CN108210894A - 预防和治疗病理性肾组织损伤的药物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及预防和/或治疗受试者肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原，其中所述受试者有肾组织损伤风险、怀疑有肾组织损伤、或罹患肾组织损伤。本发明还涉及在用于预防和/或治疗受试者肾组织损伤及其相关病症的包含纤溶酶原的药物、药物组合物、制品、试剂盒。

Description

预防和治疗病理性肾组织损伤的药物及其用途

技术领域

本发明涉及纤溶酶原在预防和治疗肾脏病变方面的作用，进而为治疗不同原因导致的肾脏病变及其相关病症提供全新的治疗策略。

发明背景

肾脏病变是各种原因引起的肾脏结构变化和功能障碍。肾脏病变导致肾组织结构的损伤，继而影响其功能。肾脏病变可以是原发的，例如感染、炎症、变态反应等引发的肾小球肾炎、慢性肾盂肾炎、肾病综合征、肾功能不全、肾小球硬化、肾小球系膜增生、肾小管间质病变、肾小管萎缩等；也可以继发于其它疾病，例如可以由于缺血、代谢紊乱，例如糖代谢、脂肪代谢紊乱、肿瘤等其他疾病导致肾脏病变。

例如高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病常伴有肾脏病变。高血压是常见的慢性疾病之一，该病的主要表现为体循环动脉压增高，如果对高血压患者的血压控制不好，容易发生脑卒中、冠心病、视网膜病变以及慢性肾脏疾病等并发症。并且长时间的高血压可以使越来越多的组织器官受到影响。所以要加强和预防高血压及高血压的并发症，从而降低高血压带来的危害^[1]。

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)，是糖尿病常见的重要并发症，是糖尿病致死、致残的主要原因。如诊治不及时，DN发展到肾病末期时，将只能采用透析甚至是肾移植。DN早期的主要病理特征是肾小球肥大，肾小球和肾小管基底膜增厚及系膜区细胞外基质的进行性积聚；后期为肾小球、肾小管间质纤维化。临床上早期可表现为肾小球滤过率减少，然后出现微量白蛋白尿、动脉血压升高、蛋白尿和体液潴留，最终导致肾衰竭^[2]。

糖尿病肾病属糖尿病微血管并发症，其发生与高血糖、氧化应激等因素相关，其中高血糖是产生微量白蛋白尿的重要因素^[3]。尿微量白蛋白可以预示糖尿病肾病的进展。而糖尿病动脉粥样硬化属于糖尿病大血管并发症，与高血糖、血管内皮功能紊乱、胰岛素抵抗等因素密切相关。近年有研究发现，蛋白尿与动脉粥样硬化密切相关^[4]。

在发达国家，糖尿病肾病、高血压肾小动脉硬化已成为慢性肾脏病的主要原因。在中国，这两种疾病在各种病因中仍位居原发性肾小球肾炎之后，但近年也有明显增高趋势。

全身性变态反应疾病，例如系统性硬化症、系统性红斑狼疮、系统性血管炎、过敏性紫癜、多发性肌炎、血栓性微血管病等常常累及肾脏。

大部分药物及其代谢产物经肾脏排出体外,因而药物引起的肾损害发生率很高。研究显示药物导致急性肾小管坏死(acute tubular necrosis,ATN)或急性间质性肾炎(acute interstitial nephritis,AIN) 的发生率高达18.3％,其中抗生素肾损害的发生率达36％^[5]。

抗感染类药物，例如氨基糖苷类氨基糖苷类抗生素广泛应用于革兰阴性细菌感染的治疗，然而肾毒性限制了其临床应用^[6]。

抗病毒制剂阿昔洛韦(aciclovir,ACV)是抗疱疹病毒的脱氧鸟苷的环状类似物。胃肠道外给予大剂量阿昔洛韦可导致10％～48％患者出现急性肾功能衰竭(acute renalfailure,ARF),这可能由于阿昔洛韦在肾小管内沉积、发生毒性免疫反应或超敏反应等引起肾内梗阻所致^[7]。阿德福韦(adedovir，ADV)和齐多福韦(cidofovir，CDV)作为核苷类似物,在临床上则常用来治疗乙肝和艾滋病。其肾毒性发生时常表现为肾小管坏死和间质纤维化^[8]。

免疫抑制剂例如环孢素环孢素(cyclosporine A,CsA)作为免疫抑制剂广泛用于器官移植和自身免疫性疾病的治疗。据报道,约有30％接受CsA治疗的患者会出现中到重度肾功能失调。其肾损伤机制是由于肾血管收缩和内皮细胞损伤引起缺血，以及CsA对肾小管上皮细胞的直接毒性作用^[9]。

抗肿瘤药物例如顺铂(cisplatin,Cis)是一种细胞增殖抑制剂,广泛用于睾丸癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、骨癌和头颈癌等实体瘤的治疗中。Cis的抗肿瘤效率高,但同时具有剂量依赖性的肾毒性等^[10]，主要表现为氮质血症、多尿症和肾功能衰竭,以肾小球与肾小管均受损为特征。

非甾体类抗炎药例如乙酰水杨酸乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid， ASA)是世界上应用最广泛的解热镇痛抗炎药。其用于解热镇痛的剂量很少引起不良反应,但长期大量用药时则较易出现副作用,表现为因氧化磷酸化解耦联而使钾离子从肾小管细胞外逸,导致缺钾、尿中尿酸排出过高；较大损害时,可发生间质性肾炎、肾乳头坏死和肾功能减退^[11]。

天然产物活性成分例如马兜铃酸马兜铃酸(aristolochic acid,AA) 作为马兜铃科植物来源的肾毒素,它是著名的马兜铃酸肾病 (aristolochic acid nephropathy,AAN)的病因^[12]。AA引起的肾脏损伤部位主要在肾小管,引起细胞凋亡或死亡,并抑制肾间质成纤维细胞增生,导致肾小管萎缩及寡细胞性间质纤维化。

利尿剂是一类通过抑制肾小管对水、电解质的重吸收,使尿量排出增多的药物。各种利尿剂均有潜在的肾毒性,应用后均有引起肾损害的可能。利尿剂引起的肾毒性与该类药物的细胞毒作用、免疫反应、过敏反应和代谢紊乱等不良反应有关，应尽量避免与肾毒性药物联用, 防止加重肾损害。此外,还有多种药物可引起肾损伤,如磺胺类药物常引起形成磺胺结晶阻塞输尿管引发梗阻性肾病^[13]。降脂药他汀类可引起横纹肌溶解，继而导致肾小管坏死^[14]。

肾脏疾病发展到后期都会引起肾功能部分或者全部丧失，即导致肾衰竭的病理状态。肾衰竭可分为急性肾衰竭及慢性肾衰竭，急性肾衰竭的病情进展快速，通常是因肾脏血流供应不足、肾脏因某种因素阻塞造成功能受损或是受到毒物的伤害，引起急性肾衰竭的产生。而慢性肾衰竭主要原因为长期的肾脏病变，随着时间及疾病的进行，肾脏的功能逐渐下降，造成肾衰竭的发生。

慢性肾功能衰竭是指各种肾脏疾病引起的缓慢进行性肾功能损害，最后导致尿毒症和肾功能完全丧失，引起一系列临床症状和生化内分泌等代谢紊乱组成的临床综合征，从原发病起病到肾功能衰竭的开始，间隔时间可为数年到十余年。

尿毒症是慢性肾功能衰竭的终末期。慢性肾功能衰竭是各种病因引起肾脏损害和进行性恶化的结果。常见的基础疾病有原发性肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎、糖尿病肾病等。其临床表现主要为肾功能减退，代谢废物潴留，水、电解质和酸碱平衡失调，以至不能维持机体内环境的稳定，根据肾功能损害的不同程度，可以将慢性肾功能衰竭分为四个阶段：肾功能不全代偿期、肾功能不全失代偿期、肾功能衰竭期、尿毒症期。

慢性肾功能不全的早期，临床上仅有原发疾病的症状，只在检查中可见到肌酐清除率下降。尿毒症代偿期的患者常在应激情况下，肾功能突然恶化，并出现水、电解质、酸碱代谢紊乱、蛋白质、糖类、脂肪和维生素代谢紊乱、食欲不振或消化不良，病情加重时可出现厌食，恶心、呕吐或腹泻等胃肠道症状等尿毒症的早期症状，临床上称为可逆性尿毒症，一旦应激因素去除，肾功能常可恢复到代偿期。若病情发展到“健存”肾单位不能适应机体最低要求时，即使没有应激因素，尿毒症状也会逐渐表现出来，表现为水电解质代谢紊乱、体内代谢产物蓄积等全身症状以及心血管系统、呼吸系统、血液系统的中度症状。

慢性肾功能不全的药物治疗主要集中在缓解症状、延缓病程进展以及防治并发症三个方面，具体例如纠正酸中毒和水、电解质紊乱、治疗高血压、防治感染、治疗高脂血症，以及针对心血管系统、呼吸系统和血液系统并发症的治疗，同时可进行尿毒症的替代透析治疗，例如血液透析或腹膜透析，或者进行肾移植。

“急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)”是近年来提出的一个新名词，用于取代使用多年的急性肾衰竭(acute renal failure，ARF)，并已获得广泛认可。它是一种常见的临床综合征，主要表现为肾功能的快速下降及代谢废物的蓄积。AKI发病率高，且呈逐年上升趋势。国外报道近10年来AKI的发病率从0.65‰增长到5‰，需要透析的AKI 发病率为0.295‰^[15-16]。住院患者AKI发生率为1.9％，重症监护病房则可高达60％^[17]。目前尚没有治疗AKI的特效药物，重症患者需要肾脏替代治疗^[18]。AKI的预后亦不容乐观，ATN和RENAL研究^[19-20]报道重症患者发生AKI后的病死率分别为53.0％和44.7％，且存活的患者也容易进展至慢性肾病乃至终末期肾病^[21]。因此，AKI越来越引起临床医师的重视。

对于各种原因导致的肾组织损伤，人们一直渴望寻找到更有效的治疗药物。本发明经过研究发现，纤溶酶原能够促进损伤的损伤的肾脏组织修复、肾功能的恢复，同时纤溶酶原还能抑制损伤的肾脏组织细胞凋亡、降低其纤维化。因此，纤溶酶原有望成为一种新型的肾脏疾病治疗药物。

发明概述

本发明涉及如下各项：

在一方面，本发明涉及：项1.一种预防和/或治疗受试者肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原，其中所述受试者有肾组织损伤风险、怀疑有肾组织损伤、或罹患肾组织损伤。

项2.项1的方法，其中所述肾组织损伤包括感染、炎症、变态反应、自身免疫、缺血、微血管病变、血栓、创伤、辐射损伤、糖代谢紊乱、电解质紊乱、脂肪代谢紊乱、癌症所致肾组织损伤。

项3.项1或2的方法，其中所述肾组织损伤为选自如下的全身性疾病导致的肾组织损伤：高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、高脂血症、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、系统性血管炎、过敏性紫癜、多发性肌炎、血栓性微血管病。

项4.项1或2的方法，其中所述肾组织损伤为慢性肾脏疾病导致的肾组织损伤。

项5.项4的方法，其中所述慢性肾脏疾病为慢性肾小球肾炎、慢性肾盂肾炎、肾病综合征、肾功能不全、肾衰或尿毒症。

项6.项1或2的方法，其中所述慢性肾脏疾病为药物导致的慢性肾损伤。

项7.项6的方法，其中所述药物包括化疗药物、降血压药物、降血脂药物、降血糖药物、非类固醇抗炎药物、抗生素药物、抗病毒药物。

项8.项7的方法，其中所述药物为化疗药物，具体为顺铂。

在另一方面，本发明涉及：项9.一种预防和/或治疗受试者急性肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原保护肾组织。

项10.项9的方法，其中所述纤溶酶原减轻急性肾组织损伤所致的肾组织细胞凋亡。

项11.项9或10的方法，其中所述纤溶酶原促进损伤肾组织的修复。

项12.项9-11任一项的方法，其中所述纤溶酶原减轻损伤肾组织的纤维化。

项13.项9-12任一项的方法，其中所述纤溶酶原促进肾功能恢复。

项14.项1-13任一项的方法，其中所述肾损伤为急性肾小球肾炎、急性肾盂肾炎、急性肾损伤、急性肾功能衰竭、急性肾功能不全、急性肾小管坏死。

项15.项1-13的方法，其中所述急性肾损伤为化疗药物导致的急性肾损伤。

在另一方面，本发明涉及：项16.一种预防和/或治疗受试者慢性肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原保护肾组织。

项17.项16的方法，其中所述纤溶酶原减轻肾组织细胞凋亡。

项18.项16或17的方法，其中所述纤溶酶原促进损伤肾组织的修复。

项19.项16-18任一项的方法，其中所述纤溶酶原减轻损伤肾组织的纤维化。

项20.项16-19任一项的方法，其中所述纤溶酶原促进肾功能恢复。

项21.项16-20任一项的方法，其中所述慢性肾损伤为肾脏组织的慢性疾病导致的肾组织损伤。

项22.项16-20任一项的方法，其中所述慢性肾损伤为其它疾病引发或伴有的肾组织损伤。

项23.项22的方法，其中所述其它疾病包括高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、高脂血症、肝炎、肝硬化、冠心病、心绞痛、心肌梗死。

项24.项23的方法，其中所述其它疾病为高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、高脂血症。

在另一方面，本发明涉及：项25.一种预防和/或治疗受试者脂质沉积导致的肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

项26.项25的方法，其中所述脂质沉积是由于受试者脂肪代谢异常或糖代谢异常导致的高脂血症所致。

在另一方面，本发明涉及：项27.一种预防和/或治疗受试者糖尿病引发或伴随的肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

在另一方面，本发明涉及：项28.一种预防和/或治疗受试者高脂血症引发或伴随的肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

在另一方面，本发明涉及：项29.一种预防和/或治疗受试者动脉粥样硬化引发或伴随的肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

在另一方面，本发明涉及：项30.一种预防和/或治疗受试者缺血性肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

项31.项30的方法，其中所述纤溶酶原减轻肾组织细胞凋亡。

项32.项30或31的方法，其中所述纤溶酶原促进损伤肾组织的修复。

项33.项30-32任一项的方法，其中所述纤溶酶原减轻损伤肾组织的纤维化。

项34.项30-33任一项的方法，其中所述纤溶酶原促进肾功能恢复。

项35.项30-34任一项的方法，其中所述缺血由血管管腔狭窄所致。

项36.项30-34任一项的方法，其中所述缺血由血栓堵塞血管所致。

项37.项35或36的方法，其中所述缺血由高血压、糖尿病、动脉粥样硬化，心脏病所致。

在另一方面，本发明涉及：项38.一种预防和/或治疗受试者缺血再灌注性肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

在另一方面，本发明涉及：项39.一种预防和/或治疗受试者自身免疫反应性肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

项40.项39的方法，其中所述自身免疫反应性肾组织损伤由系统性硬化症所致。

在另一方面，本发明涉及：项41.一种预防和/或治疗受试者炎症性肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原

项42.项41的方法，其中所述炎症为急慢性肾实质炎症或肾间质炎症。

项43.项42的方法，其中所述纤溶酶原减轻肾组织细胞凋亡。

项44.项42或43的方法，其中所述纤溶酶原促进损伤肾组织的修复。

项45.项41-44任一项的方法，其中所述纤溶酶原减轻损伤肾组织的纤维化。

项46.项41-45任一项的方法，其中所述纤溶酶原促进肾功能恢复。

项47.项1-46任一项的方法，其中所述纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。

项48.项1-47任一项的方法，所述纤溶酶原是在序列2、6、8、 10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、 1-4、1-3、1-2、1个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。

项49.项1-48任一项的方法，所述纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。

项50.项1-49任一项的方法，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、 Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。

项51.根据项1-50任一项的方法，其中所述纤溶酶原可与一种或多种选自如下的药物联合施用：降血压药物、降血脂药物、抗生素药物、抗凝药物、溶血栓药物、利尿药、抗肿瘤药、降血糖药、非甾体类抗炎药、免疫调节药物、抗感染药物、抗病毒药物、激素、天然产物活性成分。

项52.项1-51任一项的方法，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。

项53.项1-51任一项的方法，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。

项54.项1-53任一项的方法，所述纤溶酶原的氨基酸如序列2、 6、8、10或12所示。

项55.项1-54任一项的方法，其中所述纤溶酶原是人天然纤溶酶原。

项56.项1-55任一项的方法，其中所述受试者是人。

项57.项1-26任一项的方法，其中所述受试者缺乏或缺失纤溶酶原。

项58.项57的方法，其中所述缺乏或缺失是先天的、继发的和/ 或局部的。

在另一方面，本发明涉及：项59.一种用于项1-58任一项的方法的纤溶酶原。

在另一方面，本发明涉及：项60.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和用于项1-58中任一项所述方法的纤溶酶原。

在另一方面，本发明涉及：项61.一种预防性或治疗性试剂盒，其包含：(i)用于项1-58中任一项所述方法的纤溶酶原和(ii)用于递送所述纤溶酶原至所述受试者的构件(means)。

项62.根据项61所述的试剂盒，其中所述构件为注射器或小瓶。

项63.项61或62的试剂盒，其还包含标签或使用说明书，该标签或使用说明书指示将所述纤溶酶原投予所述受试者以实施项1-58 中任一项所述方法。

在另一方面，本发明涉及：项64.一种制品，其包含：

含有标签的容器；和

包含(i)用于项1-58中任一项所述方法的纤溶酶原或包含纤溶酶原的药物组合物，其中所述标签指示将所述纤溶酶原或组合物投予所述受试者以实施项1-58中任一项所述方法。

项65.项61-63中任一项的试剂盒或项64的制品，还包含另外的一个或多个构件或容器，该构件或容器中含有其他药物。

项66.项65的试剂盒或制品，其中所述其他药物选自下组：降血脂药物、抗血小板药物、降血压药物、扩张血管药物、降血糖药物、抗凝血药物、溶血栓药物，保肝药物，抗心律失常药物，强心药物，利尿药物，抗感染药物、抗病毒药物、免疫调节药物、炎症调节类药物、抗肿瘤药物、激素类药物、甲状腺素。

本发明还涉及纤溶酶原用于实施项1-58任一项的方法的用途。

本发明还涉及纤溶酶原在制备用于项1-58任一项的方法的药物、药物组合物、制品、试剂盒中的用途。

在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：静脉内、肌内、皮下给予纤溶酶原来进行治疗。在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在前述方法的一些实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、 0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、 0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。

本发明明确涵盖了属于本发明实施方案之间的技术特征的所有组合，并且这些组合后的技术方案在本申请中已经明确公开，就像上述技术方案已经单独且明确公开一样。另外，本发明还明确涵盖各个实施方案及其要素的之间的组合，该组合后的技术方案在本文中明确公开。

发明详述

“肾脏病变”是各种原因引起的肾脏结构和功能障碍。

“纤溶酶”是存在于血液中的一种非常重要的酶，能将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体。

“纤溶酶原”是纤溶酶的酶原形式，根据swiss prot中的序列，按含有信号肽的天然人源纤溶酶原氨基酸序列(序列4)计算由810个氨基酸组成，分子量约为92kD，主要在肝脏中合成并能够在血液中循环的糖蛋白，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全长的纤溶酶原包含七个结构域：位于C末端的丝氨酸蛋白酶结构域、N末端的Pan Apple(PAp)结构域以及5个Kringle结构域(Kringle1-5)。参照swiss prot中的序列，其信号肽包括残基Met1-Gly19，PAp包括残基Glu20-Val98，Kringle1包括残基Cys103-Cys181，Kringle2包括残基Glu184-Cys262，Kringle3包括残基Cys275-Cys352，Kringle4包括残基Cys377-Cys454，Kringle5包括残基Cys481-Cys560。根据NCBI 数据，丝氨酸蛋白酶域包括残基Val581-Arg804。

Glu-纤溶酶原是天然全长的纤溶酶原，由791个氨基酸组成(不含有19个氨基酸的信号肽)，编码该序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在体内，还存在一种是从Glu-纤溶酶原的第76-77位氨基酸处水解从而形成的Lys-纤溶酶原，如序列6所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-纤溶酶原 (δ-plasminogen)是全长纤溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5结构的片段，仅含有Kringle1和丝氨酸蛋白酶域^[22,23]，有文献报道了δ-纤溶酶原的氨基酸序列(序列8)^[23]，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纤溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和丝氨酸蛋白酶域组成，有文献报道其包括残基Val443-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)^[24]，其氨基酸序列如序列10所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纤溶酶原(Micro-plasminogen)仅含有丝氨酸蛋白酶结构域，有文献报道其氨基酸序列包括残基Ala543-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)^[25]，也有专利文献CN102154253A报道其序列包括残基Lys531-Asn791(以不含有信号肽的Glu-纤溶酶原序列的Glu残基为起始氨基酸)，本专利序列参考专利文献 CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，编码该氨基酸序列的 cDNA序列如序列11所示。

本发明的“纤溶酶”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶”可互换使用，含义相同；“纤溶酶原”与“纤溶酶原”、“纤维蛋白溶解酶原”可互换使用，含义相同。

在本申请中，所述纤溶酶原“缺乏”的含义为受试者体内纤溶酶原的含量或活性比正常人低，低至足以影响所述受试者的正常生理功能；所述纤溶酶原“缺失”的含义为受试者体内纤溶酶原的含量或活性显著低于正常人，甚至活性或表达极微，只有通过外源提供才能维持正常生理功能。

本领域技术人员可以理解，本发明纤溶酶原的所有技术方案适用于纤溶酶，因此，本发明描述的技术方案涵盖了纤溶酶原和纤溶酶。

在循环过程中，纤溶酶原采用封闭的非活性构象，但当结合至血栓或细胞表面时，在纤溶酶原激活剂(plasminogen activator，PA)的介导下，其转变为呈开放性构象的活性纤溶酶。具有活性的纤溶酶可进一步将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体，进而溶解血栓。其中纤溶酶原的PAp结构域包含维持纤溶酶原处于非活性封闭构象的重要决定簇，而KR结构域则能够与存在于受体和底物上的赖氨酸残基结合。已知多种能够作为纤溶酶原激活剂的酶，包括：组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、激肽释放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纤溶酶原活性片段”是指在纤溶酶原蛋白中，能够与底物中的靶序列结合并发挥蛋白水解功能的活性片段。本发明涉及纤溶酶原的技术方案涵盖了用纤溶酶原活性片段代替纤溶酶原的技术方案。本发明所述的纤溶酶原活性片段为包含纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶域的蛋白质，优选，本发明所述的纤溶酶原活性片段包含序列14、与序列 14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此，本发明所述的纤溶酶原包括含有该纤溶酶原活性片段、并且仍然保持该纤溶酶原活性的蛋白。

目前，对于血液中纤溶酶原及其活性测定方法包括：对组织纤溶酶原激活剂活性的检测(t-PAA)、血浆组织纤溶酶原激活剂抗原的检测(t-PAAg)、对血浆组织纤溶酶原活性的检测(plgA)、血浆组织纤溶酶原抗原的检测(plgAg)、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物活性的检测、血浆组织纤溶酶原激活剂抑制物抗原的检测、血浆纤维蛋白溶酶 -抗纤维蛋白溶酶复合物检测(PAP)。其中最常用的检测方法为发色底物法：向受检血浆中加链激酶(SK)和发色底物，受检血浆中的纤溶酶原在SK的作用下，转变成纤溶酶，后者作用于发色底物，随后用分光光度计测定，吸光度增加与纤溶酶原活性成正比。此外也可采用免疫化学法、凝胶电泳、免疫比浊法、放射免疫扩散法等对血液中的纤溶酶原活性进行测定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物种之间的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也称为直向同源物、垂直同源物。其具体指不同物种中由同一祖先基因进化而来的蛋白或基因。本发明的纤溶酶原包括人的天然纤溶酶原，还包括来源于不同物种的、具有纤溶酶原活性的纤溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代变体”是指其中一个给定的氨基酸残基改变但不改变蛋白质或酶的整体构象和功能，这包括但不限于以相似特性(如酸性，碱性，疏水性，等)的氨基酸取代亲本蛋白质中氨基酸序列中的氨基酸。具有类似性质的氨基酸是众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并可以互换。同样，异亮氨酸是疏水氨基酸，则可被亮氨酸，蛋氨酸或缬氨酸替换。因此，相似功能的两个蛋白或氨基酸序列的相似性可能会不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)。“保守取代变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能达75％以上更好，最好能达85％以上，甚至达90％以上为最佳，并且与天然或亲本蛋白质或酶相比具有相同或基本相似的性质或功能。

“分离的”纤溶酶原是指从其天然环境分离和/或回收的纤溶酶原蛋白。在一些实施方案中，所述纤溶酶原会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的纯度(按重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，该同质性是通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的。分离的纤溶酶原也包括通过生物工程技术从重组细胞制备，并通过至少一个纯化步骤分离的纤溶酶原。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基) 的融合物；等等。

关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，氨基酸序列同一性百分数值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列 A相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

如本文中使用的，术语“治疗”和“处理”指获得期望的药理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分预防疾病或其症状，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症状，并且包括：(a)预防疾病在受试者体内发生，所述受试者可以具有疾病的素因，但是尚未诊断为具有疾病； (b)抑制疾病，即阻滞其形成；和(c)减轻疾病和/或其症状，即引起疾病和/或其症状消退。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠，小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。

“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述预防和/或治疗的纤溶酶原的量。“治疗有效量”会根据所使用的纤溶酶原、要治疗的受试者的疾病和/ 或其症状的严重程度以及年龄、体重等而变化。

2.本发明纤溶酶原的制备

纤溶酶原可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，也可以通过标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合纤溶酶原化学合成的方法。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc 可用于合成纤溶酶原。用于固相合成的技术描述于Barany和 Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides:Analysis, Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in PeptideSynthesis,Part A., Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)；Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill. (1984)；和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005 Protein PeptLett.12:723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后将其切掉。

可以使用标准重组方法来生产本发明的纤溶酶原。例如，将编码纤溶酶原的核酸插入表达载体中，使其与表达载体中的调控序列可操作连接。表达调控序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达调控可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及纤溶酶原的收集和纯化的条件下维持宿主。

合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于对外源用期望的DNA序列转化的那些细胞进行检测。

大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆主题抗体编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其他肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属 (Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，β-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。

其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S. cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

在微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达并生成本发明的纤溶酶原(例如编码主题抗-Tau抗体的多核苷酸)。参见Winnacker,From Genes to Clones, VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括 CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等,Immunol.Rev.89:49 (1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。

一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、高效液相层析(HPLC)、凝胶电泳等来纯化本发明所述的纤溶酶原。该纤溶酶原是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的或更纯的，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除主题抗体以外的大分子，等等。

3.药物配制剂

可以通过将具有所需纯度的纤溶酶原与可选的药用载体、赋形剂，或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A. ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkoniumchloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选冻干的抗-VEGF抗体配制剂在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作为参考。

本发明的配制剂也可含有需治疗的具体病症所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，抗高血压的药物、抗心律失常的药物、治疗糖尿病的药物等。

本发明的纤溶酶原可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，可置入在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或置入粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol, A.Ed.(1980)。

用于体内给药的本发明的纤溶酶原必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。

本发明的纤溶酶原可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem. Tech.,12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸与乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等， Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯 (ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子 100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。

4.给药和剂量

可以通过不同方式，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、颅内、鞘内、动脉内(例如经由颈动脉)、肌内、鼻内、表面或皮内施用或脊髓或脑投递来实现本发明药物组合物的施用。气溶胶制剂如鼻喷雾制剂包含活性剂的纯化的水性或其它溶液及防腐剂和等渗剂。将此类制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。

在一些情况中，可以以下方式修饰或配制本发明的纤溶酶原药物组合物，从而提供其穿过血脑屏障的能力。可以通过各种肠内和胃肠外施用路径，包括口服、静脉内等对患有血栓和/或血栓相关疾病的个体施用此类纤溶酶原的组合物。

用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。

在一些实施方案中，本发明的纤溶酶原与促进穿过血脑屏障的药剂配制在一起。在一些情况中，本发明的纤溶酶原直接或经接头与促进穿过血脑屏障的载体分子、肽或蛋白质融合。在一些实施方案中，本发明的纤溶酶原与结合内源血脑屏障(BBB)受体的多肽融合。连接纤溶酶原与结合内源BBB受体的多肽，促进穿过BBB。结合内源 BBB受体的合适的多肽包括抗体，例如单克隆抗体，或其抗原结合片段，其特异性结合内源BBB受体。合适的内源BBB受体包括但不限于胰岛素受在一些情况中，抗体是囊封于脂质体中的。参见例如美国专利公开文本No.2009/0156498。

医务人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康、和同时施用的其它药物。本发明包含纤溶酶原的药物组合物的剂量范围可以为例如每天约0.0001至2000mg/kg，或约0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg 等等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围，或至少1mg/kg。高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。上述范围中的中间剂量也包含在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类剂量。例示性的剂量日程表包括连续几天1-10mg/kg。在本发明的药物施用过程中需要实时评估、定期评估血栓和血栓相关疾病的治疗效果和安全性。

5.治疗效力

本发明的一个实施方案涉及使用纤溶酶原治疗受试者后，对治疗效力和治疗安全性的判断。其中临床上对治疗效力的判断方法包括但不限于检测如下指标，从而评估肾功能：血清肌酸酐水平、肌酸酐清除率、24-小时尿蛋白排出率(UAER)、肾小球滤过率、尿白蛋白/肌酸酐比例、白蛋白分泌率和肾脏活检等。例如，肾小球滤过率可以说明肾小球过度滤过和过度灌注的情况，指示糖尿病肾病早期症状缓解程度。肾小球滤过率是肾脏每分钟产生的滤液的体积，可用各种方法确定，如测量过滤标记物如聚糖、碘酞酸盐或碘海醇的尿清除率。更常用的方法是，可通过确定肌酸酐(一种由肌肉产生并释放到血液中的蛋白质)清除率来估算肾小球滤过率。肌酸酣清除率(通常表示为毫升 /分钟)可通过比较给定时间(例如12或24小时)内尿液中收集的肌酸酐水平和血液中的肌酸酐水平来确定。成年男性的典型肌酸酐清除率约为97-137毫升/分钟，成年女性约为88-128毫升/分钟。肌酸酣清除率与尿肌酸酐排泄成正比，与血清肌酸酐浓度成反比。

通常将肌酸酐清除率/肾小球滤过率或尿白蛋白排出率作为主要效力评估指标。同时可以增添其他次要指标以评估本发明药物对相关并发症的效力，例如增加甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白等检测来评估血脂变化，增加治疗前后收缩压、舒张压水平检测来评估高血压状况缓解程度等。

6.制品或药盒

本发明的一个实施方案涉及一种制品或药盒，其包含可用于治疗糖尿病肾病的本发明纤溶酶原。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗本发明的疾病或病症并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂为纤溶酶原。所述容器上或所附的标签说明所述组合物用于治疗本发明所述糖尿病肾病和糖尿病肾病相关疾病。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤物、针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如指示所述组合物的使用者将纤溶酶原组合物以及治疗伴随的疾病的其它药物给药患者。

附图简述

图1 嘌呤诱导的慢性肾损伤模型小鼠给予纤溶酶原10天后肾脏 HE染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组， C、D为PLG^-/-组。结果显示，PLG^-/-小鼠肾脏病变最严重，可看见有大量的脓管型(粗箭头所示)，少量的嘌呤结晶(三角标识)，肾小管大面积萎缩，上皮细胞扁平化；与PLG^-/-小鼠相比，给溶媒PBS对照组小鼠肾脏损伤较轻，虽然肾小球萎缩和肾小管坏死仍然严重，但未发现明显的嘌呤结晶，脓管型相对较轻；给纤溶酶原组小鼠肾小管萎缩的面积比PBS对照组小，肾小管扩张也较之轻，未发现脓管型。说明纤溶酶原可减轻慢性肾衰竭模型小鼠肾脏的损伤。

图2 嘌呤诱导的慢性肾损伤模型小鼠给予纤溶酶原10天后肾脏天狼星红染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为PLG^-/-组，D为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组胶原的沉积明显少于PLG^-/-组，且统计差异显著 (*表示P<0.05，**表示P<0.01)。此外，给纤溶酶原组胶原的沉积明显少于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原在修复慢性肾衰模型的肾脏纤维化过程中起关键作用。

图3 嘌呤诱导的慢性肾损伤模型小鼠给予纤溶酶原10天后肾脏 Bcl-2免疫组化染色代表性图片。A为空白对照组，B为给溶媒PBS 对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组肾脏阳性着色明显深于给溶媒PBS对照组，并且与空白对照组小鼠的表达水平相近。这表明纤溶酶原能促进慢性肾衰竭模型小鼠肾脏细胞凋亡抑制分子Bcl-2的表达，从而抑制小鼠肾脏组织细胞的凋亡。

图4 嘌呤诱导的慢性肾损伤模型小鼠给予纤溶酶原10天后肾脏 IgM免疫组化染色图片。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组， C为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组小鼠肾脏IgM的阳性着色浅于给溶媒PBS对照组，并且范围较对照组小，着色与正常小鼠更加接近。这表明给纤溶酶原后肾脏的损伤得到了明显的改善，反映出纤溶酶原对慢性肾损伤小鼠肾脏损伤有显著修复作用。

图5 嘌呤诱导的慢性肾损伤模型小鼠给予纤溶酶原4天后肾脏纤维蛋白免疫组化染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为PLG-/-组。结果显示，给溶媒PBS对照组肾脏纤维蛋白的阳性着色深于给纤溶酶原组小鼠，且PLG-/-组着色深于给溶媒PBS对照组。这表明纤溶酶原可减轻肾脏的损伤。

图6 顺铂损伤模型小鼠给予纤溶酶原7天后肾脏IgM免疫染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组IgM阳性表达明显低于给溶媒PBS 对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能促进顺铂所致肾脏损伤的修复。

图7 顺铂损伤模型小鼠给予纤溶酶原7天后肾脏IV型胶原免疫染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组IV型胶原阳性表达明显低于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能改善顺铂所致的肾脏纤维化。

图8 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后肾脏IV型胶原免疫染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组IV胶原阳性着色明显浅于给溶媒PBS对照组，说明纤溶酶原能改善糖尿病小鼠肾脏纤维化。

图9 26周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后肾脏masson染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组肾间质轻度纤维化，增生的纤维化呈蓝色。给纤溶酶原组肾间质纤维化明显减少。说明纤溶酶原能降低糖尿病小鼠肾脏间质的纤维化。

图10 博莱霉素诱导的系统性硬化症模型小鼠给予纤溶酶原21天后肾脏天狼星红染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，在博莱霉素诱导的系统性硬化症小鼠模型中，给溶媒PBS对照组肾脏胶原沉积明显多于给纤溶酶原组。说明纤溶酶原有效降低系统性硬化症小鼠的肾脏纤维化。

图11 嘌呤诱导慢性肾损伤小鼠血清尿素氮检测结果。结果显示， PLG^+/+组血清中尿素氮浓度明显低于PLG^-/-组，且统计差异显著(* 表示P<0.05)。说明纤溶酶原能显著改善慢性肾衰竭模型小鼠的肾功能。

图12 嘌呤诱导的慢性肾损伤模型小鼠给予纤溶酶原4天后血清肌酐浓度检测结果。结果显示，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组血清中肌酐浓度明显低于PLG^-/-组小鼠，且统计差异显著(*表示 P<0.05)。此外，给纤溶酶原组血清中肌酐浓度明显低于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能显著改善慢性肾损伤模型小鼠的肾功能。

图13 叶酸诱导急性肾损伤小鼠血清尿素氮检测结果。结果显示，给纤溶酶原组血清中尿素氮浓度明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异接近显著(P＝0.06)。说明纤溶酶原能显著改善急性肾损伤模型小鼠的肾功能。

图14 给予纤溶酶原30天后3％胆固醇高脂血症模型小鼠肾脏油红O染色观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C 为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠肾脏脂肪沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组，且定量分析统计差异显著；此外，给纤溶酶原组脂质沉积水平与空白对照组小鼠相似。说明纤溶酶原能消减脂肪在高脂血症模型小鼠肾脏中的沉积，从而减少脂肪沉积所致的肾脏损伤。

图15 给予纤溶酶原7天后叶酸急性肾损伤模型小鼠肾脏HE染色代表性图片。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，空白对照组肾脏核呈圆形或椭圆形，胞浆红染，肾小球及肾小管均形态正常；给溶媒PBS对照组肾脏观察到大量的肾小管上皮细胞扁平化(粗箭头标识)，刷状缘脱落，部分细胞核固缩，只有部分肾小管呈现淡染的胞浆，部分肾小管还可见脓管型(细箭头标识)，肾小球及肾间质轻度的炎细胞浸润；给纤溶酶原组与给溶媒PBS对照组相比，肾小管扩张及上皮细胞扁平化明显好转，可见大部分的肾小管胞浆呈现红染，未见脓管型。说明纤溶酶能改善叶酸诱导的急性肾损伤。

图16 给予纤溶酶原7天后叶酸急性肾损伤模型小鼠肾脏Bcl-2 免疫组化观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C 为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组肾脏Bcl-2阳性着色明显多于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。这表明纤溶酶原能促进急性肾损伤模型小鼠肾脏中细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2 的表达，从而保护急性肾损伤小鼠肾脏组织细胞免于凋亡。

图17 给予纤溶酶原7天后叶酸急性肾损伤模型小鼠肾脏IgM免疫组化观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组小鼠肾脏IgM的阳性着色比给溶媒PBS对照组浅，并且范围较对照组小。这表明注射纤溶酶原后肾脏IgM的表达明显降低，反映出纤溶酶原能有效减少叶酸急性肾损伤小鼠肾脏损伤。

图18 给予纤溶酶原30天后3％胆固醇高脂血症模型小鼠肾脏天狼星红染色观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C 为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组肾脏胶原蛋白沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著；给纤溶酶原组纤维化基本恢复到正常水平。说明纤溶酶原能有效的减少3％胆固醇高脂血症模型小鼠肾脏纤维化。

图19 给予纤溶酶原7天后缺血再灌注急性肾损伤模型小鼠肾脏 HE染色代表性图片。A为假手术组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，假手术组肾小球毛细血管通畅，肾小管胞浆红染，呈正常的肾小管形态；给溶媒PBS对照组可见肾小球轻度的炎细胞浸润(三角标识)，肾间质大量的炎细胞浸润，部分肾小管呈现脓管型(细箭头标识)，少量肾小管细胞核固缩，大面积的上皮细胞扁平化(粗箭头标识)，肾小管扩张；相较于给溶媒PBS对照组，给纤溶酶原组只有少量的肾小管上皮扁平化，大部分的肾小管已经恢复正常肾小管形态，胞浆红染，未发现明显的肾小管萎缩，只有肾间质有轻度的炎细胞浸润，已接近假手术组形态。说明纤溶酶能改善缺血再灌注急性肾损伤模型小鼠肾脏损伤。

实施例

实施例1 纤溶酶原对慢性肾损伤模型肾脏的保护作用

8-9周龄的PLG^+/+小鼠20只以及PLG^-/-小鼠6只，PLG^+/+小鼠随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各10只。给纤溶酶原组、给溶媒PBS对照组以及PLG^-/-小鼠每天饲喂0.25％嘌呤饲料(南通特洛菲)，建立慢性肾损伤模型^[26]。造模当天记为第1天，同时开始给药。给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组以相同方式给予相同体积的PBS，连续造模给药10天，PLG^-/-小鼠不做处理。第11天处死小鼠取肾脏于4％的多聚甲醛中固定24小时。固定后的肾脏经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，切片在200(图1A、B、C)、400(1D) 倍光学显微镜下观察。

结果显示，PLG^-/-小鼠肾脏(图1C、1D)病变最严重，可观察到大量的脓管型(箭头所示)，少量的嘌呤结晶(三角标识)，肾小管大面积萎缩，上皮细胞扁平化；与PLG^-/-小鼠相比，给溶媒PBS对照组小鼠肾脏(图1A)损伤轻，尽管肾小球萎缩和肾小管坏死还很严重，但未发现明显的嘌呤结晶，脓管型相对较轻；给纤溶酶原组小鼠 (图1B)肾小管萎缩的面积比PBS对照组小，肾小管扩张也较之轻，未发现脓管型。说明纤溶酶原能修复慢性肾损伤模型小鼠肾脏的损伤。

实施例2 纤溶酶原修复慢性肾损伤模型肾脏的纤维化

8-9周龄雄性PLG^+/+小鼠12只以及PLG^-/-小鼠6只，PLG^+/+小鼠随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组各6只，慢性肾损伤模型造模方式同实施例1所述。造模当天记为第1天，同时开始给药。给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组以相同方式给予相同体积的PBS，连续造模给药10天， PLG^-/-小鼠不做处理。第11天处死小鼠取肾脏于4％多聚甲醛中固定 24小时。固定后的肾脏经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡至水后水洗1次，以0.1％天狼星红染色60分钟后，流水冲洗，苏木素染色1分钟，流水冲洗，1％盐酸酒精和氨水分化返蓝，流水冲洗，烘干后封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

天狼星红染色可使胶原持久染色，作为病理切片特殊染色方法，天狼星红染色可以特异显示胶原组织。

结果显示，给纤溶酶原组(图2B)和给溶媒PBS对照组(图2A) 胶原的沉积明显少于PLG^-/-组(图2C)，且统计差异显著(图2D)。此外，给纤溶酶原组胶原的沉积明显少于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原在修复慢性肾损伤模型的肾脏纤维化过程中起关键作用。

实施例3 纤溶酶原促进慢性肾损伤小鼠肾脏的凋亡抑制蛋白 Bcl-2表达

8-9周龄雄性PLG^+/+小鼠18只，随机分为三组，空白对照组、给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各6只。慢性肾损伤模型造模方式同实施例1所述。造模当天记为第1天，同时开始给药。空白对照组饲喂正常维持饲料。给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组以相同方式给予相同体积的PBS，连续造模给药10天，空白对照组小鼠组不做任何处理。开始造模给药定为第1天，第11天处死小鼠取肾脏于4％多聚甲醛中固定24小时。固定后的肾脏经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以 3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠Bcl-2抗体(Abcam)4℃孵育过夜， 0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam) 二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染 30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

Bcl-2为细胞凋亡抑制蛋白，在凋亡刺激因子作用下表达下调^[27,28]。Bcl-2免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图3C)肾Bcl-2阳性着色明显深于给溶媒PBS对照组(图3B)，并且与空白对照组(图3A)Bcl-2阳性着色程度近似。这表明纤溶酶原能促进慢性肾损伤模型小鼠肾脏中细胞凋亡抑制分子Bcl-2的表达，从而有助于保护慢性肾损伤小鼠肾脏组织细胞免于凋亡。

实施例4 纤溶酶原改善慢性肾损伤小鼠肾脏的局部损伤

8-9周龄雄性PLG^+/+小鼠18只，随机分为三组，空白对照组、给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各6只。慢性肾损伤模型造模方式同实施例1所述。造模当天记为第1天，同时开始给药，空白对照组饲喂正常维持饲料。给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组以相同方式给予相同体积的PBS，连续造模给药10天，空白对照组不做任何处理。第11天处死小鼠取肾脏于4％多聚甲醛中固定24小时。固定后的肾脏经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗 2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA) 封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加山羊抗鼠IgM(HRP) 抗体(Abcam)室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB 试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染 30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

IgM抗体在清除凋亡和坏死细胞过程中发挥着重要作用，损伤的组织器官局部IgM抗体的水平与损伤程度呈正相关^[29,30]。因此，检测组织器官局部IgM抗体的水平能够反映该组织器官的损伤程度。

结果显示，给纤溶酶原组(图4C)小鼠肾脏IgM的阳性着色比给溶媒PBS对照组浅(图4B)，并且范围较对照组小，着色与空白对照小鼠(图4A)非常接近。这表明注射纤溶酶原后肾小球的损伤得到了明显的改善，反映出纤溶酶原对慢性肾损伤小鼠肾脏损伤有显著修复作用。

实施例5 纤溶酶原减少慢性肾损伤小鼠肾脏纤维蛋白的表达

8-9周龄雄PLG^+/+小鼠12只以及PLG^-/-小鼠6只，PLG^+/+小鼠随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各6只。慢性肾损伤模型造模方式同实施例1所述。造模当天记为第1天，同时开始给药，造模给药周期4天，空白对照组饲喂正常维持饲料。给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组以相同方式给予相同体积的PBS，PLG^-/-不做任何处理。第5天处死小鼠取肾脏于4％多聚甲醛中固定24小时。固定后的肾脏经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟， 0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠纤维蛋白抗体(Abcam)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，在组织存在损伤的情况下，作为机体对损伤的一种应激反应，纤维蛋白原水解成纤维蛋白沉积在损伤部位^[31,32]。因此，可将损伤局部纤维蛋白水平作为损伤程度的一个标志。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图5A)肾脏纤维蛋白的阳性着色深于给纤溶酶原组小鼠(图5B)，且PLG^-/-组(图5C)着色深于给溶媒 PBS对照组。这表明纤溶酶原能在一定程度上修复肾脏组织的损伤。

实施例6 纤溶酶原促进顺铂所致的肾脏损伤的修复

8-9周龄健康的雄性C57小鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS 对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。分组完成后，按10mg/Kg体重单次腹腔注射顺铂^[33]，建立化疗损伤模型。建立模型后，给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组以相同方式给予相同体积的PBS。实验开始当天为第0天称量体重并分组，第1天开始腹腔注射顺铂造模，造模后3小时内给予纤溶酶原或溶媒PBS，给药期为7天。第8天处死小鼠，取肾脏在10％中性福尔马林固定液中固定24-48小时。固定后的肾脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为4μm，切片脱蜡复水后水洗1次。柠檬酸修复30分钟，室温冷却10分钟后水轻柔冲洗。PAP 笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30 分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加山羊抗鼠IgM(HRP)抗体 (Abcam)室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染 30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

IgM抗体在清除凋亡和坏死细胞过程中发挥着重要作用，组织器官损伤局部IgM抗体的水平与损伤程度呈正相关^[29,30]。因此，检测组织器官局部IgM抗体的水平能够反映该组织器官的损伤情况。

结果显示，给纤溶酶原组(图6B)IgM阳性表达明显低于给溶媒PBS对照组(图6A)，且统计差异显著(图6C)。说明纤溶酶原能促进肾脏损伤的修复。

实施例7 纤溶酶原减轻顺铂化疗损伤模型小鼠肾脏的纤维化

8-9周龄健康的雄性C57小鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS 对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。分组完成后，建立化疗损伤模型，按10mg/Kg体重单次腹腔注射顺铂^[33]。建立模型后，给纤溶酶原组1mg/0.1ml/只/天经尾静脉注射给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉注射给予相同体积的PBS。实验开始当天为第0天并称重分组，第1天开始腹腔注射顺铂造模，造模后3小时内给予纤溶酶原或溶媒PBS，给药期为7天。第8天处死小鼠，取肾脏在4％多聚甲醛固定液中固定24小时。固定后的肝脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为4μm，切片脱蜡复水后水洗 1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA) 封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠IV胶原抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG (HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.,USA)显色，水洗3 次后苏木素复染30秒，流水返蓝5分钟，然后TBS洗1次。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图7A)肾脏IV型胶原阳性表达明显高于给纤溶酶原组(图7B)。说明纤溶酶原能够减轻顺铂损伤模型小鼠肾脏的纤维化。

实施例8 纤溶酶原减轻糖尿病小鼠肾脏纤维化

24-25周龄雄性db/db小鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。实验开始当天记为第0天并称重分组，第1天开始给纤溶酶原或PBS，连续给药31天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2ml/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉给予相同体积的PBS。给纤溶酶原31天后处死小鼠并取肾脏组织在4％多聚甲醛固定液中固定24小时。固定后的肾脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为4μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加IV胶原的兔多克隆抗体(Abcam)4℃孵育过夜，TBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，TBS洗2次。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.,USA) 显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟，梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

糖尿病肾病是糖尿病慢性并发症，肾小球硬化以及肾间质纤维化是其典型的病理改变^[34]。本发明实验结果显示，给纤溶酶原组(图 8B)IV胶原阳性着色明显浅于给溶媒PBS对照组(图8A)，说明纤溶酶原能减轻糖尿病小鼠肾脏的纤维化。

实施例9 纤溶酶原减轻糖尿病小鼠肾脏纤维化

26周龄雄性db/db小鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。实验开始当天记为第0天称重分组，第1天开始给纤溶酶原或PBS，连续给药35天。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2ml/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉给予相同体积的PBS。第36天处死小鼠并取肾脏组织在4％多聚甲醛固定液中固定24小时。固定后的肾脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为4μm，切片脱蜡复水后放入重铬酸钾溶液过夜。铁苏木素染3到5分钟，流水洗。1％盐酸酒精分化，氨水处理1秒，水洗。丽春红酸性品红液染8分钟，水中快速漂洗。1％磷钼酸水溶液处理约2分钟，苯胺蓝液复染6分钟。1％冰醋酸漂洗约1分钟。无水乙醇脱水二甲苯透明后封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

Masson染色可以显示组织的纤维化。结果显示，给溶媒PBS对照组(图9A)，肾间质轻度纤维化，增生的纤维化呈蓝色。给纤溶酶原组(图9B)与给溶媒PBS对照组相比肾间质纤维化明显减少。说明纤溶酶原能降低糖尿病小鼠肾脏的纤维化。

实施例10 纤溶酶原降低系统性硬化症小鼠肾脏纤维化

取12周龄C57雄鼠10只，称重后随机分为两组，给溶媒PBS 对照组和给纤溶酶原组各5只。所有小鼠按0.1mg/0.1ml/只/天皮下注射博莱霉素诱导系统性硬化症^【35】，当天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，连续给药21天。给纤溶酶原组小鼠按1mg/0.1ml/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉注射给予相同体积的 PBS。在第22天处死小鼠并取肾脏在4％多聚甲醛固定液中固定24 小时。固定后的肾脏经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡至水后水洗1次，以0.1％天狼星红饱和苦味酸染色30分钟后，流水冲洗2min，苏木素染色1分钟，流水冲洗，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，流水冲洗，烘干后中性树胶封片，在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，在博莱霉素诱导的系统性硬化症小鼠模型中，给溶媒 PBS对照组(图10A)肾脏胶原沉积明显多于给纤溶酶原组(图10B)。说明纤溶酶原有效降低系统性硬化症小鼠的肾脏纤维化。

实施例11 纤溶酶原促进慢性肾损伤模型小鼠肾脏功能的修复

8-9周龄的PLG^+/+小鼠10只以及PLG^-/-小鼠6只，慢性肾损伤模型造模方式同实施例1所述。造模当天记为第1天，造模周期10天。在第11天摘除眼球取血，离心取上清，检测血清中尿素氮浓度。尿素氮含量采用尿素氮检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号 C013-2)，并按该尿素氮检测试剂盒所述方法进行检测。

结果显示，PLG^+/+组血清中尿素氮浓度明显低于PLG^-/-组，且统计差异显著(图11)。说明纤溶酶原能显著改善慢性肾损伤模型小鼠的肾功能。

实施例12 纤溶酶原促进慢性肾损伤模型小鼠肾脏功能的修复

8-9周龄的PLG^+/+小鼠20只以及PLG^-/-小鼠6只，PLG^+/+小鼠随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组各10只。慢性肾损伤模型造模方式同实施例1所述。造模当天记为第1天，同时开始给药，给药周期4天。给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉给予相同体积的PBS，PLG^-/-小鼠不做任何处理。第5天摘除眼球取血，离心取上清，检测血清中肌酐浓度。血清肌酐浓度采用肌酐检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C011-2)，并按该试剂盒所述方法进行检测。

结果显示，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组血清中肌酐浓度明显低于PLG^-/-组小鼠，且统计差异显著。此外，给纤溶酶原组血清中肌酐浓度明显低于给溶媒PBS对照组(图12)。说明纤溶酶原能显著改善慢性肾损伤模型小鼠的肾功能。

实施例13 纤溶酶原促进急性肾损伤模型小鼠肾脏功能的修复

7周龄雄性C57小鼠9只，随机分为两组，给纤溶酶原组5只，给溶媒PBS对照组4只。所有小鼠按照250mg/kg体重单次腹腔注射叶酸(sigma A7876)溶液，诱导急性肾损伤^【36】。叶酸溶解在0.3mol/L NaHCO₃。造模当天记为第1天，同时开始给纤溶酶原或溶媒PBS，给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS 对照组尾静脉给予相同体积的PBS，给药为期7天。在第8天摘眼球取血，离心取上清，检测血清中尿素氮浓度。尿素氮含量采用尿素氮检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号C013-2)，并按该尿素氮检测试剂盒所述方法进行检测。

结果显示，给纤溶酶原组血清中尿素氮浓度明显低于给溶媒PBS 对照组，且统计差异接近显著(P＝0.06)(图13)。说明纤溶酶原能显著改善急性肾损伤模型小鼠的肾功能。

实施例14 纤溶酶原降低3％胆固醇高脂血症模型小鼠肾脏脂肪沉积

9周龄雄性C57小鼠16只饲喂3％胆固醇高脂饲料(南通特洛菲)4 周，诱导高脂血症^[37，38]，此模型定为3％胆固醇高脂血症模型，成模后的小鼠继续饲喂3％胆固醇高脂饲料。另取相同周龄的雄性C57小鼠5只作为空白对照组，实验期间饲喂普通维持饲料。在给药前三天每只小鼠取血50μL，检测总胆固醇，模型小鼠根据总胆固醇浓度和体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各8 只。开始给药记为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，给药30天。第31天处死小鼠，取肾脏于4％多聚甲醛固定24-48小时，分别于15％、30％蔗糖中4℃过夜沉底，OCT包埋，冰冻切片厚度8μm，油红O染色15min，75％酒精分化5秒，苏木素染核30秒，甘油明胶封片。切片在200倍光学显微镜下观察。

油红O染色可显示脂质沉积，反映脂质沉积的程度^[37]。结果显示，给纤溶酶原组(图14C)小鼠肾脏脂肪沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组(图14B)，且定量分析统计差异显著(图14D)；此外，给纤溶酶原组脂质沉积水平与空白对照组小鼠(图14A)相似。说明纤溶酶原能消减脂肪在高脂血症模型小鼠肾脏中的沉积，从而减少脂肪沉积所致肾的脏损伤。

实施例15 纤溶酶原改善叶酸急性肾损伤模型小鼠肾脏损伤

7周龄雄性C57小鼠15只，随机分为三组，空白对照组3只，给纤溶酶原组7只，给溶媒PBS对照组5只。给纤溶酶原组和给溶媒 PBS对照组小鼠按照250mg/kg体重单次腹腔注射叶酸(sigma A7876) 溶液，诱导急性肾损伤模型^[36]，空白对照组单次腹腔注射相应体积的NaHCO₃溶液。叶酸溶解在0.3mol/L NaHCO₃溶液中。造模当天记为第1天，同时开始给纤溶酶原或溶媒PBS，给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/ 只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉给予相同体积的PBS，给药为期7天。第8天处死小鼠取肾脏于4％多聚甲醛中固定24小时。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，空白对照组(图15A)肾脏核呈圆形或椭圆形，胞浆红染，肾小球及肾小管均形态正常；给溶媒PBS对照组(图15B)肾脏呈大部分的肾小管上皮细胞扁平化(粗箭头标识)，刷状缘脱落，部分细胞核固缩，只有部分肾小管呈现淡染的胞浆，部分肾小管还可见脓管型(细箭头标识)，肾小球及肾间质轻度的炎细胞浸润；给纤溶酶原组(图15C)与给溶媒PBS对照组相比，肾小管扩张及上皮细胞扁平化明显好转，可见大部分的肾小管胞浆呈现红染，未见脓管型。说明，纤溶酶能改善叶酸诱导的急性肾损伤。

实施例16 纤溶酶原促进叶酸急性肾损伤模型小鼠肾脏Bcl-2的表达

7周龄雄性C57小鼠12只，随机分为两组，给纤溶酶原组7只，给溶媒PBS对照组5只。所有小鼠按照250mg/kg体重单次腹腔注射叶酸(sigma A7876)溶液，诱导急性肾损伤^[36]。叶酸溶解在0.3mol/L NaHCO₃。造模当天记为第1天，同时开始给纤溶酶原或溶媒PBS，给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS 对照组尾静脉给予相同体积的PBS，给药为期7天。第8天处死小鼠取肾脏于4％多聚甲醛中固定24小时。固定后的肾脏经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS 洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠Bcl-2抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在 200倍光学显微镜下观察。

Bcl-2免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图16B)肾脏Bcl-2 阳性着色明显多于给溶媒PBS对照组(图16A)，且统计差异显著(图 16C)。这表明纤溶酶原能促进急性肾损伤模型小鼠肾脏中细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，从而有助于保护急性肾损伤小鼠肾脏组织细胞免于凋亡。

实施例17 纤溶酶原减少叶酸急性肾损伤模型小鼠肾脏损伤

7周龄雄性C57小鼠12只，随机分为两组，给纤溶酶原组7只，给溶媒PBS对照组5只。所有小鼠按照250mg/kg体重单次腹腔注射叶酸(sigma A7876)溶液，诱导急性肾损伤^[36]。叶酸溶解在0.3mol/L NaHCO₃溶液中。造模当天记为第1天，同时开始给纤溶酶原或溶媒PBS，给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒 PBS对照组尾静脉给予相同体积的PBS，给药为期7天。第8天处死小鼠取肾脏于4％多聚甲醛中固定24小时。固定后的肾脏经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS 洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加山羊抗鼠IgM(HRP)抗体(Abcam)室温孵育1小时，PBS洗2 次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，给纤溶酶原组(图17B)小鼠肾脏IgM的阳性着色比给溶媒PBS对照组(图17A)浅，并且范围较对照组小。这表明注射纤溶酶原后肾脏IgM的表达明显降低，反映出纤溶酶原能有效减少叶酸急性肾损伤小鼠肾脏损伤。

实施例18 纤溶酶原降低3％胆固醇高脂血症模型小鼠肾脏纤维化

9周龄雄性C57小鼠16只饲喂3％胆固醇高脂饲料(南通特洛菲)4 周，诱导高脂血症^[37，38]，此模型定为3％胆固醇高脂血症模型，成模后的小鼠继续饲喂3％胆固醇高脂饲料。另取相同周龄的雄性C57小鼠5只作为空白对照组，实验期间饲喂普通维持饲料。在给药前三天每只小鼠取血50μL，检测总胆固醇，模型小鼠根据总胆固醇浓度和体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各8 只。开始给药记为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。在第30天给药后小鼠给药30天，于第31天处死小鼠，取心脏于4％多聚甲醛固定24-48小时。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。主动脉窦切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗 1次，以0.1％天狼星红饱和苦味酸染色30分钟后，流水冲洗2min，苏木素染色1分钟，流水冲洗，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，流水冲洗，烘干后中性树胶封片，在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，给纤溶酶原组(图18C)肾脏胶原蛋白沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组(图18B)，且统计差异显著(图 18D)；给纤溶酶原组纤维化基本恢复到正常水平(图18A)。说明纤溶酶原能有效的减少3％胆固醇高脂血症模型小鼠肾脏纤维化。

实施例19 纤溶酶原减少缺血再灌注急性肾损伤模型小鼠肾脏损伤

7-9周龄雄性PLG^+/+小鼠9只，随机分为三组，假手术组、给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各3只。所有小鼠用戊巴比妥钠按照50mg/kg体重腹腔注射麻醉。给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组小鼠在腹部开个缺口，暴露肾脏，分离双侧动静脉，用血管夹夹住双侧动静脉，夹好后肾脏移入腹腔，闭合伤口。时间到后再次暴露肾脏，移除血管夹，观察肾脏情况，确定再灌注后，缝合伤口。假手术组组腹部开个缺口，仅暴露肾脏，不做缺血处理，时间到后缝合伤口^[39]。手术完成后每只小鼠腹腔注射1mL 37℃生理盐水。手术期间保持体温在36.5-38℃。造模当天记为第1天，同时开始给纤溶酶原或溶媒PBS，给纤溶酶原组按1mg/0.1ml/只/天尾静脉给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉给予相同体积的PBS，假手术小鼠不做注射处理，给药为期7天。第8天处死小鼠取肾脏于4％多聚甲醛中固定24小时。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

结果显示，假手术组(图19A)肾小球毛细血管通畅，肾小管胞浆红染，呈正常的肾小管形态；给溶媒PBS对照组(图19B)可见肾小球轻度的炎细胞浸润(三角标识)，肾间质大量的炎细胞浸润，部分肾小管呈现脓管型(细箭头标识)，少量肾小管细胞核固缩，大面积的上皮细胞扁平化(粗箭头标识)，肾小管扩张；相较于给溶媒 PBS对照组，给纤溶酶原组(图19C)只有少量的肾小管上皮扁平化，大部分的肾小管已经恢复正常肾小管形态，胞浆红染，未发现明显的肾小管萎缩，只有肾间质有轻度的炎细胞浸润，已接近假手术组形态。说明纤溶酶能改善缺血再灌注急性肾损伤模型小鼠肾脏损伤。

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序列表

<110> 深圳瑞健生命科学研究院有限公司

<120> 一种预防和治疗病理性肾组织损伤的方法

<130> PDK03587

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggaatgtat gcattgcagt ggagaaaact atgacggcaa aatttccaag 540

accatgtctg gactggaatg ccaggcctgg gactctcaga gcccacacgc tcatggatac 600

attccttcca aatttccaaa caagaacctg aagaagaatt actgtcgtaa ccccgatagg 660

gagctgcggc cttggtgttt caccaccgac cccaacaagc gctgggaact ttgtgacatc 720

ccccgctgca caacacctcc accatcttct ggtcccacct accagtgtct gaagggaaca 780

ggtgaaaact atcgcgggaa tgtggctgtt accgtgtccg ggcacacctg tcagcactgg 840

agtgcacaga cccctcacac acataacagg acaccagaaa acttcccctg caaaaatttg 900

gatgaaaact actgccgcaa tcctgacgga aaaagggccc catggtgcca tacaaccaac 960

agccaagtgc ggtgggagta ctgtaagata ccgtcctgtg actcctcccc agtatccacg 1020

gaacaattgg ctcccacagc accacctgag ctaacccctg tggtccagga ctgctaccat 1080

ggtgatggac agagctaccg aggcacatcc tccaccacca ccacaggaaa gaagtgtcag 1140

tcttggtcat ctatgacacc acaccggcac cagaagaccc cagaaaacta cccaaatgct 1200

ggcctgacaa tgaactactg caggaatcca gatgccgata aaggcccctg gtgttttacc 1260

acagacccca gcgtcaggtg ggagtactgc aacctgaaaa aatgctcagg aacagaagcg 1320

agtgttgtag cacctccgcc tgttgtcctg cttccagatg tagagactcc ttccgaagaa 1380

gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcgaccac tgttactggg 1440

acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 1500

acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 1560

ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag 1620

tgtgcggccc cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccgaagaa atgtcctgga 1680

agggttgtag gggggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga 1740

acaaggtttg gaatgcactt ctgtggaggc accttgatat ccccagagtg ggtgttgact 1800

gctgcccact gcttggagaa gtccccaagg ccttcatcct acaaggtcat cctgggtgca 1860

caccaagaag tgaatctcga accgcatgtt caggaaatag aagtgtctag gctgttcttg 1920

gagcccacac gaaaagatat tgccttgcta aagctaagca gtcctgccgt catcactgac 1980

aaagtaatcc cagcttgtct gccatcccca aattatgtgg tcgctgaccg gaccgaatgt 2040

ttcatcactg gctggggaga aacccaaggt acttttggag ctggccttct caaggaagcc 2100

cagctccctg tgattgagaa taaagtgtgc aatcgctatg agtttctgaa tggaagagtc 2160

caatccaccg aactctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagttg ccagggtgac 2220

agtggaggtc ctctggtttg cttcgagaag gacaaataca ttttacaagg agtcacttct 2280

tggggtcttg gctgtgcacg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaaggttt 2340

gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 2

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly

165 170 175

Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser

180 185 190

Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys

195 200 205

Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro

210 215 220

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile

225 230 235 240

Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys

245 250 255

Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val

260 265 270

Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His

275 280 285

Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr

290 295 300

Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn

305 310 315 320

Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser

325 330 335

Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr

340 345 350

Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly

355 360 365

Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser

370 375 380

Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala

385 390 395 400

Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro

405 410 415

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu

420 425 430

Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val

435 440 445

Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe

450 455 460

Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly

465 470 475 480

Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile

485 490 495

Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys

500 505 510

Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn

515 520 525

Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro

530 535 540

Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly

545 550 555 560

Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln

565 570 575

Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu

580 585 590

Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser

595 600 605

Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val

610 615 620

Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu

625 630 635 640

Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala

645 650 655

Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr

660 665 670

Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr

675 680 685

Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val

690 695 700

Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val

705 710 715 720

Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser

725 730 735

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys

740 745 750

Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro

755 760 765

Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile

770 775 780

Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

785 790

<210> 3

<211> 2433

<212> DNA

<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原（来源于swiss prot）的核酸序列

<400> 3

atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tcaaggagag 60

cctctggatg actatgtgaa tacccagggg gcttcactgt tcagtgtcac taagaagcag 120

ctgggagcag gaagtataga agaatgtgca gcaaaatgtg aggaggacga agaattcacc 180

tgcagggcat tccaatatca cagtaaagag caacaatgtg tgataatggc tgaaaacagg 240

aagtcctcca taatcattag gatgagagat gtagttttat ttgaaaagaa agtgtatctc 300

tcagagtgca agactgggaa tggaaagaac tacagaggga cgatgtccaa aacaaaaaat 360

ggcatcacct gtcaaaaatg gagttccact tctccccaca gacctagatt ctcacctgct 420

acacacccct cagagggact ggaggagaac tactgcagga atccagacaa cgatccgcag 480

gggccctggt gctatactac tgatccagaa aagagatatg actactgcga cattcttgag 540

tgtgaagagg aatgtatgca ttgcagtgga gaaaactatg acggcaaaat ttccaagacc 600

atgtctggac tggaatgcca ggcctgggac tctcagagcc cacacgctca tggatacatt 660

ccttccaaat ttccaaacaa gaacctgaag aagaattact gtcgtaaccc cgatagggag 720

ctgcggcctt ggtgtttcac caccgacccc aacaagcgct gggaactttg tgacatcccc 780

cgctgcacaa cacctccacc atcttctggt cccacctacc agtgtctgaa gggaacaggt 840

gaaaactatc gcgggaatgt ggctgttacc gtgtccgggc acacctgtca gcactggagt 900

gcacagaccc ctcacacaca taacaggaca ccagaaaact tcccctgcaa aaatttggat 960

gaaaactact gccgcaatcc tgacggaaaa agggccccat ggtgccatac aaccaacagc 1020

caagtgcggt gggagtactg taagataccg tcctgtgact cctccccagt atccacggaa 1080

caattggctc ccacagcacc acctgagcta acccctgtgg tccaggactg ctaccatggt 1140

gatggacaga gctaccgagg cacatcctcc accaccacca caggaaagaa gtgtcagtct 1200

tggtcatcta tgacaccaca ccggcaccag aagaccccag aaaactaccc aaatgctggc 1260

ctgacaatga actactgcag gaatccagat gccgataaag gcccctggtg ttttaccaca 1320

gaccccagcg tcaggtggga gtactgcaac ctgaaaaaat gctcaggaac agaagcgagt 1380

gttgtagcac ctccgcctgt tgtcctgctt ccagatgtag agactccttc cgaagaagac 1440

tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg 1500

ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc catagacaca gcattttcac tccagagaca 1560

aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt 1620

ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt 1680

gcggcccctt catttgattg tgggaagcct caagtggagc cgaagaaatg tcctggaagg 1740

gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 1800

aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 1860

gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 1920

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 1980

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 2040

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 2100

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 2160

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 2220

tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 2280

ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 2340

ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 2400

acttggattg agggagtgat gagaaataat taa 2433

<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原（来源于swiss prot）的氨基酸序列

<400> 4

Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser

1 5 10 15

Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser

20 25 30

Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu

35 40 45

Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe

50 55 60

Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg

65 70 75 80

Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys

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Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

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Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser

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130 135 140

Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln

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Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys

165 170 175

Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn

180 185 190

Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala

195 200 205

Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe

210 215 220

Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu

225 230 235 240

Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu

245 250 255

Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr

260 265 270

Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala

275 280 285

Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro

290 295 300

His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp

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Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His

325 330 335

Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys

340 345 350

Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro

355 360 365

Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser

370 375 380

Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser

385 390 395 400

Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr

405 410 415

Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp

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Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr

435 440 445

Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro

450 455 460

Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp

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Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr

485 490 495

Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg

500 505 510

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515 520 525

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr

530 535 540

Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys

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Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys

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Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

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Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly

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Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu

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Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys

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<211> 2145

<212> DNA

<213> LYS77-PLG（Lys-纤溶酶原）核酸序列

<400> 5

aaagtgtatc tctcagagtg caagactggg aatggaaaga actacagagg gacgatgtcc 60

aaaacaaaaa atggcatcac ctgtcaaaaa tggagttcca cttctcccca cagacctaga 120

ttctcacctg ctacacaccc ctcagaggga ctggaggaga actactgcag gaatccagac 180

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tgtgacatcc cccgctgcac aacacctcca ccatcttctg gtcccaccta ccagtgtctg 540

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aaaaatttgg atgaaaacta ctgccgcaat cctgacggaa aaagggcccc atggtgccat 720

acaaccaaca gccaagtgcg gtgggagtac tgtaagatac cgtcctgtga ctcctcccca 780

gtatccacgg aacaattggc tcccacagca ccacctgagc taacccctgt ggtccaggac 840

tgctaccatg gtgatggaca gagctaccga ggcacatcct ccaccaccac cacaggaaag 900

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ccaaatgctg gcctgacaat gaactactgc aggaatccag atgccgataa aggcccctgg 1020

tgttttacca cagaccccag cgtcaggtgg gagtactgca acctgaaaaa atgctcagga 1080

acagaagcga gtgttgtagc acctccgcct gttgtcctgc ttccagatgt agagactcct 1140

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gatgtaggtg gtccctggtg ctacacgaca aatccaagaa aactttacga ctactgtgat 1380

gtccctcagt gtgcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 1440

tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 1500

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atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 1800

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aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1920

ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1980

cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 2040

gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 2100

tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 2145

<210> 6

<211> 714

<212> PRT

<213> LYS77-PLG（Lys-纤溶酶原）氨基酸序列

<400> 6

Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

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Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe

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Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu

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Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr

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Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp

325 330 335

Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr

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Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro

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Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr

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Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg

545 550 555 560

Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser

565 570 575

Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser

580 585 590

Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp

595 600 605

Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln

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Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

625 630 635 640

Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly

645 650 655

Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu

660 665 670

Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys

675 680 685

Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val

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Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

705 710

<210> 7

<211> 1245

<212> DNA

<213> delta-plg（delta-纤溶酶原）核酸序列

<400> 7

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

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tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 1245

<210> 8

<211> 414

<212> PRT

<213> delta-plg（delta-纤溶酶原）氨基酸序列

<400> 8

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val

165 170 175

Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His

180 185 190

Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met

195 200 205

His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala

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Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile

225 230 235 240

Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile

245 250 255

Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu

260 265 270

Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala

275 280 285

Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe

290 295 300

Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu

305 310 315 320

Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr

325 330 335

Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His

340 345 350

Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

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Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp

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Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val

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<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> Mini-plg（小纤维蛋白溶酶原）核酸序列

<400> 9

gtcaggtggg agtactgcaa cctgaaaaaa tgctcaggaa cagaagcgag tgttgtagca 60

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aaagatattg ccttgctaaa gctaagcagt cctgccgtca tcactgacaa agtaatccca 720

gcttgtctgc catccccaaa ttatgtggtc gctgaccgga ccgaatgttt catcactggc 780

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attgagaata aagtgtgcaa tcgctatgag tttctgaatg gaagagtcca atccaccgaa 900

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tgtgcacgcc ccaataagcc tggtgtctat gttcgtgttt caaggtttgt tacttggatt 1080

gagggagtga tgagaaataa ttaa 1104

<210> 10

<211> 367

<212> PRT

<213> Mini-plg（小纤维蛋白溶酶原）氨基酸序列

<400> 10

Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala

1 5 10 15

Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr

20 25 30

Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly

35 40 45

Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala

50 55 60

Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg

65 70 75 80

Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly

85 90 95

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys

100 105 110

Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln

115 120 125

Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala

130 135 140

His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly

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Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr

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Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val

180 185 190

Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu

195 200 205

Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala

210 215 220

Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro

225 230 235 240

Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys

245 250 255

Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg

275 280 285

Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly

290 295 300

His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

305 310 315 320

Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser

325 330 335

Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg

340 345 350

Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

355 360 365

<210> 11

<211> 750

<212> DNA

<213> Micro-plg（微纤维蛋白溶酶原）核酸序列

<400> 11

gccccttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagggtt 60

gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct tagaacaagg 120

tttggaatgc acttctgtgg aggcaccttg atatccccag agtgggtgtt gactgctgcc 180

cactgcttgg agaagtcccc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa 240

gaagtgaatc tcgaaccgca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc 300

acacgaaaag atattgcctt gctaaagcta agcagtcctg ccgtcatcac tgacaaagta 360

atcccagctt gtctgccatc cccaaattat gtggtcgctg accggaccga atgtttcatc 420

actggctggg gagaaaccca aggtactttt ggagctggcc ttctcaagga agcccagctc 480

cctgtgattg agaataaagt gtgcaatcgc tatgagtttc tgaatggaag agtccaatcc 540

accgaactct gtgctgggca tttggccgga ggcactgaca gttgccaggg tgacagtgga 600

ggtcctctgg tttgcttcga gaaggacaaa tacattttac aaggagtcac ttcttggggt 660

cttggctgtg cacgccccaa taagcctggt gtctatgttc gtgtttcaag gtttgttact 720

tggattgagg gagtgatgag aaataattaa 750

<210> 12

<211> 249

<212> PRT

<213> Micro-plg（微纤维蛋白溶酶原）氨基酸序列

<400> 12

Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys

1 5 10 15

Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro

20 25 30

Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly

35 40 45

Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu

50 55 60

Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln

65 70 75 80

Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu

85 90 95

Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser

100 105 110

Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro

115 120 125

Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly

130 135 140

Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu

145 150 155 160

Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly

165 170 175

Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr

180 185 190

Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys

195 200 205

Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala

210 215 220

Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr

225 230 235 240

Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

245

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 丝氨酸蛋白酶（结构）域的核酸序列

<400> 13

gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 60

aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 120

gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 180

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 240

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 300

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 360

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 420

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 480

tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 540

ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 600

ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 660

acttggattg agggagtgat gaga 684

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 丝氨酸蛋白酶（结构）域的氨基酸序列

<400> 14

Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile

20 25 30

Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro

35 40 45

Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn

50 55 60

Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu

65 70 75 80

Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val

85 90 95

Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val

100 105 110

Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln

115 120 125

Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile

130 135 140

Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln

145 150 155 160

Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys

165 170 175

Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr

180 185 190

Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn

195 200 205

Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu

210 215 220

Gly Val Met Arg

225

Claims (10)

1.一种预防和/或治疗受试者肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原，其中所述受试者有肾组织损伤风险、怀疑有肾组织损伤、或罹患肾组织损伤。

2.权利要求1的方法，其中所述肾组织损伤包括感染、炎症、变态反应、自身免疫、缺血、微血管病变、血栓、创伤、辐射损伤、糖代谢紊乱、电解质紊乱、脂肪代谢紊乱、癌症所致肾组织损伤。

3.权利要求1或2的方法，其中所述肾组织损伤为选自如下的全身性疾病导致的肾组织损伤：高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、高脂血症、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、系统性血管炎、过敏性紫癜、多发性肌炎、血栓性微血管病。

4.权利要求1或2的方法，其中所述肾组织损伤为慢性肾脏疾病导致的肾组织损伤。

5.权利要求4的方法，其中所述慢性肾脏疾病为慢性肾小球肾炎、慢性肾盂肾炎、肾病综合征、肾功能不全、肾衰或尿毒症。

6.权利要求1或2的方法，其中所述慢性肾脏疾病为药物导致的慢性肾损伤。

7.权利要求6的方法，其中所述药物包括化疗药物、降血压药物、降血脂药物、降血糖药物、非类固醇抗炎药物、抗生素药物、抗病毒药物。

8.权利要求7的方法，其中所述药物为化疗药物，具体为顺铂。

9.一种预防和/或治疗受试者急性肾组织损伤的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原保护肾组织。

10.权利要求9的方法，其中所述纤溶酶原减轻急性肾组织损伤所致的肾组织细胞凋亡。