でない従来の治療は、期待されるＰＦＳからの時間を取得するだけでなく、治療に対してより抵抗性のある癌細胞を選択し、典型的に患者をより乏しい物理的条件下に置いたままにする。従って、「救出」治療法（ここではＡＢ１６０を用いる場合）を受けている患者の集団のＰＦＳは、治療未経験集団よりも低いＰＦＳを有すると期待される。これは、アブラキサン単独を用いた救出患者および治療未経験患者の両方を調査した第２相臨床試験(Hersh et al., Cancer, January 2010, 116:155)において確認することができる。以前にアブラキサン単独で治療された患者では、ＰＦＳは３．５ヶ月であった。Hersh et al. Ann. Oncol 2015 (epub September 26, 2015)では、ＡＢＸ単独で治療した治療未経験患者のＰＦＳは４．８ヶ月であると報告された。
Figure 2022107690000018
従って、ＡＢ１６０を用いた第１相臨床試験の初期の結果は、以前に治療した患者における末期の転移性悪性黒色腫のＰＦＳの上昇を示している。そのＰＦＳが化学療法を受けておらず、かつより高い用量のアブラキサンおよびほぼ１２倍高い用量のベバシズマブを投与したＳｐｉｔｌｅｒのものよりも高いことを鑑みると、この上昇は特に驚くべきものである。ＡＢ１６０中に使用したＢＥＶの用量はあらゆる他の研究のものよりも非常に低いため、最良の比較対象はＳｐｉｔｌｅｒではなくＨｅｒｓｈである。
従って、ＡＢＸ／ＢＥＶ複合体（ＡＢ１６０）は、ＡＢＸおよびＢＥＶの連続投与またはＡＢＸ単独よりも優れており、非常に低い有効用量のＢＥＶを用いてこの素晴らしい結果を達成している。従って、データは、ＢＥＶにより媒介される腫瘍に対する化学療法剤の標的化が向上したＡＢ１６０と一致している。ＡＢＸナノ粒子は、アルブミンが腫瘍によって選択的に取り込まれる際にＢＥＶを腫瘍に標的化させるのを支援することができる。また、ＢＥＶ／ＡＢＸ複合体の存在により、アブラキサンよりも高い生体内での安定性を示すこともできる。
実施例１２：ＢＥＶを用いた予備治療により標的化が向上するか否かを調査するための追跡研究
上記一般的なプロトコルに従って、胸腺欠損ヌードマウスの右脇腹に１×１０６個のＡ３７５ヒト黒色腫細胞を注射し、次いでＰＢＳ、１２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶ、３０ｍｇ／ｋｇのＡＢＸ、ＡＢ１６０で治療するか、１．２ｍｇ／ｋｇのＢＥＶおよび２４時間後にＡＢ１６０で予備治療した。データは治療後７日目および１０日目の腫瘍体積（単位：ｍｍ３）として表されている。図１１Ａ～図１１Ｅは、１０日間にわたって腫瘍サイズを追跡したものである。ＡＢ１６０で治療したマウス（ＢＥＶを用いた予備治療の有無は問わない）のみが平均的な腫瘍体積の減少を示した。図１１Ｆおよび図１１Ｇも参照されたい。
図１１Ｆに要約されている治療後７日目のデータは、ＢＥＶによる予備治療が対照またはＢＥＶ単独（ｐ≦０．０００１）またはＡＢＸ単独（ｐ≦０．０００１）よりも統計的に有意な腫瘍体積の減少に関連していたことを示している。
図１１Ｇに要約されている治療後１０日目のデータも、ＢＥＶによる予備治療が対照またはＢＥＶ単独（ｐ≦０．０００１）またはＡＢＸ単独（ｐ≦０．０００１）よりも統計的に有意な腫瘍体積の減少に関連していたことを示している。また、ＡＢ１６０の前のＢＥＶによる予備治療はＡＢ１６０単独（ｐ＝０．０２）よりも腫瘍体積の減少に関連しており、２匹のマウスにおいて完全な反応が認められた。
この実験では、１２ｍｇ／ｋｇの用量のＢＥＶは治療効果がなかった。予備治療群に添加されたＢＥＶの量は、マウスにおける通常用量の１／１０である１．２ｍｇ／ｋｇのみであった。しかしながら、治療量以下の用量による予備治療は、ＡＢ１６０ナノ粒子の改善された有効性を示しているように見える。データは、ＡＢ１６０ナノ粒子による腫瘍関連ＶＥＧＦ標的化がより有効であるように、より高い相対濃度を腫瘍に残存させることにより、治療量以下の量のＢＥＶによる予備治療が全身レベルのＶＥＧＦを取り除くことができるという考えを支持している。
実施例１３：ナノ粒子を送達する他の手段
本発明のナノ粒子は腫瘍に直接送達することができると考えられる。例えば、動脈内カニューレを介するか腫瘍内への直接注射によりナノ粒子を送達することができる。そのような実施形態では、腫瘍内またはその近くへの直接注射により大きなナノ粒子（例えば、５８０ｎｍまたは１１３０ｎｍ）を送達することができると考えられる。

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載の発明。
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