WO2006001523A1

WO2006001523A1 - Des A フィブリンを含有する悪性腫瘍抑制剤

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Publication number: WO2006001523A1
Application number: PCT/JP2005/012174
Authority: WO
Inventors: Hirobumi Senga; Caixia Li; Yongling Wan; Lishui Chang
Original assignee: Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2004-06-24
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2006-01-05
Also published as: EP1762242A4; RU2006145902A; EP1762242B1; EP1762242A1; CN1972706B; JP4716994B2; KR101032249B1; CN1972706A; HK1105091A1; US20090018062A1; JPWO2006001523A1; RU2358754C2; KR20070026846A; CA2566991A1; US20060088519A1; US8481047B2; AU2005257508A1; HK1100359A1

Abstract

　Des　A　フィブリンを含有することにより、悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走を抑制して、悪性腫瘍を抑制することができる悪性腫瘍抑制剤を提供する。

Description

明細書

Des A フイブリンを含有する悪性腫瘍抑制剤技術分野

本発明は Des A フイブリンを含有することを特徴とする、悪性腫瘍抑制剤に関する。背景技術

近年、悪性腫瘍治療は、外科的手術、放射線治療あるいは化学療法による原発癌の除去の成功率の向上によって、着実に進歩している。しかしながら、原発癌の除去が完全になされても癌の転移により死亡する場合が少なくない。

特に、黒色腫、肺癌、肝癌及び滕臓癌などの悪性度が高い悪性腫瘍は早期発見が難しく、悪性腫瘍と診断された時点では、既に原発癌と転移癌とが同時に存在し、手術治療を受けられないケースが非常に多い。これらの悪性腫瘍に対して、放射線治療は良好な結果を示していない。また、現在、臨床で使用されているァドリアマイシン（adriamycin) 等の化学療法剤は、そのほとんどが悪性腫瘍細胞を直接攻撃して薬効を発揮するものであるが、同時に正常細胞をも夕一ゲッ卜とするので、副作用が強く、臨床上の問題点になっているのが現実である。したがつて、ここ数十年間、画期的な新薬が生まれていない状況にある。このような状況を打開するために、新しいタイプの悪性腫瘍用医薬品が待望されている。かかる状況の下、最近、数多くの基礎研究及び臨床研究により悪性腫瘍と凝固線溶系との密接な関係が示唆されている。例えば悪性腫瘍患者では、血漿フィプリノーゲンの増加、血液粘度の増加及び血液レオロジ一の異常等の凝固線溶系の異常により微小循環障害を引き起こすことが知られている。また、血漿フイブリノ一ゲンの増加又は悪性腫瘍細胞が自らフイブリノ一ゲンを分泌することにより、悪性腫瘍組織の細胞外マトリクスにフイブリノ一ゲン又はフィブリンの沈着が発生し、これが細胞外マトリクスの一員として悪性腫瘍細胞の増殖、浸潤及び転移に促進的な作用を果たしていることが報告されている（例えば、 Cancer Research 60: 2033-2039 (2000)、 Ann N Y Acad Sci 936 :406-425 (2001) 及び Blood 96:3302-3309 (2000) を参照）。

前述の悪性腫瘍と凝固線溶系との関係に着目し、インビトロ（in vitro) において悪性腫瘍細胞をフィプリンで処理すると、悪性腫瘍細胞の肺臓への実験的転移性が増強されることが確認されている（例えば、 Clin Exp Metastasis 17:723-730 (1999) を参照）。フイブリン（Des AB フイブリン又はフイブリン II ともいう）は、トロンビンがフィプリノーゲンに作用して、フイブリノ一ゲンからフイブリノぺプチド A (fibrinopeptide A、以下 FPAという）及びフィブリノペプチド B (fibrinopeptide B、以下 FPB という）を遊離させて得られる物質である（例えば、 Nature 275:501-505 (1978) 及び Biochemistry 35 :4417- 4426 (1996) を参照）。

また、血中フィプリノーゲン濃度と悪性腫瘍の増殖及び転移との関係に着目し、脱フィプリノ一ゲン作用を有するトロンビン様酵素であるバトロキソビン

(Batroxobin) やアンクロッド（Ancrod) を投与してフィブリノーゲンを減少させ、悪性腫瘍の増殖及び転移を抑制することが報告されている（例えば、 Eur J Cancer 16:919-923 (1980) 及び日本血液学会雑誌 44:739-743 (1981) を参照）。バトロキソビンは、 Bothrops atrox moo.ieni の毒液に由来するトロンビン様セリンプロテア一ゼであり、フイブリノ一ゲンから FPAのみを遊離し、 Des A フィプリン（フイブリン Iともいう）を産生する糖蛋白酵素である（例えば、 Thromb Haemost 36 :9-13 ( 1976 ) 及び Thromb Diath Haemorrh 45 (Suppl) :63-68

(1971) を参照)。

これらの文献に開示される技術は、悪性腫瘍細胞を攻撃する免疫系から当該細胞を保護するバリヤ一としてフイブリノ一ゲンが機能しているとの推定に基づいて、トロンビン様酵素によりフイブリノ一ゲンを減少させて、免疫系による悪性腫瘍細胞に対する攻撃を容易にし、結果として悪性腫瘍の増殖及び転移を抑制しようとするものである。

一方、悪性腫瘍細胞は伸展及び遊走することが知られている。ここで、悪性腫瘍細胞の伸展（spreading) とは、腫瘍細胞が何らかの信号を受け、円形の腫瘍細胞が偽足を形成することであり、これは腫瘍の増殖、浸潤及び転移の基礎となる腫瘍細胞の生物学的行為である。

また、悪性腫瘍細胞の遊走 (migration) とは、腫瘍細胞が何らかの信号を受け、細胞膜にある細胞接着分子とリガントとの間で結合及び解離を繰り返すことにより、腫瘍細胞が元の場所から移動することであり、これは腫瘍の浸潤と転移の基礎となる生物学的行為である。，したがって、悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走を抑制することにより、腫瘍の浸潤及び転移を抑制し、ひいては悪性腫瘍を抑制することができる。

'しかしながら、かか'る機序により悪性腫瘍を効果的に抑制することができる薬剤は報告されていない。

また、フィブリノ一ゲンの分解産物である Des A フィブリンと悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走との関連性についての報告例も存在していない。発明の開示

したがって、本発明は、悪性腫瘍抑制剤として新規な有効成分を含有する、悪性腫瘍抑制剤を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明者等は、 Des A フイブリンが悪性腫瘍細胞に対してフィブリンとは異なる作用を与えるのではないかと考え、悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走に及ぼす Des A フイブリンの影響について鋭意研究を行ったところ、 Des Aフイブリンが悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走を抑制する作用を有することを見出した。本発明は、この知見に基づいてなされたものである。

すなわち、本発明は、 Des Aフイブリンを含有することを特徴とする悪性腫瘍抑制剤に関するものである。図面の簡単な説明

図 1は、フィブリノーゲン、 Des Aフィプリン及びフィブリンの電気泳動像を示す写真である。

図 2は、図 1の電気泳動像を、画像分析システムを用い定量化して図示したグラフである。

図 3は、 PBS (A)ヽフイブリノ一ゲン（B)ヽノトロキソビン（C)ヽトロンビン（D)、 Des Aフイブリン（E)及びフイブリン（F) で処理したゥェル中で培養した黒色腫細胞の顕微鏡写真である。 '

図 4は、 PBS (A)ヽフイブリノ一ゲン（B)ヽノトロキソビン（C)ヽトロンビン（D)、 Des Aフイブリン（E)及びフイブリン（F) で処理したゥエル中で培養した黒色腫細胞の伸展率のグラフである。

図 5は、 PBS )、フイブリノ一ゲン（Β)ヽノトロキソビン（C)、トロンビン（D)、 Des Aフイブリン（E) 及びフィプリン（F) で処理したゥエル中で培養した乳癌細胞の顕微鏡写真である。

図 6は、 PBS (A)ヽフイブリノ一ゲン（B)ヽノトロキソビン（C)、トロンビン（D)、 Des Aフイブリン（E)及びフイブリン（F) で処理したゥエル中で培養した乳癌細胞の伸展率のグラフである。

図 7は、 PBS (A)ヽフイブリノ一ゲン（B)ヽノ'トロキソビン（C)、トロンビン（D)、 Des Aフイブリン（E)及びフイブリン（F) で処理したゥエル中で培養した線維肉腫細胞の顕微鏡写真である。図 8は、 P B S (A)ヽフイブリノ一ゲン（B )ヽノ 'トロキソビン（C )、トロンビン（D )、 Des A フイブリン（E ) 及びフイブリン（F ) で処理したゥエル中で培養した線維肉腫細胞の伸展率のグラフである。

図 9は、黒色腫細胞の伸展に対する Des A フイブリン量の影響を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態 ·

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の悪性腫瘍抑制剤は、 Des A フイブリンを有効成分として含有することを特徴とする。

Des A ,フィブリンは、フィブリノ一ゲンから FPAを遊離させて得られる物質でめる。

フイブリノ一ゲンは、 3種の Α ο:鎖、 Β ？鎖及びァ鎖が S-S結合で結合してなるサブユニット（Α α Β ？ァ）の 2つが、更に S-S結合により結合してなる 2 量体糖蛋白（Α α Β ？ァ） ₂である。 Α α鎖は 610個のアミノ酸（68kDa)、 β 鎖は 461個のアミノ酸（54kDa)、ァ鎖は 411個のアミノ酸（48kDa) からなるので、フィブリノ一ゲンの分子量は 340 kDaである（Thromb Res 83： 1- 75( 1996 )及び Blooa Coagulation, Fibrinolysis and Kinm, Aoki A and Iwanaga S (Eds) Chugai Igaku Co. , Tokyo, 1979, p59- 7ίを参照）。また、 Β ？鎖とァ鎖には糖が結合しているが、 Α ひ鎖にはないことが知られている（Int J Biochem & Cell Biol 31 :74 746(1999)を参照)。

FPAは、フイブリノ一ゲンの A α鎖の N¾末端から 16個のアミノ酸（N¾ - Ala- Asp- Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Va卜 Arg ) (配列番号 1 ) に該当するペプチドである。

したがって、 Des A フィプリンは、フィブリノ一ゲンから FPAを遊離して得られる残部 [(ひ B ?y) ₂] である（Thromb Haemost 36:9-13 (1976) 及び Thromb Diath Haemorrh 45(Suppl) :63-68 (1971) を参照）。 FPAの分子量は 1,536 Daであるので、 Des Aフィプリンの分子量は約 337 kDaと計算できる。フイブリノ一ゲンからの FPAの遊離は、トロンビン様酵素を用いて行うことができる。トロンビン様酵素は、セリンプロテア一ゼの一種である。一般的には、蛇毒由来のものが多い。具体例としては、 Bothrops atrox moo.ieni の毒液から抽出 ·精製したバトロキソビン（東菱薬品工業株式会社及びその子会社である Beijing Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd.₃ Beijing, China製)、アンクロッド及びその他の蛇毒由来のトロンビン様酵素（例えば Crotalase)等が挙げられる。これらのトロンビン様酵素は、天然物であってもよく、遺伝子組み換え製品であってもよい。

フィブリノ一ゲン及びトロンビン様酵素を用いた Des Aフィプリンの製造は、例えば下記（1)〜（6) の方法により行うことができる。

(1) プラスチヅク培養器具、ガラス培養器具、スライドガラス、ステンレス又は合成固形物質である EPTFE人工血管等の表面にフイブリノ一ゲンを付着させ、そこへトロンビン様酵素を添加して Des Aフイブリンを製造する方法； ·

( 2)前記の固形物質へフィブリノ一ゲン及びトロンビン様酵素を同時に添加して Des Aフイブリンを製造する方法；

(3) 液体反応系において 0.1〜15 Nの尿素及び/又は抗凝集ペプチド（Gly- Pro-Arg- Pro-amide, GPRP-N¾ (配列番号 2)) の存在下で、フイブリノ一ゲンとトロンビン様酵素とを反応させ、 Des Aフイブリン同士の凝集を防止しつつ作成する方法（Clin Exp Metastasis 17:723-730 (1999) を参照）；

(4) カラムにフイブリノ一ゲンを結合し、トロンビン様酵素を含む溶液を流して Des Aフイブリンを製造する方法； .

(5) トロンビン様酵素をカラムに結合し、フイブリノ一ゲンを含む溶液を流して Des Aフィプリンを製造する方法；

( 6 ) トロンビン様酵素を静脈、腹腔内、皮下及び筋肉注射等によ.り投与し、体内のフイブリノ一ゲンに作用させてィンビポ（in vivo) で Des Aフイブリンを製造する方法（Acta Haematol Jpn 44:706- 711( 1981)を参照)。

本発明の Des Aフィプリンの製造に用いるフィプリノ一ゲン及びトロンビン様酵素はそれ自体公知物質であり、市場において容易に入手可能であるか、又は、調製可能である。 Des Aフイブリンもそれ自体公知物質であり、上記の方法によ 'り調製可能である。 ·

本発明の悪性腫瘍抑制剤の対象となるのは悪性腫瘍である。悪性腫瘍は発生母組織により上皮性の悪性腫瘍と非上皮性の悪性腫瘍とに大別することができる。上皮性の腫瘍は腫瘍全体の約 9割を占めていると言われている。非上皮性の悪性腫瘍は更に、間葉系組織由来の悪性腫瘍、神経組織由来の悪性腫瘍及び未分化細胞の悪性腫瘍とに分類することができる。以下に、各悪性腫瘍の具体例を例示する。上皮性の悪性腫瘍

腺癌（腺上皮由来の癌腫であり、胃、腸、滕、気管、肺、乳腺、卵巣、子宮体、前立腺など、体の各所に発生するもので、ヒトの癌の 70〜80%を占めると推測される）、扁平上皮癌（重層扁平上皮由来、例えば表皮、口唇、舌、咽頭、食道、肛門、外陰、子宮頸部などの上皮組織に発生する癌、非小細胞肺癌に分類される肺扁平上皮癌)、基底細胞癌（皮膚及び付属器の基底細胞由来)、移行上皮癌（移行上皮由来、例えば膀胱癌)、肝細胞癌（肝実質細胞由来)、腎細胞癌（腎上皮由来)、胆管癌（胆管由来)、絨毛癌（胎盤上皮由来）非上皮性の悪性腫瘍

間葉系組織由来の悪性腫瘍

線維肉腫（結合組織及び線維組織由来)、脂肪肉腫（結合組織及び脂肪組織由来)、軟骨肉腫（結合組織及び軟骨組織由来)、骨肉腫（結合組織及び骨組織由来)、血管肉腫（血管由来)、リンパ管肉腫（リンパ管由来)、骨髄性白血病（造血細胞由来)、単球性白血病（造血細胞由来)、悪性リンパ腫（リンパ組織由来)、リンパ性白血病（リンパ組織由来)、形質細胞種（多発性骨髄腫）（リンパ組織由来)、ホジキン細胞（リンパ組織由来)、平滑筋肉腫（平滑筋由来)、横紋筋肉腫 (横紋筋由来）神経組織由来の悪性腫瘍

神経芽腫（神経芽由来)、髄芽細胞腫（髄芽細胞由来)、悪性星状膠細胞腫（星 '状膠細胞由来)、網膜芽腫（網膜芽細胞由来)、膠芽細胞腫（膠芽細胞由来)、悪性神経鞘腫（シュワン細胞由来)、黒色腫（神経外胚葉由来） . 未分化細胞の悪性腫瘍

悪性奇形腫（全能細胞由来)、腎芽腫（腎芽細胞由来)、肝芽腫（肝芽細胞由来)、混合腫瘍（複数種の細胞由来）本発明の悪性腫瘍抑制剤は、これらの悪性腫瘍の中で、上皮性の悪性腫瘍、並びに、非上皮性の悪性腫瘍である神経組織由来の悪性腫瘍及び間葉系組織由来の悪性腫瘍、特に黒色腫、乳癌又は線維肉腫に対して優れた効果を発揮することができる。

本発明の悪性腫瘍抑制剤は、悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走を抑制することにより、腫瘍の浸潤及び転移を抑制し、ひいては悪性腫瘍を抑制することができる。ここで、悪性腫瘍細胞の伸展（spreading) とは、腫瘍細胞が何らかの信号を受け、円形の腫瘍細胞が偽足を形成することであり、これは腫瘍細胞の増殖、浸潤及び転移の基礎となる腫瘍細胞の生物学的行為である。

また、悪性腫瘍細胞の遊走 (migration) とは、腫瘍細胞が何らかの信号を受け、細胞膜にある細胞接着分子とリガントとの間で結合及び解離を繰り返すことにより、腫瘍細胞が元の場所から移動することであり、これは腫瘍の浸潤と転移の基礎となる生物学的行為である。 · 本発明の悪性腫瘍抑制剤は、 Des A フイブリン単体からなるものであってもよく、その他の活性物質と組み合わせたものであってもよい。

その他の活性物質としては、フルォロウラシル（Fluorouracil) のような代言射拮抗剤、アドリアマイシンのような抗腫瘍抗生物質製剤、ダカルバジン (dacarbazine) のようなアルキル化剤、パクリ夕キセル (Paclitaxel) のような植物由来の制癌剤等が挙げられる。 ·

本発明の悪性腫瘍抑制剤の剤型としては、日局製剤総則にある剤型を適用でき、例えば直接体内に適用する注射剤（懸濁剤、乳剤を含む）；軟膏剤（油脂性軟膏、乳剤性軟膏（クリーム)、水溶性軟膏等を含む)、吸入剤、液剤（点眼剤、点鼻剤等を含む)、坐剤、貼付剤、パップ剤、ローション剤等の外用剤；又は、錠剤 (糖衣、フィルム、膠衣を含む)、液剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤（細粒を含む)、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等の内用剤等が挙げられる。これらの製剤は、日局製剤総則等に記載された方法で製剤化することができる。

また、本発明の悪性腫瘍抑制剤は、剤型に応じて医薬的に許容しうる固体状若しくは液体状の担体又は介入治療基材を含んでいてもよい。医薬的に許容しうる固体状若しくは液体状の担体としては、溶剤、安定化剤、保存剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、緩衝剤、等張化剤、着色剤、基剤、增粘剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、矯味剤等が挙げられる。具体例としては、水及び、乳糖、白糖、果糖、プドウ糖、マンニトール、ソルビトールなどの糖 '糖アルコール類、結晶セルロース、メチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ一スフタレ一ト、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネ —ト、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロ一スナトリウム、カルボキシメチルェチルセルロース、酢酸フ夕ル酸セルロースなどのセルロース及びその関連誘導体、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファ一化デンプン、部分アルファ一化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルス夕一チナトリウム、シクロデキストリン、プルランなどのデンプン及びその関連誘導体、カンテン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、セラヅク、トラガント、キサンタンガムなどの天然高分子 (海草類、植物粘質物、タンパク質など)、ポリビニルピロリドン、. アミノアルキルメ夕ァクリレ一トコポリマー、メタアクリル酸コポリマ一、カルボキシビ二ルポリマ一、ポリビニルアルコール、ジメチルポリシロキサンなどの合成高分子、オリ一ブ油、カカオ脂、カルナウパロウ、牛脂、硬化油、ダイズ油、ゴマ油、ヅバキ油、パラフィン、流動パラフィン、ミツロウ、白色ワセリン、ヤシ油、マイクロクリス夕リンワックスなどの油旨類、ステアリン酸、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、クェン酸トリエチル、トリァセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ハードフアット、ミリスチン酸イソプロピルなどの脂肪酸及びその誘導体、グリセリン、ステアリルアルコール、セ夕ノール、プロピレングリコール、マクロゴールなどのアルコール及び多価アルコール、酸化亜鉛リン酸水素カルシウム、沈降炭酸カルシウム、合成ケィ酸アルミニウム、無水ケィ酸、カオリン、乾燥水酸ィ匕アルミニウムゲル、合成ヒドロタルサイト、酸化チタン、タルク、ベントナイト、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、硫酸アルミニウムカリウム、次没食子酸ビスマス、次サリチル酸ビスマス、乳酸カルシゥム、重炭酸ナトリウムなどの無機性物質及び金属塩ィ匕合物、ショ糖脂肪酸ェステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシェチレンポリォキシプロピレングリコール、セスキォレイン酸ソルビ夕ン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルべ一ト、モノステアリン酸ダリセリン、ラゥリル硫酸ナ.トリウム、ラウロマグロゴールなどの界面活性物質、色素、香料等が挙げられる。

介入治療基材としてはステント、人工血管等が挙げられる。

本発明の悪性腫瘍抑制剤中の Des A フイブリンの含有量は、採用する剤型に依存して変化するが、例えば、内用剤の場合は lgあたり 0.01〜900 m であり、注射剤の場合は 1 ml あたり 0.01〜500 m であり、外用剤の場合は l gあたり 0.01〜500 mgである。

本発明の悪性腫瘍抑制剤の投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依存して変ィ匕するが、成人に使用する場合、 1日あたりの Des A フイブリン量で 0.1〜5000 mg、より好ましくは 100〜2500 mgである。

以下に実施例を示して具体的に説明するが、本発明は実施例により限定されるものではない。

[実施例 1 ] Des A フィブリンの調製及び確認

トロンビン様酵素を用いてフイブリノ一ゲンから FPA を遊離して Des A フィブリンを調製した。更に、 Des A フイブリンの生成を確認するためにフイブリノーゲン及びフィブリンとの対比を行った。

1 ( 1 ) Pes A フイブリンの調製

フィプリノ一ゲンの最終濃度が 3.0 mg/ml、ノ、'トロキソビンの最終濃度が 0.5BU/ml になるように、ヒトフイブリノ一ゲン（F- 4883， Sigma, MO, USA) のリン酸緩衝液（PBS) 溶液にトロンビン様酵素であるバトロキソビン（Tobarpin (登録商標) , Beijing Tobishi Pharmaceutical Co. , Ltd. , Beijing, China製）を加えた後、 37°Cで 1時間ィンキュベ一トして、 Des A フィプリンを調製した。

( 2 ) フイブリンの調製

フイブリノ一ゲンの最終濃度が 3.0 mg/nil、トロンビンの最終濃度が 0.5 U/ml .になるように、ヒトフイブリノ一ゲン（F- 4883, Sigma, M0, USA) の PBS溶液にトロンビン（Sigma, M0, USA)の PBS溶液を加えた後、 37°Cで 1時間インキュベートして、フイブリンを作製した。

( 3 ) フイブリノ一ゲンの調製 . ' 無処理対照として、.ヒトフイブリノ一ゲン（F- 4883, Sigma, M0, USA) を用いて最終濃度が 3.0 mg/mlのフイブリノ一ゲンの PBS溶液を調製した。

( 4 ) Des A フイブリン生成の確認

上記（ 1 ) の工程により Des A フイブリンが生成したことを電気泳動により確認した。具体的には、下記の処理によりフイブリノ一ゲンが 3種の A 鎖、 Β ？鎖及びァ鎖に還元されることを基準として、 Des A フイブリンを 3種のひ鎖、 Β ？鎖及び y鎖に、フイブリンを 3種の鎖、 ?鎖及びァ鎖に還元した後に電気泳動に付して評価した。

工程 ( 1 ) で得られた Des A フイブリン及び工程（2 ) で得られたフィプリンを無菌生理食塩水で 3回洗浄した後、 SDS-2% ?メルカプトエタノール- 5M 尿素液 0.5mlにて、 5〜6分煮沸して、 S- S結合を解除し、溶解した。

工程（3 ) で得ちれたフイブリノ一ゲンでは、上記の洗浄工程を省略し、その後は前記と同じ操作にて S-S結合を解除し、加熱溶解した。

得られたサンプルの各溶液 150〃1に、 50〃1の電気泳動緩衝液（4 X 2% SDS- 0. 1% ブロムクレゾールブルー）を加え、 7.5% SDS-PAGE(PAGEL (登録商標）， Atto Corp. , Tokyo, Japan)電気泳動を行った。

結果を電気泳動図として図 1に示す。図 1において、 Lane 1及び 4 はフイブリノ一ゲン、 Lane 2は Des Aフィプリン、 Lane 3はフィプリンを示す。

各 Laneにおいて、一番下のバンドは γ鎖、下から 2番目のバンドは鎖、下から 3番目のバンドは Αひ鎖を示す。

ここで、 Lane 1及び Lane 4 (フイブリノ一ゲン）を基準として、 Lane 2 (Des A フイブリン）を評価すると、 Lane 2の下から 3番目のバンド（Α α鎖）の位置が下方（低分子量側）にシフトした。これは、トロンビン様酵素であるバトロキソビンの作用によりフィプリノーゲンの Αひ鎖から FPAが遊離したことを示している。一方、その他のバンドの位置はフイブリノ一ゲンと一致していた。以上より、工程（1 ) によりフイブリノ一ゲンから FPAが遊離して Des A フイブリンが生成したことが理解される。

また、 Lane 1及び Lane 4 (フイブリノ一ゲン）を基準として、 Lane 3 (フィブリン）を評価すると、 Lane 3の下から 2番目のバンド鎖）及び 3番目のバンド（Aひ鎖）の位置が共に下方（低分子量側）にシフトした。これは、トロンビンの作用によりフイブリノ一ゲンの Α α: 鎖及び Β ？鎖からそれぞれ FPA及び FPBが遊離したことを示している。以上より、工程 ( 2 ) では、フイブリンが生成したことが理解される。

尚、これらの結果は、既知のデ一夕と一致していた（Acta Haematol Jpn 44:706-711(1981 )を参照)。

更に、前記の電気泳動像を、画像分析システム（Furi Science & Technology Co. , Ltd. , Shanghai, China)を用いて定量化し、グラフとして表した（図 2 )。図 2中の 3つのピークにおいて、左側のピークは Aひ鎖のバンド密度を、中央のピークは Β ？鎖のバンド密度を、右側のビークはァ鎖のバンド密度を示す。左側のピーク（ Aひ鎖）を評価すると、 Des A フイブリンとフィブリンのピ一クは一致し、かつ、フイブリノ一ゲンのピークよりも低分子量側にシフトした。これは、 Des A フィプリン及びフィプリンでは、フイブリノーゲンの A a 鎖から FPAが遊離していることを示している。

中間のピーク（Β ？鎖）を評価すると、フイブリノ一ゲンと Des A フイブリンのピークは一致しているが、フィプリンのピークのみが低分子量側にシフトした。これは、フイブリンにおいてのみフイブリノ一ゲンの B 5鎖から FPBが遊離したことを示している。

•以上より、ノトロキソビンがフィプリノーゲン（（Α α Β ？ァ） ₂ ) に作用して生成した物質は、 Des Α フイブリンァ） ₂ ) であり、トロンビンがフイブリノ一ゲンに作用して生成した物質はフイブリン（（ひ 5ァ） ₂ ) であることが確認された。

[実施例 2 ] . · Des Α フィプリンの悪性腫瘍細胞の伸展に対する影響

マトリゲル（Matrigel (登録商標）， BD Biosciences, NJ, USA)を用いて擬似的な体内の細胞外マトリクス環境を作製し、かかる環境下での悪性腫瘍細胞の伸展に対する Des A フイブリンの影響を、 3種類の悪性腫瘍（黒色腫、乳癌及び線維肉腫）細胞を用いて評価した。

4 ( 1 ) 使用した悪性腫瘍細胞

黒色腫細胞としての B16-BL6 マウス悪性黒色腫細胞（Academy of Chinese Medical Sciences , Beijing, China)は、 10% 牛胎児血清（FBS, HyClone, Utah, USA)を含有する RPMI-1640培地 (Gibco， MD, USA)中で継代培養して、本実験に供した。

乳癌細胞としての MMT060562 マウス乳癌細胞（ATCC， VA， USA) は、 10% FBS 及び 1% 非必須アミノ酸溶液 (Non - Essential Amino Acids Solution, Gibco, MD₅ USA) )を含有する MEM培地 (Gibco, MD， USA)中で継代培養して、本実験に供した。

線維肉腫細胞としての HT-1080 ヒト線維肉腫細胞（Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, China)は、 10 Sを含有する MEM培地 (Gibco, MD, USA)中で継代培養して、本実験に供した。

( 2 ) 細胞伸展の測定法

8穴スライド 'チャンバ一 (Nunc, IL, USA)の各ゥエルに 0, 25ml のマトリゲル (Matrigel (登録商標） 7.5jug/ l, BD Biosciences, NJ， USA)を添加し、室温下で 1時間インキュベートしてマトリゲルをスライ卞にコティングした。次いで、マトリゲルをコーティングしたゥエルへ下記の A〜Fの溶液（各 0.25ml) を添力 Πして処理を施した。

A：リン酸緩衝液（ P B S ) の添加（溶媒対照）

B ：フイブリノ一ゲン（3 rag/ml) の添加

C ：ノトロキソビン（0.5 BU/ml) の添カロ

D ：トロンビン（0.5 U/ml) の添加

E ： Des A フィプリン（3 mg/mlフィプリノーゲン及び 0, 5 BU/mlバトロキソビン）の添加 F：フイブリン（3 mg/mlフイブリノ一ゲン及び 0.5 U/ml トロンビン）の添カロ以上の処理に用いた溶媒はすべて PBSであった。

(ここで、 Βϋ (バトロキソビン単位）とはバトロキソビンの酵素活性量を示す単位をいい、 37°Cで、標準ヒトクェン酸加血漿 0.3ml に、ノトロキソビン溶液 0.1ml を加えるとき、 19.0±0.2秒で凝固する活性量を 2 BU とするものである。）

A〜Dの処理では、示した各成分を示された最終濃度でゥエルへ添加し、室温下で 1時間ィンキュベートし、その後液体を捨て、 PBSで洗浄した。

E〜Fの処理では、示した各成分を示された最終濃度でゥエルへ添加し、 60 秒間反応させ、生成物（処理 E ： Des A フィプリン、処理 F ：フィプリン）の凝固が起こらないうちに液体を捨てた。その後、室温下で 1.時間インキュベートし、 PBS で洗浄した。 Eの処理ではバトロキソビンをフィブリノ一ゲンへ作用させることにより Des A フイブリンが生成し、 Fの処理ではトロンビンをフイブリノ一ゲンへ作用させることによりフイブリンが生成した。

各処理ゥェルへ、無血清 RPMI- 1640培地中に懸濁した'.5600個の B16-BL6黒色腫細胞を撒き、スライド 'チャンバ一を C0₂インキュベータ一中で 2時間培養した。その後、処理済のゥエルへ付着した約 150個の細胞につき、伸展細胞（偽足を出している細胞）数を位相差顕微鏡を用いて計数し、その伸展細胞数の割合を下記の計算式にしたがい伸展率として算出した。

伸展率 (%) = (伸展細胞数/付着細胞数） X 100

同様の手順を、無血清 RPMI- 1640培地中に懸濁した 5600個の B16- BL6黒色腫細胞に替えて、無血清 MEM+1%非必須アミノ酸溶液培地中に懸濁した 5600個の MMT060562乳癌細胞、又は、無血清 MEM培地中に懸濁した 5600個の HT- 1080線維肉腫細胞について行った。 ( 3 ) 黒色腫細胞の伸展抑制

図 3に、各処理ゥエル中で 2時間培養した黒色腫細胞の顕微鏡写真（X45倍）を示す。図 4に、各処理ゥエル中で培養した黒色腫細胞の伸展率のグラフを示す。

PB S (A)、フィプリノ一ゲン（B)ヽバトロキソビン（C)ヽトロンビン (D) 及びフイブリン（F) の存在下では、黒色腫細胞の大部分が偽足を出して伸展し（図 3)、いずれも伸展率が 80%を超えた（図 4)。

一方、 Des Aフィプリン（E) の存在下では、黒色腫細胞はその大部分が丸い状態で、偽足を出しても短く（図 3)、伸展率は 12.53±6.69%であった（図 4)。したがって、 Des A フイブリンは、他の成分と比較して、マトリゲル存在下の黒色腫細胞の伸展を有意に抑制したことが認められた（図 4、 Pく 0.01)。

以上より、 Des A フイブリンが、黒色腫細胞の伸展を効果的に抑制することが理角牟される。

( 4 ) 乳癌細胞の伸展抑制

図 5に、各処理ゥエル中で 2時間培養した乳癌細胞の顕微鏡写真（X45倍）を示す。図 6に、各処理ゥエル中で培養した乳癌細胞の伸展率のグラフを示す。

PB S (A)、フイブリノ一ゲン（B)、ノ'トロキソビン（C)、トロンビン (D)及びフイブリン（F) の存在下では、乳癌細胞の大部分が偽足を出して伸展し（図 5)、いずれも伸展率が 60%を超えた（図 6)。

—方、 Des A フイブリン（E) の存在下では、乳癌細胞はその大部分が丸い状態で、偽足を出しても短く（図 5)、伸展率は 8.87±3.06%であった（図 6)。

したがって、 Des A フイブリンは、他の成分と比較して、マトリゲル存在下の乳癌細胞の伸展を有意に抑制したことが認められた（図 6、 Pく 0.01)。

以上より、 Des A フイブリンが、乳癌細胞の伸展を効果的に抑制することが理解される。 ( 5 ) 線維肉腫細胞の伸展抑制

図 7に、各処理ゥエル中で 2時間培養した線維肉腫細胞の顕微鏡写真（X45 倍）を示す。図 8に、各処理ゥエル中で培養した線維肉腫細胞の伸展率のグラフを示す。

P B S (A)、フイブリノ一ゲン（B )、ノトロキソビン（C )、トロンビン (D ) 及びフイブリン（F ) の存在下では、線維肉腫細胞の大部分が偽足を出して伸展し（図 7 )、いずれも伸展率が 70%を超えた（図 8 )。

一方、 Des A フイブリン（E ) の存在下では、線維肉腫細胞はその大部分が丸い状態で、偽足を出しても短く（図 7 )、伸展率は 34.19±6.55%であった（図 8 )。

したがって、 Des A フイブリンは、他の成分と比較して、マトリゲル存在下の線維肉腫細胞の伸展を有意に抑制したことが認められた（図 7、 Pく 0.01)。

以上より、 Des A フイブリンが、線維肉腫細胞の伸展を効果的に抑制することが理解される。 '

[実施例 3 ] 悪性腫瘍細胞の伸展に対する Des A フィプリン量の影響■ ノ 'トロキソビンをフィプリノーゲンに作用させて得られる Des A フイブリンの生成量は、フィブリノ一ゲン量の増加及びフィブリノ一ゲンとバトロキソビンとの反応時間の延長に応じて増加すると考えられる。そこで、同一濃度のバトロキソビン（0.5 BU/ml ) と異なる濃度のフイブリノ一ゲン（0.1 mg/ml、 0.5 mg/ml s 1 mg/ml s 2 mg/ml、 3 mg/ml、 6 mg/ml、 9 mg/ml、 12 mg/ml 及び 15 mg/ml) とを、それぞれ 30秒間、 60秒間及び 90秒間反応させて種々の量の Des A フイブリンを調製し、これらの悪性腫瘍細胞の伸展に対する影響を評価した。実験方法は、使用したフイブリノ一ゲンの量及び反応時間を除いて、実施例 2の ( 2 ) 細胞伸展の測定の E処理と同様であった。結果を図 9に示す。

反応時間が 30秒（口）の場合、フイブリノ一ゲン濃度を上昇させても伸展率減少への影響は見られず、伸展率は 76.23%までしか減少しなかった。これは、伸展へ影響を及ぼすことができる十分な量の Des A フィプリンが 30秒の反応時間では生成しなかったためであると考えられる。

反応時間が 60秒（〇）及び 90秒（△) の場合、フイブリノ一ゲン濃度が 3 mg/ml となったときに伸展率の大幅な減少が見られた（60秒： 12.53°ん 90秒.： 9.13¾)。フィプリノーゲン濃度を更に上昇させると、伸展細胞がほとんど見られなくなった。これは、 Des A フイブリン生成量の増加に応じて悪性腫瘍細胞の伸展がより強く抑制されたことを示している。

一方、フイブリノ一ゲン濃度が 9 mg/ml を超えると伸展率が上昇し、濃度 15 mg/ml では伸展率の減少効果が見られなかった。これは、高濃度のフイブリノ一ゲンの存在下では、生成した Des A フイブリンがゥエルへコーティングされる前にゥエル上を多量のフイブリノ一ゲンが覆ってしまう（ゥエルへコーティングされない Des A フイブリンは洗浄工程において洗い出されてしまう）ため、フィプリノ一ゲンそのものの作用が現れているためであると考えられる。

以上より、 Des A フイブリンは黒色腫細胞の伸展を用量依存的に抑制することが理解される。

[実施例 4 ] Des A フイブリンの悪性腫瘍細胞の遊走に対する影響

悪性腫瘍細胞の遊走は腫瘍転移の基礎となる生物学的行為である。悪性度の高い悪性腫瘍は遊走能力も高い。そこで、本実施例では、「かき傷アツセィ法

(scratch wound assay) j (Gynecol Oncol 89 :60- 72(2003)を参照）を用いて、 2種類の悪性腫瘍（黒色腫及び乳癌）細胞の遊走に対する Des A フイブリンの影響を評価した。 ( 1 ) 使用した悪性腫瘍細胞

黒色腫細胞としての B16- BL6 マウス悪性黒色腫細胞（Academy of Chinese Medical Sciences , Beijing, China)は、 10¾ 牛胎児血清（FBS, HyClone, Utah, USA)を含有する RPMI- 1640培地 (Gfibco, MD, USA)中で継代培養して、本実験に供した。 '

乳癌細胞としての MMT060562マウス乳癌細胞（ATCC,. VA， USA) は、 10% FBS 及び 1%非必須アミノ酸溶液（Non- Essential Amino Acids Solution, Gibco, MD， USA))を含有する MEM培地 (Gibco， MD, USA)中で継代培養して、本実験に供した。

( 2 ) 細胞遊走の測定法 · ·

6穴プレートのゥエル（Corning, NY,. USA)にカバ一ガラスを敷き、そこへ、 2mlの 10% FBS含有 RPMI- 1640培地で懸濁した 2.5X10⁴個の B16-BL6黒色腫細胞、又は、 2 mlの 10% FBS含有 MEM培地で懸濁した 2.5X10⁴個の MMT060562乳癌細胞を撒き、 C0₂インキュベータ一中で 24時間培養した。

培養後、プラスチック製のセルスクレーパー (cell scraper) を用いて、細胞が増殖しているカバーグラスへ幅が 0.5 ramの傷ラインを付け、元々その傷ラインに増殖していた細胞を取り除いて、さらに残りの細胞断片を PBSで洗浄した。黒色腫細胞培養ゥェルに対して、 10% FBS含有 RPMI- 1640培地で希釈した 0.05 mg/ml フイブリノ一ゲン、又は、 Des A フイブリン（0.05 mg/ml フイブリノ一ゲン及び 2 BU/mlバトロキソビンの添加により生成させた）をそれぞれ 2 ml添加し、 C0₂インキュベータ一中で 48時間培養した。

乳癌細胞培養ゥヱルに対して、 10% FBS MEM培地で希釈した 0.05 mg/ml フィプリノーゲン、又は、 Des A フイブリン（0.05 mg/ml フイブリノ一ゲン及び 2 BU/mlバトロキソビンの添加により生成させた）をそれぞれ 2 ml添加し、 00₂ィンキュベ一夕一中で 48時間培養した。

培養後、ライト染色（Wright staining)を行い、光学差顕微鏡（Olympus, Tokyo, Japan) を用いて傷ライン上へ遊走した細胞数を計数し、カバ一ガラス平方ミリメートルあたりの遊走細胞数（細胞数/腿²) として表した。

尚、フィブリノ一ゲン処理を Des A フィプリン処理の対照としたのは、悪性腫瘍が生体内に存在している場合、悪性腫瘍細胞の周囲にはフイブリノ一ゲンが存在しているからである。

( 3 ) 黒色腫細胞の遊走抑制

結果を表 1に示す。

表 1 . 黒色腫細胞の遊走

**P.<0.01 フィブリノーゲンとの比較

Des A フイブリン処理時の遊走細胞数（14±4個/腿²) は、フイブリノ一ゲン処理時の遊走細胞数（87±14個/腿²) よりも有意に少なかった（Pく 0.01)。

以上より、 Des A フイブリンが、黒色腫細胞の遊走を効果的に抑制することが理解される。

( 4 ) 乳癌細胞の遊走抑制

結果を表 2に示す。

表 2 . 乳癌細胞の遊走

**P<0.01 フイブリノ一ゲンとの比較

2 Des A フィプリン処理時の遊走細胞数（12± 3個/讓 ²) は、フイブリノ一ゲン処理時の遊走細胞数（29± 10個/腿²) よりも有意に少なかった（Pく 0. 01)。

以上より、 Des Aフイブリンが、乳癌細胞の遊走を効果的に抑制することが理解される。産業上の利用可能性

本発明の悪性腫瘍抑制剤は、上述の実施例で示されるように、悪性腫瘍細胞の伸展及び遊走を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は悪性腫瘍の抑制に有利に使用することができる。

Claims

1 . Des A フイブリンを含有することを特徴とする、悪性腫瘍抑制剤。

2 . Des A フイブリンが、フイブリノ一ゲンにトロンビン様酵素を作用させて得られるものである、請求項 1に記載の悪性腫瘍抑制剤。

3 . トロンビン様酵素がバトロキソビンである、請求項 2に記載の悪性腫瘍抑制剤。 . · . . ノ

4 . 悪性腫瘍細胞が上皮性悪性腫瘍細胞である、請求項 1〜3のいずれかに記載の悪性腫瘍抑制剤。

5 . 悪性腫瘍細胞が非上皮性悪性腫瘍細胞である、請求項 1〜 3のいずれかに記載の悪性腫瘍抑制剤。

· 6 . 悪性腫瘍細胞が神経組織由来悪性腫瘍細胞又は間葉系組織由来悪性腫瘍細胞である、請求項 1〜 3のいずれかに記載の悪性腫瘍抑制剤。

7 . 悪性腫瘍細胞が、黒色腫細胞、乳癌細胞又は線維肉腫細胞である、請求項 1 〜 3のいずれかに記載の悪性腫瘍抑制剤。