TWI661838B

TWI661838B - 一種預防和治療病理性腎組織損傷的方法

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Publication number: TWI661838B
Application number: TW106120523A
Authority: TW
Inventors: 李季男
Original assignee: 大陸商深圳瑞健生命科學研究院有限公司
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2019-06-11
Also published as: WO2018107695A1; JP2020502134A; US20190343930A1; CA3047170A1; CA3047171A1; JP7242057B2; JP2020502135A; EP3556388A1; US20190328848A1; CN110167582A; CN110366427A; EP3556388A4; WO2018107699A1; TW201822794A; WO2018107700A1; TW202123962A; EP3556386A1; EP3556386A4; TWI642441B; JP7182793B2

Abstract

本發明涉及預防和/或治療受試者腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原，其中所述受試者有腎組織損傷風險、懷疑有腎組織損傷、或罹患腎組織損傷。本發明還涉及在用於預防和/或治療受試者腎組織損傷及其相關病症的包含纖溶酶原的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。

Description

一種預防和治療病理性腎組織損傷的方法

本發明涉及纖溶酶原在預防和治療腎臟病變方面的作用，進而為治療不同原因導致的腎臟病變及其相關病症提供全新的治療策略。

腎臟病變是各種原因引起的腎臟結構變化和功能障礙。腎臟病變導致腎組織結構的損傷，繼而影響其功能。腎臟病變可以是原發的，例如感染、炎症、變態反應等引發的腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、腎病綜合症、腎功能不全、腎小球硬化、腎小球系膜增生、腎小管間質病變、腎小管萎縮等；也可以繼發於其它疾病，例如可以由於缺血、代謝紊亂，例如糖代謝、脂肪代謝紊亂、腫瘤等其他疾病導致腎臟病變。

例如高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病常伴有腎臟病變。高血壓是常見的慢性疾病之一，該病的主要表現為體循環動脈壓增高，如果對高血壓患者的血壓控制不好，容易發生腦中風、冠心病、視網膜病變以及慢性腎臟疾病等併發症。並且長時間的高血壓可以使越來越多的組織器官受到影響。所以要加強和預防高血壓及高血壓的併發症，從而降低高血壓帶來的危害^[1]。

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)，是糖尿病常見的重要併發症，是糖尿病致死、致殘的主要原因。如診治不及時，DN發展到腎病末期時，將只能採用透析甚至是腎移植。DN早期的主要病理特徵是腎小球肥大，腎小球和腎小管基底膜增厚及系膜區細胞外基質的進行性積聚；後期為腎小球、腎小管間質纖維化。臨床上早期可表現為腎小球濾過率減少，然後出現微量白蛋白尿、動脈血壓升高、蛋白尿和體液瀦留，最終導致腎衰竭^[2]。

糖尿病腎病屬糖尿病微血管併發症，其發生與高血糖、氧化應激等因素相關，其中高血糖是產生微量白蛋白尿的重要因素^[3]。尿微量白蛋白可以預示糖尿病腎病的進展。而糖尿病動脈粥樣硬化屬於糖尿病大血管併發症，與高血糖、血管內皮功能紊亂、胰島素抵抗等因素密切相關。近年有研究發現，蛋白尿與動脈粥樣硬化密切相關^[4]。

在發達國家，糖尿病腎病、高血壓腎小動脈硬化已成為慢性腎臟病的主要原因。在中國，這兩種疾病在各種病因中仍位居原發性腎小球腎炎之後，但近年也有明顯增高趨勢。

全身性變態反應疾病，例如系統性硬化症、系統性紅斑狼瘡、系統性血管炎、過敏性紫癜、多發性肌炎、血栓性微血管病等常常累及腎臟。

大部分藥物及其代謝產物經腎臟排出體外，因而藥物引起的腎損害發生率很高。研究顯示藥物導致急性腎小管壞死(acute tubular necrosis,ATN)或急性間質性腎炎(acute interstitial nephritis,AIN)的發生率高達18.3%，其中抗生素腎損害的發生率達36%^[5]。

抗感染類藥物，例如氨基糖苷類氨基糖苷類抗生素廣泛應用於革蘭陰性細菌感染的治療，然而腎毒性限制了其臨床應用^[6]。

抗病毒製劑阿昔洛韋(aciclovir,ACV)是抗皰疹病毒的去氧鳥苷的環狀類似物。胃腸道外給予大劑量阿昔洛韋可導致10%~48%患者出現急性腎功能衰竭(acute renal failure,ARF)，這可能由於阿昔洛韋在腎小管內沉積、發生毒性免疫反應或超敏反應等引起腎內梗阻所致^[7]。阿德福韋(adedovir，ADV)和齊多福韋(cidofovir，CDV)作為核苷類似物，在臨床上則常用來治療乙肝和愛滋病。其腎毒性發生時常表現為腎小管壞死和間質纖維化^[8]。

免疫抑制劑例如環孢素環孢素(cyclosporine A,CsA)作為免疫抑制劑廣泛用於器官移植和自身免疫性疾病的治療。據報導，約有30%接受CsA治療的患者會出現中到重度腎功能失調。其腎損傷機制是由於腎血管收縮和內皮細胞損傷引起缺血，以及CsA對腎小管上皮細胞的直接毒性作用^[9]。

抗腫瘤藥物例如順鉑(cisplatin,Cis)是一種細胞增殖抑制劑，廣泛用於睾丸癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、骨癌和頭頸癌等實體瘤的治療中。Cis的抗腫瘤效率高，但同時具有劑量依賴性的腎毒性等^[10]，主要表現為氮質血症、多尿症和腎功能衰竭，以腎小球與腎小管均受損為特徵。

非甾體類抗炎藥例如乙醯水楊酸乙醯水楊酸(acetylsalicylic acid，ASA)是世界上應用最廣泛的解熱鎮痛抗炎藥。其用於解熱鎮痛的劑量很少引起不良反應，但長期大量用藥時則較易出現副作用，表現為因氧化磷酸化解耦聯而使鉀離子從腎小管細胞外逸，導致缺鉀、尿中尿酸排出過高；較大損害時，可發生間質性腎炎、腎乳頭壞死和腎功能減退^[11]。

天然產物活性成分例如馬兜鈴酸馬兜鈴酸(aristolochic acid,AA)作為馬兜鈴科植物來源的腎毒素，它是著名的馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy,AAN)的病因^[12]。AA引起的腎臟損傷部位主要在腎小管，引起細胞凋亡或死亡，並抑制腎間質成纖維細胞增生，導致腎小管萎縮及寡細胞性間質纖維化。

利尿劑是一類通過抑制腎小管對水、電解質的重吸收，使尿量排出增多的藥物。各種利尿劑均有潛在的腎毒性，應用後均有引起腎損害的可能。利尿劑引起的腎毒性與該類藥物的細胞毒作用、免疫反應、過敏反應和代謝紊亂等不良反應有關，應儘量避免與腎毒性藥物聯用，防止加重腎損害。此外，還有多種藥物可引起腎損傷，如磺胺類藥物常引起形成磺胺結晶阻塞輸尿管引發梗阻性腎病^[13]。降脂藥他汀類可引起橫紋肌溶解，繼而導致腎小管壞死^[14]。

腎臟疾病發展到後期都會引起腎功能部分或者全部喪失，即導致腎衰竭的病理狀態。腎衰竭可分為急性腎衰竭及慢性腎衰竭，急性腎衰竭的病情進展快速，通常是因腎臟血流供應不足、腎臟因某種因素阻塞造成功能受損或是受到毒物的傷害，引起急性腎衰竭的產生。而慢性腎衰竭主要原因為長期的腎臟病變，隨著時間及疾病的進行，腎臟的功能逐漸下降，造成腎衰竭的發生。

慢性腎功能衰竭是指各種腎臟疾病引起的緩慢進行性腎功能損害，最後導致尿毒症和腎功能完全喪失，引起一系列臨床症狀和生化內分泌等代謝紊亂組成的臨床綜合症，從原發病起病到腎功能衰竭的開始，間隔時間可為數年到十餘年。

尿毒症是慢性腎功能衰竭的終末期。慢性腎功能衰竭是各種病因引起腎臟損害和進行性惡化的結果。常見的基礎疾病有原發性腎小球腎炎、腎小管間質性腎炎、糖尿病腎病等。其臨床表現主要為腎功能減退，代謝廢物瀦留，水、電解質和酸鹼平衡失調，以至不能維持機體內環境的穩定，根據腎功能損害的不同程度，可以將慢性腎功能衰竭分為四個階段：腎功能不全代償期、腎功能不全失代償期、腎功能衰竭期、尿毒症期。

慢性腎功能不全的早期，臨床上僅有原發疾病的症狀，只在檢查中可見到肌酐清除率下降。尿毒症代償期的患者常在應激情況下，腎功能突然惡化，並出現水、電解質、酸鹼代謝紊亂、蛋白質、糖類、脂肪和維生素代謝紊亂、食欲不振或消化不良，病情加重時可出現厭食，噁心、嘔吐或腹瀉等胃腸道症狀等尿毒症的早期症狀，臨床上稱為可逆性尿毒症，一旦應激因素去除，腎功能常可恢復到代償期。若病情發展到“健存”腎單位不能適應機體最低要求時，即使沒有應激因素，尿毒症狀也會逐漸表現出來，表現為水電解質代謝紊亂、體內代謝產物蓄積等全身症狀以及心血管系統、呼吸系統、血液系統的中度症狀。

慢性腎功能不全的藥物治療主要集中在緩解症狀、延緩病程進展以及防治併發症三個方面，具體例如糾正酸中毒和水、電解質紊亂、治療高血壓、防治感染、治療高脂血症，以及針對心血管系統、呼吸系統和血液系統併發症的治療，同時可進行尿毒症的替代透析治療，例如血液透析或腹膜透析，或者進行腎移植。

“急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)”是近年來提出的一個新名詞，用於取代使用多年的急性腎衰竭(acute renal failure，ARF)，並已獲得廣泛認可。它是一種常見的臨床綜合症，主要表現為腎功能的快速下降及代謝廢物的蓄積。AKI發病率高，且呈逐年上升趨勢。國外報導近10年來AKI的發病率從0.65‰增長到5‰，需要透析的AKI發病率為0.295‰^[15-16]。住院患者AKI發生率為1.9%，重症監護病房則可高達60%^[17]。目前尚沒有治療AKI的特效藥物，重症患者需要腎臟替代治療^[18]。AKI的預後亦不容樂觀，ATN和RENAL研究^[19-20]報導重症患者發生AKI後的病死率分別為53.0%和44.7%，且存活的患者也容易進展至慢性腎病乃至終末期腎病^[21]。因此，AKI越來越引起臨床醫師的重視。

對於各種原因導致的腎組織損傷，人們一直渴望尋找到更有效的治療藥物。本發明經過研究發現，纖溶酶原能夠促進損傷的損傷的腎臟組織修復、腎功能的恢復，同時纖溶酶原還能抑制損傷的腎臟組織細胞凋亡、降低其纖維化。因此，纖溶酶原有望成為一種新型的腎臟疾病治療藥物。

本發明涉及如下各項：

在一方面，本發明涉及：1.一種預防和/或治療受試者腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原，其中所述受試者有腎組織損傷風險、懷疑有腎組織損傷、或罹患腎組織損傷。

2.如第1項所述的方法，其中所述腎組織損傷包括感染、炎症、變態反應、自身免疫、缺血、微血管病變、血栓、創傷、輻射損傷、糖代謝紊亂、電解質紊亂、脂肪代謝紊亂、或癌症所致腎組織損傷。

3.如第1或2項所述的方法，其中所述腎組織損傷為選自如下的全身性疾病導致的腎組織損傷：高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、系統性硬化症、系統性紅斑狼瘡、高脂血症、非何傑金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、系統性血管炎、過敏性紫癜、多發性肌炎、及血栓性微血管病。

4.如第1或2項所述的方法，其中所述腎組織損傷為慢性腎臟疾病導致的腎組織損傷。

5.如第4項所述的方法，其中所述慢性腎臟疾病為慢性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、腎病綜合症、腎功能不全、或腎衰或尿毒症。

6.如第1或2項所述的方法，其中所述慢性腎臟疾病為藥物導致的慢性腎損傷。

7.如第6項所述的方法，其中所述藥物包括化療藥物、降血壓藥物、降血脂藥物、降血糖藥物、非類固醇抗炎藥物、抗生素藥物、或抗病毒藥物。

8.如第7項所述的方法，其中所述藥物為化療藥物，具體為順鉑。

在另一方面，本發明涉及：9.一種預防和/或治療受試者急性腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原保護腎組織。

10.如第9項所述的方法，其中所述纖溶酶原減輕急性腎組織損傷所致的腎組織細胞凋亡。

11.如第9或10項所述的方法，其中所述纖溶酶原促進損傷腎組織的修復。

12.如第9-11項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原減輕損傷腎組織的纖維化。

13.如第9-12項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原促進腎功能恢復。

14.如第1-13項中任一項所述的方法，其中所述腎損傷為急性腎小球腎炎、急性腎盂腎炎、急性腎損傷、急性腎功能衰竭、急性腎功能不全、或急性腎小管壞死。

15.如第1-13項中任一項所述的方法，其中所述急性腎損傷為化療藥物導致的急性腎損傷。

在另一方面，本發明涉及：16.一種預防和/或治療受試者慢性腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原保護腎組織。

17.如第16項所述的方法，其中所述纖溶酶原減輕腎組織細胞凋亡。

18.如第16或17項所述的方法，其中所述纖溶酶原促進損傷腎組織的修復。

19.如第16-18項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原減輕損傷腎組織的纖維化。

20.如第16-19項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原促進腎功能恢復。

21.如第16-20項中任一項所述的方法，其中所述慢性腎損傷為腎臟組織的慢性疾病導致的腎組織損傷。

22.如第16-20項中任一項所述的方法，其中所述慢性腎損傷為其它疾病引發或伴有的腎組織損傷。

23.如第22項所述的方法，其中所述其它疾病包括高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、高脂血症、肝炎、肝硬化、冠心病、心絞痛、或心肌梗塞。

24.如第23項所述的方法，其中所述其它疾病為高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、或高脂血症。

在另一方面，本發明涉及：25.一種預防和/或治療受試者脂質沉積導致的腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

26.如第25項所述的方法，其中所述脂質沉積是由於受試者脂肪代謝異常或糖代謝異常導致的高脂血症所致。

在另一方面，本發明涉及：27.一種預防和/或治療受試者糖尿病引發或伴隨的腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

在另一方面，本發明涉及：28.一種預防和/或治療受試者高脂血症引發或伴隨的腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

在另一方面，本發明涉及：29.一種預防和/或治療受試者動脈粥樣硬化引發或伴隨的腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

在另一方面，本發明涉及：30.一種預防和/或治療受試者缺血性腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

31.如第30項所述的方法，其中所述纖溶酶原減輕腎組織細胞凋亡。

32.如第30或31項所述的方法，其中所述纖溶酶原促進損傷腎組織的修復。

33.如第30-32項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原減輕損傷腎組織的纖維化。

34.如第30-33項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原促進腎功能恢復。

35.如第30-34項中任一項所述的方法，其中所述缺血由血管管腔狹窄所致。

36.如第30-34項中任一項所述的方法，其中所述缺血由血栓堵塞血管所致。

37.如第35或36項所述的方法，其中所述缺血由高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化，心臟病所致。

在另一方面，本發明涉及：38.一種預防和/或治療受試者缺血再灌注性腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

在另一方面，本發明涉及：39.一種預防和/或治療受試者自身免疫反應性腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

40.如第39項所述的方法，其中所述自身免疫反應性腎組織損傷由系統性硬化症所致。

在另一方面，本發明涉及：41.一種預防和/或治療受試者炎症性腎組織損傷的方法，包括給藥受試者有效量的纖溶酶原。

42.如第41項所述的方法，其中所述炎症為急慢性腎實質炎症或腎間質炎症。

43.如第42項所述的方法，其中所述纖溶酶原減輕腎組織細胞凋亡。

44.如第42或43項所述的方法，其中所述纖溶酶原促進損傷腎組織的修復。

45.如第41-44項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原減輕損傷腎組織的纖維化。

46.如第41-45項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原促進腎功能恢復。

47.如第1-46項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。

48.如第1-47項中任一項所述的方法，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

49.如第1-48項中任一項所述的方法，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。

50.如第1-49項中任一項所述的方法，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。

51.根據第1-50項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原可與一種或多種選自如下的藥物聯合施用；降血壓藥物、降血脂藥物、抗生素藥物、抗凝藥物、溶血栓藥物、利尿藥、抗腫瘤藥、降血糖藥、非甾體類抗炎藥、免疫調節藥物、抗感染藥物、抗病毒藥物、激素、及天然產物活性成分。

52.如第1-51項中任一項所述的方法，所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。

53.如第1-51項中任一項所述的方法，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。

54.如第1-53項中任一項所述的方法，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。

55.如第1-54項中任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

56.如第1-55項中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。

57.如第1-26項中任一項所述的方法，其中所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。

58.如第57項所述的方法，其中所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。

在另一方面，本發明涉及：59.一種用於第1-58項中任一項所述的方法的纖溶酶原。

在另一方面，本發明涉及：60.一種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載劑和用於第1-58項中任一項所述方法的纖溶酶原。

在另一方面，本發明涉及：61.一種預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於第1-58項中任一項所述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。

62.根據第61項所述的試劑盒，其中所述構件為注射器或小瓶。

63.如第61或62項所述的試劑盒，其還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施第1-58項中任一項所述方法。

在另一方面，本發明涉及：64.一種製品，其包含：含有標籤的容器；和包含(i)用於第1-58項中任一項所述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施第1-58項中任一項所述方法。

65.如第61-63項中任一項所述的試劑盒或第64項的製品，還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。

66.如第65項所述的試劑盒或製品，其中所述其他藥物選自下組：降血脂藥物、抗血小板藥物、降血壓藥物、擴張血管藥物、降血糖藥物、抗凝血藥物、溶血栓藥物，保肝藥物，抗心律失常藥物，強心藥物，利尿藥物，抗感染藥物、抗病毒藥物、免疫調節藥物、炎症調節類藥物、抗腫瘤藥物、激素類藥物、甲狀腺素。

本發明還涉及纖溶酶原用於實施第1-58項中任一項的方法的用途。

本發明還涉及纖溶酶原在製備用於第1-58項中任一項的方法的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒中的用途。

在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：靜脈內、肌內、皮下給予纖溶酶原來進行治療。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，更佳至少每天施用。

本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的之間的組合，該組合後的技術方案在本文中明確公開。

圖1係嘌呤誘導的慢性腎損傷模型小鼠給予纖溶酶原10天後腎臟HE染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C、D為PLG^-/-組。結果顯示，PLG^-/-小鼠腎臟病變最嚴重，可看見有大量的膿管型(粗箭頭所示)，少量的嘌呤結晶(三角標識)，腎小管大面積萎縮，上皮細胞扁平化；與PLG^-/-小鼠相比，給溶媒PBS對照組小鼠腎臟損傷較輕，雖然腎小球萎縮和腎小管壞死仍然嚴重，但未發現明顯的嘌呤結晶，膿管型相對較輕；給纖溶酶原組小鼠腎小管萎縮的面積比PBS對照組小，腎小管擴張也較之輕，未發現膿管型。說明纖溶酶原可減輕慢性腎衰竭模型小鼠腎臟的損傷。

圖2係嘌呤誘導的慢性腎損傷模型小鼠給予纖溶酶原10天後腎臟天狼星紅染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為PLG^-/-組，D為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組膠原的沉積明顯少於PLG^-/-組，且統計差異顯著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。此外，給纖溶酶原組膠原的沉積明顯少於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原在修復慢性腎衰模型的腎臟纖維化過程中起關鍵作用。

圖3係嘌呤誘導的慢性腎損傷模型小鼠給予纖溶酶原10天後腎臟Bcl-2免疫組化染色代表性圖片。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組腎臟陽性著色明顯深於給溶媒PBS對照組，並且與空白對照組小鼠的表達水準相近。這表明纖溶酶原能促進慢性腎衰竭模型小鼠腎臟細胞凋亡抑制分子Bcl-2的表達，從而抑制小鼠腎臟組織細胞的凋亡。

圖4係嘌呤誘導的慢性腎損傷模型小鼠給予纖溶酶原10天後腎臟IgM免疫組化染色圖片。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠腎臟IgM的陽性著色淺於給溶媒PBS對照組，並且範圍較對照組小，著色與正常小鼠更加接近。這表明給纖溶酶原後腎臟的損傷得到了明顯的改善，反映出纖溶酶原對慢性腎損傷小鼠腎臟損傷有顯著修復作用。

圖5係嘌呤誘導的慢性腎損傷模型小鼠給予纖溶酶原4天後腎臟纖維蛋白免疫組化染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為PLG-/-組。結果顯示，給溶媒PBS對照組腎臟纖維蛋白的陽性著色深於給纖溶酶原組小鼠，且PLG-/-組著色深於給溶媒PBS對照組。這表明纖溶酶原可減輕腎臟的損傷。

圖6係順鉑損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天後腎臟IgM免疫染色觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組IgM陽性表達明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能促進順鉑所致腎臟損傷的修復。

圖7係順鉑損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天後腎臟IV型膠原免疫染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組IV型膠原陽性表達明顯低於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能改善順鉑所致的腎臟纖維化。

圖8係24-25周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天後腎臟IV型膠原免疫染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組IV膠原陽性著色明顯淺於給溶媒PBS對照組，說明纖溶酶原能改善糖尿病小鼠腎臟纖維化。

圖9係26周齡糖尿病小鼠給予纖溶酶原35天後腎臟masson染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給溶媒PBS對照組腎間質輕度纖維化，增生的纖維化呈藍色。給纖溶酶原組腎間質纖維化明顯減少。說明纖溶酶原能降低糖尿病小鼠腎臟間質的纖維化。

圖10係博萊黴素誘導的系統性硬化症模型小鼠給予纖溶酶原21天後腎臟天狼星紅染色代表性圖片。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，在博萊黴素誘導的系統性硬化症小鼠模型中，給溶媒PBS對照組腎臟膠原沉積明顯多於給纖溶酶原組。說明纖溶酶原有效降低系統性硬化症小鼠的腎臟纖維化。

圖11係嘌呤誘導慢性腎損傷小鼠血清尿素氮檢測結果。結果顯示，PLG^+/+組血清中尿素氮濃度明顯低於PLG^-/-組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。說明纖溶酶原能顯著改善慢性腎衰竭模型小鼠的腎功能。

圖12係嘌呤誘導的慢性腎損傷模型小鼠給予纖溶酶原4天後血清肌酐濃度檢測結果。結果顯示，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組血清中肌酐濃度明顯低於PLG^-/-組小鼠，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。此外，給纖溶酶原組血清中肌酐濃度明顯低於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原能顯著改善慢性腎損傷模型小鼠的腎功能。

圖13係葉酸誘導急性腎損傷小鼠血清尿素氮檢測結果。結果顯示，給纖溶酶原組血清中尿素氮濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異接近顯著(P=0.06)。說明纖溶酶原能顯著改善急性腎損傷模型小鼠的腎功能。

圖14係給予纖溶酶原30天後3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟油紅O染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠腎臟脂肪沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組，且定量分析統計差異顯著；此外，給纖溶酶原組脂質沉積水準與空白對照組小鼠相似。說明纖溶酶原能消減脂肪在高脂血症模型小鼠腎臟中的沉積，從而減少脂肪沉積所致的腎臟損傷。

圖15係給予纖溶酶原7天後葉酸急性腎損傷模型小鼠腎臟HE染色代表性圖片。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，空白對照組腎臟核呈圓形或橢圓形，胞漿紅染，腎小球及腎小管均形態正常；給溶媒PBS對照組腎臟觀察到大量的腎小管上皮細胞扁平化(粗箭頭標識)，刷狀緣脫落，部分細胞核固縮，只有部分腎小管呈現淡染的胞漿，部分腎小管還可見膿管型(細箭頭標識)，腎小球及腎間質輕度的炎細胞浸潤；給纖溶酶原組與給溶媒PBS對照組相比，腎小管擴張及上皮細胞扁平化明顯好轉，可見大部分的腎小管胞漿呈現紅染，未見膿管型。說明纖溶酶能改善葉酸誘導的急性腎損傷。

圖16係給予纖溶酶原7天後葉酸急性腎損傷模型小鼠腎臟Bcl-2免疫組化觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組，C為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組腎臟Bcl-2陽性著色明顯多於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著(*表示P<0.05)。這表明纖溶酶原能促進急性腎損傷模型小鼠腎臟中細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，從而保護急性腎損傷小鼠腎臟組織細胞免於凋亡。

圖17係給予纖溶酶原7天後葉酸急性腎損傷模型小鼠腎臟IgM免疫組化觀察結果。A為給溶媒PBS對照組，B為給纖溶酶原組。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠腎臟IgM的陽性著色比給溶媒PBS對照組淺，並且範圍較對照組小。這表明注射纖溶酶原後腎臟IgM的表達明顯降低，反映出纖溶酶原能有效減少葉酸急性腎損傷小鼠腎臟損傷。

圖18係給予纖溶酶原30天後3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟天狼星紅染色觀察結果。A為空白對照組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組，D為定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組腎臟膠原蛋白沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組，且統計差異顯著；給纖溶酶原組纖維化基本恢復到正常水準。說明纖溶酶原能有效的減少3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟纖維化。

圖19係給予纖溶酶原7天後缺血再灌注急性腎損傷模型小鼠腎臟HE染色代表性圖片。A為假手術組，B為給溶媒PBS對照組，C為給纖溶酶原組。結果顯示，假手術組腎小球毛細血管通暢，腎小管胞漿紅染，呈正常的腎小管形態；給溶媒PBS對照組可見腎小球輕度的炎細胞浸潤(三角標識)，腎間質大量的炎細胞浸潤，部分腎小管呈現膿管型(細箭頭標識)，少量腎小管細胞核固縮，大面積的上皮細胞扁平化(粗箭頭標識)，腎小管擴張；相較於給溶媒PBS對照組，給纖溶酶原組只有少量的腎小管上皮扁平化，大部分的腎小管已經恢復正常腎小管形態，胞漿紅染，未發現明顯的腎小管萎縮，只有腎間質有輕度的炎細胞浸潤，已接近假手術組形態。說明纖溶酶能改善缺血再灌注急性腎損傷模型小鼠腎臟損傷。

“腎臟病變”是各種原因引起的腎臟結構和功能障礙。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體。

“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列(序列4)計算由810個氨基酸組成，分子量約為92kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Metl-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成(不含有19個氨基酸的信號肽)，編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-纖溶酶原(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域^[22,23]，有文獻報導了δ-纖溶酶原的氨基酸序列(序列8)^[23]，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纖溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[24]，其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原(Micro-plasminogen)僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[25]，也有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)，本專利序列參考專利文獻CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在本申請中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義為受試者體內纖溶酶原的含量或活性比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義為受試者體內纖溶酶原的含量或活性顯著低於正常人，甚至活性或表達極微，只有通過外源提供才能維持正常生理功能。

本領域技術人員可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。

在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原啟動劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變為呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。已知多種能夠作為纖溶酶原啟動劑的酶，包括：組織纖溶酶原啟動劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原啟動劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因數XII(哈格曼因數)等。

“纖溶酶原活性片段”是指在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結合並發揮蛋白水解功能的活性片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。本發明所述的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶域的蛋白質，較佳，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列的蛋白質。因此，本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。

目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖溶酶原啟動劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原啟動劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg)、血漿組織纖溶酶原啟動劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原啟動劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的纖溶酶原在SK的作用下，轉變成纖溶酶，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性(如酸性，鹼性，疏水性，等)的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是眾所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN演算法的70%至99%的相似度(同一性)。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA演算法確定具有60%以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上為最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99%(按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原也包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數(%)”定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公眾可得到的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何演算法。然而，為了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。

在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算：分數X/Y乘100

其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情況下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。

如本文中使用的，術語“治療”和“處理”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀，和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀，並且包括：(a)預防疾病在受試者體內發生，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷為具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退。

術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠，小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。“治療有效量”會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

2.本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，也可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支援物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁於The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield，等J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6：3-10和Camarero JA等2005 Protein Pept Lett.12：723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複迴圈後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水準表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於克隆主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統，色氨酸(trp)啟動子系統，β-內醯胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情況中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啟動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母也可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達並生成本發明的纖溶酶原(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啟動子和增強子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必需的加工資訊位元點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱、親和柱、柱層析、高效液相層析(HPLC)、凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除主題抗體以外的大分子，等等。

3.藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體、賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。

本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗高血壓的藥物、抗心律失常的藥物、治療糖尿病的藥物等。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸與乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

4.給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)、肌內、鼻內、表面或皮內施用或脊髓或腦投遞來實現本發明藥物組合物的施用。氣溶膠製劑如鼻噴霧製劑包含活性劑的純化的水性或其它溶液及防腐劑和等滲劑。將此類製劑調節至與鼻粘膜相容的pH和等滲狀態。

在一些情況中，可以以下方式修飾或配製本發明的纖溶酶原藥物組合物，從而提供其穿過血腦屏障的能力。可以通過各種腸內和胃腸外施用路徑，包括口服、靜脈內等對患有血栓和/或血栓相關疾病的個體施用此類纖溶酶原的組合物。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

在一些實施方案中，本發明的纖溶酶原與促進穿過血腦屏障的藥劑配製在一起。在一些情況中，本發明的纖溶酶原直接或經接頭與促進穿過血腦屏障的載體分子、肽或蛋白質融合。在一些實施方案中，本發明的纖溶酶原與結合內源血腦屏障(BBB)受體的多肽融合。連接纖溶酶原與結合內源BBB受體的多肽，促進穿過BBB。結合內源BBB受體的合適的多肽包括抗體，例如單克隆抗體，或其抗原結合片段，其特異性結合內源BBB受體。合適的內源BBB受體包括但不限於胰島素受在一些情況中，抗體是囊封於脂質體中的。參見例如美國專利公開文本No.2009/0156498。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以為例如每天約0.0001至2000mg/kg，或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的範圍，或至少1mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量也涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要即時評估、定期評估血栓和血栓相關疾病的治療效果和安全性。

5.治療效力

本發明的一個實施方案涉及使用纖溶酶原治療受試者後，對治療效力和治療安全性的判斷。其中臨床上對治療效力的判斷方法包括但不限於檢測如下指標，從而評估腎功能：血清肌酸酐水準、肌酸酐清除率、24-小時尿蛋白排出率(UAER)、腎小球濾過率、尿白蛋白/肌酸酐比例、白蛋白分泌率和腎臟活檢等。例如，腎小球濾過率可以說明腎小球過度濾過和過度灌注的情況，指示糖尿病腎病早期症狀緩解程度。腎小球濾過率是腎臟每分鐘產生的濾液的體積，可用各種方法確定，如測量過濾標記物如聚糖、碘酞酸鹽或碘海醇的尿清除率。更常用的方法是，可通過確定肌酸酐(一種由肌肉產生並釋放到血液中的蛋白質)清除率來估算腎小球濾過率。肌酸酣清除率(通常表示為毫升/分鐘)可通過比較給定時間(例如12或24小時)內尿液中收集的肌酸酐水準和血液中的肌酸酐水準來確定。成年男性的典型肌酸酐清除率約為97-137毫升/分鐘，成年女性約為88-128毫升/分鐘。肌酸酣清除率與尿肌酸酐排泄成正比，與血清肌酸酐濃度成反比。

通常將肌酸酐清除率/腎小球濾過率或尿白蛋白排出率作為主要效力評估指標。同時可以增添其他次要指標以評估本發明藥物對相關併發症的效力，例如增加甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白等檢測來評估血脂變化，增加治療前後收縮壓、舒張壓水準檢測來評估高血壓狀況緩解程度等。

6.製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含可用於治療糖尿病腎病的本發明纖溶酶原。所述製品較佳包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖溶酶原。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述糖尿病腎病和糖尿病腎病相關疾病。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液、稀釋劑、過濾物、針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

實施例 實施例1纖溶酶原對慢性腎損傷模型腎臟的保護作用

8-9周齡的PLG^+/+小鼠20隻以及PLG^-/-小鼠6隻，PLG^+/+小鼠隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各10隻。給纖溶酶原組、給溶媒PBS對照組以及PLG^-/-小鼠每天飼餵0.25%嘌呤飼料(南通特洛菲)，建立慢性腎損傷模型^[26]。造模當天記為第1天，同時開始給藥。給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS，連續造模給藥10天，PLG^-/-小鼠不做處理。第11天處死小鼠取腎臟於4%的多聚甲醛中固定24小時。固定後的腎臟經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，切片在200(圖1A、B、C)、400(1D)倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，PLG^-/-小鼠腎臟(圖1C、1D)病變最嚴重，可觀察到大量的膿管型(箭頭所示)，少量的嘌呤結晶(三角標識)，腎小管大面積萎縮，上皮細胞扁平化；與PLG^-/-小鼠相比，給溶媒PBS對照組小鼠腎臟(圖1A)損傷輕，儘管腎小球萎縮和腎小管壞死還很嚴重，但未發現明顯的嘌呤結晶，膿管型相對較輕；給纖溶酶原組小鼠(圖1B)腎小管萎縮的面積比PBS對照組小，腎小管擴張也較之輕，未發現膿管型。說明纖溶酶原能修復慢性腎損傷模型小鼠腎臟的損傷。

實施例2纖溶酶原修復慢性腎損傷模型腎臟的纖維化

8-9周齡雄性PLG^+/+小鼠12隻以及PLG^-/-小鼠6隻，PLG^+/+小鼠隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組各6隻，慢性腎損傷模型造模方式同實施例1所述。造模當天記為第1天，同時開始給藥。給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS，連續造模給藥10天，PLG^-/-小鼠不做處理。第11天處死小鼠取腎臟於4%多聚甲醛中固定24小時。固定後的腎臟經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟至水後水洗1次，以0.1%天狼星紅染色60分鐘後，流水沖洗，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精和氨水分化返藍，流水沖洗，烘乾後封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

天狼星紅染色可使膠原持久染色，作為病理切片特殊染色方法，天狼星紅染色可以特異顯示膠原組織。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖2B)和給溶媒PBS對照組(圖2A)膠原的沉積明顯少於PLG^-/-組(圖2C)，且統計差異顯著(圖2D)。此外，給纖溶酶原組膠原的沉積明顯少於給溶媒PBS對照組。說明纖溶酶原在修復慢性腎損傷模型的腎臟纖維化過程中起關鍵作用。

實施例3纖溶酶原促進慢性腎損傷小鼠腎臟的凋亡抑制蛋白Bcl-2表達

8-9周齡雄性PLG^+/+小鼠18隻，隨機分為三組，空白對照組、給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各6隻。慢性腎損傷模型造模方式同實施例1所述。造模當天記為第1天，同時開始給藥。空白對照組飼餵正常維持飼料。給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS，連續造模給藥10天，空白對照組小鼠組不做任何處理。開始造模給藥定為第1天，第11天處死小鼠取腎臟於4%多聚甲醛中固定24小時。固定後的腎臟經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠Bcl-2抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

Bcl-2為細胞凋亡抑制蛋白，在凋亡刺激因數作用下表達下調^[27,28]。Bcl-2免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖3C)腎Bcl-2陽性著色明顯深於給溶媒PBS對照組(圖3B)，並且與空白對照組(圖3A)Bcl-2陽性著色程度近似。這表明纖溶酶原能促進慢性腎損傷模型小鼠腎臟中細胞凋亡抑制分子Bcl-2的表達，從而有助於保護慢性腎損傷小鼠腎臟組織細胞免於凋亡。

實施例4纖溶酶原改善慢性腎損傷小鼠腎臟的局部損傷

8-9周齡雄性PLG^+/+小鼠18隻，隨機分為三組，空白對照組、給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各6隻。慢性腎損傷模型造模方式同實施例1所述。造模當天記為第1天，同時開始給藥，空白對照組飼餵正常維持飼料。給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS，連續造模給藥10天，空白對照組不做任何處理。第11天處死小鼠取腎臟於4%多聚甲醛中固定24小時。固定後的腎臟經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加山羊抗鼠IgM(HRP)抗體(Abcam)室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

IgM抗體在清除凋亡和壞死細胞過程中發揮著重要作用，損傷的組織器官局部IgM抗體的水準與損傷程度呈正相關^[29,30]。因此，檢測組織器官局部IgM抗體的水準能夠反映該組織器官的損傷程度。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖4C)小鼠腎臟IgM的陽性著色比給溶媒PBS對照組淺(圖4B)，並且範圍較對照組小，著色與空白對照小鼠(圖4A)非常接近。這表明注射纖溶酶原後腎小球的損傷得到了明顯的改善，反映出纖溶酶原對慢性腎損傷小鼠腎臟損傷有顯著修復作用。

實施例5纖溶酶原減少慢性腎損傷小鼠腎臟纖維蛋白的表達

8-9周齡雄PLG^+/+小鼠12隻以及PLG^-/-小鼠6隻，PLG^+/+小鼠隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各6隻。慢性腎損傷模型造模方式同實施例1所述。造模當天記為第1天，同時開始給藥，造模給藥週期4天，空白對照組飼餵正常維持飼料。給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS，PLG^-/-不做任何處理。第5天處死小鼠取腎臟於4%多聚甲醛中固定24小時。固定後的腎臟經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組識，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠纖維蛋白抗體(Abcam)4℃孵育過夜，PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機體對損傷的一種應激反應，纖維蛋白原水解成纖維蛋白沉積在損傷部位^[31,32]。因此，可將損傷局部纖維蛋白水準作為損傷程度的一個標誌。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖5A)腎臟纖維蛋白的陽性著色深於給纖溶酶原組小鼠(圖5B)，且PLG^-/-組(圖5C)著色深於給溶媒PBS對照組。這表明纖溶酶原能在一定程度上修復腎臟組織的損傷。

實施例6纖溶酶原促進順鉑所致的腎臟損傷的修復

8-9周齡健康的雄性C57小鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。分組完成後，按10mg/Kg體重單次腹腔注射順鉑^[33]，建立化療損傷模型。建立模型後，給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組以相同方式給予相同體積的PBS。實驗開始當天為第0天稱量體重並分組，第1天開始腹腔注射順鉑造模，造模後3小時內給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為7天。第8天處死小鼠，取腎臟在10%中性福馬林固定液中固定24-48小時。固定後的腎臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為4μm，切片脫蠟複水後水洗1次。檸檬酸修復30分鐘，室溫冷卻10分鐘後水輕柔沖洗。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加山羊抗鼠IgM(HRP)抗體(Abcam)室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

IgM抗體在清除凋亡和壞死細胞過程中發揮著重要作用，組織器官損傷局部IgM抗體的水準與損傷程度呈正相關^[29,30]。因此，檢測組織器官局部IgM抗體的水準能夠反映該組織器官的損傷情況。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖6B)IgM陽性表達明顯低於給溶媒PBS對照組(圖6A)，且統計差異顯著(圖6C)。說明纖溶酶原能促進腎臟損傷的修復。

實施例7纖溶酶原減輕順鉑化療損傷模型小鼠腎臟的纖維化

8-9周齡健康的雄性C57小鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。分組完成後，建立化療損傷模型，按10mg/Kg體重單次腹腔注射順鉑^[33]。建立模型後，給纖溶酶原組1mg/0.1ml/隻/天經尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射給予相同體積的PBS。實驗開始當天為第0天並稱重分組，第1天開始腹腔注射順鉑造模，造模後3小時內給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為7天。第8天處死小鼠，取腎臟在4%多聚甲醛固定液中固定24小時。固定後的腎臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為4μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠IV膠原抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories，Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水返藍5分鐘，然後TBS洗1次。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖7A)腎臟IV型膠原陽性表達明顯高於給纖溶酶原組(圖7B)。說明纖溶酶原能夠減輕順鉑損傷模型小鼠腎臟的纖維化。

實施例8纖溶酶原減輕糖尿病小鼠腎臟纖維化

24-25周齡雄性db/db小鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。實驗開始當天記為第0天並稱重分組，第1天開始給纖溶酶原或PBS，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積的PBS。給纖溶酶原31天後處死小鼠並取腎臟組織在4%多聚甲醛固定液中固定24小時。固定後的腎臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為4μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加IV膠原的兔多克隆抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，TBS洗2次。按DAB試劑盒(Vector laboratories，Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘，梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

糖尿病腎病是糖尿病慢性併發症，腎小球硬化以及腎間質纖維化是其典型的病理改變^[34]。本發明實驗結果顯示，給纖溶酶原組(圖8B)IV膠原陽性著色明顯淺於給溶媒PBS對照組(圖8A)，說明纖溶酶原能減輕糖尿病小鼠腎臟的纖維化。

實施例9纖溶酶原減輕糖尿病小鼠腎臟纖維化

26周齡雄性db/db小鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，第1天開始給纖溶酶原或PBS，連續給藥35天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積的PBS。第36天處死小鼠並取腎臟組織在4%多聚甲醛固定液中固定24小時。固定後的腎臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為4μm，切片脫蠟複水後放入重鉻酸鉀溶液過夜。鐵蘇木素染3到5分鐘，流水洗。1%鹽酸酒精分化，氨水處理1秒，水洗。麗春紅酸性品紅液染8分鐘，水中快速漂洗。1%磷鉬酸水溶液處理約2分鐘，苯胺藍液複染6分鐘。1%冰醋酸漂洗約1分鐘。無水乙醇脫水二甲苯透明後封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

Masson染色可以顯示組織的纖維化。結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖9A)，腎間質輕度纖維化，增生的纖維化呈藍色。給纖溶酶原組(圖9B)與給溶媒PBS對照組相比腎間質纖維化明顯減少。說明纖溶酶原能降低糖尿病小鼠腎臟的纖維化。

實施例10纖溶酶原降低系統性硬化症小鼠腎臟纖維化

取12周齡C57雄鼠10隻，稱重後隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各5隻。所有小鼠按0.1mg/0.1ml/隻/天皮下注射博萊黴素誘導系統性硬化症^【35】，當天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥21天。給纖溶酶原組小鼠按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射給予相同體積的PBS。在第22天處死小鼠並取腎臟在4%多聚甲醛固定液中固定24小時。固定後的腎臟經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟至水後水洗1次，以0.1%天狼星紅飽和苦味酸染色30分鐘後，流水沖洗2min，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，流水沖洗，烘乾後中性樹膠封片，在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，在博萊黴素誘導的系統性硬化症小鼠模型中，給溶媒PBS對照組(圖10A)腎臟膠原沉積明顯多於給纖溶酶原組(圖10B)。說明纖溶酶原有效降低系統性硬化症小鼠的腎臟纖維化。

實施例11纖溶酶原促進慢性腎損傷模型小鼠腎臟功能的修復

8-9周齡的PLG^+/+小鼠10隻以及PLG^-/-小鼠6隻，慢性腎損傷模型造模方式同實施例1所述。造模當天記為第1天，造模週期10天。在第11天摘除眼球取血，離心取上清，檢測血清中尿素氮濃度。尿素氮含量採用尿素氮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號C013-2)，並按該尿素氮檢測試劑盒所述方法進行檢測。

結果顯示，PLG^+/+組血清中尿素氮濃度明顯低於PLG^-/-組，且統計差異顯著(圖11)。說明纖溶酶原能顯著改善慢性腎損傷模型小鼠的腎功能。

實施例12纖溶酶原促進慢性腎損傷模型小鼠腎臟功能的修復

8-9周齡的PLG^+/+小鼠20隻以及PLG^-/小鼠6隻，PLG^+/+小鼠隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組各10隻。慢性腎損傷模型造模方式同實施例1所述。造模當天記為第1天，同時開始給藥，給藥週期4天。給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積的PBS，PLG^-/-小鼠不做任何處理。第5天摘除眼球取血，離心取上清，檢測血清中肌酐濃度。血清肌酐濃度採用肌酐檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號C011-2)，並按該試劑盒所述方法進行檢測。

結果顯示，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組血清中肌酐濃度明顯低於PLG^-/-組小鼠，且統計差異顯著。此外，給纖溶酶原組血清中肌酐濃度明顯低於給溶媒PBS對照組(圖12)。說明纖溶酶原能顯著改善慢性腎損傷模型小鼠的腎功能。

實施例13纖溶酶原促進急性腎損傷模型小鼠腎臟功能的修復

7周齡雄性C57小鼠9隻，隨機分為兩組，給纖溶酶原組5隻，給溶媒PBS對照組4隻。所有小鼠按照250mg/kg體重單次腹腔注射葉酸(sigma A7876)溶液，誘導急性腎損傷^【36】。葉酸溶解在0.3mol/L NaHCO₃。造模當天記為第1天，同時開始給纖溶酶原或溶媒PBS，給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積的PBS，給藥為期7天。在第8天摘眼球取血，離心取上清，檢測血清中尿素氮濃度。尿素氮含量採用尿素氮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號C013-2)，並按該尿素氮檢測試劑盒所述方法進行檢測。

結果顯示，給纖溶酶原組血清中尿素氮濃度明顯低於給溶媒PBS對照組，且統計差異接近顯著(P=0.06)(圖13)。說明纖溶酶原能顯著改善急性腎損傷模型小鼠的腎功能。

實施例14纖溶酶原降低3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟脂肪沉積

9周齡雄性C57小鼠16隻飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲)4周，誘導高脂血症^[37，38]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型，成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。另取相同周齡的雄性C57小鼠5隻作為空白對照組，實驗期間飼餵普通維持飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇，模型小鼠根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各8隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS，給藥30天。第31天處死小鼠，取腎臟於4%多聚甲酸固定24-48小時，分別於15%、30%蔗糖中4℃過夜沉底，OCT包埋，冰凍切片厚度8μm，油紅O染色15min，75%酒精分化5秒，蘇木素染核30秒，甘油明膠封片。切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

油紅O染色可顯示脂質沉積，反映脂質沉積的程度^[37]。結果顯示，給纖溶酶原組(圖14C)小鼠腎臟脂肪沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組(圖14B)，且定量分析統計差異顯著(圖14D)；此外，給纖溶酶原組脂質沉積水準與空白對照組小鼠(圖14A)相似。說明纖溶酶原能消減脂肪在高脂血症模型小鼠腎臟中的沉積，從而減少脂肪沉積所致腎的髒損傷。

實施例15纖溶酶原改善葉酸急性腎損傷模型小鼠腎臟損傷

7周齡雄性C57小鼠15隻，隨機分為三組，空白對照組3隻，給纖溶酶原組7隻，給溶媒PBS對照組5隻。給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組小鼠按照250mg/kg體重單次腹腔注射葉酸(sigma A7876)溶液，誘導急性腎損傷模型^[36]，空白對照組單次腹腔注射相應體積的NaHCO₃溶液。葉酸溶解在0.3mol/L NaHCO₃溶液中。造模當天記為第1天，同時開始給纖溶酶原或溶媒PBS，給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積的PBS，給藥為期7天。第8天處死小鼠取腎臟於4%多聚甲醛中固定24小時。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，空白對照組(圖15A)腎臟核呈圓形或橢圓形，胞漿紅染，腎小球及腎小管均形態正常；給溶媒PBS對照組(圖15B)腎臟呈大部分的腎小管上皮細胞扁平化(粗箭頭標識)，刷狀緣脫落，部分細胞核固縮，只有部分腎小管呈現淡染的胞漿，部分腎小管還可見膿管型(細箭頭標識)，腎小球及腎間質輕度的炎細胞浸潤；給纖溶酶原組(圖15C)與給溶媒PBS對照組相比，腎小管擴張及上皮細胞扁平化明顯好轉，可見大部分的腎小管胞漿呈現紅染，未見膿管型。說明，纖溶酶能改善葉酸誘導的急性腎損傷。

實施例16纖溶酶原促進葉酸急性腎損傷模型小鼠腎臟Bcl-2的表達

7周齡雄性C57小鼠12隻，隨機分為兩組，給纖溶酶原組7隻，給溶媒PBS對照組5隻。所有小鼠按照250mg/kg體重單次腹腔注射葉酸(sigma A7876)溶液，誘導急性腎損傷^[36]。葉酸溶解在0.3mol/L NaHCO₃。造模當天記為第1天，同時開始給纖溶酶原或溶媒PBS，給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積的PBS，給藥為期7天。第8天處死小鼠取腎臟於4%多聚甲醛中固定24小時。固定後的腎臟經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗小鼠Bcl-2抗體(Abcam)4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明並中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

Bcl-2免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖16B)腎臟Bcl-2陽性著色明顯多於給溶媒PBS對照組(圖16A)，且統計差異顯著(圖16C)。這表明纖溶酶原能促進急性腎損傷模型小鼠腎臟中細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達，從而有助於保護急性腎損傷小鼠腎臟組織細胞免於凋亡。

實施例17纖溶酶原減少葉酸急性腎損傷模型小鼠腎臟損傷

7周齡雄性C57小鼠12隻，隨機分為兩組，給纖溶酶原組7隻，給溶媒PBS對照組5隻。所有小鼠按照250mg/kg體重單次腹腔注射葉酸(sigma A7876)溶液，誘導急性腎損傷^[36]。葉酸溶解在0.3mol/L NaHCO₃溶液中。造模當天記為第1天，同時開始給纖溶酶原或溶媒PBS，給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積的PBS，給藥為期7天。第8天處死小鼠取腎臟於4%多聚甲醛中固定24小時。固定後的腎臟經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加山羊抗鼠IgM(HRP)抗體(Abcam)室溫孵育1小時，PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖17B)小鼠腎臟IgM的陽性著色比給溶媒PBS對照組(圖17A)淺，並且範圍較對照組小。這表明注射纖溶酶原後腎臟IgM的表達明顯降低，反映出纖溶酶原能有效減少葉酸急性腎損傷小鼠腎臟損傷。

實施例18纖溶酶原降低3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟纖維化

9周齡雄性C57小鼠16隻飼餵3%膽固醇高脂飼料(南通特洛菲)4周，誘導高脂血症^[37，38]，此模型定為3%膽固醇高脂血症模型，成模後的小鼠繼續飼餵3%膽固醇高脂飼料。另取相同周齡的雄性C57小鼠5隻作為空白對照組，實驗期間飼餵普通維持飼料。在給藥前三天每隻小鼠取血50μL，檢測總膽固醇，模型小鼠根據總膽固醇濃度和體重隨機分為兩組，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各8隻。開始給藥記為第1天，給纖溶酶原組小鼠尾靜脈注射人源纖溶酶原1mg/0.1ml/隻/天，給溶媒PBS對照組尾靜脈注射同體積的PBS。在第30天給藥後小鼠給藥30天，於第31天處死小鼠，取腎臟於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片厚度為3μm，切片脫蠟複水後水洗1次，以0.1%天狼星紅飽和苦味酸染色30 分鐘後，流水沖洗2min，蘇木素染色1分鐘，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，流水沖洗，烘乾後中性樹膠封片，在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，給纖溶酶原組(圖18C)腎臟膠原蛋白沉積(箭頭標識)明顯少於給溶媒PBS對照組(圖18B)，且統計差異顯著(圖18D)；給纖溶酶原組纖維化基本恢復到正常水準(圖18A)。說明纖溶酶原能有效的減少3%膽固醇高脂血症模型小鼠腎臟纖維化。

實施例19纖溶酶原減少缺血再灌注急性腎損傷模型小鼠腎臟損傷

7-9周齡雄性PLG^+/+小鼠9隻，隨機分為三組，假手術組、給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組，每組各3隻。所有小鼠用戊巴比妥鈉按照50mg/kg體重腹腔注射麻醉。給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組小鼠在腹部開個缺口，暴露腎臟，分離雙側動靜脈，用血管夾夾住雙側動靜脈，夾好後腎臟移入腹腔，閉合傷口。時間到後再次暴露腎臟，移除血管夾，觀察腎臟情況，確定再灌注後，縫合傷口。假手術組組腹部開個缺口，僅暴露腎臟，不做缺血處理，時間到後縫合傷口^[39]。手術完成後每隻小鼠腹腔注射1mL 37℃生理鹽水。手術期間保持體溫在36.5-38℃。造模當天記為第1天，同時開始給纖溶酶原或溶媒PBS，給纖溶酶原組按1mg/0.1ml/隻/天尾靜脈給予纖溶酶原，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積的PBS，假手術小鼠不做注射處理，給藥為期7天。第8天處死小鼠取腎臟於4%多聚甲醛中固定24小時。組織切片厚度為3μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

結果顯示，假手術組(圖19A)腎小球毛細血管通暢，腎小管胞漿紅染，呈正常的腎小管形態；給溶媒PBS對照組(圖19B)可見腎小球輕度的炎細胞浸潤(三角標識)，腎間質大量的炎細胞浸潤，部分腎小管呈現膿管型(細箭頭標識)，少量腎小管細胞核固縮，大面積的上皮細胞扁平化(粗箭頭標識)，腎小管擴張；相較於給溶媒PBS對照組，給纖溶酶原組(圖19C)只有少量的腎小管上皮扁平化，大部分的腎小管已經恢復正常腎小管形態，胞漿紅染，未發現明顯的腎小管萎縮，只有腎間質有輕度的炎細胞浸潤，已接近假手術組形態。說明纖溶酶能改善缺血再灌注急性腎損傷模型小鼠腎臟損傷。

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<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 2433

<212> DNA

<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的核酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的氨基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 2145

<212> DNA

<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)核酸序列

<400> 5

<210> 6

<211> 714

<212> PRT

<213> LYS77-PLG(Lys-纖溶酶原)氨基酸序列

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<212> DNA

<213> delta-plg(delta-纖溶酶原)核酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 414

<212> PRT

<213> delta-plg(delta-纖溶酶原)氨基酸序列

<400> 8

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<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 9

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<211> 367

<212> PRT

<213> Mini-plg(小纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列

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<212> DNA

<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 11

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<213> Micro-plg(微纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 12

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<211> 684

<212> DNA

<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的核酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的氨基酸序列

<400> 14

Claims

一種纖溶酶原用於製備促進受試者腎組織損傷修復和/或減輕其纖維化之藥物的用途。
如申請專利範圍第1項所述的用途，其中所述腎組織損傷為藥物、自身免疫反應、缺血再灌注、糖尿病、或高血脂所致的腎組織損傷。
如申請專利範圍第2項所述的用途，其中所述腎組織損傷選自：糖尿病、動脈粥樣硬化、系統性硬化症、系統性紅斑狼瘡、或高脂血症所致的腎組織損傷。
如申請專利範圍第1項所述的用途，其中所述腎組織損傷為慢性腎臟疾病導致的腎組織損傷。
如申請專利範圍第4項所述的用途，其中所述慢性腎臟疾病為慢性腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎、腎病綜合症、腎功能不全、或腎衰或尿毒症。
如申請專利範圍第2項所述的用途，其中所述慢性腎臟疾病為藥物導致的慢性腎損傷。
如申請專利範圍第6項所述的用途，其中所述藥物包括化療藥物、降血壓藥物、降血脂藥物、降血糖藥物、非類固醇抗炎藥物、抗生素藥物、或抗病毒藥物。
如申請專利範圍第7項所述的用途，其中所述藥物為化療藥物。
一種纖溶酶原用於製備預防和/或治療受試者急性腎組織損傷之藥物的用途。
如申請專利範圍第9項所述的用途，其中所述纖溶酶原減輕急性腎組織損傷所致的腎組織細胞凋亡。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的用途，其中所述促進受試者腎組織損傷修復為降低受試者血清尿素氮水準。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的用途，其中所述促進受試者腎組織損傷修復為降低受試者血清肌酐水準。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段，並且仍然具有纖溶酶原活性的蛋白質。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性的變體或片段。
如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述的用途，其中所述纖溶酶原與一種或多種選自如下的藥物聯合施用：降血壓藥物、降血脂藥物、抗生素藥物、抗凝藥物、溶血栓藥物、利尿藥、抗腫瘤藥、降血糖藥、非甾體類抗炎藥、免疫調節藥物、抗感染藥物、抗病毒藥物、激素、天然產物活性成分。