JP5254973B2 - 新規ａｄａｍｔｓ−１３改変体 - Google Patents

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Description

本願発明は、フォンビルブランド因子（以下、「VWF」と称することがある）をそのA2ドメイン内のTyr-Met部位で切断することのできる酵素ADAMTS-13の改変体に関するものである。詳細には、本願発明は、ADAMTS-13に特有なアミノ酸残基を置換することによる、酵素活性が増強したもしくは自己中和抗体の反応性が低減したADAMTS-13改変体の作製方法、当該作製方法により得られる改変体、当該改変体を有効成分として含有する医薬品組成物、及び当該医薬品組成物からなる血栓症患者の治療に有効な薬剤に関するものである。
ADAMTS-13は、ADAMTS（a disintegrin-like domain, and metalloprotease, with thrombospondin type 1 motif）ファミリーに属する亜鉛型メタロプロテアーゼで、フォンビルブランド因子（VWF）のTyr1605-Met1606（プレプロ配列切断後の番号では842-843位）を特異的に切断する酵素（VWF切断酵素：VWF-Cleaving Protease, VWF-CP）である（例えば、非特許文献１参照）。ADAMTS-13は、血小板凝集の重要因子であるVWFの活性調節因子であることは広く知られている。刺激により放出された、あるいは血中を循環しているVWFは、傷害を受けた血管壁から露呈した内皮下組織への血小板粘着・凝集反応の際のコラーゲンとの橋渡しをすることで、血小板血栓の形成に重要な役割を担っている（例えば、非特許文献２参照）。
VWFは、流血中で血管内のずり応力によりコンフォメーション変化を生じ、露呈したA2ドメイン内のADAMTS-13切断部位であるTyr1605-Met1606が、ADAMTS-13により速やかに加水分解されると推察されている。そこで、Andersonらは（例えば、非特許文献３参照）、予めVWFをグアニジン塩酸塩に晒してコンフォメーション変化を誘導したものを基質として用いて、その触媒効率を評価している。その結果、kcatは〜0.83min-1、kcat/Kmは55μM-1min-1と報告しており、これらの値は、他の凝固系酵素群の天然高分子基質に対するそれよりも小さく酵素としての活性の低さを示すものである。
一方、本酵素の活性低下により生ずる血栓性血小板減少性紫斑病（Thrombotic thrombocytopenic purpura；以下、「TTP」と称することがある）が知られており、ADAMTS-13の分子異常により生ずる遺伝性の先天性のTTP（ときにアップショウシュールマン症候群（USS）とよばれる）と、ADAMTS-13に対する自己中和抗体陽性の後天性のTTPに大別される。前者の先天性TTPに対する治療法として、ADAMTS-13の補充として、現在、血漿輸注が行われているが、将来的にはADAMTS-13濃縮製剤もしくは組換え製剤に置き換わることが期待されている。また、後天性TTPについては、一般に血漿交換により、中和抗体等の除去とADAMTS-13の補充をあわせて行う。
先天性のTTP患者（USS）に見つかったADAMTS-13の分子異常は多数報告されておりそのミスセンス、ナンセンス変異は分子全体に亘っている。一方、発症時期を調べると成人してからの発症例も認められ、このことはTTP発症において先天的なADAMTS-13の低下が唯一のトリガーではない可能性を示唆する。実際、妊娠を契機（妊娠後期では血中VWFは，通常の300％まで達するらしい）に先天性のTTPを発症する例があることを鑑みると、ADAMTS-13の血中濃度の低下に加えて、何らかの環境因子あるいは遺伝的要因など２つ目のトリガーにより血中のVWF濃度が高値となることで、TTP（全身性の血小板血栓形成）が起こるのかもしれない。事実、本発明者らは急性心筋梗塞患者（以下、「AMI」と称することがある）の発症後24時間での血中VWF濃度とADAMTS-13濃度の比（VWF/ADAMTS-13）がある値以上になると1年以内の再イベント率が有意に高くなることを見出している（例えば、特許文献１参照）。
またモノクローナル抗体を利用したサンドウィッチELISAによる播種性血管内凝固症候群（DIC）、溶血性尿毒素症候群(HUS)、深部静脈血栓（DVT）、TTP、肺塞栓、脳梗塞、全身性エリテマトーデス(SLE)等の血栓性疾患を発症した患者血漿中のADAMTS-13抗原量の測定では、いずれの疾患群も、健常人群に比べ有意なADAMTS-13抗原量の低下を認めた（例えば、特許文献２参照）。さらに、敗血症に伴ったDICにおいては、その患者のうち血中ADAMTS-13レベルが20％未満の人は、20％以上の人に比べ有意に腎障害を起こしていることが明らかとなった（例えば、非特許文献４参照）。
一方、炎症性サイトカインであるIL-8、TNF-αは内皮細胞を刺激することによりマルチマー構造が通常より大きなUnusually large (UL) VWFの放出を惹起し、IL-6は、ADSAMTS-13のFlow下でのVWF切断活性を阻害するというずり応力下（ex vivo）の実験報告もあり、これは炎症と血栓形成のつながりを示唆するものである（例えば、非特許文献５参照）。
さらにはHUSの原因となるシガトキシンは、血管内皮細胞を刺激しULVWF放出を促進するとともに、ADAMTS-13の活性を抑制するという報告もあり、HUS患者へのADAMTS-13の投与による病態の改善も可能かもしれない（例えば、非特許文献６参照）。以上、ここで挙げた種々の病態でのADAMTS-13の低下あるいはVWFレベルの上昇による両者のバランスの崩れによる病状の悪化が想定される場合は、ADAMTS-13を投与することで症状の改善を期待できるものと考えられる。
ADAMTS-13は、前述したように、ADAMTSファミリーと呼ばれるメタロプロテアーゼ群に属するが、このファミリーのメンバーはADAMTS-1〜20までが知られている（ただし、ADAMTS-5と11は同一である）。ADAMTS-13は他のADAMTSファミリーのメンバー同様マルチドメイン構造を有している（図１）。そのアミノ酸配列は，開始コドンATG（Met）から停止コドンTGAまで4284ベースのDNAにコードされ、 ADAMTS-13遺伝子は、染色体9q34上で実に29個のExonからなり、全長で37キロベースにも及ぶ。そしてADAMTS-13タンパク質は、その遺伝子配列から前駆体で1427個のアミノ酸残基からなること、10箇所のアスパラギン結合型糖鎖付加ポテンシャル部位を有している巨大一本鎖糖タンパク質であることなどが明らかとなった（特許文献４）。
生合成の過程では74残基のプレプロ配列が、プロセシングエンドプロテアーゼの一種であるFurinにより切断を受け1353アミノ酸残基からなる成熟体となる。そして、このFurinの切断モチーフとなっているプレプロ配列の終わりであるRQRR配列以降は、HEXXHXXGXXHDのコンセンサス配列からなるReprolysinタイプの亜鉛キレート領域を含むメタロプロテアーゼドメインが続く。そして、蛇毒メタロプロテアーゼで見出されるようなディスインテグリン様ドメインを経て、一般的に分子認識に重要と考えられているおよそ50〜60残基からなる最初のTsp1モチーフ（Tsp1-1）へとつながり、さらに、細胞接着モチーフの１つArg-Gly-Asp（RGD）配列が含まれるシステインリッチドメインへと続く。次いで、システイン残基を全く含まない約130アミノ酸残基からなるスペーサードメインを経て、再びTsp1モチーフの繰り返し（Tsp1-2〜8）の後、補体成分C1rあるいはC1sの中に最初に見つかったCUB1, 2ドメインが続く。このCUBドメインは、今まで報告されているADAMTSファミリーの中ではADAMTS-13が唯一有している特徴的なドメインである。本発明者らは以前より、ADAMTS-13の酵素活性発現に必須な領域として、また、抗体による中和エピトープとしてメタロプロテアーゼドメインからスペーサードメインまでを特定してきた（例えば、特許文献３、非特許文献７、８参照）。
特開２００７−２４８３９５号 国際公開ＷＯ２００５／０６２０５４ 国際公開ＷＯ２００４／０２９２４２ 国際公開ＷＯ２００２／０８８３６６ Soejima, K., Mimura, N., Hirashima, M., Maeda, H., Hamamoto, T., Nakagaki, T. & Nozaki, C.: A novel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood: possibly, the von Willebrand factor-cleaving protease? J. Biochem., 130: p.475-480, 2001 Soejima, K. & Nakagaki, T.: Interplay between ADAMTS13 and von Willebrand factor in inherited and acquired thrombotic microangiopathies. Semin. Hematol., 42: p.56-62, 2005 Anderson, P.J., Kokame, K. & Sadler, J.E.: Zinc and calcium ions cooperatively modulate ADAMTS13 activity. J. Biol. Chem., 281: p.850-857, 2006 Ono, T., Mimuro, J., Madoiwa, S., Soejima, K., Kashiwakura, Y., Ishiwata, A., Takano, K., Ohmori, T. & Sakata, Y.: Severe secondary deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13) in patients with sepsis-induced disseminated intravascular coagulation: its correlation with development of renal failure. Blood, 107: p.528-534, 2006 Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J.F. & Dong, J.F.: Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood, 104: p.100-106, 2004 Nolasco, L.H., Turner, N.A., Bernardo, A., Tao, Z., Cleary, T.G., Dong, J.F. & Moake, J.L.: Hemolytic uremic syndrome-associated Shiga toxins promote endothelial-cell secretion and impair ADAMTS13 cleavage of unusually large von Willebrand factor multimers. Blood, 106: p.4199-4209, 2005 Soejima, K., Matsumoto, M., Kokame, K., Yagi, H., Ishizashi, H., Maeda, H., Nozaki, C., Miyata, T., Fujimura, Y. & Nakagaki, T.: ADAMTS-13 cysteine-rich/spacer domains are functionally essential for von Willebrand factor cleavage. Blood, 102: p.3232-3237, 2003 Soejima, K., Nakamura, H., Hirashima, M., Morikawa, W., Nozaki, C. & Nakagaki, T.: Analysis on the molecular species and concentration of circulating ADAMTS13 in blood. J. Biochem., 139: p.147-154, 2006
したがって、本発明は、より高活性なADAMTS-13改変体を作成することで、上述した広範な適応を可能とするものであり、また、酵素活性を維持しつつ中和抗体の反応性を低下させた改変体は、後天性TTPへの適応も可能となる。しかしながら、従来までこのような特性を有したADAMTS-13改変体の報告はない。
したがって、本発明の解決すべき課題は、TTPならびにそれ以外の治療に有効な高活性を有するもしくは中和抗体との反応性の低下したADAMTS-13改変体を作製・提供することである。
上記のような状況において、本発明者らは、それ自身高い酵素活性を有するADAMTS-13改変体あるいは中和抗体のエピトープを改変し反応性を低下させつつ、その酵素活性を維持した改変体を作製すべく鋭意研究を重ね種々の検討を行った結果、本願発明を完成するに至った。本願発明は、ADAMTS-13の活性発現最小単位である、ADAMTS-13の1427個のアミノ酸残基のうち689番目のアミノ酸からC末端側が欠失したC末欠失改変体W688X（特許文献３、非特許文献７参照；以下、「ADAMTS-13W688X蛋白」と称することもある）中のディスインテグリン様ドメイン、システインリッチドメイン又はスペーサードメイン内のアミノ酸を置換することにより、酵素活性が増強されたもしくは中和抗体との反応性を低減させたADAMTS-13W688X蛋白の改変体（以下、単に「ADAMTS-13改変体」と称することもある）を作製することに成功したものである。すなわち、本願発明は、以下のとおりである。また、本発明の改変はADAMTS-13全長（野生株）分子を用いても可能である。
〔１〕ADAMTS-13のディスインテグリン様ドメイン、システインリッチドメイン又はスペーサードメインに存在する荷電アミノ酸のうち、下記アミノ酸を除く少なくとも一つが他のアミノ酸に置換されたADAMTS-13改変体：ディスインテグリン様ドメイン内の第326位のアルギニン、第330位のアスパラギン酸、第343位のアスパラギン酸及び第349位のアルギニン、システインリッチドメイン内の第480位のアスパラギン酸、第488位のアルギニン、第498位のアルギニン、第507位のアルギニン、第533位のアスパラギン酸及び第543位のアスパラギン酸、並びにスペーサードメイン内の第641位のグルタミン酸及び第660位のアルギニン。
〔２〕他のアミノ酸が、非荷電アミノ酸である、〔１〕記載の改変体。
〔３〕置換されるべき荷電アミノ酸が、第312位のアルギニン、第318位のリジン、第568位のアルギニン、第569位のグルタミン酸、第589位のアルギニン、第608位のリジン、第634位のグルタミン酸又は第635位のアスパラギン酸の少なくとも一つを含む中和抗体認識エピトープ内又は該エピトープ周辺のアミノ酸である、〔１〕又は〔２〕記載の改変体。
〔４〕置換されるべき荷電アミノ酸が、第298位のアスパラギン酸、第312位のアルギニン、第326位のアルギニン、第327位のグルタミン酸、第370位のアルギニン、第452位のアルギニン、第504位のアスパラギン酸、514位のアルギニン、第537位のアスパラギン酸、第568位のアルギニン及び第659位のアルギニンからなる群より選択されたアミノ酸である、〔１〕又は〔２〕記載の改変体。
〔５〕非荷電アミノ酸が、アラニン、グリシン、プロリン、セリン及びスレオニンからなる群より選択される、〔２〕ないし〔４〕の何れかに記載の改変体。
〔６〕ADAMTS-13の酵素活性を増強させる方法であって、ADAMTS-13のディスインテグリン様ドメイン、システインリッチドメイン又はスペーサードメインに存在する荷電アミノ酸のうち、下記アミノ酸を除く少なくとも一つを他のアミノ酸に置換することを特徴とする、前記方法：ディスインテグリン様ドメイン内の第326位のアルギニン、第330位のアスパラギン酸、第343位のアスパラギン酸及び第349位のアルギニン、システインリッチドメイン内の第480位のアスパラギン酸、第488位のアルギニン、第498位のアルギニン、第507位のアルギニン、第533位のアスパラギン酸及び第543位のアスパラギン酸、並びにスペーサードメイン内の第641位のグルタミン酸及び第660位のアルギニン。
〔７〕ADAMTS-13と抗ADAMTS-13中和抗体との反応性を低減させる方法であって、ADAMTS-13のディスインテグリン様ドメイン、システインリッチドメイン又はスペーサードメインに存在する荷電アミノ酸のうち、下記アミノ酸を除く少なくとも一つを他のアミノ酸に置換することを特徴とする、前記方法：ディスインテグリン様ドメイン内の第326位のアルギニン、第330位のアスパラギン酸、第343位のアスパラギン酸及び第349位のアルギニン、システインリッチドメイン内の第480位のアスパラギン酸、第488位のアルギニン、第498位のアルギニン、第507位のアルギニン、第533位のアスパラギン酸及び第543位のアスパラギン酸、並びにスペーサードメイン内の第641位のグルタミン酸及び第660位のアルギニン。
〔８〕他のアミノ酸が非荷電アミノ酸である、〔６〕又は〔７〕記載の方法。
〔９〕置換されるべき荷電アミノ酸が、第312位のアルギニン、第318位のリジン、第568位のアルギニン、第569位のグルタミン酸、第589位のアルギニン、第608位のリジン、第634位のグルタミン酸、第635位のアスパラギン酸又は第639位のアルギニンの少なくとも一つを含む中和抗体認識エピトープ内又は該エピトープ周辺のアミノ酸である、〔６〕ないし〔８〕の何れかに記載の方法。
〔１０〕置換されるべき荷電アミノ酸が、第298位のアスパラギン酸、第312位のアルギニン、第326位のアルギニン、第327位のグルタミン酸、第370位のアルギニン、第452位のアルギニン、第504位のアスパラギン酸、514位のアルギニン、第537位のアスパラギン酸、第568位のアルギニン及び第659位のアルギニンからなる群より選択されたアミノ酸である、〔６〕ないし〔８〕の何れかに記載の方法。
〔１１〕非荷電アミノ酸が、アラニン、グリシン、プロリン、セリン及びスレオニンからなる群より選択される、〔８〕ないし〔１０〕の何れかに記載の方法。
〔１２〕〔１〕ないし〔５〕の何れかに記載のADAMTS-13改変体を有効成分として含有する医薬組成物。
〔１３〕〔１〕ないし〔５〕の何れかに記載のADAMTS-13改変体を有効成分として含有する血栓性疾患の治療剤。
〔１４〕血栓性疾患が、播種性血管内凝固症候群（DIC）、溶血性尿毒素症候群（
HUS）、深部静脈血栓（DVT）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP)、心筋梗塞、肺塞栓、脳梗塞、全身性エリテマトーデス（SLE）である、〔１３〕記載の治療剤。
本願発明の方法に従えば、高い酵素活性を有するADAMTS-13改変体の作製方法及び当該方法により得られたADAMTS-13改変体が提供される。例えば、ディスインテグリン様ドメイン、システインリッチドメイン又はスペーサードメインに存在する荷電アミノ酸の少なくとも一つを非荷電アミノ酸に置換することにより、上記のADAMTS-13改変体が得られる。また、抗ADAMTS-13中和抗体のエピトープ近傍の荷電アミノ酸を非荷電アミノ酸に置換することにより、高い酵素活性に加えて、中和抗体に対する反応性を低減させたADAMTS-13改変体を得ることができる。したがって、本発明のADAMTS-13改変体は、血栓症患者を治療するための有効成分として有用であり、少量の投与で大きな効果を期待できる。ここで、非荷電アミノ酸とは、荷電アミノ酸（リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸）を除く、全てのアミノ酸と定義される。
図１は、ADAMTS-13の遺伝子構造及び蛋白質ドメイン構造を示す図面である。黒丸は、N型糖鎖付加ポテンシャルサイト１０箇所を示す。
図２は、ADAMTS-13改変体の培養上清についてウェスタンブロットを行った結果を示す図面である。
図３は、ADAMTS-13改変体の合成基質FRETS-VWF73切断活性を評価した図面である。比活性（U=units/μg）は、変異体の蛋白量（抗原量）(μg)当りの変異体の水解活性（units）で示した。相対活性（Umutant/Uwt）は、野生株の比活性に対する変異体の比活性の比により求めた（U=U変異体/U野生株）。比活性（U=units/μg); U=変異体の水解活性(units) / 変異体の蛋白量（抗原量）(μg)。相対活性（Umutant/Uwt);U変異体/U野生株。
図４は、ADAMTS-13改変体の天然基質VWFの切断活性を評価した図面である。比活性（U=units/μg）は、変異体の蛋白量（抗原量）(μg)当りの変異体の水解活性（units）で示した。相対活性（Umutant/Uwt）は、野生株の比活性に対する変異体の比活性の比により求めた（U=U変異体/U野生株）。比活性（U=units/μg); U=変異体の水解活性(units) / 変異体の蛋白量（抗原量）(μg)。相対活性（Umutant/Uwt);U変異体/U野生株。
図５は、ELISAプレート上へ固相化したVWFへのADAMTS-13改変体の結合能を評価した図面である。比活性（U=units/μg)は、変異体の蛋白量（抗原量）(μg)当りの変異体の結合活性(units)で示した。相対活性(Umutant/Uwt)は、野生株の比活性に対する変異体の比活性の比により求めた（U=U変異体/U野生株）。比活性（U=units/μg); U=変異体の結合活性(units) / 変異体の蛋白量（抗原量）(μg)。相対活性 (Umutant/Uwt);U変異体/U野生株。
図６は中和マウスモノクローナル抗体のエピトープ解析のウェスタンブロットを示す。矢印は、推定されたエピトープアミノ酸示す。
図７は後天性TTP患者Aの自己抗体のエピトープ解析のウェスタンブロットを示す。矢印は、推定されたエピトープアミノ酸を示す。
図８は後天性TTP患者Bの自己抗体のエピトープ解析のウェスタンブロットを示す。矢印は、推定されたエピトープアミノ酸を示す。
図９は後天性TTP患者Cの自己抗体のエピトープ解析のウェスタンブロットを示す。矢印は、推定されたエピトープアミノ酸を示す。
後天性TTP自己抗体低反応性ADAMTS-13改変体の合成基質FRETS-VWF73切断活性を評価した図面である。
本願発明は、ADAMTS-13の酵素活性を増強させる方法及び／又は抗ADAMTS-13中和抗体との反応性を低減させる方法、並びに当該方法により作製されたADAMTS-13の改変体によって特徴付けられる。本願発明の方法は、ADAMTS-13の活性発現最小単位（ADAMTS-13W688X蛋白）をベースとして、ディスインテグリン様ドメイン、システインリッチドメイン又はスペーサードメイン内の荷電アミノ酸（アルギニン（R）、リジン（K）、グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D））の他のアミノ酸、特に非荷電アミノ酸への置換を行い、その改変体の酵素活性、ならびに中和モノクローナル抗体との反応性を評価することにより達成される。具体的な方法は、以下のとおりである。
ADAMTS-13の活性発現最小単位をコードする遺伝子W688X（以下、「ADAMTS-13W688X遺伝子」と称することもある）は、例えば、非特許文献７及び特許文献３に報告されている配列を元にPCR用プライマーをデザインし、ADAMTS-13を産生しているヒト臓器や細胞由来のcDNAを鋳型にしてPCRを行うことにより取得できる。より具体的には、以下のように調製される。まず、ヒト肝臓細胞から全RNAを抽出し、この中からmRNAを精製する。得られたmRNAをcDNAに変換した後、それぞれの遺伝子配列に合わせてデザインされたPCRプライマーを用い、PCR反応を行い、得られたPCR産物をプラスミドベクターに組込み大腸菌に導入する。大腸菌コロニーの中から目的の蛋白をコードするcDNAを有するクローンを選択する。上記の全RNAの抽出には、市販のTRIzol試薬（GIBCO BRL社）、ISOGEN（ニッポンジーン社）等の試薬、mRNAの精製には、mRNA Purification Kit（Amersham BioSciences社）などの市販キット、cDNAへの変換には、SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning（GIBCO BRL社）などの市販のcDNAライブラリー作製キットがそれぞれ使用される。実際にADAMTS-13W688X遺伝子を取得する場合は、市販のcDNAライブラリー、例えば、Human Liver Marathon-Ready cDNA（BC Bioscience）が用いられる。PCR用プライマーは、DNA合成受託機関(例えば、QIAGEN社)などに依頼すれば容易に入手可能である。この時、5'側にKOZAK配列（Kozak M, J. Mol. Biol., 196, 947 (1987)）及び適切な制限酵素切断部位の配列を付加することが望ましい。PCR反応は、市販のAdvantage HF-2 PCR Kit(BC Bioscience)を用い、添付のプロトコールに従って行えばよい。PCRにより得られたDNA断片の塩基配列は、TAクローニングキット（インビトロジェン社）等を用いてクローニングした後、DNAシークエンサー、例えば、CEQ2000XL DNA Analysis System（ベックマン社）により決定される。
こうして得られたADAMTS-13W688X遺伝子に点変異を導入するときは、サイトダイレクティドミュータジェネシス法を使用するのが一般的である。実際には、本技術を応用したTakara社のSite-Directed Mutagenesis System (Mutan-Super Express Km、Mutan-Express Km、Mutan-Kなど)、Stratagene社のQuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit、QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit、Invitrogen社のGeneTailor Site-Directed Mutagenesis Systemなどの市販のキットを用い、添付のプロトコールに従って行われる。ADAMTS-13のディスインテグリン様ドメイン、システインリッチドメイン、スペーサードメイン内の全ての荷電アミノ酸、N型糖鎖付加ポテンシャルサイトをアラニンに置換する際には、表１に示した計78種のプライマーが使用される。点変異を導入したADAMTS-13W688X遺伝子を鋳型として、別のプライマーを用いたサイトダイレクティドミュータジェネシス法を繰り返すことにより、複数の点変異を導入することができる。点変異を導入したADAMTS-13W688X遺伝子の塩基配列は、上記のDNAシークエンサーにより決定される。
ADAMTS-13W688X遺伝子又は点変異を導入したADAMTS-13W688X遺伝子（以下、「改変ADAMTS-13W688X遺伝子」と称することもある）を適当な発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターで宿主を形質転換することによって、ADAMTS-13の活性発現最小単位（ADAMTS-13W688X蛋白）及びその改変体（ADAMTS-13改変体）の発現が行なわれる。宿主としては、外来蛋白の発現に常用される細菌、酵母、動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞などを使用できるが、血栓性疾患の治療剤として有効性を示すならば、いずれを用いても良い。好ましくは、動物細胞等の真核細胞が使用される。宿主として動物細胞が用いられる場合は、これに合わせてプロモーター、選択及び遺伝子増幅用マーカー遺伝子等が組み込まれた発現ベクターが選択される。例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミド（pCAGGベクター）を用いて構築した発現ベクターには、HeLa細胞、293細胞、CHO細胞及びBHK細胞などが使用される。
宿主細胞を形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい（Molecular Cloning (3rd Ed.), Vol 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。
形質転換細胞の選択・増殖には、一般に動物細胞を形質転換する際に行われる方法を使用すればよい。例えば、形質転換後の細胞は、CHO-S-SFMII培地（GIBCO-BRL）、IS CHO-V培地(アイエスジャパン)、YMM培地等無血清培地やMEMアルファ培地、RPMI培地、ダルベッコMEM培地（いずれもGIBCO-BRL）に5-10％程度のウシ胎児血清を添加した血清培地などの一般的に動物細胞培養に用いられる培地に、使用する選択マーカーに合わせてメトトレキサート、G418等を添加した選択培地を用いて、適宜培地交換をしながら、37℃前後で10〜14日間程度培養される。この培養により、形質転換されていない細胞は死滅し、形質転換した細胞のみが増殖してくる。更に、形質転換細胞に対して、限界希釈法などの方法により、目的とするADAMTS-13W688X蛋白又はADAMTS-13改変体産生細胞株の選択及びクローン化が行われる。
ADAMTS-13W688X蛋白又はADAMTS-13改変体産生細胞から当該蛋白を精製する際には、一般に、蛋白質化学において使用される精製方法、例えば、遠心分離、塩析、限外ろ過、等電点沈殿、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、CSレジンクロマトグラフィーなどの方法を組み合わせた方法が用いられる。得られた蛋白質の量は、BCA Protein Assay Reagent Kit（Pierce Biotechnology, Inc）、Protein Assay Kit (BIO-RAD, Inc)などの蛋白測定試薬を用いて測定される。
ADAMTS-13W688X蛋白及びADAMTS-13改変体の精製を容易にするために他のポリペプチドやペプチドと融合させた形で発現させても良い。このような融合蛋白を発現させるベクターとして、FLAGタグを付加した融合蛋白を発現させることができるシステム（シグマ社）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白を作製することができるGST融合タンパク質精製システム（アマシャムファルマシア社）、オリゴヒスチジンを付加することができるHAT蛋白質発現・精製システム（Clontech Inc）、MagneHis Protein Purification System（Promega Inc）などが挙げられる。例えば、本発明の実施例で行なわれたようにFLAGタグとの融合蛋白として発現させた後、抗FLAGM2モノクローナル抗体固定化アガロースゲル（シグマ社製）用いてADAMTS-13改変体発現産物が特異的に精製される。ADAMTS-13W688X蛋白及びADAMTS-13改変体の検出は、SDS-PAGE、ゲルろ過などの分子サイズに基づく方法やELISA法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法などの抗原抗体反応に基づく方法により行なわれる。いずれも外来蛋白を検出する際の一般的な方法であり、目的に応じて適宜選択すれば良い。
ADAMTS-13改変体の酵素としての能力は、ヒト血漿由来のフォンビルブラント因子（VWF）やVWFの部分合成ペプチドとの結合性や分解活性を、ADAMTS-13に対する抗体やFLAGに対する抗体を用いたELISA等の方法で測定し、その結果をアミノ酸置換のない野生型のADAMTS-13W688X蛋白の活性と比較することにより評価される。ELISAの構築は、常法に従って行われる。ELISAに用いるヒト血漿由来VWF及びADAMTS-13に対する抗体は、それぞれ非特許文献１及び非特許文献８記載の方法により取得される。VWFの部分合成ペプチドは、市販の蛍光標識されたFRETS-VWF73（ペプチド研究所製）を使用すれば良い。こうして得られたADAMTS-13W688X蛋白より高い酵素活性を有するADAMTS-13改変体は、以下を除く荷電アミノ酸をアラニンに置換したものである：第343位のアスパラギン酸、第349位のアルギニン、第480位のアスパラギン酸、第488位のアルギニン、第498位のアルギニン、第507位のアルギニン、第533位のアスパラギン酸、第543位のアスパラギン酸、第641位のグルタミン酸及び第660位のアルギニン。荷電アミノ酸の置換は、上記を除く少なくとも一箇所に行えば良い。これらのADAMTS-13改変体を、例えば、血栓症疾患の治療薬としてヒトに投与した場合、少量で大きな治療効果を得ることができる。また、投与量が少ないので副作用の低減も期待される。
これらの効果は、高酵素活性機能の付加に加えて、血栓症疾患患者に見られる自己中和抗体に対する反応性を低減させることにより絶大となる。このようなADAMTS-13改変体は、高い酵素活性を有するADAMTS-13改変体と中和抗体との結合性の強弱をELISAやウエスタンブロット（以下、「WB」と称することもある）法で調べることにより取得することができる。ここで用いる中和抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。モノクローナル抗体の場合は、未成熟樹状細胞の成熟樹状細胞で免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、Milsteinらの方法（Method Enzymol., 73, 3−46, 1981）に従って、ミエローマ細胞株等と融合し、特異抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを作製することにより得られる。また、ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al.、Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al.、ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK）により特異抗原と結合する抗体を作製することもできる。上記のELISAやWBを行うときには、得られた抗体は、蛍光標識、RI、ビオチン化などの方法により標識される。何れもキット化されて市販されているのでこれらを利用すれば良い。
こうして得られたADAMTS-13改変体は、好ましくは、第312位のアルギニン、第318位のリジン、第568位のアルギニン、第569位のグルタミン酸、第589位のアルギニン、第608位のリジン、第634位のグルタミン酸、第635位のアスパラギン酸又は第639位のアルギニンの少なくとも一つを含む中和抗体認識エピトープ内又は該エピトープ周辺の荷電アミノ酸をアラニンに置換したものである。あるいは、好ましくは、第298位のアスパラギン酸、第312位のアルギニン、第326位のアルギニン、第327位のグルタミン酸、第370位のアルギニン、第452位のアルギニン、第504位のアスパラギン酸、514位のアルギニン、第537位のアスパラギン酸、第568位のアルギニン及び第659位のアルギニンからなる群より選択された荷電アミノ酸が置換されたADAMTS-13改変体である。上述したように、これらの荷電アミノ酸の置換は、一箇所だけでなく、２箇所以上であっても良い。
また、実施例では、荷電アミノ酸をアラニンに置換したが、これに限らず他の非荷電アミノ酸に置換しても良い。好ましくは、このような他の非荷電アミノ酸は、進化の過程においてアミノ酸の置換が容易に見られる（すなわち、アミノ酸の類似性が認められる）グリシン、プロリン、セリン及びスレオニンである（BIOINFORMATICS A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins Edited by ANDREAS D. BAXEVANIS,B.F.FRANCIS OUELLETTE, John Wiley & Sons, Inc.）。
本願発明のADAMTS-13改変体は、治療、診断又は他の用途のために製薬学的調合剤に処方することができる。例えば、静脈内投与のための調合剤に対しては、組成物を、通常、生理学的に適合しうる物質、例えば塩化ナトリウム、グリシン等を含み、かつ生理学的条件に適合しうる緩衝されたpHを有する水溶液中に溶解する。また、長期安定性の確保の観点から、最終的剤型として凍結乾燥製剤の形態をとることも考慮されうる。なお、静脈内に投与される組成物のガイドラインは政府の規則、例えば「生物学的製剤基準」によって確立されている。本願発明のADAMTS-13改変体を有効成分として含有する医薬品組成物の具体的な用途としては、播種性血管内凝固症候群（DIC）、溶血性尿毒素症候群（HUS）、深部静脈血栓（DVT）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP)、心筋梗塞、肺塞栓、脳梗塞、全身性エリテマトーデス（SLE）等のADAMTS-13の低下した患者あるいは本酵素の基質であるVWFの血中濃度が上昇した患者ないし炎症等でULVWFの出現が予想される患者への補充療法が挙げられる。
以下、本願発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、これら実施例は本願発明を何ら限定するものではない。本願発明について添付図面を参照しながら実施例にて具体的に例示する。実施例は改変体を動物細胞（HeLa）の培養上清中に発現させたものである。なお、以下特に断りが無い限り、遺伝子組換えに関わる試薬・機器等は、宝酒造（TaKaRa）、東洋紡、バイオラッド、パーキンエルマーアプライド、ベックマン、New England Biolabs 社の製品を用いた。
《アラニン置換体の作製》
特許文献３記載のADAMTS-13活性発現最小単位をコードする遺伝子W688X（ADAMTS-13W688X遺伝子）のpCRベクター内のコーディング領域とそのC末端にFLAGタグ配列が導入されたDNAを制限酵素XhoI/SalIにて消化・抽出し、これをTaKaRa社製Site-Directed MutagenesisキットMutan-Super Express Km付属のpKFベクターへリクローニングし、キットの添付文書に従い、表１から４に定める5'リン酸化合成DNAプライマー配列を作製し、これを用いて、目的部位荷電アミノ酸がアラニンに置換された蛋白をコードする改変ADAMTS-13W688X遺伝子含有プラスミド計78種を作製した。全ての改変ADAMTS-13W688X遺伝子は、自動シークエンサーCEQ2000XL DNA Analysis System（ベックマン社製）にて確認した。表１はディスインテグリン様ドメイン内改変体作製用プライマー、表２はシステインリッチドメイン内改変体作製用プライマー、表３はスペーサードメイン内改変体作製用プライマー、表４はシステインリッチ・スペーサードメイン内糖鎖除去改変体用プライマーを示す。なお、表中のプライマーの表示は、左端の数値はプライマーの通し番号、ピリオドに続く例えば「R287A」は、287位アミノ酸残基アルギニン（R）がアラニン（A）に置換されていることを示す。また、変異部位は塩基配列中に小文字で表した。
Figure 0005254973
Figure 0005254973
Figure 0005254973
Figure 0005254973
《変異体発現ベクターの調製》
発現ベクターpCAGG（特許第2824434号公報）をSalIで消化し、そこに実施例１で調製した改変ADAMTS-13W688X遺伝子含有プラスミドをSalI/XhoIでカットしたものをライゲーションし、大腸菌JM109に形質転換し、アンピシリン含有のLB寒天培地上で培養し、形質転換大腸菌を選択した。出現したコロニーを市販の培地で一晩培養し、目的の発現プラスミドを抽出精製し調製した。
《各改変体 の培養上清への発現及び精製》
実施例２の改変ADAMTS-13W688X遺伝子含有発現ベクターを、市販のリポフェクチン試薬でHeLa細胞に対して遺伝子導入を行い、一時発現培養上清15ｍLを遺伝子導入後3日目に回収した。まずは、常法によりこの培養上清を用いて市販のFLAGタグに対する抗体（抗FLAGM2モノクローナル抗体（シグマ社製））を用いて、ウエスタンブロットを行い、その分泌の有無を確認した。その結果、図２に示されるように、システインリッチ内のアラニン置換体R507A（32）、D533A（37）、D543A（40）ならびにスペーサードメイン内のE641A（61）の4つが培養上清中への正常な発現が認められなかった（改変体の括弧内の数値はプライマー番号を示す、以下同じ）。これら以外の培養上清についてセントリプレップYM-10（ミリポア社製）で1ｍLまで濃縮した。いずれの変異体もそのC末端にFLAGタグ配列を有しているため、抗FLAGM2モノクローナル抗体固定化アガロースゲル（シグマ社製）を用いてアフィニティー精製を行った。溶出はFLAGペプチド溶液により、添付文書に従い、100μg/mLの濃度で溶出を行った。
《各改変体のVWF部分ペプチド基質（FRETS-VWF73）の水解活性の測定》
実施例３の各改変体の活性の測定は、市販の蛍光基質FRETS-VWF73（ペプチド研究所製）を用いて行った。精製蛋白質は非特許文献８記載の抗ヒトADAMTS-13兎ポリクローナル抗体とシグマ社製抗FLAGM2マウスモノクローナル抗体HRP標識体でのサンドウィッチELISAにより濃度を規格化した。これを基に、蛍光基質切断活性を測定し、比活性を数値化した。最終的に、アラニン置換を含まない野生型W688Xの比活性を1として、これに対する相対活性で、改変体を評価した。したがって、1より明らかに高値の場合、野生株より高酵素活性を有し、逆に1より明らかに低値の場合、酵素活性が低下している（あるいは、当該アミノ酸は活性発現に重要なアミノ酸である）と結論付けることができる。
その結果、図３に示されるように、ディスインテグリン様ドメイン内のR349位の置換と、システインリッチドメイン内のR498位（29）のアミノ酸置換において有意に酵素活性の低下を招いた（図中の棒グラフには本実験系の推定実験誤差±20％が付記されている。）。一方、R326位（6）、R370位（17）、R568位（46）、R659位（67）の置換において、酵素活性の増加が認められた。
《各改変体のVWF分解活性の測定》
実施例３の各改変体の活性の測定は、非特許文献１記載の方法でヒト血漿由来VWFを精製してそれを基質として以下の方法にて行った。非特許文献３記載の方法を参考に、1.2M塩酸グアニジンで37℃にて1時間インキューベーションし、VWFを変性させて、その後、適当な濃度のADAMTS-13変異体と37℃にて1時間反応後、終濃度5mMのEDTAで反応を停止させた。そしてVWFの切断の程度を、コラーゲン結合ELISA法にて測定した（Gerritsen, HE., Turecek, PL., Schwarz, HP., Lammle, B. & Furlan, M.: Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Thromb. Haemost. 82: 1386-1389, 1999）。精製蛋白質は非特許文献８記載の抗ヒトADAMTS-13ウサギポリクローナル抗体とシグマ社製抗FLAGM2マウスモノクローナル抗体HRP標識体でのサンドウィッチELISAにより濃度を規格化した。これを基に、蛍光基質切断活性を測定し、比活性を数値化した。最終的に、アラニン置換を含まない野生型W688Xの比活性を1として、これに対する相対活性で、改変体を評価した。したがって、1より明らかに高値の場合、野生株より高酵素活性を有し、逆に1より明らかに低値の場合、酵素活性が低下している（あるいは、当該アミノ酸は活性発現に重要なアミノ酸である）と結論付けることができる。
その結果、図４に示されるように、ディスインテグリン様ドメイン内のR326位（6）、D330位（8）、D343位（10）、R349位（11）、システインリッチドメイン内のD480位（24）、R488位（26）、R498位（29）、スペーサードメイン内のR660位（68）近傍の置換で、VWFとの結合能の低下を招いた。一方、ディスインテグリン様ドメイン内のD298位（2）及びE327位（7）、システインリッチドメイン内のR452位（21）、D504位（31）、R514位（33）及びD537位（39）の置換は、VWF切断活性を増強した（図中の棒グラフには本実験系の推定実験誤差±20％が付記されている）。
《各改変体のVWFとの結合能の評価》
実施例３で精製した各改変体を、非特許文献８記載の方法に従い、ELISAプレートへ固相化されたヒト血漿由来VWFへの結合能を評価した。前述した抗ヒトADAMTS-13ウサギポリクローナル抗体とシグマ社製抗FLAGM2マウスモノクローナル抗体HRP標識体でのサンドウィッチELISAにより濃度を規格化し、単位濃度当りのVWF結合能を定量化して、最終的に、アラニン置換を含まない野生型W688Xの比活性を1として、これに対する相対活性で、改変体を評価した。したがって、1より明らかに高値の場合、野生株より高親和性を有し、逆に1より明らかに低値の場合、親和性が低下している（あるいは、当該アミノ酸はVWF認識に重要なアミノ酸である）と結論付けることができる。
その結果、図５に示されるように、ディスインテグリン様ドメイン内のD343位（10）、R349位（11）、システインリッチドメイン内のD480位（24）、R488位（26）、R498位（29）、スペーサードメイン内のR660位（68）の置換で、VWFとの結合能の低下を招いた。一方、ディスインテグリン様ドメイン内のE327位（7）の置換は、VWFへの親和性を増強した（図中の棒グラフには本実験系の推定実験誤差±20％が付記されている）。
《中和抗体のエピトープ解析１》
実施例３で行った発現確認のウェスタンブロット（WB）に続き、ナカライ社製WB剥離液にて抗FLAG抗体を剥離し、本発明者らが常法により確立した非特許文献８記載のADAMTS-13活性中和能を有するマウスモノクローナル抗体（WH2-22-1A、W688X6-1及びW688X3-69）とそれぞれ再度反応させ、抗マウスイムノグロブリンHRP標識体（ベクター社製）で可視化し、その発色強度の低下から当該抗体のエピトープと断定した（図６）。その結果、WH2-22-1Aでは、R312、K318周辺、W688X6-1ではR568、E569周辺、W688X3-69では、R589、D635周辺をエピトープとして認識していることが明らかとなった。さらに、これらエピトープとして認識されるアミノ酸残基は、FRETS-VWF73水解活性及びVWFとの結合に重要と思われるアミノ酸残基とは異なることも判明した。この方法により、同様に患者中和抗体のエピトープ解析から酵素活性に影響を与えることなく、患者抗体との反応性を低減させた改変分子をデザインできることが示唆された。
《中和抗体のエピトープ解析２》
実施例３で行った発現確認のWB(非還元条件下)に続き、ナカライ社製WB剥離液にて抗FLAG抗体を剥離し、後天性TTP患者より単離したADAMTS-13活性中和能を有するイムノグロブリンG(IgG)画分を実施例７同様にそれぞれ再度反応させ、抗ヒトイムノグロブリンHRP標識体（ダコ社製）で可視化し、その発色強度の低下から当該抗体のエピトープを断定した（図７〜９）。その結果、スペーサードメイン内のK608、E634、D635、E642、R644ならびに糖鎖付加サイトのN578、N614、N667の近傍をエピトープとして認識していることが示唆された。さらに、これらエピトープとして認識されるアミノ酸残基は、FRETS-VWF73水解活性及びVWFとの結合に重要と思われるアミノ酸残基とは異なることも判明した。したがって、これら主要エピトープアミノ酸を抗体の反応性を低下させる他のアミノ酸に置換することで、酵素活性を維持させつつあるいはE327の改変体のごとく酵素活性を増強させつつ、患者抗体との反応性を低減させた改変分子を作製することが可能となる。
《患者抗体低反応性改変体評価》
実施例８の結果から想定された後天性TTP患者自己抗体低反応性改変体（K608A、E634A、D635A、E642A、R644Aならびに糖鎖付加サイトN578A、N614A、N667A）の自己抗体との反応性を市販の蛍光基質FRETS-VWF73（ペプチド研究所製）を用いて評価した（図１０）。患者A、B、Cの抗体の添加、無添加（Ab+/-）におけるADAMTS-13改変体のFRETS-VWF73蛍光基質の1分間当りの切断活性（ΔFU/min）を測定し、患者中和抗体添加時においても十分な酵素活性（抗体無添加の50％以上保持）を有するものを検索した。その結果、患者抗体によっては、K608A、E634A、D635Aは十分な酵素活性を有することが明らかとなった。また、いずれの患者抗体においてもK608Aは、十分な酵素活性を保持していることが明らかとなった。
したがってこれら主要エピトープアミノ酸を抗体の反応性を低下させる他のアミノ酸に置換することで、活性を維持させつつあるいはE327の改変体のごとく活性を増強させつつ患者抗体との反応性を低減させた改変分子（E327A/K608Aなどの2重変異体）の作製が可能となった。
本願発明のADAMTS-13改変体は、TTPを含む種々の血栓性疾患患者への補充療法として極めて有効な薬剤となりうるものである。

Claims (7)

  1. ADAMTS-13のディスインテグリン様ドメイン、システインリッチドメイン又はスペーサードメインに存在する荷電アミノ酸のうち、下記アミノ酸の一つが、アラニンに置換されたADAMTS-13改変体：第298位のアスパラギン酸、第309位のグルタミン酸、第312位のアルギニン、第327位のグルタミン酸、第363位のグルタミン酸、第364位のリジン、第368位のリジン、第452位のアルギニン、第459位のアルギニン、第500位のアスパラギン酸、第504位のアスパラギン酸、514位のアルギニン、第515位のグルタミン酸、第528位のアルギニン、第535位のアルギニン、第537位のアスパラギン酸、第544位のアルギニン、第551位のアスパラギン酸、第552位のアスパラギン、第558位のアルギニン、第568位のアルギニン、第569位のグルタミン酸、第579位のアスパラギン、第634位のグルタミン酸、第667位のアスパラギン、第670位のアルギニン、第683位のアルギニン。
  2. ADAMTS-13の酵素活性を増強させる方法であって、ADAMTS-13のディスインテグリン様ドメイン、システインリッチドメイン又はスペーサードメインに存在する荷電アミノ酸のうち、下記アミノ酸の一つを、アラニンに置換することを特徴とする、前記方法：第298位のアスパラギン酸、第309位のグルタミン酸、第312位のアルギニン、第327位のグルタミン酸、第363位のグルタミン酸、第364位のリジン、第368位のリジン、第452位のアルギニン、第459位のアルギニン、第500位のアスパラギン酸、第504位のアスパラギン酸、514位のアルギニン、第515位のグルタミン酸、第528位のアルギニン、第535位のアルギニン、第537位のアスパラギン酸、第544位のアルギニン、第551位のアスパラギン酸、第552位のアスパラギン、第558位のアルギニン、第568位のアルギニン、第569位のグルタミン酸、第579位のアスパラギン、第667位のアスパラギン、第670位のアルギニン、第683位のアルギニン。
  3. 下記の群から何れか一つ選択される荷電アミノ酸をアラニンに置換したアミノ酸配列からなることを特徴とする、ADAMTS-13改変体：第312位のアルギニン、第568位のアルギニン、第569位のグルタミン酸、第579位のアスパラギン、第634位のグルタミン酸、第667位のアスパラギン及び第670位のアルギニン。
  4. 下記の群から何れか一つ選択される荷電アミノ酸をアラニンに置換したアミノ酸配列からなることを特徴とする、ADAMTS-13の酵素活性を増強させ、且つADAMTS-13中和抗体との反応性を低減させる方法：第312位のアルギニン、第568位のアルギニン、第569位のグルタミン酸、第579位のアスパラギン、第667位のアスパラギン及び第670位のアルギニン。
  5. 請求項１又は３記載のADAMTS-13改変体を有効成分として含有する医薬組成物。
  6. 請求項１又は３記載のADAMTS-13改変体を有効成分として含有する血栓性疾患の治療剤。
  7. 血栓性疾患が、播種性血管内凝固症候群（DIC）、溶血性尿毒素症候群（HUS）、深部静脈血栓（DVT）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP)、心筋梗塞、肺塞栓、脳梗塞、全身性エリテマトーデス（SLE）である、請求項６記載の治療剤。
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