JPH0449246A - 賢疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は肝実質細胞増殖因子を有効成分として含有して
なる腎疾患治療剤、腎疾患予防剤、培養腎細胞増殖剤、
および腎疾患診断薬に関する。

（従来の技術） 腎臓は約１００万個のネフロンと呼ばれる機能単位の集
合体であり、尿の生成により生体内の老廃物を排泄する
という重要な機能を担っている臓器である。腎臓はまた
、血液をはじめとする体液中のナトリウムイオンやカル
シウムイオン等の電解質の調節、浸透圧の調節、体液量
の調節などの機能、あるいは内分泌器官としてホルモン
の１種であるエリスロポイエチンを生産し赤血球細胞の
分化・成熟の調節機能、あるいはビタミンＤの前躯体で
ある２５−ヒドロキシビタミンＤを活性化する機能など
広範な生理機能をもつ臓器である。

腎臓を構成するネフロンは糸球体と尿細管とからなり、
糸球体は血液の濾過を行い、尿細管は糸球体濾過液から
必要なものを再吸収し不必要なものを分泌する機能を有
する。尿細管はさらに近位尿細管、ヘンレ係蹄、遠位尿
細管、集合管から形成されている。このうちエリスロポ
イエチンの生産、ビタミンＤの活性化は近位尿細管によ
って行われ（Ｂｌｏｏｄ、６８　（Ｓｕｐｐｌｙ、１７
０ａ、１９８６、Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　ＡｃａｄＳ
ｃｉ　　ＵＳＡ、２８，１１９９．１９８１）、また腎
再生は近位尿細管細胞から行われることが知られている
。

腎疾患は大きく分類して糸球体に病変を起こしている腎
糸球体症と尿細管に病変を起こしている尿細管症とがあ
り、慢性腎不全の原因疾患は前者が多いとされていて、
１ｕｐｕｓ腎炎（ＳＬＥ）、慢性腎孟炎、ＩｇＡ腎症な
ど腎炎に分類され、タンパク尿を共通の症状とする疾患
の場合も、その原因はおもに糸球体の異常であると考え
られている。従来、腎炎の治療にはステロイド剤が用い
られてきたが、慢性腎炎が悪化するといわゆる慢性腎不
全となり透析治療の対象となり、荒廃した腎臓の機能は
永久に回復せず一生涯透析を続けなければならない。現
在、日本国における腎臓疾患患者は３０万人おり、その
うち透析治療を受けている重症患者は約９万人であり毎
年８０００人程度０増加がみられる。慢性腎不全の唯一
の根治療法は腎移植であるが、提供者や拒絶反応の回避
など問題が多く、根本的な治療法もしくは治療薬の開発
が望まれている。

腎臓疾患の画期的な治療薬として注目されている腎臓成
長因子（ＲＧＦ）は１９８８年ヒツジから単離され、腎
臓の近位尿細管細胞を増殖させる効果が見出されており
、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）もまた片方の腎臓を摘出
した場合のいわゆる代償性肥大効果を持つことが報告さ
れているが、いずれも未だ実用化するには至っていない
。

一方、本発明の有効成分である肝実質細胞増殖因子（以
下ｒＨＧＦＪという）は本発明者らが再生肝ラット血清
中から成熟肝実質細胞をｉｎ　　ｖｉｔｒｏで増殖させ
る因子として見いだした蛋白質である（Ｂｉｏｃｈｅｍ
　　Ｂｉｏｐｈｙｓ　　Ｒｅｓ　　Ｃｏｍｍｕｎ、１２
２，１４５０．１９８４）。本発明者らはさらに、ＨＧ
Ｆをラット血小板より単離することに成功しくＰｒｏｃ
　　ＮａｔＩ　　Ａｃａｄ　　Ｓｃｉ、８３，６４８９
，１９８６、ＦＦＢ５　　Ｌｅｔｔｅｒ、２２，３１１
．１９８７＞、そのアミノ酸配列を一部決定した。さら
に本発明者らは解明されたＨＧＦアミノ酸配列配列とに
ヒトおよびラット由来のＨＧＦｃＤＮＡクローニングを
行い、このｃＤＮＡを動物組織に組換えて肝臓実質細胞
増殖因子を蛋白質として得ることに成功した（ヒトＨＧ
Ｆ　：　Ｎａｔｕｒｅ。

３４２．４４０，１９８９；ラットＨＧＦ　：　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８７，３２００．１
９９０）。

（発明が解決しようとする課題） 慢性腎炎は糸球体の障害から始まる糸球体腎炎と尿細管
から始まる尿細管腎炎とがあり、前者の場合は糸球体の
損傷に続いて尿細管の荒廃が起こるが、後者の場合は尿
細管の荒廃に限られる。臨床的には重要な１ｕｐｕｓ腎
炎（ＳＬＥ）　、Ｉ　ｇＡ腎症なとは糸球体腎炎に含ま
れるが、その発症機序として免疫学的な機序と非免疫学
的な機序とが考えられる。前者の例としてブドウ球菌、
溶連菌などの細菌やＢ型肝炎、麻疹などのウィルスに由
来する抗原と、これらに対する抗体とからなる免疫複合
体（ｉｍｍｕｎｏ　　ｃｏｍｐｌｅｘ、ＩＣ）の糸球体
への沈着が知られているが、現在ではこの他にも多様な
原因があると考えられており未解決の部分が多い。急性
腎炎や軽度な慢性腎炎にはステロイド剤が用いられるが
、慢性腎炎が悪化しいわゆる腎不全に陥った場合の根本
的な治療法はなく、透析治療を続けるほかはない。しか
しながら、腎臓においてはホルモン等の分泌もまた機能
として非常に重要であり、特に近位尿細管の荒廃により
ここで産生されるエリスロポイエチンが減少すると深刻
な貧血に陥る。ＥＧＦは単独投与およびインスワンとの
併用投与により腎近位尿細管細胞の増殖、および腎臓の
代償性肥大を促進することが確認されているが、ＥＧＦ
はガン細胞の増殖をも強力に促進するため実用化には問
題が多く、かかる副作用を伴わずに、インスリンと相ま
って腎細胞増殖を促進する治療薬が望まれている。

持続的な慢性腎炎により体液中の老廃物の排泄が滞るこ
とによって腎臓への負担が増加し、さらに腎炎の進行を
助長し荒廃が進む。糸球体および尿細管が完全に荒廃し
腎不全に陥った腎臓は自刃で再生することはなく、また
再生させ得る治療法もしくは治療薬は現在までに完成さ
れていない。

−生涯透析治療を続けなければならない患者の救済策と
して腎臓移植を行われるが、提供者の絶対数の不足と組
織適合の難しさから実施例は少ない。

腎臓摘出および腎臓移植はまた悪性腫瘍等の根本的治療
法としても行われるが、移植賢、および片側腎を摘出し
た後の残余腎がいわゆる代償性肥大を実現することが患
者にとって必須であるが、しかしこれを促進する薬剤は
現在まで開発されていない。

さらに、抗生物質などの薬物を投与する場合において、
腎疾患を有する患者はもちろん正常人においても腎臓へ
の負担が増大し、腎機能低下を誘発することがある。こ
のため、薬物による腎障害誘導を予防することが重要で
ある。

腎臓はまたエリスロポイエチンを始めとする各種ホルモ
ン、酵素の生産臓器であり、腎細胞を体外で人工的に培
養することは、これらの生物性因子を医薬品等の目的で
製造する上で重要であるが、腎細胞を増殖する活性を有
する薬剤は現在のところ一般化されていない。

また、腎１ｉｌｉ機能を診断する方法として、従来から
例えば、尿中のタンパク量、糖質Ｉ測定などがあったが
、本発明は、これとは巽りＨＧＦを測定することによっ
て腎臓の炎症程度や機能回復力を診断しようとするもの
であって、臨床的に非常に有用である。

本発明の目的は腎臓細胞の増殖を充進し慢性腎炎におけ
る腎再生を促進し、さらに腎不全を改善し得る治療剤、
および腎臓の代償性肥大を促進する治療剤、薬物による
腎障害を予防する予防剤、培養腎細胞増殖を促進する薬
剤、および腎臓機能を診断する診断薬を提供することで
ある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、肝実質細胞増殖因子ＨＧＦを有効成分とする
ヒトまたは補乳動物用腎疾患治療剤、腎疾患予防剤、腎
細胞増殖剤の発明であり、またＨＧＦ、＆Ｌ＜はその一
部、またはこれらに対するポリクローナル抗体、もしく
はモノクローナル抗体を有効成分とする腎疾患診断薬、
ＨＧＦに対する定性的または定量的測定系を含有する腎
疾患診断薬の発明である。

すなわち、本発明者は、前記課題を解決すべく種々検討
を重ねた結果、片方の腎臓を摘出したラットにおいて残
りの腎臓が代償性肥大を起こすとき腎臓内においてＨＧ
Ｆが産生されるという新たな発見を行った。この知見に
基づき、肝実質細胞を増殖させる因子であるＨＧＦが腎
臓の近位尿細管細胞を始め、メサンギウム細胞など腎細
胞の増殖を冗進し、腎再生を促進する活性を持つという
意外な事実を見出し、本発明を完成させるに至った。特
に近位尿細管細胞は、腎再生開始の細胞でありまたエリ
スロポイエチンなど重要なホルモンを分泌する器官であ
るため、ＨＧＦによる近位尿細管細胞の増殖促進は腎疾
患の改善にとって重要である。また、ＨＧＦは肝障害を
受けた生体においては肝実質細胞を増殖させる効果を持
つ。しかも、正常な肝臓を持つ生体に対してＨＧＦを投
与した場合には肝臓の肥大、あるいは機能低下などの副
作用を起こさないという、腎疾患治療剤としての優れた
性状を有することが確認された。本発明のＨＧＦは腎臓
の代償性肥大を促進し、腎臓摘出後、または腎臓移植後
の腎臓機能を向上させる腎疾患治療剤としても有効に使
用することができる。また、抗生物質等の薬剤を治療目
的で投与する場合等にＨＧＦを併用投与すれば腎障害を
予防する効果を持つことも確認された。本発明の肝実質
細胞増殖因子、もしくはその一部、またはこれらに対す
るポリクローナル抗体、もしくはモノクローナル抗体は
腎疾患の有無、程度を診断する薬剤として使用すること
ができる。また、腎臓に障害を受けた生体においては血
清中のＨＧＦ量が上昇することから、血清中のＨＧＦ量
を測定することにより腎炎の程度を判断し、また腎臓の
機能回復力を調べることができる。

さらにエリスロポイエチンなどの腎臓細胞産生ホルモン
や酵素を得るなどの目的等のために腎臓細胞が培養され
るが、ＨＧＦは、腎細胞を生体外で培養する際に細胞の
増殖を促進する薬剤として有効に用いられる。

本発明に用いられるＨＧＦは、ｉｎ　　ｖｉｔｒＯで成
熟ラット肝細胞を増殖させる因子として発見された生理
活性ポリペプチドであり、分子量は５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動より８２〜８５ｋＤである。ラッ
トＨＧＦ分子は４４０アミノ酸残基からなるα鎖と２３
３アミノ酸残基からなるβ鎖が１個のジスルフィド結合
により架橋したヘテロダイマー構造を持ち、α、β画鋲
とも２個のグルコサミン型糖鎖結合部位が存在する。

ヒトＨＧＦもまたほぼ同じ生理活性を有し、４４０アミ
ノ酸残基からなるα鎖と２３４アミノ酸残基からなるβ
鎖とからなる。α鎖中には線溶酵素プラスミンと同様の
クリングル構造が４個存在し、β鎖のアミノ酸配列にお
いてもセリンプロテアーゼ活性を有するプラスミンのＢ
鎖と約３７％のホモロジーを有する。ヒトＨＧＦのアミ
ノ酸配列およびこれをコードする遺伝子の塩基配列を第
１図に示した。ラットＨＧＦとヒトＨＧＦのアミノ酸配
列のホモロジーはα鎖において９１．６％、β鎖におい
て８８．９％と非常に高い相同性を持ち、その活性は全
く互換性がある。

かかる肝実質細胞増殖因子が腎疾患治療剤、同予防剤、
腎細胞増殖剤などとして有効であり、また腎疾患診断薬
として使用できることは本発明者によってはじめて見い
だされたのである。

本発明のＨＧＦは種々の方法により得ることができる。

例えば、ラット、ウシなどの哺乳動物の肝臓、肝臓、肺
臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤などの臓器及び血小板、白血
球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得
ることができる。また、ＨＧＦを産生ずる初代培養細胞
や株化細胞を培養し、培養物から分離精製してＨＧＦを
得ることもできる。あるいは公知の遺伝子工学的手法（
Ｎａｔｕｒｅ、３４２，４４０．１９８９）によりＨＧ
Ｆをコードする遺伝子を大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌
、植物または動物細胞等適切な宿主細胞に組み込み、こ
の形質転換体の培養物から目的とする組換えＨＧＦを得
ることができる。

こうして得られたＨＧＦは、そのアミノ酸配列の一部が
欠失、もしくは置換したり、他のアミノ酸配列が一部挿
入されていたり、あるいは糖類が同様に欠失あるいは置
換されていても、近位尿細管細胞を始めとする腎細胞増
殖活性を有する限り本発明の範囲に含まれる。

本発明の有効成分であるＨＧＦは、ヒトを含むウシ、ウ
マ、ラット、ヒツジなどいずれの哺乳動物に由来するも
のであっても優れた腎細胞増殖効果を持ち、いずれの哺
乳動物に対しても有効な腎細胞増殖効果を有する。すな
わち、本発明の腎疾患治療剤等はヒトのみならず動物用
医薬品とすることができる。

本発明の治療剤および予防剤は、有効成分であるＨＧＦ
単独、または既知の担体と共に注射されることが一般的
である。例えば、注射剤はＨＧＦを適切な緩衝液に溶解
したのち、フィルター等で濾過し無菌的に容器に充填す
ることにより調整することができる。また、本発明の治
療剤および予防剤はＨＧＦと共に製剤化に必要な添加物
、例えば安定化剤、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤等
を含んても良い。液状製剤とした場合は、凍結保存また
は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望まし
い。

本発明の腎疾患治療剤および予防剤は該製剤組成物の形
態に応じた適当な投与経銘により投与され得る。例えば
、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投
与することができる。その投存置は、ＨＧＦとして０．
１■〜１００■であり、これを１日１回ないし数回に分
けて投与するのが適当て・ある。

また、本発明の培養腎細胞増殖剤はＨＧＦ単独で用いて
もよく、または動物由来蛋白質などの製剤化に必要な添
加物なども加えても良い。あるいは、動物組織や血清、
血漿などＨＧＦを含む分画からなる粗精製物、もしくは
これを凍結乾燥等により水分を除去したものでも良い。

また、本発明の腎疾患診断薬は、ＨＧＦ、もしくはその
一部、あるいはＨＧＦに対するポリクローナル抗体もし
くはモノクローナル抗体を利用してなるものであって組
織中または血中のＨＧＦ量を定性または定量的に測定す
ることができる。ＨＧＦに対するポリクローナル抗体は
ウサギ、ラット、マウスなどにＨＧＦを静脈、皮下、筋
肉中など非経口的に投与することによって得られる。モ
ノクローナル抗体は例えば、ＨＧＦを非経口的に投与し
たマウスの肝臓細胞を摘出し、マウスミエローマ（骨肉
腫）細胞と細胞融合した後培養して得られる培養上清を
精製する、など通常の方法で得ることができる。抗ＨＧ
Ｆ抗体を用いて血中のＨＧＦを検出する方法は通常のＥ
ＬＩＳＡ法、例えば、ポリスチレン製のマイクロプレー
トに抗ＨＧＦ抗体を結合させたものに被検検体を注入し
、一定時間反応後洗浄し、パーオキシダーゼなどで酵素
標識した抗ＨＧＦ抗体を添加し再洗浄した後、Ｈｚ　Ｏ
ｚなどの基質およびＯＰＤ　（オルトフェニレンジアミ
ン）などの発色剤を加えて発色させる方法がある。また
組織中のＨＧＦを検出する方法は、摘出した組織切片に
ＦＩＴＣ（フルオレ・ンセンスーイソチアネート）など
の蛍光物質で標識した抗ＨＧＦ抗体、もしくはパーオキ
シダーゼなどで酵素標識した抗ＨＧＦ抗体で染色するこ
とができる。さらに微量のＨＧＦを高怒度で検出する方
法として、ラットなどの動物由来初代培養肝細胞の増殖
活性を用いて測定する（Ｐｒｏｃ　　ＮａｔＩ　　Ａｃ
ａｄ　　Ｓｃｉ　　ＵＳＡ、８０，７２２９゜１９８３
＞ことができる。本発明はこれらの検出系を用いてＨＧ
Ｆを検出することによって、腎疾患の程度や腎再生能力
を測定することができる。

（発明の効果） 本発明の腎疾患治療剤および予防剤は、ＨＧＦを有効成
分として含有してなり、ＨＧＦの有する近位尿細管細胞
を始めとするメサンギウム細胞などの腎細胞増殖活性を
利用してなるため、慢性腎炎における腎細胞の再生を促
し腎不全への移行を防ぐと共に、腎不全に陥った腎臓の
再生を促進し腎機能を正常な状態に回復させる効果を持
つ。従って従来有効な治療法のなかった腎疾患に対する
治療剤および予防剤として極めて有用である。

また本発明の培養腎細胞増殖剤はＨＧＦを有効成分とし
て含有してなり、生体外での腎細胞培養系において従来
にない特異性と増殖促進活性を有する。また本発明の腎
疾患診断薬により血中、および組織中のＨＧＦ量を測定
することによって腎疾患程度および腎再生能力を正確に
測定することが可能である。

（実施例） 以下に本発明の実施態様及び効果を明らかにするための
実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明するが、もとより
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ ラット肝臓から本発明の肝実質細胞増殖因子ＨＧＦを次
のようにして製造した。

Ｗ　ｉ　ｓ　ｔ　ｅ　ｒ系のラットに体重の０．２％に
相当する四塩化炭素を腹腔投与し、投与後約３０時間目
で肝臓を摘出した。肝臓をワーリングブレンダーで粉砕
した後、日立２０ＰＲ−５２型冷却遠心器を用いて１０
．ＯＯＯｒｐｍ２０分間遠心し、上清を得た。上清を０
．１５Ｍ　　ＮａＣ１＋１０団ヘペス＋２　ｍＭ　　Ｃ
ａ　Ｃ１２＋０１０１％ツイン８０溶液を加えた５０Ｉ
ＴＬＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）で４℃−昼夜透
析した。透析内液を透析液で平衡化したＳ−セファロー
ス（ＦＦ）　　（ファルマシア社製）カラムに注入し、
洗浄後、ＮａＣ■の濃度勾配により溶出した。肝実質細
胞増殖因子はＮａＣ１濃度０．７Ｍ付近に溶出した。次
にこのＨＧＦをブルートリスアクリルＭ（ＩＢＦ社製）
クロマトグラフィーで精製した。溶出はアルギニンの濃
度勾配により行い、ＨＧＦはアルギニン濃度０．２５Ｍ
付近で溶出した。得られた両分を次にヘパリン−セファ
ロース（ファルマシア社）クロマトグラフィーにより精
製した。溶出はＮａＣ１）濃度勾配により行い、ＨＧＦ
は１Ｍ前後のＮａＣ１濃度付近で溶出した。次にフェニ
ル５ＰＷ（東ソー社製）クロマトグラフィーにより精製
した。溶出はＮａＣ１濃度減少およびエチレングリコー
ル濃度上昇勾配により行った。ラット１００匹の肝臓光
たり１１０１ＪのＨＧＦが得られた。ＨＧＦの比活性は
約５０万単位／■であった。得られたＨＧＦに０．２５
％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を加え、ＰＢＳ　（リ
ン酸緩衝食塩水）にて透析しな。

実施例２ 遺伝子組換え法によりヒト細胞由来の肝実質細胞増殖因
子ＨＧＦを製造した。

Ｗ　ｉ　ｇ　ｌ　ｅ　ｒらの方法（Ｃｅｌｌ、１１，２
２３．１９７７）に記載された方法に従って、ヒト肝実
質細胞増殖因子のアミノ酸配列をコードする遺伝子によ
り形質転換されたマウスＣ１２７細胞を培養し、その培
養液上清より、ヒト肝実質細胞増殖因子を得た。すなわ
ち、ヒト肝臓のｍＲＮＡから作られたｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングし、ヒト肝実質細胞増殖因子のア
ミノ酸配列をコードするクローンＨＡＣ１９とＨＢＣ２
５を得た。

ＨＡＣ１９からのＤＮＡをＢａｍＨＩとＳｃａ■で、Ｈ
ＢＣ２５からのＤＮＡを５ｃａＩとＰｓｔｌで消化し、
それぞれ得られた２つのＤＮＡフラグメントをブルース
クリプトＫＳＩＩのＢ　ａｍＨ■とＰｓｔ１部位に連結
し挿入し、ｐＢＳ　（ｈＨＧＦＩＩ）を得た。ＰＢＳ　
（ｈＨＧＦＩＩ）をＸ　ｂ江■と５ａｌＩとＮａｅ　Ｉ
で消化し、更にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし
た後、ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする約３Ｋｂの
ＤＮＡフラグメントを、ウシパピローマウィルスＤＮＡ
をベクターとする発現ベクターｐＢＰＭＴのＥｃｏＲ■
部位に挿入し、ｐＢＰＭＴ　［ｈＨＧＦｎ）を得な。得
られた肝実質細胞増殖因子発現ベクターｐＢＰＭＴ　〔
ｈＨＧＦｆｆ）を、リン酸カルシウム法によりマウスＣ
１２７細胞を形質転換した。形質転換体の選択は、Ｇ４
１８を含む培地で増殖させることにより行った。得られ
た形質転換体の中から、高い肝実質細胞増殖因子産生能
を示す細胞株ＢＰＨ８９を選び出した。ＢＰＨ８９細胞
を牛胎児血清を加えた培地で増殖させた後、培地を２日
おき変換して、肝実質細胞増殖因子ＨＧＦを実施例１の
精製法に準じた方法により精製した。

実施例３ 本発明の注射用製剤を次のようにして作成した。

生理的食塩水１００ｍ１中にＨＧＦｌｍｌ、マンニトー
ル１ｇ、およびポリソルベート８０１０■を含む溶液を
無菌的に調整し、バイアル瓶に１ｍｌずつ無菌的に分注
し、凍結乾燥した。

実施例４ 本発明の注射用製剤を次のようにして作成した。

０．１５Ｍ　　ＮａＣ１と０．０１％ポリソルベート８
０をふくむＰＨ７，４の０．０２Ｍリン酸緩衝液１００
ｍ１にＨＧＦ１■とヒト血清アルブミン１００■を添加
した水溶液を無菌的に調整し、バイアル瓶に１　ｍｌず
つ無菌的に分注し、凍結乾燥した。

実施例５ 本発明のＨＧＦが近位尿細管細胞に対する増殖効果を次
のとおり確認した。

■ラット腎近位尿細管細胞の単離 バルビタール系麻酔剤によりＷ　ｉ　Ｓ　ｊ　ｅｒスク
リプト麻酔し、腹部を切開して腎臓を摘出し、氷で冷却
したプレートに取り出した。戊寅部分を集め、小片に刻
んでダウンスホモジナイザーにかけた。得られたホモジ
エネートを２４５μｍ孔ナイロンメッシュでろ過し、さ
らに尿細管細胞と顆粒細胞を分離するために１０５１Ｊ
Ｉｕ孔ナイロンメツシユでろ過したのち、メツシュ上に
残った分画を氷で冷却したイーグルの最少栄養培地に移
した。この分画に少量の顆粒細胞が残存していたので、
０゜０１％コラゲナーゼを培地に添加し３７℃で３分間
処理しファイブロブラストを除去したのち８０ｇｘ２分
遠心分離して精製近位尿細管細胞を得た。

■ＨＧＦの近位尿細管細胞増殖に対する増殖活性。

得られたラットＨＧＦをラット腎臓より摘出した腎近位
尿細管細胞の培養系に添加し、細胞増殖効果をＤＮＡ合
成の増加より検討した。すなわち、■により得られた近
位尿細管細胞をｌＸｌ０−８Ｍインスリン（シグマ社、
米国）、ｌＸ１０−８Ｍデキサメサゾン（和光純薬社）
、５μｇ／ｍｌトランスフェリン（シグマ社、米国）　
、５　Ｕ／ｍ！アプロチニン（持田製薬社）を添加した
ＤＭＥ−Ｆ−１２混合培地（ＤＥＭ培地：ハムＦ−１２
培地＝１：１、日水製薬社）に懸濁し２４ウエルのマル
チプレートに４Ｘ１０４個／ウェルの濃度で播いた。

５％Ｃ○２．３０％０□、６５％Ｎ２の存在下３７℃で
２４時間培養後、５　Ｕ　／　ｍｌアプロチニンを添加
したＤＭＥ・Ｆ−１２混合培地に交換し、同培養条件下
で４８時間培養した。培地を新しく調整した５　Ｕ　／
　ｍｌアプロチニン添加ＤＭＥ　−Ｆ−１２培地に交換
すると共に被検試料として実施例１で得られたＨＧＦ　
（０，２５％ＢＳＡ−牛血清アルブミンを加え、ＰＢＳ
＝リン酸緩衝食塩水で透析したもの）、および陽性対照
として１０口ｇ　／　ｍ１ＥＧＦ　（雄マウス顎下腺由
来）＋ｌＸ１０−７Ｍインスリンを所定量添加した。１
６時間培養後、１μＣｉ　／　ｍｌの１２５■−デオキ
シウリジンにニーイングランドニュー２１フ社、米国）
１０μｍ／ウェルを添加した。４時間後ＰＢＳで細胞を
洗浄し１０％トリクロロ酢酸溶液に移し５分間インキュ
ベートした。トリクロロ酢酸を除き、１Ｍ水酸化ナトリ
ウム溶液で細胞を溶解し放射能をガンマカウンターにて
測定した。

その結果、第２図に示すごとくラットＨＧＦはラット腎
臓の近位尿細管細胞を用量依存的に増殖させる活性を示
した。すなわち、２　ｎｇ　／　ｍｌのＨＧＦを添加す
ることにより、該培養細胞のＤＮＡ合成は約２倍に、１
０　ｎｇ　／　ｍｌのＨＧＦにより約３倍に促進された
。これにより本発明の有効成分であるＨＧＦは培養腎細
胞を増殖させる活性を有することが明らかになると共に
、生体内における腎再生を促進させる活性を有すること
が明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＨＧＦのアミノ酸配列とそれをコードする
遺伝子の塩基（’ＤＮＡ）配列。上段に塩基配列、下段
にアミノ酸配列を示しな。 第２図はラット近位尿細管細胞に対するラットＨＧＦの
増殖促進活性の測定結果を示すグラフである。黒丸はＨ
ＧＦ添加の場合、ムはＥＧＦ＋インスリン添加の場合を
示す。 第１ｒＩ！Ｊ（１）　　ヒ）ＨＧＦ塩基配列／アミノ酸
配列００１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ＴＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＣｍＣｏｏ
ｌ　　ＩＩ　　Ｗ　　Ｖ　　Ｔ　　Ｋ　　Ｌ　　Ｌ　　
Ｐ　　Ａ　　Ｌ　　Ｌ　　Ｌ　　Ｑ　　ＨＶ　　Ｌ　　
Ｌ　　ＨＬ　　Ｌ０６１　　ＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＴＣ
ＧＣＣＡＴＣＣＣＣＴ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ＡＣＡＡＴＴＣＡＴ０２１ＬＬＰＩ　　＾　ＩＰ
ＹＡＥＧＱＩＩＫＲＲＮＴＩＩＩ＋２１　　ＣＡＡＴＴ
ＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＴＡＣＣＣＴＡ
ＡＴＣＡＡＡＡＴＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＡ
ＴＡＡＡＡ０４１　Ｅ　Ｆ　Ｋ　Ｋ　Ｓ　Ａ　Ｋ　Ｔ　
Ｔ　ＬロＩＤＰ人ロロ１８１　　＾閉＾ＡＡＡＡＡＧＴ
ＧＡＡＴＡＣＴＧＣＡＧＡＣＣ＾＾Ｔ釘αゴＡ＾Ｔ＾Ｇ
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ＲＹＲＮＫＨＩＣＧ第 ８ＧＦ　（ｎｇ／ｍｌ） 第１図（３） ＬＴＹＫＶＰＱＳ 手続補正書（方式） 平成０３年０７月０５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）肝実質細胞増殖因子ＨＧＦを有効成分とするヒト
   または哺乳動物用腎疾患治療剤。（２）ＨＧＦがヒトま
   たは動物組織由来である請求項第１項記載の腎疾患治療
   剤。 （３）ＨＧＦが遺伝子組換えにより製造したものである
   請求項第１項記載の腎疾患治療剤。 （４）遺伝子組換えの宿主細胞が大腸菌、枯草菌、酵母
   、糸状菌、植物または動物細胞のいずれかである請求項
   第３項記載の腎疾患治療剤。 （５）腎臓摘出後、または腎臓移植後の腎臓機能を向上
   させる請求項第１項記載の腎疾患治療剤。 （６）ＨＧＦを有効成分とする腎疾患予防剤。 （７）ＨＧＦを有効成分とする腎細胞増殖剤。 （８）ＨＧＦ、もしくはその一部、またはこれらに対す
   るポリクローナル抗体、もしくはモノクローナル抗体を
   有効成分とする腎疾患診断薬。 （９）ＨＧＦに対する定性的または定量的測定系を含有
   する腎疾患診断薬。