RU2358754C2

RU2358754C2 - Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, содержащий дез-а-фибрин

Info

Publication number: RU2358754C2
Application number: RU2006145902/15A
Authority: RU
Inventors: Хиробуми СЕНГА (JP); Хиробуми Сенга; Цайся ЛИ (CN); Цайся ЛИ; Юнлин ВАН (CN); Юнлин ВАН; Лишуй ЧАН (CN); Лишуй ЧАН
Original assignee: Тобиси Фармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date: 2004-06-24
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2009-06-20
Also published as: US20090018062A1; KR101032249B1; HK1105091A1; AU2005257508A1; WO2006001523A1; JPWO2006001523A1; EP1762242A1; JP4716994B2; US8481047B2; US20060088519A1; CN1972706B; EP1762242B1; CA2566991A1; HK1100359A1; EP1762242A4; RU2006145902A; KR20070026846A; CN1972706A

Abstract

Изобретение относится к области медицины и касается препарата, ингибирующего развитие злокачественных опухолей, содержащий дез-А-фибрин. Сущность изобретения включает препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, который содержит дез-А-фибрин и, следовательно, может ингибировать злокачественные опухоли посредством ингибирования распространения и миграции клеток злокачественных опухолей и тем самым может ингибировать развитие злокачественных опухолей. Преимущество изобретения заключается в ингибировании инвазии и метастазирования опухолей. 7 з.п. ф-лы, 2 табл., 9 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к препарату, ингибирующему развитие злокачественных опухолей и включающему дез-А-фибрин.

ПРЕДПОСЫЛКИ

В последние годы терапия злокачественных опухолей постоянно совершенствуется, повышая процент успешного удаления первичной карциномы посредством хирургических операций, радиотерапии или химиотерапии. Однако, даже если первичная карцинома полностью удалена, зачастую смерть связана с раковыми метастазами.

В частности, меланому, рак легких, рак печени, рак поджелудочной железы и другие опухоли с высокой злокачественностью трудно обнаружить на ранних стадиях, таким образом, к моменту диагностирования злокачественной опухоли первичная опухоль и метастазы могут уже существовать одновременно, и во многих случаях хирургическое лечение невозможно. Радиотерапия также не дает удовлетворительных результатов при лечении таких злокачественных опухолей. Кроме того, большинство химиотерапевтических лекарственных препаратов, находящихся в клиническом применении, таких как адриамицин, действуют при непосредственной атаке клеток злокачественных опухолей, но так как они одновременно нацелены на нормальные клетки, то имеют сильные побочные эффекты, что препятствует их клиническому применению. Таким образом, за последние десятилетия не было обнаружено принципиально новых лекарств. Для преодоления такой ситуации ожидается появление лекарств нового типа для лечения злокачественных опухолей.

В данном контексте недавно было сделано предположение на основе большого количества фундаментальных и клинических исследований о жесткой зависимости между злокачественными опухолями и свертыванием крови, а также системами фибринолиза. Например, известно, что у пациентов со злокачественными опухолями микроциркуляционное повреждение обусловлено повышенными уровнями фибриногена в плазме, повышенной вязкостью крови, патологической реологией крови и другими нарушениями свертывания крови и систем фибринолиза. Сообщается также, что собственно повышенные уровни фибриногена в плазме или секреция фибриногена клетками злокачественных опухолей вызывают отложение фибриногена или фибрина во внеклеточном матриксе злокачественных опухолевых тканей, и эти факторы воздействуют, как часть внеклеточного матрикса, вызывая пролиферацию, инвазию и метастазирование клеток злокачественных опухолей (смотри, например, Cancer Research 60:2033-2039(2000); Ann. NY Acad. Sci. 936:406-425(2001); и Blood 96:3302-3309(2000)).

Концентрируя внимание на приведенной выше взаимосвязи между злокачественными опухолями и свертыванием крови и системами фибринолиза, было доказано, что при обработке клеток злокачественных опухолей фибрином in vitro, происходит усиленное воздействия фибрина на экспериментальное метастазирование клеток злокачественных опухолей в легкие (смотри, например, Clin. Exp. Metastasis 17:723-730(1999)). Фибрин (также называемый дез-AB-фибрином или фибрином II) представляет собой вещество, получаемое при действии тромбина на фибриноген, вызывая высвобождение фибринопептида A (FPA) и фибринопептида B (FPB) из фибриногена (смотри, например, Nature 275:501-505(1978) и Biochemistry 35:4417-4426(1996)).

Кроме того, сосредоточив внимание на взаимосвязи между концентрациями фибриногена плазмы и ростом и метастазированием злокачественных опухолей, было сделано сообщение о том, что введение тромбиноподобных ферментов батроксобина и анкрода, которые оказывают дефибриногенное действие, снижает уровень фибриногена и ингибирует рост злокачественной опухоли и метастазирование (смотри, например, Eur. J. Cancer 16:919-923(1980); и Acta Haematol. Jpn. 44:739-743(1981)). Батроксобин, тромбиноподобная сериновая протеаза, получаемая из яда змеи Bothrops atrox moojeni, представляет собой гликопротеиновый фермент, который высвобождает из фибриногена только FPA, продуцируя дез-А-фибрин (также называемый фибрином I) (смотри, например, Thromb. Haemost 36:9-13(1976) и Thromb. Diath. Haemorrh. 45 (Suppl.):63-68 (1971)).

На основании предположения о том, что фибриноген действует как барьер, защищающий клетки злокачественных опухолей от атак иммунной системы, в приведенных выше ссылках были предприняты попытки с помощью методик, ингибировать рост и метастазирование злокачественных опухолей посредством снижения уровней фибриногена тромбиноподобными ферментами, таким образом, облегчая атаку иммунной системы на клетки злокачественных опухолей.

С другой стороны, также известно, что для клетки злокачественной опухоли характерна способность к распространению и миграции. В данном случае “распространение” клеток злокачественных опухолей означает, что округлые опухолевые клетки образуют псевдоподии в ответ на некоторый сигнал, что является биологическим поведением опухолевых клеток, и основой роста опухоли, ее инвазии и метастазирования.

Кроме того, “миграция” клеток злокачественных опухолей означает, что опухолевые клетки покидают исходное место их расположения посредством повторяющегося связывания, а также диссоциации лигандов и молекул клеточной адгезии в клеточной мембране в ответ на некоторый сигнал, что также является биологическим поведением и основой для инвазии и метастазирования опухолей.

Следовательно, посредством ингибирования распространения и миграции клеток злокачественных опухолей можно ингибировать инвазию и метастазирование опухолей и, таким образом, предотвратить развитие злокачественных опухолей.

Однако не сообщалось о препарате, который может ингибировать распространение и миграцию клеток злокачественных опухолей для эффективного ингибирования развития злокачественной опухоли.

Кроме того, не сообщалось о зависимости между дез-А-фибрином (продуктом разложения фибриногена) и распространением, и миграцией клеток злокачественных опухолей.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, целью настоящего изобретения является препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей и содержащий новый активный ингредиент, который представляет собой препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей.

Для решения указанных выше задач авторами изобретения было сделано предположение о том, что действие дез-А-фибрина на клетки злокачественных опухолей может быть отличным от действия фибрина, и после всесторонних исследований эффекта дез-А-фибрина на распространение и миграцию клеток злокачественных опухолей ими было обнаружено, что дез-А-фибрин действует, ингибируя распространение и миграцию клеток злокачественных опухолей. Настоящее изобретение основано на этом открытии.

Таким образом, настоящее изобретение относится к препарату, ингибирующему развитие злокачественных опухолей, содержащему дез-А-фибрин.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 представлена фотография, показывающая электрофореграмму фибриногена, дез-А-фибрина и фибрина.

На фиг. 2 представлен график, показывающий электрофореграмму фиг. 1, обсчитанную при помощи системы анализа изображения.

На фиг. 3 представлены микрофотографии клеток меланомы, которые культивировали в лунках и обрабатывали PBS (A), фибриногеном (B), батроксобином (C), тромбином (D), дез-А-фибрином (E) и фибрином (F).

На фиг. 4 представлен график степеней распространения клеток меланомы, которые культивировали в лунках и обрабатывали PBS (A), фибриногеном (B), батроксобином (C), тромбином (D), дез-А-фибрином (E) и фибрином (F).

На фиг. 5 представлены микрофотографии клеток рака молочной железы, которые культивировали в лунках и обрабатывали PBS(A), фибриногеном (B), батроксобином (C), тромбином (D), дез-А-фибрином (E) и фибрином (F).

На фиг. 6 представлен график степеней распространения клеток рака молочной железы, которые культивировали в лунках и обрабатывали PBS (A), фибриногеном (B), батроксобином (C), тромбином (D), дез-А-фибрином (E) и фибрином (F).

На фиг. 7 представлена микрофотография клеток фибросаркомы, которые культивировали в лунках и обрабатывали PBS (A), фибриногеном (B), батроксобином (C), тромбином (D), дез-А-фибрином (E) и фибрином (F).

На фиг. 8 представлен график степеней распространения клеток фибросаркомы, которые культивировали в лунках и обрабатывали PBS (A), фибриногеном (B), батроксобином (C), тромбином (D), дез-А-фибрином (E) и фибрином (F).

На фиг. 9 представлен график, показывающий влияние количества дез-А-фибрина на распространение клеток меланомы.

НАИЛУЧШИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение подробно объясняется ниже.

Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей по настоящему изобретению, содержит дез-А-фибрин в качестве активного ингредиента.

Дез-А-фибрин представляет собой вещество, получаемое при высвобождении FPA из фибриногена.

Фибриноген представляет собой димерный гликопротеин (AαBβγ)₂, образованный посредством дисульфидного связывания двух субъединиц (AαBβγ), каждая из которых состоит из трех цепей: цепи-Aα, цепи-Вβ и цепи-γ, которые связаны дисульфидными связями. Так как цепь-Aα состоит из 610 аминокислот (68 кДа), цепь-Bβ из 461 аминокислот (54 кДа) и цепь-γ из 411 аминокислот (48 кДа), то молекулярная масса фибриногена составляет 340 кДа (смотри Thromb. Res. 83:1-75(1996) и Blood Coagulation, Fibrinolysis and Kinin, Aoki, A. and Iwanaga, S. (Eds), Chugai Igaku Co., Tokyo, 1979, pp,59-71). Известно также, что цепь-Bβ и цепь-γ также имеют сахарную связь, тогда как в цепи-Aα такая связь отсутствует (смотри Int. J. Biochem. & Cell Biol. 31:741-746(1999)).

FPA представляет собой пептид, соответствующий 16 аминокислотам (NH₂-Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg) (Seq. ID No.1) на амино-конце цепи-Aα фибриногена.

Следовательно, дез-А-фибрин является остатком [(αBβγ)₂], получаемым при высвобождении FPA из фибриногена (смотри Thromb. Haemost. 36:9-13(1976) и Thromb. Diath. Haemorrh. 45 (Suppl.):63-68(1971)). Так как молекулярная масса FPA составляет 1536 Да, то рассчитанная молекулярная масса дез-А-фибрина составляет примерно 337 кДа.

Для высвобождения FPA из фибриногена можно использовать тромбиноподобные ферменты. Тромбиноподобный фермент представляет собой разновидность сериновой протеазы. Обычно используют ферменты, полученные из змеиного яда. Конкретные примеры включают батроксобин (Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. и Beijing Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd., Beijing, China, дочерняя компания Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd.), который экстрагируют и очищают из яда Bothrops atrox moojeni, а также анкрод и другие тромбиноподобные ферменты (например, кроталаза), которые получают из змеиного яда, и тому подобное. Эти тромбиноподобные ферменты могут быть природными препаратами или продуктами генетической рекомбинации.

Дез-А-фибрин может быть получен, например, способами, описанными в пунктах (1)-(6) ниже, используя фибриноген и тромбиноподобный фермент:

(1) способ, в котором получают фибриноген и прикрепляют за счет адгезии к поверхности пластикового сосуда для культивирования, стеклянного сосуда для культивирования, предметного стекла, сосуда из нержавеющей стали или сосуда для искусственной крови из искусственного твердого материала EPTFE, или тому подобного, и добавляют тромбиноподобный фермент с получением дез-А-фибрина;

(2) способ, в котором фибриноген и тромбиноподобный фермент добавляют одновременно к указанному выше твердому веществу, получая дез-А-фибрин;

(3) способ, в котором фибриноген и фермент типа тромбина взаимодействуют в жидкой реакционной системе в присутствии 0,1-15 Н мочевины и/или антикоагуляционного пептида (Gly-Pro-Arg-Pro-амид, GPRP-NH₂ (SEQ. ID No:2)), получая дез-А-фибрин, при этом предотвращая агглютинацию мономеров дез-А-фибрина (Clin. Exp. Metastasis 17: 723-730 (1999));

(4) способ, в котором фибриноген присоединяют к колонке и вливают в колонку раствор, содержащий тромбиноподобный фермент, получая дез-А-фибрин;

(5) способ, в котором тромбиноподобный фермент присоединяют к колонке и вливают в колонку раствор, содержащий фибриноген, получая дез-А-фибрин; и

(6) способ, в котором тромбиноподобный фермент вводят внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно или тому подобное, так чтобы он воздействовал на фибриноген в организме, давая дез-А-фибрин in vivo (смотри Acta Haematol. Jpn. 44:706-711 (1981)).

Фибриноген и тромбиноподобный фермент, используемые для получения дез-А-фибрина в настоящем изобретении, сами по себе являются известными веществами, которые коммерчески доступны или которые могут быть легко получены. Собственно дез-А-фибрин также является известным веществом, которое можно получить указанными выше способами.

Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей по настоящему изобретению, нацелен на злокачественные опухоли. В зависимости от исходного местонахождения ткани злокачественные опухоли обычно можно классифицировать на эпителиальные злокачественные опухоли и неэпителиальные злокачественные опухоли. Считается, что около 90% опухолей являются эпителиальными. Неэпителиальные злокачественные опухоли можно дополнительно классифицировать на злокачественные опухоли, происходящие из мезенхимальной ткани, злокачественные опухоли, происходящие из нервной ткани, и злокачественные опухоли, происходящие из недифференцированных клеток. Конкретные примеры злокачественных опухолей каждого типа приведены ниже.

Эпителиальные злокачественные опухоли

Аденокарциномы (карциномы, происходящие из железистого эпителия, которые возникают в любом месте организма, включая желудок, кишечник, поджелудочную железу, трахею, легкие, молочные железы, яичники, тело матки, предстательную железу и тому подобное, как полагают, что они составляют 70-80% случаев злокачественных новообразований), плоскоклеточные карциномы (раковые заболевания, происходящие из многослойного плоского эпителия и встречающиеся в эпителиальной ткани эпидермиса, губ, языка, горла, пищевода, ануса, вульвы, шейки матки и тому подобное, и легочные плоскоэпителиальные раковые заболевания, классифицируемые как немелкоклеточный рак легких), базально-клеточные карциномы, происходящие из базальных клеток кожи и придатков, переходно-клеточные карциномы (происходящие из переходного эпителия, например рак мочевого пузыря), карциномы клеток печени (происходящие из гепатоцитов), почечно-клеточные карциномы (происходящие из почечного эпителия), холангиокарциномы (происходящие из желчных протоков) и хориокарциномы (происходящие из плацентарного эпителия).

Неэпителиальные злокачественные опухоли

Злокачественные опухоли, происходящие из мезенхимальной ткани

Фибросаркомы (происходящие из соединительной ткани и фиброзной ткани), липосаркомы (происходящие из соединительной ткани и жировой ткани), хондросаркомы (происходящие из соединительной ткани и хрящевой ткани), остеосаркомы (происходящие из соединительной ткани и костной ткани), ангиосаркомы (происходящие из кровеносных сосудов), лимфангиосаркомы (происходящие из лимфотических протоков), миелогенный лейкоз (происходящий из гемопоэтических клеток), моноцитарный лейкоз (происходящий из гемопоэтических клеток), злокачественная лимфома (происходящая из лимфоидной ткани), лимфоцитарный лейкоз (происходящий из лимфоидной ткани), плазмоцитома (множественная миелома, происходящая из лимфоидной ткани), ходжкинская клетка (происходящая из лимфоидной ткани), лейомиосаркома (происходящая из гладких мышц), рабдомиосаркома (происходящая из поперечно-полосатых мышц).

Злокачественные опухоли, происходящие из нервной ткани

Нейробластома (происходящая из нейробластов), медуллобластома (происходящая из медуллобластов), злокачественная астроцитома (происходящая из астроцитов), ретинобластома (происходящая из ретинобластов), глиобластома (происходящая из глиобластов), злокачественная невриленома (происходящая из швановских клеток), меланома (происходящая из нейроэктодермы).

Злокачественные опухоли, происходящие из недифференцированных клеток

Злокачественная тератома (происходящая из тотипотентных клеток), нефробластома (происходящая из нефробластов), гепатобластома (происходящая из гепатобластов), смешанные опухоли (происходящие из клеток разных типов).

Из указанных выше злокачественных опухолей препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по настоящему изобретению, может быть высокоэффективным против эпителиальных злокачественных опухолей и против неэпителиальных злокачественных опухолей, происходящих из нервной ткани и мезенхимальной ткани, особенно меланомы, рака молочной железы и фибросаркомы.

Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по настоящему изобретению, может ингибировать инвазию и метастазирование опухоли, ингибируя распространение и миграцию клеток злокачественных опухолей и, таким образом, ингибируя развитие злокачественных опухолей.

“Распространение” клеток злокачественных опухолей в данном случае означает, что округлые опухолевые клетки образуют псевдоподии в ответ на некоторый сигнал, что является биологическим поведением опухолевых клеток и основой для роста опухоли ее инвазии и метастазирования.

Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по настоящему изобретению может содержать собственно дез-А-фибрин или дез-А-фибрин с другими активными веществами.

Примеры других активных веществ включают антиметаболиты, такие как фторурацил, противоопухолевые антибиотики, такие как адриамицин, алкилирующие агенты, такие как, дакарбазин, противораковые лекарства растительной природы, такие как, паклитаксел и тому подобное.

Для приготовления препарата, ингибирующего развитие злокачественных опухолей, по настоящему изобретению можно применять любую пропись из Japanese Pharmacopoeia General Rules for Preparations. Примеры препаратов лекарственных средств, ингибирующих развитие злокачественных опухолей, по настоящему изобретению включают инъекции для непосредственного применения в организме (включая суспензии и эмульсии); мази (включая жирные мази, эмульсионные мази (кремы), водорастворимые мази и тому подобное), средства для ингаляции, жидкости (в том числе офтальмологические растворы, растворы для орошения полости носа и тому подобное), суппозитории, пластыри, примочки, лосьоны и другие препараты для наружного применения; и препараты для внутреннего применения, включающие таблетки (в том числе таблетки с сахарной, пленочной и желатиновой оболочкой), жидкости, капсулы, гранулы, порошки (включая крупинки), пилюли, сиропы, пастилки и тому подобное. Эти препараты можно получить способами, описанными в Japanese Pharmacopoeia General Rules for Preparations.

Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по настоящему изобретению может также включать фармакологически приемлемые твердые или жидкие носители или основы для интервенционной терапии. Примеры фармакологически приемлемых твердых или жидких носителей включают растворители, стабилизаторы, консерванты, агенты, способствующие растворению, эмульгаторы, суспендирующие агенты, буферные агенты, агенты для изотоничности, подкрашивающие агенты, основы, загустители, наполнители, лубриканты, связующие агенты, разрыхлители, покрывающие агенты, корригирующие агенты и тому подобное.

Конкретные примеры включают воду, лактозу, сахарозу, фруктозу, глюкозу, маннит, сорбит и другие сахара и сахарные спирты, кристаллическую целлюлозу, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, низкозамещенную гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетатсукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы, кармелозу, кальций кармелозу, натрий кармелозу, натрий кроскармелозу, карбоксиметилэтилцеллюлозу, ацетатфталат целлюлозу и другие целлюлозы и родственные производные, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, декстрин, предварительно желатинированный крахмал, частично пептизированный крахмал, гидроксипропилкрахмал, натрийкарбоксиметилкрахмал, циклодекстрин, пуллулан и другие крахмалы и родственные производные, агар, натрий альгинат, аравийскую камедь, желатин, коллаген, шеллак, трагакант, ксантановую смолу и другие природные полимеры (морские водоросли, растительные клеи, белки и тому подобное), поливинилпирролидон, аминоалкилметакрилатный сополимер, сополимер метакриловой кислоты, карбоксивиниловый полимер, поливиниловый спирт, диметилполисилоксан и другие синтетические полимеры, оливковое масло, масло какао, карнаубский воск, говяжий жир, гидрированное масло, соевое масло, кунжутное масло, масло камелии, парафин, вазелиновое масло, желтый пчелиный воск, белый вазелин, кокосовое масло, микрокристаллический воск и другие масла и жиры, стеариновую кислоту, стеарат алюминия, стеарат кальция, стеарат магния, триэтилцитрат, триацетин, триглицерид жирной кислоты со средней цепью, твердый жир, изопропилмиристат и другие жирные кислоты и их производные, глицерин, стеариловый спирт, цетанол, пропиленгликоль, макрогол и другие спирты и поливалентные спирты, оксид цинка, двухосновный фосфат кальция, осажденный карбонат кальция, синтетический алюминийсиликат, кремниевый ангидрид (диоксид кремния), каолин, высушенный гель гидроксида алюминия, синтетический гидроталькит, оксид титана, тальк, бентонит, алюмосиликат магния, алюминий калий сульфат, субгаллат висмута, субсалицилат висмута, лактат кальция, бикарбонат натрия и другие неорганические вещества и соединения в виде солей металлов, сложные эфиры сахарозы и жирных кислот, полиоксилстеарат, полиоксиэтилен гидрированное касторовое масло, полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоль, сорбитсесквиолеат, сорбиттриолеат, сорбитмоностеарат, сорбитмонопальмитат, сорбитмонолаурат, полисорбат, глицерилмоностеарат, натрийлаурилсульфат, лауромакрогол и другие ПАВ, красители, отдушки и тому подобное.

Примеры основ для оперативного вмешательства включают эндопротезы сосудов, искусственные кровеносные сосуды и подобное.

Количество дез-А-фибрина, содержащегося в препарате, ингибирующем развитие злокачественных опухолей, по настоящему изобретению применяется в зависимости от состава. Примеры включают от 0,01 до 900 мг на 1 г в случае препарата для внутреннего использования, от 0,01 до 500 мг на 1 мл в случае инъекции или от 0,01 до 500 мг на 1 г в случае препарата для наружного использования.

Вводимую дозу препарата, ингибирующего развитие злокачественных опухолей, по настоящему изобретению изменяют в зависимости от веса пациента, характера и тяжести заболевания и она составляет, например, от 0,1 до 5000 мг или, предпочтительно, от 100 до 2500 мг дез-А-фибрина в сутки для взрослых.

Настоящее изобретение подробно описано ниже с использованием примеров, но не ограничено этими примерами.

[Пример 1] Получение и идентификация дез-А-фибрина.

Дез-А-фибрин получают, используя тромбиноподобный фермент и высвобождая FPA из фибриногена. Кроме того, получение дез-А-фибрина устанавливают посредством сравнения его с фибриногеном и фибрином.

(1) Получение дез-А-фибрина

Тромбиноподобный фермент батроксобин (Tobarpin®, Beijing Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd., Beijing, China) добавляют к раствору фибриногена человека (F-4883, Sigma, MO, США) с фосфатным буфером (PBS), получая конечный реакционный раствор с концентрацией фибриногена 3,0 мг/мл и концентрацией батроксобина 0,5 BU/мл, и инкубируют в течение 1 часа при 37°C с получением дез-А-фибрина.

(2) Получение фибрина

Раствор PBS тромбина (Sigma, MO, США) добавляют к раствору PBS фибриногена человека (F-4883, Sigma, MO, США), получая конечный реакционный раствор с концентрацией фибриногена 3,0 мг/мл и концентрацией тромбина 0,5 Ед/мл, и инкубируют в течение 1 часа при 37°C с получением фибрина.

(3) Получение фибриногена

Раствор PBS фибриногена с конечной концентрацией 3,0 мг/мл получают, используя в качестве контроля необработанный фибриноген человека (F-4883, Sigma, MO, США).

(4) Идентификация полученного дез-А-фибрина

Производство дез-А-фибрина в приведенном выше способе (1) устанавливают посредством электрофореза. Конкретно, определено, что фибриноген разлагается на цепи трех типов (цепи-Aα, Bβ и γ) при следующей обработке, получение продуктов оценивают посредством электрофореза после разложения дез-А-фибрина на цепи трех типов (цепи-α, Bβ и γ) и разложения фибрина на цепи трех типов (цепи-α, β и γ).

Дез-А-фибрин, полученный в способе (1), и фибрин, полученный в способе (2), три раза промывают стерилизованным изотоническим раствором хлорида натрия, кипятят в течение 5-6 минут в 0,5 мл раствора 2% SDS/2% бета-меркаптоэтанол/5M мочевина для разрушения дисульфидных связей и растворяют.

Фибриноген, полученный в способе (3), подвергают аналогичной обработке для разрушения дисульфидных связей, как указано выше, исключая процесс промывки, и растворяют кипячением.

К каждому раствору образца (150 мкл) добавляют пятьдесят микролитров электрофоретического буфера (4×2% SDS/0,1% бромкрезол синий) и проводят 7,5% SDS-PAGE электрофорез (Pagel®, Atto Corp., Tokyo, Japan).

Результаты представлены на фиг. 1 в виде электрофореграммы. На фиг. 1, полоса 1 и полоса 4 показывают фибриноген, полоса 2 показывает дез-А-фибрин и полоса 3 показывает фибрин.

В каждой полосе нижний диапазон представляет цепь-γ, второй снизу диапазон представляет цепь-Bβ, и третий снизу диапазон представляет цепь-Aα.

Оценка полосы 2 (Дез-А-фибрин) относительно полосы 1 и полосы 4 (фибриноген) в качестве стандарта показывает, что положение третьего снизу диапазона (цепь-Aα) на полосе 2 сдвинуто (в сторону меньшей молекулярной массы). Это указывает, что FPA высвобождается из цепи-Aα фибриногена при действии тромбиноподобного фермента батроксобина. Положения других диапазонов согласуются с данными фибриногена. Следовательно, можно иметь в виду, что в способе (1) FPA высвобождается из фибриногена и в результате обнаружен дез-А-фибрин.

Оценка полосы 3 (фибрин) относительно полосы 1 и полосы 4 (фибриноген) как стандарта показывает, что положения второго снизу диапазона (цепь-Bβ) и третьего снизу диапазона (цепь-Aα) на полосе 3 сдвинуты ниже (в сторону меньшей молекулярной массы). Это показывает, что FPA и FPB высвобождаются из цепи-Aα и цепи-Bβ фибриногена при действии тромбина. Следовательно, понятно, что в способе (2) получается фибрин.

Эти приведенные выше результаты согласуются с опубликованными ранее данными (смотри Acta Haematol. Jpn. 44:706-711(1981)).

Приведенная выше электрофореграмма обсчитана с использованием системы анализа изображения (Furi Science & Technology Co., Ltd., Shanghai, China) и представлена на фиг. 2.

Что касается трех пиков на фиг. 2: левый пик показывает плотность диапазона цепи-Aα, средний пик показывает плотность диапазона цепи-Bβ и правый пик показывает плотность диапазона цепи-γ.

Оценка левого пика (цепь-Aα) показывает, что пики дез-А-фибрина и фибрина соответствуют друг другу и сдвинуты в сторону меньшей молекулярной массы относительно пика фибриногена. Это означает, что в дез-А-фибрине и фибрине FPA высвобождается из цепи-Aα фибриногена.

Оценка среднего пика (цепь-Bβ) показывает, что пики фибриногена и дез-А-фибрина соответствуют друг другу, тогда как пик фибрина сдвинут в сторону меньшей молекулярной массы. Это означает, что в фибрине FPB высвобождается из цепи-Bβ фибриногена.

Как указано выше, это означает, что вещество, продуцируемое при действии батроксобина на фибриноген ((AαBβγ)₂), представляет собой дез-А-фибрин ((αBβγ)₂), тогда как вещество, продуцируемое при действии тромбина на фибриноген, представляет собой фибрин ((αβγ)₂).

[Пример 2] Эффект дез-А-фибрина на распространение клеток злокачественных опухолей.

Для создания окружающего искусственного внеклеточного матрикса in vitro используют Matrigel® (BD Biosciences, NJ, США) и для оценки эффекта дез-А-фибрина на распространение клеток злокачественных опухолей в данном окружении используют три типа клеток злокачественных опухолей (меланомы, рака молочной железы и фибросаркомы).

(1) Используемые клетки злокачественных опухолей

В качестве клеток меланомы субкультивируют клетки злокачественной меланомы мышей B16-BL6 (Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, China) в среде RPMI-1640 (Gibco, MD, США), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (FBS, HyClone, Utah, США), и данные клетки используют в настоящем эксперименте.

В качестве клеток рака молочной железы субкультивируют клетки рака молочной железы мышей MMT060562 (ATCC, VA, США) в среде MEM (Gibco, MD, США), содержащие 10% FBS и 1% раствор несущественных аминокислот (Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco, MD, США), и данные клетки используют в настоящем эксперименте.

В качестве клеток фибросаркомы субкультивируют клетки фибросаркомы человека HT-1080 (Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, China) в среде MEM (Gibco, MD, США), содержащей 10% FBS, и эти клетки используют в настоящем эксперименте.

(2) Способ определения распространения клеток

Двести пятнадцать микролитров Matrigel (Matrigel® 7,5 мкг/мл, BD Biosciences, NJ, США) добавляют в каждую лунку восьмикамерного предметного стекла (Nunc, IL, США) и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре для нанесения на стекло покрытия из Matrigel. Затем в лунки с Matrigel-покрытием добавляют растворы A-F (0,25 мл), соответственно.

A: Добавляют физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) (контрольный растворитель).

B: Добавляют фибриноген (3 мг/мл).

C: Добавляют батроксобин (0,5 BU/мл).

D: Добавляют тромбин (0,5 Ед/мл).

E: Добавляют дез-А-фибрин (3 мг/мл фибриногена и 0,5 BU/мл батроксобина).

F: Добавляют фибрин (3 мг/мл фибриногена и 0,5 Ед/мл тромбина)

Во всех указанных выше случаях используемый для обработки растворитель представляет собой PBS.

Используемое здесь сокращение BU (единица батроксобина) обозначает единицу, указывающую ферментативную активность батроксобина; при активности 2 BU достигается коагуляция за 19,0±0,2 с, при добавлении 0,1 мл раствора батроксобина к 0,3 мл стандартной плазмы человека, содержащей лимонную кислоту, при 37°C.

В случаях от A до D компоненты добавляют в лунки при указанных конечных концентрациях и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре, затем удаляют жидкость и промывают лунки PBS.

В случаях E и F компоненты добавляют к лункам при указанных конечных концентрациях, проводят взаимодействие в течение 60 с, и удаляют жидкость перед возможной коагуляцией продукта (обработка E: дез-А-фибрин, обработка F: фибрин). Затем проводят инкубацию в течение 1 часа при комнатной температуре и промывание PBS. В случае обработки E получают дез-А-фибрин при действии батроксобина на фибриноген, при том что в случае обработки F получают фибрин при действии тромбина на фибриноген.

Пять тысяч шестьсот клеток меланомы B16-BL6 суспендируют в среде RPMI-1640, не содержащей сыворотки, высевают в каждую обработанную лунку и инкубируют предметное стекло с несколькими камерами в течение 2 часов в CO₂-инкубаторе. Подсчитывают количество распространяющихся клеток (клеток, имеющих псевдоподии) среди примерно 150 клеток, прилипающих к каждой обработанной лунке, используя фазово-контрастный микроскоп, и рассчитывают процент распространяющихся клеток как степень распространения по следующей формуле.

Степень распространения (%)=(количество распространяющихся клеток/количество прилипающих клеток)×100

Аналогичные методики применяют к 5600 клеткам рака молочной железы MMT060562, суспендированным в среде MEM, не содержащей сыворотки и содержащей 1% раствор несущественных аминокислот, и 5600 клеткам фибросаркомы HT-1080, суспендированным в среде MEM, не содержащей сыворотки, вместо 5600 клеток меланомы B16-BL6, суспендированных в среде RPMI-1640, не содержащей сыворотки.

(3) Ингибирование распространения клеток меланомы

На фиг. 3 представлены микрофотографии (45-кратное увеличение) клеток меланомы, культивированных в течение 2 часов в каждой по-разному обработанной лунке. На фиг. 4 показаны степени распространения клеток меланомы, культивированных в каждой по-разному обработанной лунке. У большинства клеток меланомы образуются псевдоподии и они распространяются (фиг. 3) в присутствии PBS (A), фибриногена (B), батроксобина (C), тромбина (D) и фибрина (F) со степенью распространения более 80% в каждом случае (фиг. 4).

С другой стороны, в присутствии дез-А-фибрина (E) большинство обработанных клеток меланомы остаются округлыми и даже, если псевдоподии и образуют, их длина меньше, чем длина в других указанных выше случаях (фиг. 3). Степень распространения при обработке E составляет 12,53±6,69% (фиг. 4).

Таким образом, показано, что дез-А-фибрин более других факторов ингибирует распространение клеток меланомы в присутствии Matrigel (фиг. 4, p<0,01).

Как указано выше, можно иметь в виду, что дез-А-фибрин эффективно подавляет распространение клеток меланомы.

(4) Ингибирование распространения клеток рака молочной железы

На фиг. 5 представлены микрофотографии (45-кратное увеличение) клеток рака молочной железы, культивированных в течение 2 часов в каждой по-разному обработанной лунке. Степени распространения клеток рака молочной железы, культивированных в каждой по-разному обработанной лунке, показаны на фиг. 6. Большинство клеток рака молочной железы развивают псевдоподии и распространяются (фиг. 5) в присутствии PBS (A), фибриногена (B), батроксобина (C), тромбина (D) и фибрина (F) со степенью распространения более 60% в каждом случае (фиг. 6).

С другой стороны, в присутствии дез-А-фибрина (E), большинство обработанных клеток рака молочной железы остаются округлыми и даже, если псевдоподии образуются, то их длина меньше, чем длина в других указанных выше случаях (фиг. 5). Степень распространения при обработке E составляет 8,87±3,06% (фиг. 6).

Таким образом, показано, что дез-А-фибрин более других факторов существенно ингибирует распространение клеток рака молочной железы в присутствии Matrigel (фиг. 6, p<0,01).

Как указано выше, можно иметь в виду, что дез-А-фибрин эффективно подавляет распространение клеток рака молочной железы.

(5) Ингибирование распространения клеток саркомы

На фиг. 7 представлены микрофотографии (45-кратное увеличение) клеток саркомы, культивированных в течение 2 часов в каждой по-разному обработанной лунке. Степени распространения клеток фибросаркомы, культивированных в каждой по-разному обработанной лунке, показаны на фиг. 8. Большинство клеток фибросаркомы развивают псевдоподии и распространяются (фиг. 7) в присутствии PBS (A), фибриногена (B), батроксобина (C), тромбина (D) и фибрина (F) со степенью распространения более 70% в каждом случае (фиг. 8).

С другой стороны, в присутствии дез-А-фибрина (E) большинство обработанных клеток фибросаркомы остаются округлыми и даже, если образуют псевдоподии, их длина меньше, чем длина в других указанных выше случаях (фиг. 7). Степень распространения при обработке E составляет 34,19±6,55% (фиг. 8).

Таким образом, показано, что дез-А-фибрин более других факторов существенно ингибирует распространение клеток саркомы в присутствии Matrigel (фиг. 7, p<0,01).

Как указано выше, можно иметь в виду, что дез-А-фибрин эффективно подавляет распространение клеток саркомы.

[Пример 3] Влияние количества дез-А-фибрина на распространение клеток злокачественных опухолей.

Полагают, что количество дез-А-фибрина, получаемого при действии батроксобина на фибриноген, увеличивается с увеличением количества фибриногена и увеличением времени взаимодействия между фибриногеном и батроксобином. Следовательно, при взаимодействии одинаковой концентрации батроксобина (0,5 BU/мл) с различными концентрациями фибриногена (0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 2 мг/мл, 3 мг/мл, 6 мг/мл, 9 мг/мл, 12 мг/мл и 15 мг/мл) в течение 30 с, 60 с и 90 с соответственно получают различные количества дез-А-фибрина. Исследуют данные эффекты на распространение клеток злокачественных опухолей. Экспериментальные способы аналогичны обработке E, которая описана в (2) способе определения распространения клеток примера 2, исключая концентрации фибриногена и времена взаимодействия. Результаты представлены на фиг. 9.

Если время взаимодействия составляет 30 с (☐), увеличение концентрации фибриногена не влияет на снижение степени распространения, и наименьшая достигаемая степень распространения составляет 76,23%. Это приписывают тому факту, что за 30 с взаимодействия не продуцируется такого количества дез-А-фибрина, которое достаточно для влияния на распространение клеток.

Когда время взаимодействия составляет 60 с (O) и 90 с (∆), наблюдают сильное снижение степени распространения, если концентрация фибриногена достигает 3 мг/мл (60 с: 12,53%, 90 с: 9,13%). Если концентрацию фибриногена повышают далее, то почти не наблюдают распространяющихся клеток. Это указывает, что распространение клеток злокачественных опухолей ингибируется еще более при повышении количества продуцируемого дез-А-фибрина.

С другой стороны, если концентрация фибриногена превышает 9 мг/мл, то степень распространения клеток начинает увеличиваться, и при концентрации 15 мг/мл не наблюдают эффекта снижения степени распространения клеток. Эффекту самого фибриногена приписывают то, что из-за присутствия высокой концентрации фибриногена, большое количество фибриногена покрывает лунку до того, как на лунку может быть нанесено покрытие из получаемого дез-А-фибрина (дез-А-фибрин, не образовавший покрытия на лунке, смывают в процессе промывки).

Как указано выше, можно иметь в виду, что дез-А-фибрин ингибирует распространение клеток меланомы зависимым от дозы образом.

[Пример 4] Эффект дез-А-фибрина на миграцию клеток злокачественных опухолей.

Миграция клеток злокачественных опухолей является биологическим поведением, которое образует основу для метастазирования опухоли. Миграционная способность злокачественных опухолей при высокой злокачественности также является высокой. В настоящем примере оценивают эффект дез-А-фибрина на миграцию злокачественных опухолей двух типов (меланомы и рака молочной железы), используя исследование с нанесением царапин (смотри Gynecol. Oncol. 89:60-72(2003)).

В качестве клеток меланомы субкультивируют злокачественные клетки меланомы мышей B16-BL6 (Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, China) в среде RPMI-1640 (Gibco, MD, США), содержащей 10% плодную телячью сыворотку (FBS, HyClone, Utah, США), и данные клетки используют в настоящем эксперименте.

В качестве клеток рака молочной железы субкультивируют клетки рака молочной железы мышей MMT060562 (ATCC, VA, США) в среде MEM (Gibco, MD, США), содержащей 10% FBS и 1% раствор несущественных аминокислот (Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco, MD, США), и данные клетки используют в настоящем эксперименте.

(2) Определение миграции клеток

На каждую лунку 6-ячеечных планшетов накладывают покровное стекло (Corning, NY, США), высевают в лунку 2,5×10⁴ клеток меланомы B16-BL6, суспендированных в 2 мл 10% FBS-содержащей среды RPMI-1640, или 2,5×10⁴ клеток рака молочной железы MMT060562, суспендированных в 2 мл 10% FBS-содержащей среды MEM, и культивируют в течение 24 часов в CO₂-инкубаторе.

После культивирования используют пластиковый клеточный скребок для нанесения царапаньем 0,5 мм линии на покровном стекле, на котором произошла пролиферация клеток. Клетки, которые первоначально пролиферировали на царапине, удаляют и оставшиеся клеточные фрагменты смывают в PBS.

Добавляют к лункам с культивированной меланомой два миллилитра 0,05 мг/мл фибриногена, разбавленного 10% FBS-содержащей средой RPMI-1640, или дез-А-фибрина (полученного при добавлении 0,05 мг/мл фибриногена и 2 BU/мл батроксобина), и инкубируют в течение 48 часов в CO₂-инкубаторе.

Добавляют к лункам с культивированным раком молочной железы два миллилитра 0,05 мг/мл фибриногена, разбавленного 10% FBS MEM, или дез-А-фибрина (полученного при добавлении 0,05 мг/мл фибриногена и 2 BU/мл батроксобина), и инкубируют в течение 48 часов в CO₂-инкубаторе.

После культивирования проводят тест с окрашиванием по Райту, используя фазово-контрастный микроскоп, подсчитывают количество клеток, мигрировавших к нацарапанной линии (Olympus, Tokyo, Japan), и представляют результат как количество мигрировавших клеток на квадратный миллиметр покровного стекла (количество клеток/мм²).

Кроме того, так как фибриноген присутствует вокруг клеток злокачественных опухолей in vivo, обработку фибриногеном используют в качестве контроля для обработки дез-А-фибрином.

(3) Ингибирование миграции клеток меланомы

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Миграция клеток меланомы
Обработка	Количество мигрировавших клеток (клеток/мм²)
Фибриноген	87±14
Дез-А-фибрин	14±4**
**p<0,01 по сравнению с фибриногеном

При обработке дез-А-фибрином количество мигрировавших клеток (14±4

клеток/мм²) существенно меньше, чем количество мигрировавших клеток, обработанных фибриногеном (87±14 клеток/мм²) (p<0,01).

Как указано выше, можно предположить, что дез-А-фибрин эффективно ингибирует миграцию клеток меланомы.

(4) Ингибирование миграции клеток рака молочной железы

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Миграция клеток рака молочной железы
Обработка	Количество мигрировавших клеток (клеток/мм²)
Фибриноген	29±10
Дез-А-фибрин	12±3**
**p<0,01 по сравнению с фибриногеном

При обработке дез-А-фибрином количество мигрировавших клеток (12±3

клеток/мм²) существенно меньше, чем количество мигрировавших клеток, обработанных фибриногеном (29±10 клеток/мм²) (p<0,01).

Как указано выше, можно иметь в виду, что дез-А-фибрин эффективно ингибирует миграцию клеток рака молочной железы.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Как показано в приведенных выше примерах, препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по настоящему изобретению может эффективно ингибировать распространение и миграцию клеток злокачественных опухолей. Следовательно, настоящее изобретение можно эффективно применять для ингибирования развития злокачественных опухолей.

Claims

1. Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, содержащий дез-А-фибрин.

2. Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей по п.1, в котором дез-А-фибрин получают путем воздействия тромбиноподобного фермента на фибриноген.

3. Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по п.2, причем тромбиноподобный фермент является природным препаратом или продуктом генетической рекомбинации.

4. Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по п.2, причем тромбиноподобным ферментом является батроксобин.

5. Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по любому из пп.1-4, причем злокачественной опухолью является эпителиальная злокачественная опухоль.

6. Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по любому из пп.1-4, причем злокачественной опухолью является неэпителиальная злокачественная опухоль.

7. Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по любому из пп.1-4, причем злокачественной опухолью является злокачественная опухоль, происходящая из нервной ткани, или злокачественная опухоль, происходящая из мезенхимальной ткани.

8. Препарат, ингибирующий развитие злокачественных опухолей, по любому из пп.1-4, причем злокачественной опухолью является меланома, рак молочной железы или фибросаркома.