KR20170035358A - 담체-항체 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

담체-항체 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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스베토미르 엔. 마르코빅
웬디 케이. 네발라
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메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치
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Abstract

항체 및 담체 단백질의 조성물 및, 특히 암 치료제로서의, 그의 제조 및 사용 방법이 본원에 기재된다. 또한 항체 및 담체 단백질의 동결건조된 조성물 및, 특히 암 치료제로서의, 그의 제조 및 사용 방법이 기재된다.
[대표도]
도 1b

Description

담체-항체 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법 {CARRIER-ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 10월 6일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/060,484; 및 2015년 8월 18일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/206,770; 62/206,771; 및 62/206,772의 출원일의 이익을 주장한다. 상기는 그의 전체내용이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 항체 및 담체 단백질의 신규 조성물 및, 특히 암 치료제로서의, 그의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
화학요법은 흑색종을 비롯한 많은 유형의 암을 위한 전신 요법에 있어서 핵심으로 유지되고 있다. 대부분의 화학요법제는 종양 세포에 단지 약간 선택적이고, 건강한 증식 세포에 대한 독성이 높을 수 있어 (Allen TM. (2002) Cancer 2:750-763), 종종 용량 감소 및 심지어는 치료 중단이 요구된다. 이론적으로, 화학요법 독성 문제를 극복할 뿐만 아니라 약물 효능을 개선시키기 위한 한가지 방법은 화학요법 약물을 종양 세포에 의해 선택적으로 발현 (또는 과다발현)되는 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 종양에 표적화시켜 표적화된 약물을 종양으로 유인함으로써, 화학요법제의 생체분포를 변경시키고, 보다 많은 약물이 종양으로 가도록 하며 건강한 조직에는 보다 적은 영향을 미치도록 하는 것이다. 그러나, 30년의 조사에도 불구하고 치료 상황에서의 특이적 표적화는 성공하기 어렵다.
통상의 항체 의존성 화학요법 (ADC)은 합성 프로테아제-절단가능한 링커를 통해 표적화 항체에 연결된 독성제를 사용하도록 설계된다. 이러한 ADC 요법의 효능은 표적 세포가 항체에 결합하는 능력, 절단될 링커, 및 독성제의 표적 세포로의 흡수에 좌우된다. 문헌 [Schrama, D. et al. (2006) Nature reviews. Drug discovery 5:147-159].
항체-표적화된 화학요법은 표적화 능력, 다중 세포독성제, 및 잠재적으로 보다 낮은 독성을 갖는 개선된 치료 능력을 제공하므로 통상의 요법보다 유리할 것이다. 광범위한 조사에도 불구하고, 임상적으로 효과적인 항체-표적화된 화학요법은 찾기 못하고 있다: 주요 장애는 항체와 화학요법 약물 사이의 링커의 불안정성, 항체에 결합되는 경우에 화학요법제의 감소된 종양 독성, 및 접합체의 종양 세포에 결합 및 진입하는 능력의 부재를 포함한다. 또한, 이들 요법은 항체-약물 접합체의 크기에 대한 제어를 고려하지 않았다.
관련 기술분야에는 이전 치료제보다 신뢰할만하고 개선된 항종양 효능을 제공하기 위한 표적화된 약물 전달을 위한 세포독성 효과를 보유하는 항체-기재 암 치료제에 대한 필요가 남아있다.
또한, 임의의 치료적 적용에 관하여, 또한 그의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성에서 안정해야 할 조성물에 대한 필요가 남아있다.
동결건조 또는 동결 건조는 조성물로부터 물을 제거한다. 이 공정에서, 건조될 물질이 우선 동결되고, 이어서 얼음 또는 동결된 용매가 진공 환경에서 승화에 의해 제거된다. 부형제는 동결-건조 공정 동안 안정성을 증진시키고/거나 저장 시에 동결건조된 생성물의 안정성을 개선하기 위해 사전-동결건조된 제제에 포함시킬 있다. 문헌 [Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) 및 Arakawa et al., Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)].
단백질은 동결건조될 수는 있으나, 동결건조 및 재구성의 공정이 단백질의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 단백질은 종래의 유기 및 무기 약물보다 더 크고 더 복잡하기 때문에 (즉, 복잡한 3차원 구조 뿐만 아니라 다중 관능기를 보유함), 이러한 단백질의 제제는 특수한 문제점을 제기한다. 단백질을 생물학적 활성이도록 유지하기 위해, 제제는 적어도 단백질의 아미노산의 코어 서열의 입체형태적 완전성을 무손상 상태로 보존해야 하며, 동시에 단백질의 다중 관능기를 분해로부터 보호해야 한다. 단백질에 대한 분해 경로는 화학적 불안정성 (즉, 새로운 화학 물질을 생성하는 결합 형성 또는 절단에 의한 단백질의 변형을 수반하는 임의의 공정) 또는 물리적 불안정성 (즉, 단백질의 보다 높은 차원의 구조에서의 변화)을 수반할 수 있다. 화학적 불안정성은 탈아미드화, 라세미화, 가수분해, 산화, 베타 제거 또는 디술피드 교환으로부터 초래될 수 있다. 물리적 불안정성은 예를 들어 변성, 응집, 침전 또는 흡착으로부터 초래될 수 있다. 3가지 가장 흔한 단백질 분해 경로는 단백질 응집, 탈아미드화 및 산화이다. 문헌 [Cleland, et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)].
본 발명에서, 조성물은 (a) 담체 단백질, (b) 항체 및 (c) 임의적으로 치료제를 함유하는 나노입자를 포함한다. 항체는, 그의 특성에 의해, 약한 소수성 상호작용을 통해 담체 단백질에 결합되는 것으로 여겨진다. 이러한 조성물의 동결건조 및 재구성은 따라서 개별 성분의 활성 뿐만 아니라 나노입자에서의 그들의 상대적 관계를 보존해야 한다.
나노입자가 요법에 사용되는 것으로 인해 추가의 도전과제가 부과된다.
예를 들어, 나노입자 내에서의 소수성 성분의 재배열은 성분 사이의 공유 결합을 통해 완화될 수 있다. 그러나, 이러한 공유 결합은 암 치료에 있어서 나노입자의 치료적 사용에 대한 도전과제를 제기한다. 항체, 담체 단백질, 및 추가의 치료제는 전형적으로 종양 내의 상이한 위치에서 다양한 메카니즘을 통해 작용한다. 비-공유 결합은 나노입자의 성분이 종양에서 해리되도록 한다. 따라서, 공유 결합이 동결건조에는 유리할 수 있지만, 치료적 사용에는 불리할 수 있다.
나노입자의 크기 및 크기의 분포가 또한 중요하다. 본 발명의 나노입자는 그의 크기에 따라 다르게 거동할 수 있다. 큰 크기에서, 나노입자 또는 이들 입자의 응집물은 혈관을 막을 수 있으며, 이들 중 어느 하나가 조성물의 성능 및 안전성에 영향을 미칠 수 있다.
최종적으로, 동결보호제 및 동결건조 공정을 보조하는 작용제는 치료적 사용을 위해 안전하고 허용되어야 한다.
한 측면에서, 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각 담체 단백질, 약 100 내지 약 1000개의 항체, 및 임의적으로 적어도 하나의 치료제를 포함하고, 항체는 나노입자의 표면에서 외부에 배열되고, 나노입자는 생체내에서 미리결정된 에피토프에 결합할 수 있는 것인 나노입자 조성물이 본원에 제공된다.
정맥내로 투여되는 경우, 큰 입자 (예를 들어 1 μm 초과)는 전형적으로 폐의 미세혈관계에 머무르게 되기 때문에 불리하다. 동시에, 보다 큰 입자가 종양 또는 특정 기관에 축적될 수 있다. 예를 들어 (간암을 위한 임상 용도에서) "테라스피어"로 불리는 간의 종양에 공급되는 간 동맥으로의 주사에 사용되는 20-60 마이크로미터 유리 입자를 참조한다.
따라서, 정맥내 투여를 위해, 1 μm 미만의 입자가 사용된다. 1 μm 초과의 입자는, 보다 전형적으로, 종양에 직접 투여되거나 ("직접 주사") 또는 종양 부위에 공급되는 동맥에 투여된다.
또 다른 측면에서, 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각 알부민이 아닌 담체 단백질, 약 100 내지 약 100개의 항체, 바람직하게는 약 400 내지 약 800개의 항체, 및 임의적으로 적어도 하나의 치료제를 포함하고, 항체는 나노입자의 외부 표면 상에 배열되고, 나노입자는 생체내에서 미리결정된 에피토프에 결합할 수 있는 것인 나노입자 조성물이 본원에 제공된다. 나노입자가 다량체화되는 경우, 항체의 수는 비례적으로 증가한다. 예를 들어, 160 nm 나노입자가 400개의 항체를 함유하는 경우, 320 nm 이량체는 약 800개의 항체를 함유한다.
또 다른 측면에서, 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각 담체 단백질, 약 400 내지 약 800개의 항체, 및 임의적으로 파클리탁셀이 아닌 적어도 하나의 치료제를 포함하고, 항체는 나노입자의 표면 상에 항체의 결합 부분이 그 표면에서 밖으로 향하도록 배열되고, 나노입자는 생체내에서 미리결정된 에피토프에 결합할 수 있는 것인 나노입자 조성물이 본원에 제공된다.
다른 실시양태에서, 나노입자는 다량체화, 예를 들어 이량체화된다. 다량체화는 단위 분자의 중량 또는 크기의 배수로서 관찰될 수 있고, 예를 들어 160 nm 입자는 약 320 nm, 480 nm, 640 nm 등으로 다량체화된다. 일부 실시양태에서, 집단의 20% 미만이 다량체이다. 일부 실시양태에서, 집단의 80% 초과가 다량체이다.
한 실시양태에서, 담체-결합된 약물 대 항체 (예를 들어 알부민-결합된 파클리탁셀 대 베바시주맙)의 중량비는 약 5:1 내지 약 1:1이다. 한 실시양태에서, 담체-결합된 약물 대 항체의 중량비는 약 10:4이다. 한 실시양태에서, 항체는 나노입자의 표면의 전부 또는 일부 상의 항체의 실질적으로 단일 층이다. 한 실시양태에서, 조성물 중의 나노입자의 0.01% 미만이 200 nm 초과, 300 nm 초과, 400 nm 초과, 500 nm 초과, 600 nm 초과, 700 nm 초과 및 800 nm 초과로 이루어진 군으로부터 선택되는 크기를 갖는다. 보다 큰 크기는 각각 코어 및 각 나노입자의 표면의 전부 또는 일부 상의 항체 코팅을 포함하는 여러 나노입자의 다량체화의 결과인 것으로 여겨진다.
본 발명은 추가로 동결건조된 조성물을 포함하고, 동결건조된 조성물은 신선하게-제조된 나노입자의 특성과 본질적으로 상이하지 않거나 또는 동일하다. 특히, 동결건조된 조성물은 수용액 중에서의 재현탁 시에 입자 크기, 입자 크기 분포, 암 세포에 대한 독성, 항체 친화도, 및 항체 특이성의 관점에서 신선한 조성물과 유사하거나 또는 동일하다. 본 발명은 동결건조된 나노입자가 이들 입자 중의 2가지 상이한 단백질 성분의 존재에도 불구하고 신선하게-제조된 나노입자의 특성을 유지한다는 놀라운 발견에 대한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 나노입자를 포함하는 동결건조된 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각 담체-결합된 약물 코어, 및 코어의 표면 상에 항체의 결합 부분이 그 표면에서 밖으로 향하도록 배열된 소정량의 항체를 포함하고, 항체는 수용액으로의 재구성 시에 나노입자의 외부 표면과의 그의 회합을 유지하는 것인 동결건조된 나노입자 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 실온에서 적어도 3개월 동안 안정하다. 한 실시양태에서, 재구성된 나노입자는 치료제의 활성을 유지하고, 생체내에서 표적에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 평균 재구성된 나노입자 크기는 약 130 nm 내지 약 1 μm이다. 바람직한 실시양태에서, 평균 재구성된 나노입자 크기는 약 130 nm 내지 약 200 nm, 보다 바람직하게는 약 160 nm이다. 한 실시양태에서, 평균 재구성된 나노입자 크기는 800 nm 초과 내지 약 3.5 μm이며, 보다 작은 나노입자의 다량체, 예를 들어 100-200 nm 나노입자의 다량체를 포함한다. 한 실시양태에서, 코어 대 항체의 중량비는 1:1 초과 내지 약 1:3이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 나노입자를 포함하는 동결건조된 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각 (a) 알부민-결합된 파클리탁셀 코어 및 (b) 알부민-결합된 파클리탁셀 코어의 표면 상에 항체의 결합 부분이 그 표면에서 밖으로 향하도록 배열된 약 400 내지 약 800개 분자의 베바시주맙을 포함하고, 항체는 수용액으로의 재구성 시에 나노입자의 표면과의 그의 회합을 유지하며, 단 상기 동결건조된 조성물은 적어도 3개월 동안 약 20℃ 내지 약 25℃에서 안정하고, 재구성된 나노입자는 생체내에서 VEGF에 결합할 수 있는 것인 동결건조된 나노입자 조성물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 나노입자를 포함하는 동결건조된 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각 (a) 알부민-결합된 파클리탁셀 코어 및 (b) 알부민-결합된 파클리탁셀 코어의 표면 상에 항체의 결합 부분이 그 표면에서 밖으로 향하도록 배열된 소정량의 베바시주맙을 포함하고, 항체는 수용액으로의 재구성 시에 나노입자의 표면과의 그의 회합을 유지하며, 단 상기 동결건조된 조성물은 적어도 3개월 동안 약 20℃ 내지 약 25℃에서 안정하고, 재구성된 나노입자는 생체내에서 VEGF에 결합할 수 있고, 추가로 여기서 평균 재구성된 나노입자 크기는 신선하게 제조된 나노입자의 입자 크기와 실질적으로 상이하지 않은 것인 동결건조된 나노입자 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 입자 크기는 200, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800 nm를 포함하는 200 내지 800 nm이다. 다른 실시양태에서, 입자는 보다 크며, 예를 들어 800 nm 초과 내지 약 3.5 μm이다. 일부 실시양태에서, 입자는 나노입자의 다량체이다.
일부 실시양태에서, 알부민-결합된 파클리탁셀 대 베바시주맙의 중량비는 약 5:1 내지 약 1:1이다. 다른 실시양태에서, 알부민-결합된 파클리탁셀 대 베바시주맙의 중량비는 약 10:4이다. 추가 실시양태에서, 알부민-결합된 파클리탁셀 대 베바시주맙의 중량비는 1:1 초과 내지 약 1:3이다.
일부 실시양태에서, 코어는 알부민-결합된 파클리탁셀이고, 항체는 VEGF를 선택적으로 인식하는 항체 (예를 들어 베바시주맙/아바스틴), CD20을 선택적으로 인식하는 항체 (예를 들어 리툭시맙/리툭신) 및 Her2를 선택적으로 인식하는 항체 (트라스투주맙/헤르셉틴)로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 치료제는 나노입자 내부에 위치한다. 다른 실시양태에서 적어도 하나의 치료제는 나노입자의 외부 표면 상에 위치한다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 치료제는 나노입자 내부에 및 나노입자의 외부 표면 상에 위치한다.
일부 실시양태에서, 나노입자는 하나 초과 유형의 치료제를 포함한다. 예를 들어, 탁산 및 백금 약물, 예를 들어 파클리탁셀 및 시스플라틴이다.
일부 실시양태에서, 항체는 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 리툭시맙 및 트라스투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 나노입자의 표면의 전부 또는 일부 상의 항체의 실질적으로 단일 층이다.
추가 실시양태에서, 항체는 천연 인간 항체에서 정상적으로 발견되는 것보다 적게 글리코실화된다. 이러한 글리코실화는 예를 들어 발현 시스템, 또는 발현 동안의 글리코실화 억제제의 존재에 의해 영향을 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 글리코실화 상태는 효소적 또는 화학적 작용을 통해 변경된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 치료제는 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 게피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 이마티닙, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴 및 시클로포스파미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 나노입자는 파클리탁셀 또는 베바시주맙이 아닌 적어도 하나의 추가의 치료제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체, 담체 단백질 및, 존재하는 경우에, 치료제는 비-공유 결합을 통해 결합된다.
일부 실시양태에서, 담체 단백질은 젤라틴, 엘라스틴, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 우유 단백질 및 유청 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 담체 단백질은 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 정맥내 전달을 위해 제제화된다. 다른 실시양태에서, 조성물은 종양으로의 직접 주사 또는 관류를 위해 제제화된다.
일부 실시양태에서, 조성물 중의 평균 나노입자 크기는 800 nm 초과 내지 약 3.5 μm이다.
일부 실시양태에서, 나노입자는 약 1 x 10-11 M 내지 약 1 x 10-9 M의 해리 상수를 갖는다.
또 다른 측면에서, 담체 단백질 및 임의적으로 적어도 하나의 치료제를 항체와 5.0 내지 7.5의 pH 및 약 5℃ 내지 약 60℃, 약 23℃ 내지 약 60℃, 또는 약 55℃ 내지 약 60℃의 온도를 갖는 용액 중에서 목적하는 나노입자의 형성을 가능하게 할 조건 및 성분 비 하에 접촉시키는 단계를 포함하는, 나노입자 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 한 실시양태에서, 나노입자는 55-60℃ 및 pH 7.0에서 제조된다. 또 다른 측면에서, (a) 담체 단백질 및 임의적으로 적어도 하나의 치료제를 접촉시켜 코어를 형성시키는 단계 및 (b) 코어를 항체와 약 5.0 내지 약 7.5의 pH 및 약 5℃ 내지 약 60℃, 약 23℃ 내지 약 60℃, 또는 약 55℃ 내지 약 60℃의 온도를 갖는 용액 중에서 목적하는 나노입자의 형성을 가능하게 할 조건 및 성분 비 하에 접촉시키는 단계를 포함하는, 나노입자 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
성분 (예를 들어, 담체 단백질, 항체, 치료제, 그의 조합)의 양은 목적하는 나노입자의 형성을 제공하기 위해 제어된다. 성분의 양이 너무 희석된 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 나노입자를 형성하지 않을 것이다. 바람직한 실시양태에서, 담체 단백질 대 항체의 중량비는 10:4이다. 일부 실시양태에서, 담체 단백질의 양은 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 항체의 양은 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 담체 단백질:항체:용액의 비는 용액 (예를 들어, 염수) 1 mL 중 담체 단백질 (예를 들어, 알부민) 대략 9 mg 대 항체 (예를 들어, BEV) 4 mg이다. 소정량의 치료제 (예를 들어, 탁솔)가 또한 담체 단백질에 첨가될 수 있다.
추가 실시양태에서, 나노입자는 상기와 같이 제조되고, 이어서 동결건조된다.
또 다른 측면에서, 암 세포를 유효량의 본원에 개시된 나노입자 조성물과 접촉시켜 암 세포를 치료하는 단계를 포함하는, 암 세포를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 세포를 유효량의 본원에 개시된 나노입자 조성물과 접촉시켜 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 종양의 치료를 필요로 하는 환자에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 종양의 크기가 감소된다. 다른 실시양태에서, 나노입자 조성물은 정맥내로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 나노입자 조성물은 종양으로의 직접 주사 또는 관류에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 a) 나노입자 조성물을 3주 동안 1주에 1회 투여하는 단계; b) 나노입자 조성물의 투여를 1주 동안 중단하는 단계; 및 c) 단계 a) 및 b)를 필요에 따라 반복하여 종양을 치료하는 단계를 포함한다.
관련된 실시양태에서, 치료는 나노입자의 투여 전에 표적화 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 표적화 항체는 나노입자의 투여 약 6 내지 48시간, 또는 12 내지 48시간 전에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 표적화 항체는 나노입자의 투여 6 내지 12시간 전에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 표적화 항체는 나노입자의 투여 2 내지 8시간 전에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 표적화 항체는 나노입자의 투여 1주 전에 투여된다. 예를 들어, AB160의 투여 24시간 전에 BEV의 용량을 투여한다. 또 다른 예에서, AR 나노입자 투여 전에 리툭시맙이 사전 투여된다. 나노입자 전에 투여된 항체는 치료용량 미만, 예컨대 보통 치료용량으로 여겨지는 양의 1/2, 1/10 또는 1/20의 용량으로 투여될 수 있다. 따라서, 인간에서, BEV로의 사전치료는 통상의 용량의 1/10인 1 mg/kg BEV의 투여, 이에 이어서 AB160의 투여를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 유효량은 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2 담체 단백질 (즉, 환자의 m2당 담체 단백질 밀리그램)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2 치료제 (예를 들어, 파클리탁셀)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 약 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량은 약 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2 베바시주맙을 포함한다.
하나의 구체적 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2의, 바람직하게는 알부민인, 담체 단백질; 약 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2의, 바람직하게는 베바시주맙인, 항체; 및 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2의 파클리탁셀을 포함한다.
하기 도면은 단지 본 발명을 예시하는 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 일관성을 위해, 아브락산(Abraxane)® 및 베바시주맙을 사용한 본 발명의 나노입자는 두문자어 "AB"를 사용하고, AB 뒤의 숫자, 예컨대 AB160은 이들 나노입자의 평균 입자 크기 (나노미터)를 부여하기 위한 것이다. 마찬가지로, 항체가 리툭시맙인 경우, 두문자어는 "AR"이며 그 뒤의 숫자는 마찬가지로 적용된다.
도 1a는 하기를 포함한 유동 세포측정 산포도를 보여준다: 2차 항체 단독으로 염색된 아브락산® (ABX - 셀진 코포레이션(Celgene Corporation; 서미트, NJ 07901)으로부터 상업적으로 입수가능함) (상부 좌측 패널), 염소 항-마우스 IgG1 Fab + 2차 항체로 염색된 ABX (상부 우측 패널), 2차 항체 단독으로 염색된 AB160 (약 10:4의 비의 알부민-결합된 파클리탁셀 대 베바시주맙의 나노입자이며, 평균 입자 크기 160 nm를 가짐) (하부 좌측 패널), 또는 염소 항-마우스 IgG1 Fab + 2차 항체로 염색된 AB160 (하부 우측 패널).
도 1b는 AB160과 금 입자-표지된 항-인간 IgG Fc의 인큐베이션 후의 대표적인 전자 현미경사진을 보여준다.
도 1c는 AB160 분획 (미립자, 100 kD 초과 단백질 및 100 kD 미만 단백질) 중의 총 파클리탁셀 백분율을 나타내는 파이 도표 (상부); 및 공동-국재화 검증을 위한 마우스 IgG Fab에 대한 항체 (BEV) 및 파클리탁셀을 사용한 웨스턴 블롯 (하부)을 보여준다.
도 1d는 A375 인간 흑색종 세포를 사용한 시험관내 독성 검정에서의 파클리탁셀의 활성을 ABX 단독과 비교하여 보여준다. 결과는 비치료 세포의 총 증식 백분율인 평균 (+/- SEM) 증식 지수에 의해 나타낸다. 이 데이터는 3회 실험을 대표하고, 차이는 유의하지 않았다.
도 1e는 항체에 의한 리간드, VEGF의 결합을 결정하기 위한 VEGF와 ABX 및 AB160의 공동-인큐베이션 후의 상청액의 VEGF ELISA로부터의 결과를 보여준다. 결과는 2개 복합체에 의해 미결합된 VEGF의 평균 백분율 +/- SEM으로 나타낸다. 데이터는 3회 실험을 대표한다 ** P< 0.005.
도 2a는 나노입자 및 그를 초과하는 것이 형성되는 조건 하에 BEV (베바시주맙)를 ABX에 첨가하여 형성된 복합체의 크기 (광 산란 기술에 의해 결정됨)를 보여준다. 증가하는 농도의 BEV (0-25 mg)를 10 mg의 ABX에 첨가하였고, 형성된 복합체의 크기를 결정하였다. 복합체의 평균 크기 (146 nm 내지 2,166 nm)는 BEV의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 데이터는 샘플 부피/크기로서 나타내고, 그래프는 입자의 크기 분포를 보여준다. 이 데이터는 5가지 별개의 약물 제제를 대표한다. 비교로서, ABX는 그 자체로 약 130 nm의 평균 입자 크기를 갖는다.
도 2b는 ABX 및 BEV의 결합의 친화도 (광 흡수 (BLItz) 기술에 의해 결정됨)를 보여준다. 데이터는 해리 상수 (Kd)로서 나타낸다. 4가지 pH 수준 (3, 5, 7, 9) 및 3가지 온도 (RT, 37℃ 및 58℃)에서 제조된 입자의 결합 친화도를 평가하였으며, 데이터는 5회 실험을 대표한다.
도 2c는 나노사이트(Nanosight) 300 (NS300) 상에서의 나노입자 트래킹 분석 (NTA)에 의해 결정된 바와 같은 혈청에서의 도 2b로부터의 나노입자 복합체의 안정성을 보여준다. 데이터는 입자 수/ABX mg으로서 나타내고, RT 및 pH 7 (AB16007; 입자 크기, pH), 58℃ 및 pH 7 (AB1600758; 입자 크기, pH, 온도) 및 58℃ 및 pH 5 (AB1600558; 입자 크기, pH, 온도)에서 제조된 AB160을 각각의 조건 하에서의 ABX 단독과 비교한다. 입자가 제조되면, 이를 인간 AB 혈청에 15, 30, 및 60분 동안 첨가하여 시간 경과에 따른 혈청에서의 안정성을 결정한다.
도 3a는 1 x 106개 A375 인간 흑색종 세포를 우측 측복부에 주사하고, 대략 600 mm3 내지 900 mm3의 종양 크기에서 PBS, 12 mg/kg BEV, 30 mg/kg ABX, 12 mg/kg BEV + 30 mg/kg ABX, 또는 AB160 (약 12 mg/kg BEV 및 약 30 mg/kg ABX를 가짐)으로 치료한 무흉선 누드 마우스에서의 AB 나노입자의 생체내 시험을 보여준다. 데이터는 치료후-제7일에서의 기준선 (치료 당일의 종양 크기)으로부터의 종양 크기의 변화 퍼센트로서 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 유의성을 결정하였다. AB 입자에 대한 p-값은 PBS, 개별 약물 단독 및 순차적으로 제공된 2개 약물보다 모두 유의하게 상이하였다.
도 3b는 도 3a에서 분석된 마우스의 중앙 생존에 대해 생성된 카플란-마이어 곡선을 보여준다. 맨틀-콕스 검정을 사용하여 생존 곡선을 비교하여 유의성을 결정하였다.
도 3c는 종양이 700 mm3 미만 또는 초과인 경우에 치료받은 마우스에 대한 기준선으로부터의 변화 퍼센트를 보여주며, 종양의 크기가 ABX 단독 및 AB160 군에서 종양 반응에 영향을 주는지 여부를 확인시켜 준다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 유의성을 결정하였다; ABX 단독 군은 종양 크기에 기초하여 유의한 차이를 보여주지 않은 반면 (p = 0.752), AB160 군은 유의하게 상이하였다 (p = 0.0057).
도 3d는 1 x 106개 A375 인간 흑색종 세포를 우측 측복부에 주사하고, 대략 600 mm3 내지 900 mm3의 종양 크기에서 PBS, 30 mg/kg ABX, 또는 45 mg/kg BEV 및 AB160, AB580 (580 nm의 평균 입자 크기를 갖는 알부민-결합된 파클리탁셀 대 베바시주맙의 나노입자) 또는 AB1130 (1130 nm의 평균 입자 크기를 갖는 알부민-결합된 파클리탁셀 대 베바시주맙의 나노입자)으로 치료한 무흉선 누드 마우스에서의 AB 나노입자의 생체내 시험을 보여준다. 데이터는 치료후-제7일에서의 기준선 (치료 당일의 종양 크기)으로부터의 종양 크기의 변화 퍼센트로서 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 유의성을 결정하였다. AB 입자에 대한 p-값은 PBS, 개별 약물 단독 및 순차적으로 제공된 2개 약물보다 모두 유의하게 상이하였다. 상이한 크기의 AB 입자 사이의 차이는 유의하지 않았다.
도 3e는 도 3d에서 분석된 마우스의 중앙 생존에 대해 생성된 카플란-마이어 곡선을 보여준다. 맨틀-콕스 검정을 사용하여 생존 곡선을 비교하여 유의성을 결정하였다.
도 4a는 ABX 또는 AB160과 관련하여 30 mg/kg의 파클리탁셀을 IV 주사한 후에 0-24시간에서 비-종양 및 종양 보유 마우스로부터 채취한 혈액 및 종양 샘플에 기초하고 LC-MS에 의해 측정한 혈액 파클리탁셀 농도를 log 스케일의 y-축을 사용한 선 그래프로 나타내어 보여준다. 마우스를 시간 0에서 IV 주사함과 동시에 혈액 샘플을 채취하고, 마우스를 0, 4, 8, 12, 및 24시간의 시점에 희생시켰다. 시점당 적어도 3마리 마우스였다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 ABX와 AB160 사이의 농도에서의 임의의 차이가 유의한지 결정하였다.
도 4b는 도 4a로부터의 혈액 파클리탁셀 농도를 수치 스케일의 y-축을 사용한 선 그래프로 나타내어 보여준다.
도 4c는 도 4a 및 4b에 제공된 혈액 농도 데이터로부터 계산된 Cmax, 반감기 및 AUC 값을 보여준다.
도 4d는 보다 이른 시점 (2 내지 8시간)을 사용한 제2 약동학적 실험으로부터의 혈액 파클리탁셀 농도를 log 스케일의 y-축을 사용한 선 그래프로 나타내어 보여준다.
도 4e는 도 4d로부터의 혈액 파클리탁셀 농도를 수치 스케일의 y-축을 사용한 선 그래프로 나타내어 보여준다.
도 4f는 ABX 및 AB160 주사 전에 종양을 보다 큰 크기로 성장시킨 마우스에서의 혈액 파클리탁셀 농도를 보여준다.
도 4g는 도 4f에서의 데이터로부터 계산된 Cmax 및 AUC를 보여준다.
도 4h는 LC-MS에 의해 결정된 바와 같은 제2 마우스 실험으로부터의 종양에서의 파클리탁셀 농도를 보여준다. 데이터는 파클리탁셀 μg/종양 조직 mg으로서 나타낸다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 차이가 유의하였는지 결정하였다.
도 4i는 AB160으로 치료받은 마우스에서의 I-125 방사능 수준을 ABX 단독에 비하여 보여준다.
도 4j는 도 4i에 제시된 I-125 방사능 수준의 그래프 표현을 보여준다.
도 5a는 리툭시맙으로 제조된 나노입자의 입자 크기 측정치 및 친화도를 보여준다. 10 mg/ml의 ABX를 리툭시맙 (RIT)과 0-10 mg/ml에서 인큐베이션하고, 광 산란 기술 (마스터사이저(Mastersizer) 2000)을 사용하여 생성된 입자 크기를 결정한다. 데이터는 각각의 크기에서의 입자의 부피 퍼센트로서 나타내고, 곡선은 입자 크기 분포를 보여준다 (상부). 표 (하부)는 항체의 각각의 농도에서의 생성된 입자의 크기를 보여준다.
도 5b는 트라스투주맙으로 제조된 나노입자의 입자 크기 측정치 및 친화도를 보여준다. 10 mg/ml의 ABX를 트라스투주맙 (HER)과 0-22 mg/ml에서 인큐베이션하고, 광 산란 기술 (마스터사이저 2000)을 사용하여 생성된 입자 크기를 결정하였다. 데이터는 각각의 크기에서의 입자의 부피 퍼센트로서 나타내고, 곡선은 입자 크기 분포를 보여준다 (상부). 표 (하부)는 항체의 각각의 농도에서의 생성된 입자의 크기를 보여준다.
도 5c는 생물층 간섭측정 (BLItz) 기술에 의해 결정된 pH 3, 5, 7 및 9에서의 리툭시맙 및 트라스투주맙의 결합 친화도를 ABX와 비교하여 보여준다. 해리 상수를 각각의 상호작용에 대해 나타낸다.
도 6a는 CD20-양성 Daudi 인간 림프종 세포주로 시험된 바와 같은 AR160의 시험관내 독성을 보여준다. 데이터는 비치료 웰 (최고 수준의 증식)에서의 FITC 양성 세포에 비한 치료 웰에서의 FITC 양성 세포의 퍼센트인 증식 지수의 그래프로 나타낸다.
도 6b는 5 x 106개 Daudi 인간 림프종 세포를 우측 측복부에 주사한 무흉선 누드 마우스에서의 생체내 종양 효능을 보여준다. 종양을 600 mm3 내지 900 mm3로 성장시키고, 마우스를 PBS, 30 mg/kg ABX, 12 mg/kg 리툭시맙, 12 mg/kg 리툭시맙 + 30 mg/kg ABX, 또는 AR160으로 치료하였다. 종양 반응을 치료후 제7일에서의 치료 제1일로부터의 종양 크기의 변화 퍼센트로 결정하였다. 스튜던트 t-검정에 의해 유의성을 결정하였으며; 기준선으로부터의 변화 퍼센트는 AR160 치료 마우스와 모든 다른 군 사이에서 유의하게 상이하였다 (p <0.0001).
도 6c는 도 6b에 제시된 실험으로부터 생성된 카플란-마이어 생존 곡선을 보여준다. 각 치료군에 대한 중앙 생존이 제시된다. 맨틀-콕스 검정을 사용하여 생존 곡선 차이가 유의한지 여부를 결정하였다.
도 7a는 또 다른 화학요법 약물 (시스플라틴) 시스플라틴의 AB160에의 첨가를 보여준다. ABX (5 mg/ml)를 시스플라틴 (0.5 mg/ml)과 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, ABX 미립자를 제거한 후에 상청액 중의 유리 시스플라틴을 HPLC에 의해 측정하였다. 유리 시스플라틴의 양을 출발 농도에서 감하여 ABX에 결합된 시스플라틴의 양을 결정하였다. 데이터는 출발 농도 (시스플라틴)와 함께 칼럼 그래프로 나타낸다.
도 7b는 A375 인간 흑색종 세포의 증식 검정에서의 시스플라틴-결합된 ABX (AC)의 독성을 보여준다. 약물 노출 및 EdU 혼입 24시간 후에, 세포를 고정시키고, 투과시키고, FITC 접합된 항-EdU 항체로 표지하였다. 데이터는 비치료 웰 (최고 수준의 증식)에서의 FITC 양성 세포에 비한 치료 웰에서의 FITC 양성 세포의 퍼센트인 증식 지수의 그래프로 나타낸다.
도 7c는 1 x 106개 A375 인간 흑색종 세포를 우측 측복부에 주사한 무흉선 누드 마우스에서의 AC (ABC 복합체; 시스플라틴-결합된 ABX)의 생체내 종양 효능을 보여준다. 종양을 600 mm3 내지 900 mm3로 성장시키고, 마우스를 PBS, 30 mg/kg ABX, 2 mg/kg 시스플라틴, AB160, 2 mg/kg 시스플라틴 + AB160 또는 ABC160으로 치료하였다. 종양 반응을 치료후 제7일에서의 치료 당일로부터의 종양 크기의 변화 퍼센트로 결정하였다. 유의성은 스튜던트 t-검정에 의해 결정하였고; 기준선으로부터의 변화 퍼센트는 ABC160 치료 마우스와 PBS-, 시스플라틴-, 또는 ABX-치료 마우스 사이에서 유의하게 상이하였다 (p <0.0001). AB160, AB160 + 시스플라틴, 및 ABC160 치료군 사이에서 기준선으로부터의 치료후 제7일 변화 퍼센트는 유의하게 상이하지 않았다.
도 7d는 도 7c에 제시된 실험에 기초하여 생성된 카플란-마이어 생존 곡선을 보여주며, 각 치료군에 대한 중앙 생존이 제시된다. 맨틀-콕스 검정을 사용하여 생존 곡선 차이가 유의한지 여부를 결정하였다.
도 8a는 동결건조시키고, 실온에서 1개월 동안 저장하고, 재구성한 AB160 나노입자의 크기 분포를 신선한 AB160 또는 ABX 단독과 비교하여 보여준다.
도 8b는 동결건조시키고, 실온에서 1개월 동안 저장하고, 재구성한 AB160 나노입자의 리간드 (VEGF) 결합 능력을 신선한 AB160 또는 ABX 단독과 비교하여 보여준다.
도 8c는 동결건조시키고, 실온에서 1개월 동안 저장하고, 재구성한 AB160 나노입자의 시험관내 암 세포 독성을 신선한 AB160 또는 ABX 단독과 비교하여 보여준다.
도 8d는 동결건조시키고, 실온에서 10개월 동안 저장하고, 재구성한 AB160 나노입자의 크기 분포를 신선한 AB160 또는 ABX 단독과 비교하여 보여준다.
도 8e는 동결건조시키고, 실온에서 10개월 동안 저장하고, 재구성한 AB160 나노입자의 리간드 (VEGF) 결합 능력을 신선한 AB160 또는 ABX 단독과 비교하여 보여준다.
도 8f는 동결건조시키고, 실온에서 10개월 동안 저장하고, 재구성한 AB160 나노입자의 시험관내 암 세포 독성을 신선한 AB160 또는 ABX 단독과 비교하여 보여준다.
도 9a-c는 염수 중에서 실온에서 최대 24시간 동안 인큐베이션된 I.V. 주입 조건 (5 mg/mL의 ABX 최종 농도)에서의 ABX-BEV 복합체의 크기 분포를 보여준다 (도 a 및 b). 실온에서 4시간까지, ELISA에 의해 복합체 파괴의 일부 증거가 존재한다 (20%, 도 c).
도 10은 ABX (상부 패널) 또는 AB160 (하부 패널)을 염수 또는 헤파린첨가된 인간 혈장 중에서 9:1 또는 1:1의 상대 부피 비에서 30초 동안 시험관내 인큐베이션한 것을 보여준다.
도 11a-e는 1 x 106개 A375 인간 흑색종 세포를 우측 측복부에 주사하고, (도 11a) PBS, (도 11b) 12 mg/kg BEV, (도 11c) 30 mg/kg ABX, (도 11d) AB160으로 치료하거나, 또는 (도 11e) 01.2 mg/kg BEV로 사전치료하고, 24시간 후에 AB160으로 치료한 무흉선 누드 마우스의 생체내 시험을 보여준다. 데이터는 치료후 제7일 및 치료후 제10일에서의 종양 부피 (mm3)로서 나타낸다.
도 11f는 도 11a-e로부터의 치료후-제7일 데이터를 요악한다.
도 11g는 도 11a-e로부터의 치료후-제10일 데이터를 요약한다.
본 명세서를 읽은 후, 본 발명을 다양한 대안적 실시양태 및 대안적 적용으로 구현하는 방법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 모든 다양한 실시양태를 본원에 기재하지는 않을 것이다. 여기서 제시된 실시양태는 제한이 아니라 단지 예로서 제시되는 것으로 이해될 것이다. 이와 같이, 다양한 대안적 실시양태의 이러한 상세한 설명은 하기 제시된 바와 같은 본 발명의 범주 또는 폭을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명을 개시 및 기재하기 전에, 하기 기재된 측면은 구체적 조성물, 이러한 조성물의 제조 방법 또는 그의 용도에 이와 같이 제한되지는 않는 것은 물론 변경될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 측면을 기재하는 목적을 위한 것이며 제한하도록 의도된 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다.
발명의 상세한 설명은 단지 독자의 편의를 위해 다양한 섹션으로 나누어지며, 임의의 섹션에서 발견되는 개시내용은 또 다른 섹션에서 그와 조합될 수 있다. 표제 또는 부표제는 독자의 편의를 위해 본 명세서에 사용될 수 있으며, 이는 본 발명의 범주에 영향을 미치도록 의도된 것은 아니다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 흔히 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서 및 하기 청구범위에서, 하기 의미를 갖는 것으로 정의될 수 있는 다수의 용어가 언급될 것이다:
본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것이며 본 발명을 제한하도록 의도된 것은 아니다. 본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하도록 의도된다.
"임의적인" 또는 "임의적으로"는 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있으며, 그 기재가 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않은 경우를 포함하는 것을 의미한다.
범위를 포함한 수치 지정, 예를 들어 온도, 시간, 양, 농도 등 앞에 사용된 경우에 용어 "약"은 ( + ) 또는 ( - ) 10%, 5%, 1% 또는 이들 사이의 임의의 하위범위 또는 하위값만큼 변경될 수 있는 근사값을 나타낸다. 바람직하게는, 용량 양에 대해 사용된 경우에 용어 "약"은 용량이 이들 사이에서 +/- 10%만큼 변경될 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, "약 400 내지 약 800개의 항체"는 나노입자의 외부 표면이 360 내지 880개의 입자 양의 항체를 함유하는 것을 나타낸다.
"포함하는" 또는 "포함한다"는 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지는 않는 것을 의미하도록 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용된 경우에 "~로 본질적으로 이루어진"은 언급된 목적을 위한 조합에 대해 임의의 본질적으로 유의한 다른 성분을 배제하는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 청구된 발명의 기본 및 신규 특징(들)에 대해 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 물질 또는 단계를 배제하지는 않을 것이다. "~로 이루어진"은 미량 요소 초과의 다른 성분 및 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미할 것이다. 각각의 이들 전환 용어에 의해 정의된 실시양태는 본 발명의 범주 내이다.
본원에 사용된 용어 "나노입자"는 5 마이크로미터 미만인 적어도 1개의 치수를 갖는 입자를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 예컨대 정맥내 투여를 위해, 나노입자는 1 마이크로미터 미만이다. 직접 투여를 위해, 나노입자는 더 크다. 훨씬 더 큰 입자가 명백하게 본 발명에 의해 고려된다.
입자 집단에서, 개별 입자의 크기는 평균 주위에 분포되어 있다. 집단에 대한 입자 크기는 따라서 평균 및 또한 백분위수에 의해 나타내어질 수 있다. D50은 입자의 50%가 그 미만에 해당하는 입자 크기이다. 입자의 10%는 D10 값보다 더 작고, 입자의 90%는 D90보다 더 작다. 불명확한 경우에, "평균" 크기는 D50과 등가이다. 따라서, 예를 들어, AB160은 160 나노미터의 평균 크기를 갖는 나노입자를 지칭한다.
용어 "나노입자"는 더 작은 단위 나노입자의 별개 다량체를 또한 포괄할 수 있다. 예를 들어, 320 nm 입자는 단위 160 nm 나노입자의 이량체를 포함한다. 160 nm 나노입자에 대해, 다량체는 따라서 대략 320 nm, 480 nm, 640 nm, 800 nm, 960 nm, 1120 nm 등일 것이다.
본원에 사용된 용어 "담체 단백질"은 항체 및/또는 치료제를 수송하도록 기능하는 단백질을 지칭한다. 본 개시내용의 항체는 담체 단백질과 가역적으로 결합할 수 있다. 예시적인 담체 단백질은 하기에 더 상세하게 논의되어 있다.
본원에 사용된 용어 "코어"는 담체 단백질, 담체 단백질 및 치료제, 또는 다른 작용제 또는 작용제의 조합으로 구성될 수 있는 나노입자의 중심 또는 내부 부분을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항체의 소수성 부분은 코어에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료제"는 치료상 유용한 작용제, 예를 들어 질환 상태, 생리학적 조건, 증상 또는 병인 인자의 치료, 완화 또는 감쇠, 또는 그의 평가 또는 진단을 위한 작용제를 의미한다. 치료제는 화학요법제, 예를 들어 유사분열 억제제, 토포이소머라제 억제제, 스테로이드, 항종양 항생제, 항대사물, 알킬화제, 효소, 프로테아솜 억제제 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체" 또는 "항체들"은 이뮤노글로불린 분자 및 이뮤노글로불린 분자의 면역 활성 부분 (즉, 항원을 면역-특이적으로 결합시키는 항원 결합 부위를 함유하는 분자)을 지칭한다. 상기 용어는 또한 2개의 이뮤노글로불린 중쇄 및 2개의 이뮤노글로불린 경쇄로 구성된 항체 뿐만 아니라 예를 들어 이뮤노글로불린 분자, 모노클로날 항체, 키메라 항체, CDR-그라프트된 항체, 인간화 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디술피드 연결된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체 (dAb), 디아바디, 다중특이적 항체, 이중 특이적 항체, 항-이디오타입 항체, 이중특이적 항체, 그의 기능적 활성 에피토프-결합 단편, 이중기능적 하이브리드 항체 (예를 들어, 문헌 [Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]) 및 단일 쇄 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) 및 Bird et al., Science 242, 423-426 (1988)])를 포함한 전장 항체 및 그의 부분을 포함한 다양한 형태를 지칭한다. (일반적으로, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2ND ed. (1984); Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)] 참조). 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD)을 가질 수 있다. 바람직하게는, 항체는 IgG이다. 항체는 비-인간 (예를 들어, 마우스, 염소 또는 임의의 다른 동물로부터), 완전 인간, 인간화, 또는 키메라 항체일 수 있다.
"Kd"로도 지칭되는 용어 "해리 상수"는 특정한 물질이 개별 성분 (예를 들어, 단백질 담체, 항체 및 임의적인 치료제)으로 분리되는 정도를 표현하는 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "동결건조된", "동결건조" 등은 건조될 물질 (예를 들어, 나노입자)을 우선 동결시키고, 이어서 얼음 또는 동결된 용매를 진공 환경 하에 승화에 의해 제거하는 공정을 지칭한다. 부형제는 저장 시에 동결건조된 제품의 안정성을 증진시키기 위해 사전-동결건조된 제제 중에 임의적으로 포함된다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 치료제로서 사용하기 전에 동결건조된 성분 (담체 단백질, 항체 및 임의적인 치료제)으로부터 형성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 담체 단백질, 항체 및 임의적인 치료제가 먼저 나노입자 내로 조합된 다음, 동결건조된다. 동결건조된 샘플은 추가의 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
용어 "벌킹제"는 동결건조된 제품의 구조를 제공하는 작용제를 포함한다. 벌킹제에 사용되는 흔한 예는 만니톨, 글리신, 락토스 및 수크로스를 포함한다. 제약상 우아한 케이크를 제공하는 것 이외에도, 벌킹제는 또한 붕괴 온도를 개질시키고, 동결-해동 보호를 제공하고, 장기 저장에 걸친 단백질 안정성을 증진시키는 것에 대해 유용한 품질을 부여할 수 있다. 이들 작용제는 또한 장성 개질제로서 기능할 수 있다.
용어 "완충제"는 동결건조 전에 용액 pH를 허용되는 범위로 유지하는 이들 작용제를 포괄하며, 숙시네이트 (소듐 또는 포타슘), 히스티딘, 포스페이트 (소듐 또는 포타슘), 트리스(Tris) (트리스(히드록시메틸)아미노메탄), 디에탄올아민, 시트레이트 (소듐) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 완충제는 약 5.5 내지 약 6.5 범위의 pH를 갖고; 바람직하게는 약 6.0의 pH를 갖는다. pH를 이러한 범위로 제어하는 완충제의 예는 숙시네이트 (예컨대 소듐 숙시네이트), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 다른 유기 산 완충제를 포함한다.
용어 "동결보호제"는 아마도 단백질 표면으로부터 우선적으로 배제되는 것에 의해, 동결-유도된 스트레스에 대해 단백질에 안정성을 제공하는 작용제를 포함한다. 이들은 1차 및 2차 건조, 및 장기 제품 저장 동안 보호를 또한 제공할 수 있다. 예는 중합체, 예컨대 덱스트란 및 폴리에틸렌 글리콜; 당, 예컨대 수크로스, 글루코스, 트레할로스 및 락토스; 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트; 및 아미노산, 예컨대 글리신, 아르기닌 및 세린이다.
용어 "동결건조보호제"는 아마도 무정형 유리질 매트릭스를 제공하고 수소 결합을 통해 단백질과 결합시켜 건조 공정 동안 제거된 물 분자를 대체하는 것에 의해, 건조 또는 '탈수' 공정 (1차 및 2차 건조 사이클) 동안 단백질에 안정성을 제공하는 작용제를 포함한다. 이는 단백질 입체형태를 유지하고, 동결건조 사이클 동안 단백질 열화를 최소화시키고, 장기 제품을 개선시키는 것을 돕는다. 예는 폴리올 또는 당, 예컨대 수크로스 및 트레할로스를 포함한다.
용어 "제약 제제"는 활성 성분이 효과적이도록 하는 형태이며 제제가 투여될 대상체에 대해 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는" 부형제 (비히클, 첨가제)는 사용된 활성 성분의 유효 용량을 제공하기 위해 대상 포유동물에 합리적으로 투여될 수 있는 것들이다.
"재구성 시간"은 용액을 사용하여 동결건조 제제를 입자-무함유 정화된 용액으로 재수화시키는데 필요한 시간이다.
"안정한" 제제는 저장 시에 그 중의 단백질이 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체에 의해 인식되는 항원의 부분을 지칭한다. 에피토프는 단백질 (예를 들어, 항체) 또는 리간드와의 특이적 상호작용을 가능하게 하는 (임의적으로 글리코실화되거나 또는 달리 변형된) 짧은 아미노산 서열 또는 펩티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 에피토프는 항체의 항원-결합 부위가 부착하는 분자의 일부분일 수 있다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체, 예컨대 인간에서의 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)의 치료를 포괄하며, (i) 질환 또는 장애를 억제, 즉 그의 발생을 정지시키고/거나; (ii) 질환 또는 장애를 완화, 즉 장애의 퇴행을 유발하고/ 거나; (iii) 장애의 진행을 저속화시키고/거나; (iv) 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 진행을 억제, 완화 또는 저속화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서 "치료하는" 또는 "치료"는 암 세포의 사멸을 지칭한다.
암 치료와 관련하여 용어 "사멸"은 그 암 세포 또는 암 세포 집단의 적어도 일부의 사멸로 이어질 임의의 유형의 조작을 포함하도록 의도된다.
추가적으로, 본 명세서에 사용된 일부 용어는 하기에 보다 구체적으로 정의되어 있다.
개관
본 발명은 부분적으로 담체 단백질, 항체 및 치료제를 포함하는 임의적으로 동결건조된 나노입자가 환자에 대한 독성을 최소화시키면서 종양에 대한 표적화 요법을 제공한다는 놀라운 발견에 입각한 것이다. 본원에 기재된 나노입자는 따라서 통상의 ADC에 비해 유의하게 개선된 것이다.
효과적인 통상의 ADC를 위해서는, 링커가 체순환에서 해리되지 않도록 충분하게 안정하지만 종양 부위에서 충분한 약물 방출을 가능하게 하는 것이 결정적이다. 문헌 [Alley, S.C., et al. (2008) Bioconjug Chem 19:759-765]. 이는 효과적인 약물 접합체를 개발함에 있어서 주요 장애인 것으로 입증된 바 있으며 (Julien, D.C., et al. (2011) MAbs 3:467-478; Alley, S.C., et al. (2008) Bioconjug Chem 19:759-765); 따라서, 나노-면역 접합체의 매력적인 특색은 생화학적 링커가 필요하지 않다는 점이다.
현행 ADC의 또 다른 결점은 종양으로의 더 높은 약물 침투가 인간 종양에서 직접 입증된 바 없다는 점이다. 마우스 모델에서의 ADC의 이전 시험은 항체로의 종양 표적화가 종양에서 더 높은 농도의 활성제를 유발한다는 것을 시사하였지만 (Deguchi, T. et al. (1986) Cancer Res 46: 3751-3755); 인간 질환의 치료에서는 이러한 상관 관계가 없으며, 이는 아마도 인간 종양이 마우스 종양보다 투과성에 있어서 훨씬 더 이질적이기 때문일 것이다. 문헌 [Jain, R.K. et al. (2010) Nat Rev Clin Oncol 7:653-664]. 또한, 나노입자의 크기가 혈관계로부터 종양으로의 혈관외유출에 대해 결정적이다. 인간 결장 선암종 이종이식 모델을 사용한 마우스 연구에서, 혈관 구멍은 400 nm 이하의 리포솜에 대해 투과성이었다. 문헌 [Yuan, F., et al. (1995) Cancer Res 55: 3752-3756]. 종양 구멍 크기 및 투과성의 또 다른 연구는 둘 다의 특징이 종양 위치 및 성장 상태에 의존성이며, 퇴행 종양 및 두개 종양이 200 nm 미만의 입자에 대해 투과성이라는 것을 입증하였다. 문헌 [Hobbs, S.K., et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95:4607-4612]. 본원에 기재된 나노-면역 접합체는 200 nm 미만의 무손상 대형 복합체가 체순환에서 종양 조직을 용이하게 투과할 있는 더 작은 기능적 단위로 부분적으로 해리된다는 사실에 의해 이러한 문제를 극복한다. 게다가, 접합체가 종양 부위에 도달하면, 더 작은 독성 페이로드가 방출될 수 있고, 전체 접합체가 아니라 단지 독성 부분이 종양 세포에 흡수될 필요가 있다.
치료제 (즉, 아브락산®)를 함유하는 항체- (즉, 아바스틴®) 코팅된 알부민 나노입자의 출현은 미리결정된 생체내 부위에 2가지 이상의 치료제의 유도 전달의 새로운 패러다임으로 이어져 왔다. 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 특허 공개 번호 WO 2012/154861 및 WO 2014/055415를 참조한다.
알부민 및 항체의 조성물이 특정한 농도 및 비로 수용액 중에 함께 혼합되는 경우에, 항체는 알부민 내에서 및 상에서 자발적으로 자기-조립하여 항체의 다중 카피 (최대 500 또는 그 초과)를 갖는 나노입자를 형성한다. 어떠한 이론에도 제한되지 않으면서, 항체의 항원 수용체 부분은 나노입자에서 외부에 위치하는 반면에, 소수성 꼬리는 소수성-소수성 상호작용에 의해 알부민 내로 통합되는 것으로 고려된다.
단일 공급원 단백질을 포함하는 단백질 조성물은 흔히 이들이 유의한 보관-수명을 나타내는 동결건조 형태로 저장되며, 이러한 동결건조된 조성물은 소수성-소수성 상호작용에 의해 함께 통합된 2가지 상이한 단백질의 자기-조립된 나노입자를 함유하지 않는다. 더욱이, 항체 결합 부분의 대부분이 나노입자의 표면 상에 노출되어 있는 나노입자 구성은, 그렇지 않으면 양성으로 간주되는 조건에 의해, 그 자체가 축출 또는 재구성되기 쉽도록 하기에 적합하다. 예를 들어, 동결건조 동안, 단백질 상의 이온 전하가 탈수되어 기저 전하가 노출된다. 노출된 전하는 2가지 단백질 사이의 전하-전하 상호작용을 가능하게 하며, 이는 각각의 단백질의 다른 것에 대한 결합 친화도를 변경시킬 수 있다. 추가로, 나노입자의 농도는 용매 (예를 들어, 물)가 제거됨에 따라 상당히 증가한다. 나노입자의 이러한 증가된 농도는 비가역적 올리고머화로 이어질 수 있다. 올리고머화는 단량체 형태에 비해 올리고머의 생물학적 특성을 감소시키고, 입자의 크기를 때때로 1 마이크로미터 초과로 증가시키는 단백질의 공지된 특성이다.
다른 한편으로는, 나노입자 조성물의 안정한 형태는 적어도 3개월의 보관-수명이 필요하고 6개월 또는 9개월 초과의 보관-수명이 바람직한 임상적 및/또는 상업적 용도를 위해 필요하다. 이러한 안정한 조성물은 정맥내 주사에 용이하게 이용가능해야 하고, 나노입자를 미리결정된 생체내 부위로 유도하도록 정맥내 주사 시에 그의 자기-조립된 형태를 유지해야 하고, 혈류로 전달 시에 임의의 허혈성 사건이 방지되도록 1 마이크로미터 미만의 최대 크기를 가져야 하고, 최종적으로 주사에 사용된 수성 조성물과 상용성이어야 한다.
화합물
본 개시내용을 읽으면 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 개시내용은 담체 단백질, 항체 및 임의적으로 적어도 하나의 치료제를 함유하는 나노입자의 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물은 임의적으로 동결건조된다.
일부 실시양태에서, 담체 단백질은 알부민, 젤라틴, 엘라스틴 (토포엘라스틴 포함) 또는 엘라스틴-유래 폴리펩티드 (예를 들어, α-엘라스틴 및 엘라스틴-유사 폴리펩티드 (ELP)), 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질 (예를 들어, 대두 단백질 단리물 (SPI)), 우유 단백질 (예를 들어, β-락토글로불린 (BLG) 및 카세인), 또는 유청 단백질 (예를 들어, 유청 단백질 농축물 (WPC) 및 유청 단백질 단리물 (WPI))일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 담체 단백질은 알부민이다. 바람직한 실시양태에서, 알부민은 난백 (오브알부민), 소 혈청 알부민 (BSA) 등이다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 담체 단백질은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 일부 실시양태에서, 담체 단백질은 미국 미국 식품 의약품국 (FDA)에 의해 승인된 일반적으로 안전한 것으로 여겨지는 (GRAS) 부형제이다.
일부 실시양태에서, 항체는 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 리툭시맙 및 트라스투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 나노입자의 표면의 전부 또는 일부 상의 항체의 실질적으로 단일 층이다.
표 1은 항체의 비제한적 목록을 제시하고 있다.
<표 1> 항체
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일부 실시양태에서, 적어도 하나의 치료제는 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 게피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 이마티닙, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴 및 시클로포스파미드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
표 2는 암 치료제의 비제한적 목록을 제시하고 있다.
<표 2> 암 치료제
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치료제는 나노입자 내부에, 나노입자의 외부 표면 상에, 또는 둘 다에 위치할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 나노입자는 하나 초과의 치료제, 예를 들어 2가지 치료제, 3가지 치료제, 4가지 치료제, 5가지 치료제 또는 그 초과를 함유할 수 있다. 게다가, 나노입자는 나노입자 내부 및 외부에 동일하거나 상이한 치료제를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 임의의 담체 단백질, 항체, 치료제 또는 그의 임의의 조합은 명백히 배제된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 아브락산®을 제외한 임의의 담체 단백질 및 화학요법제 및/또는 베바시주맙을 제외한 임의의 표적화 항체를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 적어도 100개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 적어도 200개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 적어도 300개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 적어도 400개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 적어도 500개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 적어도 600개의 항체를 포함한다.
한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 약 100 내지 약 1000개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 약 200 내지 약 1000개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 약 300 내지 약 1000개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 약 400 내지 약 1000개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 약 500 내지 약 1000개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 약 600 내지 약 1000개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 약 200 내지 약 800개의 항체를 포함한다. 한 측면에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 약 300 내지 약 800개의 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 나노입자는 나노입자의 표면에 비-공유 결합된 약 400 내지 약 800개의 항체를 포함한다. 고려되는 값은 종점을 포함하는 임의의 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위범위를 포함한다.
한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 1 μm 미만이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 130 nm 내지 약 1 μm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 130 nm 내지 약 900 nm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 130 nm 내지 약 800 nm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 130 nm 내지 약 700 nm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 130 nm 내지 약 600 nm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 130 nm 내지 약 500 nm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 130 nm 내지 약 400 nm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 130 nm 내지 약 300 nm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 130 nm 내지 약 200 nm이다. 바람직한 실시양태에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 150 nm 내지 약 180 nm이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 160 nm이다. 고려되는 값은 종점을 포함하는 임의의 언급된 범위 내의 임의의 값, 하위범위 또는 범위를 포함한다.
한 측면에서, 나노입자 조성물은 정맥내 주사를 위해 제제화된다. 허혈성 사건을 피하기 위해, 정맥내 주사를 위해 제제화된 나노입자 조성물은 약 1 μm 미만의 평균 입자 크기를 갖는 나노입자를 포함하여야 한다.
한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 1 μm 초과이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 1 μm 내지 약 5 μm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 1 μm 내지 약 4 μm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 1 μm 내지 약 3 μm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 1 μm 내지 약 2 μm이다. 한 측면에서, 나노입자 조성물 중의 평균 입자 크기는 약 1 μm 내지 약 1.5 μm이다. 고려되는 값은 종점을 포함하는 임의의 언급된 범위 내의 임의의 값, 하위범위 또는 범위를 포함한다.
한 측면에서, 나노입자 조성물은 종양으로의 직접 주사를 위해 제제화된다. 직접 주사는 종양 부위로의 또는 그 근위로의 주사, 종양으로의 관류 등을 포함한다. 종양으로의 직접 주사를 위해 제제화될 때, 나노입자는 임의의 평균 입자 크기를 포함할 수 있다. 이론에 얽매이지 않으면서, 보다 큰 입자 (예를 들어, 500 nm 초과, 1 μm 초과 등)가 종양 내에 고정화되고, 이에 의해 유익한 효과를 제공할 가능성이 보다 많은 것으로 여겨진다. 보다 큰 입자는 종양 또는 특정한 기관에 축적될 수 있다. 예를 들어, (간암을 위한 임상 용도에서) 간의 종양에 공급되는 간 동맥 내로 주사하는데 사용되는, "테라스피어(TheraSphere)®"로 불리는 20-60 마이크로미터 유리 입자를 참조한다. 따라서, 정맥내 투여를 위해, 1 μm 미만의 입자가 전형적으로 사용된다. 1 μm 초과의 입자는 보다 전형적으로는, 종양으로 직접 투여되거나 ("직접 주사") 또는 종양 부위 내로 공급되는 동맥 내로 투여된다.
한 측면에서, 조성물 중의 나노입자의 약 0.01% 미만은 200 nm 초과, 300 nm 초과, 400 nm 초과, 500 nm 초과, 600 nm 초과, 700 nm 초과, 또는 800 nm 초과의 입자 크기를 갖는다. 한 측면에서, 조성물 중의 나노입자의 약 0.001% 미만은 200 nm 초과, 300 nm 초과, 400 nm 초과, 500 nm 초과, 600 nm 초과, 700 nm 초과, 또는 800 nm 초과의 입자 크기를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 조성물 중의 나노입자의 약 0.01% 미만은 800 nm 초과의 입자 크기를 갖는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 조성물 중의 나노입자의 약 0.001% 미만은 800 nm 초과의 입자 크기를 갖는다.
바람직한 측면에서, 본원에 언급된 크기 및 크기 범위는 재구성된 동결건조된 나노입자 조성물의 입자 크기에 관한 것이다. 즉, 동결건조된 나노입자가 수용액 (예를 들어, 물, 다른 제약상 허용되는 부형제, 완충제 등) 중에 재현탁된 후에, 입자 크기 또는 평균 입자 크기는 본원에 언급된 범위 내에 있다.
한 측면에서, 나노입자의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9%는 재구성된 조성물에 단일 나노입자로서 존재한다. 즉, 나노입자의 약 50%, 40%, 30% 미만 등은 이량체화 또는 다량체화 (올리고머화)되어 있다.
일부 실시양태에서, 나노입자의 크기는 항체에 대한 담체 단백질의 양 (예를 들어, 비)을 조정함으로써 제어될 수 있다. 나노입자의 크기 및 크기 분포가 또한 중요하다. 본 발명의 나노입자는 그의 크기에 따라 다르게 거동할 수 있다. 큰 크기에서, 응집은 혈관을 막을 수 있다. 따라서, 나노입자의 응집은 조성물의 성능 및 안전성에 영향을 미칠 수 있다. 다른 한편으로, 보다 큰 입자는 특정 조건 하에서 (예를 들어, 정맥내로 투여되지 않은 경우) 보다 치료적일 수 있다.
한 측면에서, 나노입자 조성물은 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료제는 나노입자의 외부 표면에 비-공유 결합된다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료제는 나노입자의 외부 표면 상에 배열된다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료제는 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 겜시타빈, 게피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 이마티닙, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴 및 시클로포스파미드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 추가의 치료제는 항암 항체이다.
나노입자를 제조하는 방법
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 나노입자 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 나노입자 조성물의 나노입자는 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자를 항체와, 약 10:1 내지 약 10:30의 담체 단백질 입자 또는 담체 단백질-치료제 입자 대 항체의 비로 접촉시킴으로써 형성된다. 한 실시양태에서, 비는 약 10:2 내지 약 10:25이다. 한 실시양태에서, 비는 약 10:2 내지 약 1:1이다. 바람직한 실시양태에서, 비는 약 10:2 내지 약 10:6이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 비는 약 10:4이다. 고려되는 비는 종점을 포함하는 임의의 언급된 범위 내의 임의의 값, 하위범위 또는 범위를 포함한다.
한 실시양태에서, 나노입자를 형성하기 위해 사용되는 용액 또는 다른 액체 매질의 양이 특히 중요하다. 담체 단백질 (또는 담체 단백질-치료제) 및 항체의 과도하게 묽은 용액 중에서는 어떤 나노입자도 형성되지 않는다. 과도하게 진한 용액은 비구조화 응집체를 생성할 것이다. 일부 실시양태에서, 사용되는 용액 (예를 들어, 멸균수, 염수, 포스페이트 완충 염수)의 양은 용액 약 0.5 mL 내지 용액 약 20 mL이다. 일부 실시양태에서, 담체 단백질의 양은 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 항체의 양은 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 담체 단백질:항체:용액의 비는 용액 (예를 들어, 염수) 1 mL 중 담체 단백질 (예를 들어, 알부민) 대략 9 mg 대 항체 (예를 들어, BEV) 4 mg이다. 소정량의 치료제 (예를 들어, 탁솔)가 또한 담체 단백질에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 탁솔 1 mg이 용액 1 mL 중 담체 단백질 9 mg (10 mg 담체 단백질-치료제) 및 항체 4 mg에 첨가될 수 있다. 예를 들어 대략 1 리터의 용액을 갖는 전형적인 i.v. 백을 사용할 때, 1 mL로 사용된 경우와 비교하여 담체 단백질/담체 단백질-치료제 및 항체의 양의 1000x를 사용할 필요가 있을 것이다. 따라서, 표준 i.v. 백에서 본 발명의 나노입자를 형성할 수는 없다. 게다가, 성분이 본 발명의 치료량으로 표준 i.v. 백에 첨가되는 경우, 성분은 나노입자를 형성하도록 자기-조립되지는 않는다.
한 실시양태에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 4 내지 약 8의 pH를 갖는 용액 중에서 항체와 접촉된다. 한 실시양태에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 4의 pH를 갖는 용액 중에서 항체와 접촉된다. 한 실시양태에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 5의 pH를 갖는 용액 중에서 항체와 접촉된다. 한 실시양태에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 6의 pH를 갖는 용액 중에서 항체와 접촉된다. 한 실시양태에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 7의 pH를 갖는 용액 중에서 항체와 접촉된다. 한 실시양태에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 8의 pH를 갖는 용액 중에서 항체와 접촉된다. 바람직한 실시양태에서, 담체 단백질 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 5 내지 약 7의 pH를 갖는 용액 중에서 항체와 접촉된다.
한 실시양태에서, 담체 단백질 입자 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 5℃ 내지 약 60℃의 온도, 또는 종점을 포함하는 상기 범위 내의 임의의 범위, 하위범위 또는 값에서 항체와 함께 인큐베이션된다. 바람직한 실시양태에서, 담체 단백질 입자 또는 담체 단백질-치료제 입자는 약 23℃ 내지 약 60℃의 온도에서 항체와 함께 인큐베이션된다.
이론에 얽매이지 않으면서, 나노입자 조성물 중의 나노입자의 안정성은, 적어도 부분적으로, 나노입자가 형성되는 온도 및/또는 pH, 뿐만 아니라 용액 중 성분 (즉, 담체 단백질, 항체 및 임의적으로 치료제)의 농도에 좌우된다. 한 실시양태에서, 나노입자의 Kd는 약 1 x 10-11 M 내지 약 2 x 10-5 M이다. 한 실시양태에서, 나노입자의 Kd는 약 1 x 10-11 M 내지 약 2 x 10-8 M이다. 한 실시양태에서, 나노입자의 Kd는 약 1 x 10-11 M 내지 약 7 x 10-9 M이다. 바람직한 실시양태에서, 나노입자의 Kd는 약 1 x 10-11 M 내지 약 3 x 10-8 M이다. 고려되는 값은 종점을 포함하는 임의의 언급된 범위 내의 임의의 값, 하위범위 또는 범위를 포함한다.
동결건조
본 발명의 동결건조된 조성물은 안정화제, 완충제 등의 존재 또는 부재 하에 표준 동결건조 기술에 의해 제조된다. 놀랍게도, 이들 조건은 나노입자의 비교적 취성인 구조를 변경하지 않는다. 더욱이, 최대한, 이들 나노입자는 동결건조 시에 그의 크기 분포를 유지하고, 보다 중요하게는, 생체내 투여 (예를 들어, 정맥내 전달)를 위해 신선하게 제조된 것처럼 실질적으로 동일한 형태 및 비로 재구성될 수 있다.
제제
한 측면에서, 나노입자 조성물은 종양으로의 직접 주사를 위해 제제화된다. 직접 주사는 종양 부위로의 또는 그 근위로의 주사, 종양으로의 관류 등을 포함한다. 나노입자 조성물은 전신으로 투여되지 않기 때문에, 나노입자 조성물은 종양으로의 직접 주사를 위해 제제화되고, 임의의 평균 입자 크기를 포함할 수 있다. 이론에 얽매이지 않으면서, 보다 큰 입자 (예를 들어, 500 nm 초과, 1 μm 초과 등)가 종양 내에 고정화되고, 이에 의해 보다 우수한 유익한 효과인 것으로 여겨지는 것을 제공할 가능성이 보다 많은 것으로 여겨진다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 화합물 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
일반적으로, 본원에 제공된 화합물은 환자에게 임의의 허용되는 투여 방식에 의해 투여되도록 제제화될 수 있다. 다양한 제제 및 약물 전달 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Gennaro, A.R., ed. (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.]을 참조한다.
일반적으로, 본원에 제공된 화합물은 제약 조성물로서 하기 경로 중 어느 하나에 의해 투여될 것이다: 경구, 전신 (예를 들어, 경피, 비강내 또는 좌제에 의해) 또는 비경구 (예를 들어, 근육내, 정맥내 또는 피하) 투여.
조성물은 일반적으로 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제와 조합된 본 발명의 화합물로 구성된다. 허용되는 부형제는 비-독성이고, 투여를 보조하고, 청구된 화합물의 치료 이익에 불리한 영향을 미치지 않는다. 이러한 부형제는 임의의 고체, 액체, 반-고체 부형제이거나, 또는 에어로졸 조성물의 경우에는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 일반적으로 이용가능한 기체상 부형제일 수 있다.
고체 제약 부형제는 전분, 셀룰로스, 활석, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 벼, 가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산마그네슘, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 건조 탈지유 등을 포함한다. 액체 및 반고체 부형제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올, 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등을 비롯한 다양한 오일로부터 선택될 수 있다. 특히 주사가능한 용액을 위한 바람직한 액체 담체는 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 글리콜을 포함한다. 다른 적합한 제약 부형제 및 그의 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, edited by E. W. Martin (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990)]에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은, 원하는 경우에, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유하는 팩 또는 분배기 장치에 존재할 수 있다. 이러한 팩 또는 장치는, 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩, 또는 유리, 및 바이알에서와 같은 고무 마개를 포함할 수 있다. 팩 또는 분배기 장치에는 투여를 위한 지침서가 동반될 수 있다. 상용성 제약 담체 중에 제제화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물이 또한 제조되고, 적절한 용기에 배치되고, 지시된 상태의 치료에 대해 표지될 수 있다.
치료 방법
본원에 기재된 바와 같은 나노입자 조성물은 포유동물에서 암 세포 및/또는 종양을 치료하는데 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 인간 (즉, 인간 환자)이다. 바람직하게는, 동결건조된 나노입자 조성물은 투여 전에 재구성된다 (수성 부형제 중에 현탁됨).
한 측면에서, 세포를 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 나노입자 조성물과 접촉시켜 암 세포를 치료하는 단계를 포함하는, 암 세포를 치료하는 방법이 제공된다. 암 세포의 치료는 증식의 감소, 세포의 사멸, 세포의 전이의 방지 등을 비제한적으로 포함한다.
한 측면에서, 종양의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 나노입자 조성물을 투여하여 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 종양을 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 종양의 크기가 감소한다. 한 실시양태에서, 종양 크기는 치료 동안 및/또는 치료 후에 적어도 소정 기간 동안 증가 (즉, 진행)하지 않는다.
한 실시양태에서, 나노입자 조성물은 정맥내로 투여된다. 한 실시양태에서, 나노입자 조성물은 종양에 직접 투여된다. 한 실시양태에서, 나노입자 조성물은 종양으로의 직접 주사 또는 관류에 의해 투여된다.
한 실시양태에서, 방법은 다음을 포함한다:
a) 나노입자 조성물을 3주 동안 1주에 1회 투여하는 단계;
b) 나노입자 조성물의 투여를 1주 동안 중단하는 단계; 및
c) 임의적으로 단계 a) 및 b)를 필요에 따라 반복하여 종양을 치료하는 단계.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 나노입자의 치료 유효량은 약 50 mg/m2 내지 약 200 mg/m2 담체 단백질 또는 담체 단백질 및 치료제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 치료 유효량은 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2 담체 단백질 또는 담체 단백질 및 치료제를 포함한다. 고려되는 값은 종점을 포함하는 임의의 언급된 범위 내의 임의의 값, 하위범위 또는 범위를 포함한다.
한 실시양태에서, 치료 유효량은 약 20 mg/m2 내지 약 90 mg/m2 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 치료 유효량은 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2 항체를 포함한다. 고려되는 값은 종점을 포함하는 임의의 언급된 범위 내의 임의의 값, 하위범위 또는 범위를 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 암 또는 종양은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 담도암; 교모세포종 및 수모세포종을 포함한 뇌암; 유방암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장암; 자궁내막암; 식도암, 위암; 급성 림프구성 및 골수 백혈병을 포함한 혈액 신생물; 다발성 골수종; AIDS 연관된 백혈병 및 성인 T-세포 백혈병 림프종; 보웬병 및 파제트병을 포함한 상피내 신생물; 간암 (간암종); 폐암; 호지킨병을 포함한 림프종 및 림프구성 림프종; 신경모세포종; 편평 세포 암종을 포함한 구강암; 상피 세포, 기질 세포, 배세포 및 중간엽 세포에서 발생되는 것을 포함한 난소암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종 및 골육종을 포함한 육종; 흑색종, 카포시 육종, 기저세포암 및 편평 세포암을 포함한 피부암; 배 종양 (정상피종, 비-정상피종[기형종, 융모막암종]), 기질 종양 및 배세포 종양을 포함한 고환암; 갑상선 선암종 및 수질성 암종을 포함한 갑상선암; 및 선암종 및 윌름스 종양을 포함한 신암. 중요한 실시양태에서, 암 또는 종양은 유방암, 림프종, 다발성 골수종 및 흑색종을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 유사한 유용성을 제공하는 작용제에 대해 임의의 허용되는 투여 방식에 의해 치료 유효량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물, 즉 나노입자의 실제 양은 치료될 질환의 중증도, 대상체의 연령 및 상대적인 건강, 사용되는 화합물의 효력, 투여 경로 및 형태, 및 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 인자와 같은 수많은 인자에 좌우될 것이다.
이러한 작용제의 유효량은 상용 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 마찬가지로 가장 유효하고 편리한 투여 경로 및 가장 적절한 제제도 그러할 수 있다. 다양한 제제 및 약물 전달 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Gennaro, A.R., ed. (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.]을 참조한다.
작용제, 예를 들어 본 발명의 화합물의 유효량 또는 치료 유효량 또는 용량은 대상체에서 증상의 호전 또는 생존의 연장을 가져오는 작용제 또는 화합물의 양을 지칭한다. 이러한 분자의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어 LD50 (집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서의 치료 유효 용량)을 결정함으로써 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 대 치료 효과의 용량 비가 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 작용제가 바람직하다.
유효량 또는 치료 유효량은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되는, 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출해 내는 화합물 또는 제약 조성물의 양을 지칭한다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및/또는 이용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제제, 투여 경로, 투여량 및 투여 간격은 대상체의 상태의 특성을 고려하여, 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 선택되어야 한다.
투여량 및 간격은 목적하는 효과를 달성하기에 충분한 활성 모이어티의 혈장 수준; 즉, 최소 유효 농도 (MEC)를 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다. MEC는 각각 화합물에 대해 다를 것이지만, 예를 들어 시험관내 데이터 및 동물 실험으로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하는데 필요한 투여량은 개별 특징 및 투여 경로에 좌우될 것이다. 국부 투여 또는 선택적 흡수의 경우에, 약물의 유효 국부 농도는 혈장 농도와 관련이 없을 수 있다.
실시예
본 개시내용은 코어로서 알부민-결합된 파클리탁셀 (즉, 아브락산®) 또는 시스플라틴, 및 항체로서 베바시주맙 (즉, 아바스틴®) 또는 리툭시맙 (즉, 리툭산®)으로 구성된 나노입자를 사용하여 예시된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 실시예의 나노입자를 제조 및 사용하는 것이 단지 예시의 목적을 위한 것이고 본 개시내용이 이러한 예시에 의해 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본원에 사용된 임의의 약어는 통상의 과학적 의미를 갖는다. 모든 온도는 달리 언급되지 않는 한 ℃이다. 본원에서, 하기 용어는 달리 정의되지 않는 한 하기 의미를 갖는다:
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실시예 1: 나노입자 제조
아브락산 (ABX) (10 mg)을 베바시주맙 (BEV) (4 mg [160 μl], 달리 나타내지 않는 한) 중에 현탁시키고, 0.9% 염수 840 μl를 첨가하여 ABX 및 BEV의 최종 농도를 각각 10 mg/ml 및 2 mg/ml로 하였다. 혼합물을 실온 (또는 나타낸 온도)에서 30분 동안 인큐베이션하여 입자가 형성되도록 하였다. ABX:BEV 복합체의 입자 크기를 측정하기 위한 마스터사이저 실험을 위해, ABX 10 mg을 BEV 중에 0 내지 25 mg/ml의 농도로 현탁시켰다. ABX와 리툭시맙 (0-10 mg/ml) 또는 트라스투주맙 (0-22 mg/ml)과의 복합체를 유사한 조건 하에 형성시켰다.
인간에서 사용하기 위해, ABX:BEV 복합체는 25 mg/mL BEV의 4 mL 바이알의 투여 적절한 수를 수득하고, 하기 지침에 따라 각각의 바이알을 4 mg/mL로 희석시킴으로써 제조할 수 있다. ABX의 100 mg 바이알의 투여 적절한 수는 10 mg/mL ABX 나노입자를 함유하는 최종 농도로 재구성함으로써 제조할 수 있다. 멸균 3 mL 시린지를 사용하여, 베바시주맙 (25 mg/mL) 1.6 mL (40 mg)를 빼내고, ABX 100 mg을 함유하는 각각의 바이알의 내벽 상에 최소 1분에 걸쳐 천천히 주사할 수 있다. 베바시주맙 용액을 동결건조된 케이크 상에 직접 주사하여서는 안되는데, 이로 인해 발포가 일어날 것이기 때문이다. 이어서, 멸균 12 mL 멸균 시린지를 사용하여, 0.9% 염화나트륨 주사용액 (USP) 8.4 mL를 빼내고, ABX 100 mg 및 BEV 40 mg을 함유하는 각각의 바이알의 내벽 상에 8.4 mL를 최소 1분에 걸쳐 천천히 주사할 수 있다. BEV 1.6 mL 및 0.9% 염화나트륨 주사용액 (USP) 8.4 mL의 첨가를 완료하였을 때, 각각의 바이알을 임의의 케이크/분말의 완전 용해가 일어날 때까지 적어도 2분 동안 서서히 와류시키고/거나 천천히 도치시킬 수 있다. 발포체의 생성은 피하여야 한다. 이 시점에서 각각의 바이알의 농도는 100 mg/10 mL ABX 및 40 mg/10 mL BEV여야 한다. ABX 및 BEV를 함유하는 바이알을 60분 동안 정치시켜야 한다. 바이알(들)을 10분마다 서서히 와류시키고/거나 도치시켜 복합체를 계속 혼합하여야 한다. 60분이 경과한 후에, 계산된 투여 부피의 ABX 및 BEV를 각각의 바이알로부터 빼내고, 비어있는 비아플렉스 백에 천천히 첨가하여야 한다. 이어서, 동등 부피의 0.9% 염화나트륨 주사용액 (USP)을 첨가하여 ABX 5 mg/mL 및 BEV 2 mg/mL의 최종 농도를 만든다. 이어서, 백을 1분 동안 서서히 와류시키고/거나 천천히 도치시켜 혼합한다. ABX:BEV 나노입자는 최종 희석 후 실온에서 최대 4시간 동안 보관할 수 있다.
실시예 2: 시험관내 ABX 및 BEV의 결합
ABX 및 BEV가 상호작용하는지 여부를 결정하기 위해, 실시예 1에서 형성된 나노입자를 유동 세포측정법 및 전자 현미경검사에 의해 분석하였다.
방법
유동 세포측정법: AB160을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. ABX에 대한 BEV의 결합을 결정하기 위해, AB160의 가시화를 아큐리(Accuri) C6 유동 세포측정기 (비디 프랭클린 레이크스(BD Franklin Lakes), 뉴저지주) 상에서 수행하고, 데이터 분석을 아큐리 C6 소프트웨어를 사용하여 행하였다. 비오티닐화 (5μg) 염소 항-마우스 IgG (압캠(Abcam), 매사추세츠주 캠브리지)를 5 μg의 스트렙타비딘 PE (압캠, 매사추세츠주 캠브리지)로 표지하였다. BEV의 Fab 부분이 마우스 유래이기 때문에 염소 항-마우스 IgG를 선택하여 AB160을 표지하였다. ABX 및 AB160을 실온에서 30분 동안 PE-표지된 염소 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 유동 세포측정법에 의해 가시화하였다.
전자 현미경검사: 6 mg/ml로 PBS 중에 용해된 ABX 5 μl를 300-메쉬 팔로디안-탄소 코팅된 구리 그리드에 첨가하고, 1분 동안 정치시켰다. 뾰족한 조각의 여과지를 방울에 접촉시켜 잉여량의 액체를 제거하여, 그리드 상에 박막을 남겼다. 그리드가 건조되도록 하였다. 건조된 그리드 상에 남겨진 완충제 결정을 용해시키기 위해, 샘플을 dH2O 중에서 3회 세척하였다. 작은 방울의 1% 포스포텅스텐산 (PTA) (pH 7.2)을 그리드에 첨가하였다. 이어서, 그리드를 다시 뾰족한 조각의 여과지에 의해 접촉시켜 잉여량의 액체를 제거하여, 그리드 상에 박막을 남기고 건조되도록 하였다. 0.9% 염화나트륨 용액 중 25 mg/ml의 BEV (제넨테크(Genentech))를 PBS로 1:10 비로 희석하였다. BEV 5 μl를 니켈 포름바-코팅된 그리드 상에 로딩하고, 30분 내지 1시간 동안 공기 건조되도록 하였다. AB160에 대해, PBS 중에 용해된 10 mg/ml ABX 및 0.9% 염화나트륨 용액 중의 4mg/ml BEV를 2.5:1 비로 혼합하였다. 복합체를 PBS로 1:5로 추가로 희석하였다. 복합체 5 μl를 니켈 포름바-코팅된 그리드 상에 로딩하고, 30분 내지 1시간 동안 공기 건조시켰다. 두 샘플을 염소 항-마우스 IgG에서 6 nm 금-접합된 입자 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Microscopy Sciences))와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 10% FCB/PBS로 1:30으로 희석하고, PBS로 6회 (각각 2분) 세척하고, dH2O로 6회 세척하고, 이어서 2% 메틸셀룰로스 및 4% UA (9:1)의 혼합물로 5분 동안 염색하였다. 여과지를 사용하여 염색을 제거하고, 그리드를 1시간 동안 공기 건조시켰다. 두 샘플을 당나귀 항-마우스 IgG에서 6 nm 금-접합된 입자 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))와 함께 밤새 인큐베이션하고, 10% FCB/PBS로 1:25 희석하고, PBS로 6회 (각각 2분) 세척하고, dH2O 물로 6회 세척하고, 1% PTA로 5분 동안 염색하고, 공기 건조시키고, 2% 메틸셀룰로스로 덮고, 1시간 동안 공기 건조시켰다. 80 KV에서 작동하는 JEOL1400 상에서 현미경사진을 찍었다.
결과
ABX (10 mg/ml)를 4 mg/ml BEV와 함께 시험관내에서 공동-인큐베이션하고, 이들이 160 nm 나노입자 (본원에서 AB160으로 지칭됨)를 형성하였다는 것을 발견하였다. IgG1 (BEV)의 Fab 부분이 마우스 기원이기 때문에, BEV를 함유하는 입자를 정제된 염소 항-마우스 IgG로, 이어서 2차 항체로서 항-염소 PE로 선택적으로 표지하였다. 음성 대조군으로서, 샘플을 단지 항-염소 PE만으로 염색하였다. 입자를 유동 세포측정법에 의해 가시화하고, ABX (6.7% 양성) 단독에 비해 AB160 (41.2% 양성)에 대한 항-마우스 IgG1 결합의 밝은 신호를 입증하였다 (도 1a). ABX에 대한 BEV의 결합을 검증하기 위해, BEV를 금-표지된 마우스 항-인간 IgG로 표지하고, 입자를 전자 현미경검사로 가시화하였다 (도 1b). 놀랍게도, EM 사진은 ABX 나노입자를 둘러싸는 BEV의 단층을 제시한다.
복합체가 파괴되었을 때 파클리탁셀이 결합된 채로 남아있는 단백질이 무엇 (알부민 또는 BEV)인지를 결정하기 위해, AB160을 제조하고, 다음 분획을 수집하였다: 미립자 (나노AB160), 100 kD 초과의 단백질 및 100 kD 미만의 단백질. 파클리탁셀을 각각의 분획에서 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS)에 의해 측정하였다. 파클리탁셀의 대략 75%가 미립자 내에 남아있었고, 남아있는 파클리탁셀의 대다수가 100 kD 이상의 단백질을 함유하는 분획과 회합되어 있었으며 (도 1c, 상단), 이는 미립자가 해리될 때 파클리탁셀이 BEV 단독 또는 BEV 및 알부민 이종이량체에 결합된다는 것을 시사한다. 이는 해리된 복합체가 화학요법 약물을 항체와 함께 함유하여, 여전히 고-VEGF 종양 미세환경으로 이동할 것임을 나타낸다. 이들 발견은 AB160으로부터의 상청액의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었으며, 이는 BEV 및 파클리탁셀이 파클리탁셀-BEV-알부민 단백질 복합체와 일치하는 크기인 대략 200 kD에서 공동-국재화된다는 것을 제시하였다 (도 1c, 하단).
실시예 3: 시험관내 AB160의 기능
복합체에서의 두 핵심 요소인 항체 및 파클리탁셀이 복합체 내에 존재할 때 그의 기능을 유지하였다는 확인을 입증하였다.
방법
시험관내 독성: A375 인간 흑색종 세포주 (ATCC, 버지니아주 마나사스) 및 Daudi B-세포 림프종 세포주 (ATCC, 버지니아주 마나사스)를 1% PSG 및 10% FBS가 존재하는 DMEM 중에서 배양하였다. 세포를 수거하고, 24 웰 플레이트에 웰당 0.75 x 106개 세포로 플레이팅하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 0 내지 200 μg/ml의 파클리탁셀 농도에서 ABX 또는 AB160에 노출시켰다. 증식을 측정하기 위해, 클릭(Click)-iT EdU (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 오레곤주 유진) 키트를 이용하였다. 간략하게, 10 mM EdU를 웰에 첨가하고, 세포 및 ABX 또는 AB160과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 세포에 1% 사포닌을 투과시키고, 삽입된 EdU를 FITC-접합된 항체로 표지하였다. 증식 지수는 각각의 치료로부터의 FITC 양성 세포를 최대 증식의 비치료 EdU 표지된 세포로 나눔으로써 결정하였다.
VEGF ELISA: BEV가 ABX에 결합하였을 때 여전히 그의 리간드인 VEGF에 결합할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 표준 VEGF ELISA (알 앤 디 시스템즈(R and D Systems), 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하였다. AB160을 기재된 바와 같이 제조하고, 2000 pg/ml VEGF를 AB160 복합체 또는 ABX 단독에 첨가하였다. VEGF를 실온에서 2시간 동안 나노입자와 함께 인큐베이션하였다. 현탁액을 15분 동안 6000 rpm에서 스핀시키고, 상청액을 수집하고, 유리 VEGF를 ELISA에 의해 측정하였다. 간략하게, ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 포획 항체로 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, 차단시키고, 표준물 및 샘플을 첨가하였다. 세척 후에, 검출 항체를 첨가하고, 플레이트를 기질 (알 앤 디 시스템즈, 미네소타주 미네아폴리스)로 발색시켰다. 흡광도를 베르사맥스(Versamax) ELISA 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 미결합된 VEGF의 농도를 0 내지 2000 pg/ml의 표준 곡선으로 결정하였다.
결과
AB160은 인간 흑색종 세포주 A375를 사용한 시험관내 독성 검정에서 ABX 단독과 유사한 독성을 가지며, 이는 파클리탁셀이 어느 제제에서나 동등하게 기능한다는 것을 시사한다 (도 1d).
AB160 복합체에서 BEV에 대한 VEGF의 결합을 시험하기 위해, AB160 또는 ABX를 VEGF와 함께 공동-인큐베이션하고, 미립자를 제거하고, 상청액을 VEGF 함량에 대해 시험하였다. AB160으로부터 측정된 상청액 중 VEGF의 결핍 (<10% 미결합된 VEGF)은 VEGF가 AB160 복합체에서 BEV에 의해 결합되었다는 것을 나타냈고, 반면에 ABX (>80% 미결합된 VEGF) 단독과 인큐베이션하였을 때는 VEGF가 유리 상태로 남아있었다는 것을 나타냈다 (도 1e).
중요하게, 이들 검정은 AB160에서의 파클리탁셀이 종양 세포에 대한 그의 독성을 유지하고 결합된 BEV가 그의 리간드인 VEGF에 결합하는 능력을 유지한다는 것을 입증하였다.
실시예 4: 입자 크기 및 단백질 친화도
BEV가 ABX에 결합하였을 때 형성된 나노입자의 특징을 이해하기 위해, ABX:BEV 복합체의 크기를 ABX에 대해 결정하였다.
방법
마스터사이저 및 나노사이트: ABX 및 항체-ABX 약물 복합체의 입자 크기를 마스터사이저 2000 (말번 인스트루먼츠(Malvern Instruments), 매사추세츠주 웨스트보로우) 상에서 동적 광 산란에 의해 측정하였다. 입자 크기를 측정하기 위해, 2 ml (5 mg/ml)의 아브락산 또는 복합체를 샘플 챔버에 첨가하였다. 데이터를 말번 소프트웨어에 의해 분석하고, 입자 크기 분포를 부피에 의해 나타내었다. 이후에, 입자 크기 및 안정성을 나노사이트 시스템 (말번 인스트루먼츠, 매사추세츠주 웨스트보로우)을 사용하여 검증하였다. ABX 또는 복합체 입자를 적절한 범위로 희석하여 입자 크기를 정확하게 측정하였다. 데이터를 입자 크기 분포에 의해 나타내었지만; 그러나, 나노입자 트래킹 분석은 입자 크기를 결정하기 위해 브라운 운동을 사용한다.
결합 검정: 100 μg/ml의 비오티닐화 BEV, 리툭시맙 또는 트라스투주맙을 스트렙타비딘 프로브 (포르테바이오 코포레이션(ForteBio Corp.), 캘리포니아주 멘로파크)에 결합시켰다. ABX의 결합을 1000, 500 및 100 mg/ml에서 BLItz 시스템 (포르테바이오 코포레이션, 캘리포니아주 멘로파크) 상에서 광 흡광도에 의해 측정하였다. 회합 및 해리 상수를 BLItz 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
생물-층 간섭측정법 (BLItz) 기술을 이용하여 ABX에 대한 BEV의 결합 친화도를 평가하였다. 비오티닐화 BEV를 스트렙타비딘 프로브에 결합시키고, ABX (1000, 500 및 100 μg/ml)에 노출시켰다. BEV 및 ABX의 해리 상수 (Kd)는 실온 및 pH 7에서 2.2 x 10-8 M이며, 이는 강한 비-공유 상호작용과 일치한다. BEV 및 ABX의 결합 친화도는 알부민과 일부 박테리아 단백질의 천연 또는 조작된 알부민-결합 도메인 사이에 관찰된 해리 상수의 범위 내에 있다. 문헌 [Nilvebrant, J. et al. (2013) Comput Struct Biotechnol J 6:e201303009].
결과
ABX:BEV 나노입자는 130 nm ABX 단독보다 일관되게 더 컸다 (대략 160 nm) (도 2a). 생성된 나노입자의 크기는 사용된 BEV의 농도와 직접적으로 상관관계가 있었으며, 이때 중앙 크기는 0.157 내지 2.166 μm 범위였다 (도 2a). I상 임상 시험인 이들 연구의 목표에서, 가장 작은 ABX:BEV 입자 (AB160)가 130 nm ABX와 가장 유사하기 때문에 초점이 맞추어졌다. AB160 입자의 크기는 ABX + 이를 둘러싸는 BEV의 단층과 일치하고, 입자의 EM 영상과도 일치하였다 (도 1b 참조).
정맥내 투여 조건이 나노입자 크기 분포에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 실온에서 최대 24시간 동안 염수 중에서 인큐베이션된 AB160 (또는 ABX)의 입자 크기 분포를 평가하였다. AB160 크기 분포는 최대 24시간 동안 유의하게 변화하지 않는다 (도 9a 및 9b). 그러나, 실온에서 4시간까지, ELISA에 의해 AB160 파괴의 일부 증거가 존재한다 (도 9c).
혈장에서 AB160의 안정성을 결정하기 위해, ABX 또는 AB160을 염수 또는 헤파린화된 인간 혈장에서 9:1 또는 1:1의 상대 부피 비로 인큐베이션하였다. 주목할 만하게, ABX (도 10, 상단 패널) 또는 AB160 (도 10, 하단 패널)이 혈장에서 동등 부피 (1:1)로 인큐베이션될 때 어떤 입자 (0.01 내지 1 μm)도 검출되지 않았다.
웨스턴 블롯 (데이터는 제시되지 않음)은, 염수 또는 헤파린화된 인간 혈장에서, AB160이 종양-표적화 항체, 알부민 및 세포독성제인 파클리탁셀을 여전히 함유하는 보다 작은 단백질 접합체로 해리되었다는 것을 나타냈다. 이들 단백질 접합체는 종양을 표적화하는 그의 능력을 유지하고, 종양 부위에 있을 때, 종양 세포에 의한 전체 나노입자의 내재화 없이 종양 퇴행을 효과적으로 개시하도록 세포독성 페이로드를 신속히 용해 및 방출시킬 수 있다.
다음에, ABX를 BEV 중에 현탁시키고, 혼합물을 입자가 형성되도록 다양한 온도 (RT, 37℃ 및 58℃)에서의 인큐베이션 전에 pH 3, 5, 7 또는 9에서 염수로 희석하여, 결합 친화도가 pH- 및/또는 온도-의존성이었는지 여부를 시험하였다. ABX 및 BEV의 결합 친화도는 pH- 및 온도-의존성 둘 다이며, 이때 입자가 pH 5 및 58℃에서 형성될 때 가장 높은 결합 친화도가 관찰된다 (도 2b).
58℃ 및 pH 5에서의 BEV 및 ABX의 보다 높은 친화도 결합이 복합체의 안정성으로 해석되는지 여부를 결정하기 위해, 다양한 제제를 나노입자 트래킹 분석 (나노사이트)에 의해 비교하였다. 58℃ 및 pH 5에서 제조된 AB160 (AB1600558), 실온 및 pH 7에서 제조된 AB160 (AB16007), 또는 58℃ 및 pH 7에서 제조된 AB160 (AB1600758)의 안정성을 0, 15, 30 또는 60분 동안 인간 AB 혈청에서의 인큐베이션 후에 동일한 조건에 노출된 ABX (각각 ABX0558, ABX07 및 ABX0758)와 비교하였다.
인간 AB 혈청에의 노출 후에 ABX mg당 존재하는 입자의 수에 의해 나타난 바와 같이, 보다 높은 친화도 조건 (pH 7 및 58℃) 하에서 제조된 입자가 또한 보다 안정하였다. AB160 입자는 그의 결합 친화도와 상관관계가 있는 인간 혈청에서의 증가된 안정성을 나타냈다. 특히, ABX mg당 측정된 입자의 크기 및 수에 의해 결정된 바와 같이, AB16007 및 AB1600558은 ABX 단독보다 염수 및 인간 혈청 둘 다에서 보다 안정하였다 (도 2c 및 표 3). 이는 AB160 입자의 안정성이 AB160 입자가 형성되는 조건을 변화시킴으로써 조작될 수 있다는 것을 제시한다.
<표 3> 인간 AB 혈청에서의 AB160 및 ABX의 안정성
Figure pct00013
ABX mg당 입자 x 108개
이들 데이터는 BEV가 피코몰 범위의 친화도로 ABX에 결합한다는 것 (강한 비-공유 결합을 나타냄)을 입증하였고, 항체 분자의 단층에 의해 둘러싸여 있는 ABX와 일치하는 입자 크기 분포를 입증하였으며; 생성된 입자의 크기는 항체 농도에 좌우된다.
실시예 5: 마우스에서의 AB160의 효능
무흉선 누드 마우스에 이식된 A375 인간 흑색종 세포의 이종이식편 모델을 사용하여 생체내 AB160 효능을 시험하였다.
방법
생체내 실험을 적어도 2회 수행하였다. 그러한 실험에 필요한 마우스의 수는 검정력 분석에 의해 결정하였다. 마우스 종양을 2-3회/주 측정하고, 종양이 10 중량%일때 마우스를 희생시켰다. 완전 종양 반응을 갖는 마우스를 치료후 60-80일 동안 모니터링하였다. 마우스 연구의 종점은 중앙 생존이었다. 카플란-마이어 곡선을 생성하고, 맨틀-콕스 검정을 수행하여 치료군 사이의 중앙 생존의 유의성을 결정하였다. 제시된 시험관내 결과는 적어도 5회의 반복된 실험을 대표한다. 기준선 실험으로부터 시험관내 및 생체내 변화 퍼센트의 통계적 분석을 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행하였다.
마우스 모델: 종양 효능을 시험하기 위해, 1 x 106개의 A375 인간 흑색종 세포를 무흉선 누드 마우스 (하를란 스프라그 돌리(Harlan Sprague Dawley), 인디애나주 인디애나폴리스)의 우측 측복부에 이식하였다. 종양이 약 700 mm3의 크기에 도달했을 때, 마우스를 무작위화하여 PBS, ABX (30 mg/kg), BEV (12 mg/kg), BEV에 이어서 ABX, 또는 AB160으로 상기 농도로 치료하였다. 보다 큰 AB 입자를 시험하는 마우스 실험의 경우에, 보다 큰 입자를 생성하기 위해 필요한 최고 용량의 BEV (45 mg/kg)를 BEV-단독 치료군에서 사용하였다. 종양 크기를 3회/주 모니터링하고, 하기 방정식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다: (길이*폭2)/2. 종양 크기가 마우스 체중의 10% 또는 약 2500 mm3와 동등할 때 마우스를 희생시켰다. 기준선으로부터 제7일 변화 퍼센트를 하기와 같이 계산하였다: [(치료 당일의 종양 크기-제7일의 종양 크기)/치료 당일의 종양 크기]*100. AR160의 생체내 시험은 5x106개의 Daudi 세포를 무흉선 누드 마우스의 우측 측복부에 주사한 경우를 제외하고 유사하였다.
결과
AB160을 PBS, 단일 약물 단독, 및 순차적으로 투여된 약물에 비하여 시험하였다. AB160으로 치료받은 마우스는 기준선에 비하여 치료후 제7일에 모든 다른 치료군 (p=0.0001 내지 0.0089)과 비교하여 유의하게 감소된 종양 크기를 가졌다 (도 3a). AB160으로 치료받은 모든 마우스에서 종양은 제7일에 퇴행하였고, 이러한 종양 반응은 모든 다른 군에 비하여 AB160 군의 유의하게 증가된 중앙 생존으로 해석되며 (도 3b), PBS (p<0.0001), BEV (p=0.003), ABX (p=0.0003), BEV + ABX (p=0.0006) 및 AB160 군의 경우에 각각 생존은 7, 14, 14, 18 및 33일이었다.
보다 큰 종양은 보다 높은 국부 VEGF 농도를 가질 가능성이 있다. 치료 당일의 종양 크기 (<700mm3 및 >700mm3)에 기초하여 데이터를 분석한 경우에, 보다 큰 종양은 AB160에 대해 보다 큰 반응을 갖는 것으로 나타났고, 이는 보다 높은 종양 VEGF 농도가 보다 많은 BEV-표적화 ABX를 종양으로 유인한다는 것을 시사한다. 기준선으로부터 변화 퍼센트에서의 차이는 AB160 군 (p=0.0057)의 경우에 유의하였다. 이러한 관찰은 ABX가 표적화 능력을 갖지 않는 ABX 단독 (p=0.752) 군에서는 보이지 않았다 (도 3c).
증가하는 크기의 입자를 도 2a에 제시된 바와 같이 증가하는 BEV:ABX 비를 사용하여 제조하였다. 종양 퇴행 및 중앙 생존은 증가하는 입자 크기와 양의 상관관계가 있었고, 이는 보다 큰 입자의 생체분포가 보다 작은 것에 비해 변경될 수 있다는 것을 나타낸다 (도 3d 및 3e). 완전 독성 연구를 마우스에 대해 수행하였고, 어떠한 독성도 인지되지 않았다.
실시예 6: 마우스에서의 파클리탁셀 약동학
AB160 및 ABX의 약동학 (pk)을 비교하기 위해, 혈장 파클리탁셀 농도를 AB160 또는 ABX가 투여된 마우스에서 0, 4, 8, 12 및 24시간에 측정하였다.
방법
파클리탁셀 약동학: 파클리탁셀 및 d5 파클리탁셀의 액체 크로마토그래피 분리를 40℃에서 애질런트 포로쉘(Agilent Poroshell) 120 EC-C18 분석 칼럼 (2.1 x 100 mm, 2.7 μm 크롬 테크(Chrom Tech), 미네소타주 애플 밸리)에 부착된 애질런트 포로쉘 120 EC-C18 전치칼럼 (2.1 x 5 mm, 2.7 μm, 크롬 테크, 미네소타주 애플 밸리)을 사용하여, 0.1% 포름산을 함유하는 물 (A) 및 0.1% 포름산을 함유하는 ACN (B)으로 구성된 구배 이동상을 사용하여 0.5 ml/분의 일정한 유량으로 용리시키면서 달성하였다. 용리는 0.5분 동안 60% A 및 40% B에서 개시하였고, 이어서 B를 4.5분 동안 40-85%로 선형으로 증가시키고, 0.2분 동안 85% B에서 유지시키고, 1.3분 동안 개시 조건으로 되돌렸다. 오토샘플러 온도는 10℃였고, 샘플 주입 부피는 2 μl였다. 파클리탁셀 및 내부 표준 d5-파클리탁셀의 검출은 0.075초의 체류 시간에서의 다중 반응 모니터링 (MRM) 스캔 모드를 사용한, 모세관 전압 1.75 kV, 공급원 온도 150℃, 탈용매화 온도 500℃, 콘 기체 유동 150 L/hr, 탈용매화 기체 유동 1000 L/hr에서의 양성 ESI 모드의 질량 분광계를 사용하여 달성하였다. 콘 전압 및 충돌 에너지는 매스링스-인텔리스타트(MassLynx-Intellistart), v4.1, 소프트웨어에 의해 결정하였고, 각각 6-16 V 및 12-60 eV로 다양하였다. MRM 전구체 및 생성물 이온을 파클리탁셀의 경우에 m/z 854.3>105.2에서 및 d5 파클리탁셀의 경우에 859.3>291.2에서 모니터링하였다. 파클리탁셀 (EtOH 중 1 mg/ml) 및 d5 파클리탁셀 (EtOH 중 1 mg/ml)의 1차 원액을 4 ml 호박색 실란화 유리 바이알 내에서 제조하고, -20℃에서 저장하였다. 작업 표준물은 2 ml 호박색 실란화 유리 바이알 내에서 원액을 ACN으로 희석하여 제조하였고, -20℃에서 저장하였다. 혈장 샘플을 하기와 같이 추출하고, 100 μl 혈장 샘플을 d5 파클리탁셀 (116.4 nM 또는 100 ng/ml) 및 300 μl ACN을 함유하는 1.7 ml 마이크로원심분리 튜브에 첨가하고, 볼텍싱하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 단백질을 침전시키고, 3분 동안 원심분리하였다 (14,000 rpm). 상청액을 애질런트 캡티바(Captiva) ND지질 플레이트 (크롬 테크, 미네소타주 애플 밸리) 상에서 여과하고, 딥 96-웰 플레이트 내에 수집하고, 질소 기체를 사용하여 건조시켰다. 100 μl ACN을 사용하여 샘플을 재구성하고, 플레이트 진탕기 (고속) 상에서 5분 동안 진탕시켰다. 파클리탁셀 정량화를 위해 파클리탁셀 (0.59-5855 nM 또는 0.5-5000 ng/ml) 및 d5 파클리탁셀 (116.4 nM)을 함유하는 혈장 표준 곡선을 매일 작성하였다. 마우스 종양을 얼음 상에서 해동시키고, 칭량하고, 1x PBS 중 2부 (중량 대 부피)로 희석하였다. 이어서 종양을 톱니 프로브 (5 mm x 75 mm)를 사용하는 PRO200 조직 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 이어서 종양 균질물을 인간 혈장 샘플과 동일하게 처리하였다.
마우스 영상화: 아바스틴 및 IgG 대조군 용액을 제조하고, 프로토콜에 따라 I-125 표지하였다 (이마니스 라이프 사이언시스(Imanis Life Sciences)). 간략하게, 트리스 완충제 (0.125 M 트리스-HCl, pH 6.8, 0.15 M NaCl) 및 5 mCi Na125I를 아이오딘화 튜브 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFischer Scientific), 매사추세츠주 월섬)에 직접 첨가하였다. 아이오다이드가 활성화되도록 하고, 실온에서 와류시켰다. 활성화된 아이오다이드를 단백질 용액과 혼합하였다. 50 μl의 스캐빈징 완충제 (PBS 중 10 mg 티로신/mL, pH 7.4)를 첨가하고, 5분 동안 인큐베이션하였다. 트리스/BSA 완충제를 첨가하고 혼합한 후, 샘플을 사전-냉각시킨 PBS에 대한 10K MWCO 투석 카세트에서 4℃에서 30분, 1시간, 2시간, 및 밤새 적용하였다. 방사능을 감마 계수기에 의해 결정한 다음, 분당 붕괴수 (DPM) 및 비활성을 계산하였다. 마우스에게 아바스틴 I-125, 아브락산-아바스틴 I-125, 아브락산-인간 IgG I-125, 또는 아브락산 단독을 그의 꼬리로 주사하였다. 투여후 3, 10, 24 및 72시간에 SPECT-CT 영상화를 통해 U-SPECT-II/CT 스캐너 (엠아이랩스(MILabs), 네덜란드 위트레흐트)를 사용하여 동물을 영상화하였다. POSEM (기대값 최대화에 의한 픽셀화된 규칙적 하위세트) 알고리즘을 사용하여 SPECT 재구성을 수행하였다. 펠드캠프(Feldkamp) 알고리즘 동안 CT 데이터를 재구성하였다. 공동-등록된 영상을 추가로 렌더링하고, PMOD 소프트웨어 (PMOD 테크놀로지스(PMOD Technologies), 스위스 취리히)를 사용하여 가시화하였다. 주사후 72시간에 동물을 희생시켜 해부하였다. 선택된 관심 조직 및 기관을 방사성동위원소 용량 보정기 (카핀텍(Capintec) CRC-127R, 카핀텍 인크.(Capintec Inc.))를 사용하여 측정하였다.
결과
제1 pk 실험의 결과를 도 4a 및 4b에 제공한다. 곡선하 면적 (AUC) 및 최대 혈청 농도 (Cmax)를 A375 종양 보유 및 비-종양 보유 마우스에서 계산하였다. 제1 pk 실험에서 Cmax 및 AUC는 비-종양 보유 마우스에서 AB160 및 ABX의 경우에 매우 유사하였다 (각각 63.3+/-39.4 vs. 65.5+/-14.4 및 129 vs. 133 μg/ml). 그러나, 종양 보유 마우스에서, 치료군의 경우에 Cmax 및 AUC는 상이하였다 (각각 55.7+/-21.2 vs 63.3+/-17.3 및 112 vs 128 μg/ml) (도 4c). 이러한 차이는 통계적으로 유의하지는 않지만, ABX에 비해 AB160에 의한 우월한 표적화와 일치한다.
추가의 초기 시점 및 대형 대 소형 종양 크기를 사용하여 제2 pk 실험을 수행하였다 (도 4d-4f). 이러한 실험의 결과는 비-종양 보유 마우스에 비해 종양 보유 마우스에서의 보다 작은 AUC, 및 소형 종양 마우스에 비해 대형 종양 마우스에서의 파클리탁셀의 최저 혈액 값을 입증하였다 (각각 ABX-치료 비-종양, 소형 종양 및 대형 종양 보유 마우스의 경우에 80.4+/- 2.7, 48.4+/-12.3, 및 30.7+/-5.2; AB160-치료의 경우에 66.1+/-19.8, 44.4+/-12.1 및 22.8+/-6.9). 유사하게, Cmax는 보다 큰 종양을 갖는 마우스에서 둘 다의 치료군에서 떨어졌다 (ABX의 경우에 47.2, 28.9 및 19.7 μg/ml 및 AB160의 경우에 40.1, 26.9 및 15.3 μg/ml) (도 4g). 혈액 중 파클리탁셀의 AUC 및 Cmax는 ABX-치료 마우스에 비해 AB160-치료 마우스에서 더 낮았다. 통계적으로 유의하지는 않지만, 이러한 데이터는 추가로, AB160으로 치료받은 종양에서의 파클리탁셀의 보다 높은 침착과 일치한다.
이러한 가설을 직접 시험하기 위해, LC-MS에 의해 종양 파클리탁셀 농도를 측정하였다. 종양 파클리탁셀 농도는 4시간 (3473 μg/mg 조직 +/-340 vs 2127 μg/mg 조직 +/- 3.5; p=0.02) 및 8시간 (3005 μg/mg 조직 +/- 146 vs 1688 μg/mg 조직 +/- 146; p=0.01) 시점에서, ABX에 비해 AB160으로 치료받은 종양에서 유의하게 더 높았고, 이는 항체로 표적화한 경우에 파클리탁셀이 종양에서 더 오래 체류한다는 것을 시사한다 (도 4h). 이는 혈액 pk를 설명하고, 종양을 비롯한 조직에의 약물의 재분포와 일치한다.
I-125 표지된 AB160 (Abx-AvtI125) 및 IgG 이소형 결합된 ABX (Abx-IgGI125)의 살아있는 생체내 영상화는 LC-MS의 결과를 확인시켜주었고, 주사후 3시간 (32.2 uCi/g +/- 9.1 vs 18.5 uCi/g +/- 1.65; p=0.06) 및 10시간 (41.5 uCi/g +/- 6.4 vs 28.7 uCi/g +/- 2.66; p=0.03)에, IgG-ABX에 비해 AB160으로 치료받은 마우스의 종양에서 I-125의 수준이 더 높았다 (도 4i 및 4j). 종합하면, 이들 데이터는 BEV를 ABX에 결합시키는 것이 혈액 pk를 변경시키고, 이러한 변경은 이소형 매칭된 IgG1에 비한 파클리탁셀의 LC-MS 및 BEV의 I-125 표지화 둘 다에 의해 제시되는 바와 같이 약물의 종양 조직에의 재분포로 인한 것이라는 것을 입증한다.
이론에 얽매이지 않으면서, 종양-표적화 항체를 ABX에 결합시킴으로써 pk는 ABX 단독보다 더 극적으로 변경되고, AB160의 종양 조직으로의 재분포로 인해 혈액 중 Cmax 및 AUC가 낮아지는 것으로 여겨진다. ABX 단독에 비해 AB160으로 치료받은 마우스에서의 마우스 혈액 파클리탁셀 pk, 파클리탁셀의 종양 조직 수준, 및 I-125 방사능 수준으로부터의 이들 결과는 ABX의 항체 표적화가 증가된 수준이 종양에 도달하고 그곳에 보다 긴 시간 동안 잔류하여 증진된 종양 퇴행을 발생시키도록 파클리탁셀의 생체분포를 변경시킨다는 것을 시사한다.
실시예 7: 다른 치료 항체의 결합
다른 IgG 치료 항체가 생체외에서 조합된 경우에 또한 ABX에의 결합을 나타내는지 여부를 결정하기 위해 ABX에의 항-인간 CD20 항체 (리툭시맙) 및 항-HER2/neu 수용체 항체 (트라스투주맙)의 결합을 시험하였다.
방법
리툭시맙 또는 트라스투주맙을 함유하는 나노입자를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 제조하고 시험하였다.
결과
BEV 및 트라스투주맙 (HER) 둘 다와의 복합체의 입자 크기는 매우 유사하였고, 평균 크기는 각각 0.157 내지 2.166 μm (도 2a) 및 0.148 내지 2.868 μm (도 5b) 범위였다. 대조적으로, 리툭시맙과 함께 형성된 입자는 더 낮은 항체:ABX 비에서 훨씬 더 커졌고, 입자 크기는 0.159 내지 8.286 μm 범위였다 (도 5a).
ABX와 리툭시맙 및 트라스투주맙의 결합 친화도를 BLItz에 의해 가변 pH 하에 결정하였다. 둘 다의 항체는 상대적으로 높은 친화도로 피코몰 범위에서 결합하였다 (도 5c). ABX에 대한 리툭시맙 친화도는 더 높은 pH에 의해 감소되었지만, ABX에 대한 트라스투주맙 친화도는 pH에 의해 영향받지 않았다 (도 5c).
리툭시맙과 함께 제조된 160 nm 입자 (AR160)의 효능을 시험관내 및 생체내에서 시험하였다. 시험관내에서, B-세포 림프종 세포주 Daudi를 AR160, ABX, 또는 리툭시맙 단독으로 파클리탁셀의 증가하는 농도 (0에서 200 μg/ml)에서 치료하였다. AR160 (IC50=10μg/ml)은 ABX (IC50>200μg/ml) 또는 리툭시맙 (IC50>200μg/ml) 단독과 비교하여 24시간 동안 치료받은 Daudi 세포의 증식을 유의하게 억제하였다 (p=0.024) (도 6a).
Daudi 세포의 생체내 이종이식 모델을 무흉선 누드 마우스에서 확립하였다. 종양이 확립되면, 마우스를 PBS, ABX, 리툭시맙, ABX 및 리툭시맙 (순차적으로 주어짐), 또는 AR160으로 치료하였다. 치료후 제7일에, 종양을 측정하고, 종양 크기에서의 기준선으로부터의 변화 퍼센트를 계산하였다. AR160-치료 종양은 퇴행하거나 안정하게 유지되었고, 모든 다른 치료군에서의 종양은 진행되었다 (도 6b). 모든 다른 군과 비교하여 AR160 군에서 기준선 종양 크기로부터의 변화 퍼센트가 유의하였다 (p<0.0001). AR160으로 치료받은 마우스는 각각 PBS (p<0.0001), ABX (p<0.0001), 또는 리툭시맙 (p=0.0002)으로 치료받은 마우스의 경우의 12, 16, 및 12일과 비교하여 60일을 초과하는 유의하게 더 긴 중앙 생존을 가졌다 (도 6c). 그러나, 중앙 생존에서의 차이는 AR160 및 순차적으로 치료받은 군 사이에 유의하지 않았다 (p=0.36). 이는, 가용성 표적에 결합하고 세포 표면 마커가 아닌 BEV와 달리, 리툭시맙은 종양 세포에 결합하고 세포 표면 상에서 유지되어 후속-투여된 ABX가 종양 부위에 진입한 경우에 항체에 결합하게 하기 때문일 수 있다.
실시예 8: AB160에의 다른 화학요법 약물의 결합
기능적 나노입자를 형성하기 위해 다른 화학요법 약물의 효능을 평가하였다.
방법
시스플라틴을 함유하는 나노입자를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 제조하고 시험하였다.
결과
또 다른 화학요법 약물이 AB160 입자에 결합할 수 있는지 시험하기 위해, 시스플라틴 및 ABX를 공동-인큐베이션하고, 상청액 중에 남아있는 유리 시스플라틴의 양을 HPLC에 의해 측정하였다. 대략 60% (즉, 단지 40%가 상청액 중에 남아있음)의 시스플라틴이 ABX에 결합하였다 (도 7a).
다음으로, ABX 및 시스플라틴 단독에 비해 AC의 종양 독성을 A375 세포를 사용하여 시험하였다. 복합체를 원심분리하여 고도로 독성인 미결합된 시스플라틴을 제거하고, ABX에 비해 AC의 임의의 추가의 독성이 단지 ABX-결합된 시스플라틴으로 인한 것임을 확실하게 하기 위해 배지 중에 재구성하였다. 동등성을 위해, ABX 만을 유사한 방식으로 원심분리하였다. AC (IC50=90μg/ml)는 ABX 단독 (IC50>1000μg/ml)보다 더 큰 정도로 A375 세포의 증식을 억제하였다 (도 7b). 다른 독성 실험에 비하여 이 실험에서의 감소된 독성은 원심분리 단계에서의 약물의 일부 손실로 인한 것이지만, ABX 대 AC의 비교는 관련성이 유지된다.
시스플라틴-함유 AB160 복합체의 종양 독성을 결정하기 위해, AB160을 시스플라틴과 공동-인큐베이션하여 시스플라틴 함유 입자 (ABC 복합체)를 형성하였다. ABC 복합체를 A375 흑색종 이종이식 모델에서 각각의 약물 단독 및 AB160에 비하여 시험하였다. AB160, AB160 + 시스플라틴 (순차적으로 주어짐), 및 ABC 복합체로 치료받은 종양은 모두 치료후 7일에 종양 크기에서 퇴행을 나타내었지만 (도 7c), ABC 복합체는 최장 중앙 생존을 부여하였다 (35일, 각각 24 및 26일의 AB160 및 AB160 + 시스플라틴 대비). 차이는 통계적으로 유의하지는 않지만 (p= 0.82 및 0.79) (도 7d), 데이터는 장기 생존율에 대한 ABC 복합체의 이익과 일치한다.
이들 데이터는 ABX의 알부민 부분이 다른 치료 항체, 예컨대 리툭시맙 및 트라스투주맙, 뿐만 아니라 다른 화학요법제 (예를 들어, 시스플라틴)가 결합하도록 하는 플랫폼을 제공한다는 것을 입증하였고, 이는 모두 시험관내 및 생체내에서 AB160과 유사한 효능을 가졌다.
이들 데이터는 함께, 다중 단백질 또는 세포독성제가 단일 알부민 스캐폴드에 결합되게 하는, 다기능 나노-면역 접합체를 구축하는 간단한 방법을 입증한다. 단일 작용제 단독에 비해 표적화된 약물의 개선된 효능이 마우스 모델에서 입증되었고, 이는 적어도 부분적으로 항체-표적화된 약물의 변경된 pk로 인한 것이다. 게다가, 이론에 얽매이지 않으면서, 링커 또는 표적 세포 내재화를 필요로 하지 않는 본 발명에 개시된 나노-면역 접합체의 다기능은 결과를 마우스에서 인간으로 해석하는데 있어서 다른 나노의약이 직면한 장애를 극복할 것으로 여겨진다.
실시예 9: AB160의 동결건조
베바시주맙 8mg (320μl)을 아브락산 20mg에 첨가하여 AB160을 합성하였다. 이어서 0.9% 염수 1.66ml를 4mg/ml 베바시주맙 및 10mg/ml 아브락산의 최종 농도를 위해 2ml의 최종 부피로 첨가하고, 15ml 폴리프로필렌 원추형 튜브 내에서 혼합물이 실온에서 30분 동안 인큐베이션되게 하였다.
30분 실온 인큐베이션 후에, 혼합물을 0.9% 염수 중에서 각각 2mg/ml 및 5mg/ml 베바시주맙 및 아브락산으로 1:2로 희석하였다. 이들은 환자에의 투여를 위해 제약에 의해 제조되는 경우의 2가지 약물의 농도이다.
AB160을 1.5 ml 폴리프로필렌 에펜도르프 내에 20개의 200μl 분취물로 나누고, -80℃에서 동결시켰다.
동결되면, 분취물을 비르티스(Virtis) 3L 벤치탑 동결건조기 (에스피 사이언티픽(SP Scientific), 펜실베니아주 워민스터)를 냉각 작동 상태로 사용하여 밤새 동결건조시켰다. 동결건조된 제제가 생성되었다.
건조된 분취물을 동일한 1.5ml 폴리프로필렌 에펜도르프 내에서 실온에서 저장하였다. 이들 샘플을 염수 중 실온에서 30분 동안 용이하게 재구성하고, 이어서 2000x g에서 7분 동안 원심분리하였다. 이어서 생성된 샘플을 필요에 따라 적절한 완충제 중에 재현탁시켰다.
비교에 의하면, 열 및 신속한 진공에 의해 건조시킨 샘플은 재구성이 불가능하였다.
실시예 10: 동결건조된 제제의 시험
샘플을 동결건조 후 상이한 시점에 재구성하고, ABX 및 신선하게 제조된 AB160에 대한 그의 물리적 특성을 시험하였다.
입자 크기 분포를 상기 기재된 바와 같이 평가하였다.
VEGF 결합은 샘플을 VEGF와 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 2000 x g에서 7분 동안 원심분리하는 것에 의해 평가하였다. 펠릿 (나노입자에 상응함)에 결합되었거나 또는 상청액 중에 남아있는 VEGF의 양을 ELISA에 의해 측정하였다.
파클리탁셀 활성을 시험관내에서 A375 세포에 대한 세포독성에 의해 평가하였다.
놀랍게도, 동결건조는 입자 크기, VEGF 결합, 또는 암 세포 증식을 억제하는 능력에 의해 제시되는 바와 같은 파클리탁셀의 활성에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 1개월 (도 8a-8c) 또는 10개월 (도 8d-8f) 동안 저장된 동결건조된 샘플에 대해 유지되었다.
추가로 놀라운 것은 이들 결과가 인간 치료 용도에 유해한 영향을 미칠 수 있는 동결보호제 또는 다른 작용제를 사용하지 않고 동결건조된 나노입자에 의해 관찰되었다는 것이다.
실시예 11: 인간에서의 AB160의 효능
AB160을, 선행 요법에 실패한 전이성 악성 흑색종을 갖는 환자에게 투여된 AB160의 안전성을 시험하는 1상, 최초-인간, 임상 시험에서 시험하였다. 연구는 3가지 상이한 용량의 AB160을 하기 개요로 시험하는 전형적인 3+3, 1상 임상 시험 설계를 이용하였다:
<표 4>
Figure pct00014
*용량 수준 1은 출발 용량을 지칭함.
용량은 임상 실시에서 현재 사용되는 아브락산의 용량과 관련하여 선택하였다. AB160을 각각의 치료 투여 전에 제조하였다. 치료를 28-일 치료 사이클의 제1일, 제8일 및 제15일에 30분 정맥내 주입으로서 투여하였다. 치료는 불내성 독성, 종양 진행 또는 환자 거절 시까지 계속하였다. 매 치료 사이클 전에, 환자를 독성에 대해 평가하였고; 종양 평가는 2 사이클마다 수행하였다 (RECIST).
연구는 요법의 사이클 1 및 2의 용량 1과 연관된 형식적 (입원 환자) 약동학적 연구를 동반하였다.
5명의 환자에게 AB160을 ABX 100 mg/m2 및 BEV 40 mg/m2으로 투여하였고, 이 중 4명을 분석하였다.
<표 5> I상 연구에서의 질환 과정
Figure pct00015
PFS는 중앙 무진행 생존, 즉 암 재발 전 치료 일수를 지칭한다. 유해 사건을 하기 열거한다. 어떠한 용량 제한 독성 (DLT)도 존재하지 않았고, 즉 유해 사건은 AB160의 용량과 연관되지 않았다. 보다 상세한 사항을 표 6에 제공한다.
<표 6> I상 연구에서의 유해 사건
Figure pct00016
<표 7>
Figure pct00017
평균 PFS는 7.6개월이었고, 중앙값은 7.0개월이었다.
다른 임상 시험과의 비교
하기 표는 전이성 흑색종에 대한 탁산 요법에 대한 다른 공개된 임상 연구를 보여준다.
<표 8>
Figure pct00018
현행 시험에서, AB160 입자의 투여는 아브락산 100 mg/m2 및 베바시주맙 40 mg/m2의 용량과 동등하였다. BEV 및 ABX 단독을 사용한 유일한 연구는 스피틀러(Spitler)였다. 그러나, 스피틀러는 더 높은 용량의 ABX를 사용하였다. 본 연구는 또한 용량을 평균 환자에 대해 조정한 경우에 (1.9 m2의 표면적 및 90 kg의 체중을 갖는 것으로 가정함) 이전 연구에서 보고된 BEV의 용량의 10% 미만을 사용하였다.
스피틀러는 또한 이전에 치료되지 않은 환자를 검사하였고, 현행 연구는 이전 치료에 실패한 환자를 검사하였다. 비유효 선행 치료는 예상되는 PFS에서 시간이 걸리게 할 뿐만 아니라, 치료에 대해 보다 저항성인 암 세포를 선택하게 하였고, 전형적으로 환자를 더 불량한 신체 상태로 남겼다. 따라서, "구출" 요법 (본원에서, AB160에 의함) 중인 환자의 집단에 대한 PFS는 나이브 집단보다 더 낮은 PFS를 가질 것으로 예상된다. 이는 아브락산 단독에 의한 구출 및 나이브 환자 둘 다를 검사한 2상 임상 시험 (Hersh et al., Cancer, January 2010, 116:155)에서 관찰할 수 있다. 이전에 치료받은 환자의 경우에, 아브락산 단독에 의하면 PFS는 3.5개월이었다. 문헌 [Hersh et al. Ann. Oncol 2015, (epub September 26, 2015)]은 ABX 단독에 의해 치료받은 나이브 환자의 경우에 4.8개월 PFS를 보고하였다.
<표 9> 공개된 데이터에 대한 제한된 연구에서의 AB160의 성능
Figure pct00019
따라서, AB160에 의한 I상 임상 시험의 초기 결과는 이전에 치료받은 환자에서 말기 전이성 악성 흑색종에서의 PFS의 증가를 나타내었다. 이러한 증가는, 화학요법 나이브이고 더 높은 용량의 아브락산 및 거의 12배 더 높은 용량의 베바시주맙이 주어진 스피틀러에서의 PFS보다 PFS가 더 크다는 점에서 특히 놀라운 것이다. AB160에 사용된 BEV의 용량은 임의의 다른 연구보다 훨씬 더 낮고, 따라서 최고의 비교는 스피틀러가 아니라 허쉬(Hersh)이다.
따라서, ABX/BEV 복합체 (AB160)는 ABX 및 BEV의 순차적 투여 또는 ABX 단독보다 우월하고, 매우 낮은 유효 용량의 BEV에 의해 이러한 우월한 결과가 달성된다. 따라서, 데이터는 AB160이 종양에 대한 화학요법제의 개선된 표적화를 갖는다는 것과 일치하고, 이러한 표적화는 BEV에 의해 매개된다. 알부민이 종양에 의해 선택적으로 받아들여지기 때문에 ABX 나노입자는 BEV를 종양으로 표적화하는 것을 보조하는 것이 가능하다. 또한, BEV/ABX 복합체의 존재는 생체내에서 아브락산보다 더 큰 안정성을 나타내는 것이 가능하다.
실시예 12: BEV에 의한 사전치료가 표적화를 개선시키는지 여부를 조사하기 위한 추적 연구
상기 일반적 프로토콜에 따라, 무흉선 누드 마우스에게 1 x 106개의 A375 인간 흑색종 세포를 우측 측복부로 주사한 다음, PBS, 12 mg/kg BEV, 30 mg/kg ABX, AB160으로 치료하거나, 또는 1.2 mg/kg BEV로 사전치료하고, 24시간 후에 AB160으로 치료하였다. 데이터를 치료후 제7일 및 치료후 제10일에 mm3 단위의 종양 부피로서 나타낸다. 도 11a-e는 10일에 걸쳐 종양 크기를 추적하였다. AB160에 의해 치료받은 마우스 만이 (BEV에 의한 사전치료의 존재 또는 부재 하) 평균 종양 부피에서 감소를 나타내었다. 또한 도 11f 및 도 11g를 참조한다.
치료후 제7일 데이터는, 도 11f에 요약된 바와 같이, BEV에 의한 사전치료가 대조군 또는 BEV 단독 (p≤0.0001), 또는 ABX 단독 (p≤0.0001)보다 종양 부피에서의 통계적으로 유의한 감소와 연관된다는 것을 보여준다.
치료후 제10일 데이터는, 도 11g에 요약된 바와 같이, 다시 BEV에 의한 사전치료가 대조군 또는 BEV 단독 (p≤0.0001), 또는 ABX 단독 (p≤0.0001)보다 종양 부피에서의 통계적으로 유의한 감소와 연관된다는 것을 보여준다. AB160 전 BEV에 의한 사전치료는 또한 AB160 단독 (p=0.02)보다 종양 부피에서의 감소와 연관되었고, 2마리의 마우스에서 완전 반응이 존재하였다.
이러한 실험에서, 12 mg/kg 용량의 BEV는 치료적이지 않았다. 사전치료 군에 첨가된 BEV의 양은 단지 1.2 mg/kg이었고, 이는 마우스에서의 통상의 용량의 1/10이다. 아직 치료용량 미만에 의한 사전치료는 AB160 나노입자의 개선된 효능을 나타내는 것으로 보이지 않았다. 이러한 데이터는 치료량 미만의 BEV에 의한 사전치료가, AB160 나노입자에 의한 종양-연관 VEGF 표적화가 보다 유효하도록 VEGF의 전신 수준을 소거하여 종양에서 보다 높은 상대 농도를 남길 수 있다는 아이디어를 지지한다.
실시예 13: 나노입자를 전달하는 대안적 방법
본 발명의 나노입자는 종양에 직접 전달될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 나노입자는 동맥내 캐뉼라를 통해 또는 종양으로의 직접 주사에 의해 전달될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 큰 나노입자 (예를 들어, 580 nm 또는 1130 nm)는 직접 주사에 의해 종양으로 또는 그에 근접하여 전달될 수 있는 것으로 고려된다.

Claims (81)

  1. 나노입자를 포함하는 동결건조된 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각
    a. 담체 단백질,
    b. 약 100 내지 약 1000개의 항체, 및
    c. 임의적으로 적어도 하나의 치료제
    를 포함하고,
    여기서 항체는 나노입자의 외부 표면 상에 배열되고, 추가로 여기서 수용액으로의 재구성 시에, 항체는 나노입자의 외부 표면과의 그의 회합을 유지하며, 단 상기 동결건조된 조성물은 적어도 3개월 동안 약 20℃ 내지 약 25℃에서 안정하고, 추가로 여기서 나노입자는 생체내에서 미리결정된 에피토프에 결합할 수 있는 것인
    동결건조된 나노입자 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 나노입자가 각각 약 400 및 약 800개의 항체를 포함하는 것인 나노입자 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 나노입자의 평균 크기가 130 nm 내지 14,000 nm인 동결건조된 나노입자 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 나노입자의 평균 크기가 130 nm 내지 1000 nm인 동결건조된 나노입자 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 나노입자의 평균 크기가 130 nm 내지 800 nm인 동결건조된 나노입자 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 나노입자의 0.01% 미만이 800 nm 초과의 크기를 갖는 것인 동결건조된 나노입자 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 나노입자의 0.01% 미만이 200 nm 초과, 300 nm 초과, 400 nm 초과, 500 nm 초과, 600 nm 초과, 및 700 nm 초과로 이루어진 군으로부터 선택된 크기를 갖는 것인 동결건조된 나노입자 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 나노입자 내부에 위치하거나, 나노입자의 외부 표면 상에 배열되거나, 또는 둘 다인 동결건조된 나노입자 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 리툭시맙 및 트라스투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 동결건조된 나노입자 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 게피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 이마티닙, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴 및 시클로포스파미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 동결건조된 나노입자 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 알부민 젤라틴, 엘라스틴, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 우유 단백질 및 유청 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 동결건조된 나노입자 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민이 인간 혈청 알부민인 동결건조된 나노입자 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 나노입자의 표면의 전부 또는 일부 상의 항체의 실질적으로 단일 층으로 배열되는 것인 동결건조된 나노입자 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 담체 단백질 및, 존재하는 경우에, 치료제가 비-공유 결합을 통해 결합되는 것인 동결건조된 나노입자 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 정맥내 전달을 위해 제제화되는 것인 동결건조된 나노입자 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 평균 나노입자 크기가 800 nm 초과 내지 약 3.5 μm인 동결건조된 나노입자 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 조성물이 종양으로의 직접 주사 또는 관류를 위해 제제화되는 것인 동결건조된 나노입자 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 약 1 x 10-11 M 내지 약 1 x 10-9 M의 해리 상수를 갖는 것인 나노입자 조성물.
  19. a. 담체 단백질 및 임의적으로 적어도 하나의 치료제를 항체와 5.0 또는 그 초과의 pH를 갖는 용액 중에서 약 5℃ 내지 약 60℃의 온도에서 접촉시켜 나노입자를 생성하는 단계; 및
    b. 나노입자를 동결건조시키는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 동결건조된 나노입자 조성물을 제조하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 온도가 약 55℃ 내지 약 60℃인 방법.
  21. 나노입자를 포함하는 동결건조된 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각
    a. 알부민-결합된 파클리탁셀 코어, 및
    b. 알부민-결합된 파클리탁셀 코어의 표면 상에 항체의 결합 부분이 그 표면에서 밖으로 향하도록 배열된 약 400 내지 약 800개 분자의 베바시주맙
    을 포함하고,
    여기서 항체는 수용액으로의 재구성 시에 나노입자의 표면과의 그의 회합을 유지하며, 단 상기 동결건조된 조성물은 적어도 3개월 동안 약 20℃ 내지 약 25℃에서 안정하고, 재구성된 나노입자는 생체내에서 VEGF에 결합할 수 있는 것인
    동결건조된 나노입자 조성물.
  22. 나노입자를 포함하는 동결건조된 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각
    a. 알부민-결합된 파클리탁셀 코어, 및
    b. 알부민-결합된 파클리탁셀 코어의 표면 상에 항체의 결합 부분이 그 표면에서 밖으로 향하도록 배열된 소정량의 베바시주맙
    을 포함하고,
    여기서 항체는 수용액으로의 재구성 시에 나노입자의 표면과의 그의 회합을 유지하며, 단 상기 동결건조된 조성물은 적어도 3개월 동안 약 20℃ 내지 약 25℃에서 안정하고, 재구성된 나노입자는 생체내에서 VEGF에 결합할 수 있고, 추가로 여기서 평균 재구성된 나노입자 크기는 800 nm 초과 내지 약 3.5 μm인
    동결건조된 나노입자 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 알부민-결합된 파클리탁셀 대 베바시주맙의 중량비가 약 5:1 내지 약 1:1인 나노입자 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 알부민-결합된 파클리탁셀 대 베바시주맙의 중량비가 약 10:4인 나노입자 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 알부민-결합된 파클리탁셀 대 베바시주맙의 중량비가 1:1 초과 내지 약 1:3인 나노입자 조성물.
  26. 제21항, 제23항 및 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 베바시주맙이 나노입자의 표면의 전부 또는 일부 상의 항체의 실질적으로 단일 층인 나노입자 조성물.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 베바시주맙이 비-공유 결합을 통해 코어에 결합되는 것인 나노입자 조성물.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민이 인간 혈청 알부민인 나노입자 조성물.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 나노입자의 0.01% 미만이 200 nm 초과, 300 nm 초과, 400 nm 초과, 500 nm 초과, 600 nm 초과, 700 nm 초과 및 800 nm 초과로 이루어진 군으로부터 선택되는 크기를 갖는 것인 나노입자 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 조성물이 정맥내 전달을 위해 제제화되는 것인 나노입자 조성물.
  31. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 종양으로의 직접 주사 또는 관류를 위해 제제화되는 것인 나노입자 조성물.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 파클리탁셀 또는 베바시주맙이 아닌 적어도 하나의 추가의 치료제를 추가로 포함하는 것인 나노입자 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 치료제가 나노입자의 외부 표면 상에 배열되는 것인 나노입자 조성물.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 치료제가 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 겜시타빈, 게피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 이마티닙, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴 및 시클로포스파미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나노입자 조성물.
  35. 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 약 1 x 10-11 M 내지 약 1 x 10-9 M의 해리 상수를 갖는 것인 나노입자 조성물.
  36. 알부민 및 파클리탁셀을 베바시주맙과 5.0 내지 7.5의 pH 및 약 23℃ 내지 약 60℃의 온도를 갖는 용액 중에서 접촉시켜 나노입자 조성물을 형성시키는 단계, 및 나노입자 조성물을 동결건조시키는 단계를 포함하는, 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항의 동결건조된 나노입자 조성물을 제조하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 온도가 약 55℃ 내지 약 60℃인 방법.
  38. 암 세포를 유효량의 제1항 내지 제18항 및 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항의 나노입자 조성물과 접촉시켜 암 세포를 치료하는 단계를 포함하는, 암 세포를 치료하는 방법.
  39. 종양의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 제1항 내지 제18항 및 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항의 나노입자 조성물을 투여하여 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 종양을 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 종양의 크기가 감소되는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 나노입자 조성물을 정맥내로 투여하는 것인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 나노입자 조성물을 종양으로의 직접 주사 또는 관류에 의해 투여하는 것인 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 나노입자 조성물을 3주 동안 1주에 1회 투여하는 단계;
    b. 나노입자 조성물의 투여를 1주 동안 중단하는 단계; 및
    c. 단계 a) 및 b)를 필요에 따라 반복하여 종양을 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 유효량이 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2 파클리탁셀을 포함하는 것인 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 유효량이 약 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2 베바시주맙을 포함하는 것인 방법.
  46. 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각
    a. 담체 단백질,
    b. 약 400 내지 약 800개의 항체, 및
    c. 임의적으로 파클리탁셀이 아닌 적어도 하나의 치료제
    를 포함하고,
    여기서 항체는 나노입자의 표면 상에 항체의 결합 부분이 그 표면에서 밖으로 향하도록 배열되고, 나노입자는 생체내에서 미리결정된 에피토프에 결합할 수 있는 것인
    나노입자 조성물.
  47. 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물이며, 여기서 나노입자는 각각
    a. 알부민이 아닌 담체 단백질,
    b. 약 400 내지 약 800개의 항체, 및
    c. 임의적으로 적어도 하나의 치료제
    를 포함하고,
    여기서 항체는 나노입자의 표면 상에 항체의 결합 부분이 그 표면에서 밖으로 향하도록 배열되고, 나노입자는 생체내에서 미리결정된 에피토프에 결합할 수 있는 것인
    나노입자 조성물.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 조성물 중의 나노입자의 0.01% 미만이 800 nm 초과의 크기를 갖는 것인 나노입자 조성물.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 나노입자의 0.01% 미만이 400 nm 초과, 500 nm 초과, 600 nm 초과, 및 700 nm 초과로 이루어진 군으로부터 선택되는 크기를 갖는 것인 나노입자 조성물.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 나노입자 내부에 위치하는 것인 나노입자 조성물.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 나노입자의 외부 표면 상에 위치하는 것인 나노입자 조성물.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 나노입자 내부에 위치하고 나노입자의 외부 표면 상에 위치하는 것인 나노입자 조성물.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 약 400 내지 약 800개의 항체를 포함하는 것인 나노입자 조성물.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 이필리무맙, 니볼루맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 리툭시맙 및 트라스투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나노입자 조성물.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 치료제가 아비라테론, 벤다무스틴, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카바지탁셀, 시스플라틴, 클로람부실, 다사티닙, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에를로티닙, 에토포시드, 에베롤리무스, 게피티닙, 이다루비신, 이마티닙, 히드록시우레아, 이마티닙, 라파티닙, 류프로렐린, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파조파닙, 페메트렉세드, 피코플라틴, 로미뎁신, 사트라플라틴, 소라페닙, 베무라페닙, 수니티닙, 테니포시드, 트리플라틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈크리스틴 및 시클로포스파미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나노입자 조성물.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 나노입자의 표면의 전부 또는 일부 상의 항체의 실질적으로 단일 층인 나노입자 조성물.
  57. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 담체 단백질 및, 존재하는 경우에, 치료제는 비-공유 결합을 통해 결합되는 것인 나노입자 조성물.
  58. 제46항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 젤라틴, 엘라스틴, 글리아딘, 레구민, 제인, 대두 단백질, 우유 단백질 및 유청 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 나노입자 조성물.
  59. 제46항 및 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 알부민인 나노입자 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 알부민이 인간 혈청 알부민인 나노입자 조성물.
  61. 제46항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 정맥내 전달을 위해 제제화되는 것인 나노입자 조성물.
  62. 제46항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 평균 나노입자 크기가 800 nm 초과 내지 약 3.5 μm인 나노입자 조성물.
  63. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 종양으로의 직접 주사 또는 관류를 위해 제제화되는 것인 나노입자 조성물.
  64. 제46항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 약 1 x 10-11 M 내지 약 1 x 10-9 M의 해리 상수를 갖는 것인 나노입자 조성물.
  65. 담체 단백질 및 임의적으로 적어도 하나의 치료제를 항체와 5.0 내지 7.5의 pH 및 약 5℃ 내지 약 60℃의 온도를 갖는 용액 중에서 접촉시키는 단계를 포함하는, 제46항 내지 제64항 중 어느 한 항의 나노입자 조성물을 제조하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 온도가 약 23℃ 내지 약 60℃인 방법.
  67. 제65항에 있어서, 온도가 약 55℃ 내지 약 60℃인 방법.
  68. (a) 담체 단백질 및 임의적으로 적어도 하나의 치료제를 접촉시켜 코어를 형성시키는 단계 및 (b) 코어를 항체와 약 5.0 내지 약 7.5의 pH 및 약 5℃ 내지 약 60℃의 온도를 갖는 용액 중에서 접촉시키는 단계를 포함하는, 제46항 내지 제64항 중 어느 한 항의 나노입자 조성물을 제조하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 온도가 약 23℃ 내지 약 60℃인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 온도가 약 55℃ 내지 약 60℃인 방법.
  71. 암 세포를 유효량의 제46항 내지 제64항 중 어느 한 항의 나노입자 조성물과 접촉시켜 암 세포를 치료하는 단계를 포함하는, 암 세포를 치료하는 방법.
  72. 종양의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료 유효량의 제46항 내지 제64항 중 어느 한 항의 나노입자 조성물을 투여하여 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 종양을 치료하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 종양의 크기가 감소되는 것인 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 나노입자 조성물을 정맥내로 투여하는 것인 방법.
  75. 제72항 또는 제73항에 있어서, 나노입자 조성물을 종양으로의 직접 주사 또는 관류에 의해 투여하는 것인 방법.
  76. 제65항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 나노입자 조성물을 3주 동안 1주에 1회 투여하는 단계;
    b. 나노입자 조성물의 투여를 1주 동안 중단하는 단계; 및
    c. 단계 a) 및 b)를 필요에 따라 반복하여 종양을 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  77. 제65항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 유효량이 약 75 mg/m2 내지 약 175 mg/m2 담체 단백질을 포함하는 것인 방법.
  78. 제65항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 유효량이 약 30 mg/m2 내지 약 70 mg/m2 항체를 포함하는 것인 방법.
  79. 제39항 내지 제45항 및 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 유리 항체를 나노입자의 투여 12-48시간 전에 투여하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 유리 항체는 나노입자 내에서 항체와 동일한 표적에 결합하는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 유리 항체를 치료 용량 절반 미만의 용량으로 투여하는 것인 방법.
  81. 제79항에 있어서, 항체가 BEV이고, BEV를 AB160의 투여 24시간 전에 1 mg/kg으로 투여하는 것인 방법.
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