CN107073132A - 载体‑抗体组合物及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了抗体和载体蛋白的组合物以及制备和使用该组合物的方法,具体而言,所述组合物作为癌症治疗剂。本文还描述了抗体和载体蛋白的冻干的组合物以及制备和使用该组合物的方法,具体而言,所述组合物作为癌症治疗剂。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年10月6日提交的美国临时专利申请US62/060,484和2015年8月18日提交的美国临时专利申请US62/206,770,US62/206,771和US62/206,772的申请日的权益。上述美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本文公开的内容涉及抗体和载体蛋白的新型组合物及其制备和使用方法,具体而言,所述组合物作为癌症治疗剂。
背景技术
化疗对于多种类型的癌症(包括黑色素瘤)而言仍然是主要的全身性疗法。大多数化疗剂对肿瘤细胞仅略有选择性,并且对健康增殖的细胞的毒性非常高(Allen TM.(2002)Cancer 2:750-763),因此,通常会要求降低剂量,甚至中断治疗。理论上,克服化疗毒性问题以及改善药物疗效的一条途径是使用对由肿瘤细胞选择性表达(或过表达)的蛋白质具有特异性的抗体将化疗药物靶向肿瘤以将靶向药物吸引至肿瘤,从而改变化疗的生物分配并且将更多的药物引导至肿瘤而较低地影响健康组织。虽然进行了30年的研究,但是在治疗剂方面,特异性靶向罕有成功。
传统的抗体依赖性化疗(ADC)采用通过合成的蛋白酶-可裂解的连接体连接至靶向抗体的毒性药剂来设计。这种ADC疗法的疗效取决于目标细胞结合至抗体的能力,待裂解的连接体和目标细胞对毒性药剂的摄取。Schrama,D.等人(2006)Nature reviews.Drugdiscovery 5:147-159。
抗体靶向的化疗相对于传统疗法具有显著优势,因为该抗体靶向的化疗提供了靶向能力、多个细胞毒性药剂以及改善的治疗能力与潜在较低的毒性的组合。虽然已对抗体靶向的化疗进行了广泛的研究,但是临床上有效的抗体靶向的化疗仍然难以捉摸:主要的障碍包括抗体和化疗药物之间的连接体的不稳定性,连接至抗体时化疗剂的肿瘤毒性降低以及结合物无法结合并进入肿瘤细胞。此外,这些疗法不能控制抗体-药物结合物的尺寸。
本领域仍然需要基于抗体的癌症治疗剂,其保留靶向递送的药物的细胞毒性作用,从而相对于现有技术中的治疗剂提供可靠的且改善的抗肿瘤疗效。
此外,对于任何治疗应用而言,本领域仍然还需要物理、化学和生物性质稳定的组合物。
冻干法或冷冻干燥除去了组合物中的水。在处理过程中,待干燥的材料首先被冷冻,随后冰或冷冻的溶剂在真空环境中通过升华而被除去。预冻干的制剂中可包括赋形剂以提高冷冻干燥处理过程中的稳定性和/或改善储存后冻干产品的稳定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)and Arakawa等人,Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。
虽然蛋白质可被冻干,但是冻干和复溶的过程可影响蛋白质的性质。因为蛋白质比传统的有机和无机药物更大并且更加复杂(即,除了复杂的三维结构之外还具有多种官能团),这种蛋白质的制剂带来了特殊的问题。为了保留蛋白质的生物活性,制剂必须完整保护蛋白质的氨基酸的至少核心序列的构象完整性,同时保护蛋白质的多种官能团不被降解。蛋白质的降解途径可涉及化学不稳定性(即,涉及通过键形成或产生新的化学实体的裂解进行蛋白质修饰的任何过程)或物理不稳定性(即,蛋白质的高级结构的改变)。化学不稳定性可由脱酰胺基作用、外消旋作用、水解、氧化、β消除或二硫键交换(disulfideexchange)引起。物理不稳定性可由变性作用(例如,聚集、沉淀或吸附)引起。三种最常见的蛋白质降解途径是蛋白质聚集、脱酰胺基作用和氧化。Cleland,等人,Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4):307-377(1993)。
在本发明中,组合物包含含有(a)载体蛋白,(b)抗体和(c)任选地治疗剂的纳米颗粒。所述抗体被认为通过疏水相互作用与所述载体蛋白结合,所述疏水相互作用本质上较弱。因此,这种组合物的冻干和复溶不仅仅必然保留了单个成分的活性,而且还保留了它们在纳米颗粒中的相对关系。
因为将纳米颗粒用于治疗,因此,带来了进一步的挑战。
例如,纳米颗粒中疏水成分的重新排列可能通过各个成分之间的共价键而被降低。然而,这些共价键给癌症治疗中纳米颗粒的治疗用途带来了挑战。抗体、载体蛋白和额外的治疗剂通常在肿瘤内的不同位置发挥作用并且通过不同的机理发挥作用。非共价键允许纳米颗粒的成分在肿瘤处解离。因此,虽然共价键对于冻干可能是有利的,但是,其对于治疗应用而言可能是不利的。
纳米颗粒的尺寸和粒度分布也是非常重要的。本发明的纳米颗粒可根据其尺寸产生不同的表现。在大尺寸条件下,纳米颗粒或这些颗粒的团聚可阻塞血管,其可影响组合物的性能和安全性。
最后,冷冻保护剂和有助于冻干过程的试剂必须是安全的且耐受治疗应用。
发明内容
一方面,本文提供含有纳米颗粒的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含载体蛋白,约100至约1000个抗体和任选地至少一种治疗剂,其中,所述抗体从所述纳米颗粒的表面向外排列,并且,其中,所述纳米颗粒能够在体内结合至预定的表位。
当静脉内给药时,大的颗粒(例如,大于1μm)通常是不利的,因为它们可在肺的微血管中形成沉积。同时,较大的颗粒可在肿瘤或特定器官中累积。参见,例如,用于注射进入供给肝脏肿瘤的肝动脉的20-60微米的玻璃颗粒,称为“治疗微球(therasphere)”(临床上用于肝癌)。
因此,对于静脉内给药而言,使用1μm以下的颗粒。更加通常而言,1μm以上的颗粒直接给药于肿瘤(“直接注射”)或给药于供给至肿瘤位点的动脉。
另一方面,本文提供包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含载体蛋白,该载体蛋白不是白蛋白;约100至约100个抗体,优选地约400至约800个抗体;以及任选地至少一种治疗剂,其中,所述抗体被排布在所述纳米颗粒的外表面,并且,其中,所述纳米颗粒能够在体内结合至预定的表位。当所述纳米颗粒发生多聚化时,抗体的数量成比例地增加。例如,如果160nm的纳米颗粒包含400个抗体,那么,直径为320nm的二聚体包含约800个抗体。
另一方面,本文提供包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含载体蛋白,约400至约800个抗体以及任选地至少一种治疗剂,该治疗剂不是紫杉醇,其中,所述抗体被排布在所述纳米颗粒的表面,这样,所述抗体的结合部分从该表面指向外部,并且,其中,所述纳米颗粒能够在体内结合至预定的表位。
在其他实施方式中,所述纳米颗粒发生多聚化,例如,二聚化。多聚化作用可被看做是单位分子的重量或尺寸加倍,例如,160nm的颗粒多聚化为约320nm,480nm,640nm,等等。在一些实施方式中,颗粒群中少于20%是多聚体。在一些实施方式中,颗粒群中多于80%是多聚体。
在一种实施方式中,载体结合的药物与抗体(例如,白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗)的重量比为约5:1至约1:1。在一种实施方式中,载体结合的药物与抗体的重量比为约10:4。在一种实施方式中,抗体是在纳米颗粒的全部表面或部分表面上的基本单层的抗体。在一种实施方式中,组合物中少于0.01%的纳米颗粒的尺寸选自:大于200nm,大于300nm,大于400nm,大于500nm,大于600nm,大于700nm和大于800nm。较大的尺寸被认为是若干个纳米颗粒多聚化的结果,每个纳米颗粒包含核心和位于每个纳米颗粒的全部表面或部分表面上的抗体涂层。
本发明还包括冻干的组合物,并且冻干的组合物实质上不会与新鲜制备的纳米颗粒的性质不同或者和新鲜制备的纳米颗粒的性质相同。具体而言,重悬于水性溶液之后,冻干的组合物与新鲜的组合物在粒度、粒度分布、对癌细胞的毒性、抗体亲和性和抗体特异性方面类似或等同。本发明涉及如下意想不到的发现:冻干的纳米颗粒保持新鲜制备的纳米颗粒的性质,尽管在这些颗粒中存在两种不同的蛋白质成分。
一方面,本发明涉及包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含载体结合的药物核心和一定量的排布在所述核心的表面的抗体,从而使抗体的结合部分从所述表面指向外部,其中,所述抗体在复溶于水性溶液之后保持其与所述纳米颗粒的外表面的结合。在一种实施方式中,冻干的组合物在室温下稳定至少3个月。在一种实施方式中,复溶的纳米颗粒保持治疗剂的活性并且能够在体内结合至靶点。
在一种实施方式中,复溶的纳米颗粒的平均尺寸为约130nm至约1μm。在优选的实施方式中,复溶的纳米颗粒的平均尺寸为约130nm至约200nm,并且,更优选地为约160nm。在一种实施方式中,复溶的纳米颗粒的平均尺寸为大于800nm至约3.5μm,其包含较小的纳米颗粒的多聚体,例如,100nm-200nm纳米颗粒的多聚体。在一种实施方式中,核心与抗体的重量比为大于1:1至约1:3。
一方面,本文公开的内容涉及包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含:(a)白蛋白结合的紫杉醇核心和(b)排布在所述白蛋白结合的紫杉醇核心的表面上的约400个分子至约800个分子的贝伐单抗,这样,抗体的结合蛋白从所述表面指向外部,其中,所述抗体在复溶于水性溶液之后保持其与所述纳米颗粒的表面的结合,条件是所述冻干的组合物在约20℃至约25℃的条件下稳定至少3个月并且复溶的纳米颗粒能够在体内结合至VEGF。
在其他方面,本文公开的内容涉及包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含:(a)白蛋白结合的紫杉醇核心和(b)排布在所述白蛋白结合的紫杉醇核心的表面的一定量的贝伐单抗,这样,抗体的结合部分从所述表面指向外部,其中,所述抗体在复溶于水性溶液之后保持其与所述纳米颗粒的表面的结合,条件是所述冻干的组合物在约20℃至约25℃的条件下稳定至少3个月并且复溶的纳米颗粒能够在体内结合至VEGF,进一步地,其中,复溶的纳米颗粒的平均粒度基本上不会与新鲜制备的纳米颗粒的粒度不同。在一些实施方式中,粒度为200nm至800nm,包括200nm,300nm,400nm,500nm,600nm,700nm或800nm。在其他实施方式中,颗粒更大,例如,大于800nm至约3.5μm。在一些实施方式中,颗粒是纳米颗粒的多聚体。
在一些实施方式中,白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的重量比为约5:1至约1:1。在其他实施方式中,白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的重量比为约10:4。在进一步的实施方式中,白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的重量比为大于1:1至约1:3。
在一些实施方式中,核心是白蛋白结合的紫杉醇,并且抗体选自:选择性识别VEGF的抗体(例如,贝伐单抗/阿瓦斯汀),选择性识别CD20的抗体(例如,利妥昔单抗/Rituxin)和选择性识别Her2的抗体(曲妥单抗/赫赛汀)。
在一些实施方式中,所述至少一种治疗剂位于纳米颗粒内部。在其他实施方式中,所述至少一种治疗剂位于纳米颗粒的外表面上。在其他实施方式中,所述至少一种治疗剂位于纳米颗粒内部和纳米颗粒的外表面上。
在一些实施方式中,所述纳米颗粒包含多于一种类型的治疗剂。例如,紫杉烷和铂药物,例如,紫杉醇和顺铂。
在一些实施方式中,所述抗体选自:ado-曲妥珠单抗emtansine,阿仑单抗(alemtuzumab),贝伐单抗,西妥昔单抗(cetuximab),地诺单抗(denosumab),dinutuximab,伊匹单抗(ipilimumab),纳武单抗(nivolumab),obinutuzumab,奥法木单抗(ofatumumab),帕尼单抗(panitumumab),派姆单抗(pembrolizumab),帕妥珠单抗(pertuzumab),利妥昔单抗和曲妥珠单抗。在一些实施方式中,所述抗体是所述纳米颗粒的全部表面或部分表面上的基本单层的抗体。
在进一步的实施方式中,所述抗体的糖基化比在天然人抗体中通常发现的糖基化少。这种糖基化作用可受到例如表达系统或表达过程中糖基化作用抑制剂的存在的影响。在一些实施方式中,所述抗体的糖基化状态可通过酶作用或化学作用发生改变。
在一些实施方式中,所述至少一种治疗剂选自:阿比特龙(abiraterone),苯达莫司汀(bendamustine),硼替佐米(bortezomib),卡铂(carboplatin),卡巴他赛(cabazitaxel),顺铂(cisplatin),苯丁酸氮芥(chlorambucil),达沙替尼(dasatinib),多西他赛(docetaxel),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin),厄洛替尼(erlotinib),依托泊苷(etoposide),依维莫司(everolimus),吉非替尼(gefitinib),柔红霉素(idarubicin),伊马替尼(imatinib),羟基脲(hydroxyurea),伊马替尼(imatinib),拉帕替尼(lapatinib),亮丙瑞林(leuprorelin),美法仑(melphalan),氨甲蝶呤(methotrexate),二羟蒽酮(mitoxantrone),奈达铂(nedaplatin),尼罗替尼(nilotinib),奥沙利铂(oxaliplatin),紫杉醇(paclitaxel),帕唑帕尼(pazopanib),培美曲塞(pemetrexed),吡铂(picoplatin),罗米地辛(romidepsin),沙铂(satraplatin),索拉非尼(sorafenib),威罗菲尼(vemurafenib),舒尼替尼(sunitinib),替尼泊苷(teniposide),三铂(triplatin),长春花碱(vinblastine),长春瑞滨(vinorelbine),长春新碱(vincristine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)。
在一些实施方式中,所述纳米颗粒还包含至少一种额外的治疗剂,该额外的治疗剂不是紫杉醇或贝伐单抗。
在一些实施方式中,所述抗体、载体蛋白以及治疗剂(当存在时)通过非共价键结合。
在一些实施方式中,所述载体蛋白选自:明胶、弹性蛋白、醇溶蛋白、豆球蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白、乳蛋白和乳清蛋白。在其他实施方式中,所述载体蛋白是白蛋白,例如,人血清白蛋白。
在一些实施方式中,组合物被配制成用于静脉内递送。在其他实施方式中,组合物被配制成用于直接注射或灌注至肿瘤内。
在一些实施方式中,组合物中的纳米颗粒的平均尺寸为大于800nm至约3.5μm。
在一些实施方式中,纳米颗粒的解离常数为约1x10-11M至约1x10-9M。
另一方面,本文提供制备纳米颗粒组合物的方法,其中,所述方法包括在各个成分的比例允许形成期望的纳米颗粒的条件下,使载体蛋白和任选地至少一种治疗剂在pH为5.0至7.5且温度为5℃至60℃,23℃至60℃,或55℃至60℃的溶液中与抗体接触。在一种实施方式中,纳米颗粒在55℃至60℃,pH为7.0的条件下制备。另一方面,本文提供制备纳米颗粒组合物的方法,其中,所述方法包括(a)使载体蛋白与任选地至少一种治疗剂接触以形成核心以及(b)在各个成分的比例允许形成期望的纳米颗粒的条件下使所述核心在pH为约5.0至约7.5且温度为约5℃至约60℃,约23℃至约60℃或约55℃至约60℃的溶液中与所述抗体接触。
为了形成期望的纳米颗粒,对各个成分(例如,载体蛋白、抗体、治疗剂或其组合)的量进行控制。各个成分太稀的组合物无法形成本文所述的纳米颗粒。在优选的实施方式中,载体蛋白与抗体的重量比为10:4。在一些实施方式中,载体蛋白的量为约1mg/mL至约100mg/mL。在一些实施方式中,抗体的量为约1mg/mL至约30mg/mL。例如,在一些实施方式中,载体蛋白:抗体:溶液的比例为1mL溶液(例如,盐水)中约9mg载体蛋白(例如,白蛋白)和4mg抗体(例如,BEV)。治疗剂(例如,紫杉醇)的量也可加至所述载体蛋白。
在进一步的实施方式中,所述纳米颗粒如上所述制备并且随后冻干。
另一方面,本文提供治疗癌细胞的方法,所述方法包括使所述细胞与有效量的本文公开的纳米颗粒组合物接触,从而治疗癌细胞。
另一方面,本文提供治疗有此需求的患者体内的肿瘤的方法,所述方法包括使细胞与有效量的本文公开的纳米颗粒组合物接触,从而治疗肿瘤。在一些实施方式中,肿瘤尺寸减小。在其他实施方式中,所述纳米颗粒组合物静脉内给药。在其他实施方式中,所述纳米颗粒组合物通过直接注射或灌注至肿瘤内给药。
在一些实施方式中,本文提供的方法包括如下步骤:a)每周一次给药纳米颗粒组合物持续三周;b)停止纳米颗粒组合物的给药持续一周;以及c)根据需要重复步骤a)和b),从而治疗肿瘤。
在相关的实施方式中,治疗包括在给药纳米颗粒之前给药靶向抗体。在一种实施方式中,靶向抗体在给药纳米颗粒之前约6至48小时或12至48小时给药。在另一实施方式中,靶向抗体在给药纳米颗粒之前6小时至12小时给药。在另一实施方式中,靶向抗体在给药纳米颗粒之前2小时至8小时给药。在其他实施方式中,靶向抗体在给药纳米颗粒之前一周给药。例如,在给药AB160之前24小时给药一剂BEV。在另一实施例中,在给药AR纳米颗粒之前进行利妥昔单抗的在先给药。在纳米颗粒之前给药的抗体可作为一剂给药,该一剂是亚治疗剂量的,例如,通常被认为的治疗剂量的二分之一,十分之一或二十分之一。因此,在男性体内,采用BEV预先治疗可包括给药常规剂量的十分之一的1mg/kg的BEV,随后给药AB160。
在一些实施方式中,治疗有效量包括约75mg/m2至约175mg/m2的载体蛋白(即,毫克载体蛋白/m2患者)。在其他实施方式中,治疗有效量包括约75mg/m2至约175mg/m2的治疗剂(例如,紫杉醇)。在其他实施方式中,治疗有效量包括约30mg/m2至约70mg/m2的抗体。在其他实施方式中,治疗有效量包括约30mg/m2至约70mg/m2的贝伐单抗。
在一种特定的实施方式中,冻干的组合物包括约75mg/m2至约175mg/m2的载体蛋白,所述载体蛋白优选为白蛋白;约30mg/m2至约70mg/m2的抗体,所述抗体优选为贝伐单抗;以及约75mg/m2至约175mg/m2的紫杉醇。
附图说明
下列附图仅仅是本发明的代表性附图并且无意作为限定。为了一致起见,使用和贝伐单抗的本发明的纳米颗粒使用首字母缩略词“AB”并且AB之后的数字(例如,AB160)是指这些纳米颗粒的平均粒度(单位为纳米)。同样,当抗体为利妥昔单抗时,首字母缩略词为“AR”,同时其后的数字保持相同的含义。
图1A显示了流式细胞分选散点图,其包括:仅采用二抗染色的(ABX–获自Celgene Corporation,Summit,NJ 07901)(左上图),采用山羊抗-小鼠IgG1 Fab和二抗染色的ABX(右上图),仅采用二抗染色的AB160(其是比例为约10:4且平均粒度为160nm的白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的纳米颗粒)(左下图),或采用山羊抗-小鼠IgG1 Fab和二抗染色的AB160(右下图)。
图1B显示了用金颗粒标记的抗-人IgG Fc孵育AB160之后的代表性的电子显微照片。
图1C显示了表明AB160部分(颗粒,大于100kD的蛋白质和小于100kD的蛋白质)中总紫杉醇的百分含量的饼图(上图)以及抗小鼠IgG Fab抗体(BEV)和紫杉醇的Western印迹,从而证明了共定位(下图)。
图1D表示与单独的ABX相比,在使用A375人黑色素瘤细胞的体外毒性检测中紫杉醇的活性。结果由平均(+/-SEM)增殖指数代表,该指数是未处理的细胞的总增殖百分数。该数据代表了三次实验并且差异不显著。
图1E表示VEGF与ABX和AB160共孵育之后上清液的VEGF ELISA结果,以确定配体、VEGF与抗体的结合。结果显示为未与两种复合物结合的VEGF的平均百分比+/-SEM。数据代表三次实验**P<0.005。
图2A显示了在形成纳米颗粒以及更大尺寸的颗粒的条件下通过将BEV(贝伐单抗)加至ABX形成的复合物的尺寸(通过光散射技术确定)。将增加的浓度的BEV(0-25mg)加至10mg ABX中并且确定所形成的复合物的尺寸。复合物的平均尺寸(146nm至2,166nm)随着BEV浓度的增加而增加。数据显示为样品的体积/尺寸并且图显示了颗粒的粒度分布。该数据代表了5个单独的药物制剂。作为对比,ABX其自身的平均粒度为约130nm。
图2B显示了ABX与BEV的结合亲和性(通过光吸收(BLItz)技术确定)。数据显示为解离常数(Kd)。评估了在四个pH水平(3,5,7,9)和3个温度(室温,37℃和58℃)条件下制备的颗粒的结合亲和性,并且数据代表5个实验。
图2C显示了图2B中的纳米颗粒复合物在血清中的稳定性,其由在Nanosight 300(NS300)上的纳米颗粒追踪分析(NTA)确定。数据显示为颗粒数/mg ABX并且在每种条件下将在室温和pH为7条件下制备的AB160(AB16007;粒度,pH),58℃和pH为7条件下制备的AB160(AB1600758;粒度,pH,温度)以及58℃和pH为5条件下制备的AB160(AB1600558,粒度,pH,温度)与单独的ABX进行比较。一旦制备了颗粒,就将其加至人AB血清中持续15分钟、30分钟和60分钟,以确定随时间在血清中的稳定性。
图3A显示了在右侧肋腹注射有1x106个A375人黑色素瘤细胞且用PBS,12mg/kgBEV,30mg/kg ABX,12mg/kgBEV+30mg/kg ABX或AB160治疗(具有大约12mg/kg BEV和大约30mg/kg ABX)的无胸腺裸鼠中对AB纳米颗粒的体内测试,所述无胸腺裸鼠体内的肿瘤尺寸为约600mm3至900mm3。数据被表示为治疗后第七天肿瘤尺寸相对于基线(治疗当天的肿瘤尺寸)的变化百分比。Student’s t-测试用于确定显著性。AB颗粒的p值相对于PBS、单独给药的单个药物和按顺序给药的两种药物均具有显著性差异。
图3B显示了图3A中分析的小鼠的中值生存期所产生的Kaplan-Meier曲线。使用Mantle-Cox测试比较生存期曲线确定显著性。
图3C显示了当肿瘤小于或大于700mm3时所治疗的小鼠相对于基线的变化百分比,以确定肿瘤尺寸是否影响肿瘤对单独的ABX和AB160组的响应。Student’s t-测试用于确定显著性,基于肿瘤尺寸,单独的ABX组显示出没有显著性差异(p=0.752),而AB160组具有显著性差异(p=0.0057)。
图3D显示了在右侧肋腹注射有1x106个A375人黑色素瘤细胞且用PBS,30mg/kgABX或45mg/kg BEV和AB160,AB580(白蛋白结合的紫杉醇和贝伐单抗的纳米颗粒的平均粒度为580nm)或AB1130(白蛋白结合的紫杉醇和贝伐单抗的纳米颗粒的平均粒度为1130nm)治疗的无胸腺裸鼠中对AB纳米颗粒体内测试,所述无胸腺裸鼠体内的肿瘤尺寸为约600mm3至900mm3。数据被表示为治疗后第七天肿瘤尺寸相对于基线(治疗当天的肿瘤尺寸)的变化百分比。Student’s t-测试用于确定显著性。AB颗粒的p值相对于PBS、单独给药的单个药物和按顺序给药的两种药物均具有显著性差异。不同尺寸的AB颗粒之间没有显著性差异。
图3E显示了图3D中分析的小鼠的中值生存期所产生的Kaplan-Meier曲线。使用Mantle-Cox测试比较生存期曲线确定显著性。
图4A显示了在ABX或AB160的环境下在IV注射有30mg/kg紫杉醇之后0-24小时从不带有肿瘤和带有肿瘤的小鼠中采集的且通过LC-MS测量的血液和肿瘤样本的基础上,采用对数标度的y轴以线性图显示的血液紫杉醇浓度。在0时间对小鼠进行IV注射,在0、4、8、12和24小时的时间点采集血液样本并且宰杀小鼠。每个时间点至少有三个小鼠。Student’st-测试用于确定ABX和AB160之间的浓度是否具有任何显著性差异。
图4B显示了来自图4A的血液紫杉醇浓度,显示为数字标度的y轴线图。
图4C显示了来自图4A和图4B中提供的血液浓度数据计算的Cmax,半衰期和AUC值。
图4D显示了采用对数标度的y轴在线性图中显示的血液紫杉醇浓度,该血液紫杉醇浓度来自使用较早的时间点(2至8小时)的第二药代动力学实验。
图4E显示了来自图4D的血液紫杉醇浓度,其显示在采用数字标度的y轴的线图中。
图4F显示了小鼠中的血液紫杉醇浓度,在所述小鼠中,肿瘤被允许生长至较大尺寸,随后注射ABX和AB160。
图4G显示了通过图4F的数据计算的Cmax和AUC。
图4H显示了通过LC-MS确定的来自第二小鼠实验的肿瘤中的紫杉醇浓度。数据显示为μg紫杉醇/mg肿瘤组织。Student’s t-测试用于确定是否具有显著性差异。
图4I显示了相对于用单独的ABX治疗的小鼠,用AB160治疗的小鼠体内的I-125辐射水平。
图4J显示了图4I所示的I-125辐射水平的图形表示。
图5A显示了采用利妥昔单抗制备的纳米颗粒的粒度测量值和亲和性。10mg/ml的ABX采用0-10mg/ml的利妥昔单抗(RIT)孵育并且将光散射技术(Mastersizer 2000)用于测定得到的粒度。数据显示为每种尺寸的颗粒的体积百分比并且曲线代表粒度分布(上图)。表格(下图)显示了在每种抗体浓度条件下得到的颗粒的尺寸。
图5B显示了采用曲妥珠单抗制备的纳米颗粒的粒度测量值和亲和性。10mg/ml的ABX用0-22mg/ml的曲妥珠单抗(HER)孵育并且将光散射技术(Mastersizer 2000)用于确定得到的颗粒的尺寸。数据显示为每种尺寸的颗粒的体积百分比并且曲线代表粒度分布(上图)。表格(下图)显示了在每种抗体浓度条件下得到的颗粒的尺寸。
图5C显示了在pH为3、5、7和9的条件下与ABX相比利妥昔单抗和曲妥珠单抗的结合亲和性,其由生物膜干涉(BLItz)技术确定。显示每种相互作用的解离常数。
图6A显示了采用CD20阳性Daudi人淋巴瘤细胞系测试的AR160的体外毒性。数据显示在增殖指数的图中,所述增殖指数是处理的孔中的FITC阳性细胞相对于未处理的孔中的FITC阳性细胞的百分比(最高水平的增殖)。
图6B显示了在右侧肋腹中注射有5x106个Daudi人淋巴瘤细胞的无胸腺裸鼠体内肿瘤疗效。肿瘤被允许生长至600mm3至900mm3并且用PBS,30mg/kg ABX,12mg/kg利妥昔单抗,12mg/kg利妥昔单抗+30mg/kg ABX或AR160治疗小鼠。在治疗后第7天通过从治疗第一天开始的肿瘤尺寸的变化百分比来确定肿瘤反应。通过Student’s t-测试确定显著性;AR160治疗的小鼠与所有其他组之间的相对于基线的变化百分比具有显著性差异(p<0.0001)。
图6C显示了图6B中所示的实验产生的Kaplan-Meier生存期曲线。显示了每个治疗组的中值生存期。Mantle-Cox测试用于确定生存期曲线是否具有显著性差异。
图7A显示了将另一化疗药物(顺铂)顺铂加至AB160。在室温条件下采用顺铂(0.5mg/ml)孵育ABX(5mg/ml)持续30分钟并且在除去ABX颗粒之后通过HPLC测量上清液中的游离顺铂。从起始浓度中减去游离顺铂的量以确定结合至ABX的顺铂的量。数据显示在柱状图中,其中带有起始浓度(顺铂)。
图7B显示了A375人黑色素瘤细胞的增殖检测中顺铂结合的ABX(AC)的毒性。在药物暴露以及Edu掺入24小时后,用FITC结合的抗-EdU抗体对细胞进行固定,透化和标记。数据显示在增殖指数的图中,所述增殖指数是处理的孔中的FITC阳性细胞相对于未处理的孔中的FITC阳性细胞(最高水平增殖)的百分比。
图7C显示了右侧肋腹中注射有1x106个A375人黑色素瘤细胞的无胸腺裸鼠中的AC(ABC复合物,顺铂结合的ABX)的体内肿瘤疗效。肿瘤被允许生长至600mm3至900mm3,并且用PBS,30mg/kg ABX,2mg/kg顺铂,AB160,2mg/kg顺铂+AB160或ABC160治疗小鼠。在治疗后第七天通过从治疗开始当天肿瘤尺寸的变化百分比确定肿瘤反应。通过Student’s t-测试确定显著性;相对于基线,用ABC160治疗的小鼠与PBS-治疗的小鼠、顺铂治疗的小鼠或ABX治疗小鼠的变化百分比具有显著性差异(p<0.0001)。相对于基线,AB160治疗组、AB160+顺铂治疗组合及ABC160治疗组在治疗后第七天的变化百分比没有显著性差异。
图7D显示了基于图7C所示的实验产生的Kaplan-Meier生存期曲线并且显示了每个治疗组的中值生存期。Mantle-Cox测试用于确定生存期曲线是否具有显著性差异。
图8A显示了与新鲜的AB160或单独的ABX相比,被冻干、在室温下储存一个月并复溶的AB160纳米颗粒的粒度分布。
图8B显示了与新鲜的AB160或单独的ABX相比,被冻干、在室温下储存一个月并复溶的AB160纳米颗粒的配体(VEGF)结合能力。
图8C显示了与新鲜的AB160或单独的ABX相比,被冻干、在室温下储存一个月并复溶的AB160纳米颗粒的体外癌细胞毒性。
图8D显示了与新鲜的AB160或单独的ABX相比,被冻干、在室温下储存十个月并复溶的AB160纳米颗粒的粒度分布。
图8E显示了与新鲜的AB160或单独的ABX相比,被冻干、在室温下储存十个月并复溶的AB160纳米颗粒的配体(VEGF)结合能力。
图8F显示了与新鲜的AB160或单独的ABX相比,被冻干、在室温下储存十个月并复溶的AB160纳米颗粒的体外癌细胞毒性。
图9A至C显示了在盐水中室温条件下孵育了长达24小时的ABX-BEV复合物在I.V.输注条件(ABX最终浓度为5mg/mL)下的粒度分布(图A和B)。经过在室温下4个小时,由ELISA得到复合物分解的一些证据(20%,图C)。
图10显示了在相对体积比例为9:1或1:1的条件下盐水或肝素化的人血浆中的ABX(上图)或AB160(下图)的30秒体外孵育。
图11A至E显示了右侧肋腹注射有1x106个A375人黑色素瘤细胞的并用PBS(图11A)、12mg/kg BEV(图11B)、30mg/kg ABX(图11C),AB160(图11D)治疗的或用0.12mg/kgBEV预治疗且24小时后用AB160治疗(图11E)的无胸腺裸鼠的体内测试。数据表示为治疗后第7天和治疗后第10天的肿瘤体积(mm3)。
图11F总结了图11A至E的治疗后7天的数据。
图11G总结了图11A至E的治疗后10天的数据。
具体实施方式
在阅读了具体实施方式这部分的内容之后,对于本领域技术人员而言,如何在各种可选的实施方式和可选的应用中实施本发明将变得明显。然而,本发明的所有各种不同的实施方式不会在本文中描述。应当理解的是,本文提供的实施方式仅以举例的方式呈现,并不产生限定。这样,各种不同的可选的实施方式的详细描述不应当被解释为对下文所列举的本发明的范围或广度的限定。
在公开并描述本发明之前,应当理解的是,下文描述的各个方面不限定于特定的组合物、该组合物的制备方法或其用途,当然,下文描述的各个方面可发生改变。还应当理解的是,本文使用的术语仅仅是为了描述各个具体的方面而无意进行限定。
为了方便读者,本发明的具体实施方式部分分为多个部分,并且在任何部分中发现的公开内容可与另一部分结合。为了方便读者,将标题或副标题可用于说明书中,而标题或副标题无意影响本发明的范围。
释义
除非另有说明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在说明书和后附的权利要求书中,参考定义为具有如下含义的多个术语。
本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方式,无意限定本发明。本文使用的单数形式冠词(“a”,“an”和“the”)也意在包括复数形式,除非另有明确说明。
“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可能发生或可能不发生,并且描述的内容包括事件或情况发生的实例和不发生的实例。
在数字名称(例如,温度、时间、量、浓度,等等,包括范围)之前使用的术语“约”表示近似值,其可以在正(+)负(-)10%,正(+)负(-)5%,正(+)负(-)1%或其之间的任何子范围或子值的范围内变化。优选地,与剂量相关使用的术语“约”是指剂量可发生正负(+/-)10%的改变。例如,“约400个至约800个抗体”是指纳米颗粒的外表面包含的抗体的量为约360个至880个颗粒。
“包含(comprising或comprises)”是指组合物和方法包括所记载的成分,但不排除其他成分。限定组合物和方法时使用的“基本由……构成”是指排除任何对用于指定目的的组合而言本质上显著的其他成分。因此,基本由本文所限定的组分构成的组合物可不排除对要求保护的发明的基本且新颖的特点本质上无影响的其他材料或步骤。“由……构成”是指排除其他高于痕量的成分和基本方法步骤。由这些过渡术语中的每一个界定的实施方式在本发明的范围内。
本文使用的术语“纳米颗粒”是指至少一个维度小于5微米的颗粒。在优选的实施方式中,例如,用于静脉内给药而言,纳米颗粒小于1微米。对于直接给药而言,纳米颗粒较大。本发明明确考虑甚至更大的颗粒。
在颗粒群中,单个颗粒的尺寸围绕平均值分布。因此,颗粒群的粒度可由平均值表示并且也可由百分率来表示。D50是如下粒度:50%的颗粒的粒度低于该粒度。10%的颗粒小于D10值并且90%的颗粒小于D90。在不清楚的情况下,“平均”尺寸等同于D50。因此,例如,AB160是指平均尺寸为160nm的纳米颗粒。
术语“纳米颗粒”也可包括更小单元的纳米颗粒的离散多聚体。例如,320nm颗粒包括单元160nm纳米颗粒的二聚体。因此,对于160nm的纳米颗粒而言,多聚体为约320nm,480nm,640nm,800nm,960nm,1120nm,等等。
本文使用的术语“载体蛋白”是指起到运输抗体和/或治疗剂的作用的蛋白质。本文公开的抗体可可逆地结合至载体蛋白。示例性的载体蛋白在下文更加详细地讨论。
本文使用的术语“核心”是指可由载体蛋白、载体蛋白和治疗剂或其他药剂或药剂的组合构成的纳米颗粒的中心或内部部分。在一些实施方式中,抗体的疏水部分可并入所述核心。
本文使用的术语“治疗剂”是指治疗上有用的药剂,例如,用于治疗、缓解或弱化疾病状态、生理学状况、症状或致病因素,或者用于对疾病状态、生理学状况、症状或致病因素进行评估和诊断的药剂。治疗剂可以是化疗剂,例如,有丝分裂抑制剂,拓扑异构酶抑制剂,类固醇,抗肿瘤抗生素,抗代谢剂,烷基化剂,酶,蛋白酶体抑制剂或它们的任何组合。
本文使用的术语“抗体(antibody或antidies)”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即,含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子)。该术语还指由两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链构成的抗体以及包括全长抗体及其部分的多种形式;包括,例如,免疫球蛋白分子,单克隆抗体,嵌合抗体,CDR接枝的抗体,人源化抗体,Fab,Fab’,F(ab’)2,Fv,二硫化物连接的Fv,scFv,单结构域抗体(dAb),双价抗体,多特异性抗体,双特异性抗体,抗独特型抗体,双特异性抗体,它们的功能活性表位结合片段,双功能杂交抗体(例如,Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.17,105(1987))和单链(例如,Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-5883(1988)和Bird等人,Science242,423-426(1988),其通过引用并入本文)(参见,总体上,Hood等人,Immunology,Benjamin,N.Y.,第二版(1984);Harlow and Lane,Antibodies.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988);Hunkapiller and Hood,Nature,323,15-16(1986),其通过引用并入本文)。抗体可以是任何类型(例如,IgG,IgA,IgM,IgE或IgD)。优选地,抗体是IgG。抗体可以是非人抗体(例如,来自小鼠、山羊或任何其他动物),全部人抗体,人源化抗体或嵌合抗体。
术语“解离常数”(也称为“Kd”)是指表达特定物质分离成单个成分(例如,蛋白载体,抗体和任选的治疗剂)的程度的量。
本文使用的术语“冻干(lyophilized,lyophilization,等等)”是指如下过程:通过该过程,待干燥的材料(例如,纳米颗粒)首先被冷冻,随后冰或冷冻的溶剂在真空环境中通过升华而被除去。任选地,赋形剂被包括在预冻干的制剂中以提高冻干的产品存储后的稳定性。在一些实施方式中,纳米颗粒可由冻干的成分(载体蛋白,抗体和任选的治疗剂)形成,随后用作治疗剂。在其他实施方式中,载体蛋白,抗体和任选的治疗剂首先被合并至纳米颗粒中,随后被冻干。冻干的样品还可包含其他赋形剂。
术语“填充剂”包括提供冷冻干燥的产品的结构的试剂。用于填充剂的常见实例包括甘露醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。除了提供药学上美观的饼状物之外,填充剂还可在改良塌陷温度、提供冷冻-融化保护和提高蛋白质的长期储存稳定性方面赋予有用的性质。这些试剂还可作为张力调整剂。
术语“缓冲剂”包括冻干之前将溶液pH维持在可接受的范围内的那些试剂并且可包括琥珀酸盐(琥珀酸钠或琥珀酸钾),组氨酸,磷酸盐(磷酸钠或磷酸钾),Tris(三(羟甲基)氨基甲烷),二乙醇胺,柠檬酸盐(柠檬酸钠),等等。本发明的缓冲剂的pH在约5.5至约6.5的范围内,并且pH优选地为6.0。将pH控制在该范围内的缓冲剂的实例包括琥珀酸盐(例如,琥珀酸钠),葡糖酸盐,组氨酸,柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。
术语“冷冻保护剂”通常包括为蛋白质提供对抗冷冻诱导的应力的稳定性的试剂,假定通过优先从蛋白质表面排除应力而为蛋白质提供稳定性。它们还可在初次干燥和二次干燥过程中以及在长期储存产品的过程中提供保护。实例是诸如葡聚糖和聚乙二醇之类的聚合物,诸如蔗糖、葡萄糖、海藻糖和乳糖之类的糖类,诸如聚山梨醇酯之类的表面活性剂和诸如甘氨酸、精氨酸和丝氨酸之类的氨基酸。
术语“冻干保护剂”包括在干燥或‘脱水’处理过程(初次和二次干燥循环)中为蛋白质提供稳定性的试剂,假定通过提供无定型玻璃态基质并通过氢键与蛋白质结合,代替在干燥处理过程中除去的水分子为蛋白质提供稳定性。这有助于维持蛋白质的构象,最小化冻干循环过程中蛋白质的降解并且改善长期储存的产品。实例包括多元醇或诸如蔗糖和海藻糖之类的糖类。
术语“药物制剂”是指如下形式的制剂,在该形式中使活性成分有效并且所述制剂不包含对被给药所述制剂的受治者有毒性的额外的成分。
“药学上可接受的”赋形剂(载体,添加剂)是可合理地给药于目标哺乳动物以提供所使用的活性成分的有效剂量的那些赋形剂。
“复溶时间”是采用溶液使冻干的制剂再次水合成不含颗粒的澄清溶液所需的时间。
“稳定的”制剂是储存之后其中的蛋白质基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。
本文使用的术语“表位”是指被抗体识别的抗原的一部分。表位包括但不限于:能够与蛋白质(例如,抗体)或配体发生特异性相互作用的短氨基酸序列或肽(任选地,糖基化的或其他方式修饰的)。例如,表位可以是与抗体的抗原结合位点结合的分子的一部分。
术语“治疗(treating或treatment)”涵盖了对受治者(例如,人)体内的疾病或失调(例如,癌症)的治疗,并且包括:(i)抑制疾病或失调,即,阻止其发展;(ii)缓解疾病或失调,即,使失调复原;(iii)减慢失调的进展;和/或(iv)抑制、缓解或减慢疾病或失调的一种或多种症状的进展。在一些实施方式中,治疗(treating或treatment)是指杀死癌细胞。
与癌症治疗相关的术语“杀死”意在包括任何类型的调控,所述调控导致癌细胞死亡或癌细胞群的至少一部分死亡。
此外,本说明书中使用的一些术语在下文中更加具体地界定。
概述
本发明被认为部分基于如下意想不到的发现:包含载体蛋白,抗体和治疗剂的任选地冻干的纳米颗粒提供对肿瘤的靶向治疗同时最小化对患者的毒性。因此,本文描述的纳米颗粒相对于传统ADC产生显著的改善。
对于有效的传统ADC而言,连接体足够稳定不会在全身循环中解离但是允许足量的药物释放在肿瘤位点是至关重要的。Alley,S.C.,等人(2008)Bioconjug Chem 19:759-765。这已被证明是研发有效药物结合物的主要障碍(Julien,D.C.,等人(2011)MAbs 3:467-478;Alley,S.C.,等人(2008)Bioconjug Chem 19:759-765);因此,纳米-免疫结合物的引人注目的特点在于不需要生物化学连接体。
目前的ADC的另一缺陷在于在人肿瘤中实质上并未证明较多的药物渗透进入肿瘤。小鼠模型中的早期ADC测试表明抗体靶定肿瘤会在肿瘤中产生较高浓度的活性剂(Deguchi,T.等人(1986)Cancer Res 46:3751-3755);然而,这未与人疾病的治疗产生关联,这可能是因为人肿瘤在渗透性方面相对于小鼠肿瘤有高得多的异质性。Jain,R.K.等人(2010)Nat Rev Clin Oncol 7:653-664。而且,纳米颗粒的尺寸对于从血管进入肿瘤过程中的外渗而言至关重要。在使用人结肠恶性腺瘤异种移植模型的小鼠研究中,血管的孔可渗透高达400nm的脂质体。Yuan,F.,等人(1995)Cancer Res 55:3752-3756。肿瘤孔尺寸和渗透性的另一研究表明这两个特点依赖于肿瘤位置和生长情况,退化的肿瘤和颅肿瘤可渗透小于200nm的颗粒。Hobbs,S.K.,等人(1998)Proc Natl Acad Sci U S A 95:4607-4612。本文描述的纳米-免疫结合物通过如下事实克服了该问题:整体小于200nm的大复合物在体内循环中部分解离成较小的功能单元,该功能单元能够易于渗透肿瘤组织。而且,一旦结合物到达肿瘤位点,较小的毒性有效载荷可被释放并且只有毒性部分需要被肿瘤细胞摄取,而非整个结合物。
包含治疗剂(即,)的抗体(即,)包被的白蛋白纳米颗粒的出现已产生了将两种或多种治疗剂体内定向递送至预定位点的新的范例。参见PCT申请公开WO2012/154861和WO2014/055415,这两者的全部内容均通过引用并入本文。
当白蛋白和抗体的组合物以特定浓度和比例在水性溶液中混合在一起时,抗体自发地自组装至白蛋白内和白蛋白上以形成具有多个抗体拷贝(高达500个或更高)的纳米颗粒。不受任何理论的限制,考虑将抗体的抗原受体部分定位于朝向纳米颗粒外部,而通过疏水-疏水相互作用将疏水尾端并入白蛋白内。
虽然包含单独的源蛋白的蛋白质组合物通常以冻干形式储存,在该冻干形式中,蛋白质组合物表现出明显的保质期,但是冻干的组合物不包含通过疏水-疏水相互作用形成为整体的两种不同蛋白质的自组装的纳米颗粒。而且,大部分抗体结合部分暴露于纳米颗粒的表面的纳米颗粒结构使其自身易受到移动或重组结构的影响,所述移动或重组结构通过其他被认为是良性的条件进行。例如,在冻干过程中,蛋白质上的离子电荷脱水,从而暴露其下面的电荷。所暴露的电荷在两个蛋白质之间产生电荷-电荷相互作用,该相互作用可改变每个蛋白质对另一蛋白质的结合亲和性。此外,纳米颗粒的浓度随着溶剂(例如,水)的除去而显著提高。纳米颗粒的这种浓度的提高可导致不可逆的寡聚。寡聚是蛋白质的已知性质,其使得寡聚物的生物性质相比于单体形式降低并且有时使颗粒的尺寸超过1微米。
另一方面,对于临床和/或商业使用而言,需要纳米颗粒组合物的稳定形式,在所述临床和/或商业使用中,需要至少三个月的保质期并且高于6个月或9个月的保质期是优选的。这种稳定的组合物必须容易地用于静脉内注射,必须在静脉内注射之后保持其自组装形式,从而在体内将纳米颗粒指向预定位点,必须具有小于1微米的最大尺寸,从而避免在递送进入血流时的任何缺血性事件,并且最后,必须与用于注射的水性组合物相容。
化合物
如在阅读了本公开的内容之后对于本领域技术人员明显的是,本文公开的内容涉及包含载体蛋白、抗体和任选地至少一种治疗剂的纳米颗粒的组合物,其中,所述组合物任选地为冻干的。
在一些实施方式中,载体蛋白可以是白蛋白,明胶,弹性蛋白(包括弹性蛋白原)或弹性蛋白衍生的多肽(例如,α-弹性蛋白和弹性蛋白样多肽(ELP)),醇溶蛋白,豆球蛋白,玉米蛋白,大豆蛋白(例如,大豆蛋白分离物(SPI)),乳蛋白(例如,β-乳球蛋白(BLG)和酪蛋白)或乳清蛋白(例如,乳清蛋白浓缩物(WPC)和乳清蛋白分离物(WPI))。在优选的实施方式中,载体蛋白是白蛋白。在优选的实施方式中,白蛋白是蛋白(卵白蛋白),牛血清白蛋白(BSA),等等。在甚至更优选的实施方式中,载体蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方式中,载体蛋白是美国食品药品管理局(FDA)批准的一般认为安全的(GRAS)赋形剂。
在一些实施方式中,抗体选自:ado-曲妥珠单抗emtansine,阿仑单抗(alemtuzumab),贝伐单抗,西妥昔单抗(cetuximab),地诺单抗(denosumab),dinutuximab,伊匹单抗(ipilimumab),纳武单抗(nivolumab),obinutuzumab,奥法木单抗(ofatumumab),帕尼单抗(panitumumab),派姆单抗(pembrolizumab),帕妥珠单抗(pertuzumab),利妥昔单抗和曲妥珠单抗。在一些实施方式中,所述抗体是所述纳米颗粒全部表面或部分表面上的基本单层的抗体。
表1描述了抗体的非限定性列表
表1:抗体
在一些实施方式中,所述至少一种治疗剂选自:阿比特龙(abiraterone),苯达莫司汀(bendamustine),硼替佐米(bortezomib),卡铂(carboplatin),卡巴他赛(cabazitaxel),顺铂(cisplatin),苯丁酸氮芥(chlorambucil),达沙替尼(dasatinib),多西他赛(docetaxel),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin),厄洛替尼(erlotinib),依托泊苷(etoposide),依维莫司(everolimus),吉非替尼(gefitinib),柔红霉素(idarubicin),伊马替尼(imatinib),羟基脲(hydroxyurea),伊马替尼(imatinib),拉帕替尼(lapatinib),亮丙瑞林(leuprorelin),美法仑(melphalan),氨甲蝶呤(methotrexate),二羟蒽酮(mitoxantrone),奈达铂(nedaplatin),尼罗替尼(nilotinib),奥沙利铂(oxaliplatin),紫杉醇(paclitaxel),帕唑帕尼(pazopanib),培美曲塞(pemetrexed),吡铂(picoplatin),罗米地辛(romidepsin),沙铂(satraplatin),索拉非尼(sorafenib),威罗菲尼(vemurafenib),舒尼替尼(sunitinib),替尼泊苷(teniposide),三铂(triplatin),长春花碱(vinblastine),长春瑞滨(vinorelbine),长春新碱(vincristine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)。
表2描述了癌症治疗剂的非限定性的列表
表2:癌症治疗剂
应当理解的是,治疗剂可位于纳米颗粒的内部,位于纳米颗粒的外表面或这两者。纳米颗粒可包含多于一种治疗剂,例如,包含两种治疗剂,三种治疗剂,四种治疗剂,五种治疗剂或更多。而且,纳米颗粒可在纳米颗粒的内部和外部包含相同的治疗剂或不同的治疗剂。
在一些实施方式中,任何载体蛋白,抗体,治疗剂或它们的任何组合可被明确排除。例如,在一些实施方式中,组合物可包含除了之外的任何载体蛋白和化疗剂和/或除了贝伐单抗之外的任何靶向抗体。
一方面,纳米颗粒包含至少100个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含至少200个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含至少300个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含至少400个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含至少500个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含至少600个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。
一方面,纳米颗粒包含约100至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含约200至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含约300至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含约400至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含约500至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含约600至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含约200至约800个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。一方面,纳米颗粒包含约300至约800个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。在优选的实施方式中,纳米颗粒包含约400至约800个非共价结合至纳米颗粒表面的抗体。所涉及的值包括在所记载的范围内的任何值或子范围,包括端点值。
一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为小于约1μm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约130nm至约1μm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约130nm至约900nm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约130nm至约800nm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约130nm至约700nm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约130nm至约600nm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约130nm至约500nm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约130nm至约400nm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约130nm至约300nm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约130nm至约200nm。在优选的实施方式中,纳米颗粒组合物的平均粒度为约150nm至约180nm。在特别优选的实施方式中,纳米颗粒组合物的平均粒度为约160nm。所涉及的值包括在所记载的范围内的任何值或子范围,包括端点值。
一方面,纳米颗粒组合物被配制成用于静脉内注射。为了避免缺血事件,配制成用于静脉内注射的纳米颗粒组合物应当包含平均粒度小于约1μm的纳米颗粒。
一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为大于约1μm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约1μm至约5μm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约1μm至约4μm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约1μm至约3μm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约1μm至约2μm。一方面,纳米颗粒组合物的平均粒度为约1μm至约1.5μm。所涉及的值包括在所记载的范围内的任何值或子范围,包括端点值。
一方面,纳米颗粒组合物被配制成用于直接注射至肿瘤内。直接注射包括注射至肿瘤位点或注射至靠近肿瘤位点,灌注至肿瘤内,等等。当配制成用于直接注射至肿瘤内时,纳米颗粒可包括任何平均粒度。不受理论的限制,越大的颗粒(例如,大于500nm,大于1μm,等等)被认为越有可能被固定在肿瘤内部,从而提高有益效果。较大的颗粒可在肿瘤或特定器官内累积。参见,例如,用于注射至供给肝脏肿瘤的肝动脉的20微米至60微米的玻璃颗粒,其称为(临床用于肝癌)。因此,对于静脉内给药而言,通常使用1μm以下的颗粒。1μm以上的颗粒更加通常直接给药于肿瘤(“直接注射”)或给药于供给至肿瘤位点的动脉。
一方面,组合物中小于约0.01%的纳米颗粒的粒度大于200nm,大于300nm,大于400nm,大于500nm,大于600nm,大于700nm,大于800nm。一方面,组合物中小于约0.001的纳米颗粒的粒度大于200nm,大于300nm,大于400nm,大于500nm,大于600nm,大于700nm,大于800nm。在优选的实施方式中,组合物中小于约0.01%的纳米颗粒的粒度大于800nm。在更加优选的实施方式中,组合物中小于约0.001%的纳米颗粒的粒度大于800nm。
在优选的实施方式中,本文记载的尺寸及尺寸范围涉及复溶冻干的纳米颗粒组合物的粒度。也就是说,在冻干的纳米颗粒重悬于水性溶液(例如,水,其他药学上可接受的赋形剂,缓冲剂,等)中之后,粒度或平均粒度在本文记载的范围内。
一方面,至少约50%,60%,70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%,或99.9%的纳米颗粒作为单个纳米颗粒存在于复溶的组合物中。也就是说,少于约50%,40%,30%等的纳米颗粒被二聚化或多聚化(寡聚化)。
在一些实施方式中,纳米颗粒的尺寸可通过调节载体蛋白相对于抗体的量(例如,比例)控制。纳米颗粒的尺寸和粒度分布也非常重要。本发明的纳米颗粒可根据其尺寸而起到不同的作用。在大尺寸条件下,团聚可阻断血管。因此,纳米颗粒的团聚可影响组合物的性能和安全性。另一方面,较大的颗粒可在某些情况(例如,当不是静脉给药的情况)下更加具有治疗作用。
一方面,纳米颗粒组合物包含至少一种额外的治疗剂。在一种实施方式中,所述至少一种额外的治疗剂非共价结合至纳米颗粒的外表面。在一种实施方式中,所述至少一种额外的治疗剂排布在纳米颗粒的外表面。在一种实施方式中,所述至少一种额外的治疗剂排布在选自:阿比特龙(abiraterone),苯达莫司汀(bendamustine),硼替佐米(bortezomib),卡铂(carboplatin),卡巴他赛(cabazitaxel),顺铂(cisplatin),苯丁酸氮芥(chlorambucil),达沙替尼(dasatinib),多西他赛(docetaxel),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin),厄洛替尼(erlotinib),依托泊苷(etoposide),依维莫司(everolimus),吉非替尼(gefitinib),柔红霉素(idarubicin),伊马替尼(imatinib),羟基脲(hydroxyurea),伊马替尼(imatinib),拉帕替尼(lapatinib),亮丙瑞林(leuprorelin),美法仑(melphalan),氨甲蝶呤(methotrexate),二羟蒽酮(mitoxantrone),奈达铂(nedaplatin),尼罗替尼(nilotinib),奥沙利铂(oxaliplatin),紫杉醇(paclitaxel),帕唑帕尼(pazopanib),培美曲塞(pemetrexed),吡铂(picoplatin),罗米地辛(romidepsin),沙铂(satraplatin),索拉非尼(sorafenib),威罗菲尼(vemurafenib),舒尼替尼(sunitinib),替尼泊苷(teniposide),三铂(triplatin),长春花碱(vinblastine),长春瑞滨(vinorelbine),长春新碱(vincristine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)。在一种实施方式中,所述至少一种额外的治疗剂是抗癌抗体。
制备纳米颗粒的方法
一方面,本发明涉及制备本文所述的纳米颗粒组合物的方法。
一方面,纳米颗粒组合物的纳米颗粒通过使载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒与抗体以载体蛋白颗粒或或载体蛋白-治疗剂颗粒与抗体的比例为约10:1至约10:30接触而形成。在一种实施方式中,所述比例为约10:2至约10:25。在一种实施方式中,所述比例为约10:2至约1:1。在优选的实施方式中,所述比例为约10:2至约10:6。在特别优选的实施方式中,所述比例为约10:4。所涉及的值包括在所记载的范围内的任何值或子范围,包括端点值。
在一种实施方式中,用于形成纳米颗粒的溶液或其他液体介质的量特别重要。在载体蛋白(或载体蛋白-治疗剂)和抗体过于稀的溶液中无法形成纳米颗粒。过于浓的溶液会产生无结构的聚集体。在一些实施方式中,所使用的溶液(例如,无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水)的量为约0.5mL溶液至约20mL溶液。在一些实施方式中,载体蛋白的量为约1mg/mL至约100mg/mL。在一些实施方式中,抗体的量为约1mg/mL至约30mg/mL。例如,在一些实施方式中,载体蛋白:抗体:溶液的比例为1mL溶液(盐水)中约9mg载体蛋白(例如,白蛋白)和4mg抗体(例如,BEV)。治疗剂(例如,紫杉醇)的量还可加至载体蛋白中。例如,1mg紫杉醇可加至1mL溶液中的9mg载体蛋白(10mg载体蛋白-治疗剂)和4mg抗体。当使用常规i.v.袋时,例如,该i.v.袋中带有约1升溶液,本领域技术人员需要使用相对于1mL中使用的量的1000倍的量的载体蛋白/载体蛋白-治疗剂和抗体。因此,本领域技术人员无法在标准i.v.袋中形成本发明的纳米颗粒。而且,当将各个成分以本发明的治疗量加至标准i.v.袋中时,各个成分不会自组装形成纳米颗粒。
在一种实施方式中,载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒在pH为约4至约8的溶液中与抗体接触。在一种实施方式中,载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒在pH为约4的溶液中与抗体接触。在一种实施方式中,载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒在pH为约5的溶液中与抗体接触。在一种实施方式中,载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒在pH为约6的溶液中与抗体接触。在一种实施方式中,载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒在pH为约7的溶液中与抗体接触。在一种实施方式中,载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒在pH为约8的溶液中与抗体接触。在优选的实施方式中,载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒在pH为约5至约7的溶液中与抗体接触。
在一种实施方式中,载体蛋白颗粒或载体蛋白-治疗剂颗粒在温度为约5℃至约60℃(或该范围内的任何范围、子范围或值,包括端点值)的条件下与抗体一同孵育。在优选的实施方式中,载体蛋白颗粒或载体蛋白-治疗剂颗粒在温度为约23℃至约60℃的条件下与抗体一同孵育。
不受理论的限制,纳米颗粒组合物中的纳米颗粒的稳定性被认为至少部分取决于形成纳米颗粒的温度和/或pH,以及溶液中各个成分(即,载体蛋白,抗体和任选地治疗剂)的浓度。在一种实施方式中,纳米颗粒的Kd为约1x10-11M至约2x10-5M。在一种实施方式中,纳米颗粒的Kd为约1x10-11M至约2x10-8M。在一种实施方式中,纳米颗粒的Kd为约1x10-11M至约7x10-9M。在优选的实施方式中,纳米颗粒的Kd为约1x10-11M至约3x10-8M。所涉及的值包括在所记载的范围内的任何值或子范围,包括端点值。
冻干法
本发明的冻干的组合物通过标准冻干技术在存在稳定剂、缓冲剂等或不存在稳定剂、缓冲剂等的条件下制备。意想不到的是,这些条件不会改变纳米颗粒的相对脆的结构。而且,最好的是,这些纳米颗粒在冻干后保持其粒度分布,并且更加重要的是,这些纳米颗粒可被复溶以与新鲜制备的纳米颗粒基本相同的形式和比例用于体内给药(例如,静脉内递送)。
制剂
一方面,纳米颗粒组合物被配制成用于直接注射至肿瘤内。直接注射包括注射至肿瘤位点或注射至肿瘤位点附近,灌注至肿瘤内,等等。因为,纳米颗粒组合物无法全身给药,因此,纳米颗粒组合物被配制成用于直接注射至肿瘤内并且纳米颗粒组合物可包含任何平均粒度。不受理论限制,较大的颗粒(例如,大于500nm,大于1μm等等)被认为更有可能被固定在肿瘤内部,从而被认为提供更好的有益效果。
另一方面,本文提供包含本文提供的化合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物。
总体而言,本文提供的化合物可配制成用于通过任何可接受的给药模式给药于患者。各种不同的剂型和药物递送系统是本领域可获得的。参见,例如,Gennaro,A.R.,编辑(1995)Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.。
总体而言,本文提供的化合物可作为药物组合物通过下述途径中的任何一种给药:口服给药、全身给药(例如,透皮给药,鼻内给药或通过栓剂给药),或肠胃外给药(例如,肌肉内给药,静脉内给药或皮下给药)。
总体而言,组合物由本发明的化合物结合至少一种药学上可接受的赋形剂构成。可接受的赋形剂是无毒的,有助于给药并且不会对本发明的化合物的治疗益处产生不利的影响。这些赋形剂可以是任何固体、液体、半固体或在气溶胶组合物的情况下,这些赋形剂可以是气态赋形剂,该气态赋形剂是本领域技术人员通常可获得的。
固体药物赋形剂包括淀粉,纤维素,滑石,葡萄糖,乳糖,蔗糖,明胶,麦芽,米,面粉,滑石粉,硅胶,硬脂酸镁,硬脂酸钠,硬脂酸甘油酯,氯化钠,干燥的脱脂牛奶,等等。液体和半固体赋形剂可选自:甘油,丙二醇,水,乙醇和各种不同的油类(包括石油,动物油,植物油或合成来源的油,例如,花生油,大豆油,矿物油,芝麻油,等等)。优选的液体载体,尤其是可注射溶液,包括水,盐水,水性葡萄糖和乙二醇。其他合适的药物赋形剂及其剂型在Remington's Pharmaceutical Sciences,E.W.Martin编辑(Mack Publishing Company,第18版,1990)中描述。
如果需要的话,本发明的组合物可以存在于包装或分配器设备中,所述包装或分配器设备包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。例如,这种包装或设备可包含金属箔或塑料箔,例如,泡罩包装,或玻璃和橡胶塞,例如,在小瓶中。还可制备在相容性药学载体中配制的包含本发明的化合物的组合物,其可放置于合适的容器中,并且标记治疗的适应症。
治疗方法
本文描述的纳米颗粒组合物在治疗哺乳动物体内的癌细胞和/或肿瘤方面有用。在优选的实施方式中,所述哺乳动物是人类(即,人类患者)。优选地,冻干的纳米颗粒组合物在给药之前复溶(悬浮于水性赋形剂中)。
一方面,本发明提供用于治疗癌细胞的方法,所述方法包括使所述细胞与有效量的本文描述的纳米颗粒组合物接触,从而治疗癌细胞。癌细胞的治疗包括但不限于:降低增殖,杀死细胞,预防细胞转移,等等。
一方面,本发明提供用于治疗有此需求的患者体内的肿瘤的方法,所述方法包括将治疗有效量的本文所述的纳米颗粒组合物给药于患者,从而治疗肿瘤。在一种实施方式中,肿瘤的尺寸减小。在一种实施方式中,肿瘤的尺寸不增加持续至少一段时间和/或在治疗之后肿瘤的尺寸不增加。
在一种实施方式中,纳米颗粒组合物静脉内给药。在一种实施方式中,纳米颗粒组合物直接给药至肿瘤。在一种实施方式中,纳米颗粒组合物通过直接注射或灌注给药至肿瘤内。
在一种实施方式中,所述方法包括:
a)每周一次给药纳米颗粒组合物持续三周;
b)停止给药纳米颗粒组合物持续一周;以及
c)可选地,根据需要,重复步骤a)和b)以治疗肿瘤。
在一种实施方式中,本文所述的纳米颗粒的治疗有效量包括约50mg/m2至约200mg/m2的载体蛋白或载体蛋白和治疗剂。在优选的实施方式中,治疗有效量包括约75mg/m2至约175mg/m2的载体蛋白或载体蛋白和治疗剂。所涉及的值包括在所记载的范围内的任何值、子范围或范围,包括端点值。
在一种实施方式中,治疗有效量包括约20mg/m2至约90mg/m2抗体。在优选的实施方式中,治疗有效量包括30mg/m2至约70mg/m2的抗体。所涉及的值包括在所记载的范围内的任何值、子范围或范围,包括端点值。
可由本文所述的组合物和方法治疗的癌症或肿瘤包括但不限于:胆道癌,脑癌(包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤),乳腺癌,子宫颈癌,绒毛膜癌,结肠癌,子宫内膜癌,食道癌,胃癌,血液肿瘤(包括急性淋巴细胞白血病和髓细胞性白血病),多发性骨髓瘤,AIDS相关白血病和成人T-细胞白血病淋巴瘤,上皮内瘤(包括鲍温病(Bowen's disease)和柏哲德氏病(Paget's disease)),肝癌(肝细胞癌),肺癌,淋巴瘤(包括霍奇金氏疾病和淋巴细胞性淋巴瘤),神经母细胞瘤,口腔癌(包括鳞状细胞癌);卵巢癌(包括那些由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞引起的卵巢癌),胰腺癌,前列腺癌,直肠癌,肉瘤(包括平滑肌肉瘤,横纹肌肉瘤,脂肪肉瘤,纤维肉瘤和骨肉瘤),皮肤癌(包括黑色素瘤,卡波西氏肉瘤,基底细胞癌(basocellular cancer)和鳞状细胞癌),睾丸癌(包括生殖肿瘤(精原细胞瘤,非精原细胞瘤[畸胎瘤,绒毛膜瘤(choriocarcinomas)]),基质细胞肿瘤和生殖细胞肿瘤),甲状腺癌(包括甲状腺腺癌和甲状腺髓样癌)以及肾癌(包括腺癌和肾母细胞瘤)。在重要的实施方式中,癌症或肿瘤包括乳腺癌,淋巴瘤,多发性骨髓瘤和黑色素瘤。
总体而言,本发明的化合物可以治疗有效量通过用于起类似作用的药剂的任何可接受的给药模式给药。本发明的化合物的实际量(即,纳米颗粒)将取决于多种因素,例如,待治疗的疾病的严重性,受治者的年龄和相对健康情况,所使用的化合物的效力,给药的途径和形式以及本领域技术人员熟知的其他因素。
这些药剂的有效量可通过常规实验容易地确定,最有效和方便的给药途径以及最合适的剂型也可确定。各种不同的剂型以及药物递送系统是本领域可获得的。例如,参见,Gennaro,A.R.,编辑(1995)Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,MackPublishing Co.。
药剂(例如,本发明的化合物)的有效量或治疗有效量或剂量是指使症状得到改善或延长受治者的生存期的药剂或化合物的量。这些分子的毒性和治疗疗效可通过例如测定LD50(50%的群体的致死剂量)和ED50(50%的群体的治疗有效剂量)由细胞培养物或实验动物中的标准药物步骤确定。毒性和治疗疗效的剂量比例是治疗指数,其可表达为LD50/ED50的比值。表现出高治疗指数的药剂是优选的。
有效量或治疗有效量是引起组织、系统、动物或人类的生物或医学反应的化合物的量或药物组合物的量,该量是研究者、兽医、医师或其他临床医生正在寻找的。剂量可在取决于所使用的剂型和/或所使用的给药途径的这个范围内发生改变。确切的剂型、给药途径、剂量和剂量间隔应当根据本领域已知的方法,考虑受治者的病症的特性进行选择。
剂量和剂量间隔可单独进行调节以提供足以实现期望的效果的活性部分的血药水平,即,最小有效浓度(MEC)。每个化合物的MEC是不同的,但是可从例如体外数据和动物实验来估计MEC。实现MEC所需的剂量可取决于个体特点和给药途径。在局部给药或选择性摄取的情况下,药物的有效局部浓度可不与血药浓度相关。
实施例
本文公开的内容使用由作为核心的白蛋白结合的紫杉醇(即,)或顺铂和作为抗体的贝伐单抗(即,)或利妥昔单抗(即,)构成的纳米颗粒进行举例说明。
本领域技术人员能够理解的是,实施例中纳米颗粒的制备和使用仅仅是为了举例说明,并且本发明公开的内容不受这种举例说明的限制。
除非另有说明,本文使用的任何缩写具有常见的科学含义。所有的温度为℃。在此,除非另有说明,下列术语具有如下含义。
ABX=/(白蛋白结合的紫杉醇)
AC=顺铂结合的ABX
ACN=乙腈
ADC=抗体依赖性化疗
BEV=贝伐单抗
BSA=牛血清白蛋白
dH2O=蒸馏水
DMEM=Dulbecco改良的Eagle培养基
nM=纳摩尔
EdU=5-乙炔基-2'-脱氧尿苷
EM=电子显微镜
FCB=流式细胞仪缓冲剂
FITC=荧光素
kD=千道尔顿
Kd=解离常数
kg=千克
KV=千伏
L/hr=升/小时
LC-MS=液相色谱-质谱
M=摩尔
mCi=毫居里
mg=毫克
ml or mL=毫升
m2=平方米
mm3=立方毫米
μg=微克
μl=微升
μm=微米
PBS=磷酸盐缓冲盐水
pK=药代动力学
RT=室温
rpm=每分钟转数
V=伏特
x g=时间重力
实施例1:纳米颗粒的制备
将Abraxane(ABX)(10mg)悬浮于贝伐单抗(BEV)(4mg[160μl]除非另有说明)中,并加入840μl 0.9%的盐水以提供ABX和BEV的最终浓度分别为10mg/ml和2mg/ml。在室温(或在指定温度)下孵育混合物30分钟以形成颗粒。对于测量ABX:BEV复合物的粒度的Mastersizer实验而言,将10mg ABX悬浮于浓度为0至25mg/ml的BEV中。采用利妥昔单抗(0-10mg/ml)或曲妥珠单抗(0-22mg/ml)在类似条件下形成ABX的复合物。
对于应用于人体而言,通过获得25mg/mL BEV的合适剂量的4mL小瓶以及根据下述指导将每个小瓶稀释至4mg/mL制备ABX:BEV复合物。ABX的合适剂量的100mg小瓶可通过复溶至最终浓度为包含10mg/mL ABX纳米颗粒来制备。使用无菌3mL注射器,可抽取1.6mL(40mg)贝伐单抗(25mg/mL)并且在最少1分钟内将其缓慢注射至每个含有100mgABX的小瓶的内壁上。贝伐单抗溶液不应当直接注射在冻干的饼上,因为这样会引起起泡。随后,使用无菌12mL无菌注射器,可抽取8.4mL 0.9%的氯化钠注射液(USP),并且在最少1分钟内将这8.4mL缓慢注射至每个含有100mgABX和40mgBEV的小瓶的内壁上。一旦完成添加1.6mL BEV和8.4mL 0.9%的氯化钠注射液(USP),可轻轻旋转每个小瓶和/或缓慢倒转每个小瓶持续至少2分钟,直至任何饼/粉末完全溶解。应当避免起泡。这时,每个小瓶的浓度应当为100mg/10mL ABX和40mg/10mL BEV。包含ABX和BEV的小瓶应当静置60分钟。每十分钟应当轻轻地旋转小瓶和/或缓慢地倒转小瓶,以继续混合复合物。60分钟过去之后,应当从每个小瓶中抽取计算的剂量体积的ABX和BEV并且将其缓慢加至空的viaflex袋中。随后加入等体积的0.9%氯化钠注射液(USP)以使最终浓度为ABX 5mg/mL且BEV 2mg/mL。随后,应当轻轻地旋转所述袋和/或缓慢地倒转所述袋持续1分钟,以进行混合。ABX:BEV纳米颗粒可在室温下储存长达4小时,随后进行最终稀释。
实施例2:ABX和BEV的体外结合
为了确定ABX和BEV是否发生相互作用,通过流式细胞仪和电子显微镜分析实施例1形成的纳米颗粒。
方法
流式细胞术:如上实施例1所述的那样生成AB160。为了确定BEV与ABX的结合,在Accuri C6流式细胞仪(BD Franklin Lakes,NJ)上进行AB160的可视化并且使用Accuri C6软件进行数据分析。采用5μg链霉亲和素PE(Abcam,Cambridge,MA)标记生物素化的(5μg)山羊抗-小鼠IgG(Abcam,Cambridge,MA)。选择该山羊抗-小鼠IgG标记AB160,因为BEV的Fab部分是小鼠衍生的。在室温下采用PE-标记的山羊抗-小鼠IgG孵育ABX和AB160持续30分钟,洗涤并通过流式细胞仪进行可视化。
电子显微镜:将溶解于PBS中浓度为6mg/ml的5μl ABX加至300目火棉胶片(parlodian)-碳包被的铜网上并静置1分钟。使滤纸的尖头接触液滴以除去多余的液体,在网上留下薄膜。使网干燥。为了溶解留在干燥的网上的缓冲剂结晶,在dH2O中洗涤样品三次。将pH7.2,1%磷钨酸(PTA)的小滴加至网上。随后使滤纸的尖头再次接触该网,以除去多余的液体,在网上留下薄膜并干燥。以1:10的比例用PBS稀释0.9%氯化钠溶液中的浓度为25mg/ml的BEV(Genentech)。将5μl BEV加载至镍formvar包被的网上并风干30分钟至1小时。对于AB160而言,将溶解于PBS中的10mg/ml的ABX与溶解于0.9%氯化钠溶液中的4mg/ml的BEV以2.5:1的比例混合。进一步用PBS以1:5的比例稀释复合物。将5μl的复合物加载至镍formvar-包被的网上并风干30分钟至1小时。两种样品均在山羊抗-小鼠IgG中用6nm金-结合的颗粒(Electron Microscopy Sciences)孵育1小时,用10%FCB/PBS以1:30的比例稀释,用PBS洗涤6次(每次2分钟),用dH2O洗涤6次,随后用2%甲基纤维素和4%UA(9:1)的混合物染色持续5分钟。滤纸用于吸干染色剂并风干所述网1小时。两种样品在驴抗-小鼠IgG中用6nm金-结合的颗粒(Jackson ImmunoResearch)孵育过夜,用10%FCB/PBS以1:25稀释,用PBS洗涤6次(每次2分钟),用dH2O水洗涤6次,用1%PTA染色持续5分钟,风干,用2%甲基纤维素覆盖,并风干1小时。在JEOL1400上以80KV进行操作获取显微照片。
结果
ABX(10mg/ml)在体外与4mg/ml BEV共孵育,并且发现他们形成160nm的纳米颗粒(本文称为AB160)。因为IgG1(BEV)的Fab部分是小鼠来源的,因此,含有BEV的颗粒被纯化的山羊抗-小鼠IgG选择性标记,随后以抗-山羊PE作为二抗。作为阴性对照,仅采用抗-山羊PE对样品染色。通过流式细胞仪使颗粒可视化并且相对于单独的ABX(6.7%阳性),结合至AB160的抗-小鼠IgG1显示出明亮的信号(41.2%阳性)(图1A)。为了使BEV与ABX的结合生效,采用金-标记的小鼠抗-人IgG标记BEV并且采用电子显微镜使颗粒可视化(图1B)。意想不到的是,EM图片表明单层BEV围绕ABX纳米颗粒。
为了确定当复合物分解时,紫杉醇仍然结合至何种蛋白质(白蛋白或BEV),制备AB160并收集如下碎片:颗粒(纳米AB160),高于100kD的蛋白质和低于100kD的蛋白质。通过液相色谱-质谱(LC-MS)测量每个碎片中的紫杉醇。大约75%的紫杉醇仍然留在颗粒中,大部分剩余的紫杉醇与包含100kD或更高的蛋白质的碎片结合(图1C,上图),这表明当颗粒解离时,紫杉醇结合至单独的BEV或BEV与白蛋白的异二聚体。这说明解离的复合物包含带有抗体的化疗药物,该复合物仍然可进入高VEGF肿瘤微环境中。这些发现由AB160的上清液的Western印迹分析来证实,Western印迹分析显示出BEV和紫杉醇共定位于大约200kD,尺寸与紫杉醇-BEV-白蛋白复合物的尺寸一致(图1C,下图)。
实施例3:AB160的体外功能
证明了复合物中的两个关键成分(抗体和紫杉醇)在存在于复合物中时保持其功能。
方法
体外毒性:在带有1%PSG和10%FBS的DMEM中培养A375人黑色素瘤细胞系(ATCCManassa,VA)和Daudi B-细胞淋巴瘤细胞系(ATCC Manassa,VA)。收获细胞并将其以0.75x106个细胞/孔的浓度接种于24孔板。在37℃和5%CO2的条件下,细胞暴露于紫杉醇浓度为0至200μg/ml的ABX或AB160过夜。为了测量增殖,使用Click-iT EdU(MolecularProbes,Eugene,OR)试剂盒。简言之,将10mM EdU加至孔中并用细胞和ABX或AB160孵育过夜。用1%皂素对细胞进行透性化处理并且插入的EdU用FITC结合的抗体标记。增殖指数通过每次处理的FITC阳性细胞除以由未处理的EdU标记的细胞的最大增殖来确定。
VEGF ELISA:为了确定BEV是否可仍然结合其配体VEGF,当结合至ABX时,使用标准VEGF ELISA(R and D Systems,Minneapolis,MN)。如所述的那样制备AB160并将2000pg/mlVEGF加至AB160复合物中或单独的ABX中。室温下用纳米颗粒孵育VEGF持续2小时。悬浮液以6000rpm的速度旋转15分钟,收集上清液并通过ELISA测量游离VEGF。简言之,在4℃下用捕获抗体包被ELISA板过夜。对所述板进行洗涤、封闭和标准化,并添加样品。洗涤之后,添加检测抗体并用底物对板进行显色(R and D Systems,Minneapolis,MN)。使用VersamaxELISA酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量450nm的吸光度。采用0至2000pg/ml的标准曲线确定未结合的VEGF的浓度。
结果
在使用人黑色素瘤细胞系A375的体外毒性测试中,AB160具有与单独的ABX类似的毒性,这表明在任一种制剂中紫杉醇发挥同样的作用(图1D)。
为了测试VEGF与AB160复合物中的BEV的结合,将AB160或ABX与VEGF共孵育,除去颗粒,并测试上清液中VEGF内含物。测量的AB160的上清液中缺乏VEGF(<10%VEGF未结合)表明VEGF被AB160复合物中的BEV结合,而当用单独的ABX孵育时VEGF仍然是游离的(>80%VEGF未结合)(图1E)。
重要的是,这些测试表明AB160中的紫杉醇保持其对肿瘤细胞的毒性并且结合的BEV保持与其配体VEGF的结合能力。
实施例4:粒度和蛋白质亲和性
为了理解在BEV与ABX结合时形成的纳米颗粒的特性,测定ABX:BEV复合物相对于ABX的尺寸。
方法
Mastersizer和Nanosight:通过Mastersizer 2000(Malvern Instruments,Westborough,MA)上的动态光散射测量ABX和抗体-ABX药物复合物的粒度。为了测量粒度,将2ml(5mg/ml)的Abraxane或复合物加至样品室。采用Malvern软件进行数据分析并且通过柱状图显示粒度分布。随后使用Nanosight系统(Malvern Instruments,Westborough,MA)验证粒度和稳定性。ABX或复合物颗粒被稀释至合适的范围以精确测量粒度。由粒度分布来显示数据,然而纳米颗粒跟踪分析使用布朗运动以确定粒度。
结合测试:使100μg/ml的生物素化的BEV、利妥昔单抗或曲妥珠单抗结合至链霉亲和素探针(ForteBio Corp.MenloPark,CA)。ABX的结合通过BLItx系统(ForteBioCorp.MenloPark,CA)上1000mg/ml,500mg/ml和100mg/ml条件下的吸光度来测量。结合和解离常数使用BLItx软件计算。
生物膜层干涉(BLItx)技术用于评价BEV与ABX的结合亲和性。生物素化的BEV结合至链霉亲和素探针并且暴露于ABX(1000,500,and 100μg/ml)。BEV和ABX在室温、pH为7的条件下的解离常数(Kd)为2.2x10-8M,与强的非共价相互作用一致。BEV和ABX的结合亲和性在白蛋白和一些细菌蛋白的天然或工程白蛋白结合结构域之间观察到的解离常数的范围内。Nilvebrant,J.等人(2013)Comput Struct Biotechnol J 6:e201303009。
结果
ABX:BEV纳米颗粒一直大于(大约160nm)单独的130nm的ABX(图2a)。纳米颗粒的尺寸与所使用的BEV的浓度直接相关,中值尺寸为0.157至2.166μm(图2A)。考虑到这些研究的目的在于临床I期实验,因此关注最小的ABX:BEV颗粒(AB160),这是因为其与130nm ABX最类似。AB160颗粒的尺寸与ABX加围绕其的单层BEV一致,并且与颗粒的EM图像一致(参见图1B)。
为了确定静脉内给药条件是否影响纳米颗粒粒度分布,评估了在室温、盐水中孵育长达24小时的AB160(或ABX)的粒度分布。AB160粒度分布在长达24小时的时间内没有发生显著改变(图9A和图9B)然而,在室温、4小时时,通过ELISA给出了AB160分解的一些证据(图9C)。
为了确定AB160在血浆中的稳定性,ABX或AB160在盐水或肝素化的人血浆中以相对体积比例为9:1或1:1孵育。值得注意的是,当ABX(图10,上图)或AB160(图10,下图)在等体积血浆中孵育时,没有检测到颗粒(0.01μm至1μm)。
Western印迹(数据未显示)表明,在盐水或肝素化的人血浆中,AB160解离成更小的蛋白结合物,该蛋白结合物仍然包含肿瘤靶向抗体、白蛋白和细胞毒性剂(紫杉醇)。这些蛋白结合物保持其靶向肿瘤的能力,一旦位于肿瘤位点,就可快速溶解并释放细胞毒性有效载荷以有效引起肿瘤退化,而不会由肿瘤细胞内在化整个纳米颗粒。
接下来,为了测试结合亲和性是否为pH依赖的和/或温度依赖的,将ABX悬浮于BEV并且用盐水在pH为3、5、7或9的条件下稀释混合物,随后在不同的温度(RT,37℃和58℃)条件下进行孵育,以形成颗粒。ABX和BEV的结合亲和性是pH依赖且温度依赖的,观察到在pH为5、温度为58℃条件下形成的颗粒具有最高的结合亲和性(图2B)。
为了确定58℃、pH为5的条件下的BEV和ABX的较高的结合亲和性是否转化为复合物的稳定性,通过纳米颗粒跟踪分析(Nanosight)比较了各种不同的制剂。在58℃且pH为5的条件下制备的AB160(AB1600558)、在室温且pH为7的条件下制备的AB160(AB16007),或在58℃且pH为7条件下制备的AB160(AB1600758)在人AB血清中孵育0分钟、15分钟、30分钟或60分钟后,将它们的稳定性与暴露于相同条件的ABX(分别为ABX0558,ABX07和ABX0758)进行比较。
如在暴露于人AB血清之后每mgABX中存在的颗粒数所表示的,在较高亲和性条件(pH 7且温度为58℃)下制备的颗粒也更加稳定。在人血清中AB160颗粒表现出稳定性增加,这与它们的结合亲和性相关联。具体而言,如通过每mgABX测量的颗粒尺寸和颗粒数所确定的(图2C和表3),AB16007和AB1600558相比于单独的ABX在盐水和人血清中均更加稳定。这说明AB160颗粒的稳定性可通过改变形成AB160颗粒的条件进行调控。
表3:人AB血清中AB160和ABX的稳定性
颗粒/mg ABX x 108
这些数据表明BEV以皮摩尔范围内的亲和性结合至ABX,这证明了强的非共价键并且表明粒度分布与被单层抗体分子围绕的ABX一致,所产生的颗粒的尺寸依赖于抗体浓度。
实施例5:AB160在小鼠体内的疗效
植入无胸腺裸鼠体内的A375人黑色素瘤细胞的异种移植模型用于测试AB160的体内疗效。
方法
体内实验进行至少两次。那些实验所需的小鼠数量通过功效分析确定。每周测量2-3次小鼠肿瘤并且当肿瘤为10重量%时宰杀小鼠。治疗后监测已完成肿瘤反应的小鼠持续60天至80天。小鼠研究的终点是中值生存期。生成Kaplan-Meier曲线并进行Mantle-Cox测试以确定治疗组之间的中值生存期的显著性。所提供的体外结果代表至少5次重复试验。相对于基线的体外和体内变化百分比的统计学分析使用Student’s-t测试完成。
小鼠模型:为了测试肿瘤疗效,将1x106个A375人黑色素瘤细胞接种于无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,IN)的右侧肋腹。当肿瘤尺寸已达到约700mm3时,随机分配小鼠并用PBS,ABX(30mg/kg),BEV(12mg/kg),BEV随后ABX或上述浓度的AB160进行治疗。对于测试更大的AB颗粒的小鼠实验而言,产生较大颗粒所需的最高剂量的BEV(45mg/kg)用于仅BEV治疗组。每周3次监测肿瘤尺寸并且使用如下方程计算肿瘤体积:(长度*宽度2)/2。当肿瘤尺寸等于小鼠体重的10%或约2500mm3时,宰杀小鼠。相对于基线第7天的变化百分比如下计算:[(治疗当天的肿瘤尺寸-第7天的肿瘤尺寸)/治疗当天的肿瘤尺寸]*100。AR160的体内测试类似,除了将5x106个Daudi细胞注射至无胸腺裸鼠的右侧肋腹。
结果
测试了AB160相对于PBS,单独的单个药物以及顺序给药的药物。与所有其他治疗组相比,用AB160治疗的小鼠在治疗后第7天肿瘤尺寸相对于基线显著减小(图3A)。用AB160治疗的所有小鼠中的肿瘤在第7天衰退并且这种肿瘤反应转化为AB160组相对于所有其他组显著增加的中值生存期(图3B),PBS组(p<0.0001),BEV组(p=0.003),ABX组(p=0.0003),BEV+ABX组(p=0.0006)和AB160组的生存期分别为7天、14天、14天、18天和33天。
较大的肿瘤有可能具有较高的局部VEGF浓度。当基于治疗当天的肿瘤尺寸(<700mm3和>700mm3)分析数据时,较大的肿瘤显示出对AB160具有较高的反应,这说明较高的肿瘤VEGF浓度吸引更多的BEV靶向的ABX至肿瘤。AB160组相对于基线的变化百分比具有显著性差异(p=0.0057)。该观察结果在仅ABX组(p=0.752)中没有看到,其中,ABX没有靶向能力(图3C)。
如图2A所示,使用增加的BEV:ABX比例制备尺寸增加的颗粒。肿瘤衰退和中值生存期与增加的粒度正相关,这说明较大的颗粒的生物分布相对于较小的颗粒可发生改变(图3D和3E)。在小鼠上进行了全部毒性研究并且没有出现毒性。
实施例6:小鼠体内的紫杉醇药代动力学
为了比较AB160和ABX的药代动力学(pk),测量在给药AB160和ABX 0小时、4小时、8小时、12小时和24小时的小鼠体内的紫杉醇血药浓度。
方法
紫杉醇药代动力学:使用与Agilent Poroshell 120 EC-C18分析柱(2.1x100mm,2.7μm Chrom Tech,Apple Valley,MN)连接的Agilent Poroshell 120 EC-C18预柱(2.1x5mm,2.7μm,Chrom Tech,Apple Valley,MN),在40℃下,完成紫杉醇和d5紫杉醇的液相色谱分离,采用由含0.1%甲酸的水(A)和含0.1%甲酸的ACN(B)构成的梯度流动相以0.5ml/分钟的恒定流速进行洗脱。以60%A和40%B开始洗脱持续0.5分钟,随后将B从40%线性增加至85%持续4.5分钟,保持85%B持续0.2分钟,回到起始条件持续1.3分钟。自动进样器温度为10℃并且样品注射体积为2μl。使用ESI正离子模式的质谱仪,在毛细管电压为1.75kV,源温度为150℃,脱溶剂温度500℃,锥孔气流150L/小时,脱溶剂气流为1000L/小时的条件下,采用停留时间为0.075秒的多反应监测(MRM)扫描模式,完成紫杉醇和内标d5-紫杉醇的检测。通过MassLynx-Intellistart,v4.1软件确定锥孔电压和碰撞能量,其分别为6至16V和12至60eV。对于紫杉醇而言,在m/z 854.3>105.2条件下监测MRM前体和产品离子,对于d5紫杉醇而言,在m/z 859.3>291.2条件下监测MRM前体和产品离子。紫杉醇的初始母液(EtOH中1mg/ml)和d5紫杉醇的初始母液(EtOH中1mg/ml)在4ml琥珀色硅烷化的玻璃小瓶中制备并且储存在-20℃。通过用ACN在2ml琥珀色硅烷化的玻璃小瓶中稀释母液制备工作标准并且储存在-20℃。血浆样品如下提取:将100μl血浆样品加至含有d5紫杉醇(116.4nM或100ng/ml)和300μl ACN的1.7ml微离心管中,震荡,室温下孵育10分钟以沉淀蛋白质,并离心(14,000rpm)3分钟。在Agilent Captiva NDlipids板(Chrom Tech,Apple Valley,MN)上过滤上清液,将其收集在深96孔板中,并且使用氮气干燥。使用100μl ACN复溶样品并且在板振荡器上(高速)震荡5分钟。每天制作包含紫杉醇(0.59-5855nM或0.5-5000ng/ml)和d5紫杉醇(116.4nM)的血浆标准曲线,用于紫杉醇定量。小鼠肿瘤在冰上解冻、称重并在1xPBS中稀释成2部分(重量至体积)。随后采用使用锯齿探针(5mm x 75mm)的PRO200组织匀浆器使肿瘤均质化。随后以与人血浆样品相同的方式处理肿瘤匀浆。
小鼠成像:制备阿瓦斯汀和IgG对照溶液并且根据规程(Imanis Life Sciences)用I-125标记。简言之,将Tris缓冲液(0.125M Tris-HCl,pH 6.8,0.15M NaCl)和5mCiNa125I直接加至碘化管中(ThermoFischer Scientific,Waltham,MA)。使碘化物活化并且在室温下旋转。活化的碘化物与蛋白质溶液混合。加入50μl Scavenging缓冲液(PBS中10mg酪氨酸/mL,pH 7.4)并孵育5分钟。在加入Tris/BSA缓冲液并混合之后,将样品施加于10KMWCO透析盒中,在4℃下,由预先冷却的PBS透析30分钟、1小时、2小时和过夜。由伽马计数器确定辐射活性,随后计算每分钟衰变数(DPM)和具体活性。在小鼠尾静脉注射阿瓦斯汀I-125,Abraxane-阿瓦斯汀I-125,Abraxane-人IgG I-125或仅仅Abraxane。在给药后3小时、10小时、24小时和72小时通过SPECT-CT成像使用U-SPECT-II/CT扫描仪(MILabs,Utrecht,The Netherlands)对动物进行成像。使用POSEM(像素化有序子集期望最大值法(pixelatedordered subsets by expectation maximization))算法进行SPECT重构。在Feldkamp算法过程中进行CT数据重构。相互配准的图像使用PMOD软件(PMOD Technologies,Zurich,Switzerland)进一步着色和可视化。注射后72小时宰杀动物并解剖。所选择的感兴趣的组织和器官使用放射性核素活度计(Capintec CRC-127R,Capintec Inc.)测量。
结果
第一pk实验的结果在图4A和图4B中提供。计算了带有A375肿瘤和不带有肿瘤的小鼠体内的曲线下面积(AUC)和最大血清浓度(Cmax)。在第一pk实验中,在不带有肿瘤的小鼠体内,AB160和ABX的Cmax和AUC非常类似(分别为63.3+/-39.4和65.5+/-14.4以及129和133μg/m)。然而,在带有肿瘤的小鼠体内,各治疗组的Cmax和AUC是有差异的(分别为55.7+/-21.2和63.3+/-17.3以及112和128μg/ml)(图4C)。虽然该差异不是统计学上显著的,但是这与AB160相对于ABX的更好的靶向作用一致。
第二pk实验采用另外较早的时间点和大肿瘤尺寸以及小肿瘤尺寸进行(图4D至图4F)。该实验的结果表明相对于不带有肿瘤的小鼠的AUC,带有肿瘤的小鼠的AUC较小,相对于小肿瘤小鼠,大肿瘤小鼠具有最低的紫杉醇血药值(ABX治疗的不带有肿瘤的小鼠,带有小肿瘤的小鼠和带有大肿瘤的小鼠分别为80.4+/-2.7,48.4+/-12.3,和30.7+/-5.2;AB160治疗的不带有肿瘤的小鼠,带有小肿瘤的小鼠和带有大肿瘤的小鼠分别为66.1+/-19.8,44.4+/-12.1和22.8+/-6.9)。类似地,带有较大肿瘤的小鼠的两个治疗组的Cmax下降(ABX治疗组为47.2,28.9和19.7μg/ml以及AB160治疗组为40.1,26.9和15.3μg/ml)。AB160治疗的小鼠的血液中紫杉醇的AUC和Cmax比ABX治疗的小鼠的血液中紫杉醇的AUC和Cmax低。虽然没有统计学上的显著性,但是该数据也和用AB160治疗的肿瘤中较多的紫杉醇沉积一致。
为了直接测试这种假设,通过LC-MS测量肿瘤紫杉醇浓度。在4小时(3473μg/mg组织+/-340相对于2127μg/mg组织+/-3.5;p=0.02)和8小时(3005μg/mg组织+/-146相对于1688μg/mg组织+/-146;p=0.01)时间点,用AB160治疗的肿瘤中的肿瘤紫杉醇浓度显著高于用ABX治疗的肿瘤中的肿瘤紫杉醇浓度,这表明当被抗体靶定时,紫杉醇在肿瘤中停留较长时间(图4H)。这解释了血液pk并且与药物重新分布至组织(包括肿瘤)一致。
I-125标记的AB160(Abx-AvtI125)和结合ABX的IgG同种型(Abx-IgGI125)的体内活细胞成像证实了LC-MS的结果,注射后3小时(32.2uCi/g+/-9.1相对于18.5uCi/g+/-1.65;p=0.06)和10小时(41.5uCi/g+/-6.4相对于28.7uCi/g+/-2.66;p=0.03),用AB160治疗的小鼠的肿瘤中的I-125水平高于IgG-ABX(图4I和图4J)。综上,这些数据说明BEV和ABX的结合改变了血液pk,并且这种改变是由于药物向肿瘤组织的重新分布引起的,如通过紫杉醇的LC-MS和BEV的I-125标记相对于同种型匹配的IgG1所显示的。
不受理论的限制,认为通过靶向肿瘤的抗体结合至ABX,pk比单独的ABX发生更加显著的改变,血液中Cmax和AUC降低是由于AB160重新分布至肿瘤组织。这些来自小鼠血液紫杉醇pk,紫杉醇的肿瘤组织水平和用AB160治疗的小鼠体内的I-125辐射活性水平相对于单独用ABX治疗的小鼠体内的I-125辐射活性水平的结果表明ABX的抗体靶向改变了紫杉醇的生物分布,这样更高水平的紫杉醇到达肿瘤并且停留在肿瘤位点持续更长的时间段,从而加强肿瘤衰退。
实施例7:其他治疗性抗体的结合
测试了抗-人CD20抗体(利妥昔单抗)和抗-HER2/neu受体抗体(曲妥珠单抗)和ABX的结合以确定其他IgG治疗性抗体是否也在体外结合时表现出结合至ABX。
方法
制备包含利妥昔单抗或曲妥珠单抗的纳米颗粒并且如上述实施例那样进行测试。
结果
含有BEV的复合物的粒度与含有曲妥珠单抗的复合物的粒度非常类似,平均粒度分别为约0.157至2.166μm(图2A)和0.148至2.868μm(图5B)。相反,采用利妥昔单抗形成的颗粒在较低的抗体:ABX比例条件下变得大得多,粒度为0.159至8.286μm(图5A)。
在不同的pH条件下通过BLItz测定利妥昔单抗和曲妥珠单抗与ABX的结合亲和性。这两种抗体均以在皮摩尔范围内的相对高的亲和性发生结合(图5C)。随着pH升高,利妥昔单抗与ABX的亲和性降低,但是曲妥珠单抗与ABX的亲和性不受pH的影响(图5C)。
在体外和体内测试了由利妥昔单抗制备的160nm颗粒(AR160)的疗效。在体外,在紫杉醇浓度增加(0-200μg/ml)的条件下,用AR160,ABX或单独的利妥昔单抗治疗B-细胞淋巴瘤细胞系Daudi。与ABX(IC50>200μg/ml)或单独的利妥昔单抗(IC50>200μg/ml)相比,AR160(IC50=10μg/ml)治疗24小时(p=0.024)显著抑制Daudi细胞的增殖(图6A)。
在体内,在无胸腺裸鼠体内建立Daudi细胞的异种移植模型。一旦产生肿瘤,就采用PBS,ABX,利妥昔单抗,顺序给药的ABX和利妥昔单抗或AR160治疗小鼠。在治疗后第7天,测量肿瘤并且计算相对于基线的肿瘤尺寸的变化百分比。AR160治疗的肿瘤衰退或保持稳定,而所有其他治疗组的肿瘤恶化(图6B)。AR160组中相对于基线肿瘤尺寸的变化百分比与所有其他组相比具有显著性(p<0.0001)。与分别用PBS(p<0.0001),ABX(p<0.0001)或利妥昔单抗(p=0.0002)治疗的小鼠的12天、16天和12天的中值生存期相比,用AR160治疗的小鼠具有大于60天的显著更长的中值生存期(图6C)。然而,AR160的中值生存期与顺序治疗组的中值生存期没有显著性差异(p=0.36)。这可能是因为利妥昔单抗结合至肿瘤细胞并且保留在细胞表面,当其进入肿瘤位点时允许后续给药的ABX结合至抗体,不像BEV,其结合可溶的靶点并且不是细胞表面标志物。
实施例8:其他化疗药物与AB160的结合
评估了其他化疗药物形成的功能纳米颗粒的疗效。
方法
制备包含顺铂的纳米颗粒并且如上述实施例所描述的那样进行测试。
结果
为了测试另一化疗药物是否与AB160颗粒结合,将顺铂与ABX共孵育并且通过HPLC测量上清液中残留的游离顺铂的量。大约60%的顺铂(即,仅40%留在上清液中)结合至ABX(图7A)。
接下来,使用A375细胞测试AC相对于ABX和单独的顺铂的肿瘤毒性。对复合物进行离心以除去较高毒性的未结合的顺铂并且复溶于介质中以确保AC相对于ABX的任何额外的毒性是仅由ABX结合的顺铂引起的。类似地,仅ABX以类似的方式进行离心。AC(IC50=90μg/ml)比单独的ABX(IC50>1000μg/ml)在更大程度上抑制A375的增殖(图7B)。相对于其他毒性实验,该实验中降低的毒性是由于离心步骤中药物的一些损失引起的,但是ABX和AC的比较仍然有意义。
为了确定含有顺铂的AB160复合物的肿瘤毒性,将AB160与顺铂共孵育以形成含有顺铂的颗粒(ABC复合物)。在A375黑色素瘤异种移植模型中相对于每个单独的药物和AB160测试ABC复合物。使用AB160,顺序给药的AB160+顺铂以及ABC复合物治疗的肿瘤在治疗之后7天均显示出肿瘤尺寸减小(图7C),但是ABC复合物产生最长的中值生存期(35天,相对于AB160和AB160+顺铂分别为24天和26天)。虽然没有统计学上的显著性差异(p=0.82和0.79)(图7D),但是数据与ABC复合物的长期生存率益处一致。
这些数据表明ABX的白蛋白部分为结合其他治疗性抗体(例如利妥昔单抗和曲妥珠单抗)以及结合其他化疗剂(例如,顺铂)提供了平台,这均与AB160在体外和体内具有类似的疗效。
综合这些数据证明了构建通用的纳米-免疫结合物的简单方式,其使得多种蛋白质或细胞毒性药剂结合至单个白蛋白骨架。在小鼠模型中证明了相对于单个药剂靶向药物的疗效得到改善,这至少部分由抗体靶向的药物的pk改变引起。而且,不受理论限制,本文公开的无需连接体或靶细胞内在化的纳米-免疫结合物的通用性可克服其他纳米药物在将结果从小鼠转化至人类时所面临的障碍。
实施例9:AB160的冻干
AB160通过将8mg(320μl)贝伐单抗加至20mg Abraxane来合成。随后加入1.66ml0.9%的盐水,使最终体积为2ml,贝伐单抗的最终浓度为4mg/ml且Abraxane的最终浓度为10mg/ml,并且使混合物在室温下在15ml聚丙烯圆锥管中孵育30分钟。
30分钟的室温孵育之后,以1:2的比例在0.9%的盐水中稀释混合物至贝伐单抗和Abraxane分别为2mg/ml和5mg/ml。这些是由给药于患者的药方制备的两种药物的浓度。
AB160分成20个1.5ml聚丙烯eppendorf中200μl的等份并在-80℃下冷冻。
一旦冷冻,采用Virtis 3L benchtop冻干器(SP Scientific,Warmister,PA)打开制冷将各个等份过夜冻干。生成冻干的制剂。
在相同的1.5ml聚丙烯eppendorf中,将干燥的等份储存在室温下。这些样品易于在室温在盐水中复溶30分钟,随后在2000x g条件下离心7分钟。随后,根据需要,将得到的样品重悬于合适的缓冲剂中。
通过比较,通过加热和快速真空干燥的样品不能复溶。
实施例10:冻干的制剂的测试
在冻干后的不同时间点复溶样品并且测试它们相对于ABX和新鲜制备的AB160的物理性质。
如上所述的那样评估粒度分布。
通过样品与VEGF在室温下孵育2小时,在2000x g条件下离心7分钟对VEGF结合进行评估。结合至小粒(对应于纳米颗粒)的VEGF的量或保留在上清液中的VEGF的量由ELISA测量。
通过细胞毒性在体外评价紫杉醇针对A375细胞的活性。
意想不到的是,如通过抑制癌细胞增殖的能力所显示的,冻干并未显著影响粒度、VEGF结合或紫杉醇的活性。储存1个月(图8A至8C)或10个月(图8D至8F)的冻干样品保持该结果。
更意想不到的是,这些结果在未使用冷冻保护剂或其他可不利地影响人的治疗应用的试剂的冻干的纳米颗粒中观察到。
实施例11:AB160在人体中的疗效
在1期首次人体临床试验中测试AB160,测试AB160给药于患有转移性恶性黑色素瘤的先前治疗已失败的患者的安全性。研究使用典型3+3,1期临床试验设计,测试下列模式中AB160的3个不同剂量:
表4
*剂量水平1是指起始剂量
选择与目前用于临床实践中的Abraxane的剂量相关的剂量。在每个治疗剂量之前制备AB160。治疗作为在28天治疗循环的第1天、第8天和第15天30分钟的静脉内输注来施用。继续治疗直至不耐受毒性,肿瘤恶化或患者拒绝。在每个治疗循环之前,评估对患者的毒性,每隔一个循环进行肿瘤评估(RECIST)。
研究通过与治疗循环1和治疗循环2的剂量1相关的正式(患者体内)药代动力学研究来完成。
5位患者已被给药AB160,100mg/m2的ABX和40mg/m2的BEV,对5位患者中的4位进行分析。
表5:I期研究中的疾病过程
PFS是指无恶化中值生存期,即,癌症复发之前的治疗天数。不良事件列于下表。没有剂量限制性毒性(DLT),即,不良事件与AB160的剂量不相关。更加详细的细节列于表6。
表6:I期研究中的不良事件
平均PFS为7.6个月并且中值为7.0个月。
与其他临床试验的比较
下表显示了其他公开的用于转移的黑色素瘤的紫杉烷疗法临床研究。
在目前的试验中,AB160颗粒的给药相当于100mg/m2的abraxane和40mg/m2贝伐单抗的剂量。只有Spitler的研究使用单独的BEV和ABX。然而,Spitler使用更高剂量的ABX。如果剂量调节至平均患者的话(假设表面积为1.9m2且质量为90kg),本研究还使用了低于先前研究中所报道的BEV剂量的10%的剂量。
Spilter还检测了先前尚未进行治疗的患者,而本研究检测了先前治疗失败的患者。先前的无效治疗不仅仅花费了预期的PFS的时间,而且还选择了对治疗更加具有耐受性的癌细胞,并且通常留下了身体条件不太好的患者。因此,“挽救”疗法(如本文的采用AB160)中的患者群的PFS预期比初始群的PFS更低。这可在2期临床试验中看到(Hersh等人,Cancer,January 2010,116:155),其测试了使用单独的Abraxane的挽救患者和初始患者。对于先前采用单独的Abraxane治疗的患者而言,PFS为3.5个月,Hersh等人,Ann.Oncol2015,(epub September 26,2015),采用单独的ABX治疗的初始患者的PFS报道为4.8个月。
表9:在针对公布的数据的有限的研究中AB160的性能
因此,使用AB160的I期临床试验的早期结果显示先前治疗的患者中的晚期转移的恶性黑色素瘤的PFS增加。这种增加特别意想不到,PFS高于Spitler中那些患者,他们是初始化疗并且给药更高剂量的Abraxane以及几乎12倍的贝伐单抗的剂量。AB160中使用的BEV的剂量远远低于任何其他研究,因此,最佳比较不是Spitler,而是Hersh。
因此,ABX/BEV复合物(AB160)优于顺序给药的ABX和BEV或单独的ABX,并且以非常低的BEV有效剂量实现了这种优良的结果。因此,数据与AB160使化疗药剂靶向肿瘤得到改善一致,并且这种靶向由BEV介导。因为白蛋白被肿瘤选择性摄取,所以ABX纳米颗粒可能有助于使BEV靶向肿瘤。BEV/ABX复合物的存在也有可能在体内显示出比Abraxane更好的稳定性。
实施例12:研究采用BEV预治疗是否改善靶向的跟踪研究
根据上述总体规程,向无胸腺裸鼠的右侧肋腹注射1x106个A375人黑色素瘤细胞并随后采用PBS,12mg/kgBEV,30mg/kg ABX,AB160或用1.2mg/kgBEV预治疗并在24小时后使用AB160治疗。数据表示治疗后第7天和第10天的肿瘤体积(mm3)。图11A至E跟踪10天的肿瘤体积。只有用AB160治疗的小鼠(采用BEV预先治疗或不采用BEV预先治疗)表现出平均肿瘤体积减小。参见图11F和图11G。
如图11F所总结的,治疗后第7天的数据显示采用BEV预先治疗与肿瘤体积相对于对照或单独的BEV(p≤0.0001)或单独的ABX(p≤0.0001)发生统计学上的显著减小有关。
如图11G所总结的,治疗后第10天的数据再次显示采用BEV预先治疗与肿瘤体积相对于对照或单独的BEV(p≤0.0001)或单独的ABX(p≤0.0001)发生统计学上的显著减小有关。在AB160之前采用BEV预先治疗还与肿瘤体积相对于单独的AB160(p=0.02)减小有关,在两只小鼠体内产生完全反应。
在该实验中,12mg/kg BEV的剂量不是治疗的。加至预先治疗组中的BEV的量仅为1.2mg/kg,这是小鼠中的常规剂量的十分之一。然而,采用亚治疗剂量的预先治疗看起来显示出AB160纳米颗粒的疗效得到改善。该数据支持如下想法:采用亚治疗量的BEV进行预先治疗可清除VEGF的全身水平,留下肿瘤中相对较高的浓度,这样由AB160纳米颗粒靶向肿瘤相关的VEGF更加有效。
实施例13:递送纳米颗粒的可选方式
本发明的纳米颗粒被认为可直接递送至肿瘤。例如,纳米颗粒可通过动脉内置管递送或通过直接注射至肿瘤内部。在这些实施方式中,较大的纳米颗粒(例如,580nm或1130nm)被认为可通过直接注射至肿瘤内部或肿瘤附近来递送。
Claims (81)
1.包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含:
a.载体蛋白,
b.约100个至约1000个抗体,和
c.任选地至少一种治疗剂,
其中,所述抗体排布在所述纳米颗粒的外表面,并且其中,在使用水性溶液复溶所述冻干的组合物之后,所述抗体保持其与所述纳米颗粒的外表面的结合,条件是所述冻干的组合物在约20℃至约25℃条件下稳定至少3个月,并且,其中,所述纳米颗粒能够在体内结合预定的表位。
2.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含约400个至约800个抗体。
3.如权利要求1或2所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述纳米颗粒的平均尺寸为130nm至14,000nm。
4.如权利要求3所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述纳米颗粒的平均尺寸为130nm至1000nm。
5.如权利要求3所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述纳米颗粒的平均尺寸为130nm至800nm。
6.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物中少于0.01%的纳米颗粒的尺寸大于800nm。
7.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物中少于0.01%的纳米颗粒的尺寸选自:大于200nm,大于300nm,大于400nm,大于500nm,大于600nm和大于700nm。
8.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述至少一种治疗剂位于所述纳米颗粒的内部,排布于所述纳米颗粒的外表面,或这两者。
9.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述抗体选自:ado-曲妥珠单抗emtansine,阿仑单抗,贝伐单抗,西妥昔单抗,地诺单抗,dinutuximab,伊匹单抗,纳武单抗,obinutuzumab,奥法木单抗,帕尼单抗,派姆单抗(pembrolizumab),帕妥珠单抗,利妥昔单抗和曲妥珠单抗。
10.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述至少一种治疗剂选自:阿比特龙(abiraterone),苯达莫司汀(bendamustine),硼替佐米(bortezomib),卡铂(carboplatin),卡巴他赛(cabazitaxel),顺铂(cisplatin),苯丁酸氮芥(chlorambucil),达沙替尼(dasatinib),多西他赛(docetaxel),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin),厄洛替尼(erlotinib),依托泊苷(etoposide),依维莫司(everolimus),吉非替尼(gefitinib),柔红霉素(idarubicin),伊马替尼(imatinib),羟基脲(hydroxyurea),伊马替尼(imatinib),拉帕替尼(lapatinib),亮丙瑞林(leuprorelin),美法仑(melphalan),氨甲蝶呤(methotrexate),二羟蒽酮(mitoxantrone),奈达铂(nedaplatin),尼罗替尼(nilotinib),奥沙利铂(oxaliplatin),紫杉醇(paclitaxel),帕唑帕尼(pazopanib),培美曲塞(pemetrexed),吡铂(picoplatin),罗米地辛(romidepsin),沙铂(satraplatin),索拉非尼(sorafenib),威罗菲尼(vemurafenib),舒尼替尼(sunitinib),替尼泊苷(teniposide),三铂(triplatin),长春花碱(vinblastine),长春瑞滨(vinorelbine),长春新碱(vincristine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)。
11.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述载体蛋白选自:白蛋白,明胶,弹性蛋白,醇溶蛋白,豆球蛋白,玉米蛋白,大豆蛋白,乳蛋白和乳清蛋白。
12.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述白蛋白是人血清白蛋白。
13.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述抗体排布成所述纳米颗粒的全部表面或部分表面上的基本单层抗体。
14.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述抗体、载体蛋白和存在的治疗剂通过非共价键结合。
15.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物被配制成用于静脉内递送。
16.如上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物中纳米颗粒的平均尺寸为大于800nm至约3.5μm。
17.如权利要求16所述的冻干的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物被配制成用于直接注射至肿瘤内或灌注至肿瘤内。
18.如上述权利要求中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述纳米颗粒的解离常数为约1x10-11M至约1x10-9M。
19.制备上述权利要求中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物的方法,其中,所述方法包括:
a.使所述载体蛋白和所述任选地至少一种治疗剂与在pH为5.0或更高且温度为约5℃至约60℃的溶液中与所述抗体接触,以生成纳米颗粒;以及
b.冻干所述纳米颗粒。
20.如权利要求19所述的方法,其中,所述温度为约55℃至约60℃。
21.包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含:
a.白蛋白结合的紫杉醇核心,和
b.排布在所述白蛋白结合的紫杉醇核心的表面上的约400个分子至约800个分子的贝伐单抗,这样,抗体的结合部分从所述表面指向外部,
其中,在用水性溶液复溶所述冻干的组合物之后,所述抗体保持其与所述纳米颗粒的表面的结合,条件是所述冻干的组合物在约20℃至约25℃下稳定至少3个月并且复溶的纳米颗粒能够在体内结合VEGF。
22.包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含:
a.白蛋白结合的紫杉醇核心,和
b.排布在所述白蛋白结合的紫杉醇核心的表面上的一定量的贝伐单抗,这样,所述抗体的结合部分从所述表面指向外部,
其中,在用水性溶液复溶所述冻干的组合物之后,所述抗体保持其与所述纳米颗粒的表面的结合,条件是所述冻干的组合物在约20℃至约25℃下稳定至少3个月并且复溶的纳米颗粒能够在体内结合VEGF,并且其中,复溶的纳米颗粒的平均尺寸为大于800nm至约3.5μm。
23.如权利要求21所述的纳米颗粒组合物,其中,白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的重量比为约5∶1至约1∶1。
24.如权利要求23所述的纳米颗粒组合物,其中,白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的重量比为约10∶4。
25.如权利要求22所述的纳米颗粒组合物,其中,白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的重量比为高于1∶1至约1∶3。
26.如权利要求21,23或24所述的纳米颗粒组合物,其中,所述贝伐单抗是所述纳米颗粒的全部表面或部分表面上的基本单层抗体。
27.如权利要求21至26中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述贝伐单抗通过非共价键结合至所述核心。
28.如权利要求21至27中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述白蛋白是人血清白蛋白。
29.如权利要求21至28中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物中少于0.01%的纳米颗粒的尺寸选自:大于200nm,大于300nm,大于400nm,大于500nm,大于600nm,大于700nm和大于800nm。
30.如权利要求29所述的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物被配制成用于静脉内递送。
31.如权利要求21至29中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物被配制成用于直接注射至肿瘤内或灌注至肿瘤内。
32.如权利要求21至31中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述纳米颗粒进一步包含至少一种额外的治疗剂,该治疗剂不是紫杉醇或贝伐单抗。
33.如权利要求32所述的纳米颗粒组合物,其中,所述至少一种额外的治疗剂被排布在所述纳米颗粒的外表面。
34.如权利要求32或33所述的纳米颗粒组合物,其中,所述至少一种额外的治疗剂选自:阿比特龙(abiraterone),苯达莫司汀(bendamustine),硼替佐米(bortezomib),卡铂(carboplatin),卡巴他赛(cabazitaxel),顺铂(cisplatin),苯丁酸氮芥(chlorambucil),达沙替尼(dasatinib),多西他赛(docetaxel),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin),厄洛替尼(erlotinib),依托泊苷(etoposide),依维莫司(everolimus),吉西他滨(gemcitabine),吉非替尼(gefitinib),柔红霉素(idarubicin),伊马替尼(imatinib),羟基脲(hydroxyurea),伊马替尼(imatinib),拉帕替尼(lapatinib),亮丙瑞林(leuprorelin),美法仑(melphalan),氨甲蝶呤(methotrexate),二羟蒽酮(mitoxantrone),奈达铂(nedaplatin),尼罗替尼(nilotinib),奥沙利铂(oxaliplatin),帕唑帕尼(pazopanib),培美曲塞(pemetrexed),吡铂(picoplatin),罗米地辛(romidepsin),沙铂(satraplatin),索拉非尼(sorafenib),威罗菲尼(vemurafenib),舒尼替尼(sunitinib),替尼泊苷(teniposide),三铂(triplatin),长春花碱(vinblastine),长春瑞滨(vinorelbine),长春新碱(vincristine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)。
35.如权利要求21至34中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述纳米颗粒的解离常数为约1x10-11M至约1x10-9M。
36.制备权利要求21至35中任一项所述的冻干的纳米颗粒组合物的方法,其中,所述方法包括使白蛋白和紫杉醇在pH为5.0至7.5且温度为约23℃至约60℃的溶液中与贝伐单抗接触以形成纳米颗粒组合物,并且冻干所述纳米颗粒组合物。
37.如权利要求36所述的方法,其中,所述温度为约55℃至约60℃。
38.治疗癌细胞的方法,所述方法包括使细胞与有效量的权利要求1至18或21至35中任一项所述的纳米颗粒组合物接触,从而治疗所述癌细胞。
39.治疗有此治疗需求的患者体内的肿瘤的方法,所述方法包括将治疗有效量的权利要求1至18或21至35中任一项所述的纳米颗粒组合物给药于所述患者,从而治疗所述肿瘤。
40.如权利要求39所述的方法,其中,所述肿瘤的尺寸减小。
41.如权利要求39所述的方法,其中,所述纳米颗粒组合物静脉内给药。
42.如权利要求39所述的方法,其中,所述纳米颗粒组合物通过直接注射或灌注至肿瘤内给药。
43.如权利要求39至42中任一项所述的方法,其包括:
a.每周一次给药所述纳米颗粒组合物持续三周;
b.停止给药所述纳米颗粒组合物持续一周;以及
c.根据需要重复步骤a)和b)以治疗所述肿瘤。
44.如权利要求39至43中任一项所述的方法,其中,所述治疗有效量包括约75mg/m2至约175mg/m2的紫杉醇。
45.如权利要求39至44中任一项所述的方法,其中,所述治疗有效量包括约30mg/m2至约70mg/m2的贝伐单抗。
46.包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含:
a.载体蛋白;
b.约400个至约800个抗体;和
c.任选地至少一种治疗剂,该治疗剂不是紫杉醇,
其中,所述抗体排布在所述纳米颗粒的表面,这样,所述抗体的结合部分从所述表面指向外部,并且,其中,所述纳米颗粒能够在体内结合至预定的表位。
47.包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物,其中,每个纳米颗粒包含:
a.载体蛋白,其不是白蛋白;
b.约400个至约800个抗体;以及
c.任选地至少一种治疗剂,
其中,所述抗体排布在所述纳米颗粒的表面,这样,所述抗体的结合部分从所述表面指向外部,并且,其中,所述纳米颗粒能够在体内结合至预定的表位。
48.如权利要求46或47所述的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物中少于0.01%的纳米颗粒的尺寸大于800nm。
49.如权利要求46至48中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物中少于0.01%的纳米颗粒的尺寸选自:大于400nm,大于500nm,大于600nm和大于700nm。
50.如权利要求46至49中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述至少一种治疗剂位于所述纳米颗粒的内部。
51.如权利要求46至50中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述至少一种治疗剂位于所述纳米颗粒的外表面。
52.如权利要求46至51中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述至少一种治疗剂位于所述纳米颗粒的内部和所述纳米颗粒的外表面。
53.如权利要求46至52中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述纳米颗粒组合物包含约400个至约800个抗体。
54.如权利要求46至53中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述抗体选自:ado-曲妥珠单抗emtansine,阿仑单抗,贝伐单抗,西妥昔单抗,地诺单抗,dinutuximab,伊匹单抗,纳武单抗,obinutuzumab,奥法木单抗,帕尼单抗,派姆单抗(pembrolizumab),帕妥珠单抗,利妥昔单抗和曲妥珠单抗。
55.如权利要求46至54中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述至少一种治疗剂选自:阿比特龙(abiraterone),苯达莫司汀(bendamustine),硼替佐米(bortezomib),卡铂(carboplatin),卡巴他赛(cabazitaxel),顺铂(cisplatin),苯丁酸氮芥(chlorambucil),达沙替尼(dasatinib),多西他赛(docetaxel),阿霉素(doxorubicin),表柔比星(epirubicin),厄洛替尼(erlotinib),依托泊苷(etoposide),依维莫司(everolimus),吉非替尼(gefitinib),柔红霉素(idarubicin),伊马替尼(imatinib),羟基脲(hydroxyurea),伊马替尼(imatinib),拉帕替尼(lapatinib),亮丙瑞林(leuprorelin),美法仑(melphalan),氨甲蝶呤(methotrexate),二羟蒽酮(mitoxantrone),奈达铂(nedaplatin),尼罗替尼(nilotinib),奥沙利铂(oxaliplatin),紫杉醇(paclitaxel),帕唑帕尼(pazopanib),培美曲塞(pemetrexed),吡铂(picoplatin),罗米地辛(romidepsin),沙铂(satraplatin),索拉非尼(sorafenib),威罗菲尼(vemurafenib),舒尼替尼(sunitinib),替尼泊苷(teniposide),三铂(triplatin),长春花碱(vinblastine),长春瑞滨(vinorelbine),长春新碱(vincristine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)。
56.如权利要求46至55中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述抗体是所述纳米颗粒的全部表面或部分表面上的基本单层抗体。
57.如权利要求46至56中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述抗体,载体蛋白和存在的治疗剂通过非共价键结合。
58.如权利要求46至57中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述载体蛋白选自:明胶、弹性蛋白、醇溶蛋白、豆球蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白、乳蛋白和乳清蛋白。
59.如权利要求46或48至57中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述载体蛋白是白蛋白。
60.如权利要求59所述的纳米颗粒组合物,其中,所述白蛋白是人血清白蛋白。
61.如权利要求46至60中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物被配制成用于静脉内递送。
62.如权利要求46至61中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物中的纳米颗粒的平均尺寸为大于800nm至约3.5μm。
63.如权利要求46至62中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述组合物被配制成用于直接注射或灌注至肿瘤内。
64.如权利要求46至63中任一项所述的纳米颗粒组合物,其中,所述纳米颗粒的解离常数为约1x10-11M至约1x10-9M。
65.制备权利要求46至64中任一项所述的纳米颗粒组合物的方法,其中,所述方法包括使所述载体蛋白和任选地至少一种治疗剂在pH为5.0至7.5且温度为约5℃至约60℃的溶液中与抗体接触。
66.如权利要求65所述的方法,其中,所述温度为约23℃至约60℃。
67.如权利要求65所述的方法,其中,所述温度为约55℃至约60℃。
68.制备权利要求46至64中任一项所述的纳米颗粒组合物的方法,其中,所述方法包括(a)使载体蛋白和任选地至少一种治疗剂接触以形成核心,以及(b)使所述核心在pH为约5.0至约7.5、温度为约5℃至约60℃的溶液中与抗体接触。
69.如权利要求68所述的方法,其中,所述温度为约23℃至约60℃。
70.如权利要求68所述的方法,其中,所述温度为约55℃至约60℃。
71.治疗癌细胞的方法,所述方法包括使细胞与有效量的权利要求46至64中任一项所述的纳米颗粒组合物接触,从而治疗所述癌细胞。
72.治疗有此治疗需求的患者体内的肿瘤的方法,所述方法包括将治疗有效量的权利要求46至64中任一项所述的纳米颗粒组合物给药于所述患者,从而治疗所述肿瘤。
73.如权利要求72所述的方法,其中,所述肿瘤的尺寸减小。
74.如权利要求72或73所述的方法,其中,所述纳米颗粒静脉内给药。
75.如权利要求72或73所述的方法,其中,所述纳米颗粒组合物通过直接注射或灌注至肿瘤内给药。
76.如权利要求65至75中任一项所述的方法,其包括:
a.每周一次给药所述纳米颗粒组合物持续三周;
b.停止给药所述纳米颗粒组合物持续一周;以及
c.根据需要重复步骤a)和步骤b)以治疗肿瘤。
77.如权利要求65至76中任一项所述的方法,其中,所述治疗有效量包括约75mg/m2至约175mg/m2的载体蛋白。
78.如权利要求65至77中任一项所述的方法,其中,所述治疗有效量包括约30mg/m2至约70mg/m2的抗体。
79.如上述权利要求中任一项所述的方法,所述方法还包括在给药所述纳米颗粒之前12小时至48小时向患者给药游离抗体,其中,所述游离抗体结合至与所述纳米颗粒中的抗体所结合的靶点相同的靶点。
80.如权利要求79所述的方法,其中,所述游离抗体以小于治疗剂量的一半的剂量给药。
81.如权利要求79所述的方法,其中,所述抗体是BEV并且BEV在给药AB160之前24小时以1mg/kg的剂量给药。
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